纤维二级结构

http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/05/201105260904_296200_1618299_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/05/201105260904_296201_1618299_3.jpg 据美国物理学家组织网近日报道，二极管是现代电子设备中的核心元件，麻省理工大学研究人员成功制造出一种具有二极管功能的精细纤维，并提供了一种将普通自旋半导体材料拉成纤维的工艺技术，有望给未来的高精电子设备和光子设备开辟一条制造新途径。该研究发表在近日出版的《美国国家科学院院刊》上。

如何应用波谱方法测定蛋白质一级、二级、三级结构？

[align=center][b][/b][/align][align=center][b]二维相关分析用于pH引起的人血清白蛋白二级结构变化的研究[/b][/align]采用二维/衰减全发射红外光谱的分析技术对HSA在不同pH的缓冲体系下二级结构变化的研究，根据吸收峰发生变化的顺序的不同，解释蛋白质的变化过程。通过配制不同pH的缓冲溶液，与HSA混合得HSA-缓冲溶液的体系，利用中红外光谱分析技术对以缓冲溶液为背景，HSA-缓冲溶液体系为样品进行光谱的采集，并对HSA的结构的动态变化进行分析处理。[b][color=windowtext]4.1[/color][color=windowtext]实验仪器与试剂[/color][color=windowtext]4.[/color][color=windowtext]1.[/color][color=windowtext]1[/color][color=windowtext]实验[/color][color=windowtext]仪器[/color][color=windowtext]与软件[/color][/b][align=center][color=windowtext]表[/color][color=windowtext]4-1 [/color][color=windowtext]实验仪器与软件[/color][/align] [table=568][tr][td] [align=center][color=windowtext]仪器[/color][color=windowtext]/[/color][color=windowtext]软件[/color][/align] [/td][td] [align=center][color=windowtext]规格与型号[/color][/align] [/td][td] [align=center][color=windowtext]生产厂家[/color][/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center][color=windowtext]电子分析天平[/color][/align] [/td][td] [align=center][color=windowtext]ME54E[/color][/align] [/td][td] [align=center][color=windowtext]梅特勒[/color][color=windowtext]-[/color][color=windowtext]托利多仪器股份有限公司[/color][/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center][color=windowtext]磁力搅拌器[/color][/align] [/td][td] [align=center][color=windowtext]温控型[/color][/align] [/td][td] [align=center][color=windowtext]巩义市予华仪器有限责任公司[/color][/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center][color=windowtext]pH[/color][color=windowtext]计[/color][/align] [/td][td] [align=center][color=windowtext]FE20[/color][color=windowtext]型[/color][/align] [/td][td] [align=center][color=windowtext]梅特勒[/color][color=windowtext]-[/color][color=windowtext]托利多仪器（上海）有限公司[/color][/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center][color=windowtext][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液枪[/color][/url][/color][/url][/color][/align] [/td][td] [align=center][color=windowtext]1000μL[/color][color=windowtext]、[/color][color=windowtext]100μL[/color][/align] [/td][td] [align=center][color=windowtext]美国[/color][color=windowtext]Thermo Fisher[/color][color=windowtext]公司[/color][/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center][color=windowtext]容量瓶[/color][/align] [/td][td] [align=center][color=windowtext]500mL[/color][/align] [/td][td] [align=center][color=windowtext]四川蜀牛玻璃仪器厂[/color][/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center][color=windowtext]烧杯[/color][/align] [/td][td] [align=center][color=windowtext]500mL[/color][color=windowtext]、[/color][color=windowtext]50mL[/color][/align] [/td][td] [align=center][color=windowtext]四川蜀牛玻璃仪器厂[/color][/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center][color=windowtext]傅里叶变换红外[/color][color=windowtext]/[/color][color=windowtext]拉曼联用光谱仪[/color][/align] [/td][td] [align=center][color=windowtext]NXR FT-RAMAN[/color][color=windowtext]型[/color][color=windowtext]6700FT-TR[/color][/align] [/td][td] [align=center][color=windowtext]美国[/color][color=windowtext]Nicolet[/color][color=windowtext]公司[/color][/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center][color=windowtext]MATLAB[/color][color=windowtext]数据处理软件[/color][/align] [/td][td] [align=center][color=windowtext]2015a[/color][/align] [/td][td] [align=center][color=windowtext]美国[/color][color=windowtext]Mathworks[/color][color=windowtext]公司[/color][/align] [/td][/tr][/table][b][color=windowtext]4.[/color][color=windowtext]1.[/color][color=windowtext]2[/color][color=windowtext]实验材料与[/color][color=windowtext]试剂[/color][/b][align=center][color=windowtext]表[/color][color=windowtext]4-2 [/color][color=windowtext]实验材料与试剂[/color][/align] [table=568][tr][td][color=windowtext]试剂[/color][color=windowtext]/[/color][color=windowtext]材料[/color][/td][td][color=windowtext]规格[/color][color=windowtext]/[/color][color=windowtext]批号[/color][/td][td][color=windowtext]生产厂家[/color][/td][/tr][tr][td][color=windowtext]人血[/color][color=windowtext]清[/color][color=windowtext]白蛋白[/color][color=windowtext]（[/color][color=windowtext]Albumin human[/color][color=windowtext]）[/color][/td][td][color=windowtext]A9731-5G[/color][/td][td][color=windowtext]S[/color][color=windowtext]igma[/color][color=windowtext]-A[/color][color=windowtext]ldrich[/color][color=windowtext]公司[/color][/td][/tr][tr][td][color=windowtext]二水合[/color][color=windowtext]磷酸二氢钠[/color][/td][td][color=windowtext]分析纯[/color][/td][td][color=windowtext]国药集团化学试剂有限公司[/color][/td][/tr][tr][td][color=windowtext]十二水合[/color][color=windowtext]磷酸氢二钠[/color][/td][td][color=windowtext]分析纯[/color][/td][td][color=windowtext]国药集团化学试剂有限公司[/color][/td][/tr][tr][td][color=windowtext]磷酸[/color][/td][td][color=windowtext]分析纯[/color][/td][td][color=windowtext]国药集团化学试剂有限公司[/color][/td][/tr][/table][b][color=windowtext]4.2 [/color][color=windowtext]实验[/color][color=windowtext]内容[/color][color=windowtext]4.[/color][color=windowtext]2[/color][color=windowtext].[/color][color=windowtext]1 [/color][color=windowtext]样品的[/color][color=windowtext]配制[/color][/b]（1）不同pH缓冲液的配制用磷酸配制0.2mol/L磷酸溶液作为A液，用十二水合磷酸氢二钠配制0.2mol/L磷酸氢二钠溶液作为B液。pH计测得A液pH为1.34，B液pH为9.07。利用上述的A液和 B液配制不同pH的缓冲液，配制pH为3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、 5.4、5.6、 5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2的22个不同pH的缓冲溶液，放入到EP管中备用。（2）样品的配制磷酸盐溶液二元体系：取以上22个不同pH的缓冲液中800μL于EP管中，再加入200μL的双蒸水，充分混匀。HSA的磷酸盐溶液三元体系：依次用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液枪[/color][/url][/color][/url]吸取上述22个混合样品800 μL分别加入到不同的EP管中，称取HSA 0.450 g充分溶解后，再分别向各管加入200μL的HSA溶液，充分混匀，所得三元体系HSA的浓度为30mg/mL。[b]4.2.2光谱的采集与处理[/b]（1）中红外光谱谱图采集利用仪器傅里叶变换红外/拉曼联用光谱仪（NXRFT-RAMAN型，6700FT-TR，美国Nicolet公司）、金刚石ATR采样附件（Golden Gate ATR），采集中红外光谱，4000-500cm[sup]-1[/sup]，2cm[sup]-1[/sup]分辨率，64次扫描，温度为室温（26℃），以空气为背景进行扫描，作为背景光谱，采集不同pH条件下HSA溶液的中红外光谱。（2）二维相关分析利用傅里叶变换红外/拉曼联用光谱仪测得的中红外光谱用MATLAB 2015a软件进行处理得到与pH相关的动态图谱—二维等高图，对所得的二维等高图进行二维相关的处理，计算出二维同步与异步矩阵，并得到二维同步谱图与二维异步谱图。分析二维同步谱图，谱图为主对角线对称图，相关峰出现在对角线上，为正值；交叉峰则出现在非对角线区域，可正可负。[b][color=windowtext]4.3 [/color][color=windowtext]实验结果与讨论[/color][/b][color=windowtext]（[/color][color=windowtext]1[/color][color=windowtext]）[/color][color=windowtext]H[/color][color=windowtext]SA [/color][color=windowtext]磷酸盐[/color][color=windowtext]溶液[/color][color=windowtext]中红外光谱图预处理结果与分析[/color][color=windowtext]图[/color][color=windowtext]4-1[/color][color=windowtext]为[/color][color=windowtext]pH 3.0[/color][color=windowtext]-[/color][color=windowtext]7.2[/color][color=windowtext]的[/color][color=windowtext]HSA [/color][color=windowtext]磷酸盐[/color][color=windowtext]溶液的经过[/color][color=windowtext]SNV[/color][color=windowtext]处理之后的光谱图[/color][color=windowtext]，[/color][color=windowtext]SNV[/color][color=windowtext]与标准化算法计算公式相同，但不同之处是标准化算法是对一组光谱进行处理，而[/color][color=windowtext]SNV[/color][color=windowtext]是对一条光谱进行处理[/color][color=windowtext]。[/color][color=windowtext]进行[/color][color=windowtext]SNV[/color][color=windowtext]处理的主要目的是消除光谱的基线漂移的影响。[/color][align=center][img=,690,339]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131726099980_5308_3237657_3.png!w690x339.jpg[/img][/align][align=center][color=windowtext]图[/color][color=windowtext]4-1pH 3.0[/color][color=windowtext]-[/color][color=windowtext]7.2[/color][color=windowtext]的[/color][color=windowtext]HSA [/color][color=windowtext]磷酸盐[/color][color=windowtext]溶液的经过[/color][color=windowtext]SNV[/color][color=windowtext]处理之后的光谱图[/color][/align]在本章的研究中，主要考察HSA酰胺I区和酰胺II区结构的光谱变化，即1750-1580cm[sup]-1[/sup]，图4-2所示从上到下依次为pH7.0、pH4.8、pH4.0和pH3.0的HSA的原始光谱减去对应pH缓冲液的光谱后得到的差谱图，进行差谱的主要目的是扣除水与缓冲盐对光谱的影响。从图中可以看到在酰胺I段在1653cm[sup]-1[/sup]具有明显的吸收峰，这个吸收峰可以归属为α-螺旋的吸收峰，并且在pH下降到3.0时，α-螺旋的特征峰变化较为明显，与pH7.0、pH4.8、pH4.0的光谱图在1653cm[sup]-1[/sup]不一样，吸收峰有所下降，形状也有一定程度的变化。推测在较低的pH条件下，HSA的α-螺旋结构遭到了破坏，因此发生了一定的结构变化。[align=center][img=,690,334]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131726229783_6130_3237657_3.png!w690x334.jpg[/img][/align][align=center]图4-2 HSA 磷酸盐溶液在波长为1750-1580cm[sup]-1[/sup]段的差谱图[/align]图4-3所示为 pH7.0-3.0范围的的HSA的连续小波变换（CWT）光谱，连续小波变化的目的是提高光谱分辨率。CWT应用的关键是选择合适的小波基与小波尺度，参数设置合理时，CWT在扣除无用信息的同时，可以提取出光谱中的有效信息。本章中使用了“Sym2”小波基和20小波尺度获得平滑效果以得到更高的分辨率。可以看出经过小波变换之后，光谱信息得到进一步的分辨，pH7.0下HSA可以保持天然结构，随着pH的降低，可以明显看大部分结构都发生了变化，某些吸收峰甚至消失。[align=center][img=,690,404]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131726350596_917_3237657_3.png!w690x404.jpg[/img][/align][align=center]图4-3 pH7.0-3.0范围的的HSA的连续小波变换光谱[/align]如表4-3所示，是在中红外光谱中，对蛋白质HSA分辨出的一些主要吸收峰进行了结构归属，可以辅助研究不同pH对蛋白质HSA的结构变化的影响。[align=center]表4-3 HSA的分辨出主要吸收峰[/align] [table=568][tr][td] [align=center]峰的波数（cm-1）[/align] [/td][td] [align=center]归属情况[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center] 1745[/align] [/td][td] [align=center]自由COOH基团[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1732/1722[/align] [/td][td] [align=center]半氢键结合的COOH基团[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1711[/align] [/td][td] [align=center]弱氢键结合的COOH基团[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1702[/align] [/td][td] [align=center]中等强度氢键结合的COOH基团[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1695[/align] [/td][td] [align=center]强氢键结合的COOH基团[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1680[/align] [/td][td] [align=center]β-转角[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1667[/align] [/td][td] [align=center]β-转角[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1653[/align] [/td][td] [align=center]α-螺旋[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1625[/align] [/td][td] [align=center]β-折叠链[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1613[/align] [/td][td] [align=center]Side chains[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1598[/align] [/td][td] [align=center]COO[sup]-[/sup][/align] [/td][/tr][/table][color=windowtext]（[/color][color=windowtext]2[/color][color=windowtext]）[/color][color=windowtext]pH 7[/color][color=windowtext].[/color][color=windowtext]2-5[/color][color=windowtext].[/color][color=windowtext]0[/color][color=windowtext]范围内[/color][color=windowtext]HSA[/color][color=windowtext]磷酸盐溶液[/color][color=windowtext]中红外[/color][color=windowtext]光谱的二维相关[/color][color=windowtext]分析[/color]由于在酰胺I区和酰胺II区能代表蛋白质HSA二级结构的吸收峰有重叠，在图4-1、图4-2、图4-3中能表示HSA的二级结构的信息不够详细，又因为二维红外光谱分析能提高图谱的分辨率，所以对不同pH下HSA磷酸盐溶液与磷酸盐溶液的差谱进行二维红外光谱分析。图4-4为pH 7.2-5.0范围内HSA磷酸盐溶液对应的二维相关同步谱（左）和异步谱（右），其中虚线部分为负相关，实线现部分为正相关。从图中可以看出，各吸收峰之间在HSA的质子化过程中具有高度的协同性。[align=center][img=,690,327]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131726485419_7489_3237657_3.png!w690x327.jpg[/img][/align][align=center]图4-4 pH 7.2-5.0范围内HSA磷酸盐溶液的二维相关同步谱（左）和异步谱（右），横、纵坐标均为波数Wavenumber（cm[sup]-1[/sup]）[/align]在图4-4的同步谱中，除以上表4-4中得到的特征吸收峰外，另外可以辨识出的峰还包括1637cm[sup]-1[/sup]，可以归属为β-strand。HSA中包括98个酸性侧链，包括36个天冬氨酸残基和62个谷氨酸残基和100个含有24个精氨酸、59个赖氨酸和17个组氨酸的侧链结构。在pH= 4.3的溶液中，大约有一半的天冬氨酸和谷氨酸酸性侧链基团发生质子化，因此推测，在pH从7.0到5.0过程中，羧基基团逐渐经历质子活化过程，将1732cm[sup]-1[/sup]和1722cm[sup]-1[/sup]归属为介于自由羧基和弱氢键结合的羧基之间的的半氢键结合状态的羧基基团。Noda规则为一段波长范围内出现异步相关光谱，说明该区域有重叠峰，但在同步谱中该位置没有明显的同步交叉峰，此时同步谱图中同步交叉相关的强度变化是越靠近峰位置中心其相关强度越小，表明峰强度变化方向是反向，而强度一个是增加的情况，另一个则是减小的情况。表4-2为根据Noda规则，已分辨出的吸收峰的变化顺序。[align=center]表4-4 根据同步谱/异步谱得到的交叉峰信息及根据Noda原则得出的pH7.2-5.0的范围内可以分辨的吸收峰的变化顺序[/align] [table=568][tr][td] [align=center]峰（cm[sup]-1[/sup]）[/align] [/td][td] [align=center]Ф[/align] [/td][td] [align=center]ψ[/align] [/td][td] [align=center]变化顺序[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1739，1628[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]1628＞1739[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1716，1628[/align] [/td][td] [align=center]0[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]—[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1739, 1682[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]1739＞1682[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1682，1671[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]1682＞1671[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1671，1653[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]1653＞1671[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1682，1653[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]1653＞1682[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1739，1653[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]1739＞1653[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1716，1653[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]1716＞1653[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1727，1653[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]1727＞1653[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1700，1653[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]1700＞1653[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1671，1609[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]1609＞1671[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1637，1609[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]1609＞1637[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1682，1609[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]1682＞1609[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1671，1624[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]1624＞1671[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1624，1609[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]1609＞1624[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1671，1594[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]1594＞1671[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1682，1594[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]1682＞1594[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1609，1594[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]1609＞1594[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1624，1594[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]1594＞1624[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1653，1594[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]1653＞1594[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1653，1637[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]1653＞1637[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1637，1609[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]1609＞1637[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1637，1594[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]1594＞1637[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1637，1624[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]1624＞1637[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1671，1637[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]1637＞1671[/align] [/td][/tr][/table]由表4-4可得： 1739cm[sup]-1[/sup]（自由COOH基团）、1727cm[sup]-1[/sup]（半氢键结合的COOH基团）、1716cm[sup]-1[/sup]（弱氢键结合的COOH基团）＞1653cm[sup]-1[/sup]（α-螺旋）＞1682cm[sup]-1[/sup]（β-转角）＞1609cm[sup]-1[/sup]（Side chains）＞1594cm[sup]-1[/sup]（COO[sup]-[/sup]）＞1624cm[sup]-1[/sup]（β-折叠链）＞1637cm[sup]-1[/sup]（β-strand）＞1671cm[sup]-1[/sup]（β-转角）。因此除1653cm[sup]-1[/sup]目前在文献中其余的均无归属，此处因峰强度较小可以忽略；异步谱交叉峰峰强度很弱，因此，HSA的异步光谱表明羧基组的氢键的变化先于二级结构变化，二级结构的变化顺序为；先是α-螺旋，其次是高波长β-转角、酪氨酸侧链、β-折叠链、β-股、低波长β-转角。所以，pH（7.2-5.0）在较高情况下，COOH对pH的敏感性要高于α-螺旋结构的敏感性。（3）pH 5.2-4.4范围内HSA磷酸盐溶液中红外光谱的二维相关分析图4-7为pH5.2-4.4范围内的二维相关同步谱（左）和异步谱（右），其中虚线部分为负相关，实线部分为正相关。从图中可以看出，各吸收峰之间在HSA的质子化过程中具有高度的协同性。[align=center][img=,690,321]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131727525262_7281_3237657_3.png!w690x321.jpg[/img][/align][align=center]图4-5 pH5.2-4.4范围内的二维相关同步谱（左）和异步谱（右），横、纵坐标均为波数Wavenumber（cm[sup]-1[/sup]）[/align][align=center]表4-5 根据同步谱/异步谱得到的交叉峰信息及根据Noda原则得出的pH5.2-4.4的范围内可以分辨的吸收峰的变化顺序[/align] [table=568][tr][td] [align=center]峰的波数（cm[sup]-1[/sup]）[/align] [/td][td] [align=center]Ф[/align] [/td][td] [align=center]ψ[/align] [/td][td] [align=center]变化顺序[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1733，1720[/align] [/td][td] [align=center]0[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]—[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1720，1653[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]1720＞1653[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1697，1653[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]1697＞1653[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1653，1607[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]1653＞1607[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1607，1591[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]1591＞1607[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1653，1591[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]1591＞1653[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1697，1591[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] 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变化的敏感性要高于α-螺旋的敏感性。（4）pH4.6-3.8范围内HSA磷酸盐溶液中红外光谱的二维相关分析图4-6为pH4.6-3.8范围内的二维相关同步谱（左）和异步谱（右）其中虚线部分为负相关，实线部分为正相关。从图中可以看出，各吸收峰之间在HSA的质子化过程中具有高度的协同性。[align=center][img=,690,315]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131728232083_9380_3237657_3.png!w690x315.jpg[/img][/align][align=center]图4-6pH4.6-3.8范围内的二维相关同步谱（左）和异步谱（右），横、纵坐标均为波数Wavenumber（cm[sup]-1[/sup]）[/align][align=center]表4-6 根据同步谱/异步谱得到的交叉峰信息及根据Noda原则得出的pH4.6-3.8的范围内可以分辨的吸收峰的变化顺序[/align] [table=568][tr][td] [align=center]峰的波数（cm[sup]-1[/sup]）[/align] [/td][td] [align=center]Ф[/align] [/td][td] [align=center]ψ[/align] [/td][td] [align=center]变化顺序[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1697，1677[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]1697＞1677[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1677，1668[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]1677＞1668[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1668，1648[/align] 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[/td][/tr][/table]由表4-6得：1738cm[sup]-1[/sup]（半氢键结合的COOH基团）、1729cm[sup]-1[/sup]（半氢键结合的COOH基团）、1718cm[sup]-1[/sup]（弱氢键结合的COOH基团）、1697cm[sup]-1[/sup]（强氢键结合的COOH基团]＞1677cm[sup]-1[/sup]（β-转角）＞1648cm[sup]-1[/sup]（random coil）＞1636cm[sup]-1[/sup]（β-strand）＞1682cm[sup]-1[/sup]（β-转角）＞1668cm[sup]-1[/sup]（β-转角）、1611cm[sup]-1[/sup]（Side chains）、1604cm[sup]-1 [/sup]（COO[sup]-[/sup]）。由上顺序得，HSA的异步光谱表明羧基组的氢键的变化先于二级结构变化，二级结构的变化顺序为：中波长β-转角、无卷曲构象、β-strand、高波长β-转角、低波长β-转角、酪氨酸残基。因此，pH在4.6-3.8范围内羧基组的氢键对pH的敏感性要高于无卷曲构象、β-strand，但羧基对pH的敏感性要低于无卷曲构象、β-strand。又因异步谱交叉峰峰强度很弱，所以1738cm[sup]-1[/sup]、1729cm[sup]-1[/sup]、1718cm[sup]-1[/sup]、1697cm[sup]-1[/sup]的顺序相当，1668cm[sup]-1[/sup]、1611cm[sup]-1[/sup]、1604cm[sup]-1[/sup]的顺序相当。（5）pH3.8-3.0范围内HSA磷酸盐溶液中红外光谱的二维相关分析[align=center][img=,690,308]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131729083359_5528_3237657_3.png!w690x308.jpg[/img][/align][align=center]图4-7 pH3.8-3.0范围内的二维相关同步谱（左）和异步谱（右），横、纵坐标均为波数Wavenumber（cm[sup]-1[/sup]）[/align]图4-7为pH3.8-3.0范围内的二维相关同步谱（左）和异步谱（谱），其中虚线部分为负相关，实现部分为正相关，在异步谱中，仍可分辨出部分的吸收峰，包括1743cm[sup]-1[/sup]，1730cm[sup]-1[/sup]，1706cm[sup]-1[/sup]，1699cm[sup]-1[/sup].与整个的酰胺I和酰胺II区分别形成强的正相关和负相关和正相关和负相关，说明在强酸环境中，羧基组的氢键形成要比其他pH条件范围快得多。[align=center][img=,690,365]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131729231532_818_3237657_3.png!w690x365.jpg[/img][/align][align=center]图4-8 pH3.8-3.0范围内的同步谱的透射图，x、y轴均为波数Wavenumber（cm[sup]-1[/sup]），z轴为相对强度）[/align][align=center][img=,690,322]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131729358095_7590_3237657_3.png!w690x322.jpg[/img][/align][align=center]图4-9pH3.8-3.0范围内的异步谱的透射图，x、y轴均为波数Wavenumber（cm[sup]-1[/sup]），z轴为相对强度[/align]在图4-8pH3.8-3.0范围内的同步谱的透射图、图4-9pH3.8-3.0范围内的异步谱的透射图中可以看到，1618cm[sup]-1[/sup]出现强的自动峰，而其他峰因为1618cm[sup]-1[/sup]信号较强而被掩盖掉。1618cm[sup]-1[/sup]可归属为蛋白侧链基团。可以得知，占HSA67%的α-螺旋结构在强酸环境中遭到破坏，吸收峰基本消失。[align=center]表4-7 根据同步谱/异步谱得到的交叉峰信息及根据Noda原则得出的pH3.8-3.0的范围内可以分辨的吸收峰的变化顺序[/align] [table=568][tr][td] [align=center]峰的波数（cm-1）[/align] [/td][td] [align=center]Ф[/align] [/td][td] [align=center]ψ[/align] [/td][td] [align=center]变化顺序[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1656，1648[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]1656＞1648[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1648，1640[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]1640＞1648[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1656，1640[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]0[/align] [/td][td] [align=center]—[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1648，1633[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]-[/align] [/td][td] [align=center]1633＞1648[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1656，1633[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] [align=center]+[/align] [/td][td] 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chains）＞1633cm[sup]-1[/sup]（β-折叠链）＞1648cm[sup]-1[/sup]（random coil）。pH为3.8-3.0时，HSA的异步光谱表明羧基组的氢键的变化先于二级结构的变化，首先是α-螺旋，其次是酪氨酸残基，β-折叠链等。因此，在pH 3.8-3.0的范围内，羧基对pH的敏感性要高于α-螺旋的敏感性。[align=center][img=,690,335]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131729514171_7621_3237657_3.png!w690x335.jpg[/img][/align][align=center]图4-10不同pH段的二维相关同步谱的能量谱，a、b、c、d四个谱图依次为pH7.2-5.0，5.2-4.4，4.6-3.8，3.8-3.0范围二维相关同步能量谱图[/align]从图4-10中可以看出在这四个pH段的光谱特征具有明显的区别,这些差异意味着在不同的pH条件下HSA的结构发生了明显不同的改变。从图4-11中可以明显看出在不同的pH中蛋白结构发生明显的变化。[align=center][img=,690,492]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131730224583_14_3237657_3.png!w690x492.jpg[/img][/align][align=center]图4-11对异步谱中的1653cm[sup]-1[/sup]的异步谱进行提取的图谱，从上到下依次为pH7.2-5.0、5.2-4.4、4.6-3.8、3.8-3.0范围对异步谱中的1653cm[sup]-1[/sup]的异步谱进行提取图谱[/align][b]4.4结论[/b]本章内容通过广义二维相关红外光谱探究了HSA在酸性条件下解折叠的过程，同步谱和异步相关谱提供了详细的光谱变化。二维相关光谱不仅提供了二级结构的变化信息，并且也能表征羧基基团和侧链结构的变化。在分析中可以看出有至少四种不同氢键结合程度的羧基基团参与了结构变化过程中，在不同的pH范围，均是由羧基结构先发生变化，因此推测在酸性环境中羧基基团的质子化可能是诱发蛋白结构发生变化的重要原因。且在不同pH范围内HSA的二级结构发生变化的过程中，吸收峰发生变化的顺序有所不同。二维相关技术的应用有助于解释蛋白质的变化过程，具有独特的优势。此外，异步谱的应用，可以提供更多的蛋白结构变化信息。虽然分析中得到了谱图相关强度，但是因为有些信号较弱，且差谱之后噪音的存在，这些峰变化的先后的准确性仍需要进一步的确定。此外，应用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/1p][color=#3333ff]近红外光谱[/color][/url]分析技术结合中红外光谱分析技术对pH引起的体系变化仍需要进一步探索，以相互补充和印证。