细胞破壁

下列哪类物质是酵母菌细胞壁主要的成分()。 A、甘露聚糖 B、脂质 C、无机盐 D、蛋白质

药物MTT实验步骤(贴壁细胞)----个人改进版by sssholy （2012-10-22） 1. 边缘孔用无菌PBS充填。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度为50000个/ml，每孔加入100ul细胞悬液(每孔5000个细胞)。注：⑴每次加入细胞都使枪头贴着孔底边缘(最好相同位置)，缓慢加入100ul细胞悬液。孔加入顺序：可从上到下，从左到右依次加入。⑵为了保证细胞密度均匀，最好每加3-5列细胞混匀一下细胞悬液，避免因重力沉降导致细胞密度不均。⑶每块96孔板加完细胞后，应拿起板子前后左右水平摇晃几下（勿旋转摇晃），使细胞均匀分散。⑷一般设6个复孔（B-G行），对照孔非常重要，且变异大，故设2列（2，3列为对照孔），4-10或4-11列为给药孔。⑸边缘孔用无菌PBS充填， 2-11列均可加入细胞。因为要设置调零孔（即不加细胞孔），所以可将第11列设为调零孔，也可将第12列的无菌PBS孔在第2天加药时改为调零孔。2. 细胞放入培养箱培养，待贴壁后第二天给药（通常前一天下午或晚上铺板，第2天上午给药）。给药方法：先配好药（用EP管配好药），再拿出96孔板，弃去原有培养液（可不用PBS洗，太麻烦了），加入药物。注：⑴MTT加药时都是先配药再弃去原培养液，最后加入药物。切勿先弃去原有培养液再配药，因为配药一般要花较长时间，若先弃去培养液再配药会导致细胞无营养液体而死亡。⑵药物是用母液溶于无血清培养基配成工作液，事先算好对照孔，药物孔，调零孔如何配制，如何设置加药顺序。一般越靠中央的孔变异越小，故最重要的给药孔一般放在最中间，次要孔放边缘，调零孔可用第11或12列。⑶如果某个给药孔需加入2种药物，一般需要一种药物先预处理1-2h（预处理药物可用Ep管配好后再分别加入各孔），1-2h再加入另一种药物（直接加入各孔）。3.细胞放入培养箱培养24h（或其他指定时间）。4. 药物作用结束后，每孔加入20ul---MTT(5mg/ml)，培养3-4h。若药物能与MTT反应，可先弃去原培养液，再加入含MTT的培养液（无血清培养液：MTT=5：1配制）。注：MTT使用前预先解冻。MTT对光敏感，故一般保存于负20℃，配好5mg/mlMTT后我习惯分装于EP管中。5.终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150ul---DMSO（DMSO可预先算好所需体积加入15ml离心管中）,37℃温箱孵育10分钟或摇床低速振荡10分钟。之后用酶标仪检测OD—490nm（也有测570nm的）各孔的吸光度(A)值。6.同时设置调零孔（无血清培养基, MTT, DMSO）,对照孔（细胞，最大浓度的药物溶解介质，无血清培养基, MTT, DMSO）。7.细胞活力（cell viability）：细胞活力（cell viability of control）=（药物组A值-调零孔A值）/(对照孔A值-调零孔A值）*100%0 http://img.dxycdn.com/upload/2012/10/22/48/88256443.snap.jpg药物MTT实验步骤----原版：0 http://img.dxycdn.com/upload/2012/10/22/45/66035574.snap.jpg

原文是Purton, L.E., and Scadden, D.T. (2007). Limiting Factors in Murine Hematopoietic Stem Cell Assays. Cell Stem Cell 1, 263-270.发表在2007年cell stem cell 杂志上，最近由于要进行相应的课题研究，拿来精读了一番，做了一个笔记，发上来和大家分享，由于初涉小鼠造血干细胞这个领域，肯定有很多地方理解不全和错误，请大家指正。下面是我的精读笔记：小鼠造血干细胞研究方法综述一．关于HSC 免疫表型1. Thy1.1lo,Lin-Sca-1+Cells:其缺点是Thy1.1只表达于C57BL/Ka-Thy1.1小鼠，不表达于常用的C57BL/6小鼠；2. Lin- c-Kit+ Sca-1+ Cells（LSK）：异质性，含有祖细胞，HSC含量不超过10%；结合CD34和Flt3可以分为long-term repopulating HSCs (LKS+ CD34- Flt3-) ，short-term repopulating HSCs (LKS+ CD34+ Flt3-) ，以及multipotent progenitors(LKS+ CD34+ Flt3+)；3.荧光染料标记HSC: Rhodamine 123, Hoescht 33342, 以及Side Population，Rhodamine 123为线粒体染料，Hoescht 33342为DNA染料，HSC能够更多地将这两种染料泵出细胞外，所以染色较浅；4. SLAM Family Members：SLAM antigens (CD150+ CD244-CD48- cells)，其优点是不像Thy1.1和Sca-1其表达受到品系和发育阶段等的影响，在更多的种系的小鼠中适用二．克隆形成实验：主要反映的是祖细胞的造血能力，不反映HSC，检测T系和B系需要另外特定的培养条件；三．Cobblestone Area-Forming Cells/Long-Term Culture-Initiating Cells，鹅卵石样区域形成细胞实验/长期培养-启动细胞实验：体外检测更早期造血干/祖细胞的方法，但由于feeder layers和培养条件不同，实验结果在不同实验室间稳定性较差，对于其是否真正能检测造血干细胞也比较有争议，不过在一些情况下，比如归巢（homing）或植入（engraftment）有缺陷导致体内造血重建实验无法进行时，这两个方法是较好的替代方法；四．Colony-forming unit-spleen (CFU-S)脾集落单位形成实验：属于短期（1-3周）体内重建实验，检测的干祖细胞比体外CFC早，但比HSC晚；五．long-term repopulating assays，长期重建实验，包括：1. competitive repopulation assay：竞争重建实验：属于定性或者半定量研究HSC重建能力的方法，不能区别是HSC的数量还是质量造成的结果差异，得到的结果为RU即重建单位；2. limiting dilution assay：统计的指标是造血重建失败的小鼠数目，采用泊松分布来计算HSC的频率，得到的结果为CRU即竞争重建单位；Stem Cell公司的免费软件L-Calc,可用于分析实验结果。limiting dilution assay有两种方法：1CRU assay，采用最小数的HSC作为竞争细胞，可以在单细胞水平检测HSC；2也称为CRU assay，采用标准的，足量的HSC作为竞争细胞，不能在单细胞水平检测HSC；3serial transplant assay，多代移植，最为严格的检测造血干细胞的方法；六：Limiting Dilution Assays需要考虑的几个重要因素：1.竞争细胞：1compromised bone marrow，即连续两代重建成功的骨髓细胞，比较耗时2W41/W41受体小鼠：c-kit基因发生突变，具有更加敏感的宿主微环境，能够检测更少的植入的HSC，不需要另外的HSC作为支持细胞（竞争细胞）；3全骨髓细胞（whole bone marrow cells）：经验表明2 X105 competing bone marrow cells比较适合2.受测细胞（Test Cells, Unknown HSC Potential）：有人用LKS+ CD34- cells，但作者认为全骨髓细胞最好，原因是这种方法是在功能上评价HSC，避免了HSC在基因修饰的小鼠中免疫表型发生变化导致的结果的不可靠，在作者实验室通常采用的受测全骨髓细胞数为8 X 103到2 X106；3.重建失败的标准：现在一般认为受测细胞的重建比例小于1%为重建失败；在重建比例中，红细胞是不计算在内的，因为其不表达CD45,但一般认为只要其他系重建成功，红系应该也会重建成功；4.分析重建的时间点：看长期造血重建，最少要16周，最佳是六个月；5.其他考虑因素：归巢，HSC各系分化阻滞或减弱，祖细胞增殖动力学特性的改变，造血微环境对HSC的影响等等七．区分供体，受体的遗传学标志：最常用的是CD45.1,CD45.2系统，还有可以通过性别（Y染色体）来区分。

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随着分子生物学的快速发展，许多实验的目标物质都是细胞内物质，要进行实验研究或产物收集就必须将细胞破壁，使产物得以释放，才能进一步提取，因此细胞破碎就变成了提取胞内产物的关键步骤，破碎方法的得当与否，直接影响到所提取产品的产量、质量和生产成本。现将常用的几种细胞破碎方法介绍如下。1.超声波破碎 　 利用超声波高强度声能产生的空化现象引起冲击波和剪切力进行细胞破碎。超声破碎的效率与超声频率、超声功率、处理时间、细胞浓度及处理量等因素有关。 　 不足及须加强的问题：超声波破碎在实验室规模应用较普遍，处理少量样品时操作简便，液量损失少，但超声波产生的化学自由基团可能使某些敏感性活性物质变性失活影响实验结果。且大容量装置声能利用率低，装置散热性差。2.生物酶溶法 　　就是用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方法。常用的溶酶有溶菌酶β-1．3-葡聚糖酶、蛋白酶等。 　　不足：易造成产物抑制作用，这可能是导致胞内物质释放率低的最主要因素。而且溶酶价格高，限制了大规模利用。若回收溶酶，则又增加分离纯化溶酶的操作。另外酶溶法通用性差，不同菌种需选择不同的酶。3.物理珠磨法 　　微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌浆作用下充分混合，珠子之间以及珠子和细胞之间和互相剪切、碰撞，使细胞壁破碎，释出内容物，在珠波分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出，从而实现连续操作，破碎中产生的热量由夹套中的冷却液带走。缺陷：效能利用率仅为1％左右，且破碎过程产生大量的热能无法利用。4.化学渗透法 　　某些有机溶剂（如苯、甲苯）、抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性从而使细胞内容物物有选择地渗透出来。其作用机理；化学渗透取决于化学试剂的类型以及细胞壁和膜的结构与组成。 　　不足：时间长，效率低；化学试剂毒性较强，同时对产物也有毒害作用，进一步分离时需要用透析等方法除去这些试剂；通用性差。

大肠杆菌表达外源蛋白，在超声破碎的时候，用含有1%triton-X-100的PBS悬浮，然后超声的效果较好，1%triton-X-100的作用还是很明显的，对其他的一些细菌同样起作用，比如链霉菌。 细菌沉淀直接加样品1buffer，再加5ul的巯基乙醇，混匀，离心，煮沸10min，直接上样，染色脱色步骤如下:将胶放入适量的染色液微波炉里加热1min(下次适当补点醋酸即可),将染色液换成大量的水(自来水即可)在微波炉煮10min 就可以。 在表达重组蛋白后超声波破碎细胞，采用冰浴，400w，破2s停1s，但是不一会就产生大量泡沫，影响了破碎功率，pbs和tris缓冲液都是这样，最后都是破碎不完全，而我的目的蛋白就在这些未破碎的细胞中。1*会产生气泡是因为你的探头位置没放好。探头一定要接近底部，约1cm（我一般是距底部0.5mm）。功率根据仪器不同会有所不同，但你可以观察液面，有波动但不要太剧烈就好。2*破3S停10S，破个二三十次看看。 3*变幅杆位置摆放也要注意，听声音如果不对的话就要及时调整。另外可以从菌浓度方面考虑。 在破碎时试着加大体积,强度最好不要超过60%. 4*尝试超8s停8s,对有些菌体蛋白来说，你的方法很难散热，导致蛋白变性产生气泡，最好停顿时间稍长一些，这种情况多见于包涵体形式的蛋白。链霉菌（放线菌）超声破碎的，用的方法条件是什么？前处理一般就是配置成一定浓度的菌悬液。使用超声破碎时采用的具体条件是：(1)取细菌的24 h培养液于5 000 r／min 下离心5 min收集菌体．(2)用pH 7．5的Na2HPO -NaH2PO 缓冲液洗涤3次，再用该缓冲液将菌体配成1：3的菌悬液．置于40 mL大塑料试管内．(3)将大塑料试管置于冰浴中，采用超声波破碎(功率200 W，1／2”探头，破碎30 s，间歇30 S)．(4)破碎液于12 000 r／min下高速冷冻离心30 min，收集细胞碎片和上清夜． 超声破菌流程与 上述基本一致，就是洗涤菌体也可以用预冷的生理盐水或pH8的Tris－HCl，洗涤一次就可以。另外，超声剂量随样品量、菌体改变比较大，功率可以到400－600w，超5s，停5s，冰浴，要加终浓度1 mM的PMSF。为确定合适的超声强度和次数，有必要随时镜检观察菌体是否完全破碎。 放线菌属于原核生物系统进化树上的（G＋C）摩尔百分含量（mol％）高的革兰氏阳性菌（Eubacteria）分枝类群，它虽然具有原核生物特有的分子生物学特性，但在其不同类群中，细胞壁的化学组分变化很大。 在做大肠杆菌超声时，采用的是400W，超5停5的方法，效果不错，但是用在链霉菌上，似乎没什么效果。会不会就是由于细胞壁组成差异造成的呢，因为大肠杆菌式属于革兰氏阴性菌的。 再有镜检是检验破碎效果,但是细胞破碎程度和我需要的酶获得之间有正比关系吗？破碎时间长也会影响到酶的活性。所以想问问anaisai战友，你提供的“功率200 W，1／2”探头，破碎30 s，间歇30 S”的条件好像是用于破碎链霉菌孢子的，也可以用于发酵离心后的菌泥吗？如果可以，你破碎的全程时间大概是多少呢？ 如果你需要的是胞内酶，细胞破碎程度和需要的酶获得之间基本上有正比关系。破碎时间长的确会影响到酶的活性。这就需要在最佳的破碎时间和酶活性之间做出判断，最直接的办法是先绘制相关曲线（酶活性和时间的关系曲线）。 实验中，破碎的是棒状杆菌（也是很难破壁的G+菌），破碎时间控制在30min左右，酶活较好。

闲置merck-millipore公司Muse智能细胞分析仪出售，2014年购买，9.5成新，只做过几次演示实验,正宗产品，低价转让。

[font=宋体][font=宋体]稳定细胞，又被称为静止细胞，是那些在生理状态下增殖不明显，处于细胞增殖周期静止阶段的细胞（[/font][font=Calibri]G0[/font][font=宋体]期）。然而，当它们受到组织损伤的刺激时，这些稳定细胞会迅速反应，进入[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成前期（[/font][font=Calibri]G1[/font][font=宋体]期），展现出强大的再生能力。它们是维持组织和器官稳态的关键因素。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]稳定表达细胞株，也被称为稳定转染细胞株，是一种特殊的细胞株。这些细胞能够持续、稳定地表达特定的基因或干扰特定基因的表达。在生物学和医学研究中，稳定表达细胞株被广泛应用于基因功能研究、药物筛选和疾病模型建立等领域。[/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体]稳定细胞株平台的常见问题解答[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]①若想做稳定细胞株，需提供哪些信息？[/font][font=宋体][font=宋体]客户仅需提供目标蛋白的序列信息和希望表达的目标蛋白的区段，义翘神州技术人员会根据客户要求进行表达风险评估和制定表达纯化策略。常见蛋白序列信息来源包括[/font][font=Calibri]UniProt[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]NCBI[/font][font=宋体]等数据库。客户也可直接提供编码目标蛋白的核苷酸序列。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②稳定株细胞如何交付？[/font][font=宋体]采用干冰运输，尽可能减少温度波动对细胞造成的影响。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]③单克隆和[/font][font=Calibri]pool[/font][font=宋体]怎么选择？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]成药蛋白需要单克隆，以便溯源。如只需拿到蛋白[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]抗体的话，[/font][font=Calibri]pool[/font][font=宋体]即可满足。需要提醒的是，通常情况下，[/font][font=Calibri]pool[/font][font=宋体]产量较单克隆低。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]④稳定细胞株做重组蛋白，能否根据蛋白活性进行克隆筛选？[/font][font=宋体][font=宋体]是可以的，只要客户有完整的活性检测方法，我们可以提供[/font][font=Calibri]minipool[/font][font=宋体]供客户进行活性检测（或由义翘进行活性检测）。符合客户对活性的要求后再进行后续的实验。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]⑤为什么要构建稳定细胞株？[/font][font=宋体]稳定株一个很大的优势是减小重组表达蛋白的批间差异，并且表达量通常比瞬转高。对于成药性抗体来说，构建稳定细胞株是十分必要的。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]⑥为什么稳定细胞株构建周期较长？[/font][font=宋体]稳定株的构建周期长，很大程度是由于要筛选出阳性克隆，并需要对细胞株的稳定性进行检测。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]⑦制备稳定株表达蛋白的周期大致如何？[/font][font=宋体][font=宋体]如只需要[/font][font=Calibri]pool[/font][font=宋体]即可，从基因合成到得到纯化后的蛋白，周期一般在[/font][font=Calibri]7[/font][font=宋体]周左右。如需引入多步纯化方案，标签切除，以及额外检测服务则周期会根据具体项目情况有所延长。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/stable-cell-line-development-service][b]稳定细胞系构建服务[/b][/url]，同时提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/platform/stable-cell-line-development][b]稳定细胞株构建平台[/b][/url]，详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/platform/stable-cell-line-development[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

特点：实时在线测量活细胞浓度，只对活细胞敏感，电容探头对于悬浮液中的死细胞、细胞碎片、微载体、非细胞粒子不敏感。优化细胞生长、培养基、补料策略、诱导时间、收获时间、或者检测细胞裂解以及其他培养过程中的偏差工作原理：电容传感器采用活细胞的介电特性，实时连续测量活细胞的生物体积，可应用于实验室桌面型的反应器或者是工业规模的大型反应器两对电极位于传感器的顶部，一对用于在培养基中产生交变的电场，在电场范围内，带有完整细胞膜的细胞会在培养基中发生极化现象，发生极化的细胞可以认为是极小的电容，死细胞或者其他粒子没有完整的细胞膜，所以不能形成电容型号。另一对电极用于检测培养基中的介电信号，培养基中的介电信号和细胞的浓度是精确关联的。细胞的极化率和电场的频率纯在函数关系，当频率增加时，培养基中细胞的介电常数由低频峰（最大极化）降低到高频峰（最小极化）。这种随频率增加极化率降低的现象称为β-散射。传感器采用双频测量模式：培养基的基线在10MHz左右得到，细胞的信号在临界频率区域获得，在曲线的拐点，（动物细胞和细菌在1MHz，酵母在2MHz）我们获得了最佳的信号线性。参考文献：如果您想进一步了解这项技术、相关应用、结果，请查看以下文献Monitoring nutrient limitations by onlinecapacitance measurements in batch and fed-batch CHO fermentations. SvenAnsorge. ESACT 2005 Poster; CCEX 2006 PosterOnline Measurement of Viable Cell Density inAnimal Cell Culture Processes. Georg Schmid. CCE IX 2003 Poster. Evaluation of a Novel Capacitance Probe forOn-Line Monitoring of Viable Cell Densities in Batch and Fed-Batch Animal CellCulture Processes. Georg Schmid. ESACT 2003 Poster On-line viable cell density andphysiological states monitoring by dielectric spectroscopy sf9 growth andinfection process. G.Esteban. CCEX 2006 Poster. On-line monitoring of infected Sf-9 insectcell cultures by scanning permittivity measurements and comparison withoff-line biovolume measurements. Sven Ansorge. Cytotechnology (2007) 55:115–124Process optimization of large-scaleproduction of recombinant adeno-associated vectors using dielectricspectroscopy. Alejandro Negrete. Appl Microbiol Biotechnol (2007) 76:761–772. Online monitoring of vero cells culturesduring the growth and rabies virus process using biomass spectrometer. Samia Rourou.ESACT 2007 Poster On-Line Monitoring of Lentiviral VectorProduction for Characterization of Viral Production and Release Kinetics. SvenAnsorge. ESACT 2009 Poster On-line Pichia pastoris physiological statemonitoring by dielectric spectroscopy. L. PREZIOSI-BELLOY. ECB12 2005 Poster

液氮槽vaporphase长期储存。-20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。（2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。3、步骤：（1）冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。（2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。（3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。（4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1～2ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。4、注意事项：（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80～90％致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。（2）细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力；在-70度可保存数月。（3）注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22micron　FGLP　Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液，可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗，可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用10%甘油冻存。（4）冷冻保存之细胞浓度：①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml②hybridoma:1～3×106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。③adherent tumor lines:5～7×106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1～3×106cells/ml④other suspensions:5～10×106cells/ml，human lymphocyte须至少5×106cells/ml。（5）冷冻保护剂浓度为5或10％DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。（6）冻存可用10%～90%的血清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积（4度时），复苏存活率在80%～90%以上，对原代培养细胞，以90%血清冻存更为有效。二、冷冻细胞活化1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。2、细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。3、材料37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器4、步骤：（1）操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。（2）自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。（3）将新鲜培养基置于37℃水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。（4）取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。（5）取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10～1:15)，混合均匀，放入CO2培养箱培养。取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。（6）解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心1000rpm，5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。（7）若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。三、细胞计数与存活测试1、原理：（1）计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。（2）血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。（3）存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料；因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。2、材料：0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061)；Erythosin bluish stain；取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline；血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip)；计数器(counter)；低倍倒立显微镜；粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液（4%乙酸溶液）。3、步骤：（1）取50μl细胞悬浮液与50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。（2）取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosin bluish)。（3）计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypanblue等体积混合)，最后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。注：4大格细胞总数×稀释倍数×104/4=细胞数/ml；每一大格的体积=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml计数板计数时，最适浓度为5～10×105细胞/ml，此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。5、范例：T75 monolayer culture制成10ml细胞悬浮液，取0.1ml溶液与0.1ml trypan blue混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。活细胞数/方格：55，62，49，59；死细胞数/方格：5，3，4，6；细胞总数=243平均细胞数/方格=60.75；稀释倍数=2；细胞数/ml：60.75×104×2（稀释倍数）=1.22×106；细胞数/flask（10ml）：1.22×106×10ml=12.2×106存活率：225/243﹦92.6%

###一部汇总，大家伙先看着，未完待续###原理与技术干细胞：成体干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞（ips）、肿瘤干细胞、分离、培养、鉴定、建系、分选、信号通路、起源、组织工程干细胞的培养《干细胞原理、技术与临床》核心章节131页/赵春华/ http://bbs.bioon.net/bbs/thread-358972-1-1.html分享一本最新出版的肿瘤干细胞的书http://bbs.bioon.net/bbs/thread-299056-1-1.html强烈推荐：一个关于干细胞的powerpoint http://bbs.bioon.net/bbs/thread-296701-1-1.html干细胞电子书免费下载http://bbs.bioon.net/bbs/thread-264289-1-1.html干细胞研究进展消息 http://bbs.bioon.net/bbs/thread-360149-1-1.html干细胞教师用ppt http://bbs.bioon.net/bbs/thread-362296-1-1.html英文版干细胞ppt集锦（很不错的） http://bbs.bioon.net/bbs/thread-272416-1-1.html干细胞从科研走向临床推广http://bbs.bioon.net/bbs/thread-353817-1-1.html干细胞可用于治疗脊髓损伤http://bbs.bioon.net/bbs/thread-353818-1-1.html老外是如何学习做干细胞的--干细胞课程http://bbs.bioon.net/bbs/thread-57973-1-1.html上传几篇大牛写的干细胞综述 http://bbs.bioon.net/bbs/thread-341447-1-1.html一篇干细胞的NICHE的年度综述！http://bbs.bioon.net/bbs/thread-287579-1-1.html上传几篇大牛写的干细胞综述4 http://bbs.bioon.net/bbs/thread-341451-1-1.html关于干细胞的PPT http://bbs.bioon.net/bbs/thread-259255-1-1.html【免费下载】肿瘤干细胞起源及其生物学特性/陈晶等/http://bbs.bioon.net/bbs/thread-358973-1-1.htmlhttp://www.nature.com/sc/journal/v45/n1/full/3101943a.htmlhttp://www.springerprotocols.com/Full/doi/10.1007/978-1-59745-060-7_10?encCode=QkVDOjAxXzctMDYwLTU0Nzk1LTEtODc5&tokenString=lSYIGGltPLruD0lr0AWrWg==&access=deniedhttp://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jnr.20317/fullhttp://www.transplantation-proceedings.org/article/S0041-1345(08)00008-0/abstracthttp://www.nature.com/nprot/journal/v3/n12/full/nprot.2008.194.htmlNature实验方法-大鼠/小鼠少突胶质前体细胞培养 http://bbs.bioon.net/bbs/thread-358977-1-1.html成人胰腺多能干细胞生成与胰腺癌和非胰腺癌后代 http://bbs.bioon.net/bbs/thread-358980-1-1.htmlBMC Neurosci：电针治疗可以促进移植干细胞的存活和分化 http://bbs.bioon.net/bbs/thread-358982-1-1.htmlstem cells:揭示骨髓干细胞和AMSCs相当 http://bbs.bioon.net/bbs/thread-358984-1-1.html【免费下载】Nature Pro：鼠胚胎干细胞的分化 http://bbs.bioon.net/bbs/thread-358985-1-1.htmlStem Cells:Mesenchymal stem cells instruct oligodendrogenic fate decision onhttp://bbs.bioon.net/bbs/thread-358986-1-1.html胚胎干细胞培养标准化操作规程.dochttp://bbs.bioon.net/bbs/thread-311031-1-1.html干细胞的培养方法(图片)http://bbs.bioon.net/bbs/thread-264491-1-1.html人表皮干细胞的培养技术http://bbs.bioon.net/bbs/thread-323841-1-1.html用sphere法培养肿瘤干细胞的protocol http://bbs.bioon.net/bbs/thread-289291-1-1.html日本科学家关于脂肪干细胞的研究http://bbs.bioon.net/bbs/thread-328832-1-1.html

随着重组DNA技术得到广泛应用以来，生物技术发生了质的飞跃。很多基因工程产物都是胞内物质，必须将细胞破壁，使产物得以释放，才能进一步提取，因此细胞破碎是提取胞内产物的关键步骤，破碎方法的得当与否，直接影响到所提取产品的产量、质量和生产成本。现将近年来常用的几种细胞破碎方法介绍一下。 　　1. 高压匀浆法 　　设备是高压匀浆器，它由高压泵和匀浆间组成，美国Microfluidics公司和ATS公司均有产品出售。其破碎机理：细胞在一系列过程中经历了高速造成的剪刀，碰撞以及由高压到常压的变化从而造成细胞的破碎。 　　存在的问题；较易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性首以及有些亚细胞器，质地坚硬，易损伤匀浆阀，也不适合用该法处理。 　　2. 高速珠磨法 　　设备是珠后机，瑞士WBC公司和德国西门子机械公司均制造各种型号的珠磨机，其破碎机下：微生物细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌浆作用下充分混合，珠子之间以及珠子和细胞之间和互相剪切、碰撞，促使细胞壁破碎，释出内含物，在珠波分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出，从而实现连续操作，破碎中，生的热量由夹套中的冷却液带走。 　　存在的问题：操作参数多，一般赁经验估计并且珠子之间的液体损失30％左右。 　　3. 超声破碎 　　频高于15-20KHz的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎。其破碎机理：可能与空化现象引起的冲击波和剪切力有关。超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及首种类型等因素有关。 　　存在问题；超声波破碎在实验室规模应用较普遍，处理少量样品时操作简便，液量损失少，但是超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质变性失活。而且大容量装置声能传递，散热均有困难。 　　4. 酶溶法 　　就是用生物酶将细胞壁和细胞腊消化溶解的方法。常用的溶酶有溶菌酶β-1．3-葡聚糖酶、蛋白酶等。 　　存在的问题；易造成产物抑制作用，这可能是导致胞内物质释放率低的一个重要因素。而且溶酶价格高，限制了大规模利用。若回收溶酶，则又增加百分离纯化溶酶的操作。另外酶港法通用性差，不同菌种需选择不同的酶。 　　5. 化学渗透法 　　某些有机溶剂（如苯、甲苯）、抗生素、表面活性剂、金属螯合剂、变性剂等化学药品都可以改变细胞壁或膜的通透性从而使内合物有选择地渗透出来。其作用机理；化学渗透取决于化学试剂的类型以及细胞壁和膜的结构与组成。 　　存在的问题；时间长，效率低；化学试剂毒性较强，同时对产物也有毒害作用，进一步分离时需要用透析等方法除去这些试剂；通用性差：某种试剂只能作用于某些特定类型的微生物细胞。 　　本文介绍了几种细胞破碎的方法，可谓各有千秋，在实际应用中，应尽量考虑全面，选择最科学、有效的方法。

摘要：细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。一、细胞凋亡的形态学检测根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。1. 光学显微镜和倒置显微镜(1) 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。(2) 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。2. 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与 DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased)，部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1）。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1376376278_small.jpg3 透射电子显微镜观察结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1376376295_small.jpg二、磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V法)磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE)或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1376376296_small.jpg方法1. 悬浮细胞的染色：将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞(0.5~1×106)用PBS洗2次，加入100 ul Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V(20ug/ml)10 ul，室温避光30 min，再加入PI(50 ug/ml)5 ul，避光反应5 min后，加入400 ul Binding Buffer，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测(一般不超过1 h)， 同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。2. 贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细胞。3. 爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜进行观察。结果 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1376376298_small.jpg http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1376376300_small.jpg

[size=3][font=Times New Roman]1. [/font][font=宋体]附着细胞的凋亡研究：在悬液中的细胞比贴壁细胞更容易发生凋亡，建议在用胰蛋白酶处理前单独收集培养液中悬浮的细胞。[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]2.[/font][font=宋体]固定剂的影响：在做[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=宋体]断裂片段分析凋亡细胞时（如[/font][font=Times New Roman]APO-BRDU[/font][font=宋体]、[/font][font=Times New Roman]APO-DIRECT[/font][font=宋体]），要注意使用化学固定剂（如多聚甲醛）固定细胞，使[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=宋体]交联。原因是：在洗细胞的步骤中，未固定的细胞可能会丢失小的[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=宋体]片段，而使用化学试剂固定后的细胞，小[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=宋体]片段就不会丢失。建议做[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=宋体]断裂片段分析细胞系时，比较不同的固定剂和破膜剂的效果。[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]3.[/font][font=宋体]为了减少细胞丢失，染色、分析时建议使用[/font][font=Times New Roman]12[/font][font=宋体]′[/font][font=Times New Roman]75mm[/font][font=宋体]聚苯乙烯管。其它类型的试管（如聚丙烯管），会使细胞在管壁堆积，造成细胞丢失，并影响染色效果。洗细胞后，建议轻轻药匀细胞沉淀，避免使用加液枪，以免由于塑料枪头的使用造成细胞损失。[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]4.[/font][font=宋体]洗细胞时应注意应洗到管壁内侧细胞可能附着的位置，使细胞充分悬浮。这样可以避免在随后的染色步骤中，由于细胞贴壁或悬着不充分，造成细胞染色不均一。如果细胞染色不均，在荧光参数分析时，表现为双峰现象，即多出一群着色弱的细胞。[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]5.[/font][font=宋体]做[/font][font=Times New Roman]APO-BRDU[/font][font=宋体]或[/font][font=Times New Roman]APO-DIRECT[/font][font=宋体]分析时，若发现染色荧光弱，可以适当延长[/font][font=Times New Roman]BrdU[/font][font=宋体]掺入反应的时间。一些细胞的反应时间可以到[/font][font=Times New Roman]37[/font][font=宋体]°[/font][font=Times New Roman]C 4[/font][font=宋体]小时。[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][/size][size=3][font=Times New Roman]6.[/font][font=宋体]做[/font][font=Times New Roman]APO-BRDU[/font][font=宋体]或[/font][font=Times New Roman]APO-DIRECT[/font][font=宋体]分析时，可以结合[/font][font=Times New Roman]PI[/font][font=宋体]染色，研究凋亡与细胞[/font][font=Times New Roman]DNA[/font][font=宋体]周期的关系。[/font][/size]

细胞自噬是机体一种重要的防御和保护机制。但是这种自噬“信号”如何传递给细胞从而使其“执行”自噬过程，则一直是科学界的难题。近期，我校生命科学学院林圣彩教授课题组成功找到高等动物细胞在生长因子缺失条件下，启动自噬的部分“密码”，从而在细胞自噬机制研究方面取得重大突破。　　4月27日，最新一期的美国《科学》杂志以研究文章的形式刊发了这项研究成果，并配发专门评述。这也是近三年来，我校生命科学学院第二篇发表在这一世界顶级学术刊物上的论文。2009年6月，该院韩家淮教授的一篇有关细胞选择死亡方式机制的研究文章曾“登上”该杂志。　　所谓自噬，是指细胞消化自身蛋白质或细胞内的结构（细胞器）的一种自食现象。通过这种现象，细胞可以降解、消除和消化受损、变性、衰老和失去功能的细胞器和变性蛋白质等生物大分子，为细胞的生存和修复提供必须的能量。　　科学家们认为，自噬与细胞凋亡、细胞衰老一样，是一种十分重要的生物学现象。有关实验表明，包括肥胖症、糖尿病、神经退行性疾病、免疫失调及癌症在内的人类许多重大疾病的发生都与该过程的异常有关。为此，自噬也是当前生命科学中最热门的研究领域之一。　　据林圣彩介绍，对自噬进行分子机制的研究始于上世纪90年代的以单细胞生物酿酒酵母为模型的研究，目前，一系列构成单细胞生物自噬核心机器的基因已被发现并命名。　　然而，对自噬在多细胞生物特别是哺乳动物中的调控机制的研究，科学界至今仍在不断探索中。摆在科学家面前的一个根源性的问题是：在多细胞生物中，诱导自噬的各种信号是如何被传递到细胞内自噬“核心机器”从而启动自噬过程的？　　研究表明，与单细胞生物不同，在多细胞生物内，外界营养元素要依赖于生长因子的调控才能被转运到细胞内。一旦细胞外的生长因子匮乏，细胞便能启动自噬以维持能量平衡。那么，生长因子缺失这一信号又是如何“传达”的呢？　　这也成为长期致力于细胞信号转导研究的林圣彩教授课题组近年来的研究目标之一。经过多年研究，课题组终于成功“**”这一自噬启动“密码”——即通过一种名为GSK3的激酶活性增高后磷酸化并随之激活乙酰转移酶TIP60，进而导致自噬核心机器中的蛋白激酶ULK1的乙酰化水平增强而启动细胞自噬。简言之，这一发现揭示了多细胞生物在生长因子缺失条件下的细胞自噬过程的新的介导分子及其通路。　　林圣彩认为，弄清楚了细胞内到底有哪些蛋白分子“参与”了自噬和它们如何串联在一起，将有益于科学界从“源头”上认识相关疾病，并为这些疾病的诊断和治疗提供新的靶点。

名 称：骨髓细胞的提取目的：分离并培养骨髓间充质干细胞原理：先分离出单核细胞然后再通过培养分离出骨髓间充质干细胞内容：步骤一：小鼠骨髓细胞的获取1． 断颈处死小鼠（7-12周，雌雄均可），投入盛有250ml左右的0.1%新洁尔灭或75%酒精中浸泡3-5分钟，拎出后将小鼠仰面翻铺于超净台上一个消毒托盘上。2． 用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤，用眼科剪小心剪开皮肤，并分离两下肢的皮肤，往下在脚踝处剪断，往上在髋关节处剪断，这样可以游离出小鼠的两条下肢。将它们放入另外一个消毒托盘中，并换一套新的剪子和镊子。手术器械事先均必须消毒。3． 小心剥离肌肉，分别剪下Femurs and Tibias, 剪去两端软骨，露出红色的骨髓腔。注意尽可能少的剪走骨髓腔。4． 拿两支5ml无菌注射器，每支吸取5ml IMDM(10%FBS, 50/50u/ml Pen/Strep)，换装一个4号针头（又称皮针）或1ml注射器的针头，并用无菌的针头套管将之轻轻拧弯。轻轻插入骨髓腔，对准一个无菌15ml离心管，将细胞冲出。每根骨用2.5ml IMDM培养液左右即可基本冲下骨髓腔内的细胞。5． 300C下离心，1200转/10分钟，去上清，但留1ml，以便用于在振荡器上悬浮细胞。6． 加进氯化铵溶液（NH4Cl: 8.99g/L, KHCO3: 1g/L, Na4-EDTA: 0.037g/L ，过滤灭菌, 40C储存）裂解红细胞，按1: 9比例，即1ml 细胞悬液，加进9ml氯化铵溶液，混匀，冰上10分钟。 7． 300C离心，1200转/10分钟，去上清。步骤二：淋巴细胞分离液分离小鼠骨髓细胞1． 按步骤二方法采集小鼠骨髓细胞，并破红细胞2． 细胞用4ml培养液悬浮，缓慢留置于8ml淋巴细胞分离液液面上，2000rpm for 20min.3． 小心吸取云雾状底层的基质细胞约1.5ml的体积，置于1个盛有1ml无菌细胞培养用PBS的15ml离心管中，颠倒混匀，1200rpm for 10min, 去上清4． 如果是注射用细胞，则用5ml PBS洗涤细胞2次；5． 离心沉淀下来的细胞用50-200ul PBS，计数细胞，并计算所需细胞体积数铺板培养

http://www.biomart.cn//upload/userfiles/image/2012/02/1328771705.jpg英国剑桥大学科学家首次从人皮肤样品中构建出大脑皮层细胞(cerebral cortex cell)---这些细胞组成大脑灰质。2012年2月5日，这项研究结果在线发表在《自然-神经科学》期刊上。大脑皮层疾病包括从诸如癫痫和自闭症之类的发育疾病到诸如阿尔茨海默(Alzheimer)疾病之类的神经退化疾病。这些研究发现将使得科学家们能够研究人大脑皮层如何发育和它如何“连接接通”以及这种接通如何出错(一种导致学习障碍的常见原因)。它也将允许科学家在实验室中重建诸如阿尔茨海默疾病之类的大脑疾病。这将给予他们之前不可能获得的启示，允许它们实时观察疾病发展同时也可测试阻止疾病发展的新药物。剑桥大学生物化学部门Rick Livesey 博士是这篇研究论文的主要研究员。他说，“这种方法让我们有能力研究人大脑发育和疾病，而这在5年前是难以想象的。”对他们的研究而言，科学家从病人中获取皮肤活组织，然后将来自皮肤样品中的细胞重编程为干细胞。这些干细胞如同人胚胎干细胞一样就能够被用来产生大脑皮层细胞。Livesey博士补充道，“我们正使用这种体系来重建阿尔茨海默疾病。阿尔茨海默疾病是世界上一种最为常见形式的痴呆症。当前在英国痴呆症影响着800000个人。这种疾病主要影响一种神经细胞类型，而这种神经细胞我们已能够在实验室中制造出来，因此我们在实验室中有一种非常好的工具创建出该疾病的一种完整的人类模型。”英国阿尔茨海默疾病研究中心是英国一家主要的痴呆症研究慈善组织。该中心研究主任Simon Ridley说，“我们为资助了这项研究而感到非常高兴。这项研究向前迈出了积极性的一步。在实验室中将干细胞变成完全功能性的神经细胞网络很有希望能够解密诸如阿尔茨海默疾病之类的复杂大脑疾病。痴呆症是我们时代面临的最大医学挑战，我们迫切需要更多地了解和如何阻止该疾病。我们希望这些发现能有让我们更接近这种目标。”

作者：丁香园网友Docofsoul《每日科学》2011年9月1日报道——由瑞士联邦理工学院（ETH）Yaakov Benenson教授与麻省理工Ron Weiss教授率领的研究小组成功地将生物“计算机”诊断网络导入人类细胞。该网络有识别某些肿瘤细胞的能力，利用五种肿瘤特异性分子因子的逻辑组合，进而触发肿瘤细胞毁灭过程。http://img1.jiansuo.net/cms/upload/userfiles/image/2011/09/04/1315042501_small.jpg细胞微机布线图：所有五种因子必须处于相应的正确状态，由此触发细胞死亡（图片来源：y Benenson Y. 教授 R. Weis教授）开发活体细胞内运作的生物电脑，是ETH苏黎世分院合成生物学教授Yaakov (Kobi) Benenson孜孜以求的目标，其职业生涯的大部分时间都倾注于此。他想建立既能侦测细胞生存状况、又能在细胞异常时对相应信息进行处理以提供合适的治疗响应的生物微机。目前，通过与麻省理工教授Ron Weiss以及团队成员（包括博士后学者Zhen Xie 与 Liliana Wroblewska、博士生Laura Prochazka）合作，他向这一目标迈出了重大一步。这一研究成果已发表于《Science》（见本文所附参考文献），论文介绍了一种多基因合成“电路”；此电路负责鉴别正常细胞与肿瘤细胞、继而进一步摧毁肿瘤细胞。其工作方式是：对细胞内五种肿瘤特异性分子因子及其出现频率进行抽样与综合；只有当所有这些因子在细胞内同时出现时，该电路才会作出正识别响应。这种方式使得侦测肿瘤的准确率非常高。研究者希望这一成果能够为高特异性抗癌治疗奠定基础。对肿瘤细胞的选择性破坏本研究对实验室培养的两种类型人类细胞进行了基因网络测试：海拉细胞（子宫颈癌细胞）与正常细胞。当基因生物微机被导入这两种不同的细胞类型时，只有海拉细胞被摧毁，而正常细胞则安然无恙。当然，取得这一结果需要做大量的基础工作。首先必须找出海拉细胞特有的分子组合。Benenson及其他小组成员在属于小RNA分子（MicroRNA或miRNA）这一类化合物的分子中找，终于确认其中一个miRNA组合（或者说“可识别属性”）只有海拉细胞才有，其它健康细胞类型内则不存在。发现这种可识别属性是一项颇具挑战性的任务。人体内既存在250种不同的健康细胞类型，此外也存在为数众多的肿瘤细胞的变异型（其中数百种可作实验室培养）。但miRNA多样性则更是不让须眉花样繁多，人类细胞中已得以描述的即达500到1000不同种类。Benenson指出：“每种健康或病损细胞类型都有其不同的miRNA分子处于开放或关闭状态。”可识别肿瘤属性中的五种因子确立一种miRNA“可识别属性”与发现一组症状以可靠诊断一种疾病有所不同。教授说：“一种症状，比如说发热吧，不可能由此概括出一种疾病。医生获得的信息越多，其诊断才越可靠。”　一年半前他从哈佛大学到ETH后，研究小组找到了几种因子，可由此可靠地将海拉细胞从所有其它健康细胞中鉴别出；结果表明，仅仅五种特定miRNA的组合（其中某些以高水平出现，某些则以极低水平出现）就足以将海拉细胞从其混迹的健康细胞中揪出来。与微机运作相似的网络Benenson介绍说：“这些miRNA因子在细胞内进行逻辑代数运算；该生物微机运用诸如‘与’与‘非’等逻辑操作将这些因子进行组合，并且，当全部因子的整体运算结果为逻辑‘真’值时，只产生所需要的结果——那就是细胞死亡。”　确实，研究者已经能够显示该网络在活体细胞内可以非常稳定地运作，可正确组合所有细胞内因子并给出正确的诊断。Benenson认为，这一成果代表该领域的一项重大成就。动物模型与基因疗法该研究小组想在下一步在合适的动物模型上测试该细胞计算方法，以期在未来创建诊断与治疗工具。这听起来可能象科幻小说，但Benenson相信其可行性；不过，仍有不少棘手的问题需要解决。比如，如何有效、安全地将外源基因导入细胞？这种DNA递送在目前情况下颇具挑战性。尤其是，该方法需要将外源基因暂时而不是永久导入细胞。现有的病毒导入法或化学导入法均未充分开发，需要进一步完善。Benenson说：“为人类提供一种功能完善的治疗方法还非常遥远。不过这一工作是重要的第一步，显示了单一细胞水平上这样一种选择性诊断方法具有可行性。”参考文献：1. Z. Xie, L. Wroblewska, L. Prochazka, R. Weiss, Y. Benenson. Multi-Input RNAi-Based Logic Circuit for Identification of Specific Cancer Cells. Science, 2011; 333 (6047): 1307 DOI: 10.1126/science.1205527

骨髓间充质干细胞总结 2003年8月，为给大家提供一个网上交流干细胞研究经验的平台，我们干细胞版设立了骨髓间充质干细胞培养讨论区，经过近三个月的讨论学习，我们既学习丰富了自己的知识体系，也对间充质干细胞尤其是分离培养方面有了更为详实的认识，为了大家阅读的方便，我们决定把本版中的相关内容，同时参考部分书目和文献，做一总结。一、骨髓间充质干细胞的分离 目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法，全骨髓法即根据干细胞贴壁特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同，提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSC表面抗原认识的深入，有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化，但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之耗费较大和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。1. 直接培养法（全骨髓培养法） 1987年，Friedenstein等发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞扩增20－30代后仍能保持其多向分化潜能，这类细胞即为骨髓间充质干细胞（BMSC），其工作对今后MSC的研究具有重要意义，不仅证实了骨髓MSC的存在，而且创建了一种体外分离和培养MSC的简便可行的方法，得到了广泛的应用。culture-spirit采用直接贴壁法，24-36小时首次换液，换液时用PBS洗两次，7-10天传第一代，以后2-3天传代。培养基采用Hyclone的DMEM/F-12（1：1），血清是天津TBD的FBS（顶级），得到了较好的培养结果。布兰卡根据自己培养大鼠MSC的经验，详细介绍了实验步骤：（1）接种后60-80分钟,换液去除悬浮细胞（2）原代培养24 h,48 h各换液一次（3）观察细胞情况，在原代培养7天左右时，如观察到成片的典型形态的细胞，在瓶底用Marker笔标记，0.25%胰酶消化，镜下观察控制，约5-10分钟（室温太低时应放置到孵箱中），加入全培养基终止消化，瓶体朝上，吸管轻轻吹打4-8分钟，尤其是标记部位。不要用力吹打，以免把贴壁较牢的成纤维细胞，上皮样细胞吹打下来。（4）传代到新瓶中，加入少量培养基，孵箱静置20-30分钟后，MSC大多牢固贴壁。瓶底朝上，轻轻吹打，丢弃悬浮以及贴壁不牢的细胞（大多是上皮样细胞），加入全培养基开始传代培养，如观察仍有较多杂细胞，可重复上述步骤。（5）经上述处理后，原代的那瓶细胞仍有一些MSC生长，可继续按原代培养，如观察到MSC的克隆，仍可按上述步骤纯化处理。（6）原代或传代的细胞如观察的少量成片的杂细胞，可直接镜下瓶底标记后，超净台里用长吸管尖端机械刮除，吸出去掉。菊花与刀用的是全骨髓培养法，直接用含10%的FBS培养基冲洗大鼠的股骨和胫骨，为了避免冲起许多气泡应缓慢冲，冲的次数不应太多。冲洗后不用离心直接接种在培养瓶里，48 h~72 h后首次换液，一般7~10天可传代。天之饺子介绍的小鼠MSC的分离方法：取6 w小鼠的股骨和胫骨，直接用含培养基冲出骨髓，一定要尽量把干垢端的骨髓冲干净。冲洗后不离心直接接种在培养瓶里，24－48 h后去悬浮，再接下来的每3－4天换液一次，直到需要传代。2. 密度梯度离心法 裴雪涛等用比重为1.073 g/ml的percoll分离（400 g×20 min）人骨髓MSCs，取界面处细胞层，离心后洗涤以2×105/cm2的密度接种，72 h后更换培养液，弃掉未贴壁细胞，以后每3 d换液一次。细胞长到80％汇合时1：1传代。菊花与刀利用PERCOLL密度1.073分离大鼠MSC 时，用2400 rpm×20 mins后可见中间有一层约1～2 mm厚的白色层，仔细用吸管吸取这一层再用PBS离心2遍即可加培养基和胎牛血清培养即rMSCs。周进明等利用密度为1.082的percoll分离小鼠MSCs，500g×30min离心后，取中间的单个核细胞层，PBS洗两次，接种于IMDM培养基，1 d后换液，去掉非贴壁细胞，以后每3-4天换液。jetter用过FICOLL,FERCOLL,上海二分厂的淋巴细胞分离液分离MSC细胞效果都不错，当然所获细胞群的纯度不一，Percoll最纯，而上海二分厂的淋巴细胞分离液所获细胞群的传代能力优秀（35 PASSAGE）。本版的部分园友认为MSC贴壁培养得到的细胞不均一，但是多能分化能力和增殖力好，percoll分离得到的细胞较为均一，多能分化性和增殖力不如贴壁培养的，尤其是增殖力相差很远，有人添加bFGF或/和表皮生长因子发现可以增强增殖能力。二、骨髓间充质干细胞的培养 天之饺子认为，间质干细胞的培养一定要用塑料培养瓶，不能用玻璃的。因为象间质干这类的基质细胞不易贴玻璃，而且现在买的进口好品牌的培养瓶都涂有一层促细胞贴壁的物质，多数园友培养时都添加10－15％胎牛血清。分离培养结果的差异可能是由于各个研究小组标本来源、采用的分离方法不同从而所获得的细胞不同，或者用来检测的细胞代数不同，或者培养过程中用的胎牛血清不同，导致MSCs获得或失去这些表面标记物的表达。三、骨髓间充质干细胞的特性 体外培养的MSC体积小，成梭形，核浆比大。不表达分化相关的细胞标志，如I、II、III型胶原、碱性磷酸酶或Osteopontin；也不表达SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124、CD166和多种表面蛋白，这群细胞特性稳定，扩增一代和两代后的细胞同质性分别达到95％和98％。MSC联系传代培养和冷冻保存后仍能具有多向分化潜能，而且保持正常的核型核端粒酶活性，但不易自发分化，在体外特定的诱导条件下，MSC可以分化为骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉、神经等多种细胞。四、其他相关内容 Jiang将从成人以及成年大鼠和小鼠骨髓分离的间充质干细胞（CD45－TER119－）命名为多潜能成年祖细胞，他们证明，MAPC高表达端粒酶，而且随着细胞的扩增，端粒的长度不变，单个MAPC来源的细胞群不仅能在体外向3个胚层的细胞分化，而且能在体内能够向各种组织细胞分化，相比较而言，形态与MSC相似的体外培养的皮肤成纤维细胞则不具有类似的分化潜能。参考文献 生理学报2003.55（2）：153－159 人骨髓间充质干细胞在成年大鼠脑内的迁移及分化中华放射医学与防护杂志.2002,22(3).-167-169 培养小鼠骨髓间充质干细胞及其移植后在体内的定位分布Exp Biol Med Vol. 226:507 520, 2001 Mesenchymal Stem CellsNATURE |VOL 418 | 4 JULY 2002 Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow干细胞生物学 裴雪涛 主编

目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。二、细胞冻存操作步骤：(1)选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25%胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，10分钟)。(2)去上清液，加入含20%小牛血清的完全培养基，于4℃预冷15分钟后，逐滴加入已无菌的DMSO或甘油，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为3×106～1×107/mL之间。(3)将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料管中，安瓿装1～1.5mL在火焰喷灯上封口，封口处要完全封闭，圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记(日期、细胞种类及代次、冻存支数)。(4)将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内；置于液氮容器颈口处存放过夜，次日转入液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤：先将安瓿置入4℃冰箱中2～3小时，再移至冰箱冷冻室内3～4小时(此步可省略)，再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时，最后沉入液氮中。细胞冻存在液氮中可以长期保存，但为妥善起见，冻存半年后，最好取出一只安瓿细胞复苏培养，观察生长情况，然后再继续冻存。

一、酶消化法1、胰酶。这是用得最多的。一般浓度在0.25-0.5%。作用时间根据细胞种类、作用温度等因素而变化很大，从几分钟到几十分钟不等。0.25%的胰酶作用于单层贴壁的细胞，在37度条件下，一般消化1-5分钟就足够了。终止是用血清。主要作用于细胞间。配制时不能用含钙、镁的平衡液，否则影响活性。保存于-20度。2、胶原酶。这种方法比较少，一般是用原代培养时，从组织消化下细胞。这种方法作用温和，对细胞损伤较小，但是，价格也较贵。中止同样是用血清。二、离子螯合剂 不破坏细胞表面分子，仅与CAMs螯合，因此，如果检测细胞表面分子的话，尽量，甚至是一定不要用酶消化法。1、EDTA。用得也是非常多。一般浓度在0.02%左右。作用于细胞与间质，对细胞间也有一定作用。注意，它能显著影响pH值，而且在弱碱性条件下才易溶。因此，配制时应调节好酸碱度。它不能被终和。因此，消化下来的细胞要洗一遍。2、商品化的无酶消化液。个人的使用经常觉得对细胞的损伤比较大，但是分离成单细胞悬液的能力确实比较强。三、物理法 直接吹打或用细胞刮子将细胞刮下来。四、冷冻法 这是本人做细胞培养时发现的方法。此方法仅能用于细胞传代时。无法使组织上的细胞脱落下来。本方法的原理，我想是因细胞冷冻后收缩，从而从培养瓶上脱落下来。优点是：对细胞损伤小，不需要中止或洗细胞，方便，不需要另外配制消化液。特别适用那些贴壁不是特别紧，又特别娇气的细胞。不足是细胞常成小片脱落。此种方法曾用于因用其它方法传代导致大量细胞死亡操作的间充质干细胞、DC细胞的培养，效果非常满意。具体过程是：1、用较多的4度的PBS洗涤一遍细胞(以6孔板为例，加1.5 ml/孔)；2、再加0.5 ml 4度的PBS，静置操作台上，很快细胞就小片脱落；3、轻轻吹打，细胞即完全脱落；4、按一定比例传代。

概念：细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。基本步骤：1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率 =（克隆数/接种细胞数）×100%平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

用体外方法对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定、计数和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段。为此，须将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来。参与免疫反应的细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等。由于检测的目的和方法有同，分离细胞的需求和技术也异。有的仅需分离白细胞，有的则需分离单个核细胞（mononuclearcell），其中含淋巴细胞和单核细胞（monocyte），有的则需分离T细胞和B细胞以及其亚群。分离细胞选用的方法应力求简便可行，并能获得高纯度、高获得率、高活力的细胞。现用分离细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以组分，另一则按照各类细胞的表面标志，包括细胞表面的抗原和受体加以选择性分离。 一、白细胞的分离 （一）血液中红细胞与白细胞比例约600～1000:1，两者的比重不同其沉降速度亦异，通常用两种方法加以分离。 本法是利用血细胞自然沉降率的分离法，采集血液后应及时抗凝，通常选用肝素抗凝法。肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白而防止血液凝固。操作原则是将含抗凝血的试管直立静置室温30～60min后，血液分成明显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞，轻轻吸取即得富含白细胞的细胞群，离心洗涤后加入少量蒸馏水或含氯化铵的Gey溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。 （二）聚合物加速沉淀法 本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（polyvinylpyrolidone，PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。本法的细胞获得率比自然沉降法高。

作为一只刚进实验室的菜鸟把自己遇到的东东总结一点发出来，抛砖引玉吧，为即将进实验室的朋友些资料，同时欢迎老鸟们指正。1、在实验室登记领试剂和药品pbs 1640 Gbico的FBS 台盼蓝 计数板 酒精灯 胶塞 封口胶 消毒的喷剂 记号笔 镊子 标签 饭盒 消毒时包饭盒的布 冻存管 冻存剂 离心管 培养瓶 6孔板 96空板 吸管 吸球。pbs 1640 Gbico的FBS 我都是买的现成的，就是那些实验室老师用原料配好了来卖的那种，我是害怕自己本来就是一个新手，为省那钱自己配，别污染了多的事情都来了，当然很多老鸟都自己配，别鄙视我哈。2、换液a 开瓶盖的时候，网上的视频里是用镊子开的，但是现在用的瓶塞多是新的，稍微一使劲，胶塞就会被扯破（我这周换了好多塞子了），扯破了的塞子把瓶子包不住，有污染的危险，特别是冰箱里试剂装得很拥挤的时候。方法：切忌男生像我一样用力过猛，如果实在要扯烂，干脆就用手去扯塞子，不过严格按照翻起塞子-烧-扯-再烧就是了，完全没有污染的顾虑b 加液体的时候很很容易就吸到赛棉花那一截去了（很多熟练的都不塞棉花了，他们力度控制得好，只要不吸过头，完全ok的），这时候，就不要再吝惜你的培养基了，全部甩到废液缸里去吧，毕竟吸球没有消毒（我们这里是这样的哈），浸湿过了棉花就可能沾到吸球。c 往培养瓶里加pbs、FBS等液体时候，手抖得厉害。不是滴在瓶口，瓶壁上，就是滴在超净台上。方法：滴在瓶口的一定要烧干，不然小心污染，瓶壁和台子上的可以用消毒后的干净纱布擦拭；另外就是自己找个空瓶子，自己练习加液体，熟能生巧。3、传代a 消化细胞的时间真的是不同细胞就不同，我的细胞是消化5分钟，还是在孵箱里放着的，拿出来以后还要又拍又晃的，朋友的一分钟就全飘起来了，如果你是第一次做，或者你们实验室没有做过这个细胞，您就最好一直在镜下看着细胞，摸一下时间（用表记录时间，不光是“摸”哈），消化过头的细胞，长得不好，如果你是外面买的细胞，就又可能浪费经费了。另外，认真分析了一下，我的癌细胞稍微比朋友的正常组织的细胞消化得慢，他的细胞长得慢，细胞少（毕竟正常细胞不能和癌细胞比），3天才传第一代，我的都2代的瓶子了都铺满60%，他的贴的也不怎么紧。b 离心离心的时候，因为忙着把刚终止了消化的细胞拿去离心，很容易忘记在您的离心管上标记，配平完了，机子都转到1000转了，才想起来，也没法子了。方法：实在是忘记了标记，用于配平的管子里的液体没有你刚做完消化的液体清亮，你反正选最清亮的那个就是了。c 分装的时候，我一传3，加上离心管的盖子，满桌子都是瓶盖，很容易搞错，尤其是在和别个拼台子做实验的时候，更是拥挤，千万要放好，不然空间一拥挤，你取东西的时候很容易从这些面朝上的盖子塞子上面经过，就有可能污染了，虽然盖盖子的时候还要过火烧，但是说实话，烧那几下，连手指都烧不烫，咱还是从不污染的角度做起吧。4、我犯其他的傻a 进细胞间去照台子（说实话，是去抢台子，别人要是紫外照起了，就只能等他们做完再照，就又要等半小时），结果口罩帽子都忘记了带，挨了顿批评。b 吸管在酒精灯上过火烧几次的时候，吸管尖碰在了灯芯旁的酒精瓶铜的那部分。c 倒老的培养液的时候才发觉，废液缸没拿进细胞间。跑出去再拿。记得重新消毒手，而且我离开台子的时候，很怕其他人经过污染我已经打开了的各个试剂的瓶子。不放心的只有盖好再走，再进来时再从头弄，浪费时间。5、其他要注意的问题a 我看见也是个新进实验室的女生，双手悬在空中费劲的塞胶塞（估计也是新胶塞，太紧了，塞不大进去），结果手一滑，整瓶胰酶倒在超净台上。（还好不是加GbicoFBS的1640，呵呵），倒了记得把台子擦干净，上次不知道是谁把什么有机溶剂都倒在台子上了，我一去，还沾手，郁闷，自己做好自己分内的，别让实验室里其他的人说你是个污染源或者细胞杀手。b 某天朋友准备换液，结果就把培养基pbs胰酶全都放在37摄氏度水浴里，结果后来有事走了，只把照台子时候放那的东西收拾了，5个小时后才突然想起，只好暂时不用那个培养基了，重新再用新的。养到后面细胞多了，不怕细胞死的时候，还是可以试验着用用那瓶培养基的。

植物细胞原生质体制制备与融合2006-11-20 17:14植物细胞原生质体制制备与融合1、原生质体常现的杂交育种由于物种间难以逾越的天然屏障而举步维艰。科学家们受细胞全能性理论及组织培养成功的启示，逐渐将眼光转向细胞融合，试图用这种崭 图3-2新的手段冲破自然界的禁钢。１９３７年michel率先实施植物细胞融合的试验。如何去除坚韧的细胞'接成了牛物学工作者必须解决的首要难题。１９６Ｏ年该领域终于出现了重大突破。由英国诺丁汉大学Cocking教授领导的小组率先利用真菌纤维素酶，成功地制备出了大量具有高度活性可再生的番茄幼根细胞原生质体，开辟了原生质体融合研究的新阶段。植物细胞原生质体是指那些已去除全部细胞壁的细胞。2、原生质体制备（１）取材与除菌 为了让制得的原生质体一般都生活力较强，再生与分生比例较高。常用的外植体包括：种子根。子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。对外植体的除菌要因材而异。悬浮培养细胞一般无需除菌。对较脏的外植体往往要先用肥皂水清洗再以清水洗２～３次，然后浸人 ７０％酒精消毒后，再放进 ３％次氯酸钠处理。最后用无菌水漂洗数次，并用无菌滤纸吸干。（２）酶解 现以叶片为例说明如何制备植物原生质体。①配制酶解反应液：反应液应是一种ＰＨ值在５·５～５·８的缓冲液，内合纤维素酶０．３%～３．０%以及渗透压稳定剂、细胞膜保护剂和表面活性剂等，②酶解：除菌后的叶片 撕去下表皮 切块放人反应液 不时轻摇 (条件25℃～30℃,2～4h)反应液转绿。反应液转绿是酶解成功的一项重要指标，说明已有不少原生质体游离在反应液中。经镜检确认后应及时终止反应，避免脆弱的原生质体受到更多的损害。（３） 分离 在反应液中除了大量的原生质体外，尚有一些残留的组织块和破碎的细胞。为了取得高纯度的原生质体就必需进行原生质体的分离。可选取２００～４００目的不锈钢网或尼龙布ｊ叭ｉ过滤除渣，也可采用低速离心法或比重漂浮法直接获取原生质体。（４） 洗涤刚分离得到的原生质体往往还含有酶及其他不利于原生质体培养。再生的试剂，应以新的渗透压稳定剂或原生质体培养液离心洗涤２～４次。 （5） 鉴定 只有经过鉴定确认已获得原生质体后才能进行下阶段的细胞融合工作。由于已去除全部或大部分细胞壁，此时植物细胞呈圆形。如果把它放人低渗溶液中，则很容易胀破。也。'厂月荧光增白剂染色后置紫外显微镜下观察，残留的细胞壁呈现明显荧光。通过以上观测，基本上可判别是否原生质体及其百分中 此外，尚可借助台盼蓝活细胞染色、胞质环流观察以及测定人、作用、呼吸作用等参数定量检测原生质体的活力。4、 原生质体的融合（1）化学法诱导融合 化学法诱导融合无需贵重仪器，试剂易于得到，因此一直是细胞融合的主要方法。尤其是聚乙二醇（ＰＥＧ）纳合成钙高ｐＨ诱导融合法已成为化学法诱导细胞融合的主流。以下简介此方法（在无菌条件下进行）：按比例混合双亲原生质体-----滴加 ＰＥＧ溶液，摇匀，静置----滴加高钙高ｐＨ值溶液，摇匀，静置-----滴加原生质体培养液洗涤数次-----离心获得原生质体细胞团一筛选、再生杂合细胞。（２）物理法诱导融合 １９７９年Ｓｅｎｄａ等发明了微电极法诱导细胞融合。１９８１年Ｚｉ。。ｍａｎｎ等提出了改进的平行电极法，现简介如下：将双亲本原生质体以适当的溶液悬浮混合后，插入微电极，接通一定的交变电场。原生质体极化后顺着电场排列成紧密接触的珍珠串状。此时瞬间施以适当强度的电脉冲，则使原生质体质膜被击穿而发生融合。电激融合不使用有毒害作用的试剂，作用条件比较温和，而且基本上是同步发生融合。只要条件摸索适当，亦可获得较高的融合率。上述操作实际上是供体与受体原生质体对等融合的方法。由于双方各具几万对基因，要筛选得到符合需要且能稳定传代的杂合细胞是相当困难的。最近，有人提出以Ｘ射线、伽玛射线。纺锤体毒素或染色体浓缩剂等对供体原生质体进行前处理。轻剂量处理可造成染色体不同程度的丢失、失活、断裂和损伤，融合后实现仅有少数染色体甚至是DNA片段的转移；致死量处理后合ｕ可能产生没再仅体万染色体ｗ划她旋余种。利用这种价值不对称融合方法，大大提高了融合体的生存率和可利用率。经过上述融合处理后再生的细胞株将可能出现以下几种类型．2） 亲本双方的细胞核和细胞质能融洽地合为一体，发育成为完全的杂合植株。这种例子不多。3） 融合细胞由一方细胞核与另一方细胞质构成，可能发育为核质异源的植株。亲缘关系越远的物种，某个亲本的染色体被丢失的现象就越严重。 4） 融合细胞由双方胞质及一方核或再附加少量他方染色体或ＤＮＡ片段构成。④原生质体融合后两个细胞核尚未融合时就过早地被新出现的细胞壁分开。以后它们各自分生长成嵌合植株。5、 杂合体的鉴别与筛选双亲本原生质体经融合处理后产生的杂合细胞，一般要经含有渗透压稳定剂的原生质体培养基培养（液体或固体），再生出细胞壁后转移到合适的培养基中。待长出愈伤组织后按常规方法诱导其长芽、生根、成苗。在此过程中可对是否杂合细胞或植株进行鉴别与筛选。 (1) 杂合细胞的显微镜鉴别 根据以下特征可以在显微镜下直接识别杂合细胞：若一方细胞大，另一方细胞小，则大。小细胞融合的就是杂合细胞；若～方细胞基本无色，另一方为绿色，则自绿色结合的细胞是杂合细胞；如果双方原生质体在特殊显微镜下或双方经不同染料着色后可见不同的特征，则可作为识别杂合的标志；发现ｈ述杂合细胞后可借助显微操作仪在显微镜下直接取出，移置再牛培养基培养。（2）以互补法筛选杂合细胞 显微鉴别法虽然比较可信，但实验者有时会受到仪器的限制，工作进度慢且未知其能否存活与个长 遗传互补法则可弥补以上不足。 遗传互补法的前提是获得各种遗传突变细胞株系。白化互补：不同基山叨的白化突变株出aBｘAh，可互补为绿色细胞株AaBb。生长互补：甲细胞株缺外源激素Ａ不能生长，乙细胞株需要提供外源激素Ｂ才能生长，则甲株与乙株融合，杂合细胞在不含激素Ａ、Ｂ的选择培养基上可能生长。抗性互补筛选：假如某个细胞株具某种抗性(抗青霉素)另一个细胞株具另一种抗性（如抗卡那霉素），则它们的杂合株将可在含上述两种抗生素的培养基上再生与分裂。这种筛选方式即所谓的抗性互补筛选。代谢互补筛选：根据碘代乙酚胺能抑制细胞代谢的特点，用它处理受体原生质体，只有融合后的供体细胞质才能使细胞活性得到恢复，等等。 （３）采用细胞与分子生物学的方法鉴别杂合体 经细胞融合后长出的愈伤组织或植株，可进行染色体核型分析、染色体显带分析、同功酶分析以及更为精细的核酸分子杂交、限制性内切酶片段长度多态性（ＲＦＬＰ，见８．２．２．２）和随机扩增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分析，以确定其是否结合了双亲本的遗传素质。（４）根据融合处理后再生长出的植株的形态特征进行鉴别质。

植物细胞原生质体制制备与融合1、原生质体常现的杂交育种由于物种间难以逾越的天然屏障而举步维艰。科学家们受细胞全能性理论及组织培养成功的启示，逐渐将眼光转向细胞融合，试图用这种崭 图3-2新的手段冲破自然界的禁钢。１９３７年michel率先实施植物细胞融合的试验。如何去除坚韧的细胞'接成了牛物学工作者必须解决的首要难题。１９６Ｏ年该领域终于出现了重大突破。由英国诺丁汉大学Cocking教授领导的小组率先利用真菌纤维素酶，成功地制备出了大量具有高度活性可再生的番茄幼根细胞原生质体，开辟了原生质体融合研究的新阶段。植物细胞原生质体是指那些已去除全部细胞壁的细胞。2、原生质体制备（１）取材与除菌 为了让制得的原生质体一般都生活力较强，再生与分生比例较高。常用的外植体包括：种子根。子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。对外植体的除菌要因材而异。悬浮培养细胞一般无需除菌。对较脏的外植体往往要先用肥皂水清洗再以清水洗２～３次，然后浸人 ７０％酒精消毒后，再放进 ３％次氯酸钠处理。最后用无菌水漂洗数次，并用无菌滤纸吸干。（２）酶解 现以叶片为例说明如何制备植物原生质体。①配制酶解反应液：反应液应是一种ＰＨ值在５·５～５·８的缓冲液，内合纤维素酶０．３%～３．０%以及渗透压稳定剂、细胞膜保护剂和表面活性剂等，②酶解：除菌后的叶片 撕去下表皮 切块放人反应液 不时轻摇 (条件25℃～30℃,2～4h)反应液转绿。反应液转绿是酶解成功的一项重要指标，说明已有不少原生质体游离在反应液中。经镜检确认后应及时终止反应，避免脆弱的原生质体受到更多的损害。（３） 分离 在反应液中除了大量的原生质体外，尚有一些残留的组织块和破碎的细胞。为了取得高纯度的原生质体就必需进行原生质体的分离。可选取２００～４００目的不锈钢网或尼龙布ｊ叭ｉ过滤除渣，也可采用低速离心法或比重漂浮法直接获取原生质体。（４） 洗涤刚分离得到的原生质体往往还含有酶及其他不利于原生质体培养。再生的试剂，应以新的渗透压稳定剂或原生质体培养液离心洗涤２～４次。 （5） 鉴定 只有经过鉴定确认已获得原生质体后才能进行下阶段的细胞融合工作。由于已去除全部或大部分细胞壁，此时植物细胞呈圆形。如果把它放人低渗溶液中，则很容易胀破。也。'厂月荧光增白剂染色后置紫外显微镜下观察，残留的细胞壁呈现明显荧光。通过以上观测，基本上可判别是否原生质体及其百分中 此外，尚可借助台盼蓝活细胞染色、胞质环流观察以及测定人、作用、呼吸作用等参数定量检测原生质体的活力。4、 原生质体的融合（1）化学法诱导融合 化学法诱导融合无需贵重仪器，试剂易于得到，因此一直是细胞融合的主要方法。尤其是聚乙二醇（ＰＥＧ）纳合成钙高ｐＨ诱导融合法已成为化学法诱导细胞融合的主流。以下简介此方法（在无菌条件下进行）：按比例混合双亲原生质体-----滴加 ＰＥＧ溶液，摇匀，静置----滴加高钙高ｐＨ值溶液，摇匀，静置-----滴加原生质体培养液洗涤数次-----离心获得原生质体细胞团一筛选、再生杂合细胞。（２）物理法诱导融合 １９７９年Ｓｅｎｄａ等发明了微电极法诱导细胞融合。１９８１年Ｚｉ。。ｍａｎｎ等提出了改进的平行电极法，现简介如下：将双亲本原生质体以适当的溶液悬浮混合后，插入微电极，接通一定的交变电场。原生质体极化后顺着电场排列成紧密接触的珍珠串状。此时瞬间施以适当强度的电脉冲，则使原生质体质膜被击穿而发生融合。电激融合不使用有毒害作用的试剂，作用条件比较温和，而且基本上是同步发生融合。只要条件摸索适当，亦可获得较高的融合率。上述操作实际上是供体与受体原生质体对等融合的方法。由于双方各具几万对基因，要筛选得到符合需要且能稳定传代的杂合细胞是相当困难的。最近，有人提出以Ｘ射线、伽玛射线。纺锤体毒素或染色体浓缩剂等对供体原生质体进行前处理。轻剂量处理可造成染色体不同程度的丢失、失活、断裂和损伤，融合后实现仅有少数染色体甚至是DNA片段的转移；致死量处理后合ｕ可能产生没再仅体万染色体ｗ划她旋余种。利用这种价值不对称融合方法，大大提高了融合体的生存率和可利用率。经过上述融合处理后再生的细胞株将可能出现以下几种类型．2） 亲本双方的细胞核和细胞质能融洽地合为一体，发育成为完全的杂合植株。这种例子不多。3） 融合细胞由一方细胞核与另一方细胞质构成，可能发育为核质异源的植株。亲缘关系越远的物种，某个亲本的染色体被丢失的现象就越严重。 4） 融合细胞由双方胞质及一方核或再附加少量他方染色体或ＤＮＡ片段构成。④原生质体融合后两个细胞核尚未融合时就过早地被新出现的细胞壁分开。以后它们各自分生长成嵌合植株。5、 杂合体的鉴别与筛选双亲本原生质体经融合处理后产生的杂合细胞，一般要经含有渗透压稳定剂的原生质体培养基培养（液体或固体），再生出细胞壁后转移到合适的培养基中。待长出愈伤组织后按常规方法诱导其长芽、生根、成苗。在此过程中可对是否杂合细胞或植株进行鉴别与筛选。 (1) 杂合细胞的显微镜鉴别 根据以下特征可以在显微镜下直接识别杂合细胞：若一方细胞大，另一方细胞小，则大。小细胞融合的就是杂合细胞；若～方细胞基本无色，另一方为绿色，则自绿色结合的细胞是杂合细胞；如果双方原生质体在特殊显微镜下或双方经不同染料着色后可见不同的特征，则可作为识别杂合的标志；发现ｈ述杂合细胞后可借助显微操作仪在显微镜下直接取出，移置再牛培养基培养。（2）以互补法筛选杂合细胞 显微鉴别法虽然比较可信，但实验者有时会受到仪器的限制，工作进度慢且未知其能否存活与个长 遗传互补法则可弥补以上不足。 遗传互补法的前提是获得各种遗传突变细胞株系。白化互补：不同基山叨的白化突变株出aBｘAh，可互补为绿色细胞株AaBb。生长互补：甲细胞株缺外源激素Ａ不能生长，乙细胞株需要提供外源激素Ｂ才能生长，则甲株与乙株融合，杂合细胞在不含激素Ａ、Ｂ的选择培养基上可能生长。抗性互补筛选：假如某个细胞株具某种抗性(抗青霉素)另一个细胞株具另一种抗性（如抗卡那霉素），则它们的杂合株将可在含上述两种抗生素的培养基上再生与分裂。这种筛选方式即所谓的抗性互补筛选。代谢互补筛选：根据碘代乙酚胺能抑制细胞代谢的特点，用它处理受体原生质体，只有融合后的供体细胞质才能使细胞活性得到恢复，等等。 （３）采用细胞与分子生物学的方法鉴别杂合体 经细胞融合后长出的愈伤组织或植株，可进行染色体核型分析、染色体显带分析、同功酶分析以及更为精细的核酸分子杂交、限制性内切酶片段长度多态性（ＲＦＬＰ，见８．２．２．２）和随机扩增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）分析，以确定其是否结合了双亲本的遗传素质。（４）根据融合处理后再生长出的植株的形态特征进行鉴别质。