柱晶白霉素分析标准品

[align=center][b]【国家药品标准】林可霉素利多卡因凝胶的分析[/b][/align][align=center][b][/b][/align][align=right][b]——依据国家药品标准WS-10001-(HD-0140)-2002方法[/b][/align][b]林可霉素利多卡因凝胶[/b]为复方制剂，每克含林可霉素5毫克，利多卡因4毫克。适应症为用于轻度烧伤、创伤及蚊虫叮咬引起的各种皮肤感染。 [img=,193,127]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807260834522166_2994_2222981_3.gif!w193x127.jpg[/img] [img=,140,64]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807260834520028_3541_2222981_3.gif!w140x64.jpg[/img] 林可霉素 利多卡因 Lincomycin Lidocaine M.W.: 406.54 M.W.: 234.34客户提供林可霉素利多卡因凝胶样品，希望本实验室帮忙通过筛选色谱柱及调节分析条件，依据[color=#ff0000][b]国家药品标准WS-10001-(HD-0140)-2002[/b][/color]方法，实现林可霉素利多卡因凝胶样品的良好分析。首先，使用能在纯水条件下稳定使用的高极性色谱柱[color=#ff0000][b]CAPCELL PAK C[sub]18[/sub] AQ S5 4.6 mm i.d. × 150 mm[/b][/color]，对林可霉素利多卡因凝胶样品进行分析，结果如图1所示，[color=#330099]利多卡因与其峰后杂质之间分离度为1.77[/color]。[align=center][img=,690,437]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807260858200006_8607_2222981_3.png!w690x437.jpg[/img][/align][align=center]图1 CAPCELL PAK C[sub]18 [/sub]AQ分析所得色谱图[/align]注：峰上标数字为分离度。[img=,528,205]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807260858202566_2695_2222981_3.png!w528x205.jpg[/img]为进一步提高利多卡因与其峰后杂质之间的分离度，在原条件基础上将柱温由30℃降低至25℃，并分别使用 CAPCELL PAK C[sub]18[/sub] AQ、CAPCELL PAK C[sub]18[/sub] MG及高含碳量ODS色谱柱SUPERIOREX ODS进行分析，结果如图2所示。[align=center][img=,690,490]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807260859201516_7229_2222981_3.png!w690x490.jpg[/img][/align][align=center]图2 25℃条件下不同色谱柱分析结果对比[/align]注：峰上标数字为分离度。[img=,637,223]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807260859204236_7198_2222981_3.png!w637x223.jpg[/img]如图2所示，在柱温25℃条件下使用三款色谱柱进行分析，其中，[color=#ff0000][b]CAPCELL PAK C[sub]18[/sub] AQ色谱柱分析结果最好，利多卡因与其峰后杂质分离得到最佳分离，分离度为4.23[/b][/color]；[color=#330099][b]使用CAPCELL PAK C[sub]18[/sub] MG色谱柱进行分析时，利多卡因与其峰后杂质分离度为3.27[/b][/color]；而使用SUPERIOREX ODS色谱柱分析时，利多卡因与其峰后杂质未得到有效分离。综上，在国家药品标准WS-10001-(HD-0140)-2002方法基础上，将色谱柱柱温由30℃降低至25℃，使用高极性色谱柱CAPCELL PAK C[sub]18[/sub] AQ及中等极性色谱柱CAPCELL PAK C[sub]18[/sub] MG进行分析，均可在25 min内完成林可霉素利多卡因凝胶样品的分析，并得到利多卡因与其峰后杂质之间的良好分离结果。[align=right][/align][align=right][/align][align=right] [/align][align=right]三耀精细化工品销售（中国）有限公司[/align][align=right]技术开发部[/align][align=right]地址：北京经济技术开发区宏达南路5号[/align][align=right]宏达利德工业园1栋418室[/align][align=right]邮编：100176[/align]

一、背景1.1莫能菌素﹝Monensin﹞是聚醚类离子载体抗生素，是一种[url=http://baike.baidu.com/subview/138504/138504.htm][color=windowtext]反刍动物[/color][/url]中运用较广泛的饲料添加剂；原为[url=http://baike.baidu.com/subview/150635/150635.htm][color=windowtext]链霉菌[/color][/url]所分泌的一种物质，具有控制[url=http://baike.baidu.com/subview/39929/39929.htm][color=windowtext]瘤胃[/color][/url]中[url=http://baike.baidu.com/subview/3852509/3852509.htm][color=windowtext]挥发性脂肪酸[/color][/url]比例，减少瘤胃中蛋白质的降解，降低饲料干物质消耗，改善营养物质利用率和提高动物能量利用率等作用。1.2莫能菌素为百盛客户对肉类原料中兽药残留的监控项目，为了应对客户要求，满足实验室检测要求，对莫能菌素进行新项目技术开发。盐霉素为原有分析项目，此次技术开发对盐霉素前处理及仪器分析条件重新优化，与莫能菌素合并同为聚醚类抗生素检测检测方法。[img=,490,100]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708141014_01_3081717_3.png[/img]二、前处理流程2.1提取称取（2.00±0.02）g样品，加入10mL乙腈混匀，再加入3.00g无水硫酸钠，震荡混匀，超声提取10min；离心取上清液于50mL离心管中，残渣加入5mL乙腈重复提取，合并两次上清液，定容至20mL，加入5mL乙腈饱和正己烷，震荡离心。2.2净化取下层（乙腈层）5mL于圆底烧瓶中，旋转蒸发至1mL，氮气吹干。普通肉类基质：圆底烧瓶中加入1mL乙腈超声溶解。内脏类基质：圆底烧瓶中加入3mL甲醇+水（1+1）超声溶解，过Waters HLB柱（waters oasis HLB 6cc/200mg依次用5mL甲醇 5mL水活化），用5mL水淋洗，5mL甲醇洗脱于100mL圆底烧瓶中，40℃减压蒸干，加入1mL乙腈超声溶解。三、仪器分析条件（[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]MS8050）3.1质谱参数：离子源ESI源 Nebulizing Gas Flow: 3 L/min HeatingGas Flow: 10 L/min Interface Temperature 300 ℃；DLTemperature 250 ℃；Heating Block Temperature 400℃ Drying Gas Flow: 10 L/min [table=595][tr][td=1,2]化合物名称[/td][td=1,2]Precursor m/z[/td][td]Product[/td][td]Dwell Time[/td][td]Q1 Pre[/td][td=1,2]CE[/td][td]Q3 Pre[/td][/tr][tr][td]m/z[/td][td](msec)[/td][td]Bias(V)[/td][td]Bias(V) 1[/td][/tr][tr][td=1,3]莫能菌素[/td][td]688.6[/td][td]635.50*[/td][td]100[/td][td]-26[/td][td]-18[/td][td]-28[/td][/tr][tr][td]688.6[/td][td]461.35[/td][td]100[/td][td]-26[/td][td]-26[/td][td]-30[/td][/tr][tr][td]688.6[/td][td]617.5[/td][td]100[/td][td]-26[/td][td]-24[/td][td]-28[/td][/tr][tr][td=1,3]盐霉素[/td][td]773.1[/td][td]431.20*[/td][td]100[/td][td]-28[/td][td]-53[/td][td]-28[/td][/tr][tr][td]773.1[/td][td]531.35[/td][td]100[/td][td]-28[/td][td]-46[/td][td]-36[/td][/tr][tr][td]773.1[/td][td]413.2[/td][td]100[/td][td]-28[/td][td]-53[/td][td]-27[/td][/tr][/table]3.2液相参数： 流动相组成：A: 0.1%甲酸 B: 乙腈；流速：0.35Ml/min；A -10% B -90%恒流分析；进样量：2uL；色谱柱型号：ODS-III 1.6μm四、实验结果及分析4.1线性配制盐霉素、莫能菌素混标（稀释溶剂：乙腈），0.1ug/kg、1ug/kg、5ug/kg、10ug/kg、20ug/kg五个浓度点，仪器分析线性如下：[img=,490,157]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708141016_02_3081717_3.png[/img][img=,490,173]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708141017_01_3081717_3.png[/img]以上实验中，盐霉素、莫能菌素标准曲线R[sup]2[/sup]均大于0.99，各浓度点精密度良好；仪器分析标准品线性、稳定性符合实验要求。4.2选择性选取牛肉样品进行空白、添加回收实验，实验谱图如下：[img=,490,173]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708141019_01_3081717_3.png[/img][img=,490,173]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708141019_02_3081717_3.png[/img]4.3真度对空白牛肉进行前处理，采用空白样品萃取液与溶剂稀释统一标准品标准品，同一浓度下两者峰面积比值的百分比作为真度评价参数，实验结果及谱图如下： [table=386][tr][td]基质类型[/td][td]化合物名称[/td][td]基质稀释标准品[/td][td]溶剂稀释标准品[/td][td]真度（%）[/td][/tr][tr][td=1,2]牛肉[/td][td]盐霉素[/td][td]116,440[/td][td]107,537[/td][td]106.4%[/td][/tr][tr][td]莫能菌素[/td][td]9,845[/td][td]13,312[/td][td]74.0%[/td][/tr][/table]以上实验中牛肉基质对盐霉素无明显基质效应，对莫能菌素产生一定的基质效应，基质效应在70%左右，在可接受范围之内，日常分析准确定量可以做spiked校正。6实验总结本次试验，从前处理、仪器分析、实验分析的真度、精密度、准确度等多项参数验证了此方法的适用性及准确性，可初步满足试验要求，后续继续多基体验证。

先和大家唠唠青霉素酶的主要来源：奶牛每到换季容易发作乳腺炎等疾病，往往通过注射抗生素进行治疗。凡经治疗过的乳牛，其牛奶在一定时期内残存着青霉素，而在原奶收购检测时，抗生素超标会拒收，奶户为了私利会人为添加青霉素分解酶。别小看这东东，个人认为危害大着呢：1.青霉素酶的安全性以及是否可以在食品中添加尚未有定论。2.在分解青霉素后，可能引进其他有害物质。3.这种做法纵容了奶牛饲养过程中抗生素的滥用。（这三条都个人主义的看法仅供参考）一.杯碟法检测原理：采用对青霉素类药物绝对敏感的标准菌株，利用舒巴坦特性抑制β-内酰胺酶的活性，并加入青霉素作对照，通过比对加入β-内酰胺酶抑制剂与未加抑制剂的样品所产生的抑菌圈的大小来间接测定样品是否含有β-内酰胺酶类药物。二.实验试剂与材料1 菌种：藤黄微球菌，对青霉素较敏感，有青霉素存在时藤黄微球菌不会生长繁殖（如图）http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/05/201405231328_500247_2227357_3.jpg2 试剂及药品1）磷酸盐缓冲液（配药)：取8g磷酸二氢钾和2g磷酸氢二钾，用1000ml溶解，121℃高压灭菌15min。2）舒巴坦标准储备溶液：将舒巴坦标准品用磷酸盐缓冲液溶解并定容为10mg/ml。4℃保存，可使用一周。3）舒巴坦标准工作溶液：吸取100ul舒巴坦标准储备溶液到1ml

0.9940。河豚鱼中的8种抗生素和鳗鱼中林可霉素、红霉素、泰乐菌素、吉它霉素方法检出限(LOD)为2.0 μg/kg；鳗鱼中螺旋霉素、竹桃霉素、交沙霉素、替米考星方法检出限(LOD)为5.0µg/kg。回收率在75.4%～124.0%之间。八种大环内酯类抗生素重复性相对标准偏差(RSDr)在1.34%～5.79%之间，再现性相对标准偏差(RSDR)在6.20%～15.27%之间。可以用于河豚鱼和鳗鱼中8种大环内酯类抗生素残留检测的高效液相色谱-串联质谱方法的定性和定量。河豚鱼和鳗鱼在中国有着悠久的食用历史，营养丰富。由于目前中国的河豚鱼和鳗鱼主要是养殖的，在养殖过程中不可避免使用抗生素用于保护鱼体正常生长。养殖用药主要是林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星和泰乐菌素等，该类抗生素通过羟基以苷键与去氧氨基糖或二甲氨基糖缩合成碱性苷，作用于细胞核糖体50 S亚单位，阻碍细菌蛋白质合成，有较强的抗菌活性。曾广泛应用于食用动物作为预防和治疗用药，而通过食用途径进入人体,导致中毒，甚至死亡。世界各国对抗生素药物残留均有严格的限量要求，欧盟已限制在供食用动物中的饲料中使用，中国也有相应的要求。近年来，日本、韩国针对河豚鱼以药物残留为借口相继对中国河豚鱼实行贸易技术壁垒，限制和排斥中国河豚鱼出口。因此，为破解该类壁垒、促进出口，一种高灵敏度的测定河豚鱼和鳗鱼中大环内酯类抗生素的多残留方法是十分必要的。林可霉素等抗生素的吸收光谱多在紫外末端区，缺乏可用的特征紫外吸收区位。已见报道的文献中，主要分析方法有微生物法、荧光光度法、紫外分光光度法、气相色谱、薄层谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法(CE)和液质联用技术LC-MSn法法。在近期的文献报道中，测定大环内酯类残留，样品前处理大多采用缓冲溶液提取合固相萃取技术分析技术，采用液相色谱-串联质谱方法检测。这种技术灵敏度高、选择性和特异性好，能够对低浓度的样品进行很好的定性确认，已经成为食品和环境中污染物定性、定量分析的重要手段。文献报道的测定大环内酯类分析方法多应用于食品和动物产品，未见到同时适用于河豚鱼、鳗鱼的相关检测研究。在参考以上文献的基础上，建立用Tris缓冲溶液提取河豚鱼和鳗鱼中8种大环内酯类抗生素残留，Oasis HLB固相萃取柱萃取、净化，罗红霉素为内标，LC-MS-MS检测河豚鱼和鳗鱼中8种大环内酯类抗生素的新方法。该方法经过4年的推广使用，提取操作简单、回收率稳定、灵敏度高、选择性好，未发现不良反应，林可霉素、红霉素、泰乐菌素、吉它霉素检出限达到2.0µg/kg，鳗鱼中的螺旋霉素、竹桃霉素、交沙霉素、替米考星检出限达到5.0µg/kg，低于国际上该类药物残留限量的检测要求。1 实验过程1.1 主要试剂水，符合GB/T 6682，一级。甲醇、乙腈，色谱纯。甲醇溶液(2+3)。定容液：0.01 mol/L乙酸铵溶液+乙腈(17+3)。tris溶液：依次溶解12.0 g三羟甲基氨基甲烷(tris)和7.35 g氯化钙(CaCl2·2H2O)于1000 mL水中，用盐酸调节pH值为9。标准物质：林可霉素(CAS 7179-49-9)、竹桃霉素(CAS 7060-74-4)、红霉素(CAS 59319-72-1)、替米考星(CAS 108050-54-0)、泰乐菌素(CAS 74610-55-2)、螺旋霉素(CAS 8025-81-8)、吉它霉素(CAS 1392-21-8)、交沙霉素(CAS 16846-24-5)和内标物质罗红霉素(CAS 80214-83-1)，纯度≥95%。2.0 μg/mL标准工作溶液：依次准确称取每种标准物质适量，用甲醇溶解至浓度为1.0 mg/mL的标准储备溶液；将标准储备溶液用甲醇逐步稀释为2.0 μg/mL的标准工作溶液。1.0 μg/mL内标标准溶液：准确称取罗红霉素适量，用甲醇溶解为浓度1.0 mg/mL的内标储备溶液；将内标储备溶液用甲醇逐步稀释为1.0 μg/mL内标标准溶液。测定河豚鱼用基质标准混合工作溶液系列：分别吸取1.0 μL、2.0 μL、5.0 μL、25.0 μL浓度为2.0 μg/mL的标准工作溶液，依次加入到相应的试剂瓶中，再分别加入20.0 μL内标工作溶液，用河豚鱼样品空白提取液定容至1.0 mL。配成内标物浓度均为20 ng/mL，林可霉素、竹桃霉素、红霉素、替米考星、泰乐菌素、螺旋霉素、吉它霉素和交沙霉素分别为2.0 ng/mL、4.0 ng/mL、10.0 ng/mL、50.0 ng/mL的四个浓度水平的测定河豚鱼用基质标准混合工作溶液系列。测定鳗鱼用基质标准混合工作溶液：分别吸取浓度为2.0 μg/mL的林可霉素、红霉素、泰乐菌素、吉它霉素标准工作溶液各1.0 μL、2.0 μL、5.0 μL、25.0 μL和螺旋霉素、竹桃霉素、交沙霉素、替米考星标准工作溶液各2.5 μL、5.0 μL、10.0 μL、25.0 μL，依次加入相应的试剂瓶中，再分别加

动物源性食品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考（氟甲砜霉素）的测定色谱柱：菲罗门 kinetex C18柱（100×2.1mm 2.6um）试剂溶液: 甲醇水（3+7）：300 mL甲醇与700 mL去离子水混匀；乙腈饱和正己烷：乙腈与正己烷等比例混合，取上层；[b]说明：下列所述标准工作液A、B为氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素混合标液[/b]标准中间液：氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素1.0 μg/mL内标中间液：D-CAP 1.0 μg/mL标准工作液[b]A[/b]（25 ng/mL）：吸取1.0 μg/mL标准中间液0.25 mL用30%甲醇水定容至10 mL，混匀(该溶液临用现配)；内标工作液[b]A[/b]（25 ng/mL）：吸取1.0 μg/mL内标中间液0.25 mL用30%甲醇水定容至10 mL，混匀(该溶液临用现配)；标准工作液[b]B[/b](1 ng/mL)：吸取标准工作液[b]A [/b]0.4 mL用30%甲醇水定容至10 mL，混匀 (临用现配)。上机标准曲线:分别移取0、0.1、0.2、0.4、1.0mL标准工作液[b]A[/b]（25 ng/mL），1.0mL内标工作液[b]A[/b]（25 ng/mL）于5个10mL容量瓶中，30%甲醇水定容至刻度，得标液浓度为0、0.25、0.5、1.0、2.5 ng/mL，内标溶度为2.5ng/mL。附：标准曲线配制： 外标中间液：氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素1.0 μg/mL[img=,690,237]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810310617262550_9107_2166779_3.png!w690x237.jpg[/img]样品前处理：准确称样5.00 g(精确至0.01 g)于50 mL离心管中，添加氯霉素内标[sup][/sup]，加入0.5mL氨水，加入5 g 无水Na[sub]2[/sub]SO[sub]4[/sub][sup][/sup]和20 mL乙酸乙酯，用均质器以10000 r/min的速度均质1 min，15 mL乙酸乙酯[color=#ff0000]清洗均质头[/color]，加盖振摇[sup][/sup]，3500 r/min离心5 min，上清液转移至150 mL的棕色梨形瓶中，在40 ℃减压旋转蒸发至干，加入2 mL甲醇水（3+7）和2 mL 乙腈饱和正己烷溶解洗脱，高速离心分层，取下清液，用0.2 μm微孔[color=#ff0000]有机[/color]滤膜过滤，上机测试。[img=,690,393]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810310619102674_6914_2166779_3.png!w690x393.jpg[/img]氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考（氟甲砜霉素）的测定涉及标准汇总、比较见表1：[img=,690,247]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810310621041150_5153_2166779_3.png!w690x247.jpg[/img][b]线性范围、线性方程[/b]分别对氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考标准系列工作溶液进行测定，以标准溶液的浓度(ng/mL)与氘代氯霉素浓度的比值为横坐标，以标准溶液中被测组分峰面积与氘代氯霉素峰面积比为纵坐标，绘制标准曲线或计算回归方程，具体结果见表2。[img=,673,185]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810310636522800_5170_2166779_3.png!w673x185.jpg[/img]氯霉素（0.25ng/mL）、甲砜霉素(2.5ng/mL)、氟苯尼考（氟甲砜霉素）(2.5ng/mL)MRM图：[img=,690,399]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810310626212579_611_2166779_3.png!w690x399.jpg[/img][img=,690,434]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810310626315649_9067_2166779_3.png!w690x434.jpg[/img][img=,657,417]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810310626401955_677_2166779_3.png!w657x417.jpg[/img]鸡肉样品测定MRM图：[img=,689,363]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810310629369622_5025_2166779_3.png!w689x363.jpg[/img][img=,666,443]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810310629457983_2475_2166779_3.png!w666x443.jpg[/img][img=,655,416]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810310629536961_3288_2166779_3.png!w655x416.jpg[/img]鸡肉样品加标氯霉素（0.25ng/mL）、甲砜霉素(2.5ng/mL)、氟苯尼考（氟甲砜霉素）(2.5ng/mL)MRM图：[img=,690,361]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810310633092540_6864_2166779_3.png!w690x361.jpg[/img][img=,682,443]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810310633202300_3044_2166779_3.png!w682x443.jpg[/img][img=,671,425]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810310633330468_2212_2166779_3.png!w671x425.jpg[/img][img=,673,185]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810310638525567_679_2166779_3.png!w673x185.jpg[/img][img=,690,437]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810310639003515_512_2166779_3.png!w690x437.jpg[/img][img=,690,455]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810310639089904_8264_2166779_3.png!w690x455.jpg[/img][img=,690,455]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810310639089904_8264_2166779_3.png!w690x455.jpg[/img][img=,658,289]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810310641135748_6268_2166779_3.png!w658x289.jpg[/img]鸡肉样品加标0.1ug/kg氯霉素提取定量子离子151.9的信噪比：[img=,690,290]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810310644563180_387_2166779_3.png!w690x290.jpg[/img]鸡肉样品加标1.0ug/kg甲砜霉素提取定量子离子184.9的信噪比：[img=,685,303]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810310646330148_451_2166779_3.png!w685x303.jpg[/img]鸡肉样品加标1.0ug/kg氟苯尼考提取定量子离子336.0的信噪比：[img=,690,294]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810310648135100_953_2166779_3.png!w690x294.jpg[/img]注意事项：1、[color=#ff0000]每批样品检测应包含：[/color]标液曲线、试剂空白、样品空白、样品加标、样品。2、加标回收：分别添加1 ng/mL标准工作液[b]B [/b]0.5 mL于空白样品中，氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素相当于0.1 μg/kg水平；3、负离子模式，上机前如响应不够需清洗离子源[color=#ff0000]或增加仪器平衡时间[/color]；4、初测选适用基质的任一样品加标，如遇特殊基质（如饲料、血粉等粉末样品）称1.0 g，其余步骤同肉制品，定量下限与加标水平同时提高为氯霉素1.0 μg/kg，特殊基质应选用该样品做加标回收，复测时做平行样品，如初测浓度过高，复测时应加大曲线范围或者将样品稀释后上机，保证样品浓度在曲线范围内。

随着现代化市场经济的迅猛发展,人们的生活条件得到了改善，对动物源性食品的需求也越来越多，其安全问题也随之越来越重要,其中，氯霉素残留是较为突出的因素之一。那么，氯霉素是什么？其在动物源性食品中的现状又是怎样的呢？动物源性食品 动物源性食品是指来源于动物，可供人类食用的动物产品，包括肉、脂肪、脏器、血液、蛋、奶等。随着国民经济的发展，我国城乡居民的生活水平和健康消费观念的提高，动物源性食品在我国居民食品结构中占有比例越来越大，需求量不断增大，拉动了畜牧业的快速发展。然而，近几年发生的“瘦肉精”“掺假羊肉”“病死猪肉”“三鹿婴幼儿奶粉”等事件使消费者谈“肉”色变，动物源性食品的安全状况已成为当今广受关注的社会话题。氯霉素http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/08/201508251507_562769_2984502_3.jpg 氯霉素为白色针状或微带黄绿色的针状、长片状结晶或结晶性粉末，味苦，易溶于甲醇、乙醇、丙酮，微溶于水，干燥时稳定。氯霉素的化学结构含有对硝基苯基、丙二醇与二氯乙酰胺三个部分， 因其分子中含有一个不游离的氯，故命名氯霉素，其抗菌活性主要与丙二醇有关。 氯霉素是由委内瑞拉链丝菌产生的一种抑菌性广谱抗生素，它通过与核糖体的50s亚单位结合而抑制细菌蛋白质的合成。对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有较好的抑制作用，对立克次体、衣原体也有抑制作用。因其高效廉价，曾在畜牧业中广为应用。然而由于其对造血系统有严重的不良反应，且细菌对氯霉素有发展缓慢的耐药性，所以对其临床应用已经做出严格控制。动物源性食品中氯霉素的现状 国际上对动物源性农产品的兽药残留问题亦广泛关注，世界上许多国家禁止氯霉素使用于生产食品动物,并规定了其在畜产品中的最高残留限量。欧盟、美国等均在其相关法规中规定氯霉素的残留为“零容许量” ,即不得检出。　　我国农业部已将氯霉素从2000年版的《中国兽药典》中删除,作为禁用药品。在2002年底的农业部第235号公告《动物源性食品中兽药最高残留限量》中也明确规定氯霉素禁止使用,在动物性食品中不得检出。现在，氯霉素是动物性农产品的必检指标。动物源性食品中氯霉素的检测 关于动物源性食品中氯霉素的检测，主要使用的标准方法有：GB/T22338-2008《动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》、GB/T20756-2006《可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》、GB29688-2013《食品安全国家标准 牛奶中氯霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》、GB/T18932.19-2003《蜂蜜中氯霉素残留量的测定方法 液相色谱-串联质谱法》等。食品生产企业和销售单位应把动物源性食品中氯霉素的检测作为原料质控和进货采购验证的一项重要指标进行管理，要求供应商出具相关检测报告，必要时可委托有资质的第三方检测机构进行检测。

高效液相色谱串联质谱测定猪肉中新型兽药泰拉霉素摘要 建立了猪肉中新型兽药泰拉霉素的液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS）联用确证方法。样品用甲醇+0.1%磷酸（70:30 v/v）提取，离心后用PCX固相萃取小柱净化，Symmetry®C8色谱柱分离，串联质谱多反应监测(MRM)模式下分析，内标法定量。方法的线性范围为10~500μg/kg，检出限为5.0μg/kg，在10、20和50μg/kg 3个浓度水平进行添加实验，平均回收率为93.1%~105.5%，批内相对标准偏差为1.5%~4.6%，批间相对标准偏差为1.8 %~5.6%。 关键词 高效液相色谱串联质谱，猪肉，泰拉霉素，残留 泰拉霉素（Tulathromycin）是一种新近上市且为动物专用的大环内酯类半合成抗生素，分子式为C41H79N3O12(分子量806)。我国农业部在2008年第957号公告中首次允许泰拉霉素在动物生产中使用。泰拉霉素主要用于放线杆菌、支原体、巴氏杆菌、副嗜血杆菌引起的猪、牛的呼吸系统疾病。具有用量少、一次给药、低残留和动物专用等众多优点。在我国，大环内酯类药物现行使用较为广泛的是泰乐菌素和替米考星，虽然这2种药物在生产中都取得了良好的效果，但随着使用时间的延长，我国很多地区出现了不同程度的耐药性，导致用量不断增大，但治疗效果却在逐步降低 ，而泰拉霉素药效均强于泰乐菌素和替米考星等市场广泛使用的大环内酯类药物。因此，泰拉霉素在畜禽生产中使用前景非常广阔，其残留分析方法研究也显得尤为必要。 目前国内外大环内酯类药物残留检测方法已有ELISA筛选法、薄层色谱法、气质联用法、高效液相色谱和高效液相色谱串联质谱法等众多方法。但泰拉霉素的残留检测方面研究较少，国内尚未见有相关报道。本研究建立了以罗红霉素(C41H76N2O15, 837)为内标的泰拉霉素HPLC-MS/MS方法，方法的定量限为10μg/kg，可以满足国内外有关法规对其残留检测的要求，可为残留监控提供技术支持。1 材料与方法1.1仪器与材料 Waters 2695 Quattro MicroTM API高效液相色谱串联质谱仪（美国Waters公司）；固相萃取仪（美国SUPELCO公司）。 泰拉霉素标准品(Sigma公司)；罗红霉素 (Sigma公司)；乙腈（色谱纯）；甲醇（色谱纯）；其余试剂均为分析纯试剂。PCX固相萃取柱(3 mL, 60 mg，AGELA公司)。1.2标准溶液的配制 泰拉霉素和内标储备液：分别准确称取10mg标准品于10mL容量瓶中，用0.05M K2HPO4/乙腈（75:25，v/v; pH6）定容，混匀后置冰箱冷藏储存，有效期3个月。 标准工作溶液的配制：吸取储备液1mL于100mL容量瓶中并用0.05M K2HPO4/乙腈（75:25，v/v; pH6）定容，再从中吸取1mL于50mL容量瓶中得0.2mg/L，用于添加（置冰箱冷藏储存，有效期2个月）。内标物罗红霉素的添加溶液配制方法同泰拉霉素。1.3样品制备 称取2.0g组织样品于50mL的聚四氟乙烯塑料管中，加入10mL甲醇+0.1%磷酸提取液（70:30 v/v）和50μL内标工作液，匀质1 min后5000rpm转速离心2min，收集上清液过已经分别用3mL甲醇和3mL提取液润洗过的60mg/3mL的PCX小柱，待全部过柱后，再用3mL水、3mL甲醇淋洗，最后用4mL4%的氨化甲醇洗脱，50℃水浴氮气吹干后用1mL流动相定容，进行HPLC-MS/MS分析。1.4仪器分析条件 液相色谱条件：Symmetry®C8 5μm 3.9mmx20mm，流动相：乙腈：0.1%甲酸水溶液=70:30；柱温：30℃，进样室温度15℃，进样量：10μL，流速为0.3mL/min。质谱条件：电离模式：ESI（+）；检测方式：多级反应检测（MRM）；毛细管电压：4.2 KV；锥孔电压：20 V；RF透镜电压：0.2 V；离子源温度：110 ℃；脱溶剂气温度：350 ℃；锥孔气流速：100 L/h；脱溶剂气流速：600 L/h；二级碰撞气：氩气。1.5添加回收率实验 添加回收率实验添加浓度为10、20和50µg/kg，实验步骤同1.3。2 结果与讨论2.1样品的提取和净化 泰拉霉素含3个氨基基团，为弱碱性化合物，易溶于酸性溶液和极性溶剂中，在pH 6~8的水溶液中较稳定，在pH 9条件下均不稳定。对泰拉霉素残留的提取和净化方法的设计主要依据其弱碱性、脂溶性和酸碱不稳定性。本实验比较了4种提取液：乙腈-0.1%偏磷酸（70:30 v/v）、甲醇-0.1%偏磷酸（70:30 v/v）、乙腈-0.1%磷酸（70:30 v/v）、甲醇-0.1%磷酸（70:30 v/v）对泰拉霉素的提取效果。结果表明，甲醇-0.1%磷酸（70:30）提取液对泰拉霉素的提取效果较好，回收率高于其他提取液，故本方法选择甲醇-0.1%磷酸（70:30）为样品提取液。 液-液分配（LLE）和固相萃取（SPE）是大环内酯类药物的2种主要净化手段，其中LLE操作较麻烦且回收率较低、重复性较差，所以本研究采用固相萃取技术净化，并比较了3种SPE净化小柱：SUPELCO C18小柱、Oasis MCX小柱和PCX小柱, 由于Oasis MCX小柱和PCX小柱兼有阳离子交换和疏水作用机制，基于泰拉霉素的弱碱性和脂溶性的理化特性，Oasis MCX小柱和PCX小柱的净化效果好于C18小柱。Oasis MCX小柱和PCX小柱提取效率没有明显差别，但PCX小柱成本低，所以，本方法净化选择PCX小柱。2.2色谱质谱条件的优化[fo

动物源性食品中氯霉素检测的固相萃取方法一、实验目的本研究利用固相萃取法作为样品的前处理方法，LC-MS法作为检测手段。该方法可简化样品的前处理过程，节省有机溶剂的使用，操作简便。 二、实验目标物氯霉素(CAS:56-75-7) 三、应用范围本方法适用于动物源性食品中氯霉素的LC-MS/MS检测及确证。 四、参考标准推荐性国家标准《GB/T 22338-2008动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》 五、实验材料 Biocomma®Silibase™ C18固相萃取柱6mL/1000mg。六、实验方法 1、样品提取 将称取5g试样，精确到0.01g。置于50ml于涡旋具盖离心管中，加入5ml水，于涡旋混合器上快速混合1min，使试样完全溶解。准确加入15ml乙酸乙酯，在振荡器上振荡10min，以3000r/min离心10min，准确吸取上层乙酸乙酯12ml转入15ml的离心管中，置于浓缩吹氮仪在45℃吹扫蒸干，加入5ml水溶解，待净化。 2、SPE柱净化(1)活化：依次采用5mL甲醇、5mL水活化C18固相萃取小柱。(2)净化：将提取液过C18固相萃取柱，待溶液完全流出后，用2×3ml水过柱，然后再用5ml乙腈+水淋洗柱，弃去全部淋出液。用真空泵减压抽干10min。 3、洗脱 用6ml乙酸乙酯洗脱，收集洗脱液于10ml离心管中，于45℃用氮气吹干液吹干，用乙腈+水（2：8，体积比）定容至1ml，供LC-MS/MS上机测定。 4、LC-MS条件色谱柱：Venusil ASBC18（2.1×150mm，5µm，100Å）；质谱仪：API 4000流动相：A:0.1mM乙酸铵溶液（0.1%甲酸） B:甲醇溶液；流速：0.2mL/min柱温：40℃进样体积:5ul离子源：电喷雾（ESI），负离子模式检测方式：多反应监测（MRM）。 表1 质谱仪离子源参数 Source/Gas Collision Gas(CAD) 6 Curtain Gas(CUR) 30 Ion Source Gas 1(GS 1) 50 Ion Source Gas 2(GS 2) 50 Ion Spray Voltage(IS) -4500 Temperature(TEM) 550 Interface Heater(ihe) On 表2 氯霉素及内标的母离子和子离子参数表 物质名称 保留时间（min） 监测离子对 DP EP CE CXP 氯霉素 4.90 320.9/151.9 -60 -10 -25 -12 320.9/256.9 -60 -10 -25 -12 氯霉素-D5 4.90 326.1/157.0 -60 -10 -25 -12 七、实验结果1、10ppb猪肉基质氯霉素添加回收结果平均加标回收率在90%以上，RSD值小于5符合标准要求。 表3 猪肉基质氯霉素添加回收结果 名称 1（%） 2（%） 3（%） 平均回收率（%） RSD（%） 氯霉素 98.31 96.28 90.61 95.07 4.20 2、 空白样品添加氯霉素残留物色谱图http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/08/201508141639_560777_3310_3.jpg