细胞球图像

GE医疗细胞图像年度竞赛旨在展现细胞之美，并展示全世界细胞生物学家所进行的鼓舞人心的研究，至今已有六年历史。获奖者的参赛细胞图片于4月19日至21日在美国纽约时代广场NBC Universal高清屏幕上播放的特别节目中展示。 2012年，参赛作品第一次分为两个类别，包括高内涵分析和显微镜。GE医疗生命科学部根据15,000名公众投票结果选出三位获奖者，分别为Jane Stout女士（来自美国）、Anushree Balachandran女士（来自澳大利亚）和Markus Posch先生（来自英国）。 \Jane Stout' s Image Microscope winner来自美国印第安纳大学医学院的Stout女士获得了显微镜类第一名，她的图像作品（侧重于癌症）为&ldquo 中期上皮细胞，其中微管染为红色、丝粒染为绿色，DNA染为蓝色&rdquo 。 Anushree Balachandran, the High-Content Analysis winner来自澳大利亚悉尼Genea的Balachandran女士获得了高内涵分析类第一名，她的图像作品（侧重于亨廷顿舞蹈症）为&ldquo 来源于亨廷顿舞蹈症干细胞的少突胶质前体细胞，其中鬼笔环肽染为绿色，粘着斑蛋白染为红色，DNA染为蓝色&rdquo 。 Markus Posch' s image, Regional winner, UK 来自英国邓迪大学基因调控与表达中心的Posch先生是显微镜类地区获奖者，他的图像作品（侧重于癌症）为&ldquo 前中期人子宫颈癌（HeLa）细胞，其中GFP-组蛋白标记的染色体呈蓝色，微管蛋白染为黄色&rdquo 。本次竞赛吸引了100多名研究癌症、HIV和神经退行性疾病等细胞水平疾病的研究人员参与。先由包括五位评判者的专家科学小组确定每个类别的入围作品，然后由公众投票决定获奖作品。GE医疗生命科学部研究与应用市场总经理Eric Roman博士表示：&ldquo 今年的获奖图像与往年一样漂亮、引人注目。这些图像不仅可从美学角度进行欣赏，还提醒我们注意疾病背后的细胞复杂性以及细胞研究为何如此重要。我们感谢向我们发送图像的参赛者、评审小组以及参与投票的每个人。&rdquo 今年的入围作品由以下人员选出：Kristie Nybo博士（BioTechniques助理编辑）；Julian Heath博士（Microscopy & Analysis编辑）；Nick Thomas博士（GE Healthcare首席科学家）；Paul Goodwin博士（GE Healthcare科学主管）；以及上届GE Healthcare细胞图像竞赛获奖者Leslie Caron博士（Genea研究科学家）。

加速简化细胞和基因治疗的研发及制造流程Cellaca® PLX图像式细胞分析仪带来工作流程的革新，一站式满足多个关键质量属性的分析致力于以创新技术打造更健康世界的技术型企业--珀金埃尔默日前推出Cellaca® PLX图像式细胞分析系统，这是业界第一款能让研究人员在单个自动化工作流中实现对细胞样本多个关键质量属性（CQA）进行分析和评估的台式平台，包括对细胞性质、质量和数量的分析评估。拥有尖端技术的Cellaca PLX系统由珀金埃尔默旗下的Nexcelom公司设计，它整合了一流的图像式细胞分析仪的硬件、软件、经验证的耗材和可跟踪的数据报告功能于一体，无需复杂的校准程序或严格的培训要求，即可操作。为了进一步提升客户体验，这一专利解决方案中还使用了来自珀金埃尔默旗下BioLegend公司经验证的抗体试剂盒对试剂方案进行优化。这一新产品可为研究人员提供超越流式细胞术和染色方法的扩展细胞样本CQA分析选项，而这些分析选项历来都需要采用各种不同的仪器和分析方法进行分析。通过这些功能的整合，Cellaca PLX系统能够让研究人员在一台仪器中同时检测多个标记物（多路技术），并通过简单易用的现代化用户界面在短短数秒内即可执行免疫表型分析和细胞活性测定。Cellaca(R) PLX Image Cytometer图像式细胞分析仪珀金埃尔默生命科学事业部高级副总裁Alan Fletcher表示，"制药公司在细胞和基因治疗领域大举投入，然而他们面临的一项重大挑战是如何对复杂的细胞样本进行评估，以满足其研究和制造过程中巨大的科研需求和严苛的法规要求。目前我们仍在对Cellaca PLX Image Cytometer图像式细胞分析平台在治疗领域的应用加以开发，我们预计它对于从事CAR-T细胞治疗研究，简化免疫细胞表型分析的下游流程而言，将具有重大意义。"珀金埃尔默旗下Nexcelom公司是细胞分析领域自动化细胞计数技术和图像式细胞仪产品的领先供应商，其产品包括现有的应用广泛的Cellaca® MX高通量自动化细胞计数仪。有关新平台Cellaca PLX及其它图像式细胞分析仪和试剂的更多资讯，可在11月5日至10日在第五届中国国际进口博览会上了解，珀金埃尔默将在国家会展中心（上海）8.1号馆B4-03展示其生命科学及细胞和基因治疗产品组合的最新创新。

“成像设备运行正常！培养环境控制稳定！细胞生长状态良好！““哈哈，做了两个月预实验的活细胞成像终于成功了，动起来的活细胞可真好看！”等等！好看的图像只是好的开始，花费这么多心血得到的成像数据，你想不想进一步了解这些细胞的分裂/融合关系，运动轨迹，运动速度？这些藏在图像里的数据才是得出实验结论的关键。来来来，蔡司君带你深入解析活细胞动态图像，挖掘藏在图像中的实验结果，让每一个图像物尽其用。想了解从动态活细胞成像中能挖掘哪些有意义的数据，快来参加蔡司arivis图像分析系列网络研讨会之“不止步于图像”——蔡司arivis带您解析活细胞动态数据。会议信息“不止步于图像”——蔡司arivis带您解析活细胞动态数据语言：中文时间：2023年7月12日星期三 | 14：00-15：15主讲人：明倩-蔡司显微镜资深应用专家医学发育生物学硕士，主要负责光学显微镜成像系统的售后培训及产品技术支持，帮助客户解决成像困难，协助客户获取重要的实验数据，在生物光镜和图像数据分析等方面拥有多年丰富经验。会议主要内容：&bull 蔡司arivis图像分析解决方案介绍&bull 蔡司arivis活细胞动态分析案例分析&bull 蔡司arivis活细胞动态分析操作演示扫描二维码报名参会

在看到上面的那组狗狗的照片后，我们通常会根据长相（品种）、毛色、耳朵大小、脸型等特征对它们进行快速地比较和分类。这似乎是人类所擅长的。然而，如果针对狗狗下面那组蛋白质图像进行细胞分析，那显然那不是人眼人脑能胜任的工作；但一种新的人工智能就可以做到。众所周知，细胞功能失调是许多人类疾病的根源，包括心血管疾病、神经退行性疾病、糖尿病和癌症等。因此，解释蛋白质定位的多样性和复杂性对于充分理解细胞结构和功能至关重要。它不仅可以揭示出健康细胞的工作方式；更重要的是，当疾病来临时，它还可以让科学家知道细胞内部发生了什么。2022年7月25日，发表在《Nature Methods》上的一项新研究中，来自陈扎克伯格生物中心（简称CZ Biohub）的研究团队开发了这种名为“Cytoself”的完全自监督的深度学习方法，可以在没有预存知识、类别或注释的情况下从荧光显微镜图像中分类和比较不同的人类蛋白质，从而揭示出高分辨率的蛋白质亚细胞定位图谱。每个细胞包含大约10000种不同类型的蛋白质，它们中的一些单独工作，另一些协同工作以保持细胞健康。蛋白质在细胞中定位的所有可能方式是什么？它可能存在于任何位置，以及位置的各种组合。这是一个最基本的问题。几十年来，生物学家们一直试图建立细胞内蛋白质所有可能的位置和可能的结构。但这一直都是通过人工查看数据的方式来实现的。问题是，人类的局限性和偏见在很大程度上会使这一过程产生瑕疵。Cytoself要比人类做得更好。它可以找到更精细的类别，并在极其精细的图像中看到差异。在旋转的3D UMAP图像中，每个点代表单个蛋白质图像。根据蛋白质定位类别进行着色在这篇论文中，Cytoself不仅展示了机器学习算法的威力，还深入了解了细胞和蛋白质，提供了细胞内蛋白质定位丰富且详细的信息。由于蛋白质的定位与其细胞功能高度相关，因此，Cytoself将是一个宝贵的工具，可以对未知的或研究不多的蛋白质进行初步的功能预测，并定量研究细胞扰动和细胞状态变化对蛋白质亚细胞定位的影响。这将进一步加快细胞生物学的研究进度，并最终用于加速药物发现和药物筛选过程。Cytoself是一个自监督学习的例子，这意味着人类不会像监督式学习那样教授关于蛋白质图像算法的任何内容。在监督学习中，研究人员必须一个例子接一个例子地去教授机器学习算法，这需要大量繁琐枯燥的工作；而且，如果机器仅限于人类训练给它的知识类别，那么它可能会在系统中引入偏差。该研究第一作者Hirofumi Kobayashi说：“我们相信信息已经在图像中了。我们想看看这台人工智能自己能学会什么。”他们发现，Cytoself从图像中提取的信息量着实令人感到惊讶。该研究共同通讯作者Manuel Leonetti说：“蛋白质定位的详细程度比我们想象的要高得多。机器将每个蛋白质图像转换成一个数学向量。然后你可以开始对看起来相同的图像进行排序。我们意识到，Cytoself可以让我们以高特异性预测蛋白质在细胞中的协同作用，这着实令人惊讶。”虽然以前也有一些研究使用了自监督或无监督模型对蛋白质图像进行了研究工作；但该团队表示，能在如此大的数据集上且如此成功地使用自监督学习还是首次。该数据集包含100多万张图像，涵盖了从活体人类细胞中测量的超过1300种蛋白质。这些图像是CZ Biohub开发的OpenCell项目的一部分，该项目旨在创建人类细胞的完整图谱，包括最终描述驱动细胞的20000种左右的蛋白质。与CZ Biohub开发的所有工具一样，cytoself是开源的，所有人都可以使用。该团队望这将激励更多研究人员使用类似的算法来解决自己的图像分析问题。今年早些时候，他们在《Science》上发表了第一批1310种蛋白质的特征，包括每种蛋白质的图像以及它们之间相互作用的映射。Cytoself是OpenCell成功的关键（所有图像可在OpenCell.czbiohub.org上获得），提供了关于蛋白质定位的非常精细和定量的信息。Cytoself团队的下一个目标是如何利用对蛋白质定位的微小变化进行跟踪来识别不同的细胞状态，例如，正常细胞与癌细胞。这可能是更好地了解许多疾病和促进药物发现的关键。Kobayashi说：“药物筛选基本上是试错的过程。但对于Cytoself，这是一个巨大的飞跃，因为你不需要对数千种蛋白质逐一进行实验。这是一种低成本的方法，可以大大提高研究速度。”该团队表示，Cytoself是关于人体细胞如何连接的重要生物学结果。同时，他们还在将该算法应用于新的问题，并且在继续完善人类已知的一切和未知问题。未来，他们会将Cytoself应用于不同类型的图像，从而开辟出更多的可能性。论文链接：https://www.nature.com/articles/s41592-022-01541-zhttps://www.science.org/doi/10.1126/science.abi6983https://opencell.czbiohub.org/

据New Atlas报道，了解细胞和细菌的微观世界非常重要，但要进行详细研究却很困难，尤其是在不伤害受试者的情况下。洛桑联邦理工学院(EPFL)的研究人员现在开发了一种新的显微镜技术，结合了现有的两种技术，使科学家能够建立细胞内部和外部的高清和三维图像。科学家已经开发出很多不同的显微镜成像技术，但它们都有其优点和缺点。电子显微镜可以揭示标本表面的复杂细节，但它不能用于活细胞，因为电子束的强度会破坏样本。其他方法，如荧光显微镜，不会伤害样本，但要以分辨率为代价。因此，对于这项新的研究，EPFL的研究人员从开发他们自己的成像技术开始。它是基于现有的一种叫做扫描探针显微镜（SPM）的技术，用探针尖刺入样品以绘制出其表面。然而，这对细胞是侵入性的，所以EPFL团队用一个玻璃纳米孔取代了这种探针，测量离子的流动而不需要接触样品。他们把这种方法称为扫描离子电导率显微镜（SICM）。该团队将这种新的SICM技术与现有的一种叫做随机光学波动成像的技术结合起来，后者可以窥视细胞内部，观察里面的各种分子和过程。这两种技术结合在一起，使科学家能够同时拍摄细胞内部和外部的高清三维图像。该研究的作者Samuel Mendes Leitão说：“一个细胞的膜是它与周围环境互动的地方。它是许多生物过程和形态变化发生的地方，比如在细胞感染期间。我们的系统让研究人员分析细胞内的分子排列，并绘制出它们与膜动态的关联。”也许最重要的是，他们可以随着时间的推移监测过程，从一秒钟以下到数天的规模。在测试中，该团队能够观察哺乳动物细胞的移动、交流、分化、通过其膜吞噬分子以及被细菌感染。研究人员说，这项新技术将是感染生物学、免疫学和神经生物学的一个非常有用的工具，但也可以在能源科学等其他领域找到用途，以帮助生产太阳能燃料等事情。相关研究成果发表在《ACS Nano》和《自然通讯》杂志上的两篇论文中。

一、项目基本情况项目编号：GZZJ-ZG-2023163项目名称：广医大2023年科研仪器设备购置项目（六）采购方式：公开招标预算金额：7,713,300.00元采购需求：合同包1(低温保存箱等设备):合同包预算金额：2,562,700.00元品目号品目名称采购标的数量（单位）技术规格、参数及要求品目预算(元)最高限价(元)1-1临床检验设备二级生物安全柜（A2型）20(台)详见采购文件1,260,000.00-1-2临床检验设备二级生物安全柜（B2型）13(台)详见采购文件819,000.00-1-3试验箱及气候环境试验设备电热恒温干燥箱7(台)详见采购文件117,600.00-1-4试验箱及气候环境试验设备低温保存箱7(台)详见采购文件171,500.00-1-5试验箱及气候环境试验设备生化培养箱7(台)详见采购文件194,600.00-本合同包不接受联合体投标合同履行期限：合同签订后90个日历日内交货、安装及调试。（不包含质保期）合同包2(常温台式离心机等设备):合同包预算金额：3,395,600.00元品目号品目名称采购标的数量（单位）技术规格、参数及要求品目预算(元)最高限价(元)2-1消毒灭菌设备及器具高压灭菌锅7(台)详见采购文件306,600.00-2-2显微镜普通倒置显微镜7(台)详见采购文件420,000.00-2-3离心机台式冷冻离心机7(台)详见采购文件595,000.00-2-4离心机常温台式离心机7(台)详见采购文件420,000.00-2-5分析仪器辅助装置移液器14(套)详见采购文件142,100.00-2-6试验箱及气候环境试验设备恒温金属浴7(台)详见采购文件24,500.00-2-7试验箱及气候环境试验设备恒温沙浴7(台)详见采购文件22,400.00-2-8试验箱及气候环境试验设备过氧化氢消毒机1(台)详见采购文件265,000.00-2-9显微镜倒置荧光显微镜4(台)详见采购文件1,200,000.00-本合同包不接受联合体投标合同履行期限：合同签订后90个日历日内交货、安装及调试。（不包含质保期）合同包3(直热式二氧化碳培养箱):合同包预算金额：1,755,000.00元品目号品目名称采购标的数量（单位）技术规格、参数及要求品目预算(元)最高限价(元)3-1试验箱及气候环境试验设备直热式二氧化碳培养箱27(台)详见采购文件1,755,000.00-项目编号：GZZJ-ZG-2023164项目名称：广医大2023年科研仪器设备购置项目（三）采购方式：公开招标预算金额：4,490,000.00元采购需求：合同包1(全景组织单细胞识别及图像分析系统等设备):合同包预算金额：2,990,000.00元品目号品目名称采购标的数量（单位）技术规格、参数及要求品目预算(元)最高限价(元)1-1其他分析仪器全景组织单细胞识别及图像分析系统1(套)详见采购文件2,590,000.00-1-2临床检验设备石蜡切片机1(台)详见采购文件400,000.00-本合同包不接受联合体投标合同履行期限：合同签订后90个 日历日内交货、安装及调试。（不包含质保期）合同包2(全自动数字玻片扫描系统):合同包预算金额：1,500,000.00元品目号品目名称采购标的数量（单位）技术规格、参数及要求品目预算(元)最高限价(元)2-1其他分析仪器全自动数字玻片扫描系统1(套)详见采购文件1,500,000.00-本合同包不接受联合体投标合同履行期限：合同签订后90个 日历日内交货、安装及调试。（不包含质保期）二、获取招标文件时间： 2023年05月06日 至 2023年05月25日 ，每天上午 00:00:00 至 12:00:00 ，下午 12:00:00 至 23:59:59 （北京时间,法定节假日除外）地点：广东省政府采购网https://gdgpo.czt.gd.gov.cn/方式：在线获取售价： 免费获取三、对本次招标提出询问，请按以下方式联系。1.采购人信息名 称：广州医科大学地 址：广州市番禺区新造镇新造路1号联系方式：371031322.采购代理机构信息名 称：广州中经招标有限公司地 址：广州市越秀区寺右一马路18号泰恒大厦14楼1409室联系方式：020-873851513.项目联系方式项目联系人：陈秀洁电 话：020-87385151

瑞典皇家理工学院的研究人员最近发表的研究表明，利用新的荧光显微镜技术，生成了世界上第一个完整的活细胞中分子的纳米级三维图像，显示了脑海马神经元中蛋白质的近分子尺度图像。这种技术被称为3-D pRESOLFT，可以在比电子显微镜更大的范围内观察蛋白质，可以在不杀死细胞和破坏切片的情况下实现它。在以往的荧光显微镜中，可见光照射到用荧光染料染色的细胞和组织，但该方法仅限于制作二维图像，通常分辨率较低。3-D pRESOLFT通过使用包含可切换的荧光染料的干涉图案的组合，可以像光开关那样一边切换接通和断开一边记录大量的平行图像。 整个样品暴露在少光下，防止样品褪色。研究人员发现，观察精度缩小到50纳米，比人类头发小20000倍，用这种正确的方法在三维空间观察活细胞的能力可以研究蛋白质是如何重要但鲜为人知的生理过程。

日前，珀金埃尔默宣布推出Signals Image Artist™ 软件，这是一款新一代的图像分析和管理平台，用于药物开发研究，旨在帮助科学家在数小时内（而非数天或数周）准确处理和分析高内涵筛选（HCS）和细胞成像数据，以快速制订更智慧的决策。Signals Image Artist™ 是珀金埃尔默Signals™ 信息科学组合方案中的领先产品。Signals Image Artist™ 专为满足药物开发实验室的大数据处理需求而设计，包括3D细胞图像、表型图像以及细胞全景绘制图像的大数据处理。其用户界面直观，无需复杂的用户培训，软件支持多用户同时处理、分析、共享、存储信息，且不影响性能。软件提供云配置和内部配置选项，可扩展存储容量，以适应实验室需求变化。此款软件是珀金埃尔默的高内涵筛选（HCS）工作流解决方案的有力补充，该解决方案涵盖：Opera Phenix Plus、Operetta CLS 高内涵筛选系统、PhenoVue™ 试剂、PhenoPlate™ 微孔板、自动化和Signals VitroVivo™ 。通过Signals Image Artist™ 的预构整合，Signals VitroVivo™ 平台的用户可以无缝传送高内涵筛选试验数据，用于二次分析，如支持机器学习的聚类和统计分析。整合还可帮助科学家了解候选药物的时间序列、潜在治疗方案和表型变化，支持共享结果和相关工作流程。此外，Signals Image Artist™ 与当今市场上的所有主要高内涵筛选系统和细胞成像系统兼容，适用于配备了多厂商设备的实验室。珀金埃尔默生命科学业务高级副总裁Alan Fletcher表示：“如今，随着生理相关模型的应用，以及细胞全景绘制和表型筛选方法的日益增加，药物研发实验室会生成大量的图像数据，以降低临床实验失败率。我们的Signals Image Artist™ 平台可大幅加快图像处理进程、快速生成准确数据、简化并加速协作，以帮助药物研发人员更高效、更有效地开发新型候选药物。“珀金埃尔默公司的高内涵筛选解决方案是其生命科学和药物研发全方位组合方案的一部分。更多信息，请访问关于珀金埃尔默珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决最棘手的科学和医疗难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在全球，我们拥有约15000名专业技术人员，服务于190个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2020年，珀金埃尔默年营收达到约38亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。了解更多有关珀金埃尔默的信息，请访问www.perkinelmer.com.cn

细胞是跨越了至少四个数量级的、复杂而精妙的模块化系统【1】。对细胞内模块化系统的刻画主要有两种方式，一是蛋白质荧光成像，一是蛋白质生物物理特性，这两种方面的技术可以产生大量的数据，但是这两种方式所产生的数据库具有不同的质量和分辨率，通常需要分别进行处理。那如何将两种方式的优点进行同时整合呢？近日，美国加州大学圣地亚哥分校Trey Ideker研究组（第一作者为博士生秦越）与瑞典皇家理工学院以及斯坦福大学Emma Lundberg研究组合作发文题为A multi-scale map of cell structure fusing protein images and interactions，将来自于人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas）【2】的免疫荧光图像与BioPlex数据库【3】中亲和纯化结果进行整合，构建了多维度细胞整合图谱MuSIC1.0（Multi-scale integrated cell），对人类细胞中的结构层次进行了统一化的分析，从而解析出69个亚细胞系统，为整合各种各样不同类型的数据来创建全蛋白细胞模型铺平了道路。真核细胞由多种大的组分组成，比如细胞器、凝聚体或者蛋白质复合体，从而形成一个多维度的结构。人类蛋白图谱系统性地对人类细胞中蛋白质在亚细胞结构中定位进行了全面解析，与此同时质谱与亲和纯化（Mass spectrometry combined with affinity purification， AP-MS）技术将临近标记引入蛋白质组学探究之中，从而能够快速检测蛋白和蛋白之间的相互作用。因此，如果能将蛋白质成像与生物物理之间的关联结合起来，便可以对细胞结果进行更进一步地解析。为此，作者们构建了一种机器学习方法，可以将蛋白质成像与生物物理特性进行关联和集成，从而构建一个亚细胞结构组成组分的统一图谱。图1 蛋白质成像与AP-MS数据库整合策略首先，作者们使用深度神经网络（Deep neural network，DNN）对蛋白质图像与相互作用数据进行整合，确定每个平台中蛋白质的坐标，对蛋白质之间的距离进行校准和组合，从而确认在不同维度下蛋白质复合体的组装方式（图1）。这两个全方位的数据库均来自HEK293细胞。作者们对蛋白质配对之间的相互作用距离进行检测，举例来说，来自蛋白质复合体中的蛋白之间相互作用距离少于20nm，而细胞器中的蛋白质之间距离可能会超过1μm。作者们分析了661个蛋白质之间的所有距离，以识别相互接近的蛋白质组分。随着距离的变化，能够产生一个蛋白质多维度结构层次图谱（图2）。由此，作者们发现所构建的MuSIC系统能够以很广的范围对生物系统内的蛋白质相互作用进行测量和捕捉。图2 结构层次图谱建立和检测的流程在建立起该整合图谱后，作者们希望对MuSIC系统进行一个全局性的评估。MuSIC图谱中有370个蛋白以前未在AP-MS实验中用于亲和标记进行相互作用因子的钓取。因此，作者们对134个猎物蛋白进行标记进行AP-MS实验，从而检测到339个相互作用配对，进而对该整合图谱的准确性进行了全面的验证。在MuSIC发现的全新的亚细胞系统中，有一个由七个蛋白质复合体组成的直径估计为81nm的系统，作者们将此系统命名为前体核糖体RNA加工组装复合体（Pre-ribosomal RNA processing assembly，PRRPA）。为了对PRRPA复合体在前体rRNA加工中的作用进行确认，作者们使用siRNA对每个蛋白进行了敲降，发现所有的敲降都会一定程度上破坏核糖体RNA的成熟。另外，作者们使用RNA免疫共沉淀定量qPCR对这些蛋白结合45S前体rRNA的能力进行检测，再次证明了这些蛋白质在前体rRNA加工过程中的作用。同时作者们发现所建立的MuSIC系统也可以对一些蛋白质的功能进行更为全面的认识，包括发现已知蛋白的全新功能和未知蛋白的潜在功能。总的来说，该工作通过汲取蛋白质荧光成像与蛋白质生物物理特性两方面之长构建了多尺度细胞整合图谱MuSIC 1.0，进一步地提高了现有蛋白质荧光图像中信息的分辨率，也为蛋白质相互作用提供了空间维度的信息，为人类细胞中蛋白质组研究提供了更为全面的认识。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-021-04115-9

随着组织工程领域的发展，生物材料界面与细胞的相互作用及物理机制成为研究热点。生物界面的拓扑形貌可以有效调控细胞行为并影响细胞功能。而体内的一些生理过程如胚胎发育、免疫应答和组织更新与重塑等往往涉及多细胞的集体行为。肿瘤的侵袭和转移也与集体细胞的协调运动有关。细胞球作为一种体外三维细胞培养模型，具有强烈的细胞-细胞相互作用，可在细胞生理学、信号通路、基因和蛋白表达以及气体/营养物质梯度等方面更好地模拟体内环境。因此，明确材料表面拓扑结构与细胞球的相互作用对探究体内生理、病理机制具有重要意义。然而，当前同时具有厘米级尺度和微纳米精度的跨尺度微纳拓扑结构尚难以快速制备。 　　近日，中国科学院理化技术研究所仿生智能界面科学中心有机纳米光子学实验室研究员郑美玲团队在跨尺度微纳拓扑结构制备及细胞球浸润性调控方面取得了新进展。该团队提出采用飞秒激光无掩膜投影光刻技术（MOPL）制备大面积兼具高精度的微盘阵列拓扑结构以研究细胞球的浸润性。该研究发现细胞球在多种不同单元直径的微盘阵列拓扑结构上展示出不同的浸润速度。研究通过分析细胞形态、骨架分布和细胞黏附，解析了细胞球浸润速度的变化机制，并发现了细胞球在大尺寸和小尺寸的微盘结构单元上采取不同的浸润模式。该研究揭示了细胞球对跨尺度微纳拓扑结构的响应机制，为探讨组织浸润行为提供了参考。 　　MOPL是一种高效率且能灵活化地制备微纳拓扑结构的技术。考虑到单个细胞的尺寸以及细胞球浸润过程中与大面积拓扑结构的相互作用，该工作利用MOPL技术制备了高度低于1μm，且拓扑单元直径分别为2、5、20和50 μm的大面积（8 mm × 10 mm）微盘阵列结构（图1）。 　　该研究采用超低吸附法制备了大小均一的人肾透明细胞癌细胞的细胞球。进一步，科研人员利用激光扫描共聚焦荧光显微镜对细胞球在微盘阵列拓扑结构上的动态浸润行为进行观察。细胞球在一系列微盘阵列拓扑结构上发生了完全浸润并展现出不同的浸润面积。结合细胞球铺展理论，通过量化不同时间点的细胞球浸润面积，研究发现细胞球的浸润速度在2、5、50和20 μm直径的微盘结构单元上依次减小，且细胞球在直径为20 μm的微盘结构单元上具有较小的细胞-基底黏附能（图2）。 　　进一步地，研究人员利用免疫荧光染色分析了多种不同微盘结构上的细胞形态、肌动蛋白和黏着斑分布，提出了细胞球在直径2μm和5 μm的小尺寸的微盘结构上采取攀爬模式浸润，以及在直径20μm和50 μm的较大尺寸的微盘结构上采取绕行模式浸润（图3）。细胞球的浸润过程表现为一种多细胞的集体协调运动。 　　该研究揭示了细胞球在各向同性微盘阵列拓扑结构表面的浸润机制，深化了对于细胞球与界面拓扑结构相互作用的认知。本工作是飞秒激光面投影纳米光刻技术及应用的拓展。相关研究成果发表在Small上。研究工作得到国家重点研发计划“纳米科技”重点专项、国家自然科学面上基金项目和中科院国际伙伴计划等的支持。

肿瘤干细胞（CSC）除了具有高度致瘤性、无限的增殖潜力和产生恶性肿瘤的能力外，还在肿瘤转移和治疗后原发肿瘤的再增殖中发挥作用，更可以抵抗传统的化疗以及更现代的靶向治疗，CSC的这些特性使得开发治疗恶性肿瘤的有效疗法变得复杂。克隆形成试验作为CSC功能研究的一个标准，通过检测CSC形成克隆的能力，既可以评估其干性，也可以对后续的放化疗进行个性化的用药指导，但是目前对CSC的克隆表征进行高通量筛选还存在，考虑到CSC的复杂性及其临床相关性，需要有更高效的方法来对CSC的克隆表征进行高通量筛选分析，并在此基础并开发更有效地针对这些人群的药物或其他疗法。Advanced High-Content-Screening Applications of Clonogenicity in Cancer一文就提出了一种运用高内涵系统来量化2D和3D细胞培养模型中CSC克隆数量、大小和形态，并基于荧光标记区分克隆的高通量方法。图一：2D培养模式下用化合物61预处理的SW620细胞克隆图像，全实验组克隆计数、平均表面积和全孔融合率定量分析在2D培养模式中，使用极限稀释法将SW620结直肠癌细胞从2500个细胞/孔稀释至1个细胞/孔，并配合不同化合物处理，在培养的第8天对细胞进行核染色。结合明场与Hoechst 33342染色图像，对细胞形成的克隆数量、面积和融合度进行了分析，数据显示SW620细胞的克隆形成对TOP2A抑制剂（化合物61）的处理呈现出浓度依赖性反应，并且不同处理方式（预处理VS.连续处理）克隆的生长情况也有所不同。图二：3D培养模式中SW620细胞克隆的计数和形态学分析在3D培养模式中，采用同样的方法对SW620细胞（混于基质胶中）进行稀释，从40000个细胞/400μl稀释至约1248个细胞/200μl，并以50μl/孔接种于96孔培养板中，培养到第7-10天时同样对细胞进行核染色（Hoechst 33342）并使用高内涵系统对样品进行3D成像和分析，结果显示与2500个细胞相比，在5000个铺板细胞上观察到的克隆数量增加了一倍以上，而克隆表面积和体积则保持相对一致。图三：3D培养模式中A549细胞克隆的形态学分析为了评估这一体系在不同种类、不同形态的肿瘤细胞中的适用性，研究中还用A549肺癌细胞进行了验证，形态学进行分析发现A549细胞球长成了两种不同典型形态的克隆—“圆形”、“分支”，随后用高内涵分析软件对这两种细胞球的体积、表面积、椭球轴（长度、短轴与长轴之比、中轴长度、最短轴长度、倾斜度和方向）、球度和最大厚度等形态学参数进行定量，这些结果表明A549细胞可能含有两种不同的CSC亚群。图四：2D培养SW620克隆中CD44和CD24的免疫荧光染而对CSCs的细胞表面标志物（高CD44 ，低CD24）进行图像分析后发现，CD24表达在所有细胞接种浓度下不变，CD44表达随着细胞数量的减少而增加，CD44high/CD24low在细胞中的表达与其干细胞潜能一致。对比只分析膜区域的荧光强度和全细胞区域分析的结果其表达趋势是相似的。本文中介绍的工作概述了克隆形成集落的2D和3D分析的方法、算法和工作流程，可广泛适用于其他HCS仪器和成像分割软件。这些高内涵技术可用于研究促进CSC干性的复杂机制，但也可广泛用于其他药物的发现，以及评估小分子药物、生物制剂和放射治疗的治疗潜力。高内涵系统的智能预扫功能允许灵活地执行初始低倍镜大范围扫描以定位感兴趣的克隆，并自动以更高的放大倍数仅对所需克隆的XYZ位置进行重新扫描。在大量样本中定位研究人员感兴趣的特殊对象大大减少了使用整个成像过程所需的时间。参考文献Esquer H , Zhou Q , Abraham A D , et al. Advanced High-Content-Screening Applications of Clonogenicity in Cancer[J]. SLAS DISCOVERY Advancing the Science of Drug Discovery, 2020

据美国物理学家组织网近日报道，最近，加拿大英属哥伦比亚大学与英属哥伦比亚癌症研究所、转化与应用基因组学中心合作，开发出一种硅酮材料的芯片实验室技术，能让每个细胞像弹球机里的球一样各就各位，然后进行基因检测。这种“单细胞基因分析”技术使基因检测更加灵敏迅速，有助于肿瘤分析和临床疾病的诊断。本周出版的《美国国家科学院院刊》对该芯片实验室进行了详细介绍。　　这种芯片实验室大小跟一个9伏电池相当，能同时分析300个细胞。研究人员设计了一种路线，用液体载运细胞通过显微管道和一个个小阀门，当细胞挨个进入各自的小空位时，它们的RNA就会被提取出来，经过复制用于进一步分析。　　标准基因检测要求使用大量细胞，才能得出由上千万不同细胞平均化以后的“综合图像”，这会掩盖细胞的真实属性和它们之间的相互作用。“这就好比用混合水果慕丝来研究草莓和树莓为什么不一样。”领导该研究的高通量生物中心副教授卡尔汉森介绍说，而单细胞分析正在成为基因研究中的黄金手段，因为即使是从同一肿瘤组织中采集的样本，也包含了正常细胞和多种癌细胞类型，而单细胞分析显出极微小的差异。　　此外，这种芯片实验室几乎将所有细胞分析过程整合在了一起，不仅能分离细胞，还能用化学试剂将细胞混合起来，通过检测反应过程中的荧光发射获得它们的基因编码。所有这些都能在芯片上完成，不仅操作简单，而且成本效益高。

主题：如何做好3D细胞球培养及提高成像分析技能？日期：2018年12月18日 周二时间：上午 10:00-11:00感兴趣的朋友请扫描下方二维码立即报名！背景：3D细胞培养技术是最近10年左右才出现的新的细胞生物学实验技术，其实体结构以及细胞间更加紧密的联系，加之接近于真实组织结构的先天优势，使其更加适合于生命科学的研究和药物的开发、筛选。随着3D细胞培养技术的发展，相继出现了大量的新方法，如类组织、类器官的研究以及相关的临床应用，这些都是以常规的3D细胞球技术为基础。本次介绍基于3D细胞球培养技术的基本方法，介绍3D细胞球的获得方法，以及如何能够准确有效地获取3D细胞球内的信息。本次讲堂将介绍：● 3D细胞球与传统的2D细胞培养的差异● 3D细胞球的培养方式● 3D细胞球标记过程中的注意事项● 3D细胞球的成像方式● Molecular Devices 公司 ImageXpress Micro高内涵成像系统对于3D细胞球实验的独特解决之道主讲人简介：周旋 技术支持经理 美谷分子仪器（上海）有限公司10年多来一直从事于显微成像及高内涵成像的应用技术工作，熟悉目前各种细胞学成像技术，包括共聚焦、双光子、超分辨以及Light Sheet等。希望能够为广大科研工作者提供帮助。

当地时间10月7日，瑞典卡罗琳医学院宣布，授予威廉凯林(William G. Kaelin Jr)、彼得拉特克利夫(Sir Peter J. Ratcliffe)及格雷格塞门扎(Gregg L. Semenza)诺贝尔生理学或医学奖，以表彰他们在“发现细胞如何感知和适应氧气供应”领域的卓越贡献。我们都知道，这次诺奖的核心发现就是围绕HIF-1（低氧诱导因子）这条信号通路，小编在这里不再赘述这条通路伟大而精妙的丰富内核，而要强调的是，人类的多种疾病都和常氧/低氧的调节有关，比如恶性肿瘤，肾性贫血，损伤修复，循环障碍疾病等，这次的三位诺奖得主已经为我们发现并阐明了生物体启动氧感知的重要钥匙，而仍然有太多未知的关键节点等待同道中人去探索发现。常用的方法包括体外化学模拟和体外物理模拟，说白了就是给细胞加工具药物（例如CoCl2）或者是低氧环境培养。对于有些细胞模型或研究方向来说，低氧环境培养是必不可少的，然而往往很多实验室的低氧培养设备和其他检测设备是分家的，或者甚至缺少低氧培养的相关设备，给许多实验设计造成了不大不小的困扰。点点点点一下嘛解决方案靠谱的隆重介绍所以Cytation & Lionheart氧浓度可调节活细胞检测系统上图便是能够便捷控制CO2和O2的气体控制装置，在面板上可以方便设定CO2和O2的浓度范围，比如上图，O2的浓度已经从常规的20%降低到5%。是不是惊讶于她的轻盈体型？咱们就是这么节约空间资源有木有！当然，作为控制器，是需要和咱们的核心检测设备Cytation或Lionheart搭载使用的，这样就能够完美实现低氧环境控制和灵活多样的活细胞检测同步进行（传送门）。新鲜小案例：研究一下3D细胞球的缺氧变化此前我们已经介绍过非常多的3D细胞的应用案例，由于3D细胞能够更好地模拟体内细胞的微环境，因此针对3D细胞培养的缺氧水平下的研究需求也是非常多的。11个小时内，人源肝细胞球内的低氧水平逐渐增加（Cyto-ID Hypoxia 染料用于标记细胞内缺氧水平，红色荧光信号增加，表示细胞低氧状态加剧） 请向后滑动_____通过Gen5软件的细胞圈选识别，可以对Cyto-ID标记的细胞缺氧信号定量分析。_____这个图展示了不同的分析方式下的信号倍比变化，数据说明一切，咱们还是需要选择对合适的分析方法__________使用低亲和力球形96板 ，能够快速的构建3D细胞模型（相关案例传送门），接入CO2和N2后，通过气体控制装置设定CO2条件5%，氧气条件8%，放入细胞培养板，即可在长时间内实时监测细胞球的形态或其他需要检测的指标。来自霍普金斯医学院的案例Dr. Gilkes团队的主要研究方向是低氧和乳腺癌的相关研究，2019年他们的一篇文章中通过3D组织细胞培养，阐述了低氧可激活RhoB的表达与活性，并且RhoB在乳腺癌的转移过程中发挥了复杂而关键的作用。首先，Dr. Gilkes团队在分子水平，研究了多种乳腺癌细胞系在低氧（1%）培养条件下的HIF-1和RohB的mRNA水平及蛋白水平的表达变化，在发现显著差异后，当然是要研究一下这个关键的RohB在活细胞水平，特别是3D细胞培养模型中， 如何影响肿瘤细胞的表型变化，于是，Cytation和Lionheart就发挥了重，要，作，用啦。比如，使用LionheartFX连续16小时检测基质胶3D结构中的MDA‐MB‐231亚克隆细胞的迁移运动情况，评价不同RohB的表达量对细胞迁移的影响。16个小时，每隔2分钟拍照一次，然后软件合成视频，可以看出细胞的迁移运动情况，这个gif图是未处理的亚细胞克隆迁移情况。（请向后滑动）__________另外，作者团队构建了3D细胞球的低氧培养模型，用于更深入的研究RohB对肿瘤细胞的迁移及侵袭能力的影响。这里恰好又使用了Cytation5的1%低氧及常氧培养系统，使用了针对3D细胞成像的Z-Stack模式。3D细胞球在基质胶内的侵袭情况及定量统计。（请向后滑动）_______________在整体动物水平，Dr. Gilkes团队通过构建不同RohB表达量的患瘤小鼠模型，通过不同组织的HK2基因表达评估及免疫组化、HE染色等病理学评估，研究了RohB对于肿瘤病灶的生长和迁移的影响。其中大量的免疫组化及HE染色成像均由LionheartFX完成。有趣的是，研究结果发现RhoB对于肿瘤的生长和转移并非单一单向的作用，而是较为复杂的双向作用。肝脏组织切片免疫组化对RhoB的表达定量检测，以及HE染色观察肿瘤转移病灶。（请向后滑动）_____小鼠淋巴结组织切片的波性蛋白免疫组化，波形蛋白是肿瘤进展过程中的重要指标_______________到这里，我们可以看到，搭载了低氧活细胞培养的Cytation&LionheartFX细胞成像系统，可以从分子、3D细胞到整体动物水平帮助研究者获得多种多样的实验结果，其操作便捷性及提供数据的广泛性均极为出色。说到这，小编都有点嫉妒Dr. Gilkes团队的学生了，毕竟曾经的小编想做活细胞实验都是奢望呀，更何况是低氧模型的细胞追踪啦~其实，低氧和氧感知研究还涉及到更多的实验类型，比如氧耗速率检测、氧应激检测、血管生成检测、信号通路研究相关检测、药物筛选方案等等，基于Cytation和Lionheart的图像采集、分析系统在这些领域都积累了丰富的应用，如果有感兴趣的童鞋可以随时和我们联系，或者持续关注我们的后续更新~

前言 随着人类对生物学领域深入探索和科技创新的不断发展，目前越来越多的研究院所和生物制药公司将细胞水平的功能性研究、模型建立及药物筛选做为一个重要的研究/研发手段。而高内涵成像分析系统就为这种细胞水平的研究提供了集高分辨率、自动化、智能化及海量信息为一体的新的检测平台。干细胞（stem cells）是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体干细胞。正是干细胞的这种特性，为细胞生物学的研究提供了更有力的永生化的稳定细胞株。干细胞水平的研究比在普通的细胞株提供了更接近临床相关性的生理学信息；并且比原代细胞相比更容易获得，且具有更好的实验重复性。 干细胞的研究与其他细胞水平的研究有一些相似之处，但其关键的不同点在于在干细胞的研究过程中干细胞的分化。干细胞水平的实验比传统的单线性/单参数的实验具有更多的检测目标，包括其分化能力、分化过程、分化类型及不同类型的量化分析统计等。高内涵成像分析系统以其自身的高分辨率、多参数及智能化分析的特性，恰如其分的满足了干细胞研究的以上需求，而高内涵成像系统的自动化和高通量的特点又以海量的有效数据加速了该研究的过程。 利用高内涵成像分析系统可完成干细胞研究的自动化图像获取及多参数分析，目前常用的全能性干细胞分化研究主要有三类：造血细胞、神经细胞和诱导型多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPS）来源的心肌细胞（图1）。图1：全能干细胞分化层次图应用实例1． 神经祖细胞向神经球分化研究冷藏保存的神经祖细胞（StemCell Technologies, mouse Cells）培养在6孔板内，在培养基中加入不同的生长因子，培养6天后通过ImageXpress Micro对每孔内神经球进行无标记相差成像，并对的神经球的面积进行自动化定量分析。结果如下（图2）： 图2：神经球无标记检测及分析（ImageXpress Micro 20X 相差物镜）2． 神经干细胞向神经元及胶质细胞分化研究神经干细胞在加有EGF（表皮生长因子）和bFGF（成纤维细胞生长因子）的培养基中培养1-2天，然后在分化培养基中培养12-14天。加入EPO（促红细胞生成素）后，检测为神经球向神经元及胶质细胞的分化情况。ImageXpress Micro进行自动化图像获取，运用细胞分类（Cell Scoring）模块进行神经元/胶质细胞阳性率分析，运用神经生长（Neurite Outgrowth）模块进行神经元突触长度及数量分析。结果如下（图3）：图3：神经干细胞分化检测及分析。图（上）表示加入（左）及不加（右）神经细胞的分化图片；图（下）表示不同条件下神经元细胞的阳性率（左）及神经元突出的长度（右）。（ImageXpress Micro 20X物镜）3． 造血祖细胞向骨髓细胞及血细胞分化研究人源CD34+造血祖细胞培养在96孔板中，加入多种不同的造血细胞因子组合（SCF+Flk3+TPO/SCF+IL-3+GM-SCF）后，通过检测CD45和CD15两种标记物在细胞内的表达量，统计分析不同造血细胞因子组合对造血祖细胞的自我更新能力及骨髓细胞分化能力的变化。结果如下（图4）：图4：检测细胞内CD45和CD15的阳性率，评价造血祖细胞在不同条件下的自我更新能力及定向分化能力4． 诱导型多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPS）向心肌细胞分化研究iPS细胞（Celprogen）在专用培养基中培养3-7天，同时检测7种不同标志物的表达量，以判断心肌细胞分化及成熟的状态。下图（图5）中显示Oct4（干细胞标记物）和a-Actinin（心肌细胞标志物）在细胞内的表达情况：图5：iPS细胞分化情况（ImageXpress Micro 20X 物镜）5． iPS细胞来源的心肌细胞跳动实验临床前安全性评价是药物研发过程中非常重要的环节，早期的心脏毒理学研究将会大大降低在进入临床研究阶段后因药物毒性带来的投入风险。iPS细胞来源的心肌细胞跳动实验为药物心脏毒性评价提供了一个高效的体外细胞水平的检测方法。心脏跳动可通过传统电生理的方法来检测，用高内涵成像分析系统来进行检测及分析是一个全新的挑战。Molecular Devices公司最近一代的高内涵成像分析系统ImageXpress Micro XL以其最新一代的检测器sCMOS（采样频率可达100pfs）和自定义模块分析功能，完全可出色完成心肌细胞跳动实验的快速检测及分析要求。iPS细胞来源的心肌细胞单层培养在96或384孔板中，心肌细胞会自发跳动同步收缩。加入Calcein-AM染料孵育10min后，撤掉培养基，再加入不同浓度的化合物，置于ImageXpress Micro XL活细胞培养装置中，检测心肌细胞跳动频率的变化。结果如下（图6）：图6：iPS细胞来源的心肌细胞跳动实验（ImageXpress Micro XL 20X 物镜）总结 干细胞研究作为一种复杂的细胞水平检测模型，需对干细胞的生长、增殖、分化能力、分化类型及状态等多种参数进行检测及定量分析，为疾病治疗研究及药物研发提供了更有效的研究手段。Molecular Devices公司的ImageXpress高内涵系统提供了集高分辨率、自动化、智能化及海量信息为一体高内涵成像分析系统完全解决方案，可满足以上研究需求（图7）。图7：Molecular Devices公司针对干细胞研究的高内涵成像系统完全解决方案

p style="text-indent: 2em "从二十世纪八十年代至今，世界上生产流式细胞仪的厂家几经变迁，BC & BD仍在，新玩家不断进入，并购重组各取所需，它们生产各种不同性能和功能的流式细胞仪。总体而言，呈现出以下的发展趋势：br//pp　　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "1. 应用对象从细胞到颗粒/span/strong/pp　　一般而言，流式细胞仪检测的对象是细胞，而且是呈独立状态的悬浮于液体中的细胞，即单细胞悬液。组织和器官中的细胞，必须用各种方法制备成单细胞悬液，才能进行检测。/pp　　细菌、浮游生物等也可以用流式细胞仪分析。/pp　　一些不是细胞的单个粒子，如病毒、细胞核、染色体、原生质体等也是流式细胞仪的检测对象。实际上，用“颗粒”而不仅仅是“细胞”来定义流式细胞仪的检测对象，显然更有代表意义。/pp　　因为流式细胞仪可以将“颗粒”视同为“细胞”来进行检测，在特制的微球上包被抗原，抗体或核酸探针，以微球为载体来检测各种可溶性蛋白、细胞因子、自身抗体、特定的核酸序列等，从而使流式细胞仪的检测对象扩展到分子范围。/pp　　Luminex公司的多重流式检测平台能够自一个微量反应孔中同时检测50、100甚至多达500种分析物，俨然成为这一技术的金标准。/pp　　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "2. 检测颗粒尺度大大拓宽/span/strong/pp　　常规流式细胞仪检测颗粒的范围为0.5-50μm。/pp　　电荷分选流式细胞仪检测颗粒范围与喷嘴直径等相关，最大应到喷嘴直径的1/3-1/2，目前最大直径的喷嘴为200μm。/pp　　Union Biometrica公司的气流分选平台COPAS FP和BioSorter能够适应大到1500μm的颗粒，可以用于分选模式动物的卵和幼虫 模式植物种子与花粉 大体积细胞与细胞簇等。CytoBuoy公司的Cytosense也可以到1500μm。　　/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/aca8ce15-8bb8-42f4-8863-4675f7724835.jpg" title="01.jpg" alt="01.jpg" width="381" height="417" style="width: 381px height: 417px "//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(127, 127, 127) "Union Biometrica公司气流分选流式原理图/span/pp　　通过光路优化，采用多角度光散射，使用特殊荧光探针，甚至加装紫色激光收集散射光信号，有些流式细胞仪可以实现0.2μm颗粒与噪音信号的鉴别。/pp　　Apogee着力于微颗粒分析，其A50-Micro plus散射光的检测低限至80nm，可用于循环微粒，外泌体及特殊微生物检测。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/28e29df6-ee87-449c-b362-20f9785b26ec.jpg" title="02.jpg" alt="02.jpg" width="311" height="320" style="width: 311px height: 320px "//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(127, 127, 127) "Apogee A50-Micro plus/span/pp　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "　3.多种流路技术商品化/span/strong/pp　　绝大多数流式细胞仪基于鞘液流体动力学模式。/pp　　因为负压进样省去了庞大的压缩气源，可以灵活使用各种上样管，已经成为几乎所有公司新仪器的选择。/pp　　一般认为，流式细胞仪采用毛细管而非鞘液，容易被大的细胞或聚集细胞所阻塞，而且流动细胞难以准确聚焦，流速难以维持恒定。/pp　　Guava平台easyCyte(现被Luminex公司收购)通过负压进样，采用高压注射泵与PEEK管路，建立自稳流的微毛细管系统，据称解决了以上困扰，带来的好处是无需鞘液，产生废液也少。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/bebe5684-49c2-419d-aa5c-e4fc9f47041a.jpg" title="03.jpg" alt="03.jpg"//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(127, 127, 127) "Guava easyCyte(Luminex)/span/pp　　Thermo公司声波流式细胞仪Attune NxT ，该产品利用超声波将细胞聚集在样品流中轴线上。进样速度至1mL/min时，也可以避免基于鞘液的流式的所谓轴流加宽和细胞分散现象，这一技术的最大优势是快速检测，同时对稀有细胞的分析比较有利。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/407f47e9-043f-4bea-a5ab-dcd240aebc70.jpg" title="04.jpg" alt="04.jpg"//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(127, 127, 127) "Thermo Attune NxT/span/pp　　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "4.从相对计数到直接绝对计数/span/strong/pp　　为满足统计学要求，流式细胞仪必须采集一定数量的细胞，仪器设定以细胞数为停止条件。传统流式细胞仪测试结果为相对计数，即目标细胞在某一总体系中的比值。/pp　　随着应用深入，人们发现比值的变或者不变，以及变化大小不能反映细胞的真实变化，绝对计数，即单位体积内的细胞数被证明更具实际价值。/pp　　最早是采用双平台法来解决以上问题，即用血细胞分析仪来获得白细胞，淋巴细胞等浓度，再结合流式细胞仪测定的百分比来计算被测细胞的绝对计数值。由于该法需要使用两种仪器，操作步骤多、变异系数大，不同实验室之间的差异也较大，因此应用受到限制。/pp　　后来人们采用微球法，即用已知浓度的微球作为参比，通过被测细胞和微球的比例关系来进行绝对计数，但因计数微球价格较为昂贵，实际应用受到限制。/pp　　近年来，厂家的共识回到了测定进样体积这一思路上来，替代微球法直接进行绝对计数，取得更为精确的结果。区别在于不同产品具体测定技术的差别。/pp　　蠕动泵：Accuri C6 Plus、CytoFlex/pp　　注射泵：easyCyte、NovoCyte、CytoFlow/pp　　流量传感器：FACSVerse、Bricyte E6/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/ccfa4c2d-589a-4fd1-8bcd-17e1112840b1.jpg" title="05.jpg" alt="05.jpg"//pp style="text-align: center "Sysmex CytoFlow系列TVAC体积测定原理/pp　　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "5.光路优化和光学新元件的应用/span/strong/pp　　庞大的水冷或气冷的激光器逐渐被小型化的固态激光器取代。/pp　　光纤传导应用越来越普遍。/pp　　光纤耦合让光能量传输更高效，而不为公司所专有。/pp　　雪崩光电二极管等等新检测器提供新的选择。请见专家分析：/pp　　流式细胞仪是怎么“看见”光的?/pp　　以及光学元件的神级组合让灵敏度达到新的高度。/pp　　MESF是仪器灵敏度衡量的标准，基于微球，基于鞘液。/pp　　不同公司没有约定俗成，不是那么容易比较，但就同一公司产品而言：/pp　　BD FACSCelesta FITC 25 PE 15/pp　　Beckman Coulter CytoFlex FITC 30 PE 10/pp　　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "6.以多色分析为核心的新型光学技术的迅速发展/span/strong/pp　　早期流式细胞仪的主要应用还是细胞DNA含量测定，这一技术对设备要求不高，通常配备一个散射光和一个荧光信号的流式细胞仪就足以应付。随着新型荧光探针的不断开发和仪器软、硬件的逐步更新，流式细胞仪多色荧光分析得到了迅速发展，包括两个方面：/pp　　单激光多色，如488nm激光同时激发7色，紫色激光同时激发10色/pp　　多激光：如10激光机器。/pp　　也包括两种新的光学设计机型：/pp　　光谱流式，利用特殊的接受装置收集某范围内的全发射光谱，无需补偿，区别发射光谱重合度高的荧光染料对。目前有Sony公司SP6800Z和SA3800，Cytek公司的Aurora。/pp　　质谱流式，利用质谱原理对单细胞进行多参数检测的流式技术。这个名为CyTOF的平台最初由DVS Sciences公司开发，后被Fluidigm公司收购。仪器采用同位素标记抗体来标记或识别细胞表面和内部的信号分子，并根据流式细胞原理分离单个细胞，再用感应耦合等离子质谱(ICP-MS)观察单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱的数据转换为细胞表面和内部的信号分子数据。2015年推出的Helios的检测通道达到135个，几乎没有信号重叠或背景噪音。/pp　　img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/c79c2dc9-dc52-45a2-9c40-da860593a6cd.jpg" title="06.jpg" alt="06.jpg" style="text-align: center "//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(127, 127, 127) "来自CyTek网站，不代表本人观念/spanbr//pp　　必须注意的是，多色分析提供了多种细胞特性的相互关系图，从而更加精确地界定一种细胞亚群，更好地对不同细胞进行分类。但是，同时检测的荧光染料越多，需准确调节各通道之间的补偿，技术难度更大，因为其中包含的信息量非常大，错误信号掺杂的概率也相应增加，所以数据分析时需格外注意，一般需采用不同的标记方案多次相互验证才能得出重要结论。光谱流式和质谱流式的出现克服了补偿问题。/pp　　但是，荧光染料匹配仍未解决，毕竟不是每个激光器都能如设计所愿，同时激发6色，7色到10色，甚至如光谱流式所希望的16色或者32色。所以，对20色以上多色分析仪器来说，标称往往都是理论，至少在目前还是设计师的想象。/pp　　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "7.数据处理能力不断提升/span/strong/pp　　随着数字化技术的引入，以及数据处理系统的升级，流式细胞仪的数据处理能力得到极大提升。/pp　　数据处理速度：反映数据扫描频率，用Hz表示。/pp　　处理精度：信号采集精度，用比特表示，反映采集通道多少。目前仪器一般在20比特(2的20次方，100万通道)以上，最高达32比特(43亿通道)。/pp　　线性范围：目前一般在105以上，最高到107。/pp　　单文件存储能力：反映文件储存能力，对稀有细胞分析有利。/pp　　数据能力的提升直接影响到仪器的分析和分选速度。/pp　　速度的提升是光路，流路和数据采集系统三者共同优化改善的结果。/pp　　传统的流式细胞仪，分析速度不超过10000 events/s，新上市产品基本达到25000 events/s(注意：不是细胞/s)以上，如Beckman Coulter公司CytoFlex为30000 events/s，Cytek公司Aurora 为35000 events/s ，BD公司的LSRFortessa 为40000 events/s with beads，Bio-Rad公司ZE5为100000 events/s。/pp style="text-align: center "　　img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/eb697251-c070-476d-8a38-812717426182.jpg" title="07.jpg" alt="07.jpg" style="text-align: center "//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(127, 127, 127) "Bio-Rad ZE5/spanbr//pp　　BD公司FACSCalibur的机械分选，速度只有300/秒，对少量细胞收集困难，须配用浓缩系统进行细胞回收 捕获管的移动和浓缩系统对细胞的机械损伤大，影响分选目的细胞功能特性 由于捕捉器移动不可避免地影响到流路稳定，造成不确定性 机械装置较难彻底清洗消毒。机械式分选已被速度更高的电荷分选所完全取代。/pp　　如BD公司FACSAria III(70 psi /90 kHz)和InFlux(60 psi /100 kHz) 四路分选，纯度 98%，得率 80%, 分选速度25000 events/s，继续提高分选速度，纯度不受影响，得率会按Poisson分布下降。/pp　　Beckman Coulter公司的MoFlo XDP和MoFlo Astrios EQ，据称有效分选速度达到70000细胞/s。/pp　　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "8.仪器不断小型化到微流控/span/strong/pp　　追求小型化，几乎是所有流式制造商开发新产品的共识。/pp　　看一组数字：主机W x D x H/pp　　span style="color: rgb(192, 0, 0) "strongBD/strong/span Accuri C6 plus / FACSVia/pp　　37.5 x 41.9 x 27.9 cm/pp　　span style="color: rgb(192, 0, 0) "strongBD/strong/span FACSVerse / FACSlyric/pp　　63.2 x 57.9 x 57.9 cm/pp　　span style="color: rgb(192, 0, 0) "strongBD/strong/span FACSCelesta/pp　　58 x 61 x 59 cm/pp　　span style="color: rgb(192, 0, 0) "strongBeckman Coulter/strong/span CytoFlex/pp　　42.5 x 42.5 x 34 cm/pp　　span style="color: rgb(192, 0, 0) "strongMiltenyi Biotec/strong/span MACSQuant/pp　　60 x 35 x 40 cm/pp　　span style="color: rgb(192, 0, 0) "strongThermo/strong/spanstrong /strongAttune NxT/pp　　58 x 43 x 40 cm/pp　　span style="color: rgb(192, 0, 0) "strongCytek/strong/span Aurora/pp　　54 x 52 x 52 cm/pp　　span style="color: rgb(192, 0, 0) "strongMindray/strong/span BriCyte E6/pp　　50 x 55 x 50 cm/pp　　“小”意味着节省空间，容易安装和转移，“小”更值得期许的是减少样本体积，降低试剂消耗，提高检测速度，以及缩小空间所带来的光电及液路的改善。/pp　　微流控技术兴起于上世纪90年代，顾名思义就是使用微通道(尺寸为数十到数百微米)处理或操纵微小流体。/pp　　On-chip公司于2012年推出了世界上第一台微流控芯片流式On-Chip Sort，以低压对细胞进行分选，降低对细胞的损伤 简化实验操作 容易实现系统的无菌 使用一次性交换型模块，减少样品间交叉污染 无需清洗流路通道。Miltenyi Biotec公司的MACSQuant Tyro、Namocell公司的Namocell等亦先后推出类似的微流控流式分选产品。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/4447d8ae-2611-4183-8988-ecc0f9183d53.jpg" title="08.jpg" alt="08.jpg" width="485" height="215" style="width: 485px height: 215px "//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(127, 127, 127) "on-chip公司之on-chip sort/spanbr//pp　　Sony公司分选平台的两大核心技术即为所谓的CoreFinder全自动校准技术和可更换式微流体芯片的液路设计。最新型号MA900，全自动光路及液流校准 立体式双光斑四激光激发，最多同时检测12色荧光 四路分选。/pp style="text-align: center "　　img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/16b8cd31-0eb3-44ff-bd93-1450cf1ba662.jpg" title="09.jpg" alt="09.jpg" width="415" height="293" style="text-align: center width: 415px height: 293px "//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(127, 127, 127) "Sony MA900/spanbr//pp　　专门生产分析型微流控流式的制造商Handyem公司，针对微流控装置容易导致细胞黏附和堵塞的问题，于2015年推出HPC-150(国内品牌深圳芯凯瑞)，采用双高精度玻璃注射泵代替蠕动泵或单注射泵，据称克服了上一代产品易见的流路堵塞沉积等问题。/pp　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong9.融合显微成像技术和流式细胞术/strong/span/pp　　细胞生物学两大技术平台分别基于显微镜和流式，前者以形态分析为优，可提供详细的细胞图像信息，但解释主观、费时费力 后者以统计学见长，却缺乏成像能力，因此无法了解亚细胞定位。/pp　　融合显微成像技术和流式细胞术的图像流式细胞仪，以Amnis平台为代表(现被Luminex公司收购)，最新型号ImageStreamX Mark II，从细胞经过流动池开始即按线性分拆进行分线性照相，其冷CCD采用时间延迟积分方式进行信号采集，每一个样本的分析都生成该样本中所有细胞的荧光强度测量参数和图像数据库，包括“每个细胞”的明场、暗场以及荧光图像。/pp　　对于微弱荧光信号可以通过明视野细胞图像辅助设定遮罩，特定加强遮罩下细胞荧光信号，实现对微弱荧光图像的捕捉和分析。/pp　　系统可以对每个细胞分析超过500种量化参数，包括细胞整体的散射光和荧光信号强度，以及对细胞形态，细胞结构及亚细胞信号分布的分析。/pp　　图像流式细胞仪无须为了得到细胞群统计学资料而损失丰富的形态信息，也无须为了获得细胞细节而损失统计学功能。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/9d9b7215-7328-4a75-9018-1c4425cc45d0.jpg" title="010.jpg" alt="010.jpg"//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(127, 127, 127) "Amnis图像流式细胞仪ImageStreamX Mark II/span/pp　　Sysmex公司最近推出MI-1000，自动检测多达10000细胞的图像荧光。/pp　　Union Biometrica公司的气流分选平台COPAS VISION也加入了明场图像。/pp　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong10.专业化和临床型仪器纷纷面世/strong/span/pp　　CytoBuoy公司生产多种用于水体微型生物分析的流式细胞仪，如CytoBuoy安放在浮标上 CytoSub具有特殊的耐压装置，以及内部鞘液循环处理装置，不需外部加入鞘液，可在水下200米使用。Bentley Instruments 公司和Delta Instruments 公司公司专门提供牛奶场使用的专项检测仪器。/pp　　临床市场是商品流式细胞仪最具潜力的发展方向。但是，诊断流式试剂的研发和报证，以及符合检验流程的仪器开发，与不断增长的临床应用需求并不匹配。/pp　　一些公司推出了专门的小型流式细胞仪，用于CD4细胞的快速计数，如FACSCount、CyFlow Counter等。/pp　　迈瑞公司面向临床用户工作流程和场景推出BriCyte E6，针对淋巴细胞亚群分群等临床常规分析，可以实现检验仪器常有的一键得结果，免去繁复的电压和补偿调整，其LIS的双向通信，数据管理都非常符合临床诊断的期望。类似思路在后来上市的BD公司FACSlyric也有体现。/pp　　老牌血球生产厂商Sysmex 在收购Partec后的第五年，推出了PS-10流式样本前处理系统，配合新款流式XF-1600，实现样本处理、离心和检测的全自动化流程。详情请见：/pp　　全自动流式检测时代的来临!/pp　　可以期待，流式细胞仪未来将会作为一个重要的组成部分被整合到血液细胞分析流水线上，在这个系统中，血液细胞分析仪提供血常规结果和异常报警信息，流式细胞仪则根据这些信息对异常细胞进行不同策略的精细鉴别。/pp style="text-indent: 2em "strong style="text-decoration: underline color: rgb(0, 112, 192) "span style="text-decoration: underline color: rgb(0, 112, 192) "了解a href="https://www.instrument.com.cn/zc/144.html" target="_self" style="text-decoration: underline color: rgb(0, 112, 192) "详情请进入流式细胞仪专场/a/span/strong/p

关于对国家重点研发计划干细胞及转化研究等6个重点专项2017年度项目申报指南建议征求意见的通知　　根据《国务院关于改进加强中央财政科研项目和资金管理的若干意见》(国发[2014]11号)、《国务院关于深化中央财政科技计划(专项、基金等)管理改革方案的通知》(国发[2016]64号)、《科技部 财政部关于改革过渡期国家重点研发计划组织管理有关事项的通知》(国科发资[2015]423号)等文件要求，现将干细胞及转化研究、纳米科技、量子调控与量子信息、蛋白质机器与生命过程调控、大科学装置前沿研究、全球变化及应对等6个重点专项2017年度项目申报指南建议向社会征求意见。征求意见时间为2016年7月30日至2016年8月3日。　　国家重点研发计划相关重点专项的凝练布局和任务部署已经战略咨询与综合评审特邀委员会咨询评议，国家科技计划管理部际联席会议研究审议，并报国务院批准实施。本次征求意见重点针对各专项指南建议提出的目标指标和相关内容的合理性、科学性、先进性等方面听取各方意见。科技部将会同有关部门、专业机构和专家，认真研究收到的意见和建议，修改完善相关重点专项的项目申报指南。征集到的意见将不再反馈和回复。　　相关意见建议请发至电子邮件：jcs_zdxmc@most.cn。　　科技部基础司　　2016年7月30日　　附件：　　1 干细胞及转化研究重点专项2017年度项目申报指南建议.doc　　2 纳米科技重点专项2017年度项目申报指南建议.doc　　3 量子调控与量子信息重点专项2017年度项目申报指南建议.doc　　4 蛋白质机器与生命过程调控重点专项2017年度项目申报指南建议.doc　　5 大科学装置前沿研究重点专项2017年度项目申报指南建议.doc　　6 全球变化及应对重点专项2017年度项目申报指南建议.doc

安捷伦首届细胞分析创新峰会圆满落幕，尽情展现细胞分析技术的尖端应用 序曲 奇妙的细胞地球上第一个有生命的细胞诞生距今已有三十八亿年[1]，然而直到三百五十多年前[2]，科学家通过特殊的显像工具方才一睹它的真容。有赖于不断革新演进的细胞分析技术，如今，研究人员能够深度解析细胞结构、代谢、微环境以及细胞生命周期活动中的动态变化，为以细胞模型为基础的多学科应用及产学研转化提供强力的技术支撑。在全球领先的细胞分析技术阵营，安捷伦已成为极具影响力的企业。五月下旬，安捷伦在沪隆重举办了首届细胞分析创新峰会，并为享誉全球科研学术界的安捷伦 BioTek Cytation 产品家族面世十周年举办了庆典。与会嘉宾与安捷伦高层共同见证安捷伦 BioTek Cytation 产品家族面世十周年(左起：安捷伦细胞分析事业部大中华区总经理罗绍光，安捷伦大中华区行业拓展与应用创新团队经理安蓉，安捷伦副总裁兼大中华区业务总经理杨挺，安捷伦大中华区高级市场总监郑欣，安捷伦大中华区销售拓展团队总经理朱颖新)300 多位来自多领域的专家、学者及科研人员到会，与安捷伦高层以及技术工程师共同探讨了先进的细胞成像与分析技术在多学科中的深度应用。峰会聚集并展现细胞分析与研究领域前沿的理论与发现，各种思维与智慧的碰撞与交织，合奏出一曲细胞礼赞的乐章。第一章 问世十年，Cytation 助力生命科学研究持续开拓胞罗万像，聚力新生。安捷伦首届细胞分析创新峰会以此为主题，直观反映出细胞分析应用的丰富多样，也体现出细胞分析研究的目标——解读生命，改善生命。多位学界专家汇聚于此次峰会，期待深入交流安捷伦细胞分析技术在不同科研领域展现出的能力和价值，为各自今后的科研工作提供参考借鉴。问世至今正好十年，安捷伦BioTek Cytation毫无疑问成为本届峰会的主角。十年前，安捷伦BioTek推出了BioTek Cytation 3细胞成像微孔板检测系统，以及增强显微镜的概念，由此创造出一款自动化解决方案，帮助研究人员完成从图像采集到获取可发表数据的全过程。Cytation 3借助其丰富的功能与极具竞争力的价格，推动了自动化成像的广泛应用。为中小型实验室开启了自动化成像的大门。安捷伦副总裁兼大中华区业务总经理杨挺致开幕词安捷伦副总裁兼大中华区业务总经理杨挺在致辞中表示，十年来，Cytation 已经进驻全国近1000家实验室，让用户在自己的实验室全面掌控活细胞分析流程的应用，助力他们在细胞与生命研究领域里持续开拓。尤其是过去三年，人类与病毒和疾病抗争的这段经历，促进了生命科学领域新型研究工具的开发和利用。在这一特殊时期，以安捷伦Cytation 为代表的，基于活细胞、多参数、实时、高通量的多功能细胞成像与检测技术，为身处一线的科学工作者提供了有力的技术支撑。 第二章 细胞科研的夜空，群星闪耀安捷伦邀请了不同学科、以及跨学科的杰出代表，通过学术报告分享并探讨了他们的科研进展。在峰会上分享学术报告的专家(上排左起：郑明彬教授，刘嘉莉副教授，罗克博士 下排左起：印彤研究员，江宽副研究员，刘回民副教授）深圳市第三人民医院郑明彬教授分享了“微纳仿生药物可视化诊疗“进展。他使用 Cytation 在 3D 细胞球进行微纳仿生药物的靶向富集验证，并就微纳技术在疾病精确诊断和精准治疗方向提出了前瞻性见解。 中国药科大学刘嘉莉副教授介绍了“基于类器官的靶组织药动-药效时空异质性研究”及其拓展应用。她使用安捷伦 Lionheart 自动细胞成像仪进行 3D 细胞瘤球培养与检测，并基于 3D 细胞模型建立了空间异质性单细胞 PK/PD 评价新方法，希望通过外源性的药物代谢动力学和内源性的代谢进行cross talk去找到相关的内源性代谢的靶标和干预的策略。 伯桢生物（bioGenous）CTO 罗克博士（Dr. Emmanuel Enoch K. Dzakah）做了题为“Bioimaging in Organoid Technology: Application and Perspectives”的专题报告。类器官是近十年来干细胞研究最令人振奋的进展之一，伯桢生物在类器官技术开发与医药研发应用领域进行了非常深入的探索。罗克博士特别提到，类器官模型的高通量成像采集和分析对于类器官形态特征评价、药物高通量筛选和药效评估至关重要。此外，Cytation可以用于记录和分析类器官和其他细胞如免疫细胞的相互作用过程，因此在肿瘤免疫调节类抗体药物、免疫细胞疗法的药效评估上展现出巨大潜力。 上海交通大学医学院附属瑞金医院研究员印彤博士介绍了“国家转化医学中心（上海）质谱平台助力精准医学研究”进展。基于安捷伦Seahorse的细胞能量代谢分析是质谱平台新开展的业务，Cytation 作为细胞能量分析系统的联用设备，可以轻松实现活细胞能量代谢数据归一化，获得更准确的有生物学意义的细胞能量代谢数据。复旦大学附属眼耳鼻喉科医院江宽副研究员介绍了“流式细胞仪助力脂质纳米药物体内过程研究”进展，借助基于流式细胞术的机体细胞分离与鉴定技术，阐明脂质纳米药物体内与细胞互作及细胞间转运过程，进而明晰机体对脂质纳米药物调控机制，将极大助力脂质纳米药物的临床转化。吉林农业大学刘回民副教授安捷伦BioTek 自动化成像产品不仅被细胞分析、基础医学、药物开发等领域的研究人员广泛使用，而且也在农业研究、植物发育和食品科学中也有诸多应用。刘回民副教授介绍了Cytation 5 细胞成像多功能微孔板检测仪以及Seahorse细胞能量代谢分析系统如何帮助他实现“玉米黄素促进白色脂肪细胞棕色化的分子机制研究”。研究了植物来源的天然化合物在代谢性疾病（肥胖，糖尿病，非酒精性肝炎）中的作用机制。在这些现场学术报告以外，安捷伦细胞分析的应用专家团队也着力向各方嘉宾介绍了Cytation多功能细胞成像与分析技术、流式细胞术、RTCA 非标记细胞分析以及Seahorse 细胞能量代谢分析技术的前沿应用进展，并陪同现场的参会嘉宾一起参观了演示仪器，解答用户关心的实验和使用问题。 第三章 聆听客户需求，优化产品功能报告嘉宾在峰会期间也对 Cytation 和其他细胞分析技术给予肯定的评价，以及激动人心的期待。深圳市第三人民医院郑明彬教授讲到，Cytation在他的实验室里利用率非常高，并且他对其软件功能十分赞赏。郑教授的科研课题需要使用Cytation进行纳米机器人相关的监测，观察病毒是怎么被吞噬和吐出，因此要求设备具有极高的镜头捕捉效率。郑教授期待未来的Cytation着力打造出更先进、更专业的硬件，能够不仅用于细胞科研，而且能够拓展到合成生物学和细菌、甚至更小的物质研究领域。中国药科大学刘嘉莉副教授的实验室需要研究样本的时空表达差异，因此需要对不同样本的空间整体进行成像。实验室正在使用Lionheart成像产品以及Synergy H1酶标仪。她期待能够实现通过不同的license安装在不同电脑上，实现一台电脑成像，另一台电脑分析结果，以此节省时间提升实验效率。她也了解到最新的Cytation C10内嵌了共聚焦的功能，十分期待能够尝试使用。伯桢生物（bioGenous）CTO 罗克博士十分喜欢他正在使用的Cytation C10，因为它既可以实现共聚焦成像，又可以承担酶标仪的工作，并且还能检测活细胞成像。这样的设计能够帮他在同一时间完成多个实验项目，比如可以一边培养细胞，一边进行检测，这项功能对于细胞治疗这类大部分需要实时拍摄的课题非常适用。他十分期待Cytation C10能够和AI结合，自动帮助研究人员承担部分研究任务。上海交通大学医学院附属瑞金医院的研究员印彤博士认为，除了细胞活力和增殖等基础检测功能非常完备外，Cytation在代谢组学功能研究，即活细胞能量代谢中也可大显身手。此外，在更加前沿的空间代谢组研究中，从Cytation获得的样本图像可与质谱数据整合，获得空间代谢组信息，非常有利于将研究推向深入。印彤博士期待Cytation在帮助研究者应对课题挑战的同时，也能够为中国生命科学的发展带来更多助力。复旦大学附属眼耳鼻喉科医院江宽副研究员使用安捷伦流式细胞仪来检测药物对细胞的影响、细胞如何代谢这些药物，以及两者之间的相互作用。他对安捷伦流式细胞仪的模块化功能和整体应用的简约性十分认可。吉林农业大学刘回民副教授对Cytation系列软件的易用性、尤其对Cytation C10的成像能力十分赞赏。他认为，在传统观念里，涉及食品与农业的应用方向对细胞研究技术没有很高的需求，但是他的研究课题——食源性的天然化合物/功能活性物质，已经开始涉及医学类的需求。他期待Cytation C10不断改进成像功能，能够提供视野更大、分辨率更高的图像。 尾声 细胞分析未来可期，安捷伦推出强力技术组合安捷伦大中华区细胞分析事业部总经理罗绍光介绍部门发展历程和业务战略安捷伦大中华区细胞分析事业部总经理罗绍光在峰会上历数安捷伦细胞分析部门发展历程。自2015年收购 Seahorse Bioscience 公司，将活细胞代谢分析纳入公司重点发力的生命科学技术开始，安捷伦正式踏入了细胞分析领域。此后，安捷伦又于2018年与2019年接连并购了艾森生物（ACEA）和微孔板检测领导企业 BioTek ，正式成立细胞分析部门。借助这些举措，安捷伦开始在生命科学、癌症研究、生物制药、免疫与细胞治疗等前沿科技领域，借助多方位细胞分析技术，为用户提供更有深度、更加完善的解决方案。如今，安捷伦细胞分析事业部拥有极具优势的技术组合：流式细胞分析、微孔板检测、自动化成像以及细胞代谢分析，致力于在生命科学与临床研究以及生物医药产品的开发、生产和质控整个生命周期中，为用户提供简单、精准、可靠的检测方案。通过活细胞动态和表型的实时测量，帮助研究人员充满信心地探索细胞奥秘，揭示独特的细胞生物学机理，发现创新药物靶点，推进临床前毒理学研究，并引领新一代免疫疗法开发。细胞潜力，始于分析。安捷伦首届细胞分析高峰论坛在前沿思维的激荡中告一段落，也为安捷伦细胞分析技术和团队吹响继续前行的号角。在细胞科研的夜空，安捷伦期待能够衬托出更多星星的闪耀光芒。参考文献[1] It appears that life first emerged at least 3.8 billion years ago, approximately 750 million years after Earth was formed. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9841/[2] 人类第一次发现细胞是在哪一年 https://zhidao.baidu.com/question/501601301800761404.html

细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）作为蛋白质、mRNA、miRNA、脂质等信息物质在细胞间转运的载体, 是细胞与细胞间通讯的重要媒介，参与大量正常生理和病理过程，包括感染性疾病、自身免疫性疾病、心血管和其他炎症性疾病、癌症和凝血障碍等，因此研究EV在人类健康和疾病中的作用具有重要意义。EVs常分为三类外泌体 (30-150 nm) ，在胞体内区室中形成多囊泡小体，随后与质膜融合后从细胞中释放。微囊泡或微粒 (100-1000 nm) ，这是质膜起泡/出芽以及随后从细胞中释放的结果。凋亡小体 (1000-5000 nm) ，由凋亡细胞释放。目前还没有特异性标记物可以最终鉴定不同类型的囊泡。因此，我们把这些小的生物颗粒统称为细胞外囊泡。细胞外囊泡示意图EVs检测研究表明，不同疾病状态下，组织器官释放到体液中的EVs的数量及所包裹的物质是完全不一样的，因而通过检测分析EVs的特性即可对相关疾病进行精准诊断、预后判断及指导治疗。EVs具有尺寸小、异质性高且数量巨大等特点，一直以来，检测灵敏度都是EVs研究中的一个重大挑战。虽然一些关于EVs的检测是利用传统流式细胞术开展的，但也暴露出了明显的局限性，一方面由于传统流式仪器更适用于检测细胞，而细胞表面结合的荧光分子数量远远多于EVs表面；另一方面，一些传统流式仪器在检测小于500 nm单个颗粒上表现吃力。因此，想要准确的检测EVs，就需要更强大且具备高通量功能的检测工具。Amnis 成像流式的技术优势近年来，随着Amnis成像流式技术的发展，越来越多的研究利用这项技术解决了EVs检测这一难题。Amnis技术的核心是使用时间延迟积分CCD (TDI-CCD)进行信号检测。与光电倍增管(PMT)相比，CCD具有更大的动态范围、更低的“噪声”和更高的量子效率，使其更适合测量微弱信号。与传统流式细胞术相比，这种方法信号整合时间更长，噪音低，灵敏度大幅增加，对研究EVs具有独特的优势。Amnis技术EVs应用案例分享以下研究体现了Amnis 成像流式技术在小颗粒检测中的高灵敏度特点。检测脂质体和微球流式技术对比用常规流式技术 (A-B)和成像流式技术 (C-D)获得的200 nm大小的荧光标记脂质体和不同尺寸的聚苯乙烯珠(220、450、880和1300 nm)。Amnis成像流式可以清晰地分辨出缓冲液背景信号(灰色)以上的所有脂质体(粉色)，而常规流式仅能通过荧光分辨出一小部分脂质体。健康人类供体的血浆微粒检测(a)从6名健康供体中获取无血小板血浆，并使用CD235(红细胞)、CD41(血小板)、CD45(白细胞)和CD146(内皮细胞)标记物进行染色以确定微粒细胞的来源。(b)利用CD14(单核细胞)、CD66b(中性粒细胞)和CD3(淋巴细胞)标记物进一步对白细胞微粒进行表型分析，以确定其来源细胞。下方是图库中事件的代表性图片。(c)表为N = 6例供体的绝对计数±SEM。如图所示，Amnis成像流式技术可实现不同来源的外泌体的精准鉴定与计数。单核细胞内化外泌体检测(a)用Amnis成像流式技术分析PKH67标记的外泌体。BF和FITC荧光图像(E)所示。(b) PKH67预标记外泌体与外周血单个核细胞共孵育。使用AmnisIDEAS软件内化功能测量外泌体的内化程度。Amnis成像流式技术不仅实现了PKH67标记的外泌体鉴定，同时也实现了单个核细胞内化外泌体检测，且呈现直观图像佐证结果准确性。小结综上，Amnis成像流式技术做到了真正意义上的流式数据可视化。既具备传统流式可大量检测样本的特点，又利用高灵敏度TDI-CCD技术针对每个检测到的外泌体颗粒进行成像，并可通过海量形态学数据分析EVs与亲本细胞或靶细胞间的相互作用。Cytek Amnis ImageStreamx Mk II 成像流式细胞分析仪以上研究均通过 Cytek Amnis ImageStreamX Mk II 仪器完成。通过将流式细胞术的表型分析能力、高速度和高灵敏度等优势，与荧光显微镜技术在细胞形态学细节的洞察力和针对细胞功能研究的深度有机结合在一起，Amnis ImageStreamXMk II 平台可高速获取每个细胞的多个图像，包括明场、暗场 (SSC) 和多达 10 色荧光标记。ImageStreamX Mk II 通过高分辨率成像，可以定位荧光蛋白表达位置（细胞膜、细胞质或者细胞核），实现超乎想象的广泛应用需求。技术特点应用广泛：样本利用率高达 95%，可以更高效的方式分析稀有细胞。简单易用：简单友好的用户界面，可实时观察全部细胞图像和统计学数据。配置灵活：最高可升级至 6 根激光器。功能强大：提供数百种量化成像分析参数，实现无与伦比的广泛应用。参考文献：Erdbrügger, Uta, and Joanne Lannigan. "Analytical challenges of extracellular vesicle detection: A comparison of different techniques." Cytometry Part A 89.2 (2016): 123-134.Headland, S., Jones, H., D'Sa, A. et al. Cutting-Edge Analysis of Extracellular Microparticles using ImageStreamX Imaging Flow Cytometry. Sci Rep 4, 5237 (2014). https://doi.org/10.1038/srep05237.Clark, R. Imaging flow cytometry enhances particle detection sensitivity for extracellular vesicle analysis. Nat Methods 12, i–ii (2015). https://doi.org/10.1038/nmeth.f.380.Gurunathan, S. Kang, M.-H. Jeyaraj, M. Qasim, M. Kim, J.-H. Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, and Multifarious Therapeutic Approaches of Exosomes. Cells 2019, 8, 307. https://doi.org/10.3390/cells8040307.

医疗器械行业在我国受到了高度重视，近年来一系列政策不断出台，为国家医疗器械产业的发展提供了有力支持。在进口替代、医保控费、分级诊疗等多项政策的的有力推动下，我国医疗器械行业抓住了机遇，迎来了飞速发展的黄金时期。达科为与岛津强强联合达科为生物1999年成立，是生命科学研究服务和病理诊断领域的专业服务商。在生命科学研究领域，主要提供科研试剂及科研仪器，为科研客户和工业客户提供完善的产品及专业技术支持服务。达科为与岛津达成合作，成为高速2D/3D细胞成像扫描仪系列产品代理，为在2D/3D细胞监测和分析方面提供更加优质的产品与服务。岛津公司作为知名的分析仪器综合生产厂商，自1875年创业以来，始终秉承创业宗旨“以科学技术向社会做贡献”。为支援从事细胞研究，在保有自己公司的专有技术基础上，不断与持有相关技术的众多企业合作，旨在为从事细胞相关工作的客户提供解决方案。达科为携手岛津将在2D/3D细胞监测和分析方面提供更加优质的产品与服务。高通量高速2D/3D细胞成像扫描仪Cell3 iMager NX高通量高速2D/3D细胞成像扫描仪是一款专为细胞培养和分析而开发的高性能仪器，可以快速、准确、无损地获取和处理2D和3D培养细胞的图像数据。应用场景丰富：单克隆形成过程追踪：追踪记录细胞生长，单克隆来源验证；类器官的全孔观察与定量分析：观察并评估类器官的形态特征，生长状态，功能表达等；药敏实验调查药效：检测并比较不同药物对细胞或类器官的影响和变化；病毒感染实验分析：病毒空斑灶斑清晰成像及准确定量，病毒感染实验及抗体中和实验；多种类型贴壁悬浮细胞明场/荧光观察与定量分析。类器官定量分析3D肿瘤球杀伤经过多年发展，达科为在病理诊断领域已构建起丰富的产品线，打造了快速响应客户需求的服务优势。具体来看，达科为搭建了完善的产品研发平台，围绕病理诊断流程构建了较为完整的产品线。公司的病理诊断设备产品包括染色机、封片机、冷冻切片机、脱水机等，基本覆盖组织病理的脱水、切片、染色、封片等关键流程。同时，公司先后研发了多种病理诊断试剂并均已取得产品注册或备案，与病理诊断设备形成较为完整的产品体系。在生命科学研究服务领域， 达科为在整合了百余家国际生物技术品牌代理业务的基础上，不断深入地研发，快速发展自主品牌产品，组成专业完善的客户服务解决方案，为广大科研工作者的科研工作提供了强有力的产品及技术支持。

2月23日，国家药品监督管理局药品审评中心发布关于公开征求《基因修饰细胞治疗产品非临床研究与评价技术指导原则》（试行）意见的通知，全文如下：为更好引导和促进基因修饰细胞治疗产品开发，药品审评中心通过对行业调研、文献收集和专家咨询讨论会等工作，在已有《细胞制品研究与评价技术指导原则》（试行）的基础上，根据目前对基因修饰细胞治疗产品的科学认知，经中心内部讨论形成《基因修饰细胞治疗产品非临床研究与评价技术指导原则》（试行）征求意见稿，现公开征求意见和建议。 我们诚挚地期待社会各界对征求意见稿提出宝贵意见并及时反馈给我们。征求意见时限为自发布之日起1个月。 您的反馈意见请发到以下联系人的邮箱： 联系人：戴学栋 联系方式：daixuedong@cde.org.cn 联系人：张旻 联系方式：zhangmin@cde.org.cn 感谢您的参与和大力支持! 国家药品监督管理局药品审评中心 2021年2月23日《基因修饰细胞治疗产品非临床研究与评价技术指导原则》（试行）一、前言 ................................................................................... 1 二、适用范围 ........................................................................... 1 三、总体考虑 ........................................................................... 1 四、受试物 ............................................................................... 2 五、动物种属/模型选择 .......................................................... 3 六、概念验证 ........................................................................... 4 七、药代动力学 ....................................................................... 5 八、非临床安全性 ................................................................... 6 （一）总体安全性考虑 ...................................................... 6 （二）基因表达产物的风险评估 ...................................... 6 （三）插入突变风险评估 .................................................. 7 （四）载体动员（Vector mobilisation）和重组风险评估 8 九、对特定类型基因修饰细胞产品的特殊考虑 .................... 8 （一）基因修饰的免疫细胞（CAR或TCR修饰的T细胞 /NK细胞） .......................................................................... 8 （二）诱导多能干细胞（iPS）来源的细胞产品 ............ 10 （三）基因编辑的细胞产品 ............................................ 10 一、前言 近年来，随着基因修饰技术的迅速发展，基因修饰细胞 治疗产品已成为医药领域的研究热点。由于基因修饰细胞治 疗产品物质组成和作用方式与一般的化学药品和生物制品 有明显不同，传统的标准非临床研究策略和方法通常并不适 用于基因修饰细胞治疗产品。为规范和指导基因修饰细胞治 疗产品非临床研究和评价，在《细胞制品研究与评价技术指 导原则》基础上，根据目前对基因修饰细胞治疗产品的科学 认识，制定了本指导原则，提出了对基因修饰细胞治疗产品 非临床研究和评价的特殊考虑和要求。随着技术的发展、认 知程度的深入和相关研究数据的积累，本指导原则将不断完 善和适时更新。 二、适用范围 本指导原则适用于基因修饰细胞治疗产品。基因修饰细 胞治疗产品是指经过基因修饰（如调节、修复、替换、添加 或删除等）以改变其生物学特性、拟用于治疗人类疾病的活 细胞产品，如基因修饰的免疫细胞（如T细胞、NK细胞、树突状细胞和巨噬细胞等）和基因修饰的干细胞（如造血干 细胞、多能诱导干细胞等）等。 三、总体考虑 非临床研究是药物开发的重要环节之一。对于基因修饰 细胞治疗产品，充分的非临床研究是为了：1）阐明基因修饰 的目的、功能以及产品的作用机制，明确其在拟定患者人群 中使用的生物学合理性；2）为临床试验的给药途径、给药程 序、给药剂量的选择提供支持性依据；3）根据潜在风险因素， 阐明毒性反应特征，预测人体可能出现的不良反应，确定不 良反应的临床监测指标，为制定临床风险控制措施提供参考 依据。因此，应充分开展非临床研究，收集用于风险获益评 估的信息，以确立拟开发产品在目标患者人群中预期具有合 理的、可接受的风险获益比，同时为临床试验的设计和风险 控制策略的制定提供支持性依据。 由于不同基因修饰细胞治疗产品的细胞的来源、类型、 生物学特性、基因修饰方式/技术、生物学功能/作用方式、生 产工艺、非细胞组分等各不相同。在制定非临床研究计划时， 除参考《细胞制品研究与评价技术指导原则》中的对细胞制 品的一般要求外，还应具体问题具体分析，基于产品特点和 目前已有的科学认知，结合拟定适应症、患者人群、给药途 径和给药方案等方面的考虑，科学合理的设计和实施非临床 试验，充分表征产品的药理学、毒理学和药代动力学特征。 在进行风险获益评估时，还应重点关注由非临床向临床过渡 时非临床研究的局限性和风险预测的不确定性。 四、受试物 非临床试验所用受试物应可充分代表临床拟用样品的 质量和安全性，确证性非临床试验应尽可能采用临床拟用 基因修饰细胞治疗产品作为受试物。体外、体内非临床试 验所使用的样品均应符合相应开发阶段的质量标准要求。 应阐明非临床使用样品与临床拟用样品的异同及其对人体 有效性和安全性的可能影响。 在某些情况下，受种属特异性的限制，可考虑采用替 代产品（表达动物同源基因的人源细胞产品或动物源替代 细胞产品）。替代产品应与临床拟用产品采用相似的生产工艺，并对可能影响有效性和安全性的关键质量参数进行对 比研究，以评估替代产品与临床拟用产品的质量相似性及 其对非临床数据预测性的影响。 五、动物种属/模型选择 进行非临床体内试验时，应选择相关的动物种属/模型。理想状态下，基因修饰细胞应能以其预期的作用方式在所选 择的动物中表现出在拟用患者人群中所期望的功能活性。因 此，选择相关动物时需要考虑产品的特性以及临床拟用情况， 包括但不限于以下因素：1）动物病理生理学特征与拟用患者 人群的相似性；2）动物对基因修饰细胞及导入基因表达产物 （若有）的生物学反应与预期的人体反应的相似性；3）动物 对异种来源的基因修饰细胞的免疫耐受性；4）临床拟用递送 /给药方式的可行性。 由于免疫排斥反应以及细胞和/或导入基因的种属特异性，常规标准实验动物很可能并不适用，而免疫缺陷动物、 转基因动物或采用同源替代产品作为受试物可能会更合适。 对于某些作用机制涉及与疾病环境相互作用的基因修饰细 胞（例如CAR-T细胞），可能需要采用疾病模型动物。采用疾病模型动物进行的非临床研究可提供活性和毒性的剂量 关系信息，可更好的评估基因修饰细胞产品的风险获益比。每一种动物种属/模型均有其优点和不足，没有一种模型可完美预测基因修饰细胞在患者人群中的有效性和安全性， 应评估并阐明非临床研究所采用的动物种属/模型与人体的 相关性和局限性，建议采用多种动物/模型开展研究。当缺少 相关动物模型时，可采用基于细胞和组织的模型（如2D和 3D组织模型、类器官和微流体模型），这些模拟人体内环境 的模型也可为有效性和安全性的评估提供有用的补充信息。 六、概念验证 对于基因修饰细胞治疗产品，除应参照《细胞制品研究 与评价技术指导原则》的要求进行药效学研究外，还应进行 概念验证试验，阐明对细胞进行基因修饰的理由和可行性。通常，对细胞进行基因修饰的理由可能包括但不限于：1）引 入突变基因的功能拷贝以纠正遗传性疾病；2）改变/增强细 胞的生物学功能；3）引入一个安全开关，以在必要时能够清除细胞。应根据基因修饰的目的，进行相应的体外和体内验 证试验，证明可达到基因修饰的目的。 概念验证试验评估终点可能包括：1）对细胞基因组修饰的特异性；2）引入的外源调控序列对内源基因表达的影响， 或转基因的表达及功能活性；3）基因修饰对细胞正常行为和 生理功能的影响（如对扩增、分化能力的影响，对T细胞激活 和杀伤活性的影响等）。设计概念验证试验时，应考虑设置合 适的平行对照（如未修饰的细胞）。 虽然体外试验可在一定程度上验证基因修饰细胞的设 计理念和拟定作用方式，但对于功能复杂的活细胞，仅依靠 体外试验并不足以预测基因修饰细胞的体内行为和功能。因 此，除非有充分的理由，均应尽可能考虑进行体内概念验证 试验。在设计体内概念验证试验时，建议采用疾病模型动物。对于预期在人体内会长期存续或长期发挥功能的基因修饰 细胞，如果缺乏相关的动物模型，建议采用替代产品进行体 内概念验证试验，在足够的、可行的时间窗内评估基因修饰 细胞的长期效应。 七、药代动力学 参考《细胞制品研究与评价技术指导原则》中的对细胞 制品药代动力学的一般要求，采用相关动物模型开展药代动 力学试验以阐明基因修饰细胞在体内的命运和行为（包括生 物分布、归巢、定植、增殖、分化和持续性）。这些试验可以 单独开展，也可以整合到概念验证试验和/或毒理学试验中。若基因修饰细胞表达的转基因产物可分泌到细胞外，应 阐明其在局部和/或全身的暴露特征。 八、非临床安全性（一）总体安全性考虑 在评估产品的整体风险时，除参考《细胞制品研究与评 价技术指导原则》中对细胞制品的一般要求外，还应重点关 注基因修饰所可能带来的风险，如表达转基因的风险、基因 编辑脱靶风险、载体插入突变风险、载体重组风险等。在制 定非临床安全性评价策略时，应基于每个产品的特点，具体 问题具体分析考虑因素包括但不限于：1）临床拟用适应症、 目标患者人群和临床给药方案；2）细胞的来源、类型及其在 体内的细胞命运；3）基因修饰目的、方式及技术；4）作用 方式/机制或预期的功能活性；5）激起免疫应答能力/免疫耐 受能力；6）产品的质量因素；7）已有的非临床/临床数据；8）类似产品的已知有效性和安全性信息。 （二）基因表达产物的风险评估 通常，导入基因会随基因修饰细胞的存在而持续表达， 对于有复制能力的细胞，导入基因还可能会随细胞的增殖而 过度表达，导致基因表达产物的蓄积，进而导致毒性。因此， 若基因修饰细胞编码导入基因，应在体内试验中评估导入基 因表达产物的毒性风险。在设计试验时，应根据导入基因的 表达情况和功能活性设计试验期限和必要的终点指标，考虑 因素包括：1）基因表达水平和持续时间；2）基因表达产物 的分布部位；3）基因表达产物的功能活性。一些转基因（如生长因子、生长因子受体、免疫调节物等）若长期持续表达， 可能会导致长期安全性风险担忧，如导致细胞非受控的生长、 恶性转化等不良反应。因此，对于长期持续表达或具有长期 效应的转基因修饰细胞，非临床安全性研究的期限应足以评 估其长期安全性风险。为确定基因表达产物的量效关系，解 释预期和非预期的试验结果，建议在试验中伴随对导入基因 表达水平的定量检测（如采用Q-PCR或ELISA法）以及免疫 原性（ADA）检测。 （三）插入突变风险评估 一些整合性载体（如逆转录病毒、慢病毒、转座子）可 将外源基因插入整合到细胞基因组中，这可能会导致关键基 因突变或激活原癌基因，从而导致恶性肿瘤风险增加。 影响插入突变的关键风险因素包括：1）载体的整合特征， 即插入位点的偏好性；2）载体的设计，如增强子、启动子等构建元件的活性，反式激活邻近基因的潜力；产生剪接突变 体的潜在剪接位点或多聚腺苷酸信号等；3）载体剂量；4）导入基因表达产物的功能活性（如与细胞生长调控相关）和 表达水平；5）靶细胞群的转化可能性，这可能与细胞的分化 状态、增殖潜力、体外培养条件和体内植入环境等有关。 基于已有科学经验和既往非临床/临床研究结果，如果认为基因修饰细胞所采用的载体系统可将外源基因整合到细 胞基因组中并可在体内长期存续，需综合分析以上风险因素， 评估潜在的插入突变风险和致癌性风险。非临床方面，应采 用具有代表性的基因转导细胞进行基因整合位点分析，分析 细胞的克隆组成以及在关注基因（如肿瘤相关调控基因）附 近有无优先整合迹象，含有关注整合位点的细胞有无优先异 常增殖。此外，还应在临床试验中频繁检测转导细胞的基因 插入位点和克隆性来监测和减轻与基因插入突变相关的致 癌性风险。 （四）载体动员（Vector mobilisation）和重组风险评估 应基于载体的选择、载体的设计、目标转导细胞群以及 目标患者人群评估载体与内源性病毒重组和动员的风险。如 果有证据显示此类风险增加，应开展相应的非临床试验评估 载体动员和重组的风险。 九、对特定类型基因修饰细胞产品的特殊考虑 （一）基因修饰的免疫细胞（CAR或TCR修饰的T细胞/NK细胞） 对于CAR或TCR修饰的免疫细胞，应尽可能采用多种方法评估其靶点相关毒性和脱靶毒性风险，如采用合适的动物 模型或体外方法、计算机预测等。 应采用体外方法深入分析靶抗原在人体器官、组织和细 胞中的表达分布情况，基因表达分析库和文献调研也可能会 有助于阐明靶抗原在不同病理生理状态下的表达是否存在 差异。应采用表达和不表达靶抗原的细胞作为靶细胞进行体 外试验，确认CAR或TCR修饰的免疫细胞可特异性的识别和 杀伤靶细胞。 对于CAR修饰的免疫细胞，应采用体外方法（如人质膜蛋白阵列技术等）评估其胞外抗原识别区（一般为抗体的单 链可变区片段）与人体膜蛋白的脱靶结合风险。 TCR修饰免疫细胞的脱靶毒性可通过评估TCR与人体自身抗原肽的交叉识别能力来评估。首先，应采用体外试验测 定TCR修饰的免疫细胞与人自身抗原肽-HLA（与递呈靶抗原 肽的HLA等位基因相同）复合物的亲和力，并说明抗原肽的 选择依据及选择范围。此外，还应研究其他相关或不相关的 蛋白中是否含有靶抗原肽序列。如果TCR与人自身抗原肽有 交叉反应可能，应确定靶抗原肽的最小识别基序（motif），并 采用计算机预测分析评估交叉反应性。如果计算机预测可识 别出具有潜在交叉反应性的抗原肽，应在体外测定TCR修饰 免疫细胞对表达相应蛋白或递呈相应抗原肽的的细胞的识 别能力。如果不能排除交叉反应性，应基于含有潜在交叉反 应性抗原肽的蛋白的表达模式以及TCR与潜在交叉反应性抗 原肽的亲和力来进行风险评估。为获得TCR与其他等位HLA 潜在交叉反应性的信息，应进行足够的HLA交叉反应性筛选。对于TCR修饰的T细胞，还应关注引入TCR链和内源性 TCR之间的错配可能性，应描述和说明旨在降低错配可能性 的TCR设计策略。 （二）诱导多能干细胞（iPS）来源的细胞产品 iPS细胞自身具有致瘤性风险，在体内可形成畸胎瘤。因此，非临床试验中应考虑进行致瘤性试验。体内致瘤性试验 建议采用掺入未分化iPS细胞的细胞产品作为阳性对照，以确 认实验系统的灵敏度。如果iPS细胞设计了自杀机制，应在体 内试验中确认/验证这种自杀机制的功能。 重编程可能会诱导细胞的表观遗传学改变，其后果尚不 完全清楚。为评估iPS细胞衍生细胞的表观遗传学改变所引起 的潜在异常特征，应采用体外和/或体内非临床试验来阐明细胞具有适当的行为和生理功能，毒理学试验还应评估细胞异 常行为引起的不良反应。应结合质量表征数据、非临床安全 性数据以及文献数据进行深入的风险评估，并就旨在保护患 者安全的风险减轻措施进行讨论。如果发现遗传学和/或表观 遗传学改变，应解决相应的安全性问题。 （三）基因编辑的细胞产品 对于基因编辑的细胞产品，应采用相关细胞进行体外在 靶和脱靶活性评估，以确认修饰酶或向导RNA对靶基因序列的特异性。虽然计算机分析可用于预测基因编辑的脱靶风险， 但选择的评价策略仍应包含体外全基因组测序比对，以证明 潜在脱靶位点未出现脱靶。应说明所选择的评价策略的合理 性和敏感性。此外，在评估脱靶活性时，还应评估种属特异 性的差异、细胞（病理）生理状态的差异或细胞类型的差异 对非临床数据预测性的影响。必要时，还应分析基因编辑对 细胞表型和生理功能的潜在影响。 参考文献 1. 细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行），NMPA， 2017年. 2. Quality, non-clinical and clinical aspects of medicinal products containing genetically modified cells. EMA, 2020. 3. Preclinical Assessment of Investigational Cellular and Gene Therapy Products. FDA, 2013. 4. Guideline on Quality, Non-clinical and Clinical Requirements for Investigational Advanced Therapy Medicinal Products in Clinical Trials. EMA, 2019. 5. Long Term Follow-Up After Administration of Human Gene Therapy Products. FDA, 2020. 6. Guideline on the Non-Clinical Studies Required Before First Clinical Use of Gene Therapy Medical Products, EMA, 2008. 基因修饰细胞治疗产品非临床研究与评价技术指导原则（试行）.pdf征求意见反馈表.docx

摘要：线粒体和复杂的内膜系统是真核细胞的重要特征。到目前为止，对活细胞内的细胞器进行操纵仍然十分困难。多功能单细胞显微操作FluidFM技术能够从活细胞中提取、注射细胞器，将定量的线粒体移植到细胞中，同时保持它们的活力。近期，Julia A. Vorholt课题组使用多功能单细胞显微操作FluidFM技术，将线粒体移植至培养的细胞中，并实时跟踪线粒体注射后的情况，监测它们在新宿主细胞中的命运。通过跟踪，作者发现与受体细胞线粒体网络融合发生在移植后20分钟，持续16小时以上。活细胞之间移植线粒体不仅为细胞器生理学的研究开辟了新的前景，也为机械生物学、合成生物学和疾病治疗开辟了新的前景。该篇文章以” Mitochondria transplantation between living cells.”为题，发表在BioRxiv.上。 结果：1. 从活细胞中提取线粒体为了检测FluidFM探针对单细胞细胞器采样的能力。作者使用了两种探针，分别是锥型探针(A=1.2 um2)和圆柱型探针(A=1.6 um2)(图1B)。实验结果表明，使用这两种探针都可以对线粒体及单个线粒体进行提取或大量抽提。作者对内质网（ER）和线粒体提取后的细胞活力进行了检测，发现细胞仍保持较高的细胞活力 (95%)。为了进一步确保FluidFM提取方案在探针插入时不会破坏细胞质膜，作者使用荧光探针(mito-R-GECO1)监测细胞培养基中可能发生的Ca2+内流。实验显示，在操作过程中和操作后都没有Ca2+流入，表明细胞器提取过程中细胞质膜的完整性。本研究还发现暴露在FluidFM负压下的线粒体小体会经历形状的转变，类似于“串上珍珠”的形态。 其特征是离散的线粒体基质球体状，并且通过细长的膜结构相互连接，在进一步负压拉力的作用下，这些球状结构终被拉断，并在悬臂中呈现为球状线粒体(图2E)。进一步探究显示，施加FluidFM负压后，力诱导的形状转变沿线粒体小管在毫秒到秒的范围内传播了数十微米。形状转变沿这一方向均匀传播，而外层线粒体膜(OMM)保持了初的完整性。当牵引力保持数秒后，OMM在先前形成的“珍珠”之间的一个或多个收缩点分离，从而产生立的球形线粒体，而管状结构的其余部分放松并恢复。结合线粒体牵引实验和线粒体定位的钙流实验，结果证明线粒体的串上珍珠表型的形状转变以及随后细胞质内的线粒体裂变是不依赖钙的。 图1：(A) 示意图：使用FluidFM技术进行细胞器提取。通过调整悬臂探针中的负压(-Δp)进行提取。(B) 通过调节孔径大小和流体作用力的适用范围，选择性地提取不同的细胞器成分。1行：用悬梁臂探针提取单细胞细胞器的示意图。2行：不同孔径的悬臂扫描电镜图。3行：FluidFM悬臂探针孔径与对应的流体力范围。(C) 示意图：使用FluidFM技术进行细胞器注射。通过调整悬臂探针中的正压(+Δp)进行将探针中的细胞器注射到受体细胞内。 图2：(A) FluidFM悬臂探针的扫描电子显微镜图像。具体尺寸参数是：L = 200 μm, W = 35 μm, H = 1 μm。Scale bar = 5 μm。(B) 提取线粒体后的FluidFM悬臂的荧光显微镜图像。由于折射率不同，可以看到提取物和悬臂探针填充物之间的边界。Scale bar = 10 μm。(C) 是图(B)的示意图，提取物的体积是1170 fL。(D- F) 活细胞器提取的延时图像和提取后金字塔悬臂图像。黄框表示细胞内的悬臂的位置。(D) 对表达su9-BFP(线粒体)和Sec61-GFP (ER) 的U2OS细胞进行提取。箭头表示ER区域。使用孔径为0.5µm2的悬臂梁探针。Scale bar = 10 μm。(E) 从表达su9-BFP的U2OS细胞中提取单个线粒体。使用1µm2孔径的悬臂梁探针。Scale bar = 10 μm。(F) 从表达su9-BFP的U2OS细胞中提取数个线粒体。使用1µm2孔径的悬臂梁探针。Scale bar = 10 μm。 2. 线粒体移植至新细胞研究人员的下一个目标是将线粒体移植到新的宿主细胞中，并保持细胞活性。FluidFM技术为线粒体转移提供了两种可能性方案：方案一、用FluidFM技术直接提取线粒体而后注入到新的宿主细胞中；方案二、将从细胞中分离纯化的线粒体回充入FluidFM探针，然后注射(图3A-D)。作者比较了两种方法，为了实现可视化的线粒体的转移，作者在供体和受体细胞中分别对线粒体进行了差异化标记 (图3E-F 供体细胞线粒体su9-mCherry和受体细胞线粒体su9-BFP)。当使用FluidFM直接将线粒体从一个细胞移植到另一个细胞时，成功率高达95%，而且保持了细胞活力(图3G, 41个移植细胞中有39个)。在注射纯化线粒体后，作者观察到46%的样本(19/41)发生了线粒体转移且保持了细胞活力(图3G)。移植的定量结果显示，这些实验中移植的线粒体数量从3到15个线粒体每个细胞不等(图3H)。两种替代方案的不同成功率可以由线粒体分离获取的条件差异来解释。在评估线粒体提取方案时，作者观察到部分提取的线粒体外膜发生破裂。线粒体的不可逆损伤导致细胞内降解，细胞色素C释放可能导致细胞凋亡。虽然线粒体的细胞间移植降低了通量，但它的优点是细胞外时间短(1分钟)，并且通过FluidFM采样的线粒体大限度地集中在原生细胞质液中，完全避免了人工缓冲液的使用。在提取和移植之前，作者通过在探针中填充不混溶的C8F18来确保提取液在提取过程中保持在孔径附近。因此，只有很小的体积(0.5 - 2pL)被注入到宿主细胞中(图3B)。除了标记供体细胞的线粒体(su9-mCherry)外，还标记了受体细胞的线粒体(su9- BFP)，这样就能够观察移植细胞线粒体网络的实时状态。在上述两种移植方案(移植和纯化后注射)中，宿主-线粒体网络的管状状态不会因注射过程而产生影响。此外，标记可以让作者可视化地监测线粒体地移植，观察线粒体地融合。 无论移植方法是细胞到细胞(图3I)，还是注射纯化线粒体(图3J)，都可以观察到这些过程。实验跟踪了22个细胞的移植命运：18个细胞显示移植的线粒体完全融合，4个细胞的线粒体发生降解。多数细胞样本(18个细胞中的14个)在移植后30分钟内次观察到融合事件。如上所述，细胞间移植即方案一的效率高，并可以直接观察单个移植线粒体的命运。为了展示这一点，作者将标记好的线粒体(su9-mCherry)从HeLa细胞移植到差异标记的U2OS细胞(su9-BFP)中，这种细胞通常用于研究动态线粒体行为。高灵敏度相机可以用于追踪受体细胞内的单个线粒体(图3L)。作者观察到荧光线粒体基质标签在移植后23分钟的发生初始融合而后扩展到线粒体网络。综上所述，作者建立了两种将线粒体转移到单个培养细胞的方法。 一种方法是活细胞间移植。该方案显示移植后细胞活力高，允许观察移植后线粒体的动态行为，是一种高效方案。二种方法是大量纯化线粒体并将其注射到受体细胞中。 注射速度相当快，但不可避免地损害线粒体和细胞功能。图3：(A) 方案一示意图（活细胞间线粒体移植）：通过FluidFM吸入法提取线粒体。 随后，将带有提取物的悬臂探针移至受体细胞插入并注入提取物。(B) 方案一预填充C8F18的FluidFM悬臂梁的图像，被移植线粒体通过su9-mCherry标记，提取量~0.8 pL。Scale bar = 10 μm。(C) 方案二示意图（纯化线粒体注入细胞）：使用标准线粒体纯化方案纯化的线粒体进行线粒体移植的方案。 将纯化的线粒体重悬在HEPES-2缓冲液中，直接填充到FluidFM探针中并对细胞进行注射。(D) 方案二由su9-mCherry标记的FluidFM悬臂充满线粒体的图像。Scale bar = 10 μm。(E) 通过方案一（活细胞间线粒体移植）进行线粒体移植后的宿主细胞图像。宿主细胞的线粒体通过su9-BFP标记，移植细胞线粒体通过su9-mCherry标记。Scale bar = 10 μm。(F) 通过方案二（纯化线粒体注入细胞）进行线粒体移植后的受体细胞图像。宿主细胞的线粒体通过su9-BFP标记，移植细胞线粒体通过su9-mCherry标记。Scale bar = 10 μm。(G) 通过光学成像对两种方案注射的细胞进行评估。每种方法评估了40个细胞。(H) 两种方案的线粒体的计数评估。每种方法评估了22个细胞。(I) 方案一移植线粒体后，对移植线粒体(su9-mCherry)和宿主线粒体网络(su9-BFP)使用不同的荧光标记进行成像，融合。Scale bar = 5μm。(J) 方案二注入纯化线粒体后移的融合状态，标记方案同(I)。Scale bar = 5 μm。(K) 移植线粒体发生降解，分裂成多个更小的荧光囊泡(su9-mCherry)，荧光与标记的宿主细胞线粒体网络(su9-BFP)没有重叠。Scale bar=5 μm。 (L) 单个移植线粒体的延时图像序列(su9-mCherry)。细胞器供体为HeLa细胞，受体细胞为U2OS细胞，带有荧光标记线粒体网络(su9-BFP)。Scale bar = 10 μm。 讨论单细胞的操纵一直是细胞生物学领域的热点和难点，尤其是在不损害细胞活力的情况下从细胞中提取细胞器或将外源物质直接导入到细胞中。截止到目前，尽管单细胞技术有了较大的发展，但要实现将细胞器从一个细胞移植到另一个细胞，除了更大的卵母细胞外，几乎是不可能实现的。线粒体是细胞中的能量转换的核心，与细胞代谢和信号通路以及细胞命运紧密联系在一起。线粒体含有自身的遗传成分(mtDNA)，通常是严格垂直遗传给子细胞的。目前将线粒体地转移到细胞的手段有限，对于线粒体移植后的剂量-反应关系分析更是十分困难，这样我们就很难从机制上了解健康或疾病细胞的线粒体移植后的生物学效应。本文使用的FluidFM技术采用微型探针，可以在微环境中以高时空分辨率操纵单细胞或者对单个细胞进行采样，并与组学方法相结合，使细胞器的研究成为可能。FluidFM技术将原子力显微镜的高精度力学调节手段与光学检测下的纳米尺度微流控系统相结合，提供与单细胞操作相关的力学和定量的体积控制。这些特性在现有微型探针中是的，在本研究中，作者将FluidFM单细胞技术用于活细胞真核内和细胞间的细胞器微操作。成功实现了活细胞之间的线粒体移植。该研究将启发人们将FluidFM技术应用于更多领域，例如，干细胞治疗中低代谢活性细胞的再生，作为线粒体替代治疗方法的一种备选方案等。此外，FluidFM技术为解决细胞生物学、生物力学和细胞工程等问题提供了新的视角。 多功能单细胞显微操作系统- FluidFM OMNIUM参考文献[1].C. Gäbelein, Q. Feng, E. Sarajlic, T. Zambelli, O. Guillaume-Gentil, B. Kornmann & J. Vorholt. Mitochondria transplantation between living cells. (2021). BioRxiv.

干细胞的研究一直受制于供体细胞很难获得，而且相关实验的伦理风险也不容忽视。因此2007年发明的诱导式多能性干细胞(iPS)技术成为最佳的胚胎干细胞替代。iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。但是iPS转化过程中，会有一定的几率发展为癌细胞。不同体细胞来源的iPS细胞成瘤性有差异。因此，如何筛选安全型iPS细胞是该技术能够进入临床实验的关键。原子力显微镜作为一种三维形貌观察工具，不仅具备超高分辨率，而且支持在液体环境下工作，是一种理想的细胞观测设备。除了形貌观察外，原子力显微镜还可以多种表面属性进行定量观测。例如，基于力学测试的表面机械性能测试。这些特征为原子力显微镜应用于iPS细胞观测与筛选提供了技术基础。为此设计一个实验，分别用原子力显微镜观察未分化的iPS细胞和HeLa细胞。HeLa细胞是一种被广泛使用的癌变细胞，因此可以和iPS细胞进行对比观察。上图显示了SPM形状图像(a)HeLa细胞和(b)iPS细胞。用光学显微镜观察到的相应相位差图像分别显示在(c)和(d)中。图中箭头所示位置处的截面形状轮廓如(e)和(f)所示。从细胞形态上来看，HeLa细胞呈圆顶形，表面隆起比较高，约7um；而iPS细胞呈扁平状且细胞间粘附呈网状结构，细胞高约1.7um。仔细观察细胞之间的边界，可以看出HeLa细胞之间的边界呈凹陷状，而iPS细胞之间的边界是凸起的，而且呈网络状。据此可分析得知这两种细胞各自的间粘附具有差异，且HeLa细胞之间的粘附较弱，而iPS细胞之间的粘附较强。除了形貌观察外，原子力显微镜还可以通过力学测量获得细胞表面的机械性能。如下图所示，用探针针尖压触细胞表面，通过对探针获得的力反馈分析样品各类机械性能。对于本实验，在对64×64点的测量区域进行测量后，从获取的体数据中形成形状图像。该观察中使用的探针是由OlympusCorporation制造的OMCL-TR800PSA并且具有0.15N/m的弹簧常数。测量是在培养液中的活细胞条件下进行的。对细胞的最终压力(排斥力)为2.5nN。通过比较从探针与样品接触的位置到达到2.5nN的力的变化，确定样品的硬度。(a)和(b)显示了SPM观察到的HeLa和iPS细胞的细胞形状图像，(c)和(d)显示了相应的ZX断面图像，是从样品竖截面方向看时在(a)和(b)中箭头所示的X线位置处施加到探针的力的图像。图中上方为测量起点，下方白色虚线为压触终点，显示了样品截面形状轮廓。在ZX图像中，探针与样品接触后检测到力的位置以黄色到红色的颜色显示。因为这表明探针对细胞的变形，所以可以理解较大量的细胞变形显示细胞的较软部分。可以从细胞变形量了解硬度。(c)中的HeLa细胞显示出均匀的变形，但相比之下，在(d)中的iPS细胞中，细胞体较软，细胞间粘附区较硬。分析结果表明，HeLa细胞表面硬度比较均匀，软硬部分差别不大，而iPS细胞主体较软，细胞间粘附区较硬。由以上测试可知，利用原子力显微镜对iPS细胞进行表征，有潜力发展为正常细胞筛选以及剔除癌变细胞的合适工具。本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。

• 什么是活细胞成像？ 活细胞成像(live cell imaging)统称为捕捉活的、活动状态的细胞图像的技术，这些细胞图像可以是单个静态图像，也可以是延时系列图像。相应地，活细胞成像的应用可以分为两大类：❶ 细胞在自然状态下的图像记录。❷ 实时观察和记录细胞、组织或整个生物体的动态过程。• 观察分析活细胞时面临的挑战 ▷ 在相对较短的时间内采集大量信息。▷ 要保持细胞保存在可调节培养环境气体浓度和温度（在很多情况下）的培养室中。▷ 激发光源会损害活细胞。▷ 细胞焦面漂移，无法聚焦。▷ 需要使用配备有软件或硬件控制自动对焦的成像仪器来避免这种情况。Revolution全自动显微镜成像系统Revolution全自动显微镜成像系统部件高度集成内置，节省空间，避免繁琐调试及维护；触屏式操控观察工作站，界面直观简洁，易于学习，方便使用。Revolution全自动显微镜成像系统的光源采用高能LED光源，自动荧光切换把光毒降到最低。▌智能化全自动多功能系统：▶ TimeLapse延时摄影：可以根据设定在特定时间内完成特定间隔时间和特定的拍照张数。▶ 独有的Hyperscan快速成像：30帧高速成像，可以在几秒钟内完成上百张照片的采集。▶ Multi-well Point孔板导航成像：不限定孔位大小，只需输入参数就可以自动完成多孔或单孔采集。▶ Focus Map自定义多点聚焦：可以自动完成不同层面的自动聚焦。▶ Z-Stacking多层扫描大景深成像：完成多层面大景深成像。▶ DHR智能实时数字化降噪：实时完成反卷积计算，得到清晰图像。▌ECHO INCUBATOR为活细胞观察提供一个稳定而灵活的培养环境ECHO INCUBATOR采用紧凑的一体式设计，方便用户快速安装和拆卸。箱体结构透明和大型前置开门设计，可为用户提供清晰的观察视野并方便操作样本。采用无风扇对流加热和循环热空气方案，在消除振动的同时并可防止外部灰尘进入您的样品和仪器光学元件。提供稳定的细胞生长环境，确保适合的细胞培养条件，使细胞处于最佳生长状态。

冷冻保存技术是将细胞长期维持在稳定的状态，从而应用于各种疾病的诊断和治疗。据1970年代以来的研究显示，多种类型细胞冷冻保存后的存活率会随着冷冻速率的不同而不同。大多数种类细胞的存活率与冷冻速率呈倒U形关系：即当超过最佳冷却速率后，细胞存活率随冷冻速率的增加而迅速下降，当低于最佳冷却速率时，细胞存活率随冷冻速率的降低而迅速下降。在快速冷冻速率下，细胞内的冰晶形成（Intracellular ice formation，IIF）会对细胞造成损害，并随着冷冻速率的增加导致细胞活性丧失。然而，IIF的机制仍无定论，目前业内存在的主要有以下三个假设：（1）Mazur假设称细胞外冰晶可以穿过膜孔生长进而诱导细胞内冰晶形成；（2）Asahina则认为冷冻直接破坏细胞膜是导致IIF的原因；（3）Toner等人则提出表面催化形成晶核是造成IIF的原因。　　传统低温光学显微镜技术是有限的，高速图像采集和双光子显微镜可以提高观察细胞冷冻的空间和时间分辨率，虽然可以在低温下观察细胞反应，却不能与每个细胞的活性相关联。显微拉曼光谱技术可对细胞进行无标记检测，并可用于细胞内水的热力学状态（即液态水与冰）等化学属性进行识别，因此可作为探究细胞冷冻反应的有力工具。此外，显微拉曼光谱的高空间分辨率和可区分细胞膜、线粒体等亚细胞结构的能力意味着该工具可用于进一步探究IIF及其成因，并通过拉曼光谱能够直接表征IIF对细胞活性的影响进而判别冷冻细胞后的活性。　　明尼苏达大学研究团队在Biophysical Journal发表题为“CharacterizingIntracellular Ice Formation of Lymphoblasts Using Low-Temperature RamanSpectroscopy”的研究成果（图1）[1]。研究结果表明显微拉曼光谱技术可用于研究细胞在不同冷冻速率和冷冻液成分下的冷冻反应。通过拉曼光谱发现胞内冰晶形成并不一定会导致细胞死亡，但细胞内冰晶的数量及大小会影响细胞活性。另外研究还发现，细胞内冰晶形成靠近于细胞膜并靠近于细胞外冰晶，而通过增加细胞膜和细胞外冰晶间的距离可以减少IIF；实验使用细胞松弛素D破坏肌动蛋白细胞骨架以改变细胞膜的渗透性来增加胞内冰晶形成量，当存在胞内冰晶时，可以显著的观察到细胞内渗透梯度，这些观察结果揭示了细胞膜与胞外冰晶的相互作用是导致IIF的原因。图1 研究成果（图源：[1]）　　此项研究选用Jurkat细胞作为淋巴细胞的模型细胞，采用的共聚焦显微拉曼系统Alpha 300R配备：UHTS300光谱仪、600 l/mm光栅以及DV401 CCD检测器。激发光源波长为532 nm，100×物镜(NA=0.9)，聚焦在被测物上的光功率为10mW，显微分辨率约为296 nm。将细胞冷冻至-50℃，并在成像前保持20分钟。每幅图像有60×60个像素，每个像素点采集的积分时间为0.2秒，因此，对整个细胞进行成像总共需要12分钟。分别在第20、80和140分钟时对相同细胞进行拉曼光谱成像采集，以排除来自激光照射带来的光损伤/光漂白的热量影响。　　单细胞中细胞色素c的分布被作为冷冻状态下细胞活性的衡量标准，其拉曼成像结果与台盼蓝染色结果高度一致。细胞色素c的空间分布使用 Moran' s I量化，并被用作细胞活性的标记。Moran' s I是一种基于信号位置和强度的进行空间相关性度量的方法，其值为-1时表示信号完全分散，+1时表示信号完全相关，0时表示信号随机分布。细胞色素c在750、1127、1314和1585 cm-1处具有强烈的拉曼信号，本实验以1127 cm-1作为标记峰用于生成细胞色素c的拉曼成像，并通过吖啶橙/碘化丙啶（Acridine orange/Propidium iodide，AO/PI）染色验证解冻后细胞的活性。根据常见的细胞内、外物质的特征峰位置（表1，图2），整合每个像素的光谱来组合拉曼成像，表征冰晶的大小、冷冻保护剂的细胞内浓度以及外部冰与细胞膜的接近程度。表1 拉曼光谱的波数分布数据来源：[1]∣制表：生物探索编辑团队图2 不同物质的拉曼光谱（图源：[1]）　　注：1)海藻糖；2)葡聚糖；3)DMSO；4)=细胞色素c；5)冰；6)冷冻保存在10% DMSO中的Jurkat细胞。根据左边的特定信号渲染出右边图像，并以光学显微镜图像为参考。　　结果发现：1　　细胞色素c的拉曼光谱可表征细胞复温后活性　　解冻后细胞复苏率与冷冻速率的之间的函数绘制曲线呈倒U形，可知“最佳”冷冻速率为1-3℃/min，当冷冻速率高于该曲线时认为是过快的，并会与IIF相关（图3A）。在冷冻细胞的不同焦平面上获得的拉曼成像显示，细胞中间（中心）的细胞色素c图像提供了最强的信号（图3B）。台盼蓝染色阴性细胞（活细胞）的细胞色素c局部拉曼信号强且最低Moran' s I值为0.65，而台盼蓝染色阳性细胞（死细胞）没有可区分的细胞色素c拉曼峰（图3C）。因此，可使用0.65的Moran' s I值作为区分活细胞和死细胞的阈值水平。图3 Jurkat细胞活性的拉曼检测（图源：[1]）　　注：（A）在10% DMSO中冷冻Jurkat细胞后的复苏率与冷冻速率的函数曲线图。（B）冷冻细胞在三个不同深度焦平面上细胞色素c的拉曼成像。（C）通过拉曼光谱检测冷冻后Jurkat细胞的活性并使用台盼蓝进行验证，对应的细胞色素c的拉曼特征、拉曼成像和计算的Moran' s I值。2　　拉曼光谱可分析细胞内冰晶的形成　　拉曼光谱测定了细胞在1、10和50℃/min冷冻速率下的细胞活性：以1℃/min冷冻保存后的细胞中有80%是活的，以10℃/min冷冻保存后的有60%的细胞是活的，而以50℃/min冷冻保存后的只有20%的细胞是活的（图4A）。每个细胞内冰的相对量可以根据冰的横截面积与细胞的横截面积的比值（Aic）来估计。Aic与不同冷冻速率相关性函数（图4B），Aic随着冷却速率的增加而增加。统计Aic与Moran' s I值的函数曲线图，结果表明活细胞中的冰晶比死细胞少，但存在群体上的差异（图4C）。图4 不同冷却速率下细胞内细胞色素C和冰晶的分布（图源：[1]）3　　基于拉曼图像可计算IIF的冰晶尺寸及位置　　在不同冷冻速率下，大多数细胞仅存在小冰晶。图5 细胞内冰晶的拉曼成像（图源：[1]）4　　拉曼图像可表征冰晶、细胞膜和IIF的相互作用　　分别将细胞以10℃/min的冷冻速率在10% DMSO或10% DMSO+10%葡聚糖中进行冷冻保存。通过拉曼成像分析IIF和Aic，细胞通常存在于相邻冰晶之间的未冷冻溶液中（图6A）。实验观察指定了两个不同的区域：1）细胞外冰晶靠近细胞膜的区域；2）相邻冰晶之间的区域，其中细胞膜远离细胞外冰晶（图6B）。通过测量细胞和细胞外冰晶之间的未冷冻溶液的厚度来表示细胞膜与细胞外冰晶的接近度（图6C）。图6 在10% DMSO或10% DMSO+10%葡聚糖中冰和Aic的拉曼图像（图源：[1]）5　　拉曼验证破坏细胞骨架增加了细胞内冰晶的形成量　　质膜不是孤立地起作用，而是与细胞中的其他结构相互作用，特别是细胞骨架。为了确定破坏膜结构对IIF的影响，将Jurkat细胞放置于50以及250μM细胞松弛素D（Cytochalasin D，CD）中培养30分钟，然后在10% DMSO中以10℃/分钟的速率进行冷冻。对于存在CD的实验，在10个细胞中有2个中观察到大块冰晶（图7A）。约83%的细胞靠近细胞膜存在比例很高的细胞外冰晶，其中带有大块冰晶的细胞确认死亡，而带有小冰晶的细胞部分死亡部分存活。细胞内冰晶与细胞膜的空间定位确证在细胞外冰晶附近（图7B）。在所有实验条件下，IIF的细胞比例相同（100%），但结果显示Aic会随着CD浓度的增加而显著增加（图7C）。图7 细胞松弛素破坏细胞骨架对IF的影响（图源：[1]）此项研究证实了拉曼光谱技术可用于研究细胞在不同冷冻速率、不同冷冻保护剂下的冷冻反应。此外研究还表明了IIF靠近于细胞膜，特别是与细胞外冰晶相邻的位置。随着靠近细胞膜且与胞外冰晶相邻的比例增加，IIF比例也会增加，并且随着细胞膜和胞外冰晶之间的距离减小，IIF比例也会随之增加，这些结果表明细胞膜和细胞外冰晶之间的相互作用是造成IIF的原因。该研究还进一步了解了冷冻保护剂的潜在作用机制，但是，研究中无法通过拉曼技术将细胞骨架与细胞内其他蛋白质成分区分开来，因此也无法明确IIF是否会损害细胞骨架。

20世纪60年代，自骨髓移植成功治疗造血系统疾病以来，人们对干细胞治疗的研究产生了极大的兴趣。干细胞是具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是机体的起源细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞或组织器官。干细胞治疗是把健康的干细胞移植到病人体内，以达到修复病变细胞或重建功能正常的细胞和组织的目的。 在刚刚结束的&ldquo 2011细胞治疗技术研讨会&rdquo 上， GE医疗的全球研发总监Dr. Stephen Minger做了题为《Therapeutic and Research Potential of Human Stem Cells》的演讲，分享了他对人类干细胞研究与临床应用潜力的看法。 Dr. Stephen Minger 演讲现场 干细胞疗法就像给机体注入新的活力，相比于常规方法，具有很多突出优势。目前很多细胞退行性疾病的发病机理幵不明确，如心脑血管疾病、糖尿病、肝硬化、肢体缺血性疾病等，由于干细胞具有"修复再生"的生物学特性，干细胞治疗有可能成为此类疾病的终结者。无论是自体干细胞移植还是异体干细胞移植，由于所采用的干细胞免疫原性非常低，几乎不引起排异反应，因此，干细胞治疗高效安全、无毒副作用，同时，干细胞治疗可以很好的与基因治疗相结合，还是基因治疗的良好载体。成体干细胞取自成人自体或胎盘和脐带血，因此来源十分广泛，不用担心治病"原材料"短缺的问题。 干细胞技术是当今生命科学的聚焦点，被誉为二十一世纪生物和医学技术领域可能取得革命性突破的项目，有望启动具有划时代影响的一场"医学革命"，将会为社会带来巨大的社会效益。 干细胞研究和临床应用需要严格的监测细胞的属性，以确定该细胞是否保留其多能性，处于分化阶段，这对于确认干细胞性质非常重要。此外，也需要有适当的分析方法用于测试和优化干细胞的培养和分化条件。这些方法通常包括使用流式细胞仪分析生物标志物的表达，以及用RT - PCR迚行基因表达的研究。然而当前，高内涵分析技术较上述技术体现了更多的研究优势，帮助研究者更好地定量研究干细胞的多能性与分化作用，实现科研与临床的转化。 通用电气医疗集团（GE Healthcare）推出了IN Cell系列最新一代高端产品IN Cell Analyzer 6000 激光共聚焦高内涵细胞成像分析系统，它将高质量激光光源和高内涵细胞成像分析相结合的系统，使高速度和高质量细胞图像获取和分析达到统一，为客户提供了快速而精准的细胞技术分析平台。它可以满足要求更高的高内涵分析和筛选。拥有专利技术的光学系统采用了全新的设计理念：IN Cell Analyzer 6000的共聚焦光阑是可变的，类似于眼球虹膜控制瞳孔的大小；感光成像采用了新一代科研级sCMOS技术。针对不同要求和难度的实验，IN Cell Anaylzer 6000提供成像速度和图像质量最优组合。 与此同时，GE还推出了以金属卤素为荧光光源的IN Cell Analyzer 2000全自动荧光显微镜型细胞高内涵成像分析系统。该系统非常灵活，使用广泛，可以为您实现一些以前无法完成的实验设想。可实现从显微观察到自动化筛选，以及细胞器、细胞、组织和整个生物体的成像。IN Cell Analyzer 2000有着硬件和软件的独特组合，能够非常快速地获取图像，是筛选的理想选择。该仪器是利用六西格玛原理来设计的，结构坚固，能确保它在多用户环境中高通量应用的可靠性。

2022 年 6 月 3 日 医疗技术公司 BD（Becton, Dickinson and Company）（纽约证券交易所代码：BDX）宣布发布新品BD FACSDiscover™ S8 细胞分选仪。据介绍，该款仪器旨在使研究人员能够以前所未有的速度查看和分类细胞，这为改变病毒学和肿瘤学等一系列领域的研究和基于细胞的治疗开发创造了潜力，如以及许多疾病状态。全新 BD FACSDiscover™ S8 细胞分选仪新的 BD FACSDiscover™ S8 细胞分选仪采用了突破性的 BD CellView™ 图像技术，该技术于今年早些时候登上了《科学》杂志的封面。它是第一款将先进的光谱流式细胞术与能够进行分选的图像分析相结合的细胞分选仪，这可能使研究人员能够产生更准确的数据并对以前无法识别的细胞进行分选。“细胞分选的这一进步填补了生物医学研究中长期存在的空白，使科学家能够进行高参数实验，同时快速查看和分选具有特定、可视化感兴趣特征的细胞，”Westmead 科学运营总监 Xin Maggie Wang 博士说医学研究所。“对于从事光谱流式细胞术的研究人员来说，实际看到与您相互作用的细胞会让您对结果更有信心，并使您能够以前所未有的方式观察细胞，并回答以前可能无法想象的问题。”通过光谱流式细胞仪进行细胞分选是一项尖端技术，它捕获样品制备发出的全光谱信号，而不是像传统流式细胞术那样捕获特定波段，让科学家使用更多参数对细胞进行分类，以更好地了解人类健康、疾病和治疗。BD FACSDiscover™ S8 细胞分选仪将先进的光谱流式细胞术与新颖的 BD CellView™ 图像技术相结合，该技术可捕获流经系统的单个细胞的图像，并根据每个细胞的详细显微图像分析以高速分选对它们进行分选。这种组合使科学家能够更准确地了解可以实时视觉确认的细胞群和特征，并在简化的实验工作流程中对以前无法识别的细胞进行询问和分类。BD FACSDiscover™ S8 细胞分选仪是第一款采用 BD CellView™ 图像技术的 BD 仪器。 BD Biosciences 全球总裁Puneet Sarin说：“通过将高参数光谱流式细胞仪的功能与前所未有的细胞图像及其内部运作相结合，我们正在定义细胞分选的新标准，并将细胞的功能掌握在研究人员手中。采用 BD CellView™ 图像技术的 BD FACSDiscover™ S8 细胞分选仪代表了 BD 流式细胞仪创新和领先地位的新篇章，再加上我们新的光谱优化的 BD Horizon RealYellow™ 和 RealBlue™ 试剂等补充工具，我们正在很高兴看到科学界将如何利用它在更短的时间内以更大的信心实现突破性发现，并发现有助于塑造健康未来的新应用。”有关 BD FACSDiscover™ S8 细胞分选仪的更多信息，请持续关注仪器信息网更多报道。

[报告简介] 单细胞的操纵一直是细胞生物学领域的热点和难点，尤其是在不损害细胞活力的情况下从细胞中提取细胞器或将外源物质直接导入到细胞中。截止到目前，尽管单细胞技术有了较大的发展，但要实现将细胞器从一个细胞移植到另一个细胞，除了更大的卵母细胞外，几乎是不可能实现的。 线粒体和复杂的内膜系统是真核细胞的重要特征，是细胞中能量转换的核心，与细胞代谢和信号通路以及细胞命运紧密联系在一起。线粒体含有自身的遗传成分(mtDNA)，通常是严格垂直遗传给子细胞的。到目前为止，对活细胞内的细胞器进行操纵十分困难，将线粒体地转移到细胞的手段有限，对于线粒体移植后的剂量-反应关系分析更是十分困难，这样我们就很难从机制上了解健康或疾病细胞的线粒体移植后的生物学效应。多功能单细胞显微操作FluidFM技术能够从活细胞中提取、注射细胞器，将定量的线粒体移植到细胞中，同时保持它们的活力。 本报告分为两部分：1. 来自ETH的Dr. Christoph G. Gäbelein使用多功能单细胞显微操作FluidFM技术，将线粒体移植至培养的细胞中，并实时跟踪线粒体注射后的情况，监测它们在新宿主细胞中的命运。通过跟踪发现被移植线粒体与受体细胞线粒体网络融合发生在移植后20分钟，持续16小时以上。活细胞之间移植线粒体不仅为细胞器生理学的研究开辟了新的前景，也为机械生物学、合成生物学和疾病治疗开辟了新的前景。本次报告Dr. Christoph G. Gäbelein将对上述文章和数据进行详细分享。2. 2020年9月，国内套FluidFM多功能单细胞显微操作系统在北京大学生命科学学院顺利安装并交付使用。期间，在北京大学生命科学学院公共仪器中心光学成像平台覃思颖老师和Quantum Design中国工程师胡西博士的帮助下，成功举办多场workshop，FluidFM多功能单细胞显微操作系统助力北大发表多篇paper。本次报告中，覃思颖老师将分享多功能单细胞显微操作系统FluidFM技术的实验操作案例与运行维护经验。[直播入口]请扫描下方二维码进入FluidFM单细胞显微操作技术群，届时会在微信群中实时更新直播入口，无需注册！扫码进群，即刻获取直播链接，无需注册！[报告时间]06月08日 下午15:00-16:00 [主讲人介绍]Christoph G. Gäbelein，ETHChristoph是一名来自ETH的青年科学家，科研中他一直致力于将FluidFM单细胞显微操作技术应用于更多的生命科学场景中。在过去两年间，他以一作或参与者的身份发表了FluidFM多篇文章：2022 Mitochondria transplantation between living cells2022 Injection into and extraction from single fungal cells.2021 Single cell engineering using fluidic force microscopy.2021 Genome-wide molecular recording using Live-seq.Christoph对于FluidFM技术的应用具备丰富而完善的经验，文章也是高产的，目前Christoph已经成为了FluidFM技术领域的专家。本次Webinar，Christoph将介绍他应用技术的新成果，并详细阐述从活细胞中提取、注射线粒体，将定量的线粒体移植到细胞中，同时保持它们的活力的技术细节。Christoph的座右铭是：Curiosity-driven young scientist interested in fundamental cell biology 覃思颖，北京大学生命科学学院公共仪器中心光学成像平台工程师。2016年于北京大学获得生物物理学博士学位，博士期间以作者在Nature Materials发表论文，博士后期间入选届北京大学博雅博士后项目。2019年加入北京大学生科院公共仪器中心，负责原子力显微镜、多功能单细胞显微操作系统、共聚焦显微镜等大型仪器的技术支持与运行管理，在多尺度生物样品的原子力制样与成像力学检测、单细胞注射与分离等显微操作、生物荧光成像与图像处理分析等方面有着丰富的经验，为校内外100余课题组提供技术服务，辅助课题组在Nature、Cell、Nature Cell Biology等国际期刊发表论文30余篇。本次报告将分享多功能单细胞显微操作系统FluidFM技术的实验操作案例与运行维护经验。[应用简介]1. 从活细胞中提取线粒体 为了检测FluidFM探针对单细胞细胞器采样的能力。作者使用了两种探针，分别是锥型探针(A=1.2 μm2)和圆柱型探针(A=1.6 μm2)(图1B)。实验结果表明，使用这两种探针都可以对单个线粒体及多个线粒体进行提取或大量抽提。图1：(A) 示意图：使用FluidFM技术进行细胞器提取。通过调整悬臂探针中的负压(-Δp)进行提取。(B) 通过调节孔径大小和流体作用力的适用范围，选择性地提取不同的细胞器成分。1行：用悬梁臂探针提取单细胞细胞器的示意图。2行：不同孔径的悬臂扫描电镜图。3行：FluidFM悬臂探针孔径与对应的流体力范围。(C) 示意图：使用FluidFM技术进行细胞器注射。通过调整悬臂探针中的正压(+Δp)进行将探针中的细胞器注射到受体细胞内。 对线粒体提取后的细胞活力进行了检测，发现细胞仍保持较高的细胞活力 (95%)。为了进一步确保FluidFM提取方案在探针插入时不会破坏细胞质膜，作者使用荧光探针(mito-R-GECO1)监测细胞培养基中可能发生的Ca2+内流。实验显示，在操作过程中和操作后都没有Ca2+流入，表明细胞器提取过程中细胞质膜的完整性。 本研究还发现暴露在FluidFM负压下的线粒体小体会经历形状的转变，类似于“串上珍珠”的形态。 其特征是离散的线粒体基质球体状，并且通过细长的膜结构相互连接，在进一步负压拉力的作用下，这些球状结构终被拉断，并在悬臂中呈现为球状线粒体(图2E)。进一步探究显示，施加FluidFM负压后，力诱导的形状转变沿线粒体小管在毫秒到秒的范围内传播了数十微米。形状转变沿这一方向均匀传播，而外层线粒体膜(OMM)保持了初的完整性。当牵引力保持数秒后，OMM在先前形成的“珍珠”之间的一个或多个收缩点分离，从而产生立的球形线粒体，而管状结构的其余部分放松并恢复。结合线粒体牵引实验和线粒体定位的钙流实验，结果证明线粒体的串上珍珠表型的形状转变以及随后细胞质内的线粒体裂变是不依赖钙的。图2(A) FluidFM悬臂探针的扫描电子显微镜图像。具体尺寸参数是：L = 200 μm, W = 35 μm, H = 1 μm。Scale bar = 5 μm。(B) 提取线粒体后的FluidFM悬臂的荧光显微镜图像。由于折射率不同，可以看到提取物和悬臂探针填充物之间的边界。Scale bar = 10 μm。(C) 是图(B)的示意图，提取物的体积是1170 fL。(D- F) 活细胞器提取的延时图像和提取后金字塔悬臂图像。黄框表示细胞内的悬臂的位置。(D) 对表达su9-BFP(线粒体)和Sec61-GFP (ER) 的U2OS细胞进行提取。箭头表示ER区域。使用孔径为0.5 µm2的悬臂梁探针。Scale bar = 10 μm。(E) 从表达su9-BFP的U2OS细胞中提取单个线粒体。使用1 µm2孔径的悬臂梁探针。Scale bar = 10 μm。(F) 从表达su9-BFP的U2OS细胞中提取数个线粒体。使用1 µm2孔径的悬臂梁探针。Scale bar = 10 μm。 2. 将线粒体移植至新细胞 研究人员的下一个目标是将线粒体移植到新的宿主细胞中，并保持细胞活性。FluidFM技术为线粒体转移提供了两种可能性方案：方案一、用FluidFM技术直接提取线粒体而后注入到新的宿主细胞中；方案二、将从细胞中分离纯化的线粒体回充入FluidFM探针，然后注射(图3A-D)。作者比较了两种方法，为了实现可视化的线粒体的转移，作者在供体和受体细胞中分别对线粒体进行了差异化标记 (图3E-F 供体细胞线粒体su9-mCherry和受体细胞线粒体su9-BFP)。当使用FluidFM直接将线粒体从一个细胞移植到另一个细胞时，成功率高达95%，而且保持了细胞活力(图3G, 41个移植细胞中有39个)。在注射纯化线粒体后，作者观察到46%的样本(19/41)发生了线粒体转移且保持了细胞活力(图3G)。移植的定量结果显示，这些实验中移植的线粒体数量从3到15个线粒体每个细胞不等(图3H)。两种替代方案的不同成功率可以由线粒体分离获取的条件差异来解释。在评估线粒体提取方案时，作者观察到部分提取的线粒体外膜发生破裂。线粒体的不可逆损伤导致细胞内降解，细胞色素C释放可能导致细胞凋亡。 虽然线粒体的细胞间移植降低了通量，但它的优点是细胞外时间短(1分钟)，并且通过FluidFM采样的线粒体大限度地集中在原生细胞质液中，完全避免了人工缓冲液的使用。在提取和移植之前，作者通过在探针中填充不混溶的C8F18来确保提取液在提取过程中保持在孔径附近。因此，只有很小的体积(0.5 - 2pL)被注入到宿主细胞中(图3B)。 除了标记供体细胞的线粒体(su9-mCherry)外，还标记了受体细胞的线粒体(su9- BFP)，这样就能够观察移植细胞线粒体网络的实时状态。在上述两种移植方案(移植和纯化后注射)中，宿主-线粒体网络的管状状态不会因注射过程而产生影响。此外，标记可以让作者可视化地监测线粒体地移植，观察线粒体地融合。 无论移植方法是细胞到细胞(图3I)，还是注射纯化线粒体(图3J)，都可以观察到这些过程。实验跟踪了22个细胞的移植命运：18个细胞显示移植的线粒体完全融合，4个细胞的线粒体发生降解。多数细胞样本(18个细胞中的14个)在移植后30分钟内次观察到融合事件。 如上所述，细胞间移植即方案一的效率高，并可以直接观察单个移植线粒体的命运。为了展示这一点，作者将标记好的线粒体(su9-mCherry)从HeLa细胞移植到差异标记的U2OS细胞(su9-BFP)中，这种细胞通常用于研究动态线粒体行为。高灵敏度相机可以用于追踪受体细胞内的单个线粒体(图3L)。作者观察到荧光线粒体基质标签在移植后23分钟的发生初始融合而后扩展到线粒体网络。 综上所述，作者建立了两种将线粒体转移到单个培养细胞的方法。 一种方法是活细胞间移植。该方案显示移植后细胞活力高，允许观察移植后线粒体的动态行为，是一种高效方案。二种方法是大量纯化线粒体并将其注射到受体细胞中。 注射速度相当快，但不可避免地损害线粒体和细胞功能。图3(A) 方案一示意图（活细胞间线粒体移植）：通过FluidFM吸入法提取线粒体。 随后，将带有提取物的悬臂探针移至受体细胞插入并注入提取物。(B) 方案一预填充C8F18的FluidFM悬臂梁的图像，被移植线粒体通过su9-mCherry标记，提取量~0.8 pL。Scale bar = 10 μm。(C) 方案二示意图（纯化线粒体注入细胞）：使用标准线粒体纯化方案纯化的线粒体进行线粒体移植的方案。 将纯化的线粒体重悬在HEPES-2缓冲液中，直接填充到FluidFM探针中并对细胞进行注射。(D) 方案二由su9-mCherry标记的FluidFM悬臂充满线粒体的图像。Scale bar = 10 μm。(E) 通过方案一（活细胞间线粒体移植）进行线粒体移植后的宿主细胞图像。宿主细胞的线粒体通过su9-BFP标记，移植细胞线粒体通过su9-mCherry标记。Scale bar = 10 μm。(F) 通过方案二（纯化线粒体注入细胞）进行线粒体移植后的受体细胞图像。宿主细胞的线粒体通过su9-BFP标记，移植细胞线粒体通过su9-mCherry标记。Scale bar = 10 μm。(G) 通过光学成像对两种方案注射的细胞进行评估。每种方法评估了40个细胞。(H) 两种方案的线粒体的计数评估。每种方法评估了22个细胞。(I) 方案一移植线粒体后，对移植线粒体(su9-mCherry)和宿主线粒体网络(su9-BFP)使用不同的荧光标记进行成像，融合。Scale bar = 5μm。(J) 方案二注入纯化线粒体后移的融合状态，标记方案同(I)。Scale bar = 5 μm。(K) 移植线粒体发生降解，分裂成多个更小的荧光囊泡(su9-mCherry)，荧光与标记的宿主细胞线粒体网络(su9-BFP)没有重叠。Scale bar=5 μm。 (L) 单个移植线粒体的延时图像序列(su9-mCherry)。细胞器供体为HeLa细胞，受体细胞为U2OS细胞，带有荧光标记线粒体网络(su9-BFP)。Scale bar = 10 μm。 讨论 FluidFM技术采用微型探针，可以在微环境中以高时空分辨率操纵单细胞或者对单个细胞进行采样，并与组学方法相结合，使细胞器的研究成为可能。FluidFM技术将原子力显微镜的高精度力学调节手段与光学检测下的纳米尺度微流控系统相结合，提供与单细胞操作相关的力学和定量的体积控制。这些特性在现有微型探针中是的，在本研究中，作者将FluidFM单细胞技术用于活细胞真核内和细胞间的细胞器微操作。成功实现了活细胞之间的线粒体移植。 该研究将启发人们将FluidFM技术应用于更多领域，例如，干细胞治疗中低代谢活性细胞的再生，作为线粒体替代治疗方法的一种备选方案等。此外，FluidFM技术为解决细胞生物学、生物力学和细胞工程等问题提供了新的视角。

前所未有的全自动高精度单细胞操纵平台！多功能单细胞显微操作FluidFM技术首次将原子力系统、显微成像系统、微流控系统、活细胞培养系统融为一体的单细胞显微操作平台，其核心技术——FluidFM技术采用了纳米级别中空探针，完美实现了单个细胞水平、fL级别超高精度、全自动化的细胞及细胞器的操作。是一套超温柔，纳米级，全自动的细胞操纵方案。这项技术将传统细胞显微操作实验无法触及领域的大门彻底打开，科学家可以在单个细胞上实现前所未有的精妙操纵。其主要功能包括单细胞提取、单细胞分离、活细胞细胞器移植、单细胞注射、单细胞力谱等。图1 FluidFM技术整机外观及原理示意图在活细胞中也能进行细胞器操纵？多功能单细胞显微操作FluidFM技术首次实现活细胞间线粒体移植线粒体和复杂的内膜系统是真核细胞的重要特征。到目前为止，对活细胞内的细胞器进行操纵仍然十分困难。多功能单细胞显微操作FluidFM技术能够从活细胞中提取、注射细胞器，将定量的线粒体移植到细胞中，同时保持它们的活力。近期，Julia A. Vorholt课题组使用多功能单细胞显微操作FluidFM技术，将线粒体移植至培养的细胞中，并实时跟踪线粒体注射后的情况，监测它们在新宿主细胞中的命运。通过跟踪，作者发现与受体细胞线粒体网络融合发生在移植后20分钟，持续16小时以上。活细胞之间移植线粒体不仅为细胞器生理学的研究开辟了新的前景，也为机械生物学、合成生物学和疾病治疗开辟了新的前景。该篇文章以” Mitochondria transplantation between living cells.”为题，发表在BioRxiv.上。1从活细胞中提取线粒体在FluidFM负压下的线粒体小体会经历形状的转变，类似于“串上珍珠”的形态。其特征是离散的线粒体基质球体状，并且通过细长的膜结构相互连接，在进一步负压拉力的作用下，这些球状结构最终被拉断，并在悬臂中呈现为球状线粒体（图2）。当牵引力保持数秒后，OMM在先前形成的“珍珠”之间的一个或多个收缩点分离，从而产生独立的球形线粒体，而管状结构的其余部分放松并恢复。图2 提取线粒体后的FluidFM悬臂探针的显微图像及示意图2线粒体移植至新细胞研究人员的下一个目标是将线粒体移植到新的宿主细胞中，并保持细胞活性。FluidFM技术为线粒体转移提供了最佳的两步走方案：第一步，用FluidFM技术直接提取线粒体，第二步，将提取的线粒体注入到新的宿主细胞中。该方案的成功率高达95%，而且保持了细胞活力，其优点是细胞器在细胞外停留的时间短(1分钟)，并且通过FluidFM采样的线粒体最大限度地集中在原生细胞质液中，完全避免了人工缓冲液的使用。保持了线粒体和细胞的纯度，避免了其他因素的影响。作者标记供体细胞的线粒体(su9-mCherry)和受体细胞的线粒体(su9- BFP)，能够观察移植细胞线粒体网络的实时状态（图3）。实验跟踪了22个细胞的移植命运：18个细胞显示移植的线粒体完全融合，4个细胞的线粒体发生降解。多数细胞样本(18个细胞中的14个)在移植后30分钟内首次观察到融合事件而后扩展到线粒体网络。综上所述，作者建立了将线粒体转移到单个培养细胞的方法。该方案显示移植后细胞活力高，允许观察移植后线粒体的动态行为，是一种高效方案。图3 单个移植线粒体的延时图像序列(su9-mCherry)。细胞器供体为HeLa细胞，受体细胞为U2OS细胞，带有荧光标记线粒体网络(su9-BFP)。Scale bar = 10 μm。本文使用的FluidFM技术采用微型探针，可以在微环境中以高时空分辨率操纵单细胞或者对单个细胞进行采样，并与组学方法相结合，使细胞器的研究成为可能。FluidFM技术将原子力显微镜的高精度力学调节手段与光学检测下的纳米尺度微流控系统相结合，提供与单细胞操作相关的力学和定量的体积控制。这些特性在现有微型探针中是独一无二的，在本研究中，作者将FluidFM单细胞技术用于活细胞真核内和细胞间的细胞器微操作。成功实现了活细胞之间的线粒体移植。，时长00:07单个线粒体移植视频该研究将启发人们将FluidFM技术应用于更多领域，例如，干细胞治疗中低代谢活性细胞的再生，作为线粒体替代治疗方法的一种备选方案等。此外，FluidFM技术为解决细胞生物学、生物力学和细胞工程等问题提供了新的视角。

前言骆清铭院士和龚辉教授带领MOST团队发明的显微光学切片断层成像系列技术（MOST/fMOST）作为介观尺度最精准的三维完整器官成像技术，已在神经机制、脑疾病、心脑血管疾病以及药理毒理等科学前沿领域研究中发挥重要作用，并带动了相关标记技术和大数据处理和解析技术的发展。 文章题目：Single-neuron projectomes of mouse paraventricular hypothalamic nucleus oxytocin neurons reveal mutually exclusive projection patterns发表时间：2024年1月29日发表期刊： Neuron研究团队：北京大学生命科学学院黎胡明珠、华中科技大学苏州脑空间信息研究院江涛是论文的共同第一作者；北京大学于翔教授、华中科技大学李安安教授、西湖实验室边文杰研究员为论文的共同通讯作者 催产素是九个氨基酸组成的环状神经肽，由大脑中的神经细胞合成、分泌。其最早被报道的作用是促进分娩和泌乳，主要由垂体分泌至外周循环的催产素完成。进一步研究发现催产素还参与维持机体代谢平衡和内稳态，并调控社交行为、学习与记忆、奖赏等复杂行为。关于催产素的研究已经持续百年，但其多样功能的结构基础仍不清楚。一个关键问题是，催产素神经元如何将催产素分泌至各个脑区及外周组织，从而实现特定功能的调控。前人研究表明大脑中产生催产素的神经元主要分布在14个脑区中，其中下丘脑室旁核（paraventricular hypothalamic nucleus, PVH）拥有数量最多且投射最为复杂的催产素神经元。因此，对于室旁核催产素神经元投射的形态解析对理解其功能多样性至关重要。室旁核包含两类传统方法定义的催产素神经元类群：大细胞催产素神经元被认为拥有复杂的轴突结构并参与中枢和外周的调控，小细胞催产素神经元主要参与中枢自主神经调控（图1）。然而群体示踪的方法无法精细区分两类神经元的投射图谱，也无法揭示每一类群中是否存在进一步的功能与形态异质性。系统性重构单神经元形态为解答这一问题提供了可能。 2024年1月29日北京大学于翔团队与合作者在 Neuron 期刊发表了题为“Single-neuron projectomes of mouse paraventricular hypothalamic nucleus oxytocin neurons reveal mutually exclusive projection patterns”的研究论文，在单细胞水平揭示了下丘脑室旁核催产素神经元的完整形态。中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心与上海科技大学联合培养，目前就职于北京大学生科院的黎胡明珠博士为第一作者。 图1：（左）根据传统分类与群体示踪的大细胞催产素神经元（magnocellular）与小细胞催产素神经元（parvocellular）分类。（右）基于系统性重构单神经元形态提出的室旁核催产素神经元C1与C2分类 该研究首先构建了病毒载体rAAV-EF1α-DIO-YPet-p2A-mGFP，在Oxytocin-ires-Cre小鼠中实现了室旁核催产素神经元的稀疏高亮标记。通过荧光显微光学切片断层成像（fluorescence micro-optical sectioning tomography, fMOST）对稀疏标记样本进行全脑成像，用Fast Neurite Tracer进行形态追踪，重构了264个室旁核催产素神经元的完整三维形态，从而绘制了亚微米分辨率下的单神经元全脑投射图谱。进一步通过层级聚类和投射靶点相关性分析，揭示室旁核催产素神经元包含两类投射模式互斥的类群。其中，C1类包括177个神经元，轴突较短且终止于正中隆起（连接下丘脑与垂体的脑区），仅有少量分支分布于下丘脑区域，且对其他脑区几乎没有投射（图2，红色）；C2类包括87个神经元，其轴突广泛投射至除正中隆起之外的两百余个脑区，涵盖新皮质、嗅区、海马结构、皮质板下层、纹状体、苍白球、丘脑、下丘脑、中脑、脑干、脑桥、延髓、小脑和纤维束（图2，绿色）。每一类群又可进一步分为投射模式不同的三个亚类。此外，还发现室旁核催产素神经元，特别是C2类神经元的树突形态复杂并可延伸至室旁核以外，而C1类神经元的树突则较简单且分布在胞体附近，两类神经元胞体位置有一定偏好，并具有独特的转录特征与分子标志。 图2：小鼠下丘脑室旁核催产素神经元根据单神经元投射图谱可分为C1类（红色）和C2类（绿色）。 C1类和C2类神经元及其亚类在投射模式上的高度异质性，表明各亚类神经元可能分别执行了催产素的不同生理功能：（1）正中隆起—垂体后叶是催产素向外周分泌的重要途径，因此C1类神经元应主要负责通过神经内分泌调控外周生理活动，同时其在下丘脑的投射分支可能参与中枢自主神经调控；（2）C2类1亚型（C2-1）神经元投射至脑干多个区域，可能参与自主神经调控、介导躯体感觉以及伤痛感觉的调控；（3）C2-2 和 C2-3亚型神经元拥有复杂且精细轴突分支，全脑广泛投射，除了涵盖C2-1亚型神经元的功能之外，很可能介导社会识别、亲社会行为、学习与记忆、奖赏行为及厌恶行为等高级脑功能；（4）脑室周围存在C2类神经元轴突分布，提示其分泌的催产素可能是脑脊液中催产素的重要来源之一；（5）对催产素神经元树突的重构发现其分支延伸至室旁核周围核团中，可能具有整合信号输入及通过催产素的树突释放调控周围脑区的作用（图3）。 图3：(A, B) 室旁核催产素神经元各亚类的单神经元投射图谱。(C) C1类与C2类神经元具有截然不同的投射模式。(D) C2类神经元轴突投射至脑室附近区域。 综上，该研究对室旁核催产素神经元进行全方位的、单细胞精度的胞体、树突和轴突形态学分析，为进一步理解催产素神经元调控复杂生理功能提供了详实的结构基础。两类神经元分子标记物的鉴定，为后续特异性的分子、环路操作和功能探索奠定了基础。该项工作从单细胞水平，更新了人们长久以来对于室旁核催产素神经元形态结构的认知，并将为后续研究提供重要的参考。 该研究工作是多团队联合攻关的成果。中科院脑科学与智能技术卓越创新中心和上海科技大学博士毕业生，现北京大学生命科学学院研究助理黎胡明珠是该论文的第一作者。华中科技大学苏州脑空间信息研究院江涛是论文的共同第一作者。北京大学于翔教授、华中科技大学李安安教授、西湖实验室边文杰研究员为论文的共同通讯作者。华中科技大学骆清铭、龚辉与李安安团队，中科院遗传与发育研究所吴青峰课题组，中科院脑科学与智能技术卓越创新中心严军与许晓鸿课题组及全脑介观神经联接图谱平台中心对该研究做出了重要贡献。 原文链接：https://www.cell.com/neuron/fulltext/S0896-6273(23)01010-3