细胞趋化实验

[size=16px]克隆形成实验[/size][size=16px]及划痕实验[/size][size=16px]、[/size][size=16px]流式细胞术[/size][size=16px]操作步骤[/size]软琼脂克隆形成实验检测单细胞克隆形成能力软琼脂克隆形成实验适用于悬浮生长的细胞。1. 配胶液：用蒸馏水和琼脂糖粉配制浓度为 0.3% 的琼脂糖液，高压灭菌，置于42℃ 水浴锅中，目的是为了使其保持融化状态。2. 配制含 20% FBS 的 2×1640 培养基，用 0.22 ?m 的滤器过滤除菌。3. 铺下层胶：将 0.6% 的琼脂糖胶液与 2×1640 培养基等体积混合，以每孔 1.5mL 加至 6 孔板中，室温等其凝固。4. 细胞计数：将细胞用 PBS 洗一遍，离心，加入新的培养基混匀稀释，计数。H69-NC、H69-shMSI1-1、H69-shMSI1-2、H82-NC、H82-shMSI1-1、H82-shMSI1-2、H526-NC、H526-shMSI1-1、H526-shMSI1-2 均以 1×104/孔铺入 6 孔板。5. 铺上层胶：将 0.3% 的琼脂糖胶液与 2× 培养基 1：1 混合，加入 100 μL 细胞悬液，混匀后，每孔加入 1.5 mL 混合液。6. 放入 37℃，5%CO2 培养箱培养，约 2-3 周后终止培养。7. 比较细胞克隆形成能力的差异，利用 Graphpad prism5 作图计算两种细胞克隆形成能力的差异。平板克隆形成实验检测单细胞克隆形成能力平板克隆形成实验适用于贴壁生长的细胞。1. 细胞处理：将 SW1271-NC、SW1271-shMSI1-1、SW1271-shMSI1-2 细胞，用 PBS洗一遍，用胰酶消化并计数。2. 接种细胞： 将细胞接种于 6 孔板中， SW1271-NC 、SW1271-shMSI1-1 、SW1271-shMSI1-2 接种密度为 3×103/孔，注意一定让细胞均匀分布。于 37℃，隔离CO2 静置培养 2-3 周（终止培养时间以不小于 2 周且克隆之间不发生融合为标准）。3. 出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去旧培养基， 用 PBS 清洗 2 次，用 4% 多聚甲醛固定液固定 20 min，吸除固定液，用蒸馏水清洗 2 次后加适量结晶紫染色15-20 min，用蒸馏水洗去结晶紫，自然风干，用扫描仪扫描成图片。4. 在低倍镜下计数大于 50 个细胞的克隆数。5. 计算克隆形成率。细胞划痕实验1. 用记号笔在 12 孔板底部划两条平行线做为标记。2. 将 SW1271-NC、SW1271-shMSI1-1、SW1271-shMSI1-2 细胞接种至 6 孔板。3. 待细胞汇合度为 90% 左右时，用 10μL 枪头垂直于两条平行标记线进行划痕。4. 吸除培养基，1xPBS 漂洗 2 次，并换用无血清培养基培养。5. 分别在划痕后培养 0h，12h，24h，48h，72h 观察细胞迁移情况并拍照。流式细胞术1. 收集 H69、H82、H526、SW1271 的对照组和实验组细胞(包括培养上清中的细胞)，收集 1 - 10 ×105 个细胞，用预冷 PBS 离心洗涤。用双蒸水稀释 5 ×Binding Buffer为 1 × 工作液，取 500 μl 1 × Binding Buffer 重悬细胞。2. 每管加入 5 μl Annexin V-APC 和 10 μl 7-AAD。3. 轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育 5 分钟。4. 上机进行分析。

作为一只刚进实验室的菜鸟把自己遇到的东东总结一点发出来，抛砖引玉吧，为即将进实验室的朋友些资料，同时欢迎老鸟们指正。1、在实验室登记领试剂和药品pbs 1640 Gbico的FBS 台盼蓝 计数板 酒精灯 胶塞 封口胶 消毒的喷剂 记号笔 镊子 标签 饭盒 消毒时包饭盒的布 冻存管 冻存剂 离心管 培养瓶 6孔板 96空板 吸管 吸球。pbs 1640 Gbico的FBS 我都是买的现成的，就是那些实验室老师用原料配好了来卖的那种，我是害怕自己本来就是一个新手，为省那钱自己配，别污染了多的事情都来了，当然很多老鸟都自己配，别鄙视我哈。2、换液a 开瓶盖的时候，网上的视频里是用镊子开的，但是现在用的瓶塞多是新的，稍微一使劲，胶塞就会被扯破（我这周换了好多塞子了），扯破了的塞子把瓶子包不住，有污染的危险，特别是冰箱里试剂装得很拥挤的时候。方法：切忌男生像我一样用力过猛，如果实在要扯烂，干脆就用手去扯塞子，不过严格按照翻起塞子-烧-扯-再烧就是了，完全没有污染的顾虑b 加液体的时候很很容易就吸到赛棉花那一截去了（很多熟练的都不塞棉花了，他们力度控制得好，只要不吸过头，完全ok的），这时候，就不要再吝惜你的培养基了，全部甩到废液缸里去吧，毕竟吸球没有消毒（我们这里是这样的哈），浸湿过了棉花就可能沾到吸球。c 往培养瓶里加pbs、FBS等液体时候，手抖得厉害。不是滴在瓶口，瓶壁上，就是滴在超净台上。方法：滴在瓶口的一定要烧干，不然小心污染，瓶壁和台子上的可以用消毒后的干净纱布擦拭；另外就是自己找个空瓶子，自己练习加液体，熟能生巧。3、传代a 消化细胞的时间真的是不同细胞就不同，我的细胞是消化5分钟，还是在孵箱里放着的，拿出来以后还要又拍又晃的，朋友的一分钟就全飘起来了，如果你是第一次做，或者你们实验室没有做过这个细胞，您就最好一直在镜下看着细胞，摸一下时间（用表记录时间，不光是“摸”哈），消化过头的细胞，长得不好，如果你是外面买的细胞，就又可能浪费经费了。另外，认真分析了一下，我的癌细胞稍微比朋友的正常组织的细胞消化得慢，他的细胞长得慢，细胞少（毕竟正常细胞不能和癌细胞比），3天才传第一代，我的都2代的瓶子了都铺满60%，他的贴的也不怎么紧。b 离心离心的时候，因为忙着把刚终止了消化的细胞拿去离心，很容易忘记在您的离心管上标记，配平完了，机子都转到1000转了，才想起来，也没法子了。方法：实在是忘记了标记，用于配平的管子里的液体没有你刚做完消化的液体清亮，你反正选最清亮的那个就是了。c 分装的时候，我一传3，加上离心管的盖子，满桌子都是瓶盖，很容易搞错，尤其是在和别个拼台子做实验的时候，更是拥挤，千万要放好，不然空间一拥挤，你取东西的时候很容易从这些面朝上的盖子塞子上面经过，就有可能污染了，虽然盖盖子的时候还要过火烧，但是说实话，烧那几下，连手指都烧不烫，咱还是从不污染的角度做起吧。4、我犯其他的傻a 进细胞间去照台子（说实话，是去抢台子，别人要是紫外照起了，就只能等他们做完再照，就又要等半小时），结果口罩帽子都忘记了带，挨了顿批评。b 吸管在酒精灯上过火烧几次的时候，吸管尖碰在了灯芯旁的酒精瓶铜的那部分。c 倒老的培养液的时候才发觉，废液缸没拿进细胞间。跑出去再拿。记得重新消毒手，而且我离开台子的时候，很怕其他人经过污染我已经打开了的各个试剂的瓶子。不放心的只有盖好再走，再进来时再从头弄，浪费时间。5、其他要注意的问题a 我看见也是个新进实验室的女生，双手悬在空中费劲的塞胶塞（估计也是新胶塞，太紧了，塞不大进去），结果手一滑，整瓶胰酶倒在超净台上。（还好不是加GbicoFBS的1640，呵呵），倒了记得把台子擦干净，上次不知道是谁把什么有机溶剂都倒在台子上了，我一去，还沾手，郁闷，自己做好自己分内的，别让实验室里其他的人说你是个污染源或者细胞杀手。b 某天朋友准备换液，结果就把培养基pbs胰酶全都放在37摄氏度水浴里，结果后来有事走了，只把照台子时候放那的东西收拾了，5个小时后才突然想起，只好暂时不用那个培养基了，重新再用新的。养到后面细胞多了，不怕细胞死的时候，还是可以试验着用用那瓶培养基的。

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一天，我准备做细胞培养实验， 中午安排个师妹去准备下复苏细胞。晚上她就告诉我复苏好了， 我就奇怪了， 血清4度化冻怎么这么快？就问她怎么操作的。原来她直接把血清从-20度丢到37度的水里化冻的， 结果复苏的细胞一瓶也没活……http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09511.gif

概念：细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。基本步骤：1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率 =（克隆数/接种细胞数）×100%平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

药物MTT实验步骤(贴壁细胞)----个人改进版by sssholy （2012-10-22） 1. 边缘孔用无菌PBS充填。收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度为50000个/ml，每孔加入100ul细胞悬液(每孔5000个细胞)。注：⑴每次加入细胞都使枪头贴着孔底边缘(最好相同位置)，缓慢加入100ul细胞悬液。孔加入顺序：可从上到下，从左到右依次加入。⑵为了保证细胞密度均匀，最好每加3-5列细胞混匀一下细胞悬液，避免因重力沉降导致细胞密度不均。⑶每块96孔板加完细胞后，应拿起板子前后左右水平摇晃几下（勿旋转摇晃），使细胞均匀分散。⑷一般设6个复孔（B-G行），对照孔非常重要，且变异大，故设2列（2，3列为对照孔），4-10或4-11列为给药孔。⑸边缘孔用无菌PBS充填， 2-11列均可加入细胞。因为要设置调零孔（即不加细胞孔），所以可将第11列设为调零孔，也可将第12列的无菌PBS孔在第2天加药时改为调零孔。2. 细胞放入培养箱培养，待贴壁后第二天给药（通常前一天下午或晚上铺板，第2天上午给药）。给药方法：先配好药（用EP管配好药），再拿出96孔板，弃去原有培养液（可不用PBS洗，太麻烦了），加入药物。注：⑴MTT加药时都是先配药再弃去原培养液，最后加入药物。切勿先弃去原有培养液再配药，因为配药一般要花较长时间，若先弃去培养液再配药会导致细胞无营养液体而死亡。⑵药物是用母液溶于无血清培养基配成工作液，事先算好对照孔，药物孔，调零孔如何配制，如何设置加药顺序。一般越靠中央的孔变异越小，故最重要的给药孔一般放在最中间，次要孔放边缘，调零孔可用第11或12列。⑶如果某个给药孔需加入2种药物，一般需要一种药物先预处理1-2h（预处理药物可用Ep管配好后再分别加入各孔），1-2h再加入另一种药物（直接加入各孔）。3.细胞放入培养箱培养24h（或其他指定时间）。4. 药物作用结束后，每孔加入20ul---MTT(5mg/ml)，培养3-4h。若药物能与MTT反应，可先弃去原培养液，再加入含MTT的培养液（无血清培养液：MTT=5：1配制）。注：MTT使用前预先解冻。MTT对光敏感，故一般保存于负20℃，配好5mg/mlMTT后我习惯分装于EP管中。5.终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150ul---DMSO（DMSO可预先算好所需体积加入15ml离心管中）,37℃温箱孵育10分钟或摇床低速振荡10分钟。之后用酶标仪检测OD—490nm（也有测570nm的）各孔的吸光度(A)值。6.同时设置调零孔（无血清培养基, MTT, DMSO）,对照孔（细胞，最大浓度的药物溶解介质，无血清培养基, MTT, DMSO）。7.细胞活力（cell viability）：细胞活力（cell viability of control）=（药物组A值-调零孔A值）/(对照孔A值-调零孔A值）*100%0 http://img.dxycdn.com/upload/2012/10/22/48/88256443.snap.jpg药物MTT实验步骤----原版：0 http://img.dxycdn.com/upload/2012/10/22/45/66035574.snap.jpg

一、实验目的1、掌屋凋亡细胞的形态特征 　　2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法二、实验原理 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder（梯状带纹）的特征。相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）对细胞进行双重染色，可以区别凋亡、坏死及正常细胞。细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时，质膜不完整，PI就进入细胞内部，它可嵌入到DNA或RNA中，使坏死细胞着色，凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，因而可进行活细胞染色。Hoechst33342是一种活性荧光染料且毒性较弱，它是双苯并咪唑的一种衍生物。与DNA特异结合（主要结合于A-T）碱基区），显示凋亡细胞和活细胞。凡是看到有凋亡小体的细胞都是凋亡细胞。三、实验用品1、试剂：三尖杉酯碱（HT），300μg/ml，100mmol/L Tris-HCl（pH7.5），5mol/L EDTA缓冲液、碱性裂解液：0.2mol/L NaOH, 1%SDS、醋酸钠：3mol/L KAc（pH4.8）；异丙醇；70%乙醇；溴酚蓝，蔗糖指示剂。TBE电泳缓冲液，1%琼脂糖，溴乙锭。PI母液：500μg/ml；Ho33342母液：2mmol/L。 　　2、仪器设备：荧光显微镜，电泳仪，电泳槽，微量加样器（1ml，100μl）0.5、1.5ml离心管，载玻片，盖玻片。四、实验材料人早幼粒白血病HL-60细胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培养基在37℃，5%CO2条件下培养。五、方法步骤 1、三尖杉酯碱诱发HL-60细胞凋亡 　　（1）实验前约24小时，接种两瓶HL-60细胞，标记①、②，每瓶含约6ml培养液，置37℃，5%CO2培养箱培养。 　　（2）实验前约2.5小时，当细胞密度达到70%，①号瓶加入三尖杉酯碱200μl，使终浓度为1μg/ml，②号瓶中加入同等量PBS（pH7.4）作对照。共同放入培养箱中继续培养2.5小时。2、Ho33342和PI双重染色鉴别三种细胞 　　（1）染色：将瓶中的细胞摇匀取200μl于1.5ml的离心管中，加入Ho33342母液2μl，PI 20μl，染色15分钟。 　　（2）滴片：取一载玻片用双面胶围成一小室，从离心管中各取以上染色后的细胞悬液10μl，加入小室内盖上盖玻片，荧光镜下用紫外激发光，高倍镜下观察，区别三种细胞，并注意三者比例。六、注意事项1、诱导培养HL-60细胞时间要准确；　　2、荧光显微镜下观察细胞时，由于荧光易碎灭，观察时要尽量快。

早就听说flowjo的补偿自动调节功能，上网寻觅一圈都没有找到相应教程，实在忍不了了，就自己在此写个教程，希望能帮助到其他同学，废话不多。上教程，如果大家觉得不错，赏两个叮当，让我有更多的动力在为大家奉献一些小教程。1.样品制备，及数据采集我们实验室是BD公司的流式机，采集软件是cellqust pro，我的习惯都是采集数据以后，转用FLOWJO再继续分析，制图。样品制备同常。下面以脾淋巴细胞CD4,CD8分群来做一简单介绍。数据采集中，仍然要使用阴性管调节 阈值 电压 ，圈定大概的淋巴细胞的门。完成后，收细胞，保存数据为none.001转cd4-pe的单阳样品，不用调节补偿，直接收细胞，保存数据为cd4-pe.002。同样，转cd8-fitc的单阳样品，不用调节补偿，直接收细胞，保存数据为cd8-fitc.003最后上样品和control组，收细胞，保存数据为sample.004，如果有control组，假设为control.005（以上处理跟常规处理的主要区别，就是补偿调节都是0%，即不调节补偿，省去了补偿调节这一步，收细胞的速度是不是快了不是一点两点咧.)2，自动补偿调节将数据导入flowjo，本人用的是win环境下的lfowjo7.6.2xx版，有同学反应，文件不能导入或者导入细胞数是0，同学们可以试试将数据文件夹放在全英文路径下，同时有的从MAC系统拷来的目录，可以试着对文件夹从命名一下，也要是全英文，可能可以解决文件打不开的问题。将以上文件全部拖拽进flowjo，使用NONE.001圈定淋巴细胞门LYM.将门拖拽到allsample让门应用到所有样本上。这时候我们可以先看看sample.004的散点图，因为没有调节补偿，根本不是我们所能使用的图，更化不了象限，所以，我们开始调节补偿。

[b][font=宋体]细胞培养实验室组建的基本要求[/font]:[/b]1[font=宋体]、细胞培养是一种无菌操作技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响。[/font]2[font=宋体]、细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响，要求工作环境清洁、空气清新，干燥和无烟尘。[/font]3[font=宋体]、细胞培养室的设计原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧，常规操作和封闭培养于一室，为[/font]10[font=宋体]万级洁净环境的洁净室。而洗刷消毒工作设在洁净室外，避免物品污染洁净室内环境。细胞洁净室需要一个空调系统并对外界保持一定的正压。[/font]4[font=宋体]、解剖实验室主要用于对器官组织的分离，需要有无菌操作台、解剖显微镜、各种手术器材等。[/font] [align=center][url=http://www.hexiyiqi.com/hexi2012chanpinzhongxin/shiyanshilixinji/2018-10-12/301.html][img=实验室离心机]http://www.hexiyiqi.com/d/file/hexi2012chanpinzhongxin/luodishigaosulengdonglixinji/2019-05-14/4b60dacaa256bcc4fe665e2eb3536c0a.jpg[/img][/url][/align][align=center][b]智能台式高速冷冻实验室离心机 3H24RI[/b][/align][font=宋体]组织细胞培养室除一般实验室的普通常规设备外，尚有一些特殊需要的设备。基本可分为两大类：[/font][font=宋体]第一类为常用的基本设备；[/font][font=宋体]第二类为较高级的特殊设备。[/font][b]1. [font=宋体]细胞培养实验室常用的基本仪器设备[/font]1.[font=宋体]显微镜：[/font][/b][font=宋体]倒置显微镜——是组织细胞培养室所必需的日常工作常规使用设备之一，便于掌握细胞的生长情况并观察有无污染等。[/font][b]2.[font=宋体]培养箱：[/font][/b][font=宋体]体外培养的细胞和体内细胞一样，需要在恒定的温度下生存，大多数情况下，最适温度是[/font]37[font=宋体]℃，温差变化一般不应超过±[/font]0.5[font=宋体]℃，细胞在温度升高[/font]2[font=宋体]℃[/font] [font=宋体]时，持续数小时即不能耐受，[/font]40[font=宋体]℃以上将很快死亡。因此需要有能控制温度的培养箱，如具有较高灵敏度的恒温培养箱及[/font]CO2[font=宋体]培养箱。[/font][b]3.[font=宋体]干燥箱：[/font][/b][font=宋体]用于细胞培养箱的有些器械、器皿需要烘干后才能使用，玻璃器皿等须干热消毒。[/font][b]4.[font=宋体]水纯化装置：[/font][/b][font=宋体]细胞培养对水的质量要求较高，细胞培养以及与细胞培养工作相关的液体的配制用水必须事先严格纯化处理。进行细胞培养时配制各种培养液及试剂等均需使用三次蒸馏水：即使是用于玻璃器皿的冲洗，也应使用二次以上蒸馏水。[/font][b]5.[font=宋体]冰箱：[/font][/b][font=宋体]细胞培养室必须配备。[/font]a[font=宋体]、普通冰箱或冷藏柜——储存培养液、生理盐水等培养用的物品及短期保存组织标本。[/font]b[font=宋体]、低温冰箱（[/font]-20[font=宋体]℃）——用于储存需要冷冻保存生物活性及较长时期存放的制剂，如酶、血清等。[/font][b]6.[font=宋体]细胞冷冻储存器：[/font][/b][font=宋体]储存器常用的是液氮容器。根据使用需要分为不同的类型及多种规格。选择购置液氮容器时要综合考虑容积大小，取放使用方便及液氮挥发量（经济）三种因素。[/font][b]7.[/b][font=宋体][url=http://www.hexiyiqi.com/][b]离心机[/b][/url][b]：[/b]进行细胞培养时，常规需要进行制备细胞悬液、调整细胞密度、洗涤、收集细胞等工作，通常需要使用[url=http://www.hexiyiqi.com/hexi2012chanpinzhongxin/shiyanshilixinji/]实验室离心机[/url]。一般可常规配置[/font]4000rpm[font=宋体]的国产台式离心机，例如细胞沉降，使用[url=http://www.hexiyiqi.com/hexi2012chanpinzhongxin/taishigaosulengdonglixinji/]低速离心机[/url]即可，离心力过大有时可能引起细胞的损伤。[/font][align=center][url=http://www.hexiyiqi.com/hexi2012chanpinzhongxin/taishigaosulengdonglixinji/2012-10-17/69.html][img=低速离心机]http://www.hexiyiqi.com/d/file/hexi2012chanpinzhongxin/taishigaosulengdonglixinji/2012-10-17/0e080cd46b2ee061b55caabaaee8cbf2.jpg[/img][/url][/align][align=center][b]台式低速离心机TD5A[/b][/align][b]8.[font=宋体]天平：[/font][/b][font=宋体]常用的有扭力天平、精密天平及各种电子天平。[/font][b]9.[font=宋体]消毒器：[/font][/b][font=宋体]一般为高压蒸汽灭菌锅，直接或间接与细胞接触的物品均需消毒灭菌处理。[/font][b]10.[font=宋体]滤器：[/font][/b][font=宋体]目前细胞培养工作中采用的培养用液，包括人工合成培养液、血清、消化用胰酶等常含有维生素、蛋白、多肽、生长因子等物质，这些物质在高温或射线照射下易发生变性或失去功能，因而上述液体多采用滤过消毒以除去细菌。目前常使用的滤器有玻璃滤器和微孔滤器，各种滤器有其使用原理和特点。[/font][b][font=宋体]常用的培养器皿：[/font][font=宋体]培养用器皿[/font][/b][font=宋体]是[/font][font=宋体]供细胞接种、生长等用的器皿，可由透明度好、无毒的中性硬质玻璃或无毒而透明光滑的特制塑料制成。[/font][font=宋体]细胞培养中需要的各种耗材[/font],[font=宋体]各类细胞培养板，细胞培养瓶，平皿移液管等。[/font][b][font=宋体]培养瓶[/font][/b][font=宋体]：由玻璃或塑料制成。主要用于培养、繁殖细胞。进行培养时培养瓶瓶口加盖螺旋瓶盖或胶塞，胶塞多用于密封培养。国产培养瓶的规格以容量（[/font]ml[font=宋体]）表示，如[/font]250ml[font=宋体]、[/font]100ml[font=宋体]、[/font]25ml[font=宋体]等；进口培养瓶则多以底面积（[/font]cm2[font=宋体]）表示。[/font][b][font=宋体]培养皿：[/font][/b][font=宋体]由玻璃或塑料制成，供盛取、分离、处理组织或做细胞毒性、集落形成、单细胞分离、同位素掺入、细胞繁殖等实验使用。常用的培养皿规格有[/font] 10cm[font=宋体]、[/font]9cm[font=宋体]、[/font]6cm[font=宋体]、[/font]3.5cm[font=宋体]等。[/font][font=宋体]多孔培养板：为塑料制品。可供细胞克隆及细胞毒性等各种检测实验使用。其优点是节约样本及试剂，可同时测试大量样本，易于进行无菌操作。培养板分为各种规格，常用的规格有：[/font]96[font=宋体]孔、[/font]24[font=宋体]孔、[/font]12[font=宋体]孔、[/font]6[font=宋体]孔、[/font]4[font=宋体]孔等。[/font][b][font=宋体]培养操作有关的器皿[/font][font=宋体]贮液瓶：[/font][/b][font=宋体]常见的为蓝盖瓶，主要用于存放或配制各种培养用液体如培养液、血清及试剂等。贮液瓶分为各种不同规格，如[/font]1000ml[font=宋体]、[/font]500ml[font=宋体]、[/font]250ml[font=宋体]、[/font] 100ml[font=宋体]、[/font]50ml[font=宋体]、[/font]5ml[font=宋体]等。[/font][b][font=宋体]吸管：[/font][/b][font=宋体]主要分为刻度吸管、无刻度吸管。刻度吸管主要用于吸取、转移液体，常用的有[/font]1ml[font=宋体]、[/font]2ml[font=宋体]、[/font]5ml[font=宋体]、[/font]10ml[font=宋体]等规格。无刻度吸管分为直头吸管及弯头吸管，除可以作吸取、转移液体外，弯头尖吸管还常用于吹打、混匀及传代细胞。[/font][b][font=宋体]加样器（[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]）[/font][/b][font=宋体]：分为微量[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]和[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]电动[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]。用于吸取、移动液体或滴加样本。可根据需要调节量的大小，吸量准确、方便。可保证实验样品（或试剂）含量精确，重复性良好。[/font][b][font=宋体]其他用品：[/font][/b][font=宋体]尚有收集细胞用的离心管，放置试剂或临时插置吸管用的试管，装放吸管以便消毒的玻璃或不锈钢容器，用于存放小件培养物品便于高压消毒的铝制饭盒或贮槽，套于吸管顶部的橡胶吸头，封闭各种瓶、管的胶塞、盖子、冻存细胞用的安瓿或冻存管、不同规格的注射器、烧杯和量筒以及漏斗，超净工作台使用的酒精灯，供实验人员操作前清洁消毒手使用的盛有酒精或其他消毒液的微型喷壶等。[/font][b][font=宋体]器械[/font][/b][font=宋体]主要用于解剖、取材、剪切组织及操作时持取物件。常用的有：手术刀或解剖刀、手术剪或解剖剪（弯剪及直剪），用于解剖动物、分离及切剪组织，制备原代培养的材料；眼科虹膜小剪（弯剪或直剪），用于将组织材料剪成小块；血管钳及组织镊、眼科镊（弯、直），用于持取无菌物品（如小盖玻片）夹持组织等；口腔科探针或代用品，用以放置原代培养之组织小块。[/font][b]2[font=宋体]、细胞培养实验室特殊设备[/font][/b][font=宋体]细胞培养实验室除了应配备上述的常用基本设备以外，如有条件，可添置一些特殊或先进的设备仪器，以便更有效、更精确、更深入地进行实验室工作。例如：[/font][font=宋体]（[/font]1[font=宋体]）酶联免疫检测仪——可用于进行免疫学测定及细胞毒性、药物敏感性检测等。[/font][font=宋体]（[/font]2[font=宋体]）[/font] [font=宋体]超低温冰箱（[/font]-80[font=宋体]℃）——便于储存某些试剂及标本。[/font][font=宋体]（[/font]3[font=宋体]）旋转培养器——用于某些特殊细胞或需要收获大量细胞的培养。[/font][font=宋体]（[/font]4[font=宋体]）[/font] [font=宋体]荧光显微镜——进行荧光染色样本的观察。[/font][font=宋体]（[/font]5[font=宋体]）[/font] [font=宋体]流式细胞仪——可更精确及快速检测细胞。[/font][font=宋体]（[/font]6[font=宋体]）用于检测细胞培养条件的各种仪器，例如专门为快速分析细胞培养基中主要或关键营养成分、代谢产物及气体含量设计的多功能细胞培养分析仪、手提式[/font]CO2[font=宋体]浓度测定仪等。[/font][b][font=宋体]其余仪器[/font][/b][font=宋体]对于细胞实验还可能需要振荡器及磁力搅拌器用于混匀液体；还有一些沾满细胞的难清洗的不锈钢类或玻璃类器皿，则需要超声波清洗机的帮助；如果涉及免疫实验，肯定需要冰浴，碎冰的需求量大的话，则需要购买制冰机；另外破碎细胞可能会需要超声波细胞破碎仪；[/font]

细胞冻存是细胞培养的关键步骤，一般推荐的冻存液比例为：1：3：6（或1：2：7） 配冻存液1份DMSO3份血清和6份培养基(养细胞时用什么培养基冻存时就用什么培养基)。取生长状态良好的细胞进行冻存处理，小编实验室有一个秘密配方，就是10%DMSO和90%的纯血清，这个冻存液有一些奢侈，但是对于一些比较脆弱的细胞，或者是一些冻存条件比较差的实验室（例如没有-80冰箱）有非常良好的效果。除此之外和大家分享六大注意事项1、错误的时机：细胞状态不好（长的太过了，培养液已经很黄；细胞可疑污染；细胞已经开始凋亡或崩解；连续培养超过二个月，细胞性状已有改变改变）。解决：最佳时机：细胞增殖旺盛，情况稳定，试验效果良好，复苏后两周内。2、细胞太少：冻存时细胞浓度低于1-5×1000,000/ml。（复苏很难成功）。解决：离心后调整细胞浓度。（不要重新洗细胞）。3、盖子不紧：冻存管的盖子一定要拧紧，否则复苏水浴时会渗水，造成污染。解决：选择原配的管子和盖子（不同牌子/型号的颜色会有差别）。4、单薄的冻存盒：放在－80度的冻存盒，壁太薄，细胞在被迅速降温。解决：选择厚壁泡沫塑料盒，或塞入大量干棉花。（冻存的原则：缓降！）。5、-80度太久：放在－80度冰箱的时间超过半年。（冰箱的温度难以恒定:开门/关门，电压不稳等）解决：尽快转入液氮。6、液氮不足：液面不能漫过所有细胞。解决：定期测量液氮储备，保证细胞全部浸在液面下。

原标题 “纳米生物间谍”技术能进入活细胞取样 可用于深入揭示线粒体基因组变异的重要性 科技日报讯 据物理学家组织网近日报道，美国加利福尼亚大学圣克鲁兹分校（UCSC）研究人员开发出一种机器人式的“纳米生物间谍”系统，能从单个活细胞内提取出微量样本，进行RNA或DNA测序，而不会杀死细胞。研究人员表示，这种单细胞“纳米生物间谍”技术是一种了解活细胞内部动态过程的有力工具。相关论文发表在最近出版的美国化学协会《纳米》杂志上。 “我们能从活细胞中拿走一个‘生物间谍’，再把它送回该细胞，在几天内这样重复多次而不会杀死细胞。如果用其他技术，你不得不牺牲这个细胞才能分析它。”该生物传感与生物电技术小组负责人、UCSC巴斯金工程学院生物分子工程教授内德·波曼德说。 “纳米生物间谍”平台是研究小组用纳米吸液管开发的最新设备。纳米吸液管是一种小玻璃管，取液端越来越细，至尖端直径仅50到100纳米。波曼德说：“我能在实验室造出纳米吸液管，这不需要昂贵的纳米制造设备。但要进入一个细胞，问题是即使在高倍显微镜下，你也看不见吸液管尖端，不知道它偏离了细胞有多远。” 实验室博士后研究员亚当·赛格尔解决了这一问题。他基于在一台改造过的扫描离子电导显微镜（SICM），开发出一种反馈控制系统。该系统能利用通过纳米吸液管尖端的离子流作为反馈信号，在尖端接近细胞表面时探测其中的液滴。在尖端进入细胞之前，一种自动控制系统能定位它在细胞上面的位置，然后尖端很快插入穿透细胞膜，通过操控电压有控制地提取一小点细胞内物质。由于吸液管尖端极精细，对细胞造成的损害极微小。 研究小组用这种系统从活细胞中提取的微量细胞物质，估计只有50毫微微升（千万亿分之一升），约一个人体细胞百分之一的量。他们从单个人体癌细胞中提取物质并进行RNA测序，还从人类成纤维细胞中提取了线粒体并对其进行了DNA测序。“人们已经知道，线粒体和多种神经退化疾病有关。该技术可用于深入揭示线粒体基因组变异的重要性。”波曼德说。 该技术应用前景广阔。波曼德希望能与其他研究人员合作，探索其更多用途。“对于癌症生物学家、干细胞生物学家等想要了解细胞内部情况的科学家来说，这是一种多功能的平台。”（常丽君）来源：中国科技网-科技日报 2014年01月20日

细胞冻存是细胞培养的关键步骤，一般推荐的冻存液比例为：1：3：6（或1：2：7） 配冻存液1份DMSO3份血清和6份培养基(养细胞时用什么培养基冻存时就用什么培养基)。取生长状态良好的细胞进行冻存处理，小编实验室有一个秘密配方，就是10%DMSO和90%的纯血清，这个冻存液有一些奢侈，但是对于一些比较脆弱的细胞，或者是一些冻存条件比较差的实验室（例如没有-80冰箱）有非常良好的效果。除此之外和大家分享六大注意事项1、错误的时机：细胞状态不好（长的太过了，培养液已经很黄；细胞可疑污染；细胞已经开始凋亡或崩解；连续培养超过二个月，细胞性状已有改变改变）。解决：最佳时机：细胞增殖旺盛，情况稳定，试验效果良好，复苏后两周内。2、细胞太少：冻存时细胞浓度低于1-5×1000,000/ml。（复苏很难成功）。解决：离心后调整细胞浓度。（不要重新洗细胞）。3、盖子不紧：冻存管的盖子一定要拧紧，否则复苏水浴时会渗水，造成污染。解决：选择原配的管子和盖子（不同牌子/型号的颜色会有差别）。4、单薄的冻存盒：放在－80度的冻存盒，壁太薄，细胞在被迅速降温。解决：选择厚壁泡沫塑料盒，或塞入大量干棉花。（冻存的原则：缓降！）。5、-80度太久：放在－80度冰箱的时间超过半年。（冰箱的温度难以恒定:开门/关门，电压不稳等）解决：尽快转入液氮。6、液氮不足：液面不能漫过所有细胞。解决：定期测量液氮储备，保证细胞全部浸在液面下。

为综合探讨诱导多能干细胞的构建、培养和扩增仪器信息网将携手赛默飞“重返实验室”系列活动之“Lab实验课堂”开展[color=#cc0000][b]【干细胞请回答】- 如何构建、培养和扩增理想的“种子细胞”iPSCs[/b][/color][font=&][url=https://www.instrument.com.cn/webinar/meetings/ipscs20220928/]点击打开链接[/url][/font][img]https://simg.instrument.com.cn/bbs/images/brow/em17.gif[/img][img]https://simg.instrument.com.cn/bbs/images/brow/em17.gif[/img]了解更多~我们将邀请北京大学生命科学院 王金琳 博士后 、 赛默飞世尔科技技术支持 唐子华 博士围绕iPSCs的构建、培养和扩增，展开深度讨论观看直播，赢取[b][color=#cc0000]千元红包和直播礼[/color][/b][img]https://simg.instrument.com.cn/bbs/images/brow/em24.gif[/img]报名链接：[url]https://www.instrument.com.cn/webinar/meetings/ipscs20220928/[/url]

一、细胞因子的概念细胞因子(cytokine)是由机体多种细胞分泌的小分子蛋白质，通过结合细胞表面的相应受体发挥以调节免疫应答为主的生物学作用。细胞因子具有 非常广泛的生物学活性，包括促进靶细胞的增殖和分化，增强抗感染和细胞杀伤效应，促进或抑制其它细胞因子和膜表面分子的表达，促进炎症过程，影响细胞代谢 等。二、细胞因子的命名细胞因子按其来源可分为：由单个核吞噬细胞产生的细胞因子称为单核因子(monokine)；由淋巴细胞产生的细胞因子称为淋巴因子 (lymphokine)等。按其作用可分为干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、生长因子和趋化因子等。部分由不同细胞分泌的细胞因子，其基因及编码蛋 白与结构清楚者，在免疫调节、造血和炎症中发挥重要作用，又称为白细胞介素(interleukin，IL)。也可以依据结构或者其受体结构分类，我们的 趋化因子目前没有受体产品。三、细胞因子的特征1、低分子量；一般为＜60kD的多肽或糖蛋白。多以单体形式存在，少数为二聚体，三聚体。2、天然细胞因子由抗原、丝裂原或其他刺激物活化的细胞所分泌，通过旁分泌(paracrine)、自分泌(autocrine)或内分泌(endocrine)方式在局部发挥短暂作用。3、一种细胞因子可由多种细胞产生，同一种细胞可产生多种细胞因子。4、需通过与靶细胞表面相应受体结合后发挥其生物学效应。5、具有高效性、多效性、叠性、拮抗性、协同性和网络性。四、细胞因子的分类1、白细胞介素(interleukin，IL-s)最初是指由白细胞产生又在白细胞间发挥作用的细胞因子。2、干扰素（interferon,IFN)最早发现的细胞因子，有干扰病毒感染和复制的能力。分α、β和g三种类型。3、肿瘤坏死因子超家族(tumor necrosis factor，TNF)1975年发现的一种能使肿瘤发生出血坏死的物质。4、集落刺激因子(colony-stimulating factor，CSF)指能够刺激多能造血干细胞和不同造血祖细胞增殖分化，在半固体培养基中形成相应细胞集落的细胞因子。包括G-CSF（粒细胞）、M-CSF（巨噬细胞）、 GM-CSF（粒细胞、巨噬细胞）、Multi-CSF（多重）（IL-3）、红细胞生成素(EPO)、干细胞生长因子(SCF)、血小板生成素 (TPO)等。5、趋化因子(chemokine)主要功能是招募血液中的单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等进入特定的淋巴器官和组织以及感染发生的部位。根据趋化因子近N端半胱氨酸(Cys)的位置、排列方式和数量，可分为CC、CXC、C、CX3C四个亚家族。6生长因子(growth factor，GF)生长因子(GF)是具有刺激细胞生长作用的细胞因子。五、细胞因子的生物学活性1.介导自然免疫、参与抗肿瘤和抗感染2.调节T、B细胞活化、生长和分化，介导细胞免疫和体液免疫3.刺激造血生成、刺激骨髓祖细胞生长和分化为各种成熟血细胞4.在炎症、感染和内毒素血症中的作用5.在超敏反应和自身免疫病中的作用6.细胞因子通过激活其相应受体（CKR），导致细胞的增殖与分化或分泌某种蛋白质。六、四种蛋白表达体系比较表达细胞优点缺点原核E. coli繁殖快、成本低、产量高遗传背景及基因表达调控机制清楚易于大规模培养，成本低廉蛋白常为包涵体，纯化困难无糖基化（分泌蛋白，细胞膜上蛋白不可用），生物活性不定无翻译后修饰，内毒素含量高酵母Pichia使用简单，表达量高，His-tag便于纯化，一定的翻译后加工可进行糖基化修饰，操作简单，适合大规模生产可诱导表达，也可分泌表达，产物便于纯化有时会出现蛋白切割问题糖基化不能满足要求昆虫High-5产量高 ，翻译后加工与哺乳动物相似对于部分有毒性或较难表达蛋白有优势无内毒素污染蛋白活性不如哺乳动物适合表达激酶等定位于细胞内的真核蛋白哺乳CHO HEK293完善的翻译后加工，活性接近天然蛋白周期长、技术要求高表达产量低

关键词（必填项目）：胚胎干细胞培养目的（必填项目）：正确规范胚胎干细胞培养背景知识（选填项目）：无。原理（选填项目）：无主体内容：目录一、细胞二、一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态培养基细胞复苏冻存细胞明胶包被细胞传代三、体外分化培养基包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）体外分化方法四、移植细胞的准备细胞多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。由Dr. Nagy的实验室制备。2．D3-ATCC; CRL-1934. 我们得到时大约传了17代。3．J1-由Dr. Jaenish的实验室友情提供。我们得到时大约传了7－9代。4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr. Jaenish的实验室友情提供。5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr. Nagy的实验室提供。一般培养--维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。贮存液 DMEM(高糖) [/s

[align=center][b][size=14pt][font=等线]如何做好细胞培养？[/font]—实验室细胞培养技术面面观[/size][/b][/align][align=center][size=11pt]会议时间[/size][size=11pt]：[/size][size=11pt]2020年[/size][size=11pt]4[/size][size=11pt]月[/size][size=11pt]17[/size][size=11pt][font=等线]日[/font]1[/size][size=11pt]4[/size][size=11pt]:00[/size][/align][b][size=12pt]内容[/size][size=12pt]介绍：[/size][/b][size=10.5pt]1. 细胞培养简介[/size][size=10.5pt]；[/size][size=10.5pt]2. 细胞培养实验室[/size][size=10.5pt]：实验室安全等级、培养设备[/size][size=10.5pt]/耗材[/size][size=10.5pt]、无菌技术；[/size][size=10.5pt]3. 细胞培养基础[/size][size=10.5pt]：细胞系、细胞培养环境（[/size][size=10.5pt]PH，CO2浓度，温度，湿度）[/size][size=10.5pt]；[/size][size=10.5pt]4. 细胞培养方案[/size][size=10.5pt]：贴壁细胞传代、悬浮细胞传代、细胞冻存、细胞复苏、细胞计数；[/size][size=10.5pt]5. 细胞培养常见问题[/size][size=10.5pt]：细胞污染、细胞太稀、细胞消化过度、细胞复苏状态不佳。[/size][b][size=12pt]讲师[/size][size=12pt]介绍：[/size][size=11pt]雷俊[/size][size=11pt]:[/size][/b][size=11pt]北京大学细胞生物学博士博士研究生期间，主要从事细胞周期事件与肿瘤发生关系的研究，具有细胞生物学、蛋白质组学等学科背景，精通分子细胞生物技术、成像技术等研究手段。现任瑞沃德生命科技有限公司细胞产线产品经理。[/size][b]报名地址：[/b][url=https://www.instrument.com.cn/webinar/meeting_10287.html][u][font='Times New Roman'][color=#0000ff]https://www.instrument.com.cn/webinar/meeting_10287.html[/color][/font][/u][/url]

http://www.biomart.cn//upload/userfiles/image/2012/02/1328771705.jpg英国剑桥大学科学家首次从人皮肤样品中构建出大脑皮层细胞(cerebral cortex cell)---这些细胞组成大脑灰质。2012年2月5日，这项研究结果在线发表在《自然-神经科学》期刊上。大脑皮层疾病包括从诸如癫痫和自闭症之类的发育疾病到诸如阿尔茨海默(Alzheimer)疾病之类的神经退化疾病。这些研究发现将使得科学家们能够研究人大脑皮层如何发育和它如何“连接接通”以及这种接通如何出错(一种导致学习障碍的常见原因)。它也将允许科学家在实验室中重建诸如阿尔茨海默疾病之类的大脑疾病。这将给予他们之前不可能获得的启示，允许它们实时观察疾病发展同时也可测试阻止疾病发展的新药物。剑桥大学生物化学部门Rick Livesey 博士是这篇研究论文的主要研究员。他说，“这种方法让我们有能力研究人大脑发育和疾病，而这在5年前是难以想象的。”对他们的研究而言，科学家从病人中获取皮肤活组织，然后将来自皮肤样品中的细胞重编程为干细胞。这些干细胞如同人胚胎干细胞一样就能够被用来产生大脑皮层细胞。Livesey博士补充道，“我们正使用这种体系来重建阿尔茨海默疾病。阿尔茨海默疾病是世界上一种最为常见形式的痴呆症。当前在英国痴呆症影响着800000个人。这种疾病主要影响一种神经细胞类型，而这种神经细胞我们已能够在实验室中制造出来，因此我们在实验室中有一种非常好的工具创建出该疾病的一种完整的人类模型。”英国阿尔茨海默疾病研究中心是英国一家主要的痴呆症研究慈善组织。该中心研究主任Simon Ridley说，“我们为资助了这项研究而感到非常高兴。这项研究向前迈出了积极性的一步。在实验室中将干细胞变成完全功能性的神经细胞网络很有希望能够解密诸如阿尔茨海默疾病之类的复杂大脑疾病。痴呆症是我们时代面临的最大医学挑战，我们迫切需要更多地了解和如何阻止该疾病。我们希望这些发现能有让我们更接近这种目标。”

用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/bp][color=#3333ff]气质联用仪[/color][/url]测红细胞膜脂肪酸，参考文献里有20种脂肪酸，我只测出了7种脂肪酸，是不是甲酯化方法不好？我用的甲酯化方法是：取分离好的红细胞样本各50μL，依次加入已用BHT乙醇溶液抗氧化处理过的具塞玻璃试管中；在具塞玻璃试管中加入400μL3N盐酸-甲醇溶液，充分混匀3分钟，然后放置于90℃烘箱中避光反应3小时，反应完毕后取出冷却至室温；加入正己烷800μL到具塞玻璃试管中，充分混匀5分钟，4000rpm/min，2-8℃离心5min；将离心后的上层正己烷溶液尽量完全转移至另一个1.5ml离心管中，室温环境下，用氮气吹干仪吹干；在氮气吹干后的离心管中加入正己烷400μL溶解脂肪酸甲酯产物，充分混匀3分钟，然后转移100μL至样品瓶中，待测。

从大小来讲，细胞培养瓶约可分为约600ml，250ml，50ml和25ml的，一般都经过表面改性处理，适合细胞贴壁和生长。600ml 、300ml的多用于大规模培养时用（如单克隆细胞的培养等），50ml的多用于一般性细胞实验用（一般性的传代，保存细胞，为实验提供细胞等），25ml一般是用来复苏细胞或细胞较少时的培养，还有做原代细胞时也可以做多瓶而避免交叉污染。当然还有其他如圆形的等，都可根据个人爱好和实验需要自己选择。 根据细胞培养瓶制作材料的不同，也有玻璃和塑料之分，这里谈一点自己的浅见（欢迎不同意见的战友拍砖）。不同的细胞对胰酶的敏感度不一样，所以在实验中我们常常会遇到一些细胞消化半天也没有起色，导致细胞状态不断下滑，直至最后的死亡以至于实验进展的不顺利。当然，有时候是可以通过加一些EDTA等来增强胰酶的能力，或者提高胰酶的浓度来实现，在培养一些细胞过程中，我发现，一些细胞对玻璃和塑料制品粘附能力不同，如RAW264.7，平滑肌细胞等，在转换培养瓶之后，可以发现好消化了很多，并且在回到原制品的培养瓶时不会改变它的贴壁能力。这里希望有经验的战友可以分享你们的经验。 关于培养板的购买其实我也没有什么经验，想说的就是要尽量避免购买国产的培养板，国产的一些培养瓶还可以，但是培养板我们买过很多国产的，确实效果不是很好，细胞在里面基本上长的非常非常磕碜。所以经费富余的情况下，这些东西能买进口的就买吧。大公司的基本都可以买，BD，Corning等等。这些东西原则上是一次性的，但是我们大部分实验室根本不可能做到，其实泡酸，洗干净再用也没问题，毕竟我们没有老外那么富足的经费，所以我们就累点吧，多做点体力活锻炼一下身体吧。滴管其实也没什么好说的，国产的就足够了。要说的是图中我比较喜欢用C类的滴管，原因就是塞上棉花后吹打细胞不会怕棉花湿掉而引起污染，而且用完棉花也方便取出，便于下次再用。

诺奖得主抵制《科学》《自然》《细胞》2013-12-11http://www.bio360.net/attachments/2013/12/13867284863724be7346c1c1ed.jpg2013 年度诺贝尔生理学或医学奖得主 Randy Schekman 宣布，他的实验室将不会再向三大顶级科学期刊《科学》、《自然》和《细胞》递交论文。Schekman 称，这些世界最著名的期刊扭曲了科学进程，鼓励研究人员走捷径，在华而不实而不是真正重要的领域进行研究。他说，问题正在恶化，期刊的编辑不是活跃的科学家，而是那些追求轰动效果的所谓专业人士。Schekman 指出，如果能成功在这些著名期刊上发表论文，中科院将奖励作者大约3万美元，某些研究人员的半数收入就来自此类“贿赂”。Schekman 在《卫报》（The Guardian）上发表文章，呼吁科学界集体采取行动。

偶欲通过[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Wp][color=#3333ff]原子吸收光谱[/color][/url]测定细胞钙含量，门外汉，遍寻不到相关的样品前处理方法，望大虾赐教！细胞钙以磷酸钙形式存在。需要灰化么——看资料说灰化是为了分解有机物，可是细胞样实在想象不出来如何进行灰化？酸化的时候，用多大浓度的酸比较合适，酸化时间如何掌握，低浓度的酸需要驱酸么？用什么容器盛装比较合适阿？普通的聚乙烯管子可以么？试验选用什么级别的水？试验室只有三蒸水，玻璃烧出来的。

离心PBS液1 ml洗涤，吹打制成待测细胞悬液取1 ul悬液+9 ul PBS细胞计数：1. 盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上.2. 用10 ul枪头将细胞悬液注入计数板，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。3. 统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铬(每个大格含有16个中铬)的细胞数目。4. 计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度： (细胞悬液的细胞数)/ml=(四个大格子细胞数/4)×106

目前国内对细胞破碎机的研究局限于实验研究,仅对某种结构均质阀的均质效果进行验证与分析,或是选择结构参数。实验研究的局限性使这种分析不够全面。高压细胞破碎机是目前生物工程领域广泛使用的一种细胞破碎机。作者结合近期国外对高压细胞破碎机的理论研究工作,应用半经验半理论的方法,分析探讨了高压细胞破碎机的均质理论。高压细胞破碎机的结构及工作原理： 高压细胞破碎机由高压泵和破碎阀两部分组成,高压泵通常采用柱塞往复泵,其结构与一般柱塞泵相同。破碎阀安装在柱塞泵的排出管路上,一般由阀芯和阀座构成,阀芯和阀座的结构形式对破碎效果、能耗以及阀的磨损影响极大。国外对破碎阀的结构进行了大量研究,设计出许多不同结构的破碎阀,研究主要围绕下列问题进行：1，在较低操作压力下提高破碎效果2，提高阀的使用寿命。意大利Niro Soavi公司为此，开发出R型细胞破碎阀，经过多年的实际使用，获得用户的认可。高压细胞破碎机工作原理： 高压细胞破碎机有一个或数个往复运动的柱塞，物料在柱塞作用下进入可调节压力大小的阀组中，经过特定宽度的限流缝隙（工作区）后，瞬间失压的物料以极高的流速（1000米/秒，最高可达1500米/秒）喷出，碰撞在阀组件之一的碰撞环上，产生三种效应： 空穴效应：被柱塞压缩的物料内积聚了极高的能量，通过限流缝隙时瞬间失压，造成高能释放引起空穴爆炸，致使物料强烈粉碎细化。（主要应用于均质） 撞击效应：物料通过可调节限流缝隙的以上述极高的线速度，喷射到用特殊材料制成的碰撞环上，造成物料粉碎。（主要应用于细胞破碎） 剪切效应：高速物料通过泵腔内通道和阀口狭缝时会产生剪切效应。（主要应用于乳化）经过这三种效应处理过的物料可均匀细化到0.1μm-2μm粒径。

求助给位大侠，欲构建研究细胞的实验室常用到哪些仪器设备，主要研究中药方面

注意事项： 1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。2.安装蔡式滤器时通常使用孔径 0.45 微米 和 0.22 微米滤膜各一张，放置位置为 0.45 的位于 0.22 微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。 3.配制 RPMI1640 培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液 PH 值最终为 7.2 ，可在配制时调 PH 至 7.4 。 细胞培养的一般过程 一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。R 理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置 4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。 三、培养将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的 PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和 CO2浓度也要定时检查。一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。四、冻存及复苏为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度?－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入 37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。

一、目的流感病毒的MDCK细胞分离方法是流感实验的关键技术，用于流感病毒的分离、培养。本SOP是为确保MDCK细胞分离流感病毒的操作准确、规范和可靠而制定。二、范围适用于实验室所有技术人员进行流感病毒的MDCK细胞分离。三、程序（一）生物安全要求H5,H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的MDCK细胞分离实验室生物安全级别：BSL-3。实验操作人员需进行BSL-3防护，具体详见“生物安全个人防护SOP”。H5,H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的MDCK细胞分离操作必须在BSL-3级实验室的生物安全柜中进行。其余流感病毒的MDCK细胞分离实验室生物安全级别：BSL-2。实验操作人员需进行BSL-2防护，具体详见“生物安全个人防护SOP”。其余流感病毒的MDCK细胞分离操作必须在BSL-2级实验室的生物安全柜中进行。（二）材料1、75％～90％成片的MDCK细胞，选用合适大小的细胞培养瓶和细胞培养板来用做病毒分离2、胰酶（牛胰腺来源Ⅷ型）3、HEPES缓冲液，1M母液 4、D-MEM培养基，Hank's液5、青、链霉素母液（10000U/mL 青霉素G；10000µg/mL硫酸链霉素 6、牛血清白蛋白组分Ⅴ，7.5%溶液7、临床样品0.5mL8、1mL无菌移液管9、10mL无菌移液管10、15mL无菌离心管（三）实验步骤1、准备病毒生长液（1）细胞维持液准备500mL D-MEM液中加入①青、链霉素母液 5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素）②牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL（终浓度：0.2%）③HEPES缓冲液 12.5mL（终浓度：25mM）（2）病毒生长液每500mL细胞维持液中加入0.5mL的TPCK-胰酶（母液浓度为2mg/mL）使TPCK-胰酶的终浓度为2µg/mL。2．流感病毒MDCK细胞分离步骤：（1）75％～90％成片细胞的准备，以选取T25细胞瓶为例。①用40×物镜观察细胞生长状态。②轻轻倒出细胞生长液，用10mL的无菌移液管吸取6mL Hank's液分别清洗细胞3遍。（2）细胞培养瓶的接种①用无菌的移液管将清洗细胞的Hank's液从细胞培养瓶中移出。②用无菌的移液管吸取适量临床标本置于细胞培养瓶中，温和摇动数次。③然后放于37℃，5%CO2培养箱中吸附1～2h。④吸出接种物，用10mL的无菌移液管吸取6mL Hank's液分别清洗细胞2遍。然后加入6mL病毒生长液于细胞培养瓶中。⑤放置于33～35℃培养箱培养。⑥每日观察细胞病变情况。（细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落）。（3）细胞培养物的收获当75%～100%细胞出现病变时进行收获，收获之前可以将细胞放于-70℃冰箱，冻融1～2次，以提高收获标本的病毒滴度。即使无细胞病变也应该于接种后第7天收获。收获病毒液时，先温和摇动细胞瓶数次，然后用10mL的无菌移液管吸取病毒液置于15mL无菌离心管中，混匀病毒。收获的病毒液可以立即进行后续试验，或冻于-80℃冰箱待以后试验使用。

基本原理本分离单核细胞所用方法是Percoll非连续性密度梯度离心法，主要是根据不同细胞间密度的差别进行细胞分离。此法易操作，且使用通常的实验设备即可完成。试剂与器材•外周血单个核细胞（参见实验1）•PBS1×和PBS10×（无Ca2+、Mg2+），含0.5mM EDTA•胎牛血清（56℃，30分钟加热灭活）•HCl 1mol/l•Percoll分层液（密度=1.130g/ml,商品）•4g/l台盼蓝染液（溶解在PBS液中）•50ml聚丙烯圆锥管•毛细吸管•移液管（1、2、10ml）•CO2孵箱•超净台•有旋转桶转子装置的离心机•PH计操作步骤所有的操作应该在无菌条件下进行一．不同密度Percoll分层液的配制1. Percoll分层液储备液的制备：取未稀释的Percoll原液（从瓶中取）9ml+1ml PBS 10×（无Ca2+、Mg2+），用HCl 1PH至7.42. Percoll分层液（Ⅰ）（密度=1.080g/ml）的配制：取Percoll储备液3.12 ml（前一步配制）+1.88 ml PBS1×（无Ca2+、 Mg2+）3. Percoll分层液 （Ⅱ）（密度=1.069g/ml）的配制：取Percoll分层液（Ⅰ）2.68 ml+2.32ml PBS 1×（无Ca2+、Mg2+）4. Percoll分层液（Ⅲ）（密度=1.060g/ml）的配制：取Percoll分层液（Ⅱ）2.32 ml +2.68 ml PBS 1×（无Ca2+、Mg2+）二．不连续密度梯度制备1. 将洗涤过的8×107外周血单个核细胞重新悬浮在2ml的Percoll分层液（Ⅰ）（密度=1.080g/ml）在这层液体的表面上轻轻铺上2ml Percoll分层液（Ⅱ）（密度=1.069g/ml），后再于第二层液面上轻轻铺上2ml的Percoll分层液（Ⅲ）（密度=1.060g/ml）2. 20℃，在旋转转子中1000×g离心上步所形成的密度梯度90分钟（慢慢增加速度，无制动停转）。三．单核细胞的分离1. 离心后单核细胞存在于Percoll分层液（Ⅱ）和（Ⅲ）（密度较小的部分）之间的界面中。 （图1）图略(暂时)图1. Percoll非连续性密度梯度离心分离法2. 用毛细吸管仔细收集单核细胞。3. 用含1-5%胎牛血清的PBS 1×液洗涤细胞3次，4℃，400×g离心5分钟，弃上清液。4. 若需要进一步实验，将细胞重新悬浮于培养基中。5. 用台盼蓝拒染法测定细胞存活率。（参见第一章第一篇第一节）结果本法回收的细胞中单核细胞占70-100%（存活率应大于90%），淋巴细胞占0-20%，粒细胞占0-5%，红细胞占0-7%，血小板小于0.5%。实验要点1. 为了得到较好的结果，外周血单个核细胞分离后应立即使用。2. 所有操作过程应在18-20℃中进行。3. 仔细覆盖各种Percoll分层液，避免破坏其界面。4. 洗涤分离细胞3次，以除去残存的Percoll分层液和血小板。5. 如果所制备的细胞仍不纯，可使用包被有抗CD2、抗CD3、抗CD19抗体分子的磁珠， 以除去残存的NK、T、B淋巴细胞。

液氮槽vaporphase长期储存。-20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。（2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。3、步骤：（1）冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。（2）配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。（3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。（4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1～2ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。4、注意事项：（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80～90％致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。（2）细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力；在-70度可保存数月。（3）注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22micron　FGLP　Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液，可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗，可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用10%甘油冻存。（4）冷冻保存之细胞浓度：①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml②hybridoma:1～3×106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。③adherent tumor lines:5～7×106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1～3×106cells/ml④other suspensions:5～10×106cells/ml，human lymphocyte须至少5×106cells/ml。（5）冷冻保护剂浓度为5或10％DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。（6）冻存可用10%～90%的血清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积（4度时），复苏存活率在80%～90%以上，对原代培养细胞，以90%血清冻存更为有效。二、冷冻细胞活化1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。2、细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。3、材料37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器4、步骤：（1）操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。（2）自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。（3）将新鲜培养基置于37℃水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。（4）取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。（5）取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10～1:15)，混合均匀，放入CO2培养箱培养。取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。（6）解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心1000rpm，5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。（7）若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。三、细胞计数与存活测试1、原理：（1）计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。（2）血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。（3）存活测试之步骤为dyeexclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料；因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。2、材料：0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061)；Erythosin bluish stain；取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline；血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip)；计数器(counter)；低倍倒立显微镜；粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液（4%乙酸溶液）。3、步骤：（1）取50μl细胞悬浮液与50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。（2）取少许混合液(约15μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosin bluish)。（3）计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypanblue等体积混合)，最后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。注：4大格细胞总数×稀释倍数×104/4=细胞数/ml；每一大格的体积=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml计数板计数时，最适浓度为5～10×105细胞/ml，此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。5、范例：T75 monolayer culture制成10ml细胞悬浮液，取0.1ml溶液与0.1ml trypan blue混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。活细胞数/方格：55，62，49，59；死细胞数/方格：5，3，4，6；细胞总数=243平均细胞数/方格=60.75；稀释倍数=2；细胞数/ml：60.75×104×2（稀释倍数）=1.22×106；细胞数/flask（10ml）：1.22×106×10ml=12.2×106存活率：225/243﹦92.6%