毕赤酵母宿主细胞检测试

随着重组DNA技术的迅猛发展，外源基因在不同宿主中的表达使得各种重组蛋白的工业生物生产成为可能。选择合适的宿主是生物工艺设计中的关键步骤之一，具体取决于：1.上游培养效率2.易于基因编辑和分子工具的可用性3.翻译后修饰的能力，如糖基化4.蛋白质（用于下游加工和作为生物制药成分等）的分泌能力目前，多种生物已被应用于重组蛋白的生产，尤其是大肠杆菌，易于基因改造，具有在酵母水解物等多种基质上快速生长并产生高蛋白滴度的优势。已成为迄今为止业界追捧的主力军。典型的生物工艺优化通常需要进行一些初步试验，以发现适用于宿主菌株并提高目的重组蛋白表达的培养基成分（特别是氮基营养素）。对于此类应用需求，能够提高实验效率和参数准确度的高通量筛选平台成为热门工具。贝克曼库尔特BioLector通过在线测量关键培养参数提供可放大的高通量分析。本案例为通过BioLector对多种酵母营养素就生物量生长和重组蛋白的形成进行评估和比较，筛选出了适合大肠杆菌重组蛋白生产和诱导时间的理想培养基。方法培养菌株：大肠杆菌BL21(DE3)pET-28a(+)EcFbFP。培养基：以标准TB培养基（Carl Roth）为参照物，对多个TB 样（Terrific 液）培养基进行比较。不同的TB 样培养基使用不同的酵母提取物。BioLector培养条件：在接种至微孔板之前，先在250 mL摇瓶中进行预培养， 37°C培养6小时。然后使用48孔梅花板（MTP-BOH2）在 BioLector中进行培养。温度 37°C ，振摇速度：1400 rpm。分别在每个培养孔中填充800μL培养液用于非诱导实验，填充790μL用于诱导实验。诱导实验中，在诱导时间点上添加 10μL 50μM 的 IPTG。环境氧气浓度保持在35%，避免培养物缺氧。BioLector在线测量：培养过程中对生物量、EcFbFP(黄素荧光蛋白)、pH以及 DO进行在线测量。结果不同TB样培养基的生物量生长情况：培养实验中，不同酵母营养素的培养基中生物量的生长情况如上图所示：培养基不同，最终的光密度和生长速率也会不同。ProCel 6 中的大肠杆菌OD最高，培养基 ProCel 3 中的大肠杆菌的OD低。ProCel 6为本特定工艺的最高生长速率。上图为培养过程的DO值。培养基 ProCel 3 和 ProCel 4 中的培养物未达到0%的氧饱和度，这表明由于耗氧量有限，该培养基中的菌株代谢活性较低。相反，其他培养物包括TB标准培养基，均在短时间内达到0%的氧饱和度，表明菌株代谢活性高。不同酵母营养素TB样培养基的产物生成：通过将IPTG 添加到培养物中来诱导 T7 聚合酶的表达促进黄素荧光蛋白的生成。BioLector使用梅花板为48个培养物提供了独立的培养空间，因此可测试不同的诱导时间点。使用自动化工作站整合BioLector后的 RoboLector 系统还可以自动进行培养诱导。首先选择一个固定的诱导时间点。分别为培养启动后的3小时、3.75小时和4.5小时。下图所示为每种TB样培养基在诱导时间下所测荧光的平均值。荧光动力学清晰地表明不同培养基有不同的EcFbFP（黄素荧光蛋白）表达水平。表现出最强荧光信号的两个样本为：ProCel 2，诱导点为3.75小时；ProCel 5，诱导点为 3 小时。经过 7.7 小时的培养，ProCel 5 的荧光值达到102.94a.u.，而ProCel 2 的荧光值达到 101.82 a.u.。本方法的不足之处在于未比较不同样本的生物量对蛋白质产量的影响。经过3小时的培养，一些培养物的OD已达到6，而其他培养物仅达到3。当诱导具有不同光密度的培养物时，可能会对在每种酵母营养素上生长的实验大肠杆菌的蛋白质生产性能造成误解。鉴于此，我们采用了一种新方法，将诱导点与生物量信号耦合。使用BioLector的信号驱动RoboLector，依赖于特定生物量的诱导对于每个单独的孔都是可行的。为自动化工作站设置3、6或8的OD目标值，以根据孔内培养物的生长动力学自动添加IPTG以诱导蛋白质生产。如下图所示，ProCel 2表现最佳，最终值为 146.23 a.u.，培养时间是 12.3 小时；ProCel 5表现次之，最终值为138.1 a.u.。与之前进行的一系列实验相比，本实验中的排名与在特定时间点进行诱导的实验不同。这一观察证明了最佳工艺条件的重要性，并使这些条件具有可比性。此处数据表明：与之前的实验相比，本实验中的荧光值更高。正如该领域诸多论文中所强调的那样，诱导时间确实是一个关键参数。同样，在优化大肠杆菌重组蛋白生产的过程中，也必须评估诱导剂的浓度。另外，与对照TB培养基相比，这里测试的一些酵母氮源产生了更高的重组蛋白产量。这些结果凸显了选择培养基成分的重要性，这些成分能够在特定的生物工艺中实现高而稳定的产量。结论通过BioLector系统，贝克曼库尔特可为用户提供适用于各种应用领域的高通量筛选平台。其独特的梅花形微孔板尤其适用于好氧培养，如同实验室生物反应器，BioLector系统通过非侵入式传感器使客户能够获取更多的在线测量参数。正如本应用，通过BioLector系统可轻松实现培养基的筛选，整合自动化工作站的RoboLector，还可实现更多功能。补料、pH调控以及文中所述的诱导功能，所有这些均可在小规模实验中实现，帮助客户同时兼顾成本和效率。RoboLector高通量自动化微型生物培养平台欲了解该应用详情，请扫描下方二维码下载应用指南《利用BioLector进行大肠杆菌重组蛋白生产用酵母营养素的筛选》

“生物传感器的广泛开发与应用，主要归功于生物元件对于其敏感的分析物具有很强的特异性，不会识别其他分析物。利用生物传感器，可以快速、实时获得有关分析物准确可靠的信息。”袁吉锋说。合成生物学的发展推动了细胞生物传感器的开发。这种生物传感器以活细胞为生物元件，基于活细胞受体检测细胞内外的微环境状况和生理参数的变化，并通过两者之间的相互作用产生细胞信号转导，进一步激活不同的信号输出模块，从而产生不同的信号。袁吉锋介绍，从本质上讲，其他类型的生物传感器使用的是从生物中提取出的生物元件。而基于活细胞的细胞生物传感器是一种独特的生物传感器，它可以通过模拟细胞正常的生理生化变化来检测信号。目前，这种生物传感器已成为医疗诊断、环境分析、食品质量控制、化学制药工业和药物检测领域的新兴工具。“用于构建细胞生物传感器的生物元件包括细菌细胞、真菌细胞以及哺乳动物细胞。我们这次所构建的工程化酵母生物传感器，正是基于酿酒酵母细胞所构建的真菌细胞传感器。”袁吉锋说，酿酒酵母细胞用于生物传感器的构建，在细胞性能上具有优势。作为一种真核生物，酿酒酵母细胞与哺乳动物细胞的大多数细胞特征和分子机制一致，特别是与感知和响应环境刺激密切相关的GPCR信号通路具有极高的相似性；酿酒酵母是酵母物种中第一个基因组已完全测序的真核生物，并且遗传修饰工具非常完备；酿酒酵母的培养条件简易、培养成本低、生长速度快、温度耐受范围宽，可以通过冷冻或脱水等方式进行储存和运输，具有生物安全性。可进一步设计改造成检测试纸基于工程化酵母细胞构建生物传感器多年来一直是研究热点。袁吉锋团队此次通过人工转录因子，将GPCR信号通路与高效基因转录模块——半乳糖调控模块进行耦合，在酵母生物传感器中引入了一个额外的正反馈回路，以此来增强酵母生物传感器的灵敏度和信号输出强度。袁吉锋解释说：“我们相当于设计了一种正反馈放大器，让酿酒酵母细胞中GPCR在识别到白色念珠菌的信息素信号之后，不仅能通过人工转录因子激活下游信号报告模块的表达，同时还能驱动半乳糖调控模块自身的转录因子Gal4表达。两个转录因子协同作用，就能持续激活和放大报告基因的输出信号。”数据显示，相比于初始传感器的性能，改造后的酵母生物传感器的检测限提升了4000倍，激活浓度提升了9700倍，信号输出强度提升了近3倍，尤其是信号输出的持续时间得到了明显提升。初始传感器在检测使用2小时后就出现荧光信号的衰退，而改造后的传感器在使用12小时后仍可产生明显的荧光信号。“此次构建的酵母生物传感器，可以设计成一种简单、低成本的检测试纸，用于检测医疗样本或环境样本中的病原真菌。”袁吉锋介绍，只需将试纸浸入待检测液体样本中，即可实现对该样本快速灵敏和可视化的检测。

在给许多客户介绍酵母浸粉时，很多人都会将其与酵母粉混为一谈，经常会问：“酵母浸粉不就是酵母粉吗？”“酵母浸膏和酵母浸粉哪个好呢？” 首先我们了解一下什么是酵母粉、酵母浸粉和酵母浸膏吧！ 酵母粉含义：一般是指灭活的酵母，产品成分主要是失去活性的酵母菌体，营养成分包括仍然包裹在菌体内部的粗蛋白、胞壁多糖以及丰富的维生素、生长素、微量元素等。 酵母粉分类：分糖蜜酵母粉与啤酒渣酵母粉两大类，前者专门发酵生产并干燥制成，以糖蜜为主要原料，品质好且质量稳定；后者采用啤酒生产的废料－废啤酒酵母泥为原料，一般采取滚筒干燥制成，成本较低，但杂质较多，酵母细胞较老化，微生物不易吸收利用，品质不稳定。酵母粉主要在传统的抗生素等发酵行业应用较广泛。 酵母粉特点：微生物对酵母粉的营养物质利用率与利用速率较低，发酵完毕后不能利用的残留物（粗蛋白与菌体细胞壁）较多，难以处理。 酵母浸粉含义：又称酵母提取物，是采用新鲜酵母经酵母自溶、过滤、 浓缩、喷雾干燥而得到的一种浅黄色至类白色 干燥粉末。有酵母自然 香味，易溶于水，水溶 液呈淡黄色。酵母浸粉吸湿性，请放阴凉干燥处保存。酵母浸粉当中含有氨基酸类、肽类、水溶性维生素、及酵母多糖、酵母核酸组成的一种混合物，酵母浸粉当中含有丰富的B族维生素和各种氨基酸。核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类的水溶性物质。在当中它起的主要作用是补充氮源和提供细菌生长的各种维生素及氨基酸。 酵母浸粉分类：同样可以采取糖蜜发酵的糖蜜酵母和啤酒生产的废啤酒酵母泥为原料生产。 糖蜜酵母生产的酵母浸粉一般品质较高，这一方面是糖蜜酵母发酵经过专业的生产控制，原料品质就比较高，另外啤酒酵母粉为原料也有利于酵母积累更丰富的天然营养成分。另外一方面是以糖蜜酵母为原料的酵母浸粉生产规模可以做的很大，生产厂家可以充分采用先进的生产工艺设备与技术，从生产技术的角度保证酵母浸粉产品的高品质。 酵母浸粉特点：酵母浸粉的生物利用度高，微生物的利用速率快，特别有利于对发酵培养基比较挑剔的营养缺陷型、基因重组工程菌的吸收利用，有助于缩短发酵周期，提高微生物发酵效价；同时发酵残留非常少，有利于发酵废液的环保处理。 酵母浸粉主要用于微生物培养基制备的基础原材料以及生物制药发酵。 酵母浸膏以酵母为原料，采用自溶法或加酶水解法工艺，经分离、脱色精制浓缩而成的，含氨基酸、肽、多肽及酵母细胞水溶性成分的膏状产品。 废啤酒酵母泥生产的酵母浸粉品质一般要大大差于糖蜜酵母浸粉，这主要是因为废啤酒酵母泥本身是啤酒生产的副产物，不存在什么质量控制；另外一方面是废啤酒酵母泥不能长途运输，生产厂家一般只能依赖周边啤酒厂的有限供应，生产规模难以扩大，因此限制了厂家的投资规模，一般只能土法上马，难以把生产技术装备以及所能采取的技术手段提升到理想的状态，导致产品色泽较深、不溶性杂质较多，维生素、生长素等微量营养物质的含量也比较欠缺。 酵母粉和酵母浸粉是完全不一样的产品，更不能混为一谈。 酵母浸粉和酵母浸膏的区别在于酵母浸粉经过高温瞬时干燥所损失的营养成分比酵母浸膏长时间浓缩所损失的营养要少得多，所以酵母浸粉在实际使用中用量更经济，且使用方便，也更易于运输和保存。 酵母浸粉和酵母浸膏应用领域食:品饲料领域、动物营养领域、生物发酵领域、营养保健领域、发酵工业领域：可用于抗生素新药、多肽、核苷酸、B族维生素、生长因子、氨基酸、有机酸、酶制剂、生物防腐剂、原料药、VC及肌苷、生物材料、维生素、微量元素、基因工程等生物工程产业。为微生物发酵培养提供全面均衡的营养 、微生物培养基:假单胞杆菌、醋酸杆菌、葡萄糖酸杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌、乳酸链球菌、葡萄球菌、酵母及支原体。

英国Bibby Scientific 集团，子品牌PCRmax 下的荧光定量PCR仪ECO， 或者子品牌TECHNE下的PRIME PRO 48， 可以有效而可靠地检测名叫“德克.布鲁赛尔”的酵母。 对于全球红酒行业而言，该酵母的存在是破坏红酒的一个主要原因。从这方面说，Bibby 的基于PCR的荧光定量检测方法也有助于红酒行业防止巨额经济损失。酵母中释放的可破坏味道的酚成份， 产生了不可预计的芳香成份，通常会与谷仓的味道或动物的汗味等结合，从而破坏红酒的味道。如果采用传统的微生物学技术去检测酵母，太费时费力，成本高， 结果也不太可靠。相反， 实时定量PCR方法，能高效快速并精确地检测酵母。检测“德克.布鲁赛尔”酵母的存在，可用Bibby 的荧光定量PCR仪 ECO 或Prime Pro 48，及“德克.布鲁赛尔26S核醣体RNA” 检测试剂。该试剂专门用于德克.布鲁赛尔酵母基因组的定量检测, 由引物与探针序列组成，检测范围广。广州语特仪器科技有限公司全权代理Bibby产品在中国大南方区的销售。Bibby PCR Detection Methods Could Prevent Large Economic Losses in the Wine IndustryBibby Scientific has announced that it has launched a PCR-based method for reliable and highly specific detection of the yeast, Dekkera bruxellensis, which is a major cause of wine spoilage worldwide, causing large economic losses within the global wine industry.Flavour-spoiling phenolic compounds released from this yeast lead to undesirable aromas, known as ' Brett' taints, that are normally associated with aromas of barnyard, burnt plastic, wet animal and horse-sweat. Detection of the yeast through traditional microbiological techniques can be time-consuming, costly and unreliable. In contrast, real-time or quantitative PCR-based detection methods allow for exceptionally rapid and highly specific identification of the yeast. Testing for the presence of D. bruxellensis can be determined using the Techne Prime Pro 48 qPCR system in conjunction with the Techne qPCR test ' Dekkera bruxellensis 26S ribosomal RNA' . The Techne qPCR Kit for D. bruxellensis is designed for the in vitro quantification of D. bruxellensis genomes. The kit is designed to enable the broadest detection possible whilst remaining specific to the D. bruxellensis genome. The kit is comprised of primers and probe sequences that have 100% homology with a wide range of D. bruxellensis sequences based on comprehensive bioinformatics analyses关于语特 和 英国Bibby / 德国ART / 德国CAT / 瑞士Gerber Instruments 广州语特仪器科技有限公司专注于搅拌器/分散乳化机等实验室样品制备等通用仪器， 熔点仪/光度计/冰点仪等分析仪器，以及PCR等生命科学仪器。 作为英国比比（Bibby ）在中国南方的首代，广东，广西，四川，重庆，云南，海南，贵州和西藏是我司的服务范围。语特公司也是德国ART， 德国CAT，瑞士Gerber Instruments 在中国的首代。 * 英国BIBBY 成立于上个世纪50年代，作为英国最大的实验室科学仪器生产商， 旗下有4个子品牌：Stuart，Techne，Jenway，Electrothermal. 专注于样品前处理等通用实验室仪器（如：熔点仪, 搅拌器, 混匀器，摇床, 培养箱，干浴器/氮吹仪，水浴，菌落计数器, 纯水蒸馏器），分子生物学研究设备(基因扩增仪PCR，荧光定量，杂交箱)；分光光度计/超微量紫外等分析仪器，及平行反应工作站相关产品。 * 德国ART 成立于上个世纪，是德国乃至全球最专业的分散乳化专家。顶级分散乳化产品从实验室仪器，中试产品到工业设备， 分散头种类组合高达上百种；应用领域覆盖了化工，化妆品，制药，食品，环保等各大领域。 * 德国CAT 成立于上个世纪50年代，是德国样品制备仪器方面的专家之一, 以”品质稳定”而闻名。其顶置式搅拌器种类多样，从手持式，教学用，到科研通用型，高粘度型，是CAT的代表产品线。 * 瑞士Gerber Instruments 有超过120的历史，是专注于乳食品行业的典型代表。其产品冰点仪, 乳脂离心机, 食品专用PH计, 流出式粘度计等, 风靡欧洲及其它大陆国家。

瑞士步琦冷冻干燥含酵母菌的微球应用冷冻干燥应用”益生菌是一种有益于人体健康的微生物，常被用于改善肠道菌群。微胶囊包埋技术可以帮助保护菌株，延长其在体内的存活时间，不易受外界环境的影响而失活。因此，在生产益生菌产品时，需要考虑选择合适的微胶囊技术，以确保益生菌的稳定性和活性。下面这篇应用非常好的结合了微胶囊包埋和冷冻干燥技术，证明菌种经过包埋干燥后仍具有生物活性，为发酵工艺和食品转化等领域开辟新的可能性。1介绍冷冻干燥，也称为冻干是一种非常通用的脱水方法，常用于保存微生物、食物或药物，如蛋白质类药物。它将冷冻和干燥结合在一个独特的操作中，可以创造出高质量的干燥终产品。冷冻干燥通常用于保存微生物培养物，因为它具有不可忽视的优点：储存的方便性和增加邮寄微生物的可能性。此外，制得的产品只需要少量维护，培养基在储存过程中不会受到污染，微生物可以长时间保持活力。然而，众所周知，冷冻干燥技术对微生物至关重要，因为它对微生物的生存能力和生理状态都有负面影响。根据方法和生物体的不同，微生物存活率也各有不同；然而，活力水平明显低于液氮储存 2。观察到的活力下降主要是由于一些不良副作用引起的，例如细胞内冰晶的形成1、敏感蛋白的变性或在此过程中膜脂质的物理状态发生一些不可逆的变化 3,5。为了防止这种影响，通常在冷冻或冷冻干燥前使用脱脂牛奶、蔗糖、甘油、 DMSO 或海藻糖等作为冻干保护物质1,3。据报道，海藻糖在干燥、冷冻、渗透胁迫和热休克等极端环境下对酵母和细菌具有保护作用。这些保护效果与膜的稳定和酶活性的保存有关。关于海藻糖的保护作用，已经报道了几种假设。一些报道认为它的作用是通过多个外部氢键取代参与维持蛋白质三级结构的水分子，另一些报道认为它形成玻璃态结构以确保物理稳定性。除了发酵过程或食品转化，酿酒酵母或乳酸菌等微生物在益生菌膳食食品和饲料补充剂领域具有重要的经济意义。然而，这些应用需要在储存过程中保持细胞活力。通过造粒和冷冻干燥技术相结合，可以得到大小和组成均匀的无尘颗粒。由于具有更高的颗粒表面积，这使得产品将具有良好的颗粒流动性，更容易掌握的剂量和更快的产品复原性。尽管存在上述挑战，冷冻干燥仍然是一种酵母、孢子真菌和细菌的方便保存方法，因为它们的长期生存能力通常保持得相当好，而且菌株的储存和分发要求也很简单。因此，本应用旨在生产酿酒酵母颗粒作为模型微生物，使用微胶囊造粒仪 Encapsulator B-390 作为造粒机，将酵母悬浮液挤压进入液氮中形成单分散球体，然后使用冷冻干燥机 Lyovapor&trade L – 200 进行冷冻干燥处理。2仪器，试剂和器材仪器：ESCO NordicSafe, Biosafety Cabinet Class IIBUCHI 微胶囊造粒仪 Encapsulator B-390BUCHI 冷冻干燥机 LyovaporTM L-200 Pro，干燥腔体搭配可加热搁板BUCHI LyovaporTM Software试剂：YPD 培养基, Sigma Aldrich海藻糖, Sigma Aldrich脱脂奶粉琼脂去离子水液氮器材：玻璃培养皿液氮杜瓦瓶3实验本应用中描述的工作是在无菌条件下进行的。将 84g 市售面包酵母悬浮溶解在 50mL 无菌 YPD 培养基(Sigma Aldrich)中。在酵母悬浮液中加入 50mL 无菌冻干保护剂培养基（5g 海藻糖(Sigma Aldrich)和 5g 脱脂牛奶溶于去离子水中），然后用微胶囊造粒仪 B-390 进行制粒(表1)。将挤压后的液滴收集在液氮浴中冷冻，然后转移到不锈钢托盘中，保存在 -25°C 的冰箱中进行冷冻干燥。表1：微胶囊包埋参数_300μm 喷嘴1mm 喷嘴频率[Hz]68060电压[V]7502500压力[mbar]500500冷冻干燥步骤(初级干燥和次级干燥)使用 LyovaporTM 编程软件，如表 2 所示。使用 LyovaporTM L-200 Pro 干燥腔体、可加热的搁板和环境空气。表2：初级干燥和次级干燥冻干参数无酵母菌微球采用与含酵母菌微球相同成分培养基和参数进行制备。冷冻干燥后，将 1mL 无菌水加入 1mL 微球中，用以复原样品。对于含有酵母菌的菌珠，对每个重组溶液进行10倍、100 倍和 1000 倍的连续稀释。将复原后的溶液和稀释液分别涂于 YPD 琼脂平板上，如图 1 所示。琼脂板在 28℃ 培养 24h，评价细胞活力。▲ 图1：琼脂平板上的酵母活力测试4结果与讨论含有酵母的微球可以通过使用微胶囊造粒仪 B-390 进行包埋制备，结果表明:用微胶囊造粒仪 B-390 将酵母滴入液氮中，可使酵母迅速颗粒化；用 300μm 的喷嘴和 1mm 的喷嘴分别制备了 700μm 和 1500μm 左右的微球。仅使用含冻干保护剂介质的溶液也得到了类似的结果。如图 2 所示，冻干后的微球在形状和大小上与湿冻微球保持相似。▲ 图2：用微胶囊造粒仪 B-390 制得的 300μm 酵母微球，在冻干前（左）后（右）的对比通过扫描电镜对其结构进行分析。在图 3 中，可以观察到含有酵母的球珠(下两图)和仅由冻干保护剂培养基制成的球珠（上两图）在形态上的差异。含有酵母菌的微球具有由 5μm 颗粒组成的粗糙结构，可以认为是微生物，而只含有冻干保护剂的微球具有更光滑的结构。▲ 图3：含酵母菌的冻干微球（下）和不含酵母菌冻干微球（上）的结构对比当冷冻干燥时，考虑到膜中脂质物理状态的变化或由于某些蛋白质结构的变化，生物系统可能受到破坏3,9。为了验证酵母菌的活力，将酵母菌重新水合，稀释，并在 28°C 的 YPD 琼脂板上培养 24 小时。图 4 证实了文献报道的内容，即便失去了部分活力，酵母在冻干后仍然可以生长2,4,6,10。▲ 图4：在 28℃ 琼脂板中培养 24 小时后的酵母菌活力5结论含有酵母菌的微粒可以很容易地用微胶囊造粒仪 B-390 进行制备，并使用冻干机 LyovaporTM L-200 进行冷冻干燥处理。B-390 的喷嘴直径分别为300 μm和1000 μm，制得的微粒直径分别为 700μm 和 1500μm。冷冻干燥后，珠粒的大小和形状没有变化。该颗粒流动性好，容易掌握使用剂量，且与水混合后溶解速度快。冻干后的微生物在贮藏过程中仍能保持良好的活力，并能在复水化后成功生长。在本应用中，造粒包埋和冷冻干燥的结合显示出了非常好的实验结果。它可以在发酵工艺和食品转化等领域开辟新的可能性，有利于生产制备剂量易控制和重组的培养发酵剂；另外，在益生菌和食品补充剂领域中获得无尘且可自由流动的粉末，同时保证产品颗粒大小和组成的均匀度。6参考文献N’Guessan, F. K. Coulibaly, H. W. Alloue-Boraud, M. W. A. Cot, M. Djè, K. M. Production of Freeze-Dried Yeast Culture for the Brewing of Traditional Sorghum Beer, Tchapalo. Food Sci. Nutr. 2016, 4 (1), 34–41.Bond, C. Freeze-Drying of Yeast Cultures. In Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols Day, J., Stacey, G., Eds. Methods in Molecular BiologyTM Humana Press, 2007 pp 99–107.Leslie, S. B. Israeli, E. Lighthart, B. Crowe, J. H. Crowe, L. M. Trehalose and Sucrose Protect Both Membranes and Proteins in Intact Bacteria during Drying. Appl. Environ.Microbiol. 1995, 61 (10), 3592–3597.Miyamoto-Shinohara, Y. Imaizumi, T. Sukenobe, J. Murakami, Y. Kawamura, S. Komatsu, Y. Survival Rate of Microbes after Freeze-Drying and Long-Term Storage.Cryobiology 2000, 41 (3), 251–255.Wolkers, W. F. Tablin, F. Crowe, J. H. From Anhydrobiosis to Freeze-Drying of Eukaryotic Cells. Comp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 2002, 131 (3), 535–543.Lodato, P. Huergo, M. S. de Buera, M. P. Viability and Thermal Stability of a Strain of Saccharomyces Cerevisiae Freeze-Dried in Different Sugar and Polymer Matrices. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999, 52 (2), 215–220.Strasser, S. Neureiter, M. Geppl, M. Braun, R. Danner, H. Influence of Lyophilization,Fluidized Bed Drying, Addition of Protectants, and Storage on the Viability of Lactic Acid Bacteria. J. Appl. Microbiol. 2009, 107 (1), 167–177.Miyamoto, T. (Kyushu U. Kawabata, K. Honjoh, K. Hatano, S. Effects of Trehalose on Freeze Tolerance of Baker’s Yeast. J. Fac. Agric. - Kyushu Univ. Jpn. 1996.Giulio, B. D. Orlando, P. Barba, G. Coppola, R. Rosa, M. D. Sada, A. Prisco, P. P. D. Nazzaro, F. Use of Alginate and Cryo-Protective Sugars to Improve the Viability of Lactic Acid Bacteria after Freezing and Freeze-Drying. World J. Microbiol. Biotechnol. 2005, 21 (5), 739–746.Cerrutti, P. Huergo, M. S. de Galvagno, M. Schebor, C. Buera, M. del P. Commercial Baker’s Yeast Stability as Affected by Intracellular Content of Trehalose, Dehydration Procedure and the Physical Properties of External Matrices. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000, 54 (4), 575–580.

p style="text-indent: 2em "天津大学元英进教授带领的合成生物学团队，继人工合成酵母染色体打破非生命物质和生命物质界限后，日前首次利用精确控制基因组重排技术，培养出了能几何级生长的“超级酵母菌”。该成果填补了国内基因组结构变异的技术空白，提高了细胞工厂生产效率。该研究成果的三篇相关论文在《自然通讯》期刊同期发表。/pp style="text-indent: 2em "据介绍，以前的DNA变异技术大多只针对基因层面进行小规模改造，在更加复杂的基因组结构变异层面的人工构建技术仍具有挑战。 /pp style="text-indent: 2em "天津大学科研团队正是瞄准这一难题，研究出能够精准控制基因重排的方法，使作为研究对象的合成型酵母菌，在有限时间内产生几何级增长的基因组变异，驱动其快速进化生长。/pp style="text-indent: 2em "为了能够精准调控合成型酵母基因组重排过程，天地大的科研人员特意为细胞设计了一把“入门锁”，打开这把“锁”要用两把“钥匙”，只有两把“钥匙”同时转动的状态下，细胞内的基因组重排才会开启。而这两把“钥匙”就是添加到菌株培养基中的两种物质——半乳糖和雌激素。在它们的互相作用下，通过使用这一精准控制技术对合成型酵母基因组进行多轮迭代重排，酵母种类多样性得到了极大丰富。科研人员从中筛选出大量高产β-胡萝卜素的菌株，经过5轮迭代基因组重排，合成型酵母菌中β-胡萝卜素产量提升了38.8倍。/pp style="text-indent: 2em "在此基础上，研究人员还分别通过杂合二倍体基因组重排和跨物种基因组重排，获得了可以在摄氏42度温度下生长加快的菌株和咖啡因耐受性明显增强的酵母菌株。英国帝国理工大学的研究者们也利用天津大学合成型5号染色体的酵母菌进行基因组重排，实现底盘细胞的快速进化，显著提升了酵母紫色杆菌素合成能力和五碳糖代谢利用能力。/pp style="text-indent: 2em "这一研究未来对提升能源医药化学品的生产合成，对于工业菌株进化和功能知识发现具有重要意义。上述研究还得到国家自然科学基金委、科技部973计划以及国际合作项目的支持。/p

近日，天木生物DREM cell设备助力中国农大、清华大学完成蜜蜂肠道微生物单细胞高通量培养，实现菌株级别功能多样性研究。 各种不同的生态系统都存在微生物群落，典型的微生物群落包括土壤、海洋或江湖等环境微生物以及人体或动物肠道微生物等。其中，肠道微生物群越来越引起人类的重视，越来越多的证据表明人体肠道微生物群的组成和活性变化与多种疾病和生态表型有关，如糖尿病、肥胖、结肠炎和严重抑郁症等。因此，若研究肠道微生物与宿主的关系，则能够更好地了解肠道共生体对疾病的作用机制，指导从肠道微生物角度出发的新的治疗方法和策略的构建，以达到治疗或预防疾病的目的。 今年6月份，中国农业大学的郑浩团队和清华大学的张翀团队在 Microbiome 上发表了名为“Strain-level profiling with picodroplet microfluidic cultivation reveals host-specific adaption of honeybee gut symbionts”的研究论文，使用高通量皮升级液滴微流控细胞分选仪（DREM cell）开发基于液滴的微流控技术培养蜜蜂肠道微生物，验证了微流控液滴平台在肠道微生物培养组学中的可行性，为更复杂微生物群落的大规模研究铺平了道路。 （来源：Microbiome） 传统培养方式限制测序技术深入研究微生物的基因型和表型多样性复杂微生物群由多种微生物组成，这些微生物是多物种复合体的一部分。尽管属于同一属和种的微生物拥有一个共同的、且对于细胞功能和物种的生存至关重要的核心基因组，但它们仍然拥有相当数量的菌株特异性基因，导致它们在生理和毒性特性等方面的不同表型，这些差异菌株可能会在不同程度上改变肠道微生物群的功能，进而影响到宿主健康。 因此郑浩表示：仅在物种水平上研究微生物群落是不够的，需要深入调查基因型和表型的多样性。培养是微生物研究的基础方法之一，但实际上由于培养条件的不适合，或是缺少互利共生的个体，很少有微生物可以在实验室条件下轻松培养，对于复杂群落而言，往往也只能成功实现其中一部分占多数的，或快速生长菌株的有效表征，并且传统的培养方式通常是低通量的，丰富的菌株多样性往往会在这个过程中被掩盖。 幸运的是，越来越强大的测序技术出现了，该技术可更深入、更清楚地了解共生肠道微生物组的结构、功能和多样性。16S rRNA 基因测序（16S rRNA gene sequencing）和鸟枪法宏基因组测序（Shotgun metagenomic sequencing）是当前用于微生物群落分析的两种主要工具。 16S rRNA 基因测序一般用于通过选择性扩增和测序微生物 16S rRNA 基因的高变区来识别和分类微生物，可以通过相对少量的原始读长来获得有代表性的细菌分类学估计。其具有高通量，成本低的特点，并拥有相当多成熟的生物信息学工具。但这种方法的主要限制为分类群是根据基因组的单个区域的序列分配的，这导致了分辨率不足。此外，扩增引物的选择也影响很大，一些引物已被证明会导致特定分类群的代表性过高或过低，这可能导致对分类单元的表示存在潜在偏差。 鸟枪法宏基因组测序对从整个微生物群落中分离出来的所有微生物的基因组进行测序。它的优势在于通过收集有关广泛基因组区域的序列信息，能够支持在物种水平上进行更准确的定义，提供更高的分类分辨率。同时还能支持进一步进行菌株水平的重建，得到新的基因或基因组，并对它们进行功能注释和途径预测以产生微生物群落的详细描述。但这种方法成本较高，需要深度测序获得更高的覆盖度以达到令人满意的分辨率，以及更复杂的下游分析。“虽然基于测序的方法不限于可培养的微生物群，但 16S rRNA 基因测序方法在种内分析的分辨率上仍然极其有限，并且可能会被每个基因组的 16S rRNA 基因的多个不同拷贝混淆，这同样会造成对实际存在于环境中菌株功能的误判；鸟枪法宏基因组测序通过考虑更多标记基因或全基因组来提供更多信息，目前也已经开发了许多工具来分析宏基因组数据来解决这些问题，但来自取样时间的或空间的偏差往往需要更深的测序深度来弥补，但这也带来了急剧升高的成本。”郑浩说道。 液滴微流控平台可克服传统培养方式的缺陷因此，若有一种培养方法可突破传统培养方式的局限，则会大大减轻测序技术的压力。基于液滴的微流控平台或许是个不错的选择。液滴微流控微流控（Microfluidics）是指一种在微米尺度空间对流体进行操控的技术，在该技术下可以将化学、生物等实验室的基本功能微缩到一个几平方厘米芯片上，因此又被称为“芯片实验室”。作为微流控芯片研究中的重要分支，液滴微流控是一种在微尺度的通道内利用流动剪切力或表面张力的改变，将两种互不相溶流体中的离散相流体分割成纳升级及以下体积的微液滴，并驱动微液滴运动对其进行操控的技术。张翀表示：基于液滴微流控的特征，我们可以通过在直径为数十至数百微米并由不混溶的油和工程表面活性剂分割的介质液滴种划分微生物来消除群落培养中过度生长的快速增长种群的影响。由于微制造的物理孔或通道不会限制液滴，因此可以快速创建数百万个独立的培养系统实现单个肠道微生物体的高通量培养。这极大克服了传统培养方式的缺陷，为通过培养来表征来自肠道共生体的稀有类群提供了机会。为了证明微流控液滴平台在肠道微生物群研究中的可行性，郑浩和张翀团队将蜜蜂作为研究对象。原因是与其他动物相比，蜜蜂的肠道细菌简单且稳定，宏基因组分析也表明，虽然蜜蜂肠道由数量有限的细菌系统发育型组成，但仍然存在显著的菌株水平多样性，个别菌株具有独特的基因组潜力和关键能力，这些能力在功能上与宿主的营养代谢和健康相关，为在菌株水平分析肠道共生体与宿主关系提供了很好的模型。具体做法如下：首先，构建了一个微流体液滴平台，并产生了用蜜蜂肠道中的单个细菌细胞包裹的液滴；随后，收集液滴并进行孵育培养，确定了液滴中微生物的生长能力，宏基因组分析揭示了与常规测序方法相比蜜蜂肠道更高的菌株水平多样性，证明了微流体平台在分离和富集稀有微生物菌株方面的潜力。▲图丨微液滴生成（来源：郑浩）最后，结合分箱策略，得到了蜜蜂肠道微生物的大量基因组草图，并进行了功能预测和比较基因组分析。对双歧杆菌属的分析揭示了潜在分类单元的存在，它们在跨膜运输、肌醇利用以及多糖利用方面存在丰富的菌株多样性。研究人员还得到了来自 Lactobacillus panisapium 的新菌株，该菌种在以往的研究中被认为特异性来源于中华蜜蜂；通过进一步的基因组比较，发现来自西方蜜蜂的菌株中独特地含有一组与饮食阿拉伯糖利用相关的代谢基因簇，包括araf43A, rafB, abfA 和abfB，这可能与它对不同蜜蜂宿主的适应密切相关。 ▲图丨微流控液滴中蜜蜂肠道细菌的单细胞封装和培养（来源：研究论文）“总体而言，结果证明了基于液滴的培养在研究蜜蜂肠道微生物多样性方面的适应性，同时这种方法也有潜力适用于其他复杂群落，在稀有类群的获得以及功能鉴定方面发挥作用。”张翀说道。他补充道，对于肠道微生物，当前的研究主要集中在特定培养基质下的微流体液滴培养，结合 16s rRNA 扩增子测序以研究肠道微生物个体的膳食碳水化合物代谢或抗生素耐药性。我们的研究则着重于通过隔离培养以富集在常规状态下难以检测的稀有类群，结合宏基因组的测序和分析，以较高通量实现对肠道稀有微生物的发现，以及代谢途径和功能预测，提供关于宿主和肠道共生体关系的崭新理解。“未来，我们可能会通过调整液滴大小、改善培养条件和测序方法来研究肠道真核微生物，并实现对单胞的高通量识别，这将进一步扩大我们对肠道复杂成员的理解。同时，我们的流程也可以进一步应用于人类肠道共生体的研究，扩展对人类肠道稀有类群以及它们与健康关系的认知和了解。”相关产品 研究团队所使用的液滴微流控细胞分选仪（DREM cell）是天木生物基于液滴微流控技术开发的皮升级液滴微流控单细胞分选平台，可将待筛选细胞进行包被形成单细胞微液滴，结合荧光筛选模型，可以在细胞水平完成微生物的高通量分离、培养、检测、分选等。 ▲图丨液滴微流控细胞分选仪（来源：天木生物） ‍ 高通量皮升级液滴单细胞分选系统（DREM cell）相比于传统筛选方法，筛选效率可提升1万倍，试剂消耗量可下降至百万分之一，在筛选通量显著提升的同时，单克隆筛选成本大幅度降低。该仪器不仅可广泛应用于细菌、酵母、动物细胞等的高通量筛选，还可以应用于蛋白、核酸、抗体等生物大分子筛选等相关研究领域。 项目技术参数液滴体积1-1000pL荧光激发与检测可选波段：（1）激发波长488nm，检测波长525±15nm，灵敏度1μM荧光素/单液滴（2）激发波长532nm，检测波长578±11nm，灵敏度100nM试卤灵/单液滴液滴生产频率0-10000个/s液滴分选频率0-1000个/s微注入速度0-1000个/s样品低温控制系统4℃恒温控制，±0.5℃工作环境常压状态下，室温，30%≤湿度≤80%，洁净暗室整机功率600W应用范围细胞、酵母、细菌、蛋白、核酸等 参考资料：1.https://blog.csdn.net/woodcorpse/article/details/125118043具有菌株分辨率的高通量、单微生物基因组学，应用于人类肠道微生物组|科学 (science.org)

每年，世界著名的合成生物学竞赛iGEM（ International Genetically Engineered Machine）都会吸引数以千计来自全球各地的学生，就&ldquo 组装生命系统&rdquo 的创意与技术一较高下。Jerome Sessini/Magnum为了探讨合成生物学给社会安全和人类健康带来的潜在风险，2014年11月，FBI特工爱德华· 尤（Edward You）假设了这样一个场景：如果经过遗传改造的酵母能将糖&ldquo 加工&rdquo 成鸦片，我们该怎么办？曾经的假想现在已经成真。就在2014年iGEM大赛结束一周后，两位专门研究如何用酵母制造鸦片的科学家找到了我们。那时他们还没有发表论文，希望听听我们作为生物技术政策研究人员的意见。他们想知道，如何能在论文中将研究的益处最大化，并且缓和由此带来的风险的尖锐性。如今，加利福尼亚大学伯克利分校的约翰· （John Dueber）、肯高迪亚大学的文森特· 马丁（Vincent Martin）和同事已经将这篇论文公诸于众。经他们改造的酵母具有将葡萄糖转换成吗啡的完整生化反应通路（见&ldquo &lsquo 酿造&rsquo 鸦片的酵母&rdquo ）；而卡尔加里大学的研究人员更是给这架&ldquo 鸦片机器&rdquo 添上了最后一块零件。我们现有的吗啡都提取自罂粟（Papaver somniferum）。而通过改造酵母，寻找更简单、更可控的生物合成途径，可以帮助我们获得更便宜、成瘾性更低、更安全，以及更有效的镇痛药物。酵母可以自我复制、容易生长、貌不显眼，还能轻易地播撒四方。因此，这一研究还会为鸦片制品的违禁交易提供便利。鸦片制品可以由此实现分散化、本地化生产，普通人可以轻而易举地得到它们。这些年来，合成生物学家利用改造过的酵母、细菌和真核植物，制造了许多&ldquo 友好&rdquo 的物质，例如抗疟疾药物、香氛、调味料、工业化学品和燃料。制造吗啡的酵母菌株，是我们研究出的第一种可以合成管制镇痛药的生物系统；然而，它肯定不会是最后一种可能&ldquo 惹麻烦&rdquo 的生物合成系统。合成生物学界应该和监管者合作，积极评估这类具有&ldquo 两面性&rdquo 的技术的风险与收益。本文列出了一些最需要优先讨论的问题，它们不仅关乎公共卫生与安全，也与合成生物学的前景密切相关。这些问题包括：只允许持有相关执照的机构、获得授权的研究人员和技术人员使用能够合成鸦片制品的酵母菌株；减小这种酵母菌株对鸦片违禁交易市场的吸引力；贯彻灵活、灵敏的监管措施，以应对我们对这一技术在认识上的转变，以及技术本身的变化。&ldquo 酿&rdquo 鸦片的酵母葡萄糖需要经过若干个生物化学反应才能变成吗啡，研究人员花费了7年时间才赋予了酵母合成吗啡的能力。参与这一研究的3个团队分别将罂粟、甜菜根，以及土壤中一种细菌的遗传物质转移到酵母中，使其获得发生其中一个或几个反应的能力。第4个团队则为这条反应链接上了最后一环，在酵母中实现了(S)-网状番荔枝碱[ (S)-reticuline] 到(R)-网状番荔枝碱的转化：一种能够实现&ldquo 葡萄糖&rarr 吗啡&rdquo 全转化的酵母由此诞生。理论上，只要懂得一些基本的发酵操作，任何人都能使用家用的啤酒发酵工具养殖这种酵母。如果你用发酵罐&ldquo 酿&rdquo 出了10g吗啡，只需喝下1~2ml发酵液，你就能摄入一个标准的处方剂量。现有的工程酵母菌株并没有这么高的产能，然而，其他一些相关的商业化发酵产物，已经达到了此种产出率，有些物质的产出率甚至比这还高10倍以上。尽管研究人员的初衷是制造合法的镇痛药，这一新技术还是带来了不少麻烦。生物合成的吗啡要么比现有吗啡具有更高的费-效比（即在成本相等的情况下效果更好）、更为监管者所接受，要么成瘾性更小、更安全。然而，现有的吗啡在制造、管理，以及运输环节上，成本都不高。2001到2007年间，高产罂粟的成功培育使得罂粟制品（又叫&ldquo 罂粟杆浓缩物&rdquo ，一般以大批量形式销售）的成本降低了20%（约为每公斤300~500美元）。合成生物学家、神经科学学家、药物化学家等不同领域从业人员必须通力合作，并且进行旷日持久、所费不赀的临床试验，才能设计出更具商业价值的鸦片类镇痛药。此外，为了防止更多人对鸦片上瘾，全球鸦片制品的供需都处于严格的管控之下。法律保障为了防止罂粟制品流向非法市场，国际社会、各个国家均制定了多种条约与法律。鸦片制造国往往会采用有安保措施的大型设施生产鸦片制品。为了加强安全性，澳大利亚甚至专门选种了一种含有大量二甲氢吗啡的罂粟品种。二甲氢吗啡很难转变成吗啡，直接口服还会导致中毒。我们很难预测全球最大的麻醉品管制机构&mdash &mdash 国际麻醉品管制局（International Narcotics Control Board，INCB)）&mdash &mdash 会对这种新型吗啡合成系统作何反应。INCB不大可能因此削减目前鸦片类镇痛药的生产定额，也不大可能对目前合法的鸦片交易模式进行调整。这就阻碍了酵母菌株进入鸦片制造市场。这种新型酵母菌株很可能对鸦片的违禁交易市场产生巨大影响。如今，鸦片有两个主要的非法交易渠道。首先是药物处方。非法交易者会窃取氧可酮（oxycodone)或氢可酮（hydrocodone)等镇痛药处方、开具不合理处方，或将合法处方非法销售出去。其次是毒品犯罪网络。阿富汗、缅甸、老挝、墨西哥等国家非法种植的罂粟制成的海洛因会通过犯罪网络流入市场，并以几十上百倍于成本的价格出售。新型菌株为毒品犯罪网络（特别是对毒品有高需求的北美和欧洲）提供了一个新&ldquo 选项&rdquo 。使用酵母制毒极易掩人耳目。酵母生长迅速、运输方便，不论犯罪组织还是执法机构都很难对这种酵母的流向进行控制。总之，由此带来的&ldquo 分散化&rdquo 与&ldquo 本地化&rdquo 生产，必然会降低非法鸦片制品的生产成本，增加其易得性，对全球的鸦片问题起到持续的恶化作用。目前，全世界有超过1 600万人正在非法使用鸦片制品。理论上讲，有了这种酵母，你只需家用的啤酒酿造工具，就能制造吗啡。（How Hwee Young/EPA/Corbis）四点建议若要对这一研究进行灵活、合理的监管，我们需要克服两个主要障碍。首先，目前我们对&ldquo 工程微生物&rdquo 的监管，主要集中在病原微生物（例如炭疽杆菌和天花病毒）上；酵母本不在监管的范畴中。其次，要实现有效监管，各国与国际的药物监管部门、执法机构需要通力合作，然而他们的行为规范与准则各不相同。公共卫生专家、科学家、监管者和执法机构必须加强沟通与协调。INCB，以及其他研究生物安全与生物安保监管的专业组织，就可以担负起组织这类国际对话的责任。以下四点，是为四个亟待解决的问题敲响警钟。技术层面 我们在设计酵母菌株时，应该尽可能降低它们对犯罪分子的&ldquo 吸引力&rdquo 。例如，我们可以用它制造对毒贩无甚价值的麻醉药（比如二甲氢吗啡）；另外，我们可以弱化工程菌株，使其只能在既定的实验室环境内发挥作用，这样一来，一般人就很难利用它在其他地方生产和收集鸦片制品；最后，我们还可以设计需要特殊的营养成分，才能正常生长的酵母菌株。我们已经将以上&ldquo 生物遏制手段&rdquo （methods of biocontainment）应用在了大肠杆菌（Escherichia coli）上。我们也可以给这种菌株打上DNA水标记（DNA watermark）之类的&ldquo 烙印&rdquo ，方便执法机构对其进行识别。加强审查 鉴于犯罪组织可能利用公开的DNA序列制造自己的菌株（尽管这种可能性不大），那些专门提供DNA片段定制服务的公司，也需要提高警惕。制造此种酵母菌株的基因序列必须被列入DNA片段供应商的审查列表。目前，这一审查列表由两个自发性组织&mdash &mdash 国际合成生物学学会（International Association of Synthetic Biology）与国际基因合成联合会（International Gene Synthesis Consortium）&mdash &mdash 负责监管， 而审查的对象仅限于病原体的基因片段。健全安保 我们应该对此种酵母的使用环境进行严格管控，只有经监管者许可、受到控制的场所，才能利用它生产麻醉剂。上锁、安警报、实验室与实验原料监控系统等物理性质的生物安保措施可以防止酵母被盗。实验室的工作人员需要通过安保审查，方能上岗。同样，研究人员要承担相应的权责，不能向未经合法授权的单位或个体提供酵母菌种。法律监管 监管麻醉剂的现有法律，例如《美国管制药物法案》（US Controlled Substance Act）以及其他国家的类似法律，应该将监管触角延伸至此类酵母，保证其产物在生产与销售上的合法性。生物技术的发展日新月异，如果我们能够对这种具有两面性的技术采取有力、有效的监管，就能给以后的类似情况树立榜样。事实上，参与此项研究的生物学家，已经在最关键问题上做出了表率：他们愿意，也正在为他们的&ldquo 造物&rdquo 担负责任。然而，这篇文章的写作对象并不是他们。其他基因组工程师也在沿着这条道路前进。参与研发基因组编辑工具CRISPR/Cas9的科学家已经对学术界和监管机构发出呼吁，对CRISPR/Cas9进行积极的风险评估；而在此之前，我们不能利用这一工具编辑野生动植物基因，或修改人生殖细胞基因组。合成生物学已经日臻成熟，这要求我们必须拿出负责的态度，做出负责的行动。（撰文：肯尼思· A· 奥耶（Kenneth A. Oye） J· 查普尔· H· 劳森 （J. Chappell H. Lawson） 塔尼亚· 布贝拉（Tania Bubela）。

本期为您推荐广西科技大学生物与化学工程学院牛福星副教授课题组发表在Microbial Cell Factories上面的文章：Key role of K+ and Ca2+ in high-yield ethanol production by S. Cerevisiae from concentrated sugarcane molasses。本研究利用常压室温等离子体进行诱变，筛选出对不同胁迫因素（高渗透压、高醇、高温、高盐离子以及高浓度甘蔗糖蜜）分别具有鲁棒性能的酿酒酵母菌株。其中由此所选育的对高浓度甘蔗糖蜜具有鲁棒性能的酿酒酵母乙醇合成产量达到目前物理诱变高水平（111.65 g/L，糖醇转化率达到95.53%）。最后结合酵母的细胞形态、发酵产能以及组学分析，揭示了限制酿酒酵母无法实现高浓度甘蔗糖蜜高浓度乙醇发酵的主要限制性因素是K+和Ca2+同时存在的影响。 生物基乙醇的合成原料有很多，从环保、经济、富民的角度研发是重点。我国是人口大国，每年由于食品添加、工业应用等所消耗的糖量位居世界前列。甘蔗是糖分提炼的主要原材料之一，在提料糖分的同时会产生糖蜜，而且早期研究数据表明产3吨糖的同时可产约1吨糖蜜。糖蜜是一种混合物，成分复杂，直接排放或者用于田间施肥是为浪费且会造成环境污染，而且是为资源利用的不充分。但是利用糖蜜（非粮食）生物资源进行酿酒酵母的乙醇合成，却可以在不断满足人们对乙醇用量需求的同时，助推国家绿色低碳能源发展。酿酒酵母利用糖蜜进行乙醇发酵的工艺已经比较成熟，但是在利用高浓度的糖蜜来生产高浓度的乙醇效率方面却是一个挑战，究其原因便是各种胁迫性因素的影响。但是从科学研究的角度确切的阐述哪种才是限制性的关键影响因素早期还未有研究报道。 研究人员借助ARTP（室温等离子体）诱变、适应性进化以及高通量的基于三苯基-2H-四唑氯化铵（TTC）及前体物丙酮酸（或丙酮酸自由基离子）与Fe3+发生络合反应呈现黄色的双重高通量筛选方法（Py-Fe3+）获取了分别对高浓度甘蔗糖蜜（总糖浓度达到300 g/L）以及蔗糖添加模型下的高温（37℃）、高醇（10%）、高渗透压（400 g/L可发酵总糖）以及高浓度K+(15 g/L)、Ca2+(8 g/L)、K+&Ca2+(15 g/L &8 g/L)发酵环境下的七株鲁棒型酿酒酵母菌株（图1、表1）。通过各自鲁棒型菌株在高浓度甘蔗糖蜜环境下细胞形态比较（图2），乙醇合成的产率以及细胞数量（图3、图4）、鲁棒型菌株比较基因组学、比较转录组学GO、KEGG分析研究，得出K+、Ca2+同时存在才是限制酿酒酵母高浓度甘蔗糖蜜乙醇发酵的主要因素。图1 实验流程 表1 在相同发酵条件下与野生型J108相比产量差距图2 在250 g/L糖蜜发酵不同菌株的细胞形态A:NGCa2+-F1 B:NGK+-F1 C:NGK+&Ca2+-F1 D:NGTM-F1图3 不同菌株的乙醇合成率及细胞数图4.在5L发酵罐体系中利用250 g/L甘蔗糖蜜发酵， 菌株NGTM-F1的乙醇产量达到111.65 g/L 总结：甘蔗糖蜜对细胞的影响不仅仅局限于高浓度发酵，在低浓度情况下同样会对细胞的生长造成一定影响。该项目的研究是为初次从科学研究的角度准确阐述了限制酿酒酵母无法实现高浓度甘蔗糖蜜高浓度乙醇发酵的主要限制因素，其结果对于以甘蔗糖蜜作为底物的生物合成具有重要指导作用。文章链接：https://doi.org/10.1186/s12934-024-02401-5

空气污染特别是PM2.5是当前人类面临的重要的环境问题之一。北京大学课题组研究人员近期在此问题上取得跨学科进展,首次以荧光标记的酵母菌取代现有方法中的半导体传感器,实现了对PM2.5多方面毒性的实时在线监测。　　据了解,目前对于大气颗粒物的毒性研究,大多采用离线的方式,不能及时知晓其毒性 而细胞染毒或动物暴露实验灵敏度偏低,一些健康效应不易检测到。在颗粒物致病机理方面,目前也存在类似“盲人摸象”的现象,不能够全方面地了解PM2.5的毒性机理。　　受酵母菌相关研究的启发,由北大环境科学与工程学院研究员要茂盛、物理学院副教授罗春雄领导的研究团队,集成利用空气采样、微流控、荧光蛋白标记的酵母菌以及单酵母菌蛋白荧光自动检测平台,用活体酵母菌替代传统半导体传感器,创建了大气PM2.5毒性实时在线监测系统。　　要茂盛介绍,课题组先将PM2.5颗粒物采集到液体中,再将样品实时输送至放有酵母菌的芯片里。由于酵母菌会对来自颗粒物的刺激发生反应,通过用不同荧光蛋白标记酵母菌的所有基因,就可实时看到酵母菌的哪些基因对颗粒物的刺激发生了响应,就好像可“实时监测不同地区车辆行驶状况”。　　目前,此项研究成果已申请国家发明专利。课题组正在利用该体系对不同国家、地区颗粒物的毒性进行研究,同时也在筛查更多有响应的酵母菌蛋白,并研究其灵敏度、响应的毒性标定,以进一步揭示PM2.5对人体的具体致病毒性机制。

2020年初，一场突如其来的疫情打乱了大家的生活节奏。面对来势汹涌的疫情，全国上下正在积聚力量，全力战胜新型高致病性冠状病毒（2019-nCoV）。医护人员、解放军战士、志愿者们纷纷奔赴武汉，与疫魔竞速，守卫着国民的生命安全，致敬最美逆行者！同时疫情研究者一样没有停下自己的脚步，特别是在分子水平，我们调研了基于Orbitrap超高分辨的蛋白质组学和结构组学技术在病毒学研究中的应用，谨以此文致敬白衣天使和深耕医学研究的学者。Orbitrap技术促进病毒机理研究病毒与宿主共同进化，获得捕获和操纵宿主细胞过程进行复制的机制传播。同样，宿主细胞会通过部署防御机制或通过适应感染环境。在整个感染过程中，细胞严重依赖于时空调控的病毒-宿主蛋白-蛋白相互作用的形成。 蛋白质组学方法与病毒学的结合促进了对病毒复制、抗病毒宿主反应和病毒对宿主防御的颠覆机制的深入研究。而Orbitrap技术依靠其高灵敏度、高精度，高通量等特性在该方面表现出色。案例一：Orbitrap技术深度挖掘病毒-宿主蛋白质相互作用2019年Viruses杂志上发表了基于组学技术研究宿主变化的综述，质谱技术中基于亲和纯化分离蛋白质复合物随后进行MS分析（AP-MS）的方法可以用于分离病毒-病毒和病毒-宿主多蛋白复合物，可识别间接和直接的蛋白质相互作用，提供相互作用事件的瞬时信息，或跟踪单个病毒基因产物的过表达，以深入了解单个蛋白质的功能；表达蛋白质组学技术（定量蛋白质组学和翻译后修饰组学）可以研究病毒蛋白的组成，宿主在病毒入侵过程中蛋白质和翻译后修饰的动态变化。（Viruses 2019, 11, 878 doi:10.3390/v11090878）迄今为止，基于蛋白质组学方法的进展已经为识别数量惊人的病毒-宿主蛋白关联铺平了道路，科学家基于这些数据构建了包含了5000多种病毒成分和宿主细胞之间的非冗余蛋白相互作用数据库。这些有价值的信息库包括相互作用蛋白数据库、VirHostNet(http://virhostnet.prabi.fr/)、VirusMentha(Nucleic Acids Res. 2015 43(D1):D588–D592)、IntAct-MINT(Nucleic Acids Res. 2015 43(D1):D583–D587)和Uniprot。 案例二：Orbitrap技术揭示新型塞卡病毒宿主因子Pietro, Scaturro, Alexey, et al. Nature, 2018 寨卡病毒(ZIKV)最近成为全球健康问题，由于它的广泛传播和与严重的联系新生儿神经症状和小头症。然而,与致病性相关的分子机制关于ZIKV的大部分仍然未知。 技术路线：利用赛默飞 LTQ-Orbitrap和Orbitrap Q Exactive HF质谱进行全蛋白质组学和修饰蛋白质组学（实验路线见下图a），研究对象为神经细胞系SK-N-BE2和NPC细胞，表征细胞对病毒的反应，在蛋白质组和磷酸化蛋白质组水平上的变化，利用亲和蛋白组学方法鉴定ZIKV蛋白的细胞靶点。使用这种方法，找到了386个与zikv相互作用的蛋白质，导致宿主在神经发育受损，视网膜缺陷和不孕。此外，确定了寨卡病毒感染后1216个磷酸化位点存在上调或下调，来自AKT, MAPK-ERK和ATM-ATR信号通路中，为防范ZIKV感染扩散提供机制基础。在功能上，系统地理解了ZIKV诱导后的宿主的蛋白质和细胞通路水平的扰动，并对感染后细胞施加Rock抑制剂药物干预,利用非标定量蛋白质组学方法分析差异蛋白进行验证（下图热图），补充这一空白。技术路线图案例三：Orbitrap技术深入探寻寨卡病毒病毒与宿主的相互作用Etienne Coyaud, et al. Molecular & Cellular Proteomics，2018,技术路线技术路线：本文利用生物素识别以及IPMS亲和纯化结合MS 方法，研究寨卡病毒侵染后病毒与宿主细胞蛋白质的相互作用（技术路线见上图），实验结果揭示了1224个蛋白3033多肽形成的相互作用网络（见下图a）。相互作用包括多肽加工和质量控制、囊泡方面的作用运输，RNA处理和脂质代谢。40%的 作用都是以新报道的相互作用。通过数据挖掘分析，揭示过氧化物酶体在ZIKV感染中的关键作用。病毒宿主蛋白相互作用网络图 温馨提示：积极防护 保护自己 戴口罩 勤洗手

p style="text-indent: 2em "strong酵母可能依赖内含子帮助它们度过艰难时期。/strong/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/1082ae37-6879-49ea-89f6-bd66609032f0.jpg" title="酵母.jpg" alt="酵母.jpg" width="300" height="200" border="0" vspace="0" style="width: 300px height: 200px "//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(127, 127, 127) "图片来源：STEVE GSCHMEISSNER/spanbr//pp　　就像从电影中删掉的片段一样，生物基因中的一些序列最终也会被剪掉，细胞不会利用它们制造蛋白质。现在，两项研究发现，这些被称为内含子的片段有助于酵母在艰难时期存活。这项研究揭示了DNA的另一种可能的功能，科学家曾认为这种功能是无用的。/pp　　未参与该研究的美国加州旧金山州立大学进化分子生物学家Scott Roy说：“这些结果非常令人信服，也非常令人兴奋。”这项研究开启了了解“内含子作用的全新范式”。/pp　　加州大学洛杉矶分校酵母微生物学家Guillaume Chanfreau说，这也回答了一个长期存在的问题：strong为什么酵母保留了以前被认为是“垃圾DNA”的东西/strong。/pp　　内含子普遍存在于植物和真菌中，也存在于人类和其他动物体内——在大约2万个基因中，每个基因平均携带8个内含子。在最初将它们视为垃圾之后，研究人员最近开始确定内含子的某些功能。例如，一些基因中的内含子可能有助于控制细胞制造多少相应的蛋白质。/pp　　为了确定剥夺内含子的影响，加拿大谢布鲁克大学RNA生物学家Sherif Abou Elela和同事系统地从酵母菌中删除内含子，并产生了数百个菌株。然后，研究人员将这些改良菌株与普通真菌一起培养。/pp　　当食物缺乏时，大多数缺乏内含子的菌株很快就死掉了，研究小组近日在《自然》上报道称，它们无法与普通酵母竞争。然而，在营养更丰富的培养基中，经过改造的酵母具有优势。Abou Elela说：“如果你处于好时期，内含子是一种负担。但在逆境中，它是有益的。”/pp　　麻省理工学院分子生物学家David Bartel和同事也独立研究出了类似的结果。他们测量了酵母细胞中不同RNA分子的数量，同时注意到，在“拥挤”的培养基中生长的酵母积累了大量内含子。相关论文刊登于《自然》。/p

各会员及相关单位：宁夏化学分析测试协会对团体标准申报材料进行审核后，经研究决定对宁夏回族自治区食品检测研究院申报的《葡萄酒中布鲁塞尔德克酵母的检测 实时荧光PCR法》等3项团体标准批准立项，现予以公示。欢迎与该团体标准有关的科研、生产单位加入该标准的编制工作，有意者请与协会秘书处联系。联系人：张小飞电话： 13995098931地址：宁夏银川市金凤区新田商务中心413室邮箱：1904691657@qq.com 序号拟立项团标名称1《葡萄酒中布鲁塞尔德克酵母的检测 实时荧光PCR法》2《调味料中常见动物源性成分的检测 实时荧光PCR法》3《食用植物油中常见植物源性成分的检测 实时荧光PCR法》 宁夏化学分析测试协会2023年12月4日 2023团标立项公示12.4.pdf

1月28日，国家自然科学基金委员会发布了“冠状病毒-宿主免疫互作的全景动态机制与干预策略”重大研究计划2021年度项目指南。指出，2021年度拟资助培育项目18－22项，直接费用资助强度约为60－80万元/项；拟资助重点支持项目6－8项，直接费用平均资助强度约为300万元/项。以下为“冠状病毒-宿主免疫互作的全景动态机制与干预策略”重大研究计划2021年度项目指南详细内容：一、科学目标本重大研究计划以“冠状病毒-宿主免疫互作的全景动态机制与干预策略”为核心科学问题，以冠状病毒特别是新发冠状病毒感染为研究对象，克服既往断面、单尺度、单维度研究的局限性，采用动态、多尺度、多维度的全景研究新范式，通过多学科交叉研究，解析病毒和宿主免疫互作的动态调控网络及其关键节点，阐释免疫保护/免疫损伤的平衡机制及其与不同临床表现的内在联系，发展针对病毒免疫损伤关键节点的靶向治疗手段，研发特异性免疫防治药物和长效安全的预防疫苗，揭示群体免疫流行病学特征，为病毒性传染病的免疫防控提供理论支持和技术储备。培养一批高层次专门人才，支持国家级疫苗、药物和诊断监测研究基地建设，提升我国在该领域的创新水平，增强国际竞争力和引领力。二、核心科学问题冠状病毒-宿主免疫互作机制和免疫防御策略。以冠状病毒免疫应答的启动、维持、消退、记忆产生过程为基础，与感染的发生、演进、相变、不同临床表现和转归相联系，以冠状病毒免疫保护和免疫损伤机制为核心，围绕病毒和宿主因素、感染与免疫反应两个过程的动态演变，在免疫系统与感染靶系统两个维度，以及群体、环境、生态、个体、器官组织、细胞、分子多尺度进行组织细胞分子基因解码，以高分辨率和新范式开展原始创新研究，揭示冠状病毒感染免疫基本属性，阐明冠状病毒感染免疫调控机制，发展冠状病毒感染免疫干预及监测新策略。三、2021年度重点资助研究方向根据本重大研究计划总体布局，鼓励申请人采用免疫学和多学科交叉的研究手段，注重临床医学与流行病学、比较医学与疾病动物模型、数学、信息学和人工智能、化学、材料学、药学、地球科学等领域的合作。2021年度拟重点资助如下研究方向：（一）病毒感染细胞路径与感染建立、免疫应答启动和调控的关系。病毒首先感染上皮、内皮等非专职免疫细胞或首先感染免疫细胞，这直接影响免疫反应的启动与维持过程。针对这一重大问题，阐明与感染建立相关病毒基因组编码产物的结构特征及生物学功能，病毒复制周期的生物学过程、关键分子事件及影响其复制的关键宿主因子；揭示病毒攻击靶细胞的应激反应特征和作用机理，引发细胞死亡的类型、机制及其生物学效应；阐释病毒变异、感染细胞路径及其对感染建立、病毒复制、先天免疫和特异性应答启动的影响和调控机制；针对病毒或宿主基因或蛋白发现干预靶点，发现特异性或广谱性药物或免疫制剂先导化合物；开展不同人类冠状病毒（包括高致病性冠状病毒、季节性冠状病毒）感染复制和免疫机制的比较研究，发现共性干预靶点，阐明不同冠状病毒致病性差异的生物学基础。（二）免疫系统感知病毒全景刺激信号、启动免疫应答的机制。采用免疫组学、生物信息学技术、基于疾病动物模型、临床队列等，发现和鉴定病毒激发固有免疫应答的危险信号和获得性免疫应答的抗原表位信号，阐明免疫应答的启动机制，及其与保护性应答和损伤性应答的关系；阐释病毒演化变异过程中或在宿主免疫压力下，所产生的不同病毒亚型是否具有交叉或优势表位、跨种感染潜能及逃避免疫识别的能力。（三）免疫应答的系统性多维度抗病毒免疫保护和记忆机制。基于免疫反应的系统性、多维度和复杂性，阐明抗病毒免疫应答启动后的免疫效应、免疫记忆维持的时相特征及固有免疫和适应性免疫的协同机制；重点阐明粘膜免疫屏障保护作用，病毒感染靶器官的区域免疫反应特征，病毒负向调节免疫应答的“逃逸”机制，从而揭示免疫保护和免疫记忆维持机制及其关键因素；实时动态呈现病毒感染宿主的免疫应答“全景”过程，发现病毒与免疫细胞、免疫分子间相互作用网络的关键节点。（四）病毒感染诱导的免疫损伤及其动态致病机制。重点揭示病毒感染诱发的损伤性免疫应答的致病机理，阐释临床无症状感染、二次感染、重症感染、较长时间感染（“常阳”病例）等临床差异表现的免疫病理机制；揭示免疫保护/免疫损伤平衡的时空特征、关键节点及其调控机制，病毒感染临床表现与转归差异化机制，发现重症预警免疫分子靶标，验证免疫干预新靶点；探索免疫反应与微循环、凝血功能、能量代谢、应激反应、细胞死亡及组织修复之间的内在联系及其在致病性中的作用，阐释老年和基础疾病患者等易感人群病毒感染的致病及致死原因；以高度模拟人类病毒感染和病理特征的类器官和动物模型，探究抗病毒免疫应答导致这些器官损伤的分子机制，寻找治疗新靶点。（五）发展疾病监测-诊断-治疗-预防-免疫力评估的新策略新方法。研究冠状病毒等感染治愈恢复期患者、无症状感染者、疫苗接种者等抗冠状病毒的免疫力指标特征，力争建立远期病毒特异性免疫力精准评估的指标体系。发展检测感染者免疫应答状态新方法，促进个体免疫学精准诊断、精准治疗。在揭示病毒感染免疫保护、免疫损伤机制基础上，发展群体免疫力流行病学监测新方法，研究环境、生态、气候等因素对疾病传播和流行的影响，指导疫情预警和疫苗精准使用。发展基于前沿免疫理论和技术指导下的疫苗理性设计新策略，形成精准、快速疫苗研制技术体系。研究疫苗保护效力与免疫应答之间的关系，以建立免疫学替代指标，指导疫苗快速研发。四、2021年度资助计划2021年度拟资助培育项目18－22项，直接费用资助强度约为60－80万元/项，资助期限为3年，申请书中研究期限应填写“2022年1月1日－2024年12月31日”；拟资助重点支持项目6－8项，直接费用平均资助强度约为300万元/项，资助期限为4年，申请书中研究期限应填写“2022年1月1日－2025年12月31日”。五、申请要求及注意事项（一）申请条件。本重大研究计划项目申请人应当具备以下条件：1.具有承担基础研究课题的经历；2.具有高级专业技术职务（职称）。在站博士后研究人员、正在攻读研究生学位以及无工作单位或者所在单位不是依托单位的人员不得作为申请人进行申请。（二）限项申请规定。执行《2021年度国家自然科学基金项目指南》“申请规定”中限项申请规定的相关要求。（三）申请注意事项。申请人和依托单位应当认真阅读并执行本项目指南、《2021年度国家自然科学基金项目指南》和《关于2021年度国家自然科学基金项目申请与结题等有关事项的通告》中相关要求。1. 本重大研究计划项目实行无纸化申请。申请书提交日期为2021年2月28日－3月4日16时。（1）申请人应当按照科学基金网络信息系统(以下简称信息系统)中重大研究计划项目的填报说明与撰写提纲要求在线填写和提交电子申请书及附件材料。（2）本重大研究计划旨在紧密围绕核心科学问题，将对多学科相关研究进行战略性的方向引导和优势整合，成为一个项目集群。申请人应根据本重大研究计划拟解决的具体科学问题和项目指南公布的拟资助研究方向，自行拟定项目名称、科学目标、研究内容、技术路线和相应的研究经费等。（3）申请书中的资助类别选择“重大研究计划”，亚类说明选择“培育项目”或“重点支持项目”，附注说明选择“冠状病毒-宿主免疫互作的全景动态机制与干预策略”，根据申请的具体研究内容选择相应的申请代码。培育项目和重点支持项目的合作研究单位不得超过2个。（4）申请人在申请书“立项依据与研究内容”部分，应当首先说明申请符合本项目指南中的重点资助研究方向，以及对解决本重大研究计划核心科学问题、实现本重大研究计划科学目标的贡献。如果申请人已经承担与本重大研究计划相关的其他科技计划项目，应当在申请书正文的“研究基础与工作条件”部分论述申请项目与其他相关项目的区别与联系。2. 依托单位应当按照要求完成依托单位承诺、组织申请以及审核申请材料等工作。在2021年3月4日16时前通过信息系统逐项确认提交本单位电子申请书及附件材料，并于3月5日16时前在线提交本单位项目申请清单。3.涉及人的生物医学研究请申请人和依托单位注意在项目申请及执行过程中严格遵守针对相关医学伦理和患者知情同意等问题的有关规定和要求，包括在申请书中提供所在单位或上级主管单位伦理委员会的审核证明（电子申请书应附扫描件）。涉及病原微生物研究的项目申请，应严格执行国务院关于《病原微生物实验室生物安全管理条例》和有关部委关于“伦理和生物安全”的相关规定；涉及人类遗传资源研究的项目申请应严格遵守《中华人民共和国人类遗传资源管理条例》相关规定；涉及高致病性病原微生物的项目申请，应随申请书提交依托单位生物安全保障承诺，未按要求提供上述证明的申请项目将不予资助。4. 其他注意事项。(1) 为实现重大研究计划总体科学目标和多学科集成，获得资助的项目负责人应当承诺遵守相关数据和资料管理与共享的规定，项目执行过程中应关注与本重大研究计划其他项目之间的相互支撑关系。(2) 为加强项目的学术交流，促进项目群的形成和多学科交叉与集成，本重大研究计划将每年举办一次资助项目的年度学术交流会，并将不定期地组织相关领域的学术研讨会。获资助项目负责人有义务参加本重大研究计划指导专家组和管理工作组所组织的上述学术交流活动。（四）咨询方式。国家自然科学基金委员会医学科学部四处联系电话：010-62328653、62327207

近日，安琪酵母公司检测中心接到中国合格评定国家认可委员会秘书处通知：检测中心已通过“CNAS T0442 食品(虾粉)中砷与重金属的检测”能力验证。　　 　　CNAS组织此次能力验证活动是为了配合国家质检总局和国家认监委的“质量和安全年”的相关活动，是中国合格评定国家认可委员会(CNAS)“质量和安全年”活动的组成部分，由CNAS组织，山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心负责实施，检测项目为砷、汞、镉和铜。安琪酵母公司检测中心全部检测结果均为满意结果。　　自2004年来，安琪酵母公司检测中心共参加了9次由CNAS组织实施的能力验证活动，项目覆盖食品、饲料、肥料和水质4个大项，砷、铅、汞、镉、钙、镁、总氮、五氧化二磷、粗蛋白、菌落总数、沙门氏菌等等25个检测指标，全部结果均为满意。

美国食品药物管理局(FDA)近日修订了美国食品添加剂法规，允许安全使用维生素D2面包酵母(vitamin D2 bakers yeast)，并将其作为维生素D2的来源和膨松剂，但必须满足以下条件：(1)维生素D2面包酵母是由面包酵母(酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae)暴露于紫外线下产生的物质，是面包酵母中内源性麦角脂醇(ergosterol)经过光化学反应转化成维生素D2(也被称为麦角钙化甾醇(ergocalciferol)或(9,10-seco(5Z,7E,22E)-5,7,10(19),22-ergostatetraen-3-ol)) (2)维生素D2面包酵母可单独作为一种活性干酵母浓缩物，或与传统的面包酵母进行组合 (3)这种添加剂可用于酵母发酵的烘焙食品和烘焙混合以及酵母发酵的烘焙小吃食品，但在每100克成品食品中维生素D2的含量不得超过400国际单位(International Units) (4)为了确保添加剂的安全使用，除了《联邦食品药品和化妆品法规》所要求的其他信息外，食品添加剂容器标签必须要有适当的使用说明，以确保所生产的最终产品符合上述第(3)点描述的限制要求 (5)含有该添加剂的加工食品标签必须按照成品食品中含量递减的合适顺序，在成分声明中标注添加剂名称：“维生素D2面包酵母”。　　为了合理确立在预期使用条件下某种食品添加剂的无危害性，FDA考虑了该添加剂的人类饮食预期的摄入量、添加剂的毒理学数据和其他提供给该局的相关信息。FDA还将个人来自所有食品源的添加剂的预计每日摄入量(estimated daily intake，EDI)与根据毒性数据建立的可接受摄入量水平进行了对比。EDI由基于拟议用于特定食品中的添加剂数量预测和来自所有食品源的添加剂数量决定。该机构通常将百分之九十消费者使用的食品添加剂的EDI来衡量高慢性饮食的摄入量。

录音已经上线：RNAi高通量检测宿主介导的病毒感染错过了细胞成像系列讲座？在线收听录音！很荣幸的通知您，现在已经可以通过WebEx在线收听&ldquo 用RNAi高通量筛选检测宿主因素对病毒感染的影响&rdquo 网络研讨会的录音了！如您想观看这个讲座或转发给您的同事或朋友，请点击下面的链接。 收听网络研讨会录音：July 10, 2012 如您有关于这个网络研讨会的任何问题或意见，请联系Grischa Chandy (grischa.chandy@ moldev.com) 或点击获得更多信息。想收到更多高内涵网络研讨会的通知？点击订阅. 快速解决收听WebEx录音的问题，请拨打WebEx的服务热线1-408-435-7088，或登录常见问题解答及在线支持

发酵指人们借助微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体本身、或者直接代谢产物或次级代谢产物的过程。经发酵过程制造食品时所利用的。最常用的有酵母菌、曲霉以及细菌中的乳酸菌、醋酸菌、黄短杆菌、棒状杆菌等。通过这些微生物作用制成的食品通常有以下5类：1、酒精饮料：如蒸馏酒、黄酒、果酒、啤酒等；2、乳制品：如酸奶、酸性奶油、马奶酒、干酪等；3、豆制品：如豆腐乳、豆豉、纳豆等；4、发酵蔬菜：如泡菜、酸菜等；5、调味品：如醋、黄酱、酱油、甜味剂（如天冬甜味精）、增味剂（如5′-核苷酸）和味精等。 如何有效地评估酵母等微生物的发酵能力、培养基（面团、啤酒等）发酵特性及样品的发酵条件等？如何长时间监测面包面团、酒类酿造、生物乙醇相关的发酵过程以及BP（发酵粉=化学膨胀剂）等工艺过程？ 产品推荐 日本WSF-2000MH系列发酵特性分析仪是一种通过自动持续测量并记录各种样品在微生物发酵过程中产生的气体总量和产气速度的变化曲线，分析样品的发酵条件、发酵特性等，可同时分析10到20个样品，每个样品独立控制、监测和分析。 产品应用微生物方面——菌株的育种、烘焙制品、酒类酿造、酱油、食品腐败、工业酒精以及甲烷氢气等领域，如小麦粉品质评价、酿造品质控制、微生物菌株筛选等。化学方面——食品膨胀剂、发泡剂、洗涤剂、入浴剂以及医药品等领域，如膨化剂、发泡剂等的新品开发和质量管控等。

各有关单位：根据《中国食品科学技术学会团体标准工作管理办法》等规定，我学会组织起草了《食品中霉菌酵母的快速检测 测试片法（征求意见稿）》等3项团体标准，现公开征求意见，请于2024年1月8日前将相关意见反馈学会秘书处。邮箱：zhanxiaoqingok@163.com附件：1.标准文本及编制说明2.意见反馈表中国食品科学技术学会2023年12月8日附件：附件1-1-标准文本-食品中霉菌酵母的快速检测 测试片法（征求意见稿）.pdf附件1-2-编制说明-食品中霉菌酵母的快速检测 测试片法（征求意见稿）.pdf附件2-1-标准文本-食品中沙门氏菌的快速检测 测试片法（征求意见稿）.pdf附件2-2-编制说明-食品中沙门氏菌的快速检测 测试片法（征求意见稿）.pdf附件3-1-标准文本-食品中金黄色葡萄球菌的快速检测 测试片法（征求意见稿）.pdf附件3-2-编制说明-食品中金黄色葡萄球菌的快速检测 测试片法（征求意见稿）.pdf附件2-意见反馈表.docx

【引言】酿酒酵母菌是一种具有高工业附加值的菌种，其在真核和人类细胞研究等领域也有着非常重要的作用。酿酒酵母菌由于自身所在的细胞周期不同，遗传特性不同或是所处的环境不同可展现出球形单体，有芽双体或形成团簇等多种形貌。因此获得具有高纯度单一形貌的酿酒酵母菌无论是对生物学基础性研究还是对应用领域均有着非常重要的意义。 【成果简介】麦考瑞大学Ming Li课题组利用MicroWriter ML3小型台式无掩膜光刻机制备了一系列矩形微流控通道。在制备的微流控通道中，通过粘弹性流体和牛顿流体的共同作用对不同形貌的酿酒酵母菌进行了有效的分类和收集。借助MicroWirter ML3中所采用的无掩模技术，课题组轻松实现了对微流控传输通道长度的调节，优化出对不同形貌酵母菌进行分类的佳参数。 【图文导读】图1.在MicroWriter制备的微流控通道中利用粘弹性流体对不同形貌的酿酒酵母菌进行分类。（a）对不同形貌酿酒酵母菌，而非根据尺寸进行分类的原理图。微流控结构有两个入口，一个是用于注入酿酒酵母菌溶液，另一个用于注入聚氧乙烯（PEO）鞘液。除此之外，该结构还有一个微流控传输通道，一个扩展区和七个出口。所有的酵母菌初期排列在鞘液的边缘，在界面弹性升力和内在升力的共同作用下，酿酒酵母菌根据形貌在鞘液内被分类。（b）对酿酒酵母菌进行形貌分类的微流控通道设计图（左）和用MicroWirter ML3制备出的实际微流控通道（右）的对比。图中比例尺为10 μm。图2. 微流控传输通道的长度对不同形貌酿酒酵母菌分类的影响。（a）不同形貌的酿酒酵母菌在不同长度传输通道参数下的实际结果。黑色虚线代表传输通道的中心线。图中比例尺是50 μm。（b）不同形貌的酿酒酵母菌在侧向的分布结果，单体（蓝色），有芽双体（黄色）和形成团簇（紫色）。误差棒代表测量100次实验的分布结果。图3. PEO浓度1000 ppm，微流控传输通道长度15 mm，酵母菌流量为1μL/min, 鞘液流量为5μL/min的条件下不同形貌的酿酒酵母菌的分类和收集效果。（a）收集不同形貌酿酒酵母菌的七个出口。（b）不同形貌酵母菌在入口和出口的比较图。（c）实验表明不同形貌的酵母菌可在不同出口处进行收集。单体主要在O1出口，形成团簇的菌主要O4出口。（d）不同出口处对不同形貌的酿酒酵母菌的分类结果，单体（蓝色），有芽双体（黄色）和形成团簇（紫色）。（e）和（f）不同出口对不同形貌的酿酒酵母菌的分离和收集结果的柱状图。误差棒代表着三次实验的误差结果。 【结论】随着微流控在生物领域的应用逐渐增多，影响力逐渐扩大，如何快速开发出符合实验设计的原型微流控结构变得十分重要。由于实验过程中需要及时修改相应的参数，得到优化的实验结果，灵活多变的光刻手段显得尤为重要。从上文中可以看出，MicroWirter ML3小型台式无掩膜光刻机可以帮助用户快速实现原型微流控结构的开发，助力生物相关微流控领域的研究。 【参考文献】[1]. Liu P , Liu H , Yuan D , et al. Separation and Enrichment of Yeast Saccharomyces cerevisiae by Shape Using Viscoelastic Microfluidics[J]. Analytical Chemistry, 2021, 93(3):1586-1595.

核糖体是一种广泛存在于细胞中的分子机器。所有生物，包括微小的细菌直至人类个体，都依赖核糖体对各种各样的蛋白质进行生物合成。作为一个分子量巨大的复合物，核糖体本身是如何在细胞中由多条RNA链及超过70种蛋白分子装配而成?这一问题已困扰相关领域科学家近30年。　　核糖体自身是一个由核糖核酸(RNA)和蛋白质组成的超大复合物(半径20纳米)，其三维结构和分子机制的研究一直是生命科学基础研究中的重要方向。2009年的诺贝尔化学奖即授予了首次解析出细菌核糖体原子分辨率的三位结构生物学家。　　真核细胞核糖体装配过程是个高度复杂的动态过程，有超过300种不同功能的辅助装配因子(蛋白质或者RNA)参与其中。然而绝大多数装配因子的结构及其行使功能的分子机理完全未知。此外，核糖体的组装与细胞的生长调控通路密切相关，某些装配因子的遗传突变会导致核糖体生物生成的失调，引起一系列的人类遗传性疾病(称为ribosomopathies)。某些特定的装配因子(例如eIF6)不正常表达也在多种人类癌症细胞中被发现。因此，针对核糖体装配过程的研究不仅具有重要的科学意义，还具有潜在的临床应用潜力。　　图1酵母核糖体大亚基组装中间体的3.08埃冷冻电镜结构。a，3.08 埃冷冻电镜密度图，核糖体蛋白颜色为米色，核糖体RNA颜色为灰色。b，19个装配因子的原子模型。　　清华大学生命科学学院高宁研究组自2009年一直致力于研究各种生物的核糖体装配过程。2013年，高宁研究组和美国卡内基梅隆大学的约翰伍尔福德(John L. Woolford Jr)教授研究组携手合作，利用清华大学的高端冷冻电镜平台，以真核生物酵母菌为材料，开展真核核糖体的装配研究工作。2015年，合作研究获得重大突破，课题组得到了酵母细胞核内的一系列组成上和结构上不同的核糖体60S亚基前体复合物的冷冻电镜结构。其中一种状态的三维结构分辨率达到3.08埃，其核心部分的分辨率可达2.8埃，是国际在核糖体组装研究领域迄今为止分辨率最高的结构。基于这一冷冻电镜结构，课题组确定了超过20种不同装配因子在核糖体60S前体上的结合位置，并获得了19种装配因子的原子模型。课题组所提供的丰富结构信息为详细阐释真核核糖体装配过程中的多种装配因子功能和分子机制提供了重要基础。　　2016年5月25日，报道这一重大突破的研究论文在线发表于《自然》(Nature)期刊，题目为《细胞核内的核糖体组装前体结构揭示了装配熟因子的功能多样性》(Diverse roles of assembly factors revealed by structures of late nuclear pre-60S particles)。高宁研究员和卡内基梅隆大学约翰伍尔福德(John L. Woolford Jr)教授为论文共同通讯作者，清华大学生命学院2013级博士生吴姗为第一作者。北京生命科学研究所董梦秋教授及谭丹博士提供了化学偶联交联质谱数据。论文中冷冻电镜数据收集和处理工作获得了国家蛋白质科学(北京)设施清华大学冷冻电镜平台及高性能计算平台支持。课题组得到了中国科技部、国家自然科学基金委、清华大学自主科研、北京高精尖结构生物学中心的经费支持。　　论文链接

上一篇推文，介绍了WIGGENS的CGQ生物量在线监测系统，在微生物（细胞）效能评价/菌种筛选的应用。 本期介绍生物量监测在微生物（细胞）培养条件优化中的应用。培养基为微生物（细胞）的生长提供环境条件以及碳源，氮源，生长因子等。培养基具有通用性，但每种培养物都有特殊性。在通用培养基的基础上针对培养物的特性做适当的调整或成分添加，对目的产物的高效产出，具有重要正作用。 下图是德国法兰克福歌德大学，使用CGQ生物量监测系统对Saccharomyces cerevisiae (一种酿酒酵母)在不同碳源组分中的生长曲线。 三种碳源Glc（葡萄糖）、Gal（半乳糖）、Mal（酰胺）不同浓度对酿酒酵母的生长有着明显的影响，对迟缓期和对数期的影响显著。碳源各组分浓度不同，对酿酒酵母进入平台期的时间甚至有超过6小时的差距影响。这对注重效率的工业发酵来说，减少迟缓期的时间段，有着重要的参考意义。 下图是，在M9培养基中，通过加入不同浓度的甘油，Escherichia coli (大肠杆菌)的生长曲线 从上图大肠杆菌的生长曲线可以看出，在M9培养基中，甘油浓度是对大肠杆菌最终生长量的最大影响因素。0.4%的甘油浓度对比0.1%的甘油浓度，对数生长期有明显提升，最终得到的生物量也是低浓度甘油的4倍以上。 下图是通过培养过程的摇瓶补液，CGQ进行的实时生物量监测。 在大肠杆菌培养中，通过LIS摇瓶补液系统，在摇瓶培养过程中进行在线补入缓冲液，缓冲液对pH值进行了调节。在使用LB培养基培养大肠杆菌的过程中，对生物量的限制的最大因素不是培养基组分，而是pH值，持续的进行pH调节，可以有效的增加生物量，提高培养基的利用率。更多的CGQ生物量监测应用，请参考如下文献：[1]Tripp et al (2017):Establishing a yeast-based screening system for discovery of human GLUT5inhibitors and activators (Nature – Scientific Reports)[2]Bruder, S. &Boles, E. (2017): Improvement of the yeast based (R)-phenylacetylcarbinol productionprocess via reduction of by-product formation (Biochemical EngineeringJournal).[3]Gottardi et al. (2017):De novo biosynthesis of trans-cinnamicacidderivatives in Saccharomycescerevisiae (AppliedMicrobiology and Biotechnology).[4]Bracharz et al. (2017):The effects of TORC signal interference on lipogenesis in theoleaginous yeast Trichosporonoleaginosus (BMCBiotechnology). [5]Bruder et al. (2016):Parallelised onlinebiomass monitoring in shake flasks enables efficient strain and carbon sourcedependent growth characterisation of Saccharomycescerevisia (MicrobialCell Factories).

p　　2016年12月16日，清华大学生命学院、结构生物学高精尖创新中心施一公教授研究组于《科学》(Science)杂志就剪接体的结构与机理研究再发长文(Research Article)，题为《酵母剪接体处于第二步催化激活状态下的结构》(Structure of a Yeast Step II Catalytically Activated Spliceosome)，报道了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)剪接体在即将开始第二步剪接反应前的工作状态下的三维结构，阐明了剪接体在第一步剪接反应完成后通过构象变化起始第二步反应的激活机制，从而进一步揭示了前体信使RNA剪接反应(pre-mRNA splicing，以下简称RNA剪接)的分子机理。/pp　　由于真核生物中的基因编码区中存在不翻译成蛋白质的序列(称为内含子)，染色体DNA转录出来的前体mRNA(pre-mRNA)并不直接参与蛋白质翻译，而是需要先将其中的内含子片段去除，才能进入核糖体进行蛋白质合成。内含子的去除需要通过两步转酯反应来实现：首先，位于内含子序列中下游被称为分支点(branch point sequence)的序列中有一个高度保守的腺嘌呤核苷酸(A)，其2’羟基亲核攻击内含子5’末端的鸟嘌呤(G)，于是第一步反应发生，形成套索结构 然后，5’外显子末端暴露出的3’-OH向内含子3’末端的鸟嘌呤发起攻击，第二步反应发生，两个外显子连在一起。通过这两步反应，前体信使RNA中数量、长度不等的内含子被剔除，剩下的外显子按照特异顺序连接起来从而形成成熟的信使RNA(mRNA)(图1)。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201612/insimg/0e590db1-7664-40b3-9508-9269cc1b944d.jpg" title="201612161410211731.jpg"//pp style="text-align: center "图1 基因剪接反应示意图(图片来源：《Cell》)/pp　　这两步化学反应在细胞内是由一个庞大、复杂而动态的分子机器——剪接体催化完成的。对于每一个内含子来说，为了调控反应的各个基团在适当时机呈现合适的构象从而发挥其活性，剪接体各组分按照高度精确的顺序结合和解离，组装成一系列具有不同构象的分子机器，统称为剪接体。根据它们在RNA剪接过程中的生化性质，这些剪接体又被区分为B、Bact、B*、C、P、ILS等若干状态。获取剪接体在组装、激活、催化反应过程中各个状态的结构是最基础也是最富挑战性的结构生物学难题之一。/pp　　2015年8月，施一公研究组率先突破，在世界上首次报道了裂殖酵母剪接体处于ILS状态的3.6埃高分辨率结构。2016年7月22日，施一公教授研究组在《科学》在线发表背靠背长文，首次报道了酿酒酵母剪接体分别处于激活状态(activated spliceosome，又称为Bact complex)和第一步催化反应后(catalytic step I spliceosome，又称为C complex)的近原子分辨率的剪接体结构，首次完整地展示了第一步转酯反应前后pre-mRNA和其中起催化作用的snRNA的反应状态，以及剪接体内部蛋白组分的组装情况。但是对于剪接体催化第二步转酯反应的细节，至今没有高分辨率的结构加以佐证。/pp　　在最新发表的《科学》长文中，施一公教授研究组捕获了性质良好的酿酒酵母剪接体样品，并利用先进的单颗粒冷冻电镜技术和高效的数据分类方法，重构出了总体分辨率分别为4.0埃的冷冻电镜结构，首次报道了酵母第二步催化激活状态下的剪接体结构。该结构的解析，进一步补充了mRNA剪接过程的关键信息，描述了从第一步转酯反应到第二步转酯反应过程中，剪接体催化反应活性中心内部组分的变化，以及关键蛋白的参与情况，为理解第二步反应所需的3’剪接位点是如何进入活性位点提供了重要的结构基础。值得关注的是，该结构的催化核心区域的分辨率达到3.5埃，第一次展示了转酯反应进行中的关键结构信息，填写了第二步转酯反应细节信息的空白。/pp　　2015年8月至今，施一公教授研究组共报道了剪接反应中5个关键状态剪接体复合物的高分辨率结构，分别是3.8埃的预组装复合物tri-snRNP、3.5埃的激活状态复合物Bact complex、3.4埃的第一步催化反应后复合物C complex、4.0埃的第二步催化激活状态下的C* complex以及3.6埃的内含子套索剪接体ILS complex。这5个高分辨率结构所代表的剪接体状态，基本覆盖了整个剪接通路中关键的催化步骤，提供了迄今为止最为清晰的剪接体不同工作状态下的结构信息，大大推动了RNA剪接研究领域的发展。/pp　　施一公教授为本文的通讯作者 清华大学生命学院博士后结构生物学高精尖创新中心卓越学者闫创业、医学院四年级博士生万蕊雪以及生命学院二年级博士生白蕊为该文的共同第一作者 生命学院二年级博士黄高兴宇参与了这项研究 电镜数据采集于清华大学冷冻电镜平台，计算工作得到清华大学高性能计算平台、国家蛋白质设施实验技术中心(北京)以及荣之联董事长王东辉先生的支持。本工作获得了北京市结构生物学高精尖创新中心及国家自然科学基金委的经费支持。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201612/insimg/265b7d28-fd8c-4b5c-b254-723cb115e514.jpg" title="201612161410211270.jpg"//pp style="text-align: center "图2 C* complex三维结构示意图/ppbr//p

前言环境镉的膳食摄入量高，生物半衰期长，直接或通过肠道微生物群损害生理功能，是一种严重的健康风险。然而，环境镉对微生物和宿主系统的毒性机制尚不清楚。中科院营养代谢与食品安全重点实验室和上海交通大学医学院的科学家在《Hazardous Materials》杂志联合发表了一篇名为《Cadmium accelerates bacterial oleic acid production to promote fat accumulation in Caenorhabditis elegans》的文章，本研究建立了三个线虫和大肠杆菌培养系统，以研究微生物在镉诱导的脂质毒性中的重要作用，阐明了镉通过细菌代谢物在体内诱导脂质积累的机制，并揭示了环境镉、微生物和宿主之间的相互作用。本研究使用ECHO REVOLVE正倒置一体荧光显微镜（RVL-100-G，Discover ECHO，US）检测VS29蠕虫的GFP荧光。激发和检测波长分别为470–495 nm和510–550 nm。使用图像处理和分析软件对荧光图像进行分析，计算其平均荧光密度。图A ECHO REVOLVE正倒置一体荧光显微镜拍摄转基因VS29蠕虫中GFP：dgat-2表达的代表性图像（左图）和相对定量（右图）（n≥ 15） 在成年期的第1、3、5和7天。比例尺：210µm。研究表明，镉暴露导致细菌代谢物的组成存在显著差异。油酸被确定为表达差异最大的代谢物。镉暴露显著增加了油酸的含量，表明镉具有特定的诱导效应。通过在正常和代谢失活系统中直接添加到秀丽隐杆线虫，进一步证实了油酸对体脂积累的影响。因此，研究发现镉诱导的复合差异（尤其是油酸的增加）而不是数量变化介导了镉对宿主的影响。除了油酸的产生外，还发现低剂量镉暴露可提高细菌中油酸合成相关基因（fabA、fabB、fabD、fabG、fabH、fabI、fabZ和accA）的表达。并且添加油酸增加了秀丽隐杆线虫的脂质合成和代谢相关基因（fat-5、fat-7、acs-11和sbp-1）的表达，这与镉暴露线虫中的现象相似。值得注意的是，与镉暴露不同，油酸对秀丽隐杆线虫体内脂质积累的影响是直接且独立于培养系统的，这表明升高的细菌油酸是环境镉促进宿主体内脂质积累的效应器。综上所述，本研究提出了一个模型来说明环境镉、细菌和线虫之间的相互作用。本研究首先集中于环境中低剂量镉引起的细菌代谢产物改变及其对镉暴露与宿主毒性之间关系的影响。本研究还探究了维生素D3在镉诱导的脂肪积累中的作用。补充维生素D3可显著降低低剂量镉加速的秀丽隐杆线虫体内的脂肪含量，表明补充维生素D3有可能防止环境镉暴露引起的脂肪异常积累。研究亮点：▶ 本研究发现在有活细菌系统中的线虫，镉提高了细菌代谢产物油酸的产生，并提高了其合成基因的表达。从而进一步促进了线虫脂肪代谢相关基因的表达和脂肪沉积。▶ 本研究发现了维生素D3的潜在保护作用，可以显著防止镉或油酸诱导的脂肪沉积，可以降低环境镉的脂质毒性，这些发现为镉引起的健康风险和毒理学机制提供了深入的见解。原文：https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2021.126723Revolve Gen 2正倒置一体电动荧光显微镜新一代Revolve Gen 2正倒置一体电动荧光显微镜，拥有流行的触屏操控方式，配备智能荧光成像系统，将Z-Stacking全景深成像和DHR数字处理功能有机联合，提升分辨率告别照片模糊，为您打造全新的成像体验。

p　　span style="color: rgb(255, 0, 0) "日前刚在英国 《自然》杂志发表领先世界的合成生物学成果，中国科学院分子植物科学卓越创新中心、植物生理生态研究所合成生物学重点实验室覃重军研究员就在媒体面前流露出内心焦虑：论文的第一作者、掌握了自己学术思想和实验关键技术的博士生邵洋洋正在申请海外博士后，其中就包括此次与他们同时发表类似论文的美国同行实验室。/span/pp style="text-align: center "img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/ef2459e4-3725-47d6-a971-944dcbf97e7b.jpg" title="640-3.jpeg"//pp style="text-align: center "▲覃重军研究员（右）与论文第一作者也是团队成员之一的邵洋洋在实验室进行试验研究。/pp　　“为了学生的前途考虑，我希望她出国，但为国家考虑，我真希望能留住她。”覃重军无奈地说，span style="color: rgb(0, 112, 192) "按照国内学术圈现行的 “游戏规则”，年轻人若在国外实验室做出好的工作再回国，获得的待遇会好很多。能否根据真实学术水平和实际科研贡献，给予海内外青年人才同等待遇？这个近来被诸多讨论的话题，再次摆在我们面前。/span/pp　　strongspan style="color: rgb(255, 0, 0) "国内不乏孕育重大产出的优秀“学术土壤”/span/strong/pp　　将酿酒酵母中16条天然染色体，通过基因编辑的方法合成一条，覃重军研究团队在 “合并染色体”的国际竞争中拔得头筹。连他最强劲的竞争对手——美国科学院院士、纽约朗格尼医学中心的杰夫· 博伊克，都忍不住来问他，究竟是怎么会想到要这么做，又是怎样完成染色体 “十六合一”的？因为博伊克的实验室用了相同的技术路线，但只融合到两条染色体。/pp　　“这是只有外行才敢想的念头，一开始没多少人觉得我能做出来。”覃重军非常感谢植生所给了他宽松的氛围，支撑他度过了最艰难的时光，“整整五年，我没有发表一篇与酵母相关的论文，换在别的单位，或许早就让卷铺盖走人了。”/pp　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "覃重军说，这次成功的关键是他在初期作了大量思考，清晰界定了实验的原则，同时实验室也在进行系统的技术积累。/span中国科学院上海植物生理生态研究所所长、中国科学院院士韩斌告诉记者，尽管覃重军没有出论文，但研究所更看重人才的长期发展，在国际评估中，他的研究方向一直得到认可，span style="color: rgb(0, 112, 192) "“需要五到十年才能出的重大成果，我们就该耐心等待。”/span为了让科学家安心做科研，植生所为各研究组长提供稳定的年薪，而非根据各研究组的科研经费多少来核算。/pp　　维持研究团队运转的人头费一直是件头疼事。多年来，覃重军研究组的“赤字”超过300万元。 “有些单位的研究组账面少于50万元，就可能被要求关闭，更不可能赤字运行。”为此，他感到十分幸运， “现在无论哪里要我去，我都不会离开植生所这片宽容的学术土壤。”更何况，这里每年都会冒出两三项引发学术界关注的重大成果，已初具国外著名实验室的创新氛围。/ppspan style="color: rgb(255, 0, 0) "strong　　优质“小环境”还需“大环境”扶持滋养/strong/span/pp　　宽松而有活力的 “学术土壤”在国内尽管还不多，但越来越多的 “星星之火”已经出现。不必远寻，就在生命科学领域，上海就有多个研究所具备了专注学术、宽容失败、奋力创新科研氛围，而且具备了国际一流的研究实力。/pp　　照理说，span style="color: rgb(0, 112, 192) "这样的研究所对优秀博士毕业生应该具有相当吸引力。但邵洋洋斟酌再三，还是决定申请海外博士后。/span的确，以此次单染色体人工酵母的工作，她可以申请到全球合成生物学领域任何一个顶尖实验室，去那些实验室接受训练和熏陶，这是每个年轻博士所向往的。然而，更吸引人的，是去一个优秀海外实验室学习上两三年，做出杰出工作再回国，就能比不出国的青年科学家获得更多科研经费支持和房贴，申请人才计划、科研项目都更有优势。/pp　　“可我又有什么理由阻止她出国做博士后呢？尽管我的研究组人手十分紧张，她走之后，很多后续工作可能难以开展。”span style="color: rgb(0, 112, 192) "尽管植生所的 “小环境”不错，但从整个科研大环境来看， “海归”标签依然在科研经费获取、人才评价等方面起着重要作用。这让覃重军如鲠在喉。/span/pp　　不久之前，中国科学院神经科学研究所博士后刘真受聘为研究组长，他也曾为是否出国做博士后而纠结过。尽管他留在国内并做出了世界首批克隆猴这样的杰出工作，但在科研启动期所获得的资助仍比不上 “海归”们。/pp　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "“一个优秀博士生的流失，不仅意味着一段黄金创造力的流失，也可能将国内实验室的创新科研思路带给竞争对手。”痛心之余，覃重军疾呼，能否更公平地对待不同路径成长起来的人才，适时转变人才评价方式，让优秀博士生不必为了 “海归”标签而出国。/span/p

日前，国际著名科学杂志《先进科学》（Advanced Science）发表了一篇专题文章，详细介绍了我国科学家团队在单细胞生物学研究领域的一项最新技术成果：中国科学院青岛生物能源与过程研究所单细胞中心（以下简称单细胞中心）和青岛星赛生物科技有限公司（以下简称星赛生物）合作发明了拉曼流式检测技术pDEP-D LD-RFC ，该技术基于介电诱导确定性侧向位移，可高效完成单细胞聚焦、捕获/释放，针对人体细胞（肿瘤）、植物（微藻）、酵母和细菌等多种细胞类型具有广谱适用性。 《先进科学》（Advanced Science）相关文章页面截图 据悉，基于此星赛生物即将推出的升级版FlowRACS仪器，为活体单细胞代谢表型组的高通量检测提供了全新工具，研究小组已经开发了一系列应用，广泛适用于肿瘤细胞分类、微藻合成过程监控、产油酵母多表型监控、细菌药敏性检测等生命科学研究的重点高精尖领域。 活体单细胞代谢表型组流式检测技术发展简史活体单细胞代谢表型组的流式检测，在微生物资源挖掘、细胞工厂筛选、酶元件表征、生物过程监控、临床诊疗等方面，具有共性的支撑作用。此前，荧光流式和质谱流式作为常用手段被广泛接受，但经过长时间的验证，二者均在不同方面有其技术的局限性。 其中，荧光流式受限于对生物标志物需有先验知识，并引入荧光标记探针来识别生物标志物——但许多细胞都没有可靠的生物标志物，如微生物群，无论是在基因上还是在生物分子上，都不能就其多数功能进行普遍标记，且可能存在强荧光干扰问题。另一方面，质谱流式涉及到细胞破碎，难以耦合目标单细胞的下游分选、培养或测序等单细胞组学技术。于是，新的技术应运而生。与荧光流式和质谱流式等现有流式细胞检测手段相比，拉曼流式具有无需标记细胞、活体检测、信息量丰富等优势，因此是一种具有广阔应用前景的细胞分析手段。但是，新技术的诞生必将伴随实际应用带来的阵痛。高通量拉曼流式技术的应用受限于：首先，如何提高样品的普适性，以适用于不同细胞类型与不同表型的检测；其次，如何提高检测的通量，以实现高度异质性细胞群体的深度检测；最后，如何提高运行的稳定性，以支撑高度可靠的仪器使用流程。活体单细胞代谢表型组检测新技术针对上述问题，单细胞中心王喜先、任立辉、刁志钿、何曰辉等带 领的研究小组发明了“介电诱导确定性侧向位移实现单细胞聚焦、捕获/释放的拉曼流式检测技术”（Positive Dielectrophoresis Induced Deterministic Lateral Displacement-based Raman Flow Cytometry，pDEP-DLD-RFC）。 《先进科学》（Advanced Science）文章页面中，关于拉曼流式细胞检测技术原理的插图首先，新技术采取的是宽流场高流量的进样策略。其能够有效防止细胞沉降，进而实现了长时间稳定运行（＞5小时），但是此策略带来的问题就是如何在宽流场中实现快速、精准地对高速流动的单个细胞进行一一捕获，且不会漏检，也就是如何保证拉曼检测的高效率和高准确性。因此，团队又通过介电诱导细胞确定性侧向位移，实现了宽场中细胞高效聚焦地流经检测位点，从而保证了拉曼检测效率。最后，通过施加检测时间依赖的周期性介电场，实现了单细胞的快速捕获/释放，以满足各种不同细胞类型的普适性、高通量检测。 FlowRACS中介电诱导细胞确定性侧向位移实拍周期性介电场中单细胞的快速捕获/释放实拍生物过程监控及肿瘤/微生物细胞分类研究的新工具基于上述关键技术突破，星赛生物即将推出的升级版FlowRACS兼具广谱通用性、高通量、运行稳定性等性能的高通量拉曼流式检测系统，并开发了一系列应用：肿瘤细胞分类、微藻合成过程监控、产油酵母多表型监控、细菌药敏性检测。这套全新的细胞检测分选技术和仪器设备系统，将能极大提升相关领域的科研效率和能力。 在肿瘤细胞类型的快速区分场景中，基于SCRS中信息丰富的指纹区，以膀胱癌、肺癌、肾细胞癌、乳腺癌等细胞株为例，证明流式拉曼技术耦合拉曼组机器学习算法，能以平均95%的准确率，完成肿瘤细胞类型的快速判别。该方法对于肿瘤细胞质量检测等应用具有潜在的应用价值。在植物生物制造过程的代谢监控场景中，基于共振拉曼信号，实现了雨生红球藻中虾青素含量的实时监测，从而示范了单细胞精度的虾青素累积过程细胞工厂代谢状态的监控，并考察了“高光”和“缺氮”等条件对细胞虾青素累积速度及其同步性的影响。其虾青素含量检测速度达～2700 events/min，为目前最高的自发拉曼检测/分选通量。在酵母生物制造过程的代谢监控场景中，基于非共振拉曼信号，示范了油脂酵母中细胞代谢活力、甘油三脂含量、油脂不饱和度等多个关键代谢表型的同步动态监控，进而通过拉曼组机器学习、拉曼组内关联分析（Intra-Ramanome Correlation Analysis，IRCA）等算法，实现了单细胞代谢状态（准确率＞96%）的实时鉴定，以及细胞内代谢物相互转化网络的实时重建。在细菌药敏性的流式快检场景中，基于单细胞中心前期提出的重水饲喂单细胞拉曼药敏原理，以大肠杆菌和多种常见抗生素为例，开发了流式药敏快检技术，并通过与拉曼药物应激条形码（Raman Barcode for Cellular Stress-response，RBCS）、IRCA、拉曼组机器学习等算法，证明该流式药敏快检技术还能实时地判断单菌体精度的药物应激状态、构建细胞内代谢物相互转化网络等，从而揭示细菌-药物互作机制。此外，流式检测大大提高了药敏检测中SCRS取样深度，对于识别群体中通常占比很低的耐药细胞，具有重要的意义。与转录组、蛋白组和代谢物组相比，拉曼组能表征单细胞精度的底物代谢、产物合成、环境应激性、化合物相互转化等关键代谢表型，而具广谱适用、活体、无损、非标记、全景式表型、可分辨复杂功能、快速、低成本、能耦合下游测序、质谱或培养等优势，因此拉曼组是一种更接近于“功能”、更适合于临床、工业等场景的单细胞表型组。为了支撑人体、动植物和微生物拉曼组数据的自动化采集与分析，单细胞中心与星赛生物基于pDEP-DLD-RFC技术，星赛生物即将推出升级版FlowRACS仪器，将大大加速拉曼组平台的推广应用。原文链接：https://doi.org/10.1002/advs.202207497

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染可引起肝脏的急性和慢性炎症。急性感染一般表现为自限性肝炎，除爆发性肝炎外，对人体的危害较小；而慢性感染则与肝硬化（cirrhosis）和原发性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的发生密切相关。全球约有3.5亿的HBV携带者，最终发展为肝癌的比例高达25%，每年死于HBV相关肝癌的患者高达100多万。中国为HBV高度流行的国家，HBV感染是严重危害国民健康和生活质量的重要传染性疾病。　　MicroRNA 是一类小的非编码RNA，可通过降解靶mRNA和抑制靶mRNA翻译等方式调控基因表达，在动植物的生长发育、肿瘤的发生发展、感染性疾病的发生发展中有重要作用。近年来的研究发现，microRNA 参与了HCV病毒、HIV病毒、EB病毒、Plum pox病毒、CMV病毒、Kaposi' s 肉瘤相关病毒等病毒在宿主细胞内的复制过程，调控宿主细胞与病毒的相互作用，影响疾病的发生发展及转归，有可能成为新的抗病毒治疗靶点。程京教授课题组、郭永副研究员与北京大学人民医院魏来教授、重庆医科大学黄爱龙教授课题组合作，利用生物芯片平台结合功能研究发现miR-372/373这簇小RNA可通过调控宿主细胞的转录因子促进HBV表达。该研究通过将microRNA和转录因子这两类细胞内非常重要的调控因子相关联，为HBV表达调控研究提供了新的方向，具有重要的理论意义。 　　上述研究的博奥生物晶芯哺乳动物miRNA芯片服务与Real time RT-PCR服务在博奥生物有限公司完成。原文摘要： 　　MicroRNAs-372/373 promote the expression of hepatitis B virus through the targeting of nuclear factor I/B MicroRNAs (miRNAs) play important roles in the posttranscriptional regulation of gene expression. Recent evidence has indicated the pathological relevance of miRNA dysregulation in hepatitis virus infection however, the roles of microRNAs in the regulation of hepatitis B virus (HBV) expression are still largely unknown. In this study we identified that miR-373 was up-regulated in HBV-infected liver tissues and that the members of the miRs-371-372-373 (miRs-371-3) gene cluster were also significantly co-up-regulated in HBV-producing HepG2.2.15 cells. A positive in vivo association was identified between hepatic HBV DNA levels and the copy number variation of the miRs-371-3 gene cluster. The enhanced expression of miRs-372/373 stimulated the production of HBV proteins and HBV core-associated DNA in HepG2 cells transfected with 1.33HBV. Further, nuclear factor I/B (NFIB) was identified to be a direct functional target of miRs-372/373 by in silico algorithms and this was subsequently confirmed by western blotting and luciferase reporter assays. Knockdown of NFIB by small interfering RNA (siRNA) promoted HBV expression, whereas rescue of NFIB attenuated the stimulation in the 1.3xHBV-transfected HepG2 cells. Conclusion: Our study revealed that miRNA (miRs-372/373) can promote HBV expression through a pathway involving the transcription factor (NFIB). This novel model provides new insights into the molecular basis in HBV and host interaction. 原文出处：http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/hep.24441/abstract jsessionid=6B0DBCF4745EF5CB4D33C995287182BA.d01t04

上一篇推文，我们介绍了WIGGENS的CGQ生物量在线监测系统监测微生物或细胞的生长阶段，本期我们介绍生物量监测对微生物（细胞）效能评价/菌种筛选的应用。 首先我们来看一篇使用CGQ系统监测生物量的已发表文献。 Bruder et al. (2016):Parallelised onlinebiomass monitoring in shake flasks enables efficient strain and carbon sourcedependent growth characterisation of Saccharomycescerevisia (MicrobialCell Factories). Bruder对酿酒酵母的高效菌株（CEN.PK2-1C）和碳源依赖性生长特性监测。 上图中生物量曲线（OD值）是CGQ系统实时在线测量。葡萄糖浓度和酒精浓度用在线生化分析仪进行实时在线监测的数据。 从上图的数据曲线中我们可以清晰的看出生物生长量与培养基中葡萄糖浓度和酒精产量三者的关联性。发酵过程希望使用的菌种是能够更高效率的将糖类等底物转化为酒精。底物与产物的效能比是对酿酒酵母菌株效能的最直接评价。 CGQ和生化分析仪的在线监测联合使用，可以对菌种的综合效能进行直观评价。 对微生物或细胞的突变体研究，是寻找高效菌种的一种有效手段。突变体与野生型的对比研究，用于对突变体进行效能评估。 上图是德国最格赖夫斯瓦尔德大学（成立于1456年），使用CGQ系统对Staphylococcus aureus（金黄葡萄球菌）野生型和突变体生物量分析。 作为菌种筛选的有力工具，CGQ系统可以对同一培养条件下，或不同培养条件下的生物量进行实时监控，根据生物量的监测数据对菌种筛选提供数据支持。 CGQ与生化分析仪同时使用，可以对多参数相关性进行综合评估，有效的拓展了应用范围，可以通过多参数变化，对微生物效能进行综合评价。更多的CGQ生物量监测应用，请参考如下文献：[1]Tripp et al (2017):Establishing a yeast-based screening system for discovery of human GLUT5inhibitors and activators (Nature – Scientific Reports)[2]Bruder, S. &Boles, E. (2017): Improvement of the yeast based (R)-phenylacetylcarbinol productionprocess via reduction of by-product formation (Biochemical EngineeringJournal).[3]Gottardi et al. (2017):De novo biosynthesis of trans-cinnamic acidderivatives in Saccharomycescerevisiae (AppliedMicrobiology and Biotechnology).[4]Bracharz et al. (2017):The effects of TORC signal interference on lipogenesis in theoleaginous yeast Trichosporonoleaginosus (BMCBiotechnology). [5]Bruder et al. (2016):Parallelised onlinebiomass monitoring in shake flasks enables efficient strain and carbon sourcedependent growth characterisation of Saccharomycescerevisia (MicrobialCell Factories).

上海远慕生物科技公司是家专业从事科研试剂的优质供应商，专业供应进口/国产ELISA试剂盒，动物血清血浆，标准品对照品，培养基，抗体，化学试剂，质粒载体，染色液，实验耗材，其他科研试剂等，提供ELISA试剂盒免费代测服务，提供试剂相关的使用说明书，价格，型号，规格等详细介绍，开学之际，本司特推出一系列的优惠活动回馈新老客户，欢迎来电咨询。 为迎接开学的到来，上海远慕生物科技有限公司现推出新产品质粒的特价优惠！ 质粒是细胞中非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子，是基因工程最常见的运载体。质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，大部分的质粒为环状构型，但也存在线形质粒。 质粒zhìlì（Plasmid）是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子（即细胞附殖粒、又胞附殖粒）。大部分的质粒虽然都是环状构型，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的叶绿体和线粒体等胞器中。然而，1984年，在Streptomyces coelicoler（天蓝色链霉菌）等放线菌以及在Borrelia hermsii（赫氏蜱疏螺旋体）等原核生物中，又相继发现线形质粒。 天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。质粒天然存在于这些生物里面，有时候一个细胞里面可以同时有一种乃至于数种的质粒同时存在。质粒的套数（copy number）在细胞里从单一到数千都有可能。有时有些质粒含有某种抗药基因（如大肠杆菌中就有含有抗四环素基因的质粒）。有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理代谢能力，乃至于在一些细菌中提高它的致病力。一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。它是基因工程最常见的运载体。 质粒大致可分为5类： 1.接合性质粒 2.抗药性质粒 3.产细菌素和抗生素质粒 4.具生理功能的质粒 5.产毒质粒 质粒根据它们所带有的基因以及赋于宿主细胞的特点可以分为六种不同的类型： 1、抗性质粒：它们带有抗性基因，可使宿主菌对某些抗菌素产生抗性，如对氨基苄青霉素，氯霉素等产生抗性。不同的细菌中也可含有相同的抗性质粒，如RP4质粒在假单胞菌属和其它细菌中都存在。R质粒还可以通过感染的形式在不同种的细菌中传播。 2、致育因子：可以通过接合在供体和受体间传递遗传物质。F因子约有1/3的DNA构成一个转移DNA的操纵子，约35个基因，负责合成和装配性伞毛。这就是DNA转移区域，受traJ基因产物的正调节。它还具有重组区和复制区。重组区含有多个插入顺序，通过这些插入顺序进行同源重组。在复制区有两个复制起始点：一个是OriV，供给F因子在宿主中自主复制时使用；另一个是OriT，供接合时进行滚环复制的起始点。 3、Col质粒：带有编码大肠杆菌素的基因。大肠杆菌素可杀死其它细菌。 4、降解质粒：这种质粒编码一种特殊蛋白，可使宿主菌代谢特殊的分子，如甲苯或水杨酸。 5、侵入性质粒：这些质粒使宿主菌具有致病的能力。如Ti质粒，此是在根癌农杆菌中发现的，现经过加工用来作植物转基因的一种常用载体。 6、隐秘质粒：不显示任何表现类型，主要通过物理方法才能发现。开学限时促销产品（更多质粒促销请来电咨询）： GW1-PercevalHR，基因文库质粒 R777-E011 Hs.ARHGAP35，基因文库质粒 pEGFP-SAMD4A载体，基因文库质粒 pASK-IBA5plus++FUS载体，人源基因质粒 pLKO.1-shYAP1#1-Puro载体，RNA文库质粒 pLexA载体，酵母系列质粒 pFC334载体，哺乳系列质粒 pDONR201载体，植物系列质粒 pBABE-GFP载体，病毒系列质粒 pDONR207载体，植物系列质粒 pH7GWIWG2（I）载体，植物系列质粒 pK7GWIWG（I）载体，植物系列质粒 pKEX4tr载体，植物系列质粒 pET14b-PGA4载体，人源基因质粒 pSNAP-tag（T7）2-His载体，大肠系列质粒 pRSETB-Clover载体，大肠系列质粒 注：活动期间，凡购买远慕指定产品即可享受特价优惠！本次活动的最终解释权归上海远慕生物科技有限公司所有。 远慕生物，专业供应科研实验所需的培养基，抗体，动物血清血浆，标准品对照品，化学试剂，酶联免疫试剂盒，白介素试剂盒，金标检测试剂盒，微生物，蛋白质，ELISA种属涵盖广，凭借多年行业经验，完善的售后服务，高质量的产品，赢得客户一致好评，欢迎来电咨询与订购！

摘要：线粒体和复杂的内膜系统是真核细胞的重要特征。到目前为止，对活细胞内的细胞器进行操纵仍然十分困难。多功能单细胞显微操作FluidFM技术能够从活细胞中提取、注射细胞器，将定量的线粒体移植到细胞中，同时保持它们的活力。近期，Julia A. Vorholt课题组使用多功能单细胞显微操作FluidFM技术，将线粒体移植至培养的细胞中，并实时跟踪线粒体注射后的情况，监测它们在新宿主细胞中的命运。通过跟踪，作者发现与受体细胞线粒体网络融合发生在移植后20分钟，持续16小时以上。活细胞之间移植线粒体不仅为细胞器生理学的研究开辟了新的前景，也为机械生物学、合成生物学和疾病治疗开辟了新的前景。该篇文章以” Mitochondria transplantation between living cells.”为题，发表在BioRxiv.上。 结果：1. 从活细胞中提取线粒体为了检测FluidFM探针对单细胞细胞器采样的能力。作者使用了两种探针，分别是锥型探针(A=1.2 um2)和圆柱型探针(A=1.6 um2)(图1B)。实验结果表明，使用这两种探针都可以对线粒体及单个线粒体进行提取或大量抽提。作者对内质网（ER）和线粒体提取后的细胞活力进行了检测，发现细胞仍保持较高的细胞活力 (95%)。为了进一步确保FluidFM提取方案在探针插入时不会破坏细胞质膜，作者使用荧光探针(mito-R-GECO1)监测细胞培养基中可能发生的Ca2+内流。实验显示，在操作过程中和操作后都没有Ca2+流入，表明细胞器提取过程中细胞质膜的完整性。本研究还发现暴露在FluidFM负压下的线粒体小体会经历形状的转变，类似于“串上珍珠”的形态。 其特征是离散的线粒体基质球体状，并且通过细长的膜结构相互连接，在进一步负压拉力的作用下，这些球状结构终被拉断，并在悬臂中呈现为球状线粒体(图2E)。进一步探究显示，施加FluidFM负压后，力诱导的形状转变沿线粒体小管在毫秒到秒的范围内传播了数十微米。形状转变沿这一方向均匀传播，而外层线粒体膜(OMM)保持了初的完整性。当牵引力保持数秒后，OMM在先前形成的“珍珠”之间的一个或多个收缩点分离，从而产生立的球形线粒体，而管状结构的其余部分放松并恢复。结合线粒体牵引实验和线粒体定位的钙流实验，结果证明线粒体的串上珍珠表型的形状转变以及随后细胞质内的线粒体裂变是不依赖钙的。 图1：(A) 示意图：使用FluidFM技术进行细胞器提取。通过调整悬臂探针中的负压(-Δp)进行提取。(B) 通过调节孔径大小和流体作用力的适用范围，选择性地提取不同的细胞器成分。1行：用悬梁臂探针提取单细胞细胞器的示意图。2行：不同孔径的悬臂扫描电镜图。3行：FluidFM悬臂探针孔径与对应的流体力范围。(C) 示意图：使用FluidFM技术进行细胞器注射。通过调整悬臂探针中的正压(+Δp)进行将探针中的细胞器注射到受体细胞内。 图2：(A) FluidFM悬臂探针的扫描电子显微镜图像。具体尺寸参数是：L = 200 μm, W = 35 μm, H = 1 μm。Scale bar = 5 μm。(B) 提取线粒体后的FluidFM悬臂的荧光显微镜图像。由于折射率不同，可以看到提取物和悬臂探针填充物之间的边界。Scale bar = 10 μm。(C) 是图(B)的示意图，提取物的体积是1170 fL。(D- F) 活细胞器提取的延时图像和提取后金字塔悬臂图像。黄框表示细胞内的悬臂的位置。(D) 对表达su9-BFP(线粒体)和Sec61-GFP (ER) 的U2OS细胞进行提取。箭头表示ER区域。使用孔径为0.5µm2的悬臂梁探针。Scale bar = 10 μm。(E) 从表达su9-BFP的U2OS细胞中提取单个线粒体。使用1µm2孔径的悬臂梁探针。Scale bar = 10 μm。(F) 从表达su9-BFP的U2OS细胞中提取数个线粒体。使用1µm2孔径的悬臂梁探针。Scale bar = 10 μm。 2. 线粒体移植至新细胞研究人员的下一个目标是将线粒体移植到新的宿主细胞中，并保持细胞活性。FluidFM技术为线粒体转移提供了两种可能性方案：方案一、用FluidFM技术直接提取线粒体而后注入到新的宿主细胞中；方案二、将从细胞中分离纯化的线粒体回充入FluidFM探针，然后注射(图3A-D)。作者比较了两种方法，为了实现可视化的线粒体的转移，作者在供体和受体细胞中分别对线粒体进行了差异化标记 (图3E-F 供体细胞线粒体su9-mCherry和受体细胞线粒体su9-BFP)。当使用FluidFM直接将线粒体从一个细胞移植到另一个细胞时，成功率高达95%，而且保持了细胞活力(图3G, 41个移植细胞中有39个)。在注射纯化线粒体后，作者观察到46%的样本(19/41)发生了线粒体转移且保持了细胞活力(图3G)。移植的定量结果显示，这些实验中移植的线粒体数量从3到15个线粒体每个细胞不等(图3H)。两种替代方案的不同成功率可以由线粒体分离获取的条件差异来解释。在评估线粒体提取方案时，作者观察到部分提取的线粒体外膜发生破裂。线粒体的不可逆损伤导致细胞内降解，细胞色素C释放可能导致细胞凋亡。虽然线粒体的细胞间移植降低了通量，但它的优点是细胞外时间短(1分钟)，并且通过FluidFM采样的线粒体大限度地集中在原生细胞质液中，完全避免了人工缓冲液的使用。在提取和移植之前，作者通过在探针中填充不混溶的C8F18来确保提取液在提取过程中保持在孔径附近。因此，只有很小的体积(0.5 - 2pL)被注入到宿主细胞中(图3B)。除了标记供体细胞的线粒体(su9-mCherry)外，还标记了受体细胞的线粒体(su9- BFP)，这样就能够观察移植细胞线粒体网络的实时状态。在上述两种移植方案(移植和纯化后注射)中，宿主-线粒体网络的管状状态不会因注射过程而产生影响。此外，标记可以让作者可视化地监测线粒体地移植，观察线粒体地融合。 无论移植方法是细胞到细胞(图3I)，还是注射纯化线粒体(图3J)，都可以观察到这些过程。实验跟踪了22个细胞的移植命运：18个细胞显示移植的线粒体完全融合，4个细胞的线粒体发生降解。多数细胞样本(18个细胞中的14个)在移植后30分钟内次观察到融合事件。如上所述，细胞间移植即方案一的效率高，并可以直接观察单个移植线粒体的命运。为了展示这一点，作者将标记好的线粒体(su9-mCherry)从HeLa细胞移植到差异标记的U2OS细胞(su9-BFP)中，这种细胞通常用于研究动态线粒体行为。高灵敏度相机可以用于追踪受体细胞内的单个线粒体(图3L)。作者观察到荧光线粒体基质标签在移植后23分钟的发生初始融合而后扩展到线粒体网络。综上所述，作者建立了两种将线粒体转移到单个培养细胞的方法。 一种方法是活细胞间移植。该方案显示移植后细胞活力高，允许观察移植后线粒体的动态行为，是一种高效方案。二种方法是大量纯化线粒体并将其注射到受体细胞中。 注射速度相当快，但不可避免地损害线粒体和细胞功能。图3：(A) 方案一示意图（活细胞间线粒体移植）：通过FluidFM吸入法提取线粒体。 随后，将带有提取物的悬臂探针移至受体细胞插入并注入提取物。(B) 方案一预填充C8F18的FluidFM悬臂梁的图像，被移植线粒体通过su9-mCherry标记，提取量~0.8 pL。Scale bar = 10 μm。(C) 方案二示意图（纯化线粒体注入细胞）：使用标准线粒体纯化方案纯化的线粒体进行线粒体移植的方案。 将纯化的线粒体重悬在HEPES-2缓冲液中，直接填充到FluidFM探针中并对细胞进行注射。(D) 方案二由su9-mCherry标记的FluidFM悬臂充满线粒体的图像。Scale bar = 10 μm。(E) 通过方案一（活细胞间线粒体移植）进行线粒体移植后的宿主细胞图像。宿主细胞的线粒体通过su9-BFP标记，移植细胞线粒体通过su9-mCherry标记。Scale bar = 10 μm。(F) 通过方案二（纯化线粒体注入细胞）进行线粒体移植后的受体细胞图像。宿主细胞的线粒体通过su9-BFP标记，移植细胞线粒体通过su9-mCherry标记。Scale bar = 10 μm。(G) 通过光学成像对两种方案注射的细胞进行评估。每种方法评估了40个细胞。(H) 两种方案的线粒体的计数评估。每种方法评估了22个细胞。(I) 方案一移植线粒体后，对移植线粒体(su9-mCherry)和宿主线粒体网络(su9-BFP)使用不同的荧光标记进行成像，融合。Scale bar = 5μm。(J) 方案二注入纯化线粒体后移的融合状态，标记方案同(I)。Scale bar = 5 μm。(K) 移植线粒体发生降解，分裂成多个更小的荧光囊泡(su9-mCherry)，荧光与标记的宿主细胞线粒体网络(su9-BFP)没有重叠。Scale bar=5 μm。 (L) 单个移植线粒体的延时图像序列(su9-mCherry)。细胞器供体为HeLa细胞，受体细胞为U2OS细胞，带有荧光标记线粒体网络(su9-BFP)。Scale bar = 10 μm。 讨论单细胞的操纵一直是细胞生物学领域的热点和难点，尤其是在不损害细胞活力的情况下从细胞中提取细胞器或将外源物质直接导入到细胞中。截止到目前，尽管单细胞技术有了较大的发展，但要实现将细胞器从一个细胞移植到另一个细胞，除了更大的卵母细胞外，几乎是不可能实现的。线粒体是细胞中的能量转换的核心，与细胞代谢和信号通路以及细胞命运紧密联系在一起。线粒体含有自身的遗传成分(mtDNA)，通常是严格垂直遗传给子细胞的。目前将线粒体地转移到细胞的手段有限，对于线粒体移植后的剂量-反应关系分析更是十分困难，这样我们就很难从机制上了解健康或疾病细胞的线粒体移植后的生物学效应。本文使用的FluidFM技术采用微型探针，可以在微环境中以高时空分辨率操纵单细胞或者对单个细胞进行采样，并与组学方法相结合，使细胞器的研究成为可能。FluidFM技术将原子力显微镜的高精度力学调节手段与光学检测下的纳米尺度微流控系统相结合，提供与单细胞操作相关的力学和定量的体积控制。这些特性在现有微型探针中是的，在本研究中，作者将FluidFM单细胞技术用于活细胞真核内和细胞间的细胞器微操作。成功实现了活细胞之间的线粒体移植。该研究将启发人们将FluidFM技术应用于更多领域，例如，干细胞治疗中低代谢活性细胞的再生，作为线粒体替代治疗方法的一种备选方案等。此外，FluidFM技术为解决细胞生物学、生物力学和细胞工程等问题提供了新的视角。 多功能单细胞显微操作系统- FluidFM OMNIUM参考文献[1].C. Gäbelein, Q. Feng, E. Sarajlic, T. Zambelli, O. Guillaume-Gentil, B. Kornmann & J. Vorholt. Mitochondria transplantation between living cells. (2021). BioRxiv.