硝基愈创木酚钠标准品

UPLC-MS/MS法测定水果中复硝酚钠残留量本文通过优化质谱参数和色谱条件，考察流动相、提取方法等因素，建立了UPLC—MS／MS测定水果中复硝酚钠残留的分析方法。该方法操作简单，快速，方法灵敏度、回收率及重现性均令人满意。1 材料与方法1.1 材料与试剂对硝基酚钠，邻硝基酚钠和5-硝基愈创木酚钠标准品纯度≥98%；乙腈，甲醇为色谱纯；实验室用水为超纯水；所用试剂除特殊说明外均为分析纯。1.2 仪器UPLC-MS/MS 超高效液相色谱串联质谱仪(QuattroPremier XE) 美国沃特世公司，配电喷雾离子源；电子分析天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司； 1.3 标准溶液的配制准确称取对硝基酚钠，邻硝基酚钠和5-硝基愈创木酚钠标准品(精确至0.1mg)，分别用水溶解制得标准储备液。取各标准储备液适量，用水稀释制得混合标准工作溶液，其中对硝基酚钠、5-硝基愈创木酚钠浓度配制成0.00,0.05，0.10，0.20,0.50,1.00,2.00mg／L，邻硝基酚钠配制成0.00,2.5，5.0，10.0，25.0，50.0,100.0mg/L。该溶液于4℃冰箱内保存。1.4 样品处理称取已匀浆的样品5 g (精确到0.0001 g)，放入具塞150mL碘量瓶内，加人甲醇提取液20mL，盖上玻璃塞，超声振荡5min，过滤，滤渣加入10mL甲醇提取液，超声振荡5min，过滤，滤渣加入lOmL甲醇提取液，超声振荡5min，残渣弃去，合并3次提取液，在提取液中加入10g无水硫酸钠脱水，然后用无水硫酸钠过滤，并用20mL甲醇冲洗，收集滤液在旋转蒸发仪上45℃减压蒸发浓缩近干，用水定容至5mL，过0.22μm滤膜，待测。1．5 仪器操作条件1.5.1色谱条件色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 (4.6 mm ×100mm，1.8 μm)；流动相A：甲醇流动相B：10 mmol／L乙酸铵水溶液。等度洗脱程序：流动相A:60% ;流动相B：40% ；进样量：5 μL；流速：0.2 mL／min；柱温：30℃ 。1.5.2质谱参数离子源：电喷雾离子源(ESI)，采用ESI- 模式；扫描方式：多反应监测(MRM)；毛细管电压（Capillary）：3.5kV；锥孔电压（Cone）：30V；离子源温度(SourceTemp)：110℃；脱溶剂气温度（Desolvation Temp）：450℃；脱溶剂气流量：450L/hr；锥孔气流量：50L/hr；碰撞气流量：0.12ml/min；驻留时间：0.2 S。三种物质的保留时间、母离子、子离子、锥孔电压、碰撞电压和驻留时间见表1。三种物质的总离子流图见图1，5-硝基愈创木酚钠总离子流图和定性离子对图见图2，对硝基苯酚钠和邻硝基苯酚钠总离子流图和定性离子对图见图3.表1 三种物质的保留时间、母离子、子离子、锥孔电压、碰撞电压和驻留时间化合物保留时间min母离子(m/z)子离子 (m/z)锥孔电压(eV)碰撞电压（eV）驻留时间（S）5-硝基愈创木酚钠2.21168.15152.9725150.2123.1225250.2对硝基酚钠2.23138.15108.1230150.292.1830250.2邻硝基酚钠2.83138.15108.1230150.2[fo

做HJ 648 水质中硝基苯类化合物的检测，15种标准品的色谱峰拖尾，DB-1701柱子，30×0.32×0.25，进样口250°，检测器300°，柱子流量1ml，初温50°保持2min.，以每分钟10°升到200°，保持1min.，再以每分钟12°升到250°，保持2min.，换过非极性的柱子OV-101，分离效果更差，请问这里有没有做过这个标准的老师指导一下。[img=,690,322]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/12/201812140954328263_5265_1620184_3.png[/img]

本人对肉粉这种基质复杂的样品进行处理，同时结合硝基呋喃代谢物提取时间长，提取率不高的问题进行优化，最终确定最佳的条件。[align=center][b]肉粉中硝基呋喃代谢物的高速动能前处理方法[/b][/align][align=center]王成梅[/align][align=center]（山东中质华检测试检验有限公司，山东省 济宁市 邮编272000；）[/align][b]摘要：[/b]采用高速动能前处理技术，建立了快速、提取率高、回收率好的肉粉中硝基呋喃代谢物的液相色谱-串联质谱方法。处理后的样品添加同位素内标、酸水解、2-硝基苯甲醛衍生化、乙酸乙酯提取，正己烷除油，采用C18色谱柱进行分离，乙腈-0.002mol/L的乙酸铵为流动相进行梯度洗脱，多反应监测（MRM）模式检测。结果表明，采用高速动能处理过的样品在60℃经过2h衍生后，四种硝基呋喃代谢物在各自的线性范围内线性关系良好，相关系数均大于0.9990；方法的检出限在0.2ug/kg；通过三个低、中、高水平的加标，平均回收率（n=3）为91.7-105.2%，标准偏差小于3.10%。本方法采用一种新型的处理样品的方法，缩短了时间，提高了效率，增加了回收率，适合于基质复杂的肉粉中硝基呋喃代谢物的测定。关键词：高速动能；硝基呋喃代谢物； 肉粉； 液相色谱-质谱方法Quantitative Determination of Four Nitrofuran Metabolites in Meat Meal using high speed kinetic energy pretreatment technology[b]Abstract[/b]：Using high speed kinetic energy pretreatment technology, a method for the simultaneous determinatin of four nitrofuran metabolites in meat meal by liquid chromatography tandem mass spectrometry([url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS)was eatalished.The method has a rapid ,high extraction and recovery rate.The homogenized sample was spiked with isotope inter standards,hydrolyzed withHCl,derivatized with nitrobenzaldehyde,extracted with ethyl acetate,and degreasing by hexane.The analysis was carried out on C18 column by gradient elution with acetonitrile-ammonium acetate as mobile phase,and detected by MS/MS system with positive electrospray ionization under multiple reaction monitoring(MRM)mode.The compounds was identified with retention time and ion ratio and quantified by the internal standard calibration curve isotope dilution technique.After 60℃ derivation,the results showed that the correlation coefficients(R20.9990)of four targets were obtained within their respective linear ranges over dynamic range of 0.2-5μg/L .The average recoveries were ranged from 91.7%-105.2% for the four targets at three spiked levels with the relative standard derivation (RSD,n=6)were under 3.10%.The method was precise and sensitivity,suitable for quantitative and qualitative analysis of four nitrofuran metabolites in meat meal.[b]Key words[/b]:High-speed kinetic energy nitrofuran metabolites meat meal [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS 硝基呋喃类药物是一种光谱抗生素，对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌一及真菌等都有杀菌作用。硝基呋喃类代谢物广泛应用于畜禽和水产养殖，以治疗有大肠杆菌或沙门氏菌引起的肠炎、溃疡病等。硝基呋喃类药物在动物体内半衰期短，但是其代谢物可以和蛋白质紧密结合，残留时间长，甚至于经过高温、微波、烘烤等处理也无法降解[sup][/sup]。研究表明，硝基呋喃类及其代谢物对人体具有致癌、致畸胎副作用，欧盟已于1995年禁止在食用动物中添加硝基呋喃类药物[sup][/sup]，中国卫生部在2010年就将硝基呋喃类药物硝基呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林列入违禁添加物质黑名单。对于硝基呋喃类药物的检测不能反映其在动物性体内真实的情况。目前对于硝基呋喃类药物的检测主要是对其代谢物的检测，主要方法有免疫分析法[sup][/sup]、液相色谱法[sup][/sup]、液相色谱-质谱法[sup][/sup]。液相色谱-质谱法灵敏度和选择性都比较高，对于基质复杂样品的检测具有明显的优势，是目前最常用的检测方法。 细胞的破碎与分离是代谢物的提取和分析中的重要步骤。高速动能处理技术是近一两年发展起来的一种新型的高科技的前处理方法。它通过一种极速的均质技术将鱼粉进行细胞破碎与分离，便于代谢物的提取。 鱼粉是由新鲜鱼类经过酶解或者蒸煮、胶磨、均质、喷雾干燥、过筛等一系列的程序生产的食品配料。其最大的特点是可以溶于水，既保留了天然鱼肉的风味，又富含营养。经过研究表明，鱼粉中粗蛋白的含量在50%以上，粗脂肪10%左右，氨基酸含量在40%-78%左右，其中人体必需氨基酸甘氨酸、精氨酸和脯氨酸含量较高。由于鱼粉在加工的过程中添加盐、防腐剂、增香剂等，导致样品基质复杂，在进行提取检测的过程中会出现分层不明显，油脂含量高等现象，难以保证检测过程中的准确性和灵敏性。目前关于鱼粉中硝基呋喃类代谢物的前处理几乎不涉及对样品的处理，因此建立一种新型的鱼粉高速动能处理技术对于硝基呋喃类代谢物的检测具有重要的研究价值和意义。本文通过高速动能前处理技术，同位素内标法，高温水解衍生快速处理。乙酸乙酯提取，正己烷除油，多重反应检测处理，从而建立一种样品前处理简单、提取速度快、净化效果好、选择性和灵敏度高的鱼粉中硝基呋喃代谢物的新型检测方法。[b]1实验部分[/b]1.1 主要仪器和试剂 Agilent1260-6460液相色谱-质谱联用仪（美国安捷伦公司）；高速动能仪（美国）；Sigma3K15离心机(德国)；IKA RV10旋转蒸发仪(德国)；恒温水浴锅；涡旋混合器XW-80A(中国)；电子天平Secura224-1cn(瑞士)；pH计；Milli-Q去离子水发生器（美国Millipore公司）。 硝基呋喃类药物的标准品；3-氨基-2-唑烷基酮（AOZ）、5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮（AMOZ）、1-氨基-2-内酰脲（AHD）、氨基脲（SEM）以及各自的同位素内标（纯度大于99%，均购至德国Dr.Ehrenstorfer GmbH）；2-硝基苯甲醛；甲醇、乙腈；甲酸铵、甲酸（HPLC级，）；乙酸乙酯、正己烷、四氯化碳、氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾均为分析纯；超纯水（18.2ΜΩ）。1.2 标准溶液的配制 四种硝基呋喃代谢物标准贮备液：准确称取适量的硝基呋喃代谢物标准物质用乙腈配成1.0mg/ml的标准储配液，-18℃冷冻避光保存，有效期为三个月。四种硝基呋喃代谢物混合标准工作液（1.0μg/ml）：取适量的硝基呋喃代谢物的标准贮备液用乙腈稀释成1.0μg/ml的混合工作使用液，-18℃冷藏避光保存，有效期为一个月，使用前回到室温左右。 氘代内标混合液储备液（0.1mg/mL）:分别准确氘代内标物用乙腈溶解，配制成0.1mg/mL的标准储备液，-18℃冷冻避光保存，有效期为6个月。 氘代内标混合工作使用液（1mg/L）：准确吸取一定量的氘代内标混合工作储备液用乙腈稀释成浓度为1mg/L的混合工作使用液，冷藏避光保存，有效期为1个月。 2-硝基苯甲醛衍生溶液：准确称取0.15g 2-硝基苯甲醛，用甲醇定容至10mL,现用现配。1.3 样品的前处理1.3.1 样品的水解和衍生 取一定的样品经过高速动能仪进行60s高速均质破碎。称取1.0g经过高速动能破碎的样品于50ml的离心管中，加入10ml的0.125mol/L的盐酸溶液，涡旋混匀1min，加入100ul2-硝基苯甲醛衍生试剂60℃恒温水浴衍生2h。1.3.2 提取 取出样品，冷却至室温。用2mol/L的氢氧化钠和1mol/L的磷酸氢二钾调节pH值至7.2左右。离心，收集上清液加入15ml的乙酸乙酯震荡30min，离心，转移上清液至另一离心管中，残渣继续用乙酸乙酯提取一次，合并清液。向上清液中加入15ml的正己烷震荡10min，离心，弃去正己烷层，重复上述操作一次。最后收集的清液于40℃条件下旋转蒸发至干，用1ml甲酸（0.2%）2.5ml的液态混合净化剂（正己烷：四氯化碳=1:1）转移至离心管中，超声，涡旋，离心，上清液过0.22μm滤膜过滤上机待测。1.3.3 UPLC色谱条件 Agilent超高效液相色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C[sub]18[/sub](1.8μm,2.1mm×50mm) 柱温：30℃；进样体积：2μL；流速：0.4ml/min；后运行：2min。梯度洗脱条件见下表1[align=center]表1 液相色谱洗脱条件[/align][align=center]Table 1 HPLCgradient elution program[/align][table][tr][td][align=center]时间（min）[/align][/td][td][align=center]A(0.1%甲酸水含乙酸铵)[/align][/td][td][align=center]B 乙腈[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]0[/align][/td][td][align=center]90[/align][/td][td][align=center]10[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]3.0[/align][/td][td][align=center]70[/align][/td][td][align=center]30[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]5.1[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][td][align=center]100[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]8.1[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][td][align=center]100[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]8.2[/align][/td][td][align=center]90[/align][/td][td][align=center]10[/align][/td][/tr][/table]1.3.4 质谱条件 离子源：电喷雾离子源；监测方式：多重反应检测；毛细管电压：4000V；离子源温度：350℃；脱溶剂气压力：40psi；脱溶剂气流量：11 L/min。质谱条件见下表2。[align=center]表2 硝基呋喃代谢物MRM 分析参数[/align][align=center]Table 2 Analysis parameters of nitrofuran metabolites class MRM[/align][table][tr][td][align=center]project[/align][/td][td][align=center]parent ion[/align][/td][td][align=center]Daughter ion[/align][/td][td][align=center]energy/v[/align][/td][td][align=center]fragmentor/v[/align][align=center] [/align][/td][td][align=center]pattern[/align][/td][td][align=center]acceleration voltage/v[/align][/td][/tr][tr][td][align=center] AOZ[/align][/td][td][align=center]236.1[/align][/td][td][align=center]133.8[/align][/td][td][align=center]7[/align][/td][td][align=center]90[/align][/td][td][align=center]positive[/align][/td][td][align=center]3[/align][/td][/tr][tr][td][align=center] AOZ[/align][/td][td][align=center]236.1[/align][/td][td][align=center]103.8[/align][/td][td][align=center]17[/align][/td][td][align=center]90[/align][/td][td][align=center]positive[/align][/td][td][align=center]3[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]AOZ-D4[/align][/td][td][align=center]240[/align][/td][td][align=center]134[/align][/td][td][align=center]7[/align][/td][td][align=center]100[/align][/td][td][align=center]positive[/align][/td][td][align=center]3[/align][/td][/tr][tr][td][align=center] AMOZ[/align][/td][td][align=center]335.1[/align][/td][td][align=center]291.2[/align][/td][td][align=center]6[/align][/td][td][align=center]110[/align][/td][td][align=center]positive[/align][/td][td][align=center]3[/align][/td][/tr][tr][td][align=center] AMOZ[/align][/td][td][align=center]335.1[/align][/td][td][align=center]261.9[/align][/td][td][align=center]12[/align][/td][td][align=center]110[/align][/td][td][align=center]positive[/align][/td][td][align=center]3[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]D5-AMOZ[/align][/td][td][align=center]340[/align][/td][td][align=center]296[/align][/td][td][align=center]8[/align][/td][td][align=center]110[/align][/td][td][align=center]positive[/align][/td][td][align=center]3[/align][/td][/tr][tr][td][align=center] AHD[/align][/td][td][align=center]249[/align][/td][td][align=center]133.9[/align][/td][td][align=center]6[/align][/td][td][align=center]100[/align][/td][td][align=center]positive[/align][/td][td][align=center]3[/align][/td][/tr][tr][td][align=center] AHD[/align][/td][td][align=center]249[/align][/td][td][align=center]104[/align][/td][td][align=center]18[/align][/td][td][align=center]100[/align][/td][td][align=center]positive[/align][/td][td][align=center]3[/align][/td][/tr][tr][td][align=center] AHD-13C3[/align][/td][td][align=center]252[/align][/td][td][align=center]134[/align][/td][td][align=center]7[/align][/td][td][align=center]90[/align][/td][td][align=center]positive[/align][/td][td][align=center]3[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]SEM[/align][/td][td][align=center]209[/align][/td][td][align=center]192[/align][/td][td][align=center]6[/align][/td][td][align=center]90[/align][/td][td][align=center]positive[/align][/td][td][align=center]3[/align][/td][/tr][tr][td][align=center] SEM[/align][/td][td][align=center]209[/align][/td][td][align=center]165.9[/align][/td][td][align=center]9[/align][/td][td][align=center]90[/align][/td][td][align=center]positive[/align][/td][td][align=center]3[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]SEM-C3,15N2[/align][/td][td][align=center]212[/align][/td][td][align=center]168[/align][/td][td][align=center]4[/align][/td][td][align=center]90[/align][/td][td][align=center]positive[/align][/td][td][align=center]3[/align][/td][/tr][/table][b]2结果与分析[/b] 2.1样品处理 鱼粉是一种基质复杂的粉状物质，大多数实验室是不经过样品处理的。硝基呋喃类在体内代谢迅速，代谢的部分化合物分子与细胞膜蛋白结合成结合态，也就是所谓的硝基呋喃代谢物。该代谢物比较稳定可以长期保持稳定状态，从而可以在人体内长期驻留。普通的处理很难将硝基呋喃类药物和蛋白质分离。本实验通过一种新型的高速动能仪是样品在极短的时间可以进行高速的均质使样品高速分散，造成组织和细胞破碎，代谢物的流出，有利于提取。对比经过高速动能处理后的样品的提取率和回收率，数据表明经过处理的样品很少出现乳化现象，提取率也高。本实验采用高速动能处理时间短、提取率高、很大程度避免了基质复杂提取过程中造成的乳化现象，非常适合于鱼粉中硝基呋喃代谢物类的检测。2.2 酸解、衍生化 四种硝基呋喃代谢物分子质量相对比较小，进行[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS分析时，在这个质量轴范围内易受低端分子离子的影响，同时这一段背景干扰比较大，对定性和定量分析造成一定程度的干扰。硝基呋喃代谢物在酸性条件下可以和蛋白质分离加入2-硝基苯甲醛衍生试剂后可以和其结合形成比较大的分子团避开小分子离子的干扰，获得较高的灵敏度和特异性。而衍生需要在一定的温度和时间条件下才可以，目前最常用的是37℃水浴振摇16h，耗时长，出现问题给检测工作造成很大的困扰。本实验对比不同的水浴温度和水浴时间，最终确定最佳条件，节省了检测时间 （见图 1）。[img=,690,349]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707020909_01_2984502_3.png[/img]2.3线性和回收率 在对复杂基质进行[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS分析时常会出现基质效应，影响定量分析的准确性和精明度。本实验采用同位素内标法减少了外标法过程中存在的干扰，使定量变得更准确。分别对0.2μg/L、0.5μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、5μg/L的基质混合标准溶液进行测定，四种硝基呋喃代谢物的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限见下表3。结果表明：四种代谢物线性关系良好，检出限为0.3μg/L，相关系数均大于0.990。分别对低、中和高三个浓度进行加标回收，按照本方法进行提取、衍生和测定，平行测定3此，计算其回收率。采用统一添加水平的样品连续测定6次，计算其稳定性。结果见表4，四种硝基呋喃代谢物的平均回收率在91.7-105.2%之间，相对偏差小于3.10%，该方法适用性良好。[align=center]表3 鱼粉中四种目标物的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限[/align][align=center]Table Linear ranges,regression equations,LODs and LOQs for 4 analytes in samples[/align][table][tr][td]Analyte[/td][td]Linear ranges/(μg/L)[/td][td]regression equations[/td][td]R2[/td][td]LOD/（μg/Kg）[/td][td]LOQ/(μg/Kg)[/td][/tr][tr][td]AOZ[/td][td]0.2~5[/td][td]y=0.822736x-0.006286[/td][td]0.9997[/td][td]0.05[/td][td]0.20[/td][/tr][tr][td]AMOZ[/td][td]0.2~5[/td][td]y=2.515006x-0.022236[/td][td]0.9989[/td][td]0.05[/td][td]0.20[/td][/tr][tr][td]AHD[/td][td]0.2~5[/td][td]y=0.837220x+0.049223[/td][td]0.9997[/td][td]0.20[/td][td]0.50[/td][/tr][tr][td]SEM[/td][td]0.2~5[/td][td]y=2.210855x+0.033769[/td][td]0.9967[/td][td]0.20[/td][td]0.50[/td][/tr][/table][align=center]表4 样品的添加回收和精密度实验数据[/align][align=center]Table 4 Recoveries and repeatabilities for 4 analytes in sample[/align][table][tr][td][align=center]Analyte[/align][/td][td][align=center]Added/(μg/kg)[/align][/td][td][align=center]Recovery/%[/align][/td][td][align=center]RSD/(%,n=6)[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]AOZ[/align][/td][td][align=center]0.20,0.50,1.00[/align][/td][td][align=center]91.7,94.3,97.2[/align][/td][td][align=center]2.34,2.56,2.92[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]AMOZ[/align][/td][td][align=center]0.20,0.50,1.00[/align][/td][td][align=center]92.0,93.1,99.3[/align][/td][td][align=center]2.41,2.85,2.91[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]AHD[/align][/td][td][align=center]0.20,0.50,1.00[/align][/td][td][align=center]94.6,98.7,105.2[/align][/td][td][align=center]2.69,2.19,3.10[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]SEM[/align][/td][td][align=center]0.20,0.50,1.00[/align][/td][td][align=center]82.9,95.9,96.9[/align][/td][td][align=center]2.58,2.34,2.90[/align][/td][/tr][/table][b]3结论[/b] 本方法通过引用一种新型的处理样品的技术高速动能仪，使样品在极短的时间里达到高速分散，不仅可以提高提取率而且避免了后续提取过程中出现的乳化现象。本实验称取经过高速动能仪处理过的样品加入同位素内标，加酸使呋喃代谢物和蛋白质分开，加入衍生剂2-硝基苯甲醛在60℃水浴条件下震荡衍生2h，调pH值，正己烷除油，乙酸乙酯提取，液态净化剂净化，液相色谱-串联质谱分析，建立了检测鱼粉中四种硝基呋喃代谢物的高速动能处理方法。该方法采用一种新型的分散均质技术、优化水解衍生条件，具有耗时短、处理过程简单、提取率高、灵敏度好、检出限低等优点，能够满足国内外对硝基呋喃代谢物限量的要求。

Pe500 进样口:250度，弱极性柱：110度（6分），5度每分到180度（10分）ECD350度分析间硝基氯苯，甲醇做溶剂，用的标准品。图1是甲醇洗针后针的本底图。图2是吸间硝基氯苯溶液上气体后，推针2下，再吸空气的色谱图，应该只有间硝基氯苯的峰啊，怎么在14和29分钟出现两个峰？高手解答！ [img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2008/09/200809031646_106955_1775690_3.jpg[/img][img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2008/09/200809031649_106956_1775690_3.jpg[/img]

动物源性食品中硝基呋喃类药物检测的固相萃取方法一、实验目的本实验利用固相萃取法作为样品的前处理方法，LC-MS/MS法作为检测手段。该方法可简化样品的前处理过程，节省有机溶剂用量。二、实验目标物呋喃唑酮(CAS:67-45-8)，呋喃它酮(CAS:139-91-3)，呋喃西林(CAS:59-87-0)，呋喃妥因(CAS:67-20-9)。三、应用范围本方法适用于动物源性食品中硝基呋喃类药物的LC-MS/MS检测及确证。四、参考文献 推荐性国家标准《GB/T 21311-2007 动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法 高效液相色谱-串联质谱法》。五、实验材料 C8/SAX固相萃取柱200mg/6mL。六、实验方法1、样品前处理 将样品组织搅碎、均质。精确称取约1g(精确到0.01g)样品于15mL带螺盖的离心管中，加入1mL水和8mL甲醇，涡旋混合均匀，2000r/min离心3min(15℃),弃去上清液；加入8mL乙醇，涡旋混合均匀，2000r/min离心3min(15℃),弃去上清液；加入8mL乙酸乙酯，涡旋混合均匀，2000r/min离心3min(15℃),弃去上清液。2、水解和衍生化向质控和样品同待测样品中加入5mL 0.2mol/L的盐酸水溶液、100μL衍生化试剂、以及100μL内标工作溶液(20μg/L)和的混合标准溶液(10μg/L)。盖好盖子，充分振荡混匀，然后放入空气浴摇床，在37℃，200r/min条件下衍生化16h（过夜）。3、样品提取 加入0.3M的磷酸钠水溶液500μL。用试管滴加10mol/L的氢氧化钠溶液，涡旋混合均匀，用精密pH试纸调节pH值至7.0—7.2。9500r/min 离心10min，取上清液。4、SPE柱净化(1)活化：依次以5mL甲醇和5mL纯水预处理。(2)洗脱：上清液全部过柱，流速控制在约每秒1滴。依次以5mL水和5mL 50%甲醇/水溶液淋洗柱子。淋洗液完全通过小柱后，至少抽真空5min。以4mL 4%的甲醇氨洗脱，洗脱液用15mL试管收集。(3)浓缩定容：40℃氮气吹干。残渣以0.05%甲酸/甲醇溶液（9:1，v/v）溶解。溶解液以0.22μm的水相滤膜过滤，滤液可直接用于LC-MS/MS分析。5、LC-MS/MS条件 液相色谱-质谱/质谱仪 色谱柱：C18柱：150mm×2.1mm，2.0μm，或相当者 流动相：甲醇-5mM乙酸铵七、实验结果1、添加回收结果 向样品中加入不同水平的四环素类药物，回收率结果如下：（见表1）表1 动物组织中四环素类药物添加回收结果 样品名称 化合物名称 添加水平（ng/mL） 回收率（%） 猪肉 呋喃唑酮 50 80.75 100 82.58 呋喃它酮 50 89.74 100 90.88 呋喃西林 50 92.74 100 91.28 呋喃妥因 50 95.63 100 96.94 2、 空白样品添加农药残留物色谱图 http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/08/201508141653_560805_3310_3.jpg

[b][b]液相色谱-串联质谱法测定草鱼中硝基呋喃类代谢物AOZ残留量[/b]摘要[/b]: 本文根据农业部783号公告-1-2006水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 液相色谱－串联质谱法来检测草鱼中硝基呋喃类代谢物AOZ的残留。样品经水解、衍生化和净化后，采用多反应监测模式测定。通过化合物的保留时间、定性离子和定量离子的筛查与确证，实现对草鱼中硝基呋喃类代谢物AOZ的定性与定量。结果表明，其线性系数大于0.99，在2.5mg/kg和4.5mg/kg添加水平下，AOZ回收率在95%-100%之间，相对标准偏差(RSD)小于15%。样品经水解、衍生化和净化后，以流动相A:0.002mol/L的醋酸铵溶液,B:甲醇进行梯度洗脱，C18(100mm×2.1mm，i.d,5um）色谱柱分离，采用正离子多反应监测( MＲM) 模式检测，基质匹配标准溶液定量。线性范围内相关系数均大于[color=#ff0000] [/color]0. 99。加标回收率在95.00%-100% 之间，相对标准偏差在6.19%- 8.43% 之间，结果表明，该方法简便、快速、灵敏度高、重现性好，可测定草鱼中硝基呋喃类代谢物AOZ的残留。[b]关键词[/b]: 高效液相色谱 － 串联质谱 硝基呋喃代谢物AOZ 草鱼；[b]Abstract[/b]:In this paper, AOZ residue of nitrofuran metabolites in grass carp was detected by liquid chromatography-tandem mass spectrometry according to the determination of nitrofuran metabolites residues in aquatic products in the ministry of agriculture no.783 bulletin 1-2006. After hydrolysis, derivatization and purification, the samples were determined by multi-reaction monitoring. AOZ, a nitrofuran metabolite in grass carp, was qualitatively and quantitatively determined by retention time, qualitative and quantitative ion screening. The results showed that the linear coefficient was greater than 0.99, the recovery of AOZ was between 95% and 100% and the relative standard deviation (RSD) was less than 15% at the addition levels of 2.5mg/kg and 4.5mg/kg.After the samples were hydrolyzed, derivated and purified, the samples were separated by gradient elution in mobile phase A:0.002mol/L ammonium acetate solution,B: methanol, and separated by C18(100mm×2.1mm, i.d,5um) chromatographic column. Positive ion multireaction monitoring (MRM) mode was adopted for detection, and the matrix matched standard solution quantification. The correlation coefficients in the linear range are all greater than 0.99. The standard recovery was between 95.00% and 100%, and the relative standard deviation was between 6.19% and 8.43%.[b]Key words[/b]:ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry；nitrofuran metabolites-AOZ Grass carp.[b]1 实验部分[/b]1.1 仪器与试剂液相色谱—质谱联用仪( 岛津[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LCMS[/color][/url]-8030) 超纯水系统(WP-UP-YJ-20， 沃特浦) 分析天平(Quintix 2102-1CN,赛多利斯公司)；旋涡混合器（VORTEX 3，IKA公司）；恒温水浴振荡器（江苏安普SHA-C)；离心机（湖南湘仪H-2050R）；甲醇(色谱纯，默克股份两合公司) 醋酸铵( 分析纯，天津市致远化学试剂有限公司)；2-硝基苯甲醛（色谱纯，天津市百世化工有限公司）；二甲基亚砜（分析纯，天津市百世化工有限公司）；磷酸氢二钾（分析纯，天津市百世化工有限公司）；乙酸乙酯（分析纯，天津市泰兴试剂厂）；农药标准物质: 均来自农业部环境保护科研监测所（天津）；实验用水为经沃特浦超纯水系统处理后的超纯水。1.2 [b]样品处理[/b]1.2.1[b] 样品水解与衍生化[/b] 准确称取样品2.0g（精确至 0.01 g） 到50 mL 离心管中，加入0.05mL的100ng/mL混合内标（AOZ-D[sub]4[/sub]），旋涡混合50s，再加入5mL盐酸溶液（0.2mol/L）和0.15mL的2-硝基苯甲醛溶液（0.05mol/L）,涡旋振荡50s后，置于恒温水浴振荡器中37℃避光震荡16h。1.2.2 [b]样品的提取净化[/b]取出离心管冷却至室温，加入3-5mL磷酸氢二钾溶液（1.0mol/L），调节pH至7.0-7.5，加入4mL乙酸乙酯，涡旋振荡50s，4000r/min离心5min，取上层清液转移至10mL玻璃离心管中；再加入4mL乙酸乙酯重复上述操作，合并上清液于40℃下氮气吹干。加入1.0mL甲醇溶液（甲醇：水=5:95（V:V））涡旋振荡溶解残留物，过0.45um滤膜，待测。1.2.3 [b]溶液配制 [/b]（1）[b]标准储备液。[/b] 分别取上述标准品（100.0 ug/mL 溶液），用甲醇稀释成 10 ng/mL 和100 ng/mL的标准储备液。（2）[b]标准工作溶液。[/b] 分别吸取上述标准品10ng/mL的标准储备液0.010mL、0.025mL、0.050mL、0.10mL和100ng/mL的标准储备液0.025mL、0.05mL、0.10mL于7个50mL离心管中，不加样品，按照1.2.1和1.2.2步骤操作，按照1.3测定。1.3 [b]色谱 － 质谱条件[/b]1.3.1 [b]色谱条件 [/b] 色谱柱:C18柱，(100mm × 2.1mm，5μm ) 柱温为40℃；进样量为20μL。流动相：A.0.002mol/L的醋酸铵溶液,B:甲醇 色谱洗脱条件见表 1。[align=center]表 1 高效液相色谱梯度洗脱条件[/align][table][tr][td][align=center]时间，min[/align][/td][td][align=center]A,%[/align][/td][td][align=center]B,%[/align][/td][td][align=center]流速，mL. [/align][/td][/tr][tr][td][align=center]3.5[/align][/td][td][align=center]15[/align][/td][td][align=center]85[/align][/td][td][align=center]0.25[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]5[/align][/td][td][align=center]15[/align][/td][td][align=center]85[/align][/td][td][align=center]0.25[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]5.1[/align][/td][td][align=center]76[/align][/td][td][align=center]24[/align][/td][td][align=center]0.25[/align][/td][/tr][/table]1.3.2[b]质谱条件[/b]离子源: 电喷雾离子源ESI 扫描模式为正离子扫描 雾化气流量3L/min；干燥气流量15L/min；加热块温度250℃；DL温度250℃；CID气230kPa；IG真空度1.9×10[sup]-3[/sup]pa；PG真空度7.5×10[sup]1[/sup]pa；检测方式为多重反应监测。其他质谱参数见表2。 [align=center]表 2 反应监测的质谱采集参数[/align][table][tr][td][align=center]化合物[/align][/td][td][align=center]母离子m/z[/align][/td][td][align=center]子离子m/z[/align][/td][td][align=center]碰撞能量（v）[/align][/td][/tr][tr][td=1,2][align=center]AOZ[/align][/td][td][align=center]236[/align][/td][td][align=center]104[/align][/td][td][align=center]19[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]236[/align][/td][td][align=center]134*[/align][/td][td][align=center]22[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]AOZ-[/align][/td][td][align=center]240[/align][/td][td][align=center]134*[/align][/td][td][align=center]14[/align][/td][/tr][tr][td=4,1]注：*为定量碎片离子[/td][/tr][/table][b]1.4 添加回收实验[/b] 准确称取不含上述药物的草鱼样品2.0g，分别以2.5mg/kg和4.5mg/kg2个水平进行添加回收实验，重复5次，按照上述实验方法测定，计算添加回收率和相对标准偏差。[b]2 结果与讨论2.1线性回归方程[/b]AOZ的基质标准曲线为 y = 0.217700 x -0.000564679( r = 0.9969876，r[sup]2[/sup]=0.9939843) 如图3 [align=center]图3（标准曲线AOZ）[/align][img=图片3 标准曲线,690,367]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/10/201910100829478357_6345_3416090_3.png!w690x367.jpg[/img][b]2.2方法的准确度、精密度[/b]在空白草鱼中分别进行 2.5和4.5 mg / kg 2 个水平的加标回收试验，每个水平重复测定 5 次，计算加标回收率和相对标准偏差。由表 5 可知，在 2.5和4.5mg / kg 2个添加水平下，AOZ的平均回收率分别为 99.648% 和95.63% ，相对标准偏差分别为 8.43% 和6.19%，方法显示出良好的准确度和精密度，可以满足试剂样品中农药残留的检测要求。[align=center]表 5 AOZ在草鱼中的回收率和相对标准偏差[/align][table][tr][td][align=center]农药[/align][/td][td][align=center]添加浓度( mg / kg)[/align][/td][td][align=center]平均回收率( %)[/align][/td][td][align=center]重复 1[/align][/td][td][align=center]重复 2[/align][/td][td][align=center]重复 3[/align][/td][td][align=center]重复 4[/align][/td][td][align=center]重复 5[/align][/td][td][align=center]平均值相对标准偏差( % )[/align][/td][td][align=center]标准曲线[/align][/td][td][align=center]相关系数r2[/align][/td][/tr][tr][td]AOZ[/td][td]2.5[/td][td]99.648[/td][td]2.517[/td][td]2.261[/td][td]2.663[/td][td]2.723[/td][td]2.292[/td][td]8.43[/td][td][align=center]Y=0.217700X-0.000564679[/align][/td][td]0.9939843[/td][/tr][tr][td]AOZ[/td][td]4.5[/td][td]95.63[/td][td]4.223[/td][td]4.768[/td][td]4.043[/td][td]3.870[/td][td]4.613[/td][td]6.19[/td][td][align=center]Y=0.217700X-0.000564679[/align][/td][td]0.9939843[/td][/tr][/table][b]2.3实际样品分析[/b] 用本方法对市场销售的2份草鱼进行硝基呋喃类代谢物AOZ检测，均未检出,见图6。 [align=center]图6[/align][img=图片6,690,366]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/10/201910100830145934_7979_3416090_3.png!w690x366.jpg[/img][b]3、结论[/b]本研究通过对样品前处理方法、质谱条件和色谱条件的优化，建立了液相色谱-串联质谱法测定草鱼中AOZ残留量的分析方法，该方法前处理简单、快速、回收率高，方法的灵敏度、准确度和精密度等均满足农药残留分析的要求，适用于大量样品的快速检测。[b]参考文献[/b]高洁，朱莉萍等.超高效液相色谱-串联质谱法测定多脂肪类动物源性食品中硝基呋喃代谢物. 食品安全质量检测学报2018年第9卷第6期，2018.[b] [/b]

前言在这个版已经混了快半年了！也看到有一些网友说硝基呋喃代谢物很难做，说实在的，开始接手液质没多久就要做硝基呋喃代谢物的期间核查，那时还真的什么都不懂，这个实验到底要怎么做？开始的时候连标线都做不出来，后来没多久才搞明白，标线终于做出来了，但是现在回收率只能算合格！望各位大侠指教。硝基呋喃类药物很不稳定，很容易生成代谢物，由于代谢物比较稳定也有致癌作用，所以在食品安全的检测中检测硝基呋喃代谢物。参考20752-2006的标准= =！本来说好了水产那边要建实验室，我们再也不用做水产品的，但是某些人为了那顿饭，为了装好人把这条巴鱼接回来了，每次来一条鱼我就要做14个样品，悲催！1.左边一排是标准曲线每个管子分别写着要配置的标准曲线的浓度，右边的是我的样品分别写着巴鱼1号，巴鱼2号，因为不是做委托实验我懒所以选择加那么高浓度的+5ng/ml，+5ng/ml*，+10ng/ml，+10ng/ml*http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/08/201308080937_456766_2290585_3.jpg2.好了，偶们去称样了！http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/08/201308081054_456802_2290585_3.jpg3.配置好的甲醇+水（2+1），吸取10ml加入试管中。这时候你会发现，本来透明的鱼肉会有点不透明的，因为蛋白质变性了（我记得有一次貌似没加这东西，过柱的时候出现悲催的情况。）下面内个是一个称好的透明鱼肉、http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/08/201308281059_460448_2290585_3.jpg加入酸化甲醇后http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/08/201308281059_460449_2290585_3.jpg= =！透明的肉肉立马变色，蛋白质变性了！4.加完以后盖上盖子，在漩涡上震荡。5.离心，在这里建议用高速冷冻离心，（1）.鱼肉的纤维很细，时间一长就会松散掉。（2）能使一些脂肪冻结http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/08/201308080937_456770_2290585_3.jpg6.弃去离心完的液体，倒的时候要小心，否则连肉都倒出来！7.每根管里面加入5ml 0.2mol/ml盐酸8.开始加标了！同一时间标准曲线的那点也开始做了算好自己最终需要的浓度，往管里加入标准品！eg：偶最后定容到1ml，由于衍生后的液体，调ph后全部过柱，浓缩定容上机，没有稀释倍数so，把标准品稀释到0.1mg/L，0.5ppb的管内加入5ul，1ppb管中加入10ul，如此类推然后就到均质刀头那打碎。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/08/201308081121_456819_2290585_3.jpg= =！这里地方窄，我们转移阵地！开始打样！http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/08/201308081132_456822_2290585_3.jpg9.再用5ml 0.2mol/ml盐酸冲洗刀头，如果冲洗不干净多加点都无所谓！http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/08/201308081133_456823_2290585_3.jpg10.加衍生剂！---先说说秤衍生剂，我每次秤的时候都不会秤得很准，标准上是0.075g溶于10ml，每次我都是秤到差不多0.9几，衍生剂多了应该没关系，作用是衍生而已嘛，二甲亚砜依然是10ml。好了，关灯作业。每个样品加入0.5ml的衍生剂，标准上是0.3ml，还是内句，加多了没关系！37摄氏度水浴避光衍生。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2013/08/201308081144_456825_2290585_3.jpg[