碱性蛋白胨水

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为什么要用冻干的方法制备稳定的蛋白药物产品？在蛋白药物治疗的早期研发中，有必要设计一种在运输和长期储存期间稳定的配方。显然，水溶剂的液体产品对于生产来说是很容易且经济的，对于终端使用者也是十分方便的。水溶剂的液体产品存在的问题1. 大多数的蛋白以液体状态存在时，易于化学（脱酰胺或氧化）和/或物理降解（聚合，沉淀） 2. 如果严格控制水溶剂蛋白的储存条件，并且对配方进行合理设计，可以减缓其降解，但是在实际的运输过程中，精确控制储存条件通常是行不通的，蛋白会因受到多种应力的作用而变性，包括摇动，高低温，冷冻等 3. 尽管会设计配方和运输条件尽可能规避这些应力导致的损害，但是仍然不能足够阻止在长期储存过程中造成的损害。例如，在某些情况下，尽量减少化学降解的条件会导致物理损伤，反之亦然，那么就无法找到提供必要的长期稳定性的折衷条件。解决方案：冻干配方设计合理的冻干配方，理论上可以解决以上存在的所有这些问题。在干燥的样品中，降解反应可以得到充分的抑制或减缓，蛋白产品在室温状态可以仍然维持其稳定性，保存期可达到数月或数年的时间。而且，在运输过程中，短期的温控偏离，冻干的蛋白样品通常也不会受到损害。即使在两种或多种降解途径需要不同条件才能实现最大热力学稳定性的情况下，干燥产品中反应速率的降低也可以实现长期的稳定性。因此，一般来说，当配方前研究表明在液体配方中不能获得足够的蛋白稳定性时，冷冻干燥提供了颇有吸引力的替代方案。冻干蛋白配方可能遇到的问题然而，相对水针剂产品，只需要简单灌装即可来说，冻干过程较为复杂，且耗时、成本高，再有，一个十分关心的问题，如果配方中没有合适的稳定赋形剂，大多数蛋白制剂在冻干的过程中至少部分会因冻结应力和脱水应力而变性，结果通常是不可逆的聚合，通常是在冻结之后立即聚合或在储存过程中，小部分蛋白分子发生聚合。因为大多数的蛋白药物是非肠道给药，即使只有百分之几的蛋白聚合也是不可以接受的。因此，只是简单的设计一个配方，允许蛋白能承受冻干过程中的应力，但是无法确保冻干后的样品能有长期的稳定性。一个较差的冻干配方，蛋白很容易发生反应，须要求在零度以下储存，这样的配方应当认为是不成功的。本文将提供一些实践的指导，用于配方的设计，可以在冻结和干燥过程中保护蛋白，并且在室温条件下长期储存和运输过程中具有很好的稳定性。再有，会简要地讨论，配方设计须考虑到工艺条件的物理限制，已获得最终低水分含量的良好蛋糕。我们将不讨论冻干工艺的设计和优化，也不会偏离关于赋形剂选择的实用建议，以解决关于这些化合物稳定蛋白质的机制的争论。有丰富经验的药物科学家可能跟这篇文章的内容也没有很大的关系，但是可以将蛋白药物产品推向市场，然而，我们的目标主要是针对对于稳定的冻干蛋白配方设计还不太了解以及具有很大挑战的那些研发人员提供一个很好的开始。 配方设计的主要制约因素有哪些？当合理设计冻干配方时，需要考虑的因素很多，从整体来看，工作会比较复杂，但如果能很好的理解决定最终成功的主要限制因素，那么就会容易很多。01蛋白的稳定性首先记住蛋白产品选择冻干方法的主要原因是其不稳定性，整个配方中最敏感的成分也是蛋白质，那么在配方设计中首要关心的是赋形剂的选择，能够提供蛋白好的稳定性。02最终药物配置在配方研发开始之前，须确定好最终药物的配置，需要考虑的问题包括给药途径（常为非肠道给药），共同给药的其他物质，产品体积，蛋白浓度，冻干盛装容器（西林瓶、预充针或其它）等，如果最终药物需要多次使用，在配方中需要加入防腐剂，这个可能会降低蛋白的稳定性。03配方张力在选择赋形剂时，可能会考虑设计等张溶液，甘露醇和甘氨酸通常是良好的张力调节剂，这些赋形剂经常优于NaCl,因为NaCl具有较低的共晶融化温度和玻璃态转变温度，使得冻干更难进行。另外，如果样品中含有相对低的蛋白量，经常会加入填充剂，避免在冻干的过程中蛋白损失，甘露醇和甘氨酸同时也可以充当这个角色，因为他们会最大程度的结晶并且形成机械强度较高的蛋糕结构。然而，须意识到单独使用晶体类的赋形剂通常不能够在冻干过程和储存期间给蛋白提供足够的稳定性。04产品的蛋糕结构最终冻干的样品须具有优雅的外观结构，较强的机械强度并且没有出现任何塌陷和/或共晶融化，水分残留要相对较低（1g水/100g 干物质），如果产品发生塌陷，不仅外观不能接受，而且会导致样品最终的水分含量较高，复水时间延长。05产品玻璃化转变温度为了确保干燥后蛋白具有长期稳定性，非晶态成分（包含蛋白）的玻璃转化温度要高于计划的储存温度。水是无定形相的增塑剂，需要保持较低的水分含量确保样品的Tg 要高于运输和储存的最高温度。06产品塌陷温度一般来说，达到最终的目标，在整个冻干过程中，需要维持产品温度在其玻璃转化温度以下。在干燥过程中，当冰晶升华时，对于非晶态样品，产品温度须维持在其塌陷温度以下，塌陷温度通常与热致相变温度（也就是最大冻结浓缩无定形相的玻璃态转变温度Tg’）一致，同时，也有必要维持产品温度在任何晶体成分的共晶融化温度以下。在实际中，这些温度可以通过差示扫描量热仪DSC或冻干显微镜来测定。在配方开发中有必要测定产品的塌陷温度。 冻干显微镜Lyostat5及搭配使用的DSC模块为什么要测定塌陷温度？在低于产品的塌陷温度下干燥是需要付出代价的，产品的温度越低，干燥的速度越慢，干燥的成本就越高。通常，在-40℃以下干燥是不实际的，同时样品能降低到的温度还受一些物理条件的限制，比如冻干机的性能以及产品的配方。在配方开发过程中，药物研发人员应该与工艺工程师（设计冻干工艺人员）紧密配合，并且清楚了解放大化生产型冻干机与实验室研发冻干机的区别是非常重要的，通常情况下，生产型冻干机和实验室冻干机在工艺参数控制方面会有所不同，一部分原因是生产型冻干机较大，在冻干过程中每瓶样品的产品温度差异较大。因此，如果对冻干过程熟悉的研发人员可以提供有用的信息帮助配方科学家做出正确的判断，避免由于误判导致将较好的配方排除在外。对于塌陷温度较低的产品，也有一些方法，如可以通过控制过程参数来实现短时快速干燥。配方设计需平衡蛋白稳定性和塌陷温度很明显，配方设计的一个目标是保证蛋白稳定性的前提下提供较高的塌陷温度，产品的塌陷温度主要取决于配方的组成，如果蛋白的含量超过所有溶质的20%，会对Tg’有较大的的影响。尽管单纯的蛋白溶液通常用DSC很难测出Tg’，根据实验得出，增加蛋白含量，对于大多数的配方来说，均可以提高Tg’。通过外推法得到纯的蛋白溶液的Tg’，大约为-10℃，远远高于大多数的单一赋形剂的Tg’(如蔗糖的Tg’为-32℃)，因此，从工艺过程的经济角度考虑，更期望配方中较高的蛋白质和稳定剂比例，然而，蛋白的稳定性通常随着稳定剂与蛋白含量比例的增加而提高，因此须在高的塌陷温度和较好的稳定性方面做出平衡。并且，如下文讨论的内容，随着蛋白浓度的增加，蛋白质在预冻过程中抵抗冻结应力损伤的能力就会得到改善，那么在高蛋白浓度和高稳定剂和蛋白重量比的情况下，稳定性是最好的，这样，就会导致整个配方较高的固形物浓度，给工艺带来困难，总浓度超过10%的配方将比较难冻干。如何改变Tg'？在升华之前对配方进行一些处理可以改变Tg’，如经常使用的退火处理，在退火处理过程中，会从无定形相中移走一小部分成分，如使用甘氨酸作为晶体的填充剂，取决于预冻的方法，可能一部分的甘氨酸分子会保留在样品的无定形相中，甘氨酸具有相对较低的Tg’(-42℃)，因此让甘氨酸尽可能的结晶是非常重要的，这样可以提高样品中无定形相的Tg’，加快干燥，节省成本。对于赋形剂结晶，设计理想完善的方案，可以用DSC模仿冻结和退火工艺的条件来进行，这个方法可以参考Carpenter 和 Chang的文章内容。 在哪些步骤蛋白需要维持稳定性？实际上，从灌装到最终干燥的产品复水，每一步均会对蛋白造成损伤，并且要求配方的成分能够抑制蛋白的降解。在快速处理步骤（如灌装，预冻，干燥和复水等）中，主要的问题通常是物理损害，如低聚物的形成和/或蛋白沉淀；通常，蛋白从液体到固体的转变，相对与减缓化学变化，更多的会减缓蛋白的物理变化的速率，因此，储存过程中的化学降解经常是更严重的稳定性问题。在储存期间或复水时，蛋白也会发生聚合。在预冻和干燥过程中，受到冻结和干燥应力的作用，蛋白的结构很容易遭到破坏，如果在这些过程中，能够抑制蛋白去折叠（变性），那么降解过程就会达到最小化，因此，配方设计主要的关注点就是在这些过程中能够保护蛋白，在干燥后的样品中具有较高的Tg及较低的含水量，能阻止样品内部发生化学反应，更好的保持蛋白的天然性能。01在预冻过程中的蛋白的稳定性特定的蛋白是否易受冷冻破坏的影响取决于许多因素，除了在配方中包含适当的稳定剂外。一般来说，会考虑三个很重要的参数：蛋白浓度，缓冲液的种类以及预冻方法。蛋白浓度增加蛋白质的浓度能够提高蛋白对冻结变性的抵抗力，可以通过简单地测定冻融后蛋白聚合的百分比，该百分比与蛋白质浓度呈反比。通常，如果预冻过程中去折叠的蛋白分子部分与浓度无关，那么预计增加蛋白浓度会增加蛋白聚合。然而，现在人们认为，增加蛋白质浓度会直接减少冷冻诱导的蛋白质去折叠。据推测，冻结阶段的损伤包括蛋白在冰水界面的变性，假设只有有限数量的蛋白分子在这个界面变性，增加蛋白的初始浓度会导致较低比例的变性蛋白。处于实际的目的，将蛋白浓度作为一个重要的考虑因素，在配方开发过程中尽可能保持较高的浓度，就显得特别简单了。缓冲液种类缓冲液的选择也是非常关键，主要引起问题的是磷酸钠和磷酸钾，在预冻和退火过程中，二者的pH值会有明显的变化。对于磷酸钠，其二元碱形式的容易结晶，导致在冷冻样品中，剩余的无定形相中的pH会降到4或更低。对于磷酸钾，其二氢盐结晶后，pH会变到接近9. pH改变的风险以及对蛋白的损害可以通过提高最初的冷却速度，限制退火步骤的时间，降低缓冲液的浓度等来控制，所有这些措施可以降低盐类结晶的机会。快速冷冻，不进行退火也限制了蛋白质在暴露在冷冻状态下的时间。尽管其他的赋形剂能够辅助抑制pH的改变，较好的方法是避免使用磷酸钠和磷酸钾。在预冻阶段pH有较小变化的缓冲液包括柠檬酸盐，组氨酸，Tris溶液等。预冻方法排除由于pH变化造成的问题，在实验中发现，预冻过程中，蛋白质受破坏的程度跟冷却的速率有关系，较快的冷却速度形成的冰晶体较小，冰的比表面积越大，受破坏的程度越大，这个推测是由于蛋白在冰水界面变性导致。冷却的速度通常受冻干机设备本身性能的限制，然而，一些对冷冻敏感的蛋白，即使慢速冷却也会导致其变性。02、在干燥和储存过程中蛋白的稳定性尽管整个蛋白分子在预冻过程中保持了其原有的结构，然而，在后续的脱水干燥过程中如果不加入合适的稳定剂也会面临变性的风险。简单的说，当去除蛋白分子的水合外层时，蛋白质天然的结构便遭到破坏。对多个蛋白的红外光谱研究表明：无合适的稳定剂存在时，在干燥的蛋白样品中，其结构将会遭到去折叠。如果样品迅速复水，损伤的程度（如，聚合百分比）与干燥蛋白质的红外光谱的非天然表现直接相关。因此，降低复水后结构的破坏需要减小预冻和主干燥过程中蛋白结构的去折叠。而且，即使样品立即复水后100%的天然蛋白分子被恢复，干燥的固体中也会有相当一部分去折叠的分子。在复水过程中分子内的再折叠可以主导分子间的相互作用，从而导致聚集，在复水后表现为100%的天然分子。适当的赋形剂可以阻止或至少减轻蛋白结构的去折叠，配方是否成功可以通过红外光谱检查干燥后蛋白的二级结构来立即判断，更重要的是，发表的一些研究显示，干燥样品的长期稳定性取决于干燥过程中天然蛋白的保留量，如果干燥后的蛋白样品存在结构上的去折叠，即使样品在低于其Tg温度以下储存，蛋白也会很快被破坏，因此，红外光谱法可作为蛋白配方的另外一种工具，研发人员可以在冻干后对样品进行检测，确定其结构是否遭到破坏。欢迎先关注我们，下一期内容将继续为大家带来“实用建议：如何合理设计稳定的冻干蛋白配方（二）”，详细分享：蛋白样品冻干的首选赋形剂有哪些、基于成功蛋白冻干配方会导致最终失败的一些细节问题等。莱奥德创冻干技术分享关注“莱奥德创冻干工场“，立即获取冻干线上技术分享内容。基于对于冻干研发的一些考量，莱奥德创创建了金字塔冻干技术分享平台：包含了从冻干理论基础，到配方和工艺开发，再到放大及生产，以及进阶的设备管理和线上线下专题内容分享。内容结合了来自Biopharma的冻干理论指导体系、来自于莱奥德创产品经理及应用工程师的实践经验总结及国内外专家的专题内容。获取方式Step 1：关注公众号 扫码关注莱奥德创公众号Step 2：点击菜单栏“冻干讲堂” Step 3：点击你感兴趣的内容Banner Step 4：开始学习 更多关于冻干技术分享平台的介绍请点击下方阅读：● 冻干免费技术内容获取-莱奥德创金字塔冻干技术分享平台► 点击阅读如果您对上述设备或冻干服务感兴趣，欢迎随时联系德祥科技/莱奥德创，可拨打热线400-006-9696或点击下方链接咨询。译自：《Rational Design of Stable Lyophilized Protein Formulations:Some Practical Advice》 John F.Carpenter,Michael J.Pikal,Byeong S.Chang,Theodore W.RandolpH pHarmaceutical Research, Vol.14,No.8,1997* 如有理解错误之处，还请参考原文关于莱奥德创冻干工场上海莱奥德创生物科技有限公司专注于提供前沿的冻干设备应用和制剂开发相关服务，依托于合作伙伴加拿大ATS集团SP品牌和英国Biopharma Group等的紧密合作，致力于促进中国生物医药技术创新升级，助力中国大健康行业的持续发展。莱奥德创在上海及广州设有实验室，拥有专业的技术团队及国内外专家支持体系。莱奥德创面向生物制药、食品科学等各个领域行业客户，提供冻干研发、放大、委托生产及培训等服务。前期研发● 产品配方特征研究:共晶点温度(Te)、塌陷温度(Tc)、玻璃态转化温度(Tg'、Tg)测定等；● 实验室工艺开发：冻干工艺开发:冻干制剂配方开发，工艺确定，申报材料撰写；● 冻干工艺优化：利用中试冻干机上PAT工具优化及缩短工艺；● 冻干产品质量指标测试：水分含量，冻干饼韧度分析；● 咨询服务：如产品外观问题、产品质量问题、其他troubleshooting等；工艺放大/技术转移● 冻干工艺转移/放大: 远程技术指导+现场服务；● 小批量冻干生产(NON-GMP)，临床一期生产（GMP）；其他业务● 企业小团队线上线下培训服务：冻干原理，工艺开发，设备使用维护等；● 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本篇继上一篇“实用建议：“如何合理设计稳定的冻干蛋白配方（一）”继续为大家分享蛋白样品冻干的理想赋形剂有哪些、基于成功蛋白冻干配方会导致Final失败的一些细节问题等。 》》》对于蛋白样品，理想的赋形剂有哪些？从冻干对蛋白的所有危险以及我们需要在各个环节考虑的所有因素来看，快速开发一个稳定的蛋白配方看起来似乎是不可能的。幸运的是，如果我们能够采用合理的方法对配方进行很好的设计，大多数的配方问题是可以得到快速解决。这里，我们主要是对初始配方成分的选择提供基础。在一些情况下，初始的配方很有可能就是走向市场的Final产品。给定的组分，进行不同微小的修改，已经被成功地用于蛋白药物。需要强调的是对于冻干配方，在能够提供良好稳定性和结构的情况下，成分越简单越好。所加入的赋形剂都须要有数据证明对配方起有益的作用。01给定蛋白质维持稳定性的具体条件对于一些通用型的稳定剂，可以有效地保护绝大多数的蛋白质，在选择这些稳定剂之前，我们有必要通过优化影响蛋白物理和化学稳定性的具体因素来选择合适的稳定剂。影响蛋白物理和化学稳定性的具体因素：1. 避免极端的pH值可以显著降低蛋白脱氨基的几率。而且，通过优化溶液的pH值，可以显著提高蛋白在冻干过程中抵抗去折叠的能力。2. 还应该研究其他能提高蛋白质稳定性的特异性配体（通过增加去折叠的自由能）。肝素和其他聚阴离子对生长因子的稳定性影响就是一个很好的例子。3. 其它需要考虑的重要因素是离子强度对蛋白的去折叠和聚合的影响。须意识到，在预冻过程中，由于冰的形成将溶液浓缩，离子强度可增加50倍。因此负责原料药纯化和做药物配方前研究的人员已经对这些问题有了深刻的认识，配方科学家应该在着手设计冻干配方之前与他们进行沟通。即使在针对蛋白质稳定性优化的特定的溶液条件下，但是如果样品需要幸免于冻干的损害并长期保存，有必要加入一些其它的保护剂。首先，我们考虑一些已经用在冻干蛋白配方中的成分，但它们不能提供蛋白的稳定性，而且可能会促进蛋白在储存期间的破坏。我们将提供一个简单、有效的思路，并且讨论选择这些成分的原理。02不能提供蛋白稳定性的赋形剂部分多聚物作为赋形剂的优缺点在冻干工艺的快速开发过程中，为了获得一个强壮的蛋糕结构，一些多聚物，如葡聚糖，羟乙基淀粉，因具有较高的塌陷温度，导致Final产品的Tg也会比较高，常常是受欢迎的赋形剂。不好的是，这些多聚物在冻干过程中不能抑制蛋白结构的去折叠，因此在后续的储存中不能提供稳定性。无法抑制冻干诱导变性的原因大概是聚合物过大而无法与蛋白质氢键合，无法代替脱水过程中损失的水，或者是因为聚合物与蛋白质形成了分离的无定形相。尽管当这些多聚物单独使用时不是一种很好的稳定剂，但是经证实，如果其结合双糖稳定剂可以具有较好好的作用。冻干过程中的有效稳定剂对大量的化合物进行测定，显示在冻干过程在较有效的稳定剂是双糖，但是避免使用还原性糖。还原性糖在冻干过程中可以有效抑制蛋白结构的去折叠，但是在干燥样品的储存过程中，可以通过美拉德反应（糖的羰基和蛋白质上的游离氨基）降解蛋白，结果形成含有降解蛋白的棕色糖浆，而不是含活性蛋白的白色蛋糕状结构。通常，我们减缓这个过程的方法是将样品储存在零度以下，这就失去了产品冻干的意义，这些还原性的糖包括：葡萄糖，乳糖，麦芽糖，麦芽糊精等。在早期的研究中，晶体类的填充剂如甘露醇，甘氨酸在冻干过程中不能提供蛋白很好的稳定性，但是，一些配方使用了这两种物质的混合物，并且成功地推向了市场。在这些案例中，甘露醇和甘氨酸适当的比例可以导致一大部分的化合物保持无定形状态。这部分无定形状态的化合物足以抑制冻干过程中蛋白的去折叠并且提供长期储存的稳定性。但是建议谨慎选择这种方法，因为达到合适的工艺条件再加上合适的赋形剂比例，既耗时又很难办到的。03赋形剂的合理选择如何合理的选择赋形剂？案例分享举个具体的案例说明，假设：1. 蛋白药物的浓度定在2mg/ml；2. 主要的降解途径是冻干后或复水后蛋白的聚合以及储存期间蛋白的脱氨基；3. 优化具体的条件（如用柠檬酸盐缓冲液控制pH为6）只能将冻干和复水后聚合程度降到10%，尽管样品在低于Tg温度的20℃下进行储存脱氨基速度仍然不能接受。加入晶体类的膨胀剂，如甘露醇，保持样品强壮的结构及良好的外观。在这种情况下，主要缺少的成分是非还原性双糖，其在干燥样品中会与蛋白形成无定形的结构，作为主要的稳定剂，主要选择蔗糖或海藻糖。它们在预冻阶段能够很有效地保护蛋白并且能够很好的抑制复水过程中蛋白结构的去折叠。预冻阶段的保护取决于初始糖的总浓度，有时，超过5%（w/t）的浓度可以尽可能大程度地保持蛋白的稳定性。相反，在干燥阶段，蛋白的保护取决于Final糖和蛋白的质量比。一般来说，糖和蛋白的重量比至少为1:1时，可以提供较好的稳定性，当达到5:1时，可以达到很佳的稳定性。保持蛋白的浓度不变，选取一定范围的糖浓度进行筛选和检测，通过干燥样品中天然结构保留率以及复水后蛋白聚合降低的程度来确定最合适的浓度。一般来说，合适的糖浓度，可以在冻干过程中提供蛋白很好的稳定性，并且如果Final样品的Tg高于储存温度，在后期的储存期间也可以提供蛋白较好的稳定性。例如，假定最高的储存温度为30℃，那么Final产品的Tg ＞50℃应该是稳定的，但前提是Final样品的含水量需要达到允许的水平，因为水分的存在会降低样品的Tg。可以使用DSC检测每种样品的Tg值。蔗糖/海藻糖如何选择？蔗糖和海藻糖，作为两种常用的稳定剂，均有其优势和劣势，可根据不同的情况进行选择：● 在任何水分含量的样品中，海藻糖均会有较高的Tg，因此较为容易冻干。另外Tg ＞50℃的条件可以允许样品有较高的残留水分。然而，技术工程师应该能够针对这两种双糖设计经济有效的工艺。如果样品中蛋白浓度较高，可以提高Tg，这样就会弱化海藻糖的作用；● 与蔗糖相比，海藻糖更能抵抗酸解，双糖水解后会产生还原性的单糖，这是需要避免的。通常情况下，如果pH不是很低，如pH4左右或更低，这个应该不是很大的问题；● 蔗糖在冻干过程中抑制蛋白去折叠方面看似比海藻糖更有优势，当蛋白在预冻阶段非常不稳定（需要较高的糖浓度）和/或蛋白浓度较高时，这种优势更明显。海藻糖的相对不稳定性是由于在预冻和干燥过程中其更易于与蛋白之间产生相分离。对于给定的配方，这是否会有问题不能被预测，因此，每种制剂配方都需要检查其保护蛋白的能力。表面活性剂的作用在这里，我们案例中的配方可能就比较完整了，就像许多蛋白质的情况一样。然而，我们假设，即使蔗糖完全抑制可检测的蛋白质去折叠，正如用红外光谱对干燥固体的结构分析所评估那样，在复水后，仍然有1%的聚合蛋白。因为在原始的样品中是没有任何聚合的，假设在冻干过程中，一小部分蛋白发生了去折叠，在复水后，部分这些分子又重新折叠，但是部分聚合在一起。这个实际上看起来是个很普遍的问题，就像在冻干之前一些处理造成的聚合。幸运的是，通过在配方中加入一些非离子型表面活性剂，如聚山梨醇酯（吐温）通常可以抑制蛋白的聚合。要求的浓度通常比较低（＜0.5% w/v），通过将表面活性剂滴定到包含所有其它组分的冻干制剂中，可以识别出理想浓度。应避免加入过量，因为表面活性剂在室温下是液体的状态，如果浓度较高，会降低配方的玻璃态转变温度。然而，通常在优化蛋白质稳定性所需的非常低的浓度下，不会有问题。表面活性剂看作是画龙点睛，通常在冻干产品配方中加入表面活性剂是有利的，可以抑制处理过程中界面引起的去折叠和聚集（如起泡夹带或瓶-液界面引起的）。最重要的是表面活性剂在冻干/复水过程中抑制聚合的能力，目前还不太清楚表面活性剂的保护在哪一步起作用的。有资料证明，表面活性剂在冻融及复水过程中可减少蛋白聚合并且在预冻阶段有助于抑制蛋白的去折叠，对干燥固体中聚集物特定红外波段的检查表明，表面活性剂可以抑制冻干过程中产生的聚集。在复水过程中，曲折叠分子的聚合能通过表面活性剂得到抑制，猜测是通过分子之间的相互作用和/或作为一种润湿剂，加速冻干产品的溶解。如果显示表面活性剂在复水过程中是有益的，则可以通过在稀释剂中加入表面活性剂来达到这种效果。 》》》还有哪些意想不到的危险可能会导致失败？尽管根据上述给出的建议，对于给定蛋白，我们可以设计出成功的配方，但是，还有其他一些问题可能会导致Final失败，特别是在长期储存期间。● 赋形剂中经常会有一些污染物，这些会导致蛋白快速的化学降解，糖类和甘露醇中会含有过渡金属元素，表面活性剂可能被过氧化物污染，所有的这些可以促进蛋白的氧化；● 在储存过程中，水分从胶塞转移到产品，引起水分参与的降解，直接损坏蛋白，并且降低蛋白的Tg,加速蛋白的降解，特别是当储存温度高于Tg 时；● 即使在高温（如40℃）下的储存稳定性研究中，一切都表现出理想的状态，但有一个常见的，但很少报道的事件可能是灾难性的，这个问题可以用下面的故事来说明。产品在实验室中在40℃下储存可以保持几个月的稳定性，在冬季，产品在运输过程中也保持良好的稳定性，没有来自消费者的问题报告，然而，有时在夏季，运输后，在室温下储存仅2周后发现产品过度降解，用差示扫描量热仪DSC对一开始的干燥粉末进行了检查，给出了合理的解释，结果发现，制剂中的甘露醇没有全部结晶，而是形成了Tg约为45℃的亚稳玻璃态，当在夏季运输过程中，超过了这个温度时，甘露醇变发生结晶，最先与甘露醇结合的水被转移到了剩余的无定形相中，蛋白相的水含量增加，降低了它的玻璃化转变温度，因此，加速了蛋白质的降解。这个问题可以使用DSC设计合理的退火方案使甘露醇再预冻阶段全部结晶来避免，另外也可以通过调整甘露醇的浓度，降低残留水分含量，使甘露醇即使在45℃的条件下也不会结晶。 》》》对于给定的蛋白药物，这些信息足够吗？对于大多数的蛋白，上面给出的建议一般会设计出成功的配方，但是，每种蛋白都有其独特的物理化学特性和稳定性要求。因此，针对每种不同的蛋白，配方也需要自定义设计。结合蛋白本身的特性知识以及选择合理的赋形剂可以快速设计出稳定的冻干蛋白配方。最后，在快速冻干工艺中保持干物质的物理性质和在干燥后获得天然的蛋白质之间需要折衷，研究表明：当蔗糖结合葡聚糖一起使用时，由于蔗糖的作用，蛋白质的天然结构可以保留在干燥的固体中；葡聚糖的存在提高了制剂的Tg，并提供了一种无定形的填充剂，快速干燥的同时保留了所需的蛋糕性质；其他的一些聚合物有可能提供与葡聚糖相同的优势，如羟乙基淀粉也具有较高的Tg，通常比葡聚糖更容易接受用于肠胃外给药。期望可以合理地利用这些多聚物作为Tg的调节剂，使得制剂更稳定，更容易快速冻干。莱奥德创冻干技术分享关注“莱奥德创冻干工场“，立即获取冻干线上技术分享内容。基于对于冻干研发的一些考量，莱奥德创创建了金字塔冻干技术分享平台：包含了从冻干理论基础，到配方和工艺开发，再到放大及生产，以及进阶的设备管理和线上线下专题内容分享。内容结合了来自Biopharma的冻干理论指导体系、来自于莱奥德创产品经理及应用工程师的实践经验总结及国内外专家的专题内容。获取方式Step 1：关注公众号 扫码关注莱奥德创公众号Step 2：点击菜单栏“冻干讲堂” Step 3：点击你感兴趣的内容Banner Step 4：开始学习 如果您对上述设备或冻干服务感兴趣，欢迎随时联系德祥科技/莱奥德创，可拨打热线400-006-9696或点击下方链接咨询。译自：《Rational Design of Stable Lyophilized Protein Formulations:Some Practical Advice》 John F.Carpenter,Michael J.Pikal,Byeong S.Chang,Theodore W.RandolpH pHarmaceutical Research, Vol.14,No.8,1997* 如有理解错误之处，还请参考原文关于莱奥德创冻干工场上海莱奥德创生物科技有限公司专注于提供前沿的冻干设备应用和制剂开发相关服务，依托于合作伙伴加拿大ATS集团SP品牌和英国Biopharma Group等的紧密合作，致力于促进中国生物医药技术创新升级，助力中国大健康行业的持续发展。莱奥德创在上海及广州设有实验室，拥有专业的技术团队及国内外专家支持体系。莱奥德创面向生物制药、食品科学等各个领域行业客户，提供冻干研发、放大、委托生产及培训等服务。前期研发● 产品配方特征研究:共晶点温度(Te)、塌陷温度(Tc)、玻璃态转化温度(Tg'、Tg)测定等；● 实验室工艺开发：冻干工艺开发:冻干制剂配方开发，工艺确定，申报材料撰写；● 冻干工艺优化：利用中试冻干机上PAT工具优化及缩短工艺；● 冻干产品质量指标测试：水分含量，冻干饼韧度分析；● 咨询服务：如产品外观问题、产品质量问题、其他troubleshooting等；工艺放大/技术转移● 冻干工艺转移/放大: 远程技术指导+现场服务；● 小批量冻干生产(NON-GMP)，临床一期生产（GMP）；其他业务● 企业小团队线上线下培训服务：冻干原理，工艺开发，设备使用维护等；● 冻干设备租赁服务。400-006-9696www.lyoinnovation.com莱奥德创冻干工场中国(上海)自由贸易试验区富特南路215号自贸壹号生命科技产业园4号楼1单元1层1002室德祥科技德祥科技有限公司成立于1992年，总部位于中国香港特别行政区，分别在越南、广州、上海、北京设立分公司。主要服务于大中华区和亚太地区——在亚太地区有27个办事处和销售网点，5个维修中心和2个样机实验室。30多年来，德祥一直深耕于科学仪器行业，主营产品有实验室分析仪器、工业检测仪器及过程控制设备，致力于为新老客户提供更完善的解决方案。公司业务包含仪器代理，维修售后，实验室咨询与规划，CRO冻干工艺开发服务以及自主产品研发、生产、销售、售后。与高校、科研院所、政府机构、检验机构及知名企业保持密切合作，服务客户覆盖制药、医疗、商业实验室、工业、环保、石化、食品饮料和电子等各个行业及领域。德祥始终秉承诚信经营的理念，致力于成为优秀的科学仪器供应商，为此我们从未停止前进的脚步。我们始终相信，每一天都在使这个世界变得更美好！

仪器信息网讯，2010年5月15日，蛋白质组数据处理暨全国生物质谱学术交流会”在云南省丽江市召开。会议为期两天，主要讨论了蛋白质组学技术和应用、数据挖掘和生物质谱等方面的现状及其进展。在所有的大会报告中，除一些关于蛋白质组学技术最新研究进展的大会特邀报告外，第一天的专家报告集中讨论了糖蛋白组的最新分析技术与研究进展，第二天的报告集中讨论了蛋白质数据处理技术，包括蛋白质组生物数据库及分析平台的构建、数据统计分析方法的研究等方面。　　作为会议议题的主要内容之一，糖蛋白广泛存在于生物体内，是重要的生物活性物质，具有很多重要功能，关于其的最新研究进展已受到国内外科学家们的高度关注。在本次大会上，南京大学的梁亮博士、美国约翰霍普金斯大学李岩博士、上海交通大学系统生物医学研究院的张延研究员等多位专家学者作了关于糖蛋白最新研究进展的报告，本文对关于糖蛋白研究的部分报告主要内容进行简要报道：　　报告题目：应用糖蛋白质组学和糖组学的方法筛选癌症分子标记物　　报告人：美国约翰霍普金斯大学李岩博士李岩博士　　李岩博士在报告中表示，目前分子标记物研究主要面临的挑战主要是，样品的复杂性与患者的个体差异性，应对其建立高准确度、高灵敏度、高通读、高重复性的分析检测方法。糖蛋白在分子标志物研究中的重要意义，大部分分泌蛋白、跨膜蛋白、和细胞表面蛋白是糖基化蛋白，他们涉及大量的生物学功能，并且，美国FDA已批准的生物标记物几乎全是糖蛋白。　　在其报告中，分别通过糖蛋白质组学糖组学的方法对分子标记物进行了分析比较分析。　　在糖蛋白质组学研究中，其分别采用多维色谱-质谱法(MALDI-TOF/TOF)和SRM-MS对糖蛋白进行了定量检测 在糖组学研究中，其表示，现有的糖组学方法不能用于临床样本检测，而新方法有待确立，李岩博士通过凝集素-抗体反应方法检测了糖的motif在前列腺组织中的表达水平。通过对糖蛋白质组学和糖组学方法的分析比较，其建立了适用于临床的检测方法，对于在前列腺中发现可能的分子标志物选择临床治疗方案有很大的帮助。　　报告题目：用于糖蛋白富集的团队硼亲和方法研究　　报告人：南京大学梁亮博士梁亮博士　　梁亮博士在报告中首先提到，糖蛋白(包括糖肽)的富集是糖蛋白质组学研究中的一个关键科学问题。目前用于糖蛋白富集的主要方法有凝集素亲和法、肼化学法、亲水作用色谱法和硼亲和色谱法等。和其他些方法比较，硼亲和方法虽具有显著的优点，但也有两个明显的缺点：(1)在中性pH下的亲和能力极弱，必须在碱性pH下才能与顺式二羟基化合物结合，这造成了操作上的不便，增加了样品变性的危险 (2)在碱性pH时取代硼酸带负电，与样品及样品基体间存在静电相互作用，因而导致专一性的下降。　　为了同时解决以上两个问题，其科研团队提出了“团队硼亲和”的原理以及相应的方法。该方法要求分子团队成员在分子的另一端带上氨基，通过与环氧开环形成多孔整体材料，分子团队固定到整体材料的表面。该方法只需要一步反应即可制备得到所需的整体柱，操作十分简单，对操作者和环境友好。制备得到的整体柱可以直接应用于生理样品中的核苷等生物分子的专一性富集。最近，其科研团队提出了构建团队硼亲和的另一个绿色化学路线：分子自组装法。分子团队成员在分子的另一端带为噻吩或巯基，利用在金表面的分子自组装，一步反应即可得到团队硼亲和材料。利用该方法，制备了团队硼亲和磁性纳米颗粒和团队硼亲和MALDI靶板，其优异的亲和力和专一性得到验证，成功实现了在中性pH条件下对糖蛋白的专一性富集和纯化。利用团队硼亲和磁性纳米颗粒作为微萃取探针，通过MALDI-TOF MS检测，在生理pH条件下，存在于浓度高100倍的非糖蛋白基体中的糖蛋白能被专一性地萃取。　　报告题目：蛋白质的O-糖基化修饰研究　　报告人：上海交通大学系统生物医学研究院张延研究员张延研究员　　糖链修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰。细胞内50%以上的蛋白质都有糖链修饰。糖链参与了细胞识别、细胞分化、发育、信号传导、免疫应答等各种重要生命活动。按糖链与氨基酸的糖苷键结合方式的不同，真核生物中蛋白质糖基化可分为N-糖基化修饰和O-糖基化修饰，蛋白质的O-糖基化修饰中最主要的O-GalNAc修饰。　　张延研究员通过对O-GalNAc糖基转移酶的糖基化修饰特性进行研究，利用UDP-GalNAc衍生物糖探针的荧光标记技术，结合质谱及多肽蛋白质芯片技术，建立了一种高通量发现蛋白质O-糖基化的新策略。

Ultimate SEC色谱柱是硅胶基质的体积排阻色谱柱，也可以称之为&ldquo 球状蛋白亲水改性硅胶柱&rdquo （中国药典门冬酰胺酶指定色谱柱）。其色谱填料为高纯度、具有良好稳定性的硅胶微球表面键合亲水性聚合物。月旭公司采用特殊的表面修饰技术，确保了该填料具有良好的稳定性和批与批之间的重现性。 Ultimate SEC填料采用独特的化学键合技术，在硅球表面键合了亲水性聚合物以及亲水性二醇基官能团。双重键合机制使水溶性高分子聚合物、蛋白、生物酶、多肽等生物样品的非特异性吸附极小，因而可广泛应用于水溶性聚合物及生物大分子的分离和测定。Ultimate SEC色谱填料的特点1) Ultimate SEC色谱填料由含二醇基官能团的刚性球形硅胶微球表面覆盖亲水性高分子聚合物所组成；2) Ultimate SEC色谱填料内径为5 &mu m或3 &mu m的硅胶微球，能够获得最高的分离效率。3）Ultimate SEC 120 Å 小孔径色谱柱适合分离头孢类等极性目标物；300 Å 适合分离蛋白、多肽等生物大分子；4) Ultimate SEC产品目前有120 Å 、300 Å 、500 Å 和1000 Å 四种孔径规格的色谱柱。Ultimate SEC色谱填料的技术参数Ultimate SEC色谱柱使用注意事项1）使用前，请把色谱柱用纯水冲洗40-60个柱体积，以确保柱填料能够充分被润湿，防止色谱柱在使用过程中造成固定相塌陷；2）色谱柱在用纯水流动相分析时，需要充分地用纯水流动相平衡色谱柱，待基线充分平稳后进样分析；3）由于该类型色谱柱一般用的流动性是纯水相的缓冲盐，因而色谱柱在使用完以后需要用纯水流动相充分冲洗色谱柱，以保证缓冲盐被充分的清除，防止缓冲盐对色谱柱固定相造成的伤害；4）长时间不使用色谱柱时， 该类型色谱柱保存方式类似于常规的色谱柱，即高比例的有机溶剂-水溶液中，一般有机溶剂的比例为90%。Ultimate SEC色谱柱可替代市场上同类型产品1) Ultimate SEC 120 Å 可替代的其他厂家色谱柱有：日本东曹Tosoh公司的TSK gel G2000SWxl、日本昭和电工Shodex公司的 PROTEIN KW-802.5、Sepax SRT SEC-150等；2) Ultimate SEC 300Å 可替代的类型有： 日本东曹Tosoh公司的TSK gel G3000SWxl、日本昭和电工Shodex公司的 PROTEIN KW-803、Sepax SRT SEC-300等；3) Ultimate SEC 500Å 可替代的类型有：日本东曹Tosoh公司的TSK gel G4000SWxl、Sepax SRT SEC-300、日本昭和电工Shodex公司的PROTEIN KW-804；Ultimate SEC型色谱柱性能评价色谱柱：Ultimate SEC(7.8× 300 mm，5 &mu m，300 Å )；流动相：150 mM磷酸盐缓冲溶液，pH 7.0(具体配置方法为：称取17.997 g磷酸二氢钠，用超纯水定容至1000 mL，然后用1 M氢氧化钠调节至所需pH值)；检测波长：214 nm；流速：0.8 mL/min；柱温：室温(25 oC)；进样量：10 &mu L。样品处理方法：四种标准物质的浓度均为1.0mg/mL，解冻至室温后直接进样； 四种标准物质色谱图(1.甲状腺球蛋白；2.牛血清蛋白；3.核糖核苷酸酶A；4.尿嘧啶)

岛津制作所(SSI)近日发布了ATHAP-MALDI基质方法工具包，用于改进对包含跨膜疏水蛋白和多肽的分析能力。传统的LC-MS/MS和MALDI-TOF 很难分析包含疏水基团的膜蛋白。烷基化三羟基苯乙酮(ATHAP)新基质在此方法中发挥了特殊的作用。　　许多疾病的生物标志物是包含疏水基团的膜蛋白。之前用液质和MALDI-TOF的检测效果都不理想，这类蛋白和多肽一般不被目标分析物列表所包含。由于疏水多肽的低溶解性，其难于在液相质谱中得到检测。采用如α -氰基-4-羟基肉桂酸 (CHCA)、芥子酸(SA)、二羟基苯甲酸(DHB)等传统基质的MALDI法离子化效率较低，从而导致用MALDI-TOF检测这些物质灵敏度很差。　　“疏水性是将横跨膜片段整合到脂质双分子层的主要动力。这些新的基质工具包为科学家分析这些重要物质的生物和物理化学性质提供了前所未有的可能性。”岛津公司Scott Kuzdzal博士说。“这些工具包可以提高分析灵敏度，开拓对从抗菌肽到癌症蛋白标志物等关键疏水性分子结构和功能的研究。”　　ATHAP基质由广岛大学和田中耕一尖端科技实验室联合开发，并授权给岛津制作所。本研究得到日本学术振兴会(JSPS) “世界领先创新科技研发资助项目 (FIRST Program) ”的赞助支持。编译：郭浩楠

图1：通过定向固定抗冻蛋白，发现抗冻蛋白的冰结合面和非冰结合面对冰核形成的“janus”效应。图2：分子动力学模拟揭示了抗冻蛋白的冰结合面和非冰结合面上界面水性能具有显著差异，从而提供了抗冻蛋白对冰核形成具有的“janus”效应的分子机制。抗冻蛋白是生活在寒冷区域的生物经过长期自然选择进化产生的一类用于防止生物体内结冰而导致生物体死亡的功能性蛋白质。对于抗冻蛋白抗冻机制的研究有助于揭开冰晶成核、生长和冰晶形貌调控的分子层面的机理。因而，自上世纪60年代首次发现抗冻蛋白以来，科研人员对这类蛋白的抗冻机制进行了近半个世纪的研究。但是，科研人员对抗冻蛋白调控冰晶成核的机制一直有争议，即有些科研人员认为抗冻蛋白能促进冰核的形成，而另一些科研人员认为抗冻蛋白可以抑制冰核的生成。在国家自然科学基金委、科技部和中国科学院的大力支持下，中科院化学研究所研究员王健君课题组与中科院上海应用物理研究所副研究员王春雷、研究员方海平和新疆大学教授马纪合作，根据抗冻蛋白的冰结合面 (ice-binding face)和非冰结合面 (non-ice-binding face)具有截然不同官能团的特性，将抗冻蛋白定向固定于固体基底，选择性地研究了抗冻蛋白冰结合面与非冰结合面对冰核形成的影响。研究表明抗冻蛋白的不同面对冰核的形成表现出完全相反的效应：冰结合面促进冰晶成核，而非冰结合面抑制冰晶成核（图1）。他们通过分子动力学模拟进一步研究了抗冻蛋白的冰结合面和非冰结合面界面水的结构，发现了冰结合面上羟基和甲基有序间隔排列使得冰结合面上形成类冰水合层，从而促进冰核生成；而非冰结合面上存在的带电荷侧链及疏水性侧链，使得非冰结合面上的界面水无序，从而抑制冰核形成。揭示了抗冻蛋白对冰成核“janus”效应分子层面的机制。该研究大大加深了人们对抗冻蛋白分子层面防冻机制的理解，同时对仿生合成防覆冰材料和低温器官保存材料有着重要的指导意义。相关结果发表在《美国科学院院刊》（pnas, 2016, doi: 10.1073/pnas.1614379114）上。

丝素是最早利用的动物蛋白质之一,它作为纤维材料在纺织领域中具有无可比拟的优越性。随着科学技术的进步和人们对蚕丝结构、性质研究的不断深入,丝素在生物材料及医药领域中的应用越来越引人注目。 丝素蛋白可用作手术缝线、隐形眼镜、人工皮肤等,还可以与其他材料混合制作人工肌肉。丝素具有独特的氨基酸组成和丝阮蛋白的二级结构,并且其中部分氨基酸对人体具有保健、医药功效，丝素蛋白作为生物医药材料的研究更加广阔而深入,特别在创面覆盖材料、药物释放材料、活性酶的载体及其生物传感器的应用、生物材料等方面的研究已取得了十分显著的成效。 丝素蛋白冻干粉是丝素蛋白再经技术处理后，通过冷冻干燥技术制备出来的丝素蛋白的冻干态，丝素蛋白冻干粉结构稳定，可溶于水，同时在室温下能长期保存和运输。丝素蛋白冻干粉经水调配后会再次形成丝素蛋白溶液，继而用于生物材料的制备和其他科学研发领域。广泛应用于组织工程、化妆品等领域，本文为您提供专业的应用方法来检测丝素蛋白冻干粉中的水分含量。使用仪器：禾工AKF-2010V智能卡尔费休水分测定仪配置：全封闭安全滴定池组件；铂针电极；滴定池搅拌台；10ul微量注样针；样品称量舟；电子天平（0.1mg）使用试剂：滴定剂：容量法单组份试剂，当量3mg/ml；溶剂：无水甲醇； 实验步骤：使用AKF-2010V水分仪的“吸溶剂”功能向滴定池内注入约40ml的无水甲醇溶剂，再通过”打空白“功能滴定至终点，以去除滴定池内的水分，仪器就绪并保持终点的状态，用经过干燥处理的微量进样针精确抽取5ul的纯水，拭干针头后放入天平称量选择仪器标定仪功能，将纯水注入到滴定池内液面以下，拭干针头后放入天平称量，将前后两次称量只差作为纯水的重量输入到仪器，开始标定。重复操作3-5次，仪器自动保存标定结果并计算出平均值作为试剂的滴定度。用称量舟称取一定量的样品加入滴定池，将进样前后称量舟的重量之差作为样品进样量输入仪器，并开始测量。 结果表明通过使用禾工AKF-2010V直接进样法测量，不但为分析测试人员省去了宝贵的时间，还同样有效的检测出了丝素蛋白冻干粉当中的含水量。

冷冻干燥蛋白酶是在生物制药、生物化学实验和分子生物学研究等领域中常见的操作，该过程能够保留蛋白酶的活性，延长其保存时间。以下是冷冻干燥蛋白酶的一般操作流程：1. 准备工作：选择蛋白酶： 根据实验需求选择合适的蛋白酶，确保其适用于冷冻干燥的过程。准备样品： 准备含有蛋白酶的溶液。注意溶液的浓度和成分，确保其适用于冷冻干燥处理。 2. 冷冻：样品冷冻： 将蛋白酶溶液以合适的体积倒入冷冻盘或其他冷冻容器中，然后放入冷冻设备冷阱室中，确保冷冻过程中样品均匀冷却。冷冻温度： 控制冷冻温度，通常是零下温度，使蛋白酶迅速冻结。 3. 冷冻干燥：转移： 将冷冻的样品迅速从冷阱室内转移到冷冻干燥机的干燥架上。真空抽气： 启动冷冻干燥机的真空泵，建立真空环境，抽除样品中的水分。升温阶段： 开始升温（提供样品中水分升华时所需的热量），使蛋白酶在真空条件下升华，从而去除水分。等温阶段： 在升温后的一定温度下保持稳定，确保样品中的水分充分升华。 4. 收集和存储：冷冻干燥结束： 当冷冻干燥结束后，停止真空，关闭冷冻干燥机。收集样品： 从冷冻干燥机中取出样品。注意避免受潮，尽快妥善保存。存储： 将冷冻干燥后的蛋白酶样品存储在防潮、密封的容器中，最好在-20°C以下的低温环境中保存，以确保长期稳定性。 注意事项：操作过程中要防止样品过度升温，以免影响蛋白酶的活性。确保冷冻干燥机和其他设备的清洁和维护，以保证实验的准确性和重复性。操作过程中要避免样品受到空气湿度的影响，尽量在湿度低的环境中进行。这个操作流程是一般性的指导，具体操作可能因使用的冷冻干燥机型号和蛋白酶种类而略有不同。在操作过程中，请参考设备和试剂的使用说明书，确保按照正确的步骤进行操作。

在翻译后修饰和/或极碱肽的序列分析方面，电子转移裂解（ ETD ）线性离子阱质谱是很有优势的工具。传统的诱导活化裂解（CAD）常用来鉴定蛋白，并试图确定和找到他们修饰的位点，但这种技术有其本身固有的缺点，下面将详细叙述。与线性离子阱的结合使用的ETD是蛋白质组学研究的一个可靠的技术，可以很容易鉴定用CAD不能鉴定的多肽。ETD 是一个相对较新的肽/蛋白质碎裂的技术，能够大大推进质谱鉴定蛋白质这个领域的进步。 翻译后修饰 翻译后修饰（PTM）是翻译后的蛋白质进行的一种化学修饰，是蛋白质生物合成的后续步骤之一。蛋白的分析及其翻译后修饰的分析对于研究许多疾病是非常重要的，如癌症、糖尿病、心血管疾病和神经退行性疾病---阿尔茨海默病。这是因为在蛋白质的合成的过程中以及合成之后，可能发生各种蛋白修饰。对于正常细胞的功能，这些修饰是必须的，但调节这些修饰的变化可能会导致疾病的发生，如阿尔茨海默病，癌症和勃起功能障碍。蛋白质修饰可提高/降低蛋白质的活性，可以与其他蛋白质发生相互作用和将某一蛋白质定位到细胞的特定地方。 翻译后修饰，如磷酸化，乙酰化和甲基化被用作化学开关，激活/灭活组蛋白基因转录调控， DNA复制和DNA损伤修复。组蛋白是染色质的主要蛋白，DNA盘绕时，它们起到线轴的作用，而且在基因调控中发挥重要作用。因此，鉴定这种翻译后修饰是必需的，因为它在生物系统中对于某些蛋白的功能和作用至关重要。 用CAD鉴定蛋白 质谱在确定蛋白及其翻译后修饰上发挥了不可或缺的作用。CAD是一种常见的分析鉴定蛋白质的技术。一般用胰蛋白酶将蛋白质消化成较小的多肽，然后用反相色谱将其分离，并直接注入电喷雾质谱仪检测，通过串联质谱（ MS / MS法）获得序列信息。通过电喷雾电离这些多肽形成几种带电状态的肽离子，而较低带电状态的最适合CAD分析。低能量的CAD串联质谱一直是最常用的分析方法，通过裂解肽离子进行后续的序列分析。 翻译后修饰分析，如磷酸化，磺酸化和糖基化很难用CAD进行分析，因为这些修饰通常是不稳定且容易丢失肽骨架的碎裂信息，从而导致很少或几乎不能得到肽序列和磷酸化位点。利用常规的CAD质谱对于含多个碱性残基多肽测序也是极为困难。 根据不同的蛋白质序列，有时胰蛋白酶会产生过小或过大的肽段。在这种情况下，缺乏可信的序列分析手段。因此CAD对短的，低带电的多肽是最有效的。对于鉴定蛋白和了解蛋白的生物学功能，这是一种广泛使用的方法，然而，限制了研究者分析了所有的肽段，这也阻止多个翻译后修饰位点的检测和了解这些蛋白的生物学功能。 先进的碎裂方式：ETD ETD是基于离子/离子气相化学一种碎裂多肽的新方法。ETD通过从阴离子自由基到质子肽转移电子的化学能量将肽碎裂，这引起多肽骨干的分裂。 ETD产生的骨干肽序列和肽侧链的信息往往与CAD互补。 ETD已成功应用与线性离子阱以及其前身三维离子阱。虽然ETD在三维阱的执行价格具有竞争力且和CAD自身相比提供了独特好处 ，这样的组合并没有提供蛋白质组学分析所需的技术能力。非线性离子阱的ETD，它一直未能很好控制裂解过程，而且由于三维阱离子存储能力的有限不能处理大量的多肽。基于此，研究人员已经提出ETD功能应用于线性离子阱（Thermo Scientific LTQ XL mass spectrometer质谱仪） 。 相对于传统的CAD技术， ETD提供了更稳定的方法来定性PTMs，鉴定大型多肽或甚至整个蛋白质。 ETD能够将普通翻译后修饰的多肽，或者多个碱性残基的多肽甚至整个蛋白质生成离子。 ETD也可以轻易碎裂含有二硫键的的多肽。 ETD是为更复杂的FT-ICR仪器开发相似的裂解技术。使用电子转移试剂，而不是影响肽碎裂的自由电子使ETD在广泛使用的射频四极离子阱中得到应用。射频离子阱质谱仪具有低成本，低维护费用以及更易接受优点，相对于CAD碎裂方法，ETD碎裂技术能够产生更多的产物离子，利于肽段的解读。 ETD的线性离子阱提供了强有力的工具鉴定蛋白及其翻译后修饰 。LTQ XL线性离子阱质谱仪比其他任何离子阱提供更多的结构信息，ETD能够得到常规方法无法得到的序列信息。相比非线性离子阱，ETD的线性离子阱的显著特征在于离子和离子发生反应。虽然ETD功能是完全自动的且通常无需用户干预，但是当需要对离子数进行累积的时候，用户可通过软件完全控制线性离子阱的离子。线性离子阱质谱仪有能力处理大量的样品，并分析低浓度的大分子和小分子。与非线性离子阱的相比，该过程更为复杂和费时 应用实例 在最近的应用中，极碱的多肽和大量重要的翻译后修饰已经用含CAD和ETD线性离子阱质谱分析了。通常CAD碎裂方式产生的普通只显示有限的肽碎裂信息。然而，用ETD碎裂这些多肽的时候， 肽骨架碎裂信息能完全或几乎完全产生，因此得到更广泛的多肽序列的信息。 ETD的灵敏度和稳定性对于蛋白质组学分析是必不可少的。 ETD提供了高度可靠的解决方案，此方案具有用户友好性，几乎不需要日常维护，并提供高度准确的数据，而且ETD的数据分析有相应的软件支持，非常方便简单。 结论： 在蛋白质组学研究领域，ETD的应用对于研究疾病的机理，如癌症，药物开发研究以及细胞功能和信号转导有重大意义，ETD将扩大目前的分析，包括更多的碱性、非胰酶切肽段和蛋白质。它们能确定各种翻译后修饰以及鉴定新的蛋白亚型。 配备ETD的线性离子阱质谱可应用于蛋白质组学各个领域内。ETD的线性离子阱将继续推动蛋白质组学的发展，而且已被证明是替代CAD一种有效技术，而且ETD同样可以应用于非线性离子阱进行肽序列分析。在不久的将来，配备ETD的线性离子阱预计将成为碎裂技术的一种新选择。 参考文献 Leann M. Mikesh et al, The utility of ETD mass spectrometry in proteomic analysis, Biochemica et Biophysica Acta (2006), doi:10.1016/j.bbapap.2006.10.003关于 Thermo Fisher Scientific （赛默飞世尔科技，原热电公司） Thermo Fisher Scientific纽约证交所代码：TMO）是全球科学服务领域的领导者，致力于帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。公司年销售额超过100亿美元，拥有员工约30000人，在全球范围内服务超过350000家客户。主要客户类型包括：医药和生物公司，医院和临床诊断实验室，大学、科研院所和政府机构，以及环境与工业过程控制装备制造商等。公司借助于ThermoScientific和FisherScientific这两个主要的品牌，帮助客户解决在分析化学领域从常规的测试到复杂的研发项目中所遇到的各种挑战。ThermoScientific能够为客户提供一整套包括高端分析仪器、实验室装备、软件、服务、耗材和试剂在内的实验室综合解决方案。FisherScientific为卫生保健，科学研究，以及安全和教育领域的客户提供一系列的实验室装备、化学药品以及其他用品和服务。赛默飞世尔科技将努力为客户提供最为便捷的采购方案，为科研的飞速发展不断地改进工艺技术，提升客户价值，帮助股东提高收益，

冻干可以通过去除样品中的水分，限制分子的流动性，减慢药物成分的物理/化学反应来延长产品的保质期，然而固体状态的配方也不是一直稳定的，由于在干燥过程中，蛋白质暴露在许多应力作用下，在长期的储存过程中，仍然容易发生物理/化学反应。在冻干及储存过程中，我们常常会加入一些稳定剂来保护蛋白免受应力的影响，主要有两种稳定机理来解释：水替代假说和玻璃化假说；但是两种稳定机制都需要将蛋白质分子分散在稳定剂中，使得蛋白质和稳定剂都处于相同的单一无定形相，即不发生相分离。那么相分离是如何发生的？为什么会发生？相分离主要发生在冻干的预冻步骤，在一定程度上取决于冻干的工艺和配方成分。1、相分离的机理 图1：冻干分为三个步骤冻干主要分为三个步骤：预冻，主干燥及次级干燥。（如图1所示）在预冻过程中，溶液被降到一个很低的温度，晶核形成并且生长，样品中的溶质浓度不断浓缩，可以达到初始浓度的约50倍，如果在热力学和动力学上均利于反应发生的条件下，高浓度的溶质可以导致相分离。2、相分离热力学当溶液为成分A 和成分B的混合物，会发生下面的相互作用（如图2所示）。熵和焓之间的竞争决定了相分离的过程。相分离的热力学基于混合物的自由能（弗洛里-哈金斯理论），聚合物由于尺寸大小和连通性，不能充分利用可用体积，大分子量聚合物的熵变化较小，因此，混合物热力学更容易受到较大焓贡献的支配，当ΔGmix 0: 热力学上有利于相分离 (A-A和B-B相互作用优于A-B相互作用)。 图2：溶液A和B发生的相互作用如果相分离是热力学自发以及动力学上利于反应（足够的移动性和时间），蛋白和稳定剂会分离成两个不同的相，富含稳定剂的无定形相以及富含蛋白的无定形相，后者由于缺乏稳定剂的保护，蛋白更易于降解。（如图3所示）图3：蛋白和稳定剂会分离成两个不同的相3、相分离的检测方法无定形-无定形物质的相分离不容易检测，由于检测方法有限，证据不足，目前主要有如下检测方法：检测技术方法局限性调制DSC配方中有多个Tg’表示有多个无定形相通常，富含蛋白的相不能被DSC检测到，因为在Tg’温度下具有较小的ΔCP；要求高浓度的蛋白配方。拉曼成像技术非重叠成分峰的线谱分析范围：2-50微米；不能检出低于检测限的成分波动。固体核磁共振利用弛豫时间来探测2-5 nm, 20-50 nm分子大小物质的混溶性动态实验需要大量的样品。X射线衍射/散射在纳米尺度上探测结构特征对于两个组分，均包含重要的结构层次，无法区分相分离；成本高，动态实验。SEM肉眼观察物质的形态结果会存在模棱两可的现象；需要较大的容易辨认的相。电介质技术依赖于电场中的分子迁移率响应存在不确定性。4、工艺参数对相分离的影响过冷度-----成核温度❖热力学冻结温度和首次成核温度之间的差值为过冷度；（如图4所示）❖较高的成核温度会更易导致相分离；（由于溶质在远高于Tg’温度下进行浓缩） 图4：过冷度冷却速度❖控制达到给定过冷度的速度；❖缓慢的冻结速度会更容易导致相分离；退火❖主要用于填充剂结晶，控制冰晶形态或增加冰晶体的大小，缩短一次干燥时间；❖如果两相热力学更稳定，退火时间和迁移率的增加可能会提供相分离的机会；灌装体积❖较大的灌装体积会对相分离有较大的影响，因为在样品中具有较大的热梯度。案例分享成核温度和冷却速度对相分离的影响对已知的相分离聚合物体系 1:1 PVP29K:DEX10K(100 mg/ml) 进行研究，将冷却台放在拉曼显微镜下进行观察。（如图5所示） 图5：已知相分离聚合物体系在拉曼显微镜下的观察成核温度对相分离的影响 图6：成核温度对相分离的影响与每个单一组分相比，成核温度较高的一组（-5℃）对相分离具有较大的影响；其余的成核温度对相分离影响较小。（如图6所示）冷却速度对相分离的影响 图7：冷却速度对相分离的影响所有的冷却速度均会在一定程度上提高相分离的倾向，但是影响较小。（如图7所示）*结论在没有热历史的情况下，成核温度和冷却速率对相分离的影响较小。成核温度和灌装体积对相分离的影响 图8：成核温度和灌装体积对相分离的影响较大的灌装体积（1ml VS 0.2ml）和较高的成核温度（-5℃ VS -10 ℃）会导致相分离,可能是由于样品内部存在较大的温度梯度。（如图8所示）5、配方成分对相分离的影响在冻干过程中配方成分的兼容性是阻止相分离的关键，如研究表明聚合物体系的不混溶性随着聚合物分子量的增加而增加。对于蛋白而言，相分离的倾向性可能与稳定剂大小，静电相互作用（盐类），稳定剂类型（填充剂、表面活性剂），稳定剂浓度，蛋白质特性（等电点，大小），配方PH值等有关。案例分享——配方组分对相分离的影响❖实验进行了系统的研究，探索蛋白质:糖的比例以及蛋白质(分子量，电荷)和糖(分子量，单糖亚基和长度)的特性如何影响配方在冻干过程中的混溶性。（如图9,10,11所示）❖蛋白质和糖(200mg /mL)的混合物按以下比例(w:w)：蛋白质：糖——0:1,1:9,1:4,1:2.3,1:1.5,1:1,1:5:1,2.3:1,4:1,9:1❖多个Tg’的存在表明存在相分离。 图9 图10 图11实验表明● 在所有的蛋白-糖体系均观察到了相分离现象（两个不同的Tg’），尽管不同的比例出现相分离的时间不同；● 不同蛋白-糖混合物Tg’的宽度不同，有可能多个Tg’会重叠在一起，形成一个较宽的Tg’, 导致无法检测到相分离现象；● 其中在牛血清蛋白和海藻糖混合物中，当二者比例为1:1.5和1:1 时，观察到存在相分离现象；（如图12所示） 图12● 对于蛋白-糖体系中，二者比例从1:2.3 到4:1 均观察到存在相分离现象；（如图13所示） 图13结论● 对于几乎所有被研究的体系中，当配方中蛋白质和糖的比例为1:1和1.5:1时确定会发生相分离现象，这表明蛋白质和糖的比例和系统的相分离倾向之间可能存在相关性；● 在系统的相分离趋势和以下属性之间似乎没有明显的相关性: # 蛋白质电荷/等电点 # 蛋白质分子量 # 糖的分子量 # 单糖亚基；● 在几乎所有研究的配方中，当蛋白和糖的比例为1:1时会发生相分离；● 本研究结果表明，冻干蛋白配方中应加入过量的稳定剂。6、冻干蛋白配方中相分离的重要性● 相分离取决于具体的操作过程和组分；● 在预冻过程中，温度/时间和浓度是关键因素，会影响系统相分离的趋势；● 蛋白和稳定剂的物理化学特性会影响相分离；● 在冻干过程中保护不足会导致长期储藏过程中不稳定性的增加；● 当缺乏稳定剂时，蛋白在干燥过程中会发生改变（即形成反应型结构），这可能会导致储存过程中潜在的稳定性问题；● 需要了解相分离如何影响冻干制剂的保质期；● 相分离检测是稳定性欠佳的指标；● 未检测到的相分离会影响蛋白质稳定性和整体产品质量；● 需要更好的检测方法!当前的方法可以证明样品存在相分离，但不能证明样品不存在相分离。参考文献[1] Padilla,A.M.et.Al.(2011).”The Study of Phase Separation in a Model Polymer Phase Separating System Using Raman Microscopy and a Low-Temperature Stage: Effect of Cooling Rate and

喷雾干燥和冷冻干燥技术在蛋白多肽领域的应用蛋白多肽应用”Bart 的第 100 篇博客文章！在这个很有纪念意义的时间点，Bart 继续对喷雾干燥和冷冻干燥技术在蛋白多肽领域的应用进行剖析，完成他的蛋白多肽三部曲《如何让您的蛋白质配方稳定持久更持久？》和《当你制定蛋白质和多肽配方时，你是“喷雾干燥党”还是“冷冻干燥党”呢？》，让我们一同看看这次 Bart 给我们带来哪些应用干货吧！亲爱的读者们，我简直不敢相信，但我正坐下来写博客的第 100 篇文章!我们在这里涵盖了色谱，旋转蒸发，冷冻干燥和喷雾干燥的主题，我希望我们在接下来的 100 篇文章中继续这样做。由于这是一个有点特别（好吧，非常特别）的帖子，我决定做一些与往常不同的事情。我想和大家分享一下我最近读到的一篇非常有趣的研究论文中的发现，我认为把这篇文章专门献给我们的新成员：喷雾干燥。首先，文献链接如下：文献链接https://www.mdpi.com/2227-9717/9/3/425/htm（Sweeny C, et al. Using Peptidomics and Machine Learning to Assess Effects of Drying Processes on the Peptide Profile within a Functional Ingredient. Processes 2021, 9(3), 425 https://doi.org/10.3390/pr9030425）其次，让我告诉你他们所发现的令人兴奋的事情，是关于冷冻干燥和喷雾干燥对生物活性肽的影响以及为什么你首先应该关注这部分。 高蛋白成分因其在食用时的营养和功能益处而越来越受欢迎。然而，这些蛋白成分及其酶解产物在加工处理中可能会碰到问题，特别是在干燥过程中，因为这一步有可能会导致蛋白质变性和肽聚合。 问喷雾干燥和冷冻干燥是将一种成分转化为粉末的常用方法？提高产品稳定性提供更有效的运输选择 由于减少了水分活性，提高了产品的保质期在之前发布的一篇文章中，我已经解释了喷雾干燥和冷冻干燥的工作原理。但我将在这里再次总结这些技巧：_喷雾干燥 冷冻干燥 工作原理将溶液或悬浮液从液体转化为干燥状态，其中液体悬浮液在热干燥腔体中雾化，蒸发液滴并产生低水分含量的细颗粒水通过升华在低压环境中以冰冻状态被去除 优势快速 简单 制备定制尺寸的颗粒 包埋成分以保护其免受环境影响的可能性 相对便宜 有助于保持多肽的物理化学和生物活性的稳定性技术限制可能导致关键活性物质损失 可能导致原料中存在的营养价值成分损失 会破坏热敏性蛋白 在技术上具有挑战性 相对来说成本更高 实验过程漫长 需要较少的监督和管理 应用推荐适合低成本、高规模生产适用于关注产品稳定性和较小产品体积的应用范畴其他考虑因素包括物化性质，如溶解度、味道、密度和颜色等，需要评估冷冻干燥和喷雾干燥效果，以确定符合最终产品所需的配方。 现在，上面提到的文献中， 研究者使用肽组学和机械学习技术来观察植物蛋白水解物的干燥方法是否会影响肽谱和随后的预测功能。 研究者想要研究冷冻干燥和喷雾干燥技术不仅对样品的物理特性和蛋白质含量有影响，而且还会对肽含量产生影响。生物活性肽是活性成分功能的组成部分。天然多肽具有抗衰老、抗癌、抗炎、抗氧化、降胆固醇等特性。许多多肽物质已被证明具有一种及以上的生物活性。 有趣的是，研究者没有发现喷雾干燥和冷冻干燥制备的产品在肽谱成分和功能上有很大差异。 他们确实指出了他们在自己的研究和现有的科学工作中注意到的不同点，关于冷冻干燥和喷雾干燥对制剂的几个影响差异，包括：影响差异喷雾干燥样品颜色稍深 部分报道称喷雾干燥中随着干燥温度升高热诱导蛋白质聚集(多肽数量减少) 与喷雾干燥相比，冷冻干燥制剂中含有Asp、His 和 Lys 氨基酸的肽有所增加(如先前报道的那样，Lys 在喷雾干燥过程中特别容易受到损害) 制备得到的冷冻干燥制剂稍趋向于链更长、分子量更高、带更多正电荷的肽(可能会考虑到冷冻干燥比喷雾干燥更温和) 与冷冻干燥制剂相比，喷雾干燥制剂所得的是具有更大比例的负电荷肽(通常与喷雾干燥粉末相关的是可能有助于增加粉体溶解度) 冻干制剂制备的多肽所带负电荷略少，为0.24，这与多肽长度、分子量和物理特性的增加相关，可能导致与冻干粉末相关的溶解度降低 当使用生物信息学方法时，预测喷雾干燥的疏水性增加了 1.74%，这可能与喷雾干燥制剂里多肽中疏水氨基酸(Ala, Met, Phe, Pro, Try和Val)的轻微增加有关 根据预测，喷雾干燥和冷冻干燥的抗炎生物活性相当 以上就是冷冻干燥和喷雾干燥一个很好的对比，主要重点针对生物活性成分多肽成分。 下次见！

冷冻电镜（cryo-EM）解析了一种帮助调节血压的蛋白质，即血管紧张素转换酶（ACE）的详细结构。这些结构提供了迄今为止对ACE的最全面的看法，将有助于改善心脏病的药物设计。这项工作是由开普敦大学（UCT）的研究人员与英国同步辐射光源"DIAMOND"的电子生物成像中心（eBIC）合作完成的。研究人员在《EMBO Journal》上发表了他们的研究结果（"冷冻电镜揭示了血管紧张素I转化酶的异构化和二聚化机制"）。ACE会产生激素血管紧张素II，使血管收缩并提高血压。高血压是心脏病和中风的主要风险因素。与以前的方法相比，冷冻电镜使研究人员能够在更多的功能相关状态下观察到ACE。他们的工作为其生物功能和潜在的药物结合特性提供了关键性的见解。ACE蛋白的一个副本（即单体形式）是由两个结构相似但功能不同的结构域连接而成的。二聚体化（即两个ACE单体的相互作用）发生在一个小的表面空腔附近，改变了对ACE功能至关重要的核心氨基酸的构象。研究人员提出，这种二聚体化可能像一个 "关闭开关"，触发蛋白质核心的变化，并可能抑制它。如果能设计出一种类似药物的分子在腔内结合并引起同样的效果，它就能提供一种新的手段来使该酶失活。目前，许多ACE抑制剂在临床上可用于治疗高血压。但这些抑制剂非选择性地针对两个ACE结构域，并因此会在一些患者中引发副作用。开普敦大学教授、该研究的主要研究者Edward Sturrock博士解释说:“了解这些新发现的ACE结构和动态至关重要，这可能针对结构域选择性抑制剂的设计提供新的结合位点，进而规避副作用。”ACE蛋白在Sturrock的实验室生产，在UCT的电子显微镜单元（EMU）进行成像前的准备，并在之后转运到eBIC，在Titan Krios上进行冷冻电镜成像。图像处理在南非的CSIR高性能计算中心（CHPC）和EMU进行。“即使有高分辨率的成像，ACE的独特形状、小分子量和高度动态等特征也带来了许多挑战。"该研究的共同作者之一Jeremy Woodward博士解释道。该研究的第一作者Lizelle Lubbe博士解释说："最近开发的冷冻电镜图像处理方法对解析这些结构至关重要。"我们必须通过广泛的分类来计算分离图像，这一过程相当于' 数字纯化' ，因为生化方法无法分离ACE的单体和二聚体形式。然后，我们可以将三维细化的重点依次放在结构的不同部分，从而解析这两种ACE结构"。该研究的发现独特地揭示了ACE的高度动态特征，以及其不同结构域之间发生二聚体化和交流的机制--这可能启发治疗心脏病的新药。DIAMOND科学组组长克里斯-尼克林博士说：“我们对非洲的杰出科学家团队利用eBIC先进的冷冻电镜取得的这项研究结果感到高兴。世界迫切需要针对致命的心脏病和其他慢性健康状况的可持续解决方案。我们非常高兴的是，这项研究的结构见解可以为改进抗高血压药物设计铺平道路。”相关文献：Cryo-EM Structures of a Key Hypertension Protein to Aid Drug DesignCryo-EM揭示了血管紧张素I转化酶的异构化和二聚化的机制高血压（高血压）是心血管疾病的一个主要风险因素，而心血管疾病是全世界死亡的主要原因。血管紧张素I转化酶（sACE）的体细胞异构体在血压调节中起着关键作用，因此ACE抑制剂被广泛用于治疗高血压和心血管疾病。我们目前对sACE结构、动力学、功能和抑制作用的理解是有限的，因为截短的、最小的糖基化形式的sACE通常被用于X射线晶体学和分子动力学模拟。在这里，我们首次报告了全长的、糖基化的、可溶性的sACE（sACES1211）的冷冻电镜结构。这个高度灵活的apo酶的单体和二聚体形式都是由一个数据集重建的。单体sACES1211的N端和C端结构分别在3.7和4.1Å被解析，而负责二聚体形成的相互作用的N端结构则在3.8Å被解析。此外，观察到两个结构域都处于开放构象，这对设计sACE调节剂有意义。参考资料："Cryo-EM reveals mechanisms of angiotensin I-converting enzyme allostery and dimerization"

潜力巨大的市场背后，是胶原蛋白功效的多次争议，更似乎是厂家们的一场商业忽悠。　　继近日被卷入胶原蛋白“无效”风波后，东宝生物的胶原蛋白产品“圆素”又因未获得“保健食品”(俗称“蓝帽子”)批号而卷入涉嫌虚假宣传漩涡。　　与此同时，市场上胶原蛋白的宣传推广攻势正此起彼伏。贵州百灵(002424.SZ)邀请了章子怡作为形象代言人，东方海洋邀请了赵雅芝，颜如玉邀请了林志玲，LUMI的代言人是杨幂。东宝生物2012年销售费用大增57.79%，为推广胶原蛋白投放了大量广告。　　《第一财经日报》记者查询国家食品药品监督管理总局(下称“CFDA”)保健食品数据库后发现，涉及“胶原蛋白”的国产保健食品产品仅有32个，上市公司的相关产品几乎“全军覆没”。　　九成胶原蛋白产品未获认证　　“实际上，市面的上百个胶原蛋白类产品，其中九成以上都是普通食品。” 广州颜如玉医药科技有限公司董事长谢易麟告诉本报。　　《食品广告管理办法》明文禁止普通食品宣传疗效，普通食品出现医疗术语、易与药品混淆的用语，以及无法用客观指标评价的用语都是违规的。CFDA药品评价中心专家孙忠实表示，有保健品批号的产品尚且不能对适应证、疗效进行描述 作为普通食品，则更无资格在宣传中鼓吹暗示各种功效。　　东宝生物的“圆素”同样是普通食品，因其在天猫和京东商城等官方旗舰店上充斥着“骨骼强健”、“保湿补水”、“延缓衰老”、“淡斑祛黑”、“不只是水嫩肌，更是补骨素”等描述，而被外界质疑涉嫌虚假宣传。　　然而，本报记者近日走访广州多家连锁药店、屈臣氏和广百商场等零售网点后发现，市面上形形色色的胶原蛋白产品，都在打着“保健食品”的擦边球宣传功能。辉瑞中国出品的善存沛优胶原蛋白粉在外包装上宣称“为皮肤真皮层提供养分” 杨幂代言的LUMI液态胶原蛋白宣称“补水保湿、亮白祛黄、紧致毛孔” 昂力莱胶原蛋白片则更为夸张，在外包装上宣传产品主要作用是美白淡斑、预防乳房下垂等。这些产品均未获得“保健食品”批号。　　而此番东宝生物“圆素”之所以涉嫌“虚假宣传”，还因其一份用以佐证胶原蛋白口服产品“美容功效”的“研究报告”《口服骨胶原蛋白改善皮肤生理状况的临床研究》被媒体证实为造假。　　值得注意的是，目前食药总局正在严打保健食品“四非”，其中一项就是非保健食品冒充保健食品及虚假宣传。　　“蓝帽子”需苦候三年　　申请胶原蛋白类产品“蓝帽子”并非易事。广州金康连锁药房有限公司董事长郑浩涛告诉本报，由于国内保健食品法规不健全，所有在国外获得保健食品资质的进口产品在国内均无法获得健字号，所以像日本FANCL、美国自然之宝的胶原蛋白产品在国内无法申请“蓝帽子”。　　贵州百灵市场部一位前员工向本报透露，一开始贵州百灵“爱透”胶原蛋白口服液也想申请健字号，但他们发现要做很多验证，至少要花两三年时间，这与当时公司高层快速打开胶原蛋白市场的意愿不符合，所以没有申请。　　而谢易麟则对本报称，颜如玉从2007年就开始申请保健食品资质，2010年获批，花了整整三年时间。　　据谢易麟介绍，胶原蛋白类产品申请“蓝帽子”首先有很高的技术门槛，原料必须符合海洋鱼皮低聚肽分子量1000道尔顿以下的国家标准，这一点代表优质原料的可吸收性，但多数厂家无法达到。　　其次，申请健字号的胶原蛋白产品，需要经过严格的动物、人体试验证明其安全性和有效性，在批准的功能上也有严格的限制。　　东宝生物董秘刘芳称，公司长期重点发展胶原蛋白的计划不会因此次舆论针对胶原蛋白的质疑而改变。但连日来的质疑已经让东宝生物的股价持续走低，昨日跌幅达5.26%，报收11.16元。

原位变温低场核磁共振系统用于抗冻蛋白分子动力学分析什么是抗冻蛋白？抗冻蛋白是一种能抑制冰晶生长的蛋白质或糖蛋白质.自二十世纪发现以来,研究对象先后从极区鱼类,昆虫,转移到植物材料上。抗冻蛋白是生活在寒冷区域的生物经过长期自然选择进化产生的一类用于防止生物体内结冰而导致生物体死亡的功能性蛋白质。对于抗冻蛋白抗冻机制的研究有助于揭开冰晶成核、生长和冰晶形貌调控的分子层面的机理。抗冻蛋白生长机制的模型抗冻蛋白吸附在冰晶表面,通过EAFC3效应抑制其生长.机制的模型为:一般晶体的生长垂直于晶体的表面,假如杂质分子吸附于冰生长通途的表面,那么需要在外加一推动力(冰点下降),促使冰在杂质间生长.由于曲率增大,使边缘的表面积也增加.因表面张力的影响,增加表面积将使体系的平衡状态发生改变,从而冰点降低。通过对抗冻植物抗冻活性的研究,认为抗冻植物形成了一种特殊的控制胞外冰晶形成的机制,即抗冻蛋白和冰核聚物质的协同作用.在植物体内,热滞效应并不明显,而冰重结晶抑制效应显著.吸附抑制学说是否适应于植物有待于进一步的证实.原位变温低场核磁共振系统用于抗冻蛋白分子动力学分析原位变温低场核磁共振系统是指可以实现在线原位改变样品温度，并在设置温度下对样品进行原位测量的低场核磁共振系统。该系统可同时实现弛豫分析和磁共振成像功能。传统的低场核磁共振系统是常温测试系统，测试过程中样品的温度保持与实验室温度（环境温度）一致，检测到的数据与样品在室温下的特性相关。而原位变温低场核磁共振系统可对样品进行程序控温（高低温），并进行原位检测，可研究不同温度下样品的特性。可对样品进行冷冻过程、干燥过程、蒸煮过程、样品冰点、食品变性过程等相关研究。 原位变温低场核磁共振系统是在常规低场核磁共振系统上加配了变温探头、控温硬件以及控温软件。系统样机如下图：

在世界经济论坛发布的《2023年十大新兴技术报告》中，空间组学被评选为未来最有潜力对世界产生积极影响的十大新兴技术之一。这标志着空间组学不仅在科研领域取得了显著成果，更有望为医学、农业等多个领域带来革命性的突破。在这一技术浪潮中，景杰生物以其卓越的科研实力和前瞻性的战略布局，成为空间蛋白质组学领域的佼佼者。自2021年6月首次推出空间蛋白质组以来，景杰生物不断对技术与体系进行全面优化，一次次刷新着空间蛋白质组学的研究边界。如今，景杰生物再次重磅推出“全息空间蛋白质组学”，为空间蛋白质组学研究提供了更为强大的工具。全息空间蛋白质组学依托于景杰生物创新的10X Proteomics平台，该技术能够支持组织微环境的全覆盖高深度蛋白质组空间检测。在实验中，景杰生物研发团队选择了癌症石蜡样本，运用全流程的先进仪器设施，如徕卡冷冻切片机、数字玻片扫描系统和蔡司激光捕获显微切割仪，进行一站式操作。经过烤片、脱蜡、复水、HE染色等一系列步骤后，成像技术精准定位目标区域，并进行无间隔地切割取样。酶解后使用Orbitrap Astral / timsTOF 最新款高性能质谱平台进行蛋白质组学检测，从而得到与组织微环境图像匹配的全覆盖空间蛋白质组学数据。通过对目标区域进行全覆盖检测，得到了带有空间位置信息的100份蛋白质组学数据，每份数据对应精细组织，无间隔地构成了“全息”的空间蛋白质组学数据集。这些数据集共检测到5500多个蛋白，平均每个样本可检测到4100多个蛋白，是目前最大最全面的全息空间蛋白质组学数据集之一。对于全息空间蛋白质组学得到的庞大数据集而言，如何有效地利用生信分析手段进行挖掘和展示是大家的重要关注点。为此，景杰生物生信和人工智能团队借鉴空间转录组的分析经验，针对全息空间蛋白质组学开发了一系列工具，帮助我们“看得见、挖得深、画得漂亮、画得清晰”。通过以上数据分析方案，可实现与空间转录组学类似的：全息空间样本点无监督聚类分析、类间差异分析/差异蛋白功能注释、单个差异蛋白空间可视化、基于清晰的组织病理特征注释和指定病理分组差异分析、基于反卷积等算法注释细胞类型得分/比例等等个性化分析。相信这样一套分析的组合拳，一方面可以将蛋白信息清晰还原到组织空间微环境中，另一方面也可以与临床病理信息精准结合，定会成为空间蛋白质组学研究的标杆，加速精准医学和基础研究。随着本次全息空间蛋白质组学发布，景杰生物已搭建成全球首个结合空间蛋白质组学、空间磷酸化修饰组学以及全息空间蛋白质组学的一站式空间组学平台。包含了既可以满足个性化选取不规则点位进行蛋白质组精准检测的空间蛋白质组学，又可以进行个性化选取不规则形状点位进行磷酸化修饰精准检测的空间磷酸化修饰组学，本次又实现对组织微环境进行高分辨率全覆盖式蛋白质组精准检测的全息空间蛋白质组学，满足蛋白质组研究的多项需求，为空间蛋白质组学研究提供更多选择。展望未来，全息空间蛋白质组学将在癌症研究、神经科学、免疫学等多个领域发挥重要作用。而景杰生物作为空间蛋白质组学的先驱和引领者，将不遗余力全面推进空间蛋白质组学的技术进步，为前沿研究保驾护航！

胰蛋白酶（胰酶，Trypsin），CAS：9002-07-7，为蛋白酶的一种，EC3.4.4.4，是从牛、羊、猪的胰脏提取的一种丝氨酸蛋白水解酶。来源于胰腺的一种丝氨酸蛋白酶，由223个氨基酸残基组成的单链多肽，底物特异性是带正电荷的赖氨酸和精氨酸侧链。胰酶主要切割赖氨酸和精氨酸羧基端，当两者之一紧随为脯氨酸的情况除外。另外，当切割位点任一边紧邻酸性残基，胰酶水解速率也会减缓。在组织细胞的体外培养和原代细胞培养中的组织细胞分散（将组织块制备成单个细胞悬液）以及传代细胞培养中，贴壁生长细胞的消化分散均要使用组织细胞消化液。常用的消化液为胰蛋白酶，EDTA等，其功能主要是使细胞间的蛋白质（如细胞外基质）水解，使组织或贴壁细胞分散成单个细胞，制成细胞悬液用于进一步的实验。以下是absin胰酶部分产品，全部现货供应哦~胰蛋白酶(猪源)1:250 abs47014936本品是由猪胰提取而得的一种肽链内切酶，白色至淡黄色粉末。可用于制备单细胞悬浮液，胰蛋白酶在用于细胞培养时，可用PBS溶解成浓度为0.25%，也可以加入0.02%EDTA ，过滤除菌后使用。溶于水≥10mg/ml，不溶于乙醇、甘油、氯仿和乙醚。本品具有以下特点：1、对电点pI 10.5。Ca2+对酶活性有稳定作用。 2、重金属离子、有机磷化合物、DFP、天然胰蛋白酶抑制剂对其活性有强烈抑制。 3、可用于制备单细胞悬浮液或贴壁细胞的消化、分离。货号名称abs47014936猪源胰蛋白酶1:250胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%) abs47014938本产品含0.25%胰酶，溶于无钙镁平衡盐溶液中，经过滤除菌，可以直接用于培养细胞和组织的消化。货号名称abs47014938胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%) 不含酚红 abs47047375本品含 0.25%胰酶和 0.02%EDTA（0.53mM），溶于无钙镁平衡盐溶液中，经过滤除菌，可以直接用于培养细胞和组织的消化。本产品具有方便快速、稳定安全、细胞状态好等特点。货号名称abs47047375胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%) 不含酚红胰蛋白酶(牛胰) 1:2500 abs9154本品是由牛胰提取而得的一种肽链内切酶，白色或类白色粉末。溶于水，不溶于乙醇、甘油、氯仿和乙醚。其广泛应用于分子生物学，药理学等科研方面。是一种专一性催化水解赖氨酸、精氨酸羧基形成的肽键，可用于蛋白质化学研究。货号名称abs9154胰蛋白酶(牛胰) 1:2500更多absin胰蛋白酶相关产品 ：货号名称abs47014938胰蛋白酶-EDTA溶液abs9154胰蛋白酶（牛胰腺）abs47047375胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%) 不含酚红abs44073474重组牛胰蛋白酶abs47014937Trypsin (0.25%), Phenol Redabs47014936猪源胰蛋白酶1:250abs47014940胰蛋白酶,蛋白测序级abs47014939胰蛋白酶,组织培养级Absin特色产品线(全部现货)：WB相关：ECL发光液、预染marker、预制胶；IHC相关：二抗试剂盒、组化笔；IP/CoIP试剂盒；激动剂/抑制剂；血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE；凋亡试剂盒；呼吸爆发试剂盒；ELISA试剂盒；重组蛋白；抗体: 二抗、标签抗体、对照抗体；定制服务(抗体/多肽/蛋白/标记/检测)...

p　　蛋白酶体是细胞中发现和降解不需要或者受损蛋白的分子机器。这些需要被降解的蛋白会被标上特殊的标签，然后蛋白酶体上一个由6个亚基组成的“机械手”依靠ATP提供的能量，将需要降解的蛋白“抓”到蛋白酶体的降解室中。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201812/uepic/8fab9fd2-0c33-4660-89ee-41c68e895067.jpg" title="冷冻电镜.png" alt="冷冻电镜.png"//pp style="text-indent: 2em "美国斯克里普斯研究所(The Scripps Research Institute)的研究人员使用冷冻电镜技术，解析了这一“机械手”与需要降解的蛋白相结合时的结构。这项研究揭示了这一“机械手”的6个亚基如何利用ATP水解的能量，改变自身构象，将需要降解的蛋白装入蛋白酶体的过程。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201812/uepic/6c510877-c48f-4cb9-a059-6e0d883903da.jpg" title="冷冻电镜 FEI Titan Kiros 300kV .jpg" alt="冷冻电镜 FEI Titan Kiros 300kV .jpg"//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(127, 127, 127) "FEI Titan Kiros 300kV 冷冻电镜（示例图）/span/p

简单生物体的细胞，如细菌，以及人类细胞，都被一层膜包围着，它可以完成各种任务，包括保护细胞免受压力。在一个联合项目中，来自美因茨约翰内斯古腾堡大学 (JGU)、德国于利希研究中心（Forschungszentrum Jülich） 和海因里希海涅大学杜塞尔多夫 (HHU) 的研究人员在细菌中发现的一种膜蛋白与一组负责重塑和重建人体细胞膜。根据研究人员的说法，这两个蛋白质组之间没有联系之前是已知的。然而，此次研究过程中，通过冷冻电子显微镜，发现细菌和人类的膜蛋白惊人地相似。细菌应激反应大约 30 年前，噬菌体休克蛋白 (Psp) 系统在细菌中被发现。“今天，我们知道 Psp 系统会响应多种类型的膜应力而被激活。然而，一些分子细节仍然令人费解，” 美因茨约翰内斯古腾堡大学膜蛋白组负责人德克施耐德（Dirk Schneider） 教授解释说。 “这就是为什么我们决定仔细研究 Psp 系统的核心蛋白。”施耐德及其同事最近发现了 Psp 代表 IM30 如何在细胞膜上形成保护性地毯状结构以应对膜应力。在他们的最新工作中，他们仔细研究了噬菌体休克蛋白 A (PspA)，它在 Psp 系统中起着关键作用。 人类 酵母 细菌不同膜蛋白之间的结构相似性 [Benedikt Junglas、Dirk Schneider、Carsten Sachse]冷冻电子显微镜显示 PspA 形成长的螺旋形管，可以将生物膜包裹在内腔中。高分辨率图像首次显示了 PspA 如何局部溶解单个膜，然后将它们重塑为更大的单元，甚至介导新膜结构的形成。PspA 的原子低温电子显微结构：细长的分子是螺旋纳米棒的基本构建块（左）。灰度低温电子显微照片和示意图模型显示了掺入脂质的 PspA 管。“数千个 PspA 构建块可以组装成大型螺旋结构。因此，它们是我们冷冻电子显微结构分析的理想研究对象，”来自 Forschungszentrum Jülich 和 HHU Düsseldorf 的 Carsten Sachse 教授说。“在显微镜下，我们意识到 PspA 具有类似于 ESCRT-III 蛋白质的结构，我们的实验室已经在研究它，”他补充道。“这完全出人意料，表明阐明蛋白质结构是多么重要细节......数十亿年后，这两组蛋白质在遗传上已经发生了分歧，以至于只能根据它们的结构来检测它们的相似性。”“基于 PspA 和真核 ESCRT-III 蛋白的相似结构和功能特性，我们已将 PspA 鉴定为进化上保守的 ESCRT-III 膜重塑蛋白超家族的细菌成员，”作者在 Cell 中写道。研究发表在Cell 《细胞》上。符斌 供稿

通过车间生产方式制造肉、蛋、奶，变革了食物蛋白制造模式，实现高质量供给，替代蛋白的兴起和发展大大缓解了传统蛋白生产方式存在的问题。在5月18日举办的首届全国微生物蛋白技术创新及产业发展大会上，中国工程院院士、江南大学教授陈坚认为，作为替代蛋白的一种，微生物蛋白有助于提升人类健康水平、改进地球生态质量。随着技术进步，替代蛋白产业发展的春天已经到来。　　食物蛋白是人类重要的营养物质，现有的蛋白供应主要依赖于种植业和养殖业。随着人口增长和经济发展，到2050年食品蛋白需求将增长30%至50%，传统食品蛋白供给在数量、质量和可持续方面正面临着严峻考验，如何提高蛋白生产和转化效率，构建可持续的高品质蛋白供给模式迫在眉睫。　　践行“大食物观”向微生物要蛋白　　替代蛋白包括动物细胞蛋白、植物蛋白、微生物蛋白、藻类蛋白和昆虫蛋白等多种类。陈坚介绍，微生物蛋白是利用可再生物质原料等为底物，通过在发酵罐中培养微生物的方式制造蛋白，与传统畜禽养殖生产方式相比，产生的温室气体更少，占用耕地面积更小，在资源消耗和环境影响等方面更加高效环保。　　微生物蛋白合成效率是传统养殖方式获取蛋白效率的上千倍。据介绍，以1000平方米面积为例，种植大豆每年可以生产1.1吨蛋白，满足40人的需求；而通过二氧化碳发酵微生物技术每年能够生产15吨蛋白，满足520人的需求，生产效率大幅提升。　　据波士顿咨询公司测算，到2035年，替代蛋白市场规模有望达到2900亿美元，微生物发酵蛋白市场份额将达到22%。　　陈坚表示，替代蛋白发展的战略意义远超单纯的食品创新。目前，我国蛋白供给还存在动物蛋白缺口较大、优质蛋白自给率不足等问题，需继续开发优质蛋白资源，提高食物蛋白自给率。　　随着人们生活质量的不断提升，消费者对优质蛋白、肉等食品的需求逐步增加，生产替代蛋白是解决肉类资源紧缺的有效途径之一。陈坚认为，发展微生物蛋白产业是落实“大食物观”碳减排和解决优质食品蛋白供给问题的重要途径，是新质生产力的典型代表。　　据介绍，针对当前食品加工粗放、营养缺乏人群针对性、膳食结构不合理等问题，微生物蛋白在营养、口感等方面具有一定优势。如酵母蛋白含有人体全部必需的氨基酸，属于全价蛋白，营养丰富，能够满足人体营养需求，没有豆腥味，而且无致敏成分，适用人群广泛。　　科技创新 构建多元化蛋白供给体系　　利用更少的资源产出更多的蛋白，微生物蛋白具有生产效率高且二氧化碳排放少的优势。陈坚介绍，目前，全球已有超过80家公司从事微生物菌体蛋白的生产。作为重要的替代蛋白，微生物蛋白的高效制造和规模化应用是构建多元化蛋白供给体系，实现可持续蛋白供给的重要途径。　　陈坚认为，微生物蛋白一方面可以作为主要蛋白生产原料，从成本、可持续、生产效率等方面解决肉、蛋、奶产业链中的关键蛋白供给难题；另一方面，还可以作为功能蛋白生产配料，作为细胞工厂通过精密发酵获取高附加值的蛋白，从而在口味、口感、营养等方面提升产品品质。　　作为食品领域的前沿技术，市场需求是推动替代蛋白发展的动力。据了解，当前“人造肉”在风味、口感、品质等方面仍与真实肉存在较大差异。植物肉缺乏真实肉中的纤维结构，肉质疏松是导致其口感和品质较差的主要原因。而微生物蛋白的发展为人造肉外观、风味、口感、品质等特性的提升提供了新方法。　　 例如，植物肉中存在醇、醛等挥发性物质，导致其具有一定的豆腥味。使用醇、醛脱氢酶将醇、醛等挥发性物质分解，可以显著提高植物肉的风味。一些特定的人群对植物蛋白肉过敏，筛选特异性的蛋白酶能够将植物肉中特定的过敏原降解，使其分解成为氨基酸和短肽，在去除过敏原的同时保留其营养成分。　　“目前，我们正在建立微生物蛋白菌种库，筛选出一批原料廉价、生长速度快、蛋白含量高的菌种，加快生产多种不同类型的蛋白，满足不同应用场景的需求。”陈坚建议，行业发展应该以满足居民多元化消费需求为导向，通过科技创新，优化蛋白品种和品质，满足人民日益增长的美好生活需要。

Toxic, hot, and spicy: Nanodiscs improve membrane protein resolution in cryo-EM(作者：Cube Biotech)Nanodisc结合冷冻电镜应用时 ，Nanodisc提升了通过冷冻电镜对膜蛋白的解析率，同时揭示了功能性磷脂所扮演的重要角色。The last few years have seen a tremendous increase in high-resolution protein structures solved by cryo electron microscopy (cryo-EM). Novel electron detecting cameras and sophisticated analysis software have expanded the capacity of cryo-EM to smaller and asymmetric proteins (1). As a true competitor to X-ray crystallography, cryo-EM is particularly interesting for hard-to-crystallize targets such as membrane proteins.在过去的几年里，使用冷冻电子显微镜（冷冻电镜）对蛋白结构高分辨率结构解析的应用有着很大地增长。新型的电子探测相机和复杂的分析软件使冷冻电镜的应用延伸到更小和不对称的蛋白结构解析（1）。作为X射线晶体法的真正强势的替代方法，冷冻电镜能把如膜蛋白等难以结晶的蛋白作为应用目标，并引起了各界广泛的兴趣。The importance of sample preparation methods for high-resolution cryo-EM data cannot be underestimated. Two recent Nature publications have shown that nanodiscs are not only excellent tools for membrane protein stabilization, but that they can also improve resolution, in particular of the transmembrane region, and enable analysis of interacting phospholipids.在应用的过程中，样品制备方法对得到高分辨率冷冻电镜数据的重要性是不可低估的。从最近的两篇发表到Nature的文章来看，Nanodisc不仅是膜蛋白稳定的优良工具，而且它也可以提高在电镜解析的分辨率，特别是膜蛋白的跨膜部分，同时能实现磷脂相互作用的分析。Toxic: Near-atomic detail of a bacterial Tc toxin membrane insertion (2). Stefan Raunser' s team at the Max-Planck Institute in Dortmund, Germany unveiled the mechanism used by bacterial Tc toxin as it enters the cell. Besides the high medical relevance of this project - Tc toxins include anthrax, plague, and scarlet-like fever toxins - the conformational changes these toxins undergo are simply fascinating. Secreted by bacteria as soluble proteins, toxins fold into channels that perforate the host membrane by a putative entropic spring mechanism. In previous attempts with detergent-solubilized protein, it was not possible to resolve the transmembrane region of the toxin. Now, using nanodisc-stabilized TcdA1 protein, researchers were able to achieve an overall resolution of 3.5 Angstrom, allowing them to describe this mechanically enforced membrane insertion mechanism for the first time.Toxic: Near-atomic detail of a bacterial Tc toxin membrane insertion (2)。德国马克斯普朗克研究所的Stefan Raunser团队阐述了细菌Tc毒素进入细胞的机制。除了这个项目的高度医学相关性价值外( Tc毒素包括炭疽，鼠疫，猩红热样毒素)这些毒素所经历的构象变化是有极大吸引力的。由细菌分泌的可溶性蛋白，毒素折叠成通道穿过宿主细胞膜。以前尝试使用去污剂溶解带跨膜区域蛋白进行分析，并不能很好地解析带跨膜区域的毒素。而现在使用Nanodisc稳定TcdA1蛋白，研究人员能够获得到3.5埃的解析度，这让他们有机会首先发现并描述了这种机械的强制膜插入的机制。阅读更多Nature原文Hot & spicy: Functional lipids enable detection of heat and hot spices (3). Yifan Cheng' s team at UCSF analyzed the tetrameric transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) ion channel at 2.9 Angstrom resolution. TRPV1 reacts to many physical and chemical stimuli, including heat and capsaicin, an ingredient of chilli peppers. Nanodiscs were crucial to obtain a high resolution structure, as previous attempts with amphipol-stabilized complexes had only yielded a 3.8 A resolution.But nanodiscs played another important role in this analysis: By providing a phospholipid bilayer, they enabled the discovery of lipids with a structural function in ligand binding. Similar to the results of the Dortmund group, the transmembrane regions were those with the highest resolution, stressing the value of nanodiscs for cryo-EM analysis.Hot & spicy: Functional lipids enable detection of heat and hot spices (3).加州大学旧金山分校的程亦凡团队分析了瞬态电压感受器阳离子通道1(TRPV1一种在疼痛和热知觉中起中心作用的蛋白质）在2.9埃分辨率离子通道结构。TRPV1对许多物理和化学刺激，包括热、辣椒素(一种辣椒的成分)都有反应。Nanodisc是此研究中获得高分辨率的结构十分重要的因素，而以前的尝试使用双极性稳定复合物只得到了3.8个埃的分辨率。在这一研究中，Nanodisc还扮演了另一个非常重要的角色：通过提供一个磷脂双分子层，研究人员得以发现磷脂具有配基结合的结构功能。类似于Stefan Raunser团队的结果，跨膜区具有最高的分辨率，大大提升了Nanodisc在结合冷冻电镜分析膜蛋白应用中的价值。阅读更多Nature原文参考文献：1.Kühlbrandt, W. Cryo-EM enters a new era. eLIFE (2014) doi:10.7554/eLife.036782. Gatsogiannis, C. et al. Membrane insertion of a Tc toxin in near-atomic detail. Nature structural and molecular biology (2016),23,884-890. doi:10.1038/nsmb.32813.Gao, Y. et al. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature (2016) 534(7607):347-351. doi:10.1038/nature17964

球菌的细胞壁，与IgG的Fc片段具有非常强的特异性，分子量约为42×103，如图所示。一般在蛋白 A亲和层析中，配基在中性pH条件下结合抗体，在酸性pH条件下与蛋白解离。‍蛋白A与抗体IgG的Fc片段结合模式基于蛋白 A 亲和层析的抗体捕获工艺较为稳定，但也存在一些不足，主要包括：（1）介质成本高。（2）配基易脱落。（3）洗脱条件苛刻。（4）Protein A介质的再生比较困难。针对以上问题，部分商业化蛋白A亲和层析介质中使用的基本为改造的蛋白A配基，改善了天然蛋白A的缺点，提高了耐碱能力和洗脱 pH。月旭科技推出的耐碱抗体亲和介质-耐碱Protein A Solid/耐碱Protein A 4FF， 由大肠杆菌表达，经层析纯化获得，纯化过程不适用抗体柱亲和层析，避免了产品中掺入无关IgG的可能，改配基pH耐受0.5M NaOH和0.5M HCl处理，不降解，抗体结合能力不变。该介质适合从大批培养液捕获单克隆抗体或Fc融合蛋白，也适合与从腹水或者血浆中捕获多克隆抗体。技术参数‍应用实例订货信息

p style="text-indent: 2em "strong style="text-indent: 2em "仪器信息网讯/strongspan style="text-indent: 2em " 2020年2月15日，美国卫生总署(NIH)与美国得克萨斯大学奥斯汀分校Jason S. McLellan研究组合作在预印本平台bioRxiv上发表论文：Cryo-EM Structure of the 2019-nCoV Spike in the Prefusion Conformation（span style="text-indent: 2em color: rgb(127, 127, 127) "DOI: 10.1101/2020.02.11.944462/span），报道了新冠病毒（2019-nCoV）S蛋白的首个冷冻电镜结构，利用冷冻电镜技术分析了新型冠状病毒表面S蛋白的近原子结构。/span/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 206px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202002/uepic/29be9fbf-7286-475f-807a-ea01b409b72a.jpg" title="1.png" alt="1.png" width="600" height="206" border="0" vspace="0"//pp style="text-indent: 2em "span style="color: rgb(127, 127, 127) "（注：预印本网站bioRxiv的所有论文未经同行评议， bioRxiv在所有2019-nCoV相关论文页面增加了突出字体说明（上图黄底黑字）：“bioRxiv收到了许多关于2019年ncov冠状病毒的新论文。提醒一下:这些是没有经过同行评审的初步报告。他们不应被视为结论性的，指导临床实践/健康相关的行为，或在新闻媒体中作为既定信息进行报道。”）/span/pp style="text-indent: 2em "作者通过生物物理以及结构方面的证据发现，新冠病毒的S蛋白结合人体ACE2（宿主细胞受体血管紧张素转化酶2）的亲和力要远高于SARS-CoV的S蛋白，或解释了新型冠状病毒传染性很强的主要原因。/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 450px height: 322px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202002/uepic/4ad16a73-5442-4584-899c-bca9a93d4e04.jpg" title="2.png" alt="2.png" width="450" height="322" border="0" vspace="0"//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 176, 240) text-align: center text-indent: 0em " 预融合构象/spanspan style="color: rgb(0, 176, 240) text-align: center text-indent: 0em "中的2019-nCoV S结构/span/pp style="text-indent: 2em "新型冠状病毒（2019-nCov）的爆发代表了一种流行病威胁，已宣布为国际关注的突发公共卫生事件。CoV突刺（S）糖蛋白是疫苗、治疗性抗体和诊断方法的关键靶标。此前的大量研究均基于2019-nCoV突刺蛋白的预测结构或相关病毒（如SARS）的突刺蛋白的已知结构展开。为促进医学对策（MCM）的开发，论文中确定了预融合构象中的2019-nCoV S蛋白三聚体冷冻电镜结构，为3.5埃分辨率。三聚体的主要状态为三个受体结合结构域（RBD）之一向上旋转为受体可及构象。同时，生物物理和结构证据表明， 2019-nCoV S以比SARS-CoV S更高的亲和力结合ACE2（宿主细胞受体血管紧张素转化酶2）。此外，作者测试了几种已发布的SARS-CoV RBD特异性单克隆抗体，发现它们与nCoV-2019没有明显的结合。这表明两种病毒RBD之间的抗体交叉反应性可能受到限制。/pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 450px height: 200px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202002/uepic/96b62197-7abe-467b-b461-e70a6a2a6f3f.jpg" title="3.png" alt="3.png" width="450" height="200" border="0" vspace="0"//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 176, 240) text-align: center text-indent: 0em "2019-nCoV S.和SARS/spanspan style="color: rgb(0, 176, 240) text-align: center text-indent: 0em "-CoV S.之间的结构比较（A）/span/pp style="text-indent: 2em "span style="text-align: center text-indent: 0em color: rgb(0, 0, 0) "新型冠状病毒利用高度糖基化的同源三聚体S蛋白进入宿主细胞。S蛋白经历结构变化将病毒融合进入宿主细胞的细胞膜。此过程包括病毒的S1亚基结合到宿主细胞受体上，引发三聚体不稳定性的发生，进而造成S1亚基脱落S2亚基形成高度稳定的融合后结构。/span/pp style="text-indent: 2em "通过该结构分析，作者发现S1亚基中的RBD经历铰链类似运动，此移动特点与SARS-CoV以及MERS-CoV均非常相似，但新型管冠状病毒中则RBD结构则更靠近三聚体的中央部位，其S蛋白中3个RBP中的1个会向上螺旋突出从而让S蛋白形成能够轻易与宿主受体ACE2结合的空间构象。这也说明，新型冠状病毒引发病毒的机制虽然与其他的冠状病毒科的病毒机制异曲同工，但传染性更强。/pp style="text-indent: 2em "论文受到业界的广泛关注，研究中，John Ludes-Meyers博士对细胞转染给予很大帮助，德克萨斯大学奥斯汀分校Sauer结构生物学实验室的Aguang Dai博士在显微镜对准方面做了大量工作。/pp style="text-indent: 2em "论文链接：a href="https://www.instrument.com.cn/download/shtml/932743.shtml" target="_self" style="color: rgb(127, 127, 127) text-decoration: underline "span style="color: rgb(127, 127, 127) "https://www.instrument.com.cn/download/shtml/932743.shtml/span/a/p

蛋白组学脱胎于人类基因组计划中的功能基因组学，是研究细胞、组织或完整生物体所拥有的全套蛋白质的学科，“全景式地研究在各种特定情况下的蛋白质谱”。（贺福初，中国蛋白质组计划，中国科学基金，2002，264-268）蛋白组学的实验过程高度依赖优化的样品前处理。其中，蛋白消解和质谱分析这两步之间的处理过程对整体分析质量和灵敏度有着非常重要的影响。一种名为StageTips的关键技术于2003年由南丹麦大学蛋白质组学领域著名学者Matthias Mann首次报道，并因其高效和简便而在蛋白组学研究中得到广泛使用。许多研究机构根据自身课题特点开发了StageTips的应用规程。StageTips是一种填充了Empore膜片的微量移液管。其全称是“Stop and go extraction tips”，喻意为蛋白分解产生的肽被Empore膜片拦截，然后由适当的溶剂释放出来。这个过程中，盐份去除，肽得到纯化和浓缩，或者预分馏。Empore膜片由高分子纤维网固定住的功能颗粒构成，同时具有极佳的物理特性（如柔软、致密）和化学特性（如高保留因子），使StageTips特别适用于LC/MS分析之前处理肽溶液样品。膜片中功能颗粒种类的多样性使StageTips具有多种不同性能，可以根据应用内容有多种选择，并可以在一支StageTips中组合使用。a - 单层Empore膜片的StageTips（放大图中为Empore膜片材料结构示意） b – 多层膜片的StageTips ；图1 StageTips外观Empore相对于用松散颗粒制成的产品有多种优势，包括：颗粒填充致密无沟流；无需筛板；洗脱体积小；容量可由增加膜片层数而扩大。图2. Empore StageTips 质量控制：这些数据显示SDB-RPS StageTips 在不同批次和同一批次内测试结果的良好可重复性和可靠性，证实生产工艺的优越性。应用实例一美国著名医院Mayo Clinic 于2020 开发了基于StageTips和临床质谱的 新冠病毒快速诊断方案，可以达到和PCR相似的精度。----------------------------------------------------------------------------------------------------图3. Mayo Clinics 新冠病毒高通量检测方案：基于StageTips 和OrbiTrap LC-MS。应用实例二高通量磷酸化蛋白质组学检测----------------------------------------------------------------------------------------------------DNA转录成mRNA要再翻译成具有特定氨基酸序列的蛋白质才能在体内发挥功能，其中大部分蛋白质往往还需要经过化学修饰才能具备真正的活性，这种修饰称为翻译后修饰（PTM）。翻译修饰的过程，就是在蛋白质氨基酸序列中添加特定氨基酸或改变特定化学官能团的过程，进而改变蛋白质的结构。已有实验证明有三百多种潜在的PTM类型，并且同一个蛋白质可能在多个位点发生修饰，这就促成了蛋白结构和功能上的多样性。在众多的PTM类型中，磷酸化修饰（Phosphorylation modification）的蛋白占到了所有蛋白质约三分之一，是最普遍的修饰类型之一。会影响到细胞内信号转导、细胞结构、细胞增殖、凋亡、转录、代谢过程以及调控病原微生物的适应能力等等，所以在不同细胞中，蛋白磷酸化水平会呈现不同的差异，特定位点的磷酸化程度可能从小于1%到大于90%。图 4. StageTips 用于高通量磷酸化蛋白质组学检测磷酸化蛋白质组学是研究这个蛋白质磷酸化修饰的重要方法之一。如图四所示，通过采用基于StageTips的高通量蛋白质组学样品制备方法，相对于传统样品制备方法来说，所需要的检测样品少了10倍，检测时间减少3倍，但定量化磷酸化位点增加了3倍，极大了提高了研究效率。高碱性条件下的分馏可大大提高蛋白质检出率。相比于传统的方法，比如离线HPLC 泵，或者散装填料装的Tips，Empore C18 Stage Tips 更为高效，同时成本更低。图五显示的数据表明通过StageTips 在高碱性条件下的分馏样品处理，蛋白质检出量增加了50%，同时蛋白质覆盖率提高了10%。图5: HeLa细胞系用 Empore C18 StageTips在高碱性条件下进行分馏处理可大大增加蛋白质和多肽的检出水平Empore还具有自身优势，其中可供选择的功能颗粒和应用如下表所示。【说明】Empore最早由3M公司生产，2019年，莱伯泰科从3M公司收购了Empore的生产线，由旗下CDS公司全面掌握生产工艺并生产和销售。收购之后，许多将Empore作为关键材料的高科技产品得以继续生产。

“今天获奖的获奖者体现了基础科学的非凡力量，”尤里米尔纳说，“既揭示了宇宙的深刻真理，又改善了人类生活”。米尔纳是俄罗斯富商，是科学突破奖的创建者之一。“2023年科学突破奖”，主要奖励在蛋白结构预测、细胞组织机制以及量子信息领域做出开创性贡献的学者，他们将分享共计1575万美元的奖金。生命科学领域的三个突破性奖项被授予：克利福德布朗温（Clifford P. Brangwynne）和安东尼海曼（Anthony A. Hyman），以表彰他们发现了细胞组织的新机制；德米斯哈萨比斯（Demis Hassabis）和约翰乔普（John Jumper）开发AlphaFold，准确预测蛋白质的结构；以及伊曼纽尔米格诺特（Emmanuel Mignot）和柳泽正史（Masashi Yanagisawa ）发现嗜睡症的原因。数学突破奖授予丹尼尔斯皮尔曼（Daniel A. Spielman），以表彰他在理论计算机科学和数学方面的多项发现。基础物理学突破奖由查尔斯贝内特（Charles H. Bennett），吉尔布拉萨德（Gilles Brassard），大卫多伊奇（David Deutsch）和彼得肖尔（Peter Shor），以表彰他们在量子信息方面的基础工作。早期职业科学家的重要贡献也得到了认可，6个物理和数学新视野奖，以及3个Maryam Mirzakhani新前沿奖，它发给了刚完成博士学位的女性数学家。“神经退行性疾病的突破、量子计算、人工智能解决蛋白质结构等等......”Google创始人谢尔盖布林表示，“这些都是令人难以置信的进步，值得庆祝”。“祝贺所有突破奖获得者，他们令人难以置信的发现将为科学发现铺平道路并刺激创新，”CZI联合创始人兼联合首席执行官Priscilla Chan和Mark Zuckerberg表示，“这些获奖者和早期职业科学家正在推动研究和科学的极限，我们很高兴能够表彰他们的成就”。如下分别介绍今年的诺奖者及获奖理由：2023年生命科学突破奖普林斯顿大学、霍华德休斯医学研究所克利福德布兰格温以及来自德国马克斯普朗克分子细胞生物学与遗传学研究所的安东尼海曼获奖理由：发现了由蛋白质和RNA相分离成无膜液滴介导的细胞组织基本机制。德米斯哈萨比斯（Demis Hassabis）和约翰乔普（John Jumper）获奖理由：开发了一种深度学习算法，该方法可快速准确地从其氨基酸序列中预测蛋白质的三维结构。伊曼纽尔米格诺特（Emmanuel Mignot）和柳泽正史（Masashi Yanagisawa ）获奖理由：发现了嗜睡症是由一小群脑细胞的缺失引起的，这些脑细胞会释放促进觉醒物质，这为开发新的睡眠障碍治疗方法铺平了道路。022023年基础物理学突破奖2023年基础物理学突破奖获奖人为：IBM 托马斯沃森研究中心查尔斯贝内特、蒙特利尔大学吉尔布拉萨德、牛津大学大卫多伊奇以及麻省理工学院彼得肖尔。获奖理由：以表彰他们在量子信息方面的基础工作。032023年数学突破奖2023年数学突破奖获奖人为：耶鲁大学丹尼尔斯皮尔曼获奖理由：对理论计算机科学和数学的突破性贡献，包括对光谱图论、Kadison-Singer问题，数值线性代数的优化和编码理论。04科学突破奖简介科学突破奖(Breakthrough Prize) 创立于2012年，由俄罗斯亿万富翁尤里米尔纳夫妇、谷歌（google）联合创始人谢尔盖布林夫妇、阿里巴巴集团创建人马云和张瑛夫妇、脸书（Facebook）联合创始人马克扎克伯格夫妇、以及苹果公司董事长亚瑟莱文森等知名实业家共同设立，旨在表彰在生命科学、数学和基础物理学领域做出杰出贡献的人士。该奖项于2013年2月启动，下设“生命科学突破奖”、“基础物理学突破奖”和“数学突破奖”，并且面向年轻科学家设立“物理学新视野奖”、“数学新视野奖”和“青年挑战突破奖”，此外，2019年起开始设立“玛丽亚姆米尔扎哈尼新新前沿奖”（Maryam Mirzakhani New Frontiers Prize），颁发给在过去两年内获得博士学位并处于职业生涯早期的女数学家。科学突破奖的奖金十分丰厚，堪称科学界“第一巨奖”，并被誉为“科学界的奥斯卡”。其中，生命科学、基础物理学和数学突破奖三大奖项的获奖者，每人可获得300万美元奖金；新视野奖奖金为10万美元；“玛丽亚姆米尔扎哈尼新新前沿奖”的获奖者，可获得5万美元奖金。现在，科学突破奖由谢尔盖布林、马克扎克伯格夫妇、尤里米尔纳夫妇、基因技术公司23andMe联合创始人安妮沃西基、以及腾讯公司联合创始人马化腾赞助。科学突破奖近5年获奖情况2017年获奖情况：生命科学突破奖获得者：沙克生物学研究所、哈佛休夫医学研究所研究员乔安妮乔瑞（Joanne Chory）；加州大学圣迭戈分校路德维希癌症研究所科研人员唐克利夫兰（Don W. Cleveland）；日本京都大学科学研究院生物物理学教授森和俊（Kazutoshi Mori）；牛津大学科研人员金内史密斯（Kim Nasmyth）；加州大学旧金山分校彼得沃特（Peter Walter）。基础物理学突破奖获得者：由27名成员组成的WMAP实验团队，其中 5位获奖团队领导分别为：查尔斯贝内特（Charles L. Bennett）， 美国约翰-霍普金斯大学物理&天文学系教授；美国天文学家和天体物理学家加里欣肖（Gary F. Hinshaw），来自不列颠哥伦比亚大学；美国物理学家和天体物理学家诺曼雅罗西克（Norman C. Jarosik ），来自普林斯顿大学；普林斯顿大学詹姆斯麦克唐纳物理学杰出大学教授莱曼佩吉（Lyman Alexander Page, Jr）；美国理论天体物理学家，普林斯顿大学教授戴维斯佩格尔（David Nathaniel Spergel）。数学突破奖获得者：克里斯朵夫哈克（Christopher Hacon ），来自犹他大学；詹姆斯迈克凯南（James McKernan），来自加州大学圣迭戈分校。2018年获奖情况：生命科学突破奖获得者：哈佛大学科学家弗兰克本内特（Frank Bennett）；美国科学家艾德里安科内纳尔（Adrian Krainer）；麻省理工学院科学家安吉里卡阿蒙（Angelika Amon）；哈佛大学华裔科学家庄小威（Xiaowei Zhuang）；美国德州大学西南医学中心分子生物学教授陈志坚（Zhijian “James” Chen）。基础物理学突破奖获得者：宾夕法尼亚大学教授查尔斯凯恩（Charles Kane）；宾夕法尼亚大学科学家尤金迈乐（Eugene Mele）。基础物理学特别突破奖：英国天文学家乔瑟琳贝尔（Jocelyn Bell Burnell ）。数学突破奖获得者：法国国家科学研究中心和格勒诺布尔大学傅立叶研究所科学家文森特拉福格（Vincent Lafforgue）。 2019年获奖情况生命科学突破奖获得者：美国纽约洛克菲勒大学分子实验室、霍华德休斯医学研究所教授杰弗里M弗里德曼（Jeffrey M. Friedman）；马克斯普朗克生物化学研究所研究人员F乌尔里希哈特尔（F. Ulrich Hartl）；耶鲁医学院、霍华德休斯医学研究所科学家亚瑟L霍里奇（Arthur L. Horwich）；加州旧金山大学生理学及分子生物学教授戴维朱利叶斯（David Julius）；宾夕法尼亚大学研究人员弗吉尼娅曼仪李（Virginia Man-Yee Lee）。数学突破奖获得者：芝加哥大学的亚历克斯埃斯金（Alex Eskin）。 2020年获奖情况：生命科学突破奖获得者：华盛顿大学蛋白设计研究所和霍华德休斯医学院科研人员戴维贝克（David Baker）；哈佛大学和霍华德休斯医学研究所科研人员凯瑟琳杜拉克（Catherine Dulac）；香港中文大学医学院副院长卢煜明（Dennis Lo）；美国国家卫生院理查德J尤尔（Richard J. Youle）。基础物理学突破奖获得者：华盛顿大学科研人员埃里克阿德尔贝格尔（Eric Adelberger）、詹斯冈拉克（Jens H.Gundlach）和布莱尼赫克尔（Blayne Heckel）。数学突破奖获得者：帝国理工学院科研人员马丁海尔（Martin Hairer）。 2021年获奖情况：生命科学突破奖获得者：斯克里普斯研究所科学家杰弗里W凯利（Jeffery W. Kelly）；宾夕法尼亚大学科学家卡塔林考里科（Katalin Karikó）和德鲁韦斯曼（Drew Weissman）；剑桥大学科学家尚卡尔巴拉苏布拉尼亚安（Shankar Balasubramanian）、戴维克勒纳曼（David Klenerman）；生物技术公司AlphanososCEO帕斯卡尔迈耶（Pascal Mayer）。基础物理学突破奖获得者：日本东京大学科学家香取秀俊（Hidetoshi Katori）；中国科学院外籍院士叶军（RIKEN Jun Ye）。数学突破奖获得者：日本京都大学数学家望月拓郎（Takuro Mochizuki）。华裔科学家获奖情况自科学突破奖2013年2月正式启动以来，获得过“生命科学突破奖”、“基础物理学突破奖”和“数学突破奖”三大奖项的华裔科学家共有8位，分别为：美国加州大学洛杉矶分校澳籍华裔数学家陶哲轩，2015年数学突破奖获得者，表彰其对调和分析、组合数学、偏微分方程和解析数论做出的诸多贡献。美国加州大学洛杉矶分校澳籍华裔数学家陶哲轩美国国家科学院院士、美国德克萨斯大学西南医学中心分子生物学教授陈志坚，2019年生命科学突破奖获得者，表彰其发现负责感应胞质溶胶内DNA的环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cGAS），了解DNA在细胞中如何激发先天免疫系统。美国国家科学院院士、美国德克萨斯大学西南医学中心分子生物学教授陈志坚中国科学院外籍院士、哈佛大学化学与化学生物、物理学双聘教授庄小威，2019年生命科学突破奖获得者，表彰其发明随机光学重建显微法（Stochastic optical reconstruction microscopy或STORM），超高分辨率显微镜之一。中国科学院外籍院士、哈佛大学化学与化学生物、物理学双聘教授庄小威中国科学院院士、实验高能物理学家王贻芳、加州大学伯克利分校教授、香港大学教授陆锦标及大亚湾核反应堆中微子实验团队，2016年基础物理学突破奖获得者，表彰他们发现和探究中微子振荡，揭开超越标准模型的物理学新领域。中国科学院院士、实验高能物理学家王贻芳加州大学伯克利分校教授、香港大学教授陆锦标美国宾夕法尼亚大学科学家李文渝，2020年生命科学突破奖获得者，表彰其发现TDP43积聚会引致额颞叶痴呆症和肌萎缩性脊髓侧索硬化症，以及α-突触核蛋白在不同细胞中拥有不同形态，且会导致帕金森症和多发性系统萎缩症。美国宾夕法尼亚大学科学家李文渝美国国家科学院院士、中国科学院外籍院士、物理学家叶军，2022年基础物理学奖获得者，表彰其发明超精密的原子钟光晶格钟。美国国家科学院院士、中国科学院外籍院士、物理学家叶军美国国家科学院外籍院士、香港中文大学医学院副院长、分子生物学临床应用专家卢煜明，2021年生命科学突破奖获得者，致力于研究人体内血浆的DNA和RNA，被誉为无创DNA产前检测的奠基人。美国国家科学院外籍院士、香港中文大学医学院副院长、分子生物学临床应用专家卢煜明参考资料1.维基百科. https://zh.wikipedia.org/wiki/Wikipedia2.Breakthrough Prize: About3. https://breakthroughprize.org/News4. 刚刚！2022科学突破奖公布，两位mRNA技术先驱与其他23名学者分享1575万美元奖金.深究科学

01研究背景稳定的、高纯度、单分散的生物样品显示出更高的结晶倾向[1]。早期阶段识别那些更有可能产生晶体的结构或变体能够节省大量的人力和时间成本。目前的很多方法，如凝胶过滤、DSF等技术可以帮助识别最优性质的样品，但是存在样品消耗量大或者外源染料与溶剂不兼容等问题。NanoTemper开发的nanoDSF差示扫描荧光技术，基于蛋白的内源荧光检测Tm值，通过Tm值的绝对数值和变化来确定优先结晶的缓冲条件或者蛋白变体等。接下来，我们通过两篇文献来了解nanoDSF如何助力结晶条件的筛选。02案例解读https://doi.org/10.1038/s41467-023-35915-4IF: 16.6 Q1非特异性磷脂酶C (NPC) 是植物特有的一类磷脂酶。尽管对NPCs的研究揭示了其在植物生长发育中的基本作用，但相比于其它磷脂酶（A1/A2/D/PI-PLC）水解底物的分子机制研究，NPCs是迄今为止唯一一类尚未被阐明的磷脂酶。湖北洪山实验室、作物遗传改良全国重点实验室蛋白质科学研究团队联合油菜团队的研究成果解析研究了NPC4的晶体结构和工作机制，为真核生物磷脂水解酶家族的分子机制提供了新见解。 研究中获得了NPC41-415和NPC41-496 两组结晶，对比结晶结果，发现NPC41-415没有磷酸化，且CTD结构域没有观察到电子密度。SDS-PAGE结果显示，蛋白在结晶过程中被部分降解，可能导致晶体中缺少CTD结构域。对比结晶条件发现NPC41-415的结晶中不存在KH2PO4，同时KH2PO4不影响NPC4活性。因此，作者推测KH2PO4可能会增强NPC4的稳定性。NPC4为膜蛋白，一般膜蛋白的表达和纯化得率均比较低，因此需要使用蛋白消耗量少的热稳定分析技术以最大程度的节约膜蛋白样品。nanoDSF技术样品检测浓度可低至5ug/ml，10μl，大大节约蛋白样品。研究人员利用nanoDSF技术检测了KH2PO4对NPC蛋白热稳定性的影响，每个条件仅需5.6ug NPC4蛋白样品。加入KH2PO4后，Tm值从51.1℃提高到55.3℃，表明NPC4在KH2PO4存在下更稳定，也解释了缺少KH2PO4时蛋白降解的原因。图示：KH2PO4提高NPC41-496 稳定性：nanoDSF结果显示，NPC41-496 Tm为51.1℃；在有50mM KH2PO4 存在下提高到55.3℃03案例解读https://doi.org/10.1038/s41598-023-41616-1IF: 4.6 Q2水通道蛋白2（APQ2）调控水的重吸收进而调控机体的水代谢平衡。AQP2基因的点突变可能导致肾性尿崩症(NDI)。为了进一步了解AQP2突变导致NDI的分子机制，作者通过对三种AQP2突变体(T125M、T126M和A147T)进行结晶，以了解突变AQP2的结构和功能关系，为NDI背后的机制提供了分子见解。为了提前了解突变对AQP2蛋白稳定性以及其对后续结晶的影响，研究人员使用nanoDSF技术比较了三种突变体的热稳定性差异。需要注意的是AQP2同样为膜蛋白，其储存溶液中含有去垢剂OGNG等成分，而nanoDSF技术是基于蛋白的内源荧光进行Tm检测，对去垢剂等兼容，无需优化检测条件，可快速获得重复性高的Tm结果。nanoDSF结果显示所有的热变性曲线显示出相似的形状。然而，Tm和Tonset在不同突变体之间存在差异。野生型AQP2的稳定性最高，其次为T126M和T125M， A147T的热稳定性最低。 图示：nanoDSF检测WT AQP2以及其突变体的热稳定性接下来，作者对AQP2以及其突变体进行结晶。在与野生型AQP2相同的条件下，只有T125M和T126M产生了足以用于结构测定质量的晶体，与野生型AQP2的结构高度相似。T126M晶体的衍射分辨率最高，为(~ 3-3.3 &angst )，其次是T125M (~ 3.7-4 &angst )。A147T晶体质量最低，衍射x射线约为5-7 &angst 。结晶结果与三种蛋白质结构的热稳定性非常一致，即蛋白质的热稳定性降低可能会降低其成功结晶的能力[2][3]。03案例小结&技术优势在上述两篇文献中，作者使用nanoDSF技术检测了膜蛋白在不同缓冲条件或者突变体的热稳定性，并且均可与后续的结晶结果对应。nanoDSF对缓冲溶液兼容，如去垢剂，无需额外优化条件，仅需非常少量的样品，即可快速完成Tm检测。明星产品PR Panta更是整合了4大检测模块（DLS、SLS、Backreflection和nanoDSF），仅需一份样品即可获得多种参数，更清楚了解结晶前样品情况，挑选最佳条件蛋白或条件进行结晶。PR Panta蛋白稳定性分析仪[1] Zulauf M, D'Arcy A (1992) J Cryst Growth 122:102–106[2] Dupeux, F (2011) Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 67, 915–919.[3] Deller, M. C. (2016).Acta. Crystallogr. F Struct. Biol. Commun. 72, 72–95.

强强联合，上海易孛特 × 四川杰莱美联合推出完整的核酸蛋白分析套装四川杰莱美科技 四川杰莱美科技 2022-10-21 14:21 发表于四川 仪器选购，品质为先! 如何在有限的时间里，选择优秀的、创新的、经过评价的、或者用户验证过的科学仪器呢？ 在此，上海易孛特 × 四川杰莱美 强强联合推出完整的核酸蛋白分析套装，并提供给您！🤝🤝🤝责任于心，技术于行【关于杰莱美】励精图治 造炬成阳 四川杰莱美科技有限公司成立于2016年，是一家专业致力于生命科学、等领域高端仪器设备研发、生产、销售、服务为一体的高新技术企业。公司立足西南辐射全国，总部位于成都，在北京、上海、广州、武汉、南京、西安、重庆、海口、昆明、贵阳、乌鲁木齐、拉萨等城市均设有办事处，服务于全国多个高校、医院、科研机构及政府单位。科技赋能 创新驱动 公司高度重视技术研发，以创新驱动发展。已取得自主知识产权20余项、软件著作权14项，专利10余项，并连续四年获得政府研发项目基金支持。公司建立起基于分子生物学、细胞生物学、基因蛋白组学、病理学、生态学等相关专业，与生物信息学、计算机科学、图像处理、大数据挖掘等交叉学科形成的一整套研发、生产技术体系平台，经过近年飞速发展，已获得多项国家专利，形成多个自主研发产品，已广泛应用于各大高校、科研院所、政府实验室、医疗体系建设等各个领域。以人为本 凝聚价值 公司硕博士以上学历占比51%，本科以上学历占比95%，是一支有朝气、高水平、有情怀、善创新的队伍。四川杰莱美科技秉承“客户满意、员工支持、价值链协同、社会认可”的企业核心价值观，通过专业化的产品和服务，释放科技创新的力量，把生命科学研发技术转化为客户价值，助力客户尽享精准实验带来的卓越科研成果。 四川杰莱美科技将牢记初心使命，践行责任担当，只争朝夕推动科技创新，脚踏实地做好生产研发，用心用情服务客户发展，奋楫笃行创造社会价值！如果您对我们的产品或服务有任何意见或者建议，欢迎拨打我们的官方热线与我们联系，谢谢！

p　　摘 要：随着抗体药物上游大规模高效培养技术的飞速发展，抗体蛋白的表达浓度有了大幅度的提高，这给下游纯化工艺带来了巨大的压力。为了突破下游技术瓶颈，整个世界生物制药产业都加大了对下游技术的革新力度，近年来也取得了丰硕的成果。本文就抗体药物的纯化策略、最新技术进展以及技术应用等方面做一个调研，以期能对本部门的相关研究工作有所助益。/pp　　关键词：抗体 下游工艺 纯化 技术进展/pp　　自1997年来，全球抗体药物市场经历了一个快速发展的阶段，总销售额从1997年的3.1亿美元增长到2008年的400亿美元，复合增长率高达55%，而且增长势头还在持续 [1]。国际上通常把年销售额超过10 亿美元的品牌药称为“重磅炸弹”药物，很大一部分抗体药物都已迈入“重磅炸弹”行列。在2008年全球15大药品中，抗体药物占据了1/3，且排名仍在上升，这意味着几乎每种单抗药物的成功开发都代表着巨大的市场前景[2]。受益于此，全球主要的生物制药公司都获利颇丰，可见抗体药物具有巨大的经济价值和社会价值。/pp　　抗体药物生产技术门槛高，需要掌握抗体筛选、抗体重组、高表达细胞株构建和大规模悬浮培养等核心技术，其下游关键技术是长期以来的薄弱之处。哺乳动物细胞表达系统具有活性高、稳定性好等优点，已成为抗体等生物制品最重要的系统之一，为抗体药物的产业化提供可能。目前，国际上该项技术发展较快，已趋成熟，以默克公司为代表的流加培养生产规模达10000L以上，以贝尔公司为代表的灌流培养生产规模达200L以上，蛋白表达浓度为1-10g/L。我国在该技术领域起步较晚，基础较差，但近年来经过努力，已经实现了该项技术的突破，流加培养规模达500L以上，灌流培养规模达100L以上，蛋白表达浓度为0.2-2g/L[2]。/pp　　随着动物细胞表达抗体产品大规模高效培养技术的快速发展，下游纯化工艺越来越成为抗体药物生产中主要的技术瓶颈[3]。因此，如何提高下游工艺的生产效率就成为了抗体药物研发必须解决的问题。本文就国际上高表达抗体蛋白下游工艺的研究进展做一个调研，使本人及同事们能了解国际上的研究成果和发展趋势，以期能对本部门的相关研究工作有所助益。/pp　　1. 抗体药物纯化策略/pp　　每个单抗的等电点、电荷密度、疏水性、糖基化程度等生化性质各不相同。选择单抗的纯化方法，既要了解它们的共性，又要了解它们的个性，从而制定相应的纯化策略(表1)。/pp　　1.1 抗体药物下游工艺一般策略/pp　　CHO和NSO等哺乳动物细胞表达系统主要用来生产治疗性单抗，临床剂量大(数十至几百毫克/dose)，批产量达公斤级，纯度要求极高。层析技术是抗体分离纯化的核心技术，一般采用经典的三步纯化策略：粗纯-中间纯化-精细纯化。粗纯的主要目的是捕获、浓缩和稳定样品，约80%的下游工艺用Protein A亲和层析进行快速捕获，一步即可达到95%以上的纯度。治疗用抗体一般使用动物细胞大规模高密度无血清悬浮培养进行生产，不仅对终产品的单体含量有严格的规定，还必须去除各种潜在的杂质以满足药品安全的要求，因此在粗纯之后还需要进行中间纯化和精细纯化，去除宿主细胞蛋白(HCP)、宿主DNA、抗体聚集体和变体等，常用的层析技术有离子交换、凝胶过滤、疏水层析等[4]。/pp　　2003 年初，中国SFDA下属的中国药品与生物制品检定所(NICPBP)公布了《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》[5]。生产者除须保证最终抗体产品纯度，还需要验证所用的纯化方法能有效对潜在的污染物，如HCP、免疫球蛋白、宿主DNA、用于生产腹水抗体的刺激物、内毒素、培养液成分、层析凝胶析出成分(脱落的Protein A配基)进行去除 并能有效的去除/灭活病毒。也就是说，在设计下游工艺时，需多角度综合考虑抗体本身的性质、抗体的来源、发酵培养技术、发酵液蛋白浓度、宿主杂质、抗体批间的差异、潜在污染及病毒灭活等问题。此外，治疗用抗体在生产和纯化过程中还会由于糖基化程度不同、蛋白酶作用、以及脱氨基和脱酰胺等反应而产生带电性质不同的多种抗体变体 另外，抗体氧化、聚集和片段化也是常见的降解途径[4]。针对这些变体，一方面，在表达和纯化过程中选择参数(如pH、盐浓度等)时要充分考虑到目标抗体的稳定性 另一方面，应控制细胞培养的条件(DO、渗透压等)，同时加快下游分离纯化的速度，最大程度上避免抗体在纯化过程中产生变体，从而保证终产品的均一性和高的比活，也有利于控制终产品的内毒素水平。/pp style="text-align: center "span style="font-size: 14px "　　表1 单抗特性及纯化策略/span/pp style="text-align: center "img title="11111.png" style="float: none " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/e2693d21-e711-4b42-bb9c-53b5b7848f82.jpg"//pp style="text-align: center "img title="2222.png" style="float: none " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/5035b8d3-81f1-4e6b-96d7-3e12b347a344.jpg"//pp　　1.2 新型的两步层析技术与纯化工艺整合/pp　　近年来，GE Healthcare公司开发出了新型的亲和捕获介质Mabselect SuRe和混合作用模式的强阴离子交换介质Capto adhere(这两种介质的主要特点将在下文详细介绍)。凭借着MabSelect SuRe的卓越性能以及Capto adhere的复合多除杂功能，使得抗体纯化工艺由经典的三步层析转变为两步层析得以实现。这种新型的两步层析技术的工艺流程是：在细胞培养表达以后，采用0.2-0.45μm的中空纤维膜技术进行澄清，然后用MabSelect SuRe捕获，酸性条件洗脱后直接pH 4.0 病毒灭活，澄清过滤后穿透方式上Capto adhere，这一步离子交换之前或之后会有一步20nm纳滤去病毒，最后50K膜超滤浓缩和洗滤进行缓冲液置换。整个工艺如图1,这一工艺平台已经尝试过多个不同的抗体并取得成功(表2),同时很多实验表明这一工艺平台适合多数抗体的生产。有些抗体如果通过优化结果不甚满意, 通过增加一步Capto Q也基本上可以达到要求或是采用Capto S-Capto Q(这两种介质的主要特点将在下文详细介绍)的工艺步骤[4]。/pp style="text-align: center "　img width="450" height="374" title="1.jpg" style="width: 435px height: 258px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/401b7d6a-ad5b-4c9a-9eee-2376ebef51fa.jpg"//pp style="text-align: center "　span style="font-size: 14px "图1　抗体生产两步层析法主导的抗体纯化最新工艺[6]/span/pp　　Mabselect SuRe可以达到99%以上的抗体纯度，亲和洗脱峰使用Capto adhere的流穿模式进行精纯：使抗体分子流穿而聚合体、HCP、脱落的Protein A配基等杂质结合在柱上加以去除。这样仅用两步层析就可以得到符合药用级质量要求的高纯度抗体产品，大大缩短了工艺时间，提高了生产效率，同时增加了收率，降低了生产成本。/pp style="text-align: center "img width="599" height="164" title="2.jpg" style="width: 580px height: 159px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/ce7191a4-3940-4315-8122-856bbbadbc24.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="font-size: 14px "表2 两步法用于多种抗体的纯化结果(括号内数值为纯化前)[4]/span/pp　　2. 抗体药物下游技术最新研究进展/pp　　2.1 样品澄清/pp　　2.1.1 中空纤维膜过滤技术/pp　　中空纤维膜是近年来发展起来的新型切向流膜分离技术,与盒式膜包相比,中空纤维膜可以直接处理高固含量和高黏度的粗料液,具有容尘量高、速度快、剪切力小、成本低等优点。目前,中空纤维微滤膜已经广泛用于生物制药的各个领域[7]。/pp　　对于动物细胞培养液,可以将高密度的培养液直接用中空纤维微滤膜(0.22或0.45μm)进行澄清,而无需事先经过离心和预过滤,步骤少,速度快,收率高,成本低。和离心机比较,具有极高的澄清度,因此中空纤维澄清后的细胞培养液可直接Protein A亲和层析进行纯化。/pp　　中空纤维膜澄清细胞培养液的优势有：(1)步骤少,速度快,收率更高(通过有效的洗滤可使样品收率稳定而且高于离心机)，同时最大程度上避免抗体降解而影响产品均一性。(2)成本低：不仅省去了连续流高速离心机昂贵的前期投资和运转的日常维护成本，还节省了离心后死端过滤的成本。中空纤维膜物理化学性质稳定，可以通过清洗而反复使用，成本低廉。(3)有利于内毒素控制：中空纤维膜稳定的化学性质可以耐受1M NaOH 40-50℃和氧化剂NaClO的清洗，从而有效去除内毒素 封闭的系统，也更有利于生产过程中内毒素的控制。此外，大部分中空纤维滤柱还可以进行高压灭菌。(4)低剪切力：中空纤维采用低剪切力的开放式流道，不仅可以处理含有高固含量的料液，还避免了蛋白质活性分子在高剪切力下的聚集变性，有利于抗体的稳定。(5)工艺耐用性强：相比死端过滤，中空纤维澄清具有很好的操作灵活性和耐用性，可以通过调整操作参数(流速、TMP)处理不同性质的细胞培养液。(6)易于线性放大：通过维持切向流速、TMP 等参数恒定，方便地进行线性放大，生产规模的处理量可达几千升料液，目前国内销售最大的中空纤维膜过滤系统已达400m2且生产稳定[8]。/pp　　2.1.2 深层过滤介质/pp　　深层过滤采用两种机制去除颗粒。首先是拦截，颗粒由于自身的物理尺寸在过滤器内被截留。它们可能被困在过滤器表面，因此根本没有进入基质，或在通过深层过滤基质的曲径时被俘获(筛选)。颗粒拦截伴随过滤器压差增高，因为它的基质被不断累积的颗粒堵塞。第二种机制是吸附，比过滤器拦截精度更小的颗粒能够从流体中被吸附去除。这种机制是通过深层过滤基质上的净电荷实现的[26]。/pp　　目前应用比较广泛的双层膜深层过滤介质有Millipore公司的Millistak+HC、Sartorius公司的Sartobran-P、Pall公司的Supradisc HP等。Millistak+HC深层过滤介质由纤维素和无机助滤剂(聚丙稀粘合的硅藻土)组成，包裹在聚丙烯外壳内 它由两层全厚度深层滤板(上游一层粗过滤和下游一层精细过滤)组成，附带一层RW01纤维素膜终过滤。Sartobran-P深层过滤介质由醋酸纤维素滤膜、聚丙烯外壳和支撑层组成，加强型的滤膜有良好的机械强度，有利于在反复的过滤和灭菌过程中保持完好无损 采用了折叠膜，在体积小巧的同时还保证了超大的过滤面积。Supradisc HP深层过滤介质由纤维素、硅藻土、带正电荷树脂和聚丙烯组成 也由两层全厚度深层滤板(上游一层粗过滤和下游一层精细过滤)组成。/pp　　2.2最新抗体捕获技术/pp　　2.2.1 MabSelect介质/pp　　MabSelect是第一个使用高流速琼脂糖凝胶作为骨架的新型Protein A层析介质，专为大规模抗体纯化而设计，适合快速高效的进行抗体生产和放大，已经成为单抗纯化和放大的标准介质。/pp　　MabSelect的特点有：(1)更高的流速和动态载量：Protein A经基因工程改造，C端含一个半胱氨酸，形成一个定向的硫酯键，同时增加了对IgG的有效结合。Protein A和凝胶偶联时采用了全新的单点偶联工艺，降低了空间位阻，因此可以在使用更高流速的条件下增加动态载量：在线形流速为500cm/hr和柱床高度为20cm(停留时间2.4min)的条件下，每毫升MabSelect的动态载量可以达到 30mg IgG。(2)更低的非特异性吸附，抗体纯度更高：Mabselect介质高度亲水性的琼脂糖骨架最大程度上降低了非特异性吸附，使得洗脱峰中杂蛋白和DNA更少，有利于后期抗体的精细纯化。著名的抗体生产商IDEC公司以及R.Hahn的研究显示，Mabselect对CHO细胞HCP的吸附比其它Protein A介质低7倍[9-10]。R.L.Fahrner等的研究显示，Mabselect所得抗体的DNA残留量比其它Protein A介质低30%[11]。(3)更低的Protein A脱落：MabSelect由于通过新型环氧共价交联技术，Protein A的脱落比其它同类介质低，这不仅有利于抗体纯化，还延长了介质的使用寿命，降低了生产成本。(4)更易于工艺的线性放大：通过实验室条件的优化，MabSelect 可以在保持线性流速和上样比例等参数不变的条件下，通过增加柱直径进行线性放大。(5)MabSelect 易于清洗与除菌，寿命更长、更经济：在长期连续的生产中，有效的在位清洗(CIP)有助于延长介质使用寿命，但一般的Protein A介质往往不能耐受NaOH，只能使用高浓度的尿素或盐酸胍进行清洗，效果远不如NaOH且成本非常高。而MabSelect的CIP和除菌程序简单，用很常规、经济的试剂如50mM NaOH+1M NaCl或50mM NaOH+0.5M Na2SO4就可以有效去除沉淀和变性物质 用非离子去污剂或酒精可以去除通过疏水作用结合的物质 用0.1M醋酸和20%酒精可以在位灭菌(SIP)。经测试，Mabselect配合CIP(50mMNaOH+1M NaCl)纯化三百次后，抗体产品纯度与收率不变[12]。/pp　　2.2.2 MabSelect Xtra介质/pp　　Mabselect Xtra介质是在Mabselect介质的基础上优化而来，是目前市场上所有的商品化Protein A介质中载量最高的亲和层析介质之一。它除了具有MabSelect介质的全部特点外，还具有载量最高和非特异性吸附更低的特点。/pp　　Mabselect Xtra介质使用孔径更大的多孔高流速琼脂糖作为骨架，同时减小介质粒径。这样不仅增加了比表面积和配基密度，还降低了传质阻力，从而有效的增加了动态载量。其动态载量超过41mg/ml，在工艺生产过程中可以有效减少层析柱的体积，从而降低生产成本。R.Hahn的研究显示，Mabselect Xtra对CHO细胞HCP的吸附比其它Protein A介质更是低了近10倍[13]。/pp　　2.2.3 MabSelect SuRe介质/pp　　MabSelect SuRe介质也是在Mabselect介质的基础上优化而来，是目前市场上唯一耐强碱的Protein A亲和层析介质，寿命最长，稳定性最好[10]。它除了具有MabSelect介质的全部特点外，还具有以下特点：(1)可以耐受0.1-0.5M NaOH：MabSelectSuRe具有不同于其它Protein A介质的同型四聚体配基-SuRe配基，即使在强碱条件下也不易变性或脱落，可以用高达0.5M NaOH进行CIP和SIP，能有效去除沉淀和变性物质，大大降低了抗体产品被内毒素污染和批间交叉污染的风险，有利于延长介质使用寿命，同时还大大降低了CIP和SIP的成本。(2)更温和的洗脱，避免抗体聚集，提高收率：同型四聚体配基避免了不同配基与抗体Fc段亲和性的差异，也消除了某些域对Fab段的亲和作用，使得洗脱条件更加均一而温和。Mabselect SuRe介质可以用更高的pH进行洗脱，有效避免了抗体在低pH下的聚集，产品纯度和均一性更高，浊度也更低[14]。(3)不同抗体洗脱所需pH差异小：由于消除了对抗体Fab段的亲和作用，使得同一种属亚型的不同抗体分子洗脱所需的条件更接近，有利于平台技术的建立，进一步降低了不同的抗体分离纯化工艺的研发成本。(4)SuRe 配基稳定性更好：SuRe配基对碱和蛋白酶更稳定，纯化过程中脱落更少( 10ppm)，有利于后期脱落配基的进一步去除。/pp　　2.2.4 ProSep-vA Ultra介质/pp　　ProSep-vA Ultra介质是将自然界非动物性来源的Protein A交联于700Å 的多孔性玻璃珠骨架上，是刚性和不可压缩的介质。ProSep-vA Ultra介质具有如下特点：低反压性 不收缩、不溶胀 高动态载量 极低的Protein A脱落 高重复使用性，标准化的清洗和除菌操作[27]。/pp　　2.2.5 ProSep Ultra Plus介质/pp　　ProSep Ultra Plus介质是在ProSep-vA Ultra介质基础上优化而来，也是目前市场上所有的商品化Protein A介质中载量最高的亲和层析介质之一。它除了具有ProSep-vA Ultra介质的全部特点外，还具有载量最高、纯化效率更高、工艺更易于放大、成本更低等特点[28]。/pp　　2.2.6 MEP Hypercel介质/pp　　MEP Hypercel复合作用模式介质是一种灵活的层析介质设计，也称之为疏水电荷诱导层析(HCIC)，用于捕获和纯化从实验室到生产规模的抗体和各种重组蛋白。MEP Hypercel介质由一个独特的连接4-巯基乙基吡啶(4-MEP)的刚性纤维素骨架组成。纤维素骨架赋予高孔隙率、化学稳定性和低非特异性吸附。平均直径80-100μm，在低反压下有优良的流速特性。MEP Hypercel介质在大规模使用时具有显著优势，基于它的配基结构，可选择性地捕获免疫球蛋白。组合其它传统的方法如离子交换、疏水作用，甚至用在Protein A之后从不同的料液中直接捕获或中度纯化抗体，以增强对宿主DNA、HCP和聚合体的清除。MEP Hypercel介质有助于建立一个简化的工艺流程，节省操作步骤(例如洗滤、超滤等) 预计有更长的使用寿命，因为它可以耐受苛刻的CIP方法(0.5-1M NaOH，30-60分钟接触时间)，而所有因素都有利于降低成本[29]。/pp　　2.3最新精细纯化技术/pp　　2.3.1 CaptoFamily系列介质/pp　　新型的Capto S，Q系列介质是以高流速琼脂糖为骨架，同时交联了非常“柔软”的葡聚糖链，这样不仅增加了比表面积，同时降低了传质阻力和空间位阻，使得介质在高流速下的动态载量大大增加，有利于提高生产效率，降低成本。/pp　　Capto S，Q系列介质可以装填在直径60cm的工业层析柱中使用高达500cm/h 的流速进行纯化(柱高30cm)。这样不仅有利于工艺放大后大规模层析柱的填装，还大大提高了生产效率，每步层析更短的操作时间也有效避免了抗体分子在分离纯化过程中产生各种变体和聚合体，使得收率更好，终产品的活性更高、性质更均一。/pp　　2.3.2 Captoadhere介质/pp　　为了进一步减少抗体分离纯化步骤，提高特定杂质的去除效率，以满足日益增长的治疗用抗体的生产需要，2007 年初，GE Healthcare公司推出了新型复合作用模式的强阴离子交换介质：Capto adhere介质。Capto adher介质专为治疗用抗体的分离纯化而设计，其配基综合了阴离子交换、氢键和疏水等多种复杂的作用方式，因此对于抗体的聚合体具有非常独特而高效的去除能力。此外，通过有效的实验设计(DoE)，流穿模式的Capto adher介质还可以同时有效去除脱落的Protein A配基、HCP、宿主DNA、内毒素和潜在的病毒，并使得结合MabSelect SuRe的抗体两步层析纯化工艺成为现实(表3)。Capto adhere还具有很强的病毒去除能力，如MVM病毒的去除能力可达5.9个Log。目前，新型的两步法抗体层析纯化工艺已经被国内外诸多知名药企广泛用于多种抗体的分离纯化，各项指标均符合治疗用抗体的要求。Capto adher层析还可以和阴离子交换(Capto Q)和疏水层析等结合使用，以达到更高的质量要求[15]。/pp style="text-align: center "　　img title="3.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/4aa1c980-c9be-44e9-82b5-899ba9f7eec9.jpg"//pp style="text-align: center "span style="font-size: 14px "表3 两步层析纯化工艺对污染物的去除效果[15]/span/pp　　2.3.3膜层析技术/pp　　PALL Life Science公司自10余年前颠覆性地开发出独一无二的层析产品-Mustang膜层析系列产品后，经过不断地技术改造，于近年推出全新Mustang Q XT家族，扩展了膜层析工艺放大产品线。膜层析技术，相对于传统的柱层析，无需层析填料和层析柱等复杂构件，直接通过膜式过滤器，经过简单的过滤环节即可达到纯化目的。Mustang Q以16层超级打褶的聚醚砜过滤膜作为基架，上面偶联了季胺基等功能基团，可以使生物分子流经的时候与功能位点迅速结合，具有高流速和高动态载量等优点。/pp　　Sartorius Stedim公司也开发出了一整套膜层析技术，包括Sartobind S,Q,C和D离子交换、Sartobind IDA(亚氨基二乙酸)金属螯合、Sartobind醛、Sartobind环氧基和Sartobind Protein A(重组)等膜层析系列产品。Sartobind在很多蛋白和病毒纯化应用中可以取代传统耗时、繁琐的层析步骤。膜吸附器的快速纯化特点使蛋白分离可以在高流速下获得高收率，较传统柱层析流速最高能提高100倍，达到20-40 CV/min。传统颗粒胶95%以上的结合位点集中在颗粒胶内部。Sartobind膜层析的结合位点是均一地交联到交叉偶联的增强纤维素骨架内0.5-1μm厚的薄层上。大孔结构和快速吸附结合特性使膜吸附器可以忽略扩散时间因素。同时多微孔膜结构不存在传统颗粒胶的孔内扩散问题。在对流情况下，流动相的分子运动只由泵压力决定。因此，膜吸附器具有操作周期极短、流速和处理能力极高的特点[30]。/pp　　与离子交换柱层析相比，离子交换膜层析技术已经被证明利用高动态结合能力吸附大量的生物分子，如病毒、HCP和宿主DNA。最近，阴离子交换膜层析技术已经被作为柱层析技术的替代技术用于Protein A亲和捕获后的mAb中微量污染物的去除[16]。/pp　　2.4终产品的浓缩洗滤/pp　　多维纯化得到的洗脱峰可以用Kvick Lab/Process盒式膜包进行快速浓缩和缓冲液置换。Kvick盒式膜包的优点有：(1)无热原：很多时候，仅用0.5M NaOH 清洗难以彻底去除膜表面的热原。Kvick盒式膜包化学性质非常稳定，可以使用1M NaOH在40-50℃下进行彻底的SIP/CIP，避免最终超滤浓缩时引入热原而影响产品质量。(2)孔径均一、速度快：Kvick盒式膜包孔径更均一，甚至可以使用50-100K的膜包进行抗体浓缩而不漏过，速度更快，大大节省了操作时间。(3)易于线性放大：通过保持流速、TMP等参数恒定，可以直接线性放大到生产规模。/pp　　Amicon Ultra系列超滤离心管可以用来进行抗体的快速浓缩、脱盐及缓冲液置换。它具有如下特点：(1)效率高：一步法离心达到25到80倍浓缩。(2)节省时间：垂直结构的膜，避免堵膜，减少浓差极化，可以用超快离心速度极短时间完成 最少10分钟即可完成浓缩、脱盐或缓冲液置换。(3)收率高：独特的反转离心设计，有利于取得最大回收率且避免了人为移液误差 低吸附滤膜和聚丙烯内壳，使回收率高达90%以上。(4)不漏液、无损失：100%完整性测试确保不漏液 独特的死体积设计避免过度离心至干，没有样品损失。(5)广泛的化学相容性：与广泛的溶剂兼容，适用于pH1-pH9，热封膜杜绝了粘合剂和下游溶出物污染。/pp　　Vivaspin系列超滤离心管同样是进行蛋白质快速浓缩和缓冲液置换的常用产品。获得专利的垂直膜配合狭长的流道设计，有效地避免滤膜堵塞，提高浓缩速度 同时在浓缩管底部设计有死端结构，确保即使离心时间过长也不会发生样品被甩干的现象。Vivaspin可灵活选用三种不同材质的超滤膜：聚醚砜、三醋酸纤维和Hydrosart。它的另一个特点是有两种回收浓缩液的方法，既可以直接用移液器从浓缩管底部吸取，也可以将浓缩液反转离心到回收管内，加盖密封保存，这两种方法都保证了高回收率。Vivaspin经过一次离心，最高可以将蛋白溶液浓缩300倍。/pp　　2.5终产品的除菌除病毒过滤/pp　　浓缩后的样品，最终经过0.22μm无菌滤器进行除菌过滤。ULTA Pure SG，HC除菌滤器具有过滤速度快、化学稳定性好、载量高和溶出物少等优点，细菌挑战实验表明其除菌能力大于7log。除菌过滤过程的优化主要从三个方面入手：操作过程中过膜压力的控制、过膜流速以及单位膜载量控制，这三个参数优化以后，可以在同种类型、材质的NFF膜上进行线性放大，否则很容易影响收率。/pp　　Durapore除菌级亲水性滤膜由亲水性PVDF材料制造，具有可靠的除菌保证以及低蛋白吸附量、低析出、无纤维脱落、广泛的化学兼容性等优点，是常用的除菌滤膜。Durapore 0.22μm亲水性滤膜用于液体除菌或去除微粒，0.1μm亲水性滤膜用于液体中去除微粒、微生物和支原体。装有Durapore亲水性滤膜的滤器有Millipak、Opticap XL、Opticap XLT、筒式滤器和Optiscale等。Millipak滤器独特的堆叠盘状设计使残留量最小并且无颗粒脱落，因此适合于高附加值产品的终端过滤和灌装。Millipak和Opticap XL滤器都有O型圈垫片和软管倒钩连接的上游排气阀和排空阀设计，使操作简单易控。Opticap XL和XLT滤器的结构设计，特别耐高温、高压条件，在除菌过程中提供更高的稳定性和可靠性，同时更易清洗。Optiscale一次性滤器专为小规模工艺筛选和工艺放大所设计，是工艺评估的理想工具。/pp　　目前被广泛应用的生物制品病毒去除的方法是纳米膜过滤。纳米膜过滤有如下优点：(1)针对性强，实用性广：纳米膜过滤只与病毒和目的蛋白的大小有关，无论病毒是否有脂包膜外壳、是否耐热，纳米膜过滤都能将之去除。(2)毒性小，下游污染少：能有效去除杀灭病毒后可能留下的如抗原和核酸蛋白混合物等病毒标志物，有效降低下游污染，是纳米膜的另一特点。大多数病毒灭活处理都使用有毒或致突变的理化试剂，从而必须在使用后从蛋白质溶液中清除，而纳米膜过滤不存在毒性问题，只是在验证中要考虑到滤器浸出物的风险。(3)蛋白活性高，回收率高：纳米膜过滤是在正常条件下的pH、渗透压和温度下进行的温和的生产步骤，其蛋白回收率和活性都很高，通常在90%—95%。基于体外分析、实验研究和临床经验，纳米膜过滤试验都没有显示出蛋白质改变或是新抗原的产生。纳米膜过滤不改变制品特性，这一特点促进了监管机构认可和产品的注册。/pp　　日本Asahi Kasei公司于1989年推出了第一款专门为清除生物制药产品中病毒颗粒而设计的过滤器Planova，由亲水铜铵再生纤维素制成的中空纤维微孔膜，装入聚碳酸酯壳体中。Millipore公司的Viresolve NFP膜是一种复合PVDF膜，过滤盒被设计来从高纯蛋白溶液中移除小型病毒，如B19，蛋白质溶液中，B19的去除量通常 4 log。PALL Life Science公司的Ultipor VF DV50和DV20膜式过滤器可以从生物流体中去除显著数量级的病毒，同时目标蛋白可以很好地通过。滤芯由三层独特的亲水、低蛋白吸附的PVDF滤膜经新月型打褶方式构成，过滤面积大，具有可靠、安全和高流量等特点。Sartorius Stedim生产的Virosart CPV为聚醚砜过滤器，能去除 4 log的PPV和 6 log的逆转录病毒。/pp　　2.5扩张柱床吸附层析技术/pp　　扩张柱床吸附层析技术(EBA)是上世纪九十年代初期进入下游生产，整合了发酵和下游纯化的技术。新一代STREAMLINE Direct扩张柱床设备及介质是EBA技术中最成熟的产品。通过条件优化，STREAMLINE能直接从浑浊的发酵液中捕获目标生物分子，细胞碎片及不吸附的杂质穿过扩张床内悬浮的介质被冲洗掉，将以往澄清、浓缩、捕获等步骤整合为一步，达到粗纯化的效果(图2)[17]。/pp　　STREAMLINE的操作过程如下[17-18]：(1)起始：将STREAMLINE介质倒入扩张柱中。(2)平衡：从下向上流的缓冲液，将STREAMLINE柱内的吸附介质悬浮起来，形成稳定的、充分平衡好的扩张床。(3)上样：发酵液带菌体从柱底进入，目标生物产品吸附在STREAMLINE介质上 不吸附的宿主杂质及菌体碎片随液流从柱顶排出。(4)淋洗/穿透：进一步用缓冲液将不吸附的杂质洗掉。(5)洗脱：洗脱液洗脱目标生物产品。(6)CIP/再生：用1M NaOH+1M NaCl进行CIP。整个操作过程如图3所示。/pp style="text-align: center "img title="4.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/07a79270-4b7d-4fe5-bc9a-125837562297.jpg"//pp style="text-align: center "　span style="font-size: 14px "　图2　传统纯化工艺与STREAMLINE [17]/span/pp style="text-align: center "img title="5.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/333de887-f92b-405d-9094-9ec89635f74d.jpg"//pp style="text-align: center "span style="font-size: 14px "　　图3 STREAMLINE的基本工作原理和操作过程[18]/span/pp style="text-align: center "　span style="font-size: 14px "　(箭头示液体过柱时的流向)/span/pp　　STREAMLINE介质是一系列包裹着石英芯，以琼脂糖为骨架的介质。特殊设计的STREAMLINE扩张柱床可以产生稳定的向上拔的扩张液流，每一颗不同比重的STREAMLINE介质，悬浮在自身重力和扩张升力平衡的位置原地扰动。STREAMLINE 技术是稳态扩张，样品流均匀分布整个床体，目标产物吸附均匀，穿透小，回收率高，类似于固定床吸附性层析[19]。/pp　　3. 抗体最新下游技术应用实例/pp　　Lonza Biologics公司是全球最大的抗体合同生产商之一，为了开发一个稳定的20000L的抗体生产工艺，其纯化开发部门对多个不同的抗体亲和层析凝胶进行了有效的比较，他们发现Mabselect SuRe的动态载量高、使用寿命最长、Protein A脱落最低，实验数据明确支持放大到1.4m直径的柱子用于20000L培养规模的经济生产[4]。/pp　　德国的Roche公司一种用于肿瘤治疗的单抗已进入临床Ⅲ期。他们将目前几种Protein A介质进行充分的比较之后，选择了高载量、更易于装柱和寿命更长的Mabselect。目的抗体是通过无血清培养的转染的杂交B淋巴细胞表达的IgG1。将过滤后的无细胞上清上样到Mabselect填充的FineLINE柱，直径300cm，柱高20cm，上样的浓度是30mg/ml。洗脱后，洗脱液立即用磷酸钾中和pH值到6.8-7.0，再用凝胶过滤检测，结果表明比活超过90%，纯度在95%以上[20]。/pp　　Cytheris公司是法国一家生物制药公司，目前正在研制一种用CHO细胞表达的免疫调节剂(临床Ⅱ期)。原先的工艺采用传统层析法，但不能稳定去除病毒。改进后，在工艺的第一步使用Mustang Q对污染物进行捕获，取得了25%去除率的良好结果 同时对MVM、MLV和Re03三种病毒也达到超过4个Log的滴度降效果，而整个工艺对病毒的去除效率普遍提高了7-11个Log。说明Mustang Q的使用对下游层析起到了很好的保护作用。/pp　　在第五届生物制药工艺优化大会上，Crucell公司介绍了他们对腺病毒(AAV)纯化工艺的摸索。与传统的层析填料相比，Mustang Q膜层析的开放孔道的设计使对病毒的动态载量大大提高30倍左右，回收率在80%以上。用40L的膜层析柱相当于1000L的传统层析柱的效果，节省了验证工作，提高了工艺经济性，十分有利于放大生产。/pp　　德国的Boehringer Mannheim公司生物制药部，用STREAMLINE技术代替传统工艺生产400L CHO细胞培养的Fc融合蛋白，结果样品回收率提高14%，缓冲液减少25%，时间缩短47%[17]。/pp　　世界最大的制药公司-GlaxoSmithKline公司，使用特别设计的BioProcess全自动层析系统和STREAMLINE扩张柱生产药用脂蛋白疫苗，比原工艺产品体积缩小2倍，纯化系数1.5，内毒素减少100倍[17]。/pp　　日本YOSHITOMI公司正在使用多套STREAMLINE 1000系统生产人重组白蛋白，与原生产工艺产品纯度相同，产率提高30%，时间减少一半，年产量为12.5吨[17]。/pp　　AVECIA公司重新设计临床Ⅲ期药品生产工艺，选用STREAMLINE技术及SOURCE新型凝胶，生产效率提高12倍，回收率提高1倍[17]。/pp　　2001年，ILEX制药公司的CAMPATH获得FDA批准。该单克隆抗体使用Sartobind Q离子交换层析模块以流穿的方式进行精制，这是膜吸附器首次被批准应用于治疗性蛋白的生产，证明了膜层析技术通过了证实和测试[30]。/pp　　4. 展望/pp　　随着抗体产品上游大规模高效培养技术的进一步发展,实验室规模哺乳动物细胞表达水平可以达到25g/L，如果这一水平能够有效放大到生产,将对下游生产纯化带来更大的压力。所以下游纯化工艺的技术发展也是势在必行。/pp　　以下一些发展方向可能成为下游工艺未来发展的重要关注点：(1)刚性更好、载量更高、耐碱性更好的完全亲水琼脂糖凝胶的开发[4]。(2)优化操作次序，降低缓冲液消耗的更大规模生产线的应用[21]。(3)通过单抗的氨基酸序列预测下游工艺关键参数：亲和层析洗脱pH条件、离子交换层析洗脱pH和盐浓度条件、病毒灭活pH等[22]。(4)下游工艺的成本消耗占全部成本的50-80%，亲和捕获是下游工艺的最关键步骤，通过改进亲和配体，提高捕获能力，节省成本[23]。(5)新型层析系统全程实时控制纯化过程，在线检测HCP、宿主DNA、Protein A等的含量[24]。(6)由于在去除杂质方面的优势，膜层析将会得到飞速的发展，未来工艺甚至可能完全基于膜层析而不是柱层析[25]。/pp　　参考文献/pp　　[1] 刘亚明,薛章.生物制药：迎接抗体药物的黄金时代.医药细分子行业研究报告,2009./pp　　[2] 陈志南.基于抗体药物的我国生物制药产业化发展前景.2008中国药学会学术年会暨第八届中国药师周论文集,2008./pp　　[3]Gail Dutton.Trends in Monoclonal AntibodyProduction.Feature Articles,2010, 30(4)./pp　　[4]孙文改,苗景赟.抗体生产纯化技术.中国生物工程杂志,2008,28(10):141-152./pp　　[5]《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》.NICPBP(中国药品与生物制品检定所),2003./pp　　[6]Capto adhere：用于生产单抗的两步纯化操作.GE Healthcare公司技术资料./pp　　[7]中空纤维滤柱分离纯化应用集锦.GE Healthcare公司技术资料./pp　　[8]中空纤维膜过滤技术在单抗生产中的应用.GE Healthcare公司技术资料./pp　　[9]Amersham Biosciences.Downstream Gab’02 Abstracts,Extended Reports from the 2nd International Symposium on DownstreamProcessing of Genetically Engineered Abtibodies and Related Molecules. PortoPortugal,2002,12-14./pp　　[10] R.Hahn,R.Schlegel,A.Jungbauer.Comparison of Protein A affinity sorbents.JChromatogr B,2003，790：35-51./pp　　[11] R.L.Fahrner,et al. Performancecomparison of Protein A affinity chromatography sorbents for purifyingrecombinant monoclonal antibodies.BiotechnolAppl Biochem,1999，30：121-128./pp　　[12] K.Brorson,J.Brown,et al.Identification of protein A media performanceattributes that can be monitored as surrogates for retrovirus clearance duringextended re-use.Journal ofChromatography A,2003，989：155-163./pp　　[13] R.Hahn,et al.Comparison of Protein A affinity sorbents Ⅲ,Life time study.J Chromatogr A,2006，1102：224-231./pp　　[14] S. Ghose,et al. Antibody Variable RegionInteractions with Protein A: Implications for the Development of GenericPurification Processes. Biotechnol Bioeng,2005，92(6)：665-673./pp　　[15]用复合配基阴离子交换柱去除单克隆抗体(Mab)的污染物.BioProcessInternational技术资料./pp　　[16]利用Mustang Q膜层析从Protein A纯化的单克隆抗体中去除污染. PALL LifeScience公司技术资料./pp　　[17]整合发酵和下游纯化的新技术：扩张柱床吸附技术.GE Healthcare公司技术资料./pp　　[18]余晓玲,米力，姚西英，陈志南.扩张柱床吸附层析与固定柱床层析纯化单克隆抗体的比较.中国生物工程杂志,2003,23(1):61-64./pp　　[19]High-throughput monoclonal antibody purification.GE Healthcare公司技术资料./pp　　[20]抗体纯化手册.GE Healthcare公司技术资料./pp　　[21]Purification Strategies to Process 5 g/L Titers ofMonoclonal Antibodies. BioPharm International技术资料./pp　　[22] T.Ishihara,T.Kadoya.Accelerated purification process development ofmonoclonal antibodies for shortening time to clinic:Designand case study of chromatography processes.J Chromatogr A,2007，1176(1-2)：149-156./pp　　[23] A.Cecilia,A.Roque,et al.Antibodies and Genetically Engineered RelatedMolecules:Production and Purification.BiotechnolProg,2004，20：639-654./pp　　[24] S.Flatman,I.Alam,et al.Process analytics for purification of monoclonal antibodies.JChromatogr B,2007，848：79-87./pp　　[25]ProcessChromatography:Five Decades of Innovation.BioPharmInternational技术资料./pp　　[26]双层滤板膜堆在单抗工艺上的大规模澄清过滤应用评估.BioProcessInternational技术资料./pp　　[27]Affinity Chromatography Media.Millipore公司技术资料./pp　　[28]ProSep Ultra Plus ChromatographyMedia.Millipore公司技术资料./pp　　[29]MEP Hypercel混合模式层析填料. PALL LifeScience公司技术资料./pp　　[30]Sartobind膜层析技术高效的蛋白纯化工具. SartoriusStedim公司技术资料./pp/p

p　　随着抗体药物上游大规模高效培养技术的飞速发展，抗体蛋白的表达浓度有了大幅度的提高，这给下游纯化工艺带来了巨大的压力。为了突破下游技术瓶颈，整个世界生物制药产业都加大了对下游技术的革新力度，近年来也取得了丰硕的成果。本文就抗体药物的纯化策略、最新技术进展以及技术应用等方面做一个调研，以期能对本部门的相关研究工作有所助益。br//pp　　自1997年来，全球抗体药物市场经历了一个快速发展的阶段，总销售额从1997年的3.1亿美元增长到2008年的400亿美元，复合增长率高达55%，而且增长势头还在持续 [1]。国际上通常把年销售额超过10 亿美元的品牌药称为“重磅炸弹”药物，很大一部分抗体药物都已迈入“重磅炸弹”行列。在2008年全球15大药品中，抗体药物占据了1/3，且排名仍在上升，这意味着几乎每种单抗药物的成功开发都代表着巨大的市场前景[2]。受益于此，全球主要的生物制药公司都获利颇丰，可见抗体药物具有巨大的经济价值和社会价值。br//pp　　抗体药物生产技术门槛高，需要掌握抗体筛选、抗体重组、高表达细胞株构建和大规模悬浮培养等核心技术，其下游关键技术是长期以来的薄弱之处。哺乳动物细胞表达系统具有活性高、稳定性好等优点，已成为抗体等生物制品最重要的系统之一，为抗体药物的产业化提供可能。目前，国际上该项技术发展较快，已趋成熟，以默克公司为代表的流加培养生产规模达10000L以上，以贝尔公司为代表的灌流培养生产规模达200L以上，蛋白表达浓度为1-10g/L。我国在该技术领域起步较晚，基础较差，但近年来经过努力，已经实现了该项技术的突破，流加培养规模达500L以上，灌流培养规模达100L以上，蛋白表达浓度为0.2-2g/L[2]。/pp　　随着动物细胞表达抗体产品大规模高效培养技术的快速发展，下游纯化工艺越来越成为抗体药物生产中主要的技术瓶颈[3]。因此，如何提高下游工艺的生产效率就成为了抗体药物研发必须解决的问题。本文就国际上高表达抗体蛋白下游工艺的研究进展做一个调研，使本人及同事们能了解国际上的研究成果和发展趋势，以期能对本部门的相关研究工作有所助益。/pp　　1. 抗体药物纯化策略/pp　　每个单抗的等电点、电荷密度、疏水性、糖基化程度等生化性质各不相同。选择单抗的纯化方法，既要了解它们的共性，又要了解它们的个性，从而制定相应的纯化策略(表1)。/pp　　1.1 抗体药物下游工艺一般策略/pp　　CHO和NSO等哺乳动物细胞表达系统主要用来生产治疗性单抗，临床剂量大(数十至几百毫克/dose)，批产量达公斤级，纯度要求极高。层析技术是抗体分离纯化的核心技术，一般采用经典的三步纯化策略：粗纯-中间纯化-精细纯化。粗纯的主要目的是捕获、浓缩和稳定样品，约80%的下游工艺用Protein A亲和层析进行快速捕获，一步即可达到95%以上的纯度。治疗用抗体一般使用动物细胞大规模高密度无血清悬浮培养进行生产，不仅对终产品的单体含量有严格的规定，还必须去除各种潜在的杂质以满足药品安全的要求，因此在粗纯之后还需要进行中间纯化和精细纯化，去除宿主细胞蛋白(HCP)、宿主DNA、抗体聚集体和变体等，常用的层析技术有离子交换、凝胶过滤、疏水层析等[4]。/pp　　2003 年初，中国SFDA下属的中国药品与生物制品检定所(NICPBP)公布了《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》[5]。生产者除须保证最终抗体产品纯度，还需要验证所用的纯化方法能有效对潜在的污染物，如HCP、免疫球蛋白、宿主DNA、用于生产腹水抗体的刺激物、内毒素、培养液成分、层析凝胶析出成分(脱落的Protein A配基)进行去除 并能有效的去除/灭活病毒。也就是说，在设计下游工艺时，需多角度综合考虑抗体本身的性质、抗体的来源、发酵培养技术、发酵液蛋白浓度、宿主杂质、抗体批间的差异、潜在污染及病毒灭活等问题。此外，治疗用抗体在生产和纯化过程中还会由于糖基化程度不同、蛋白酶作用、以及脱氨基和脱酰胺等反应而产生带电性质不同的多种抗体变体 另外，抗体氧化、聚集和片段化也是常见的降解途径[4]。针对这些变体，一方面，在表达和纯化过程中选择参数(如pH、盐浓度等)时要充分考虑到目标抗体的稳定性 另一方面，应控制细胞培养的条件(DO、渗透压等)，同时加快下游分离纯化的速度，最大程度上避免抗体在纯化过程中产生变体，从而保证终产品的均一性和高的比活，也有利于控制终产品的内毒素水平。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/1eb75a7d-0f0f-4f60-8224-a3984ccff0e3.jpg" title="表1.png" alt="表1.png"//pp style="text-align: center "img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/f8ff0f67-6f0b-4295-ab81-05543e5efbd8.jpg" title="表2.png" alt="表2.png"/br/strong表1 单抗特性及纯化策略/strong/pp　　1.2 新型的两步层析技术与纯化工艺整合/pp　　近年来，GE Healthcare公司开发出了新型的亲和捕获介质Mabselect SuRe和混合作用模式的强阴离子交换介质Capto adhere(这两种介质的主要特点将在下文详细介绍)。凭借着MabSelect SuRe的卓越性能以及Capto adhere的复合多除杂功能，使得抗体纯化工艺由经典的三步层析转变为两步层析得以实现。这种新型的两步层析技术的工艺流程是：在细胞培养表达以后，采用0.2-0.45μm的中空纤维膜技术进行澄清，然后用MabSelect SuRe捕获，酸性条件洗脱后直接pH 4.0病毒灭活，澄清过滤后穿透方式上Capto adhere，这一步离子交换之前或之后会有一步20nm纳滤去病毒，最后50K膜超滤浓缩和洗滤进行缓冲液置换。整个工艺如图1,这一工艺平台已经尝试过多个不同的抗体并取得成功(表2),同时很多实验表明这一工艺平台适合多数抗体的生产。有些抗体如果通过优化结果不甚满意, 通过增加一步Capto Q也基本上可以达到要求或是采用Capto S-Capto Q(这两种介质的主要特点将在下文详细介绍)的工艺步骤[4]。/pp style="text-align: center "　　img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/a804fe1c-9660-4ab2-8cc4-177870630ce5.jpg" title="图1.png" alt="图1.png" style="text-align: center "//pp style="text-align: center "strong图1　抗体生产两步层析法主导的抗体纯化最新工艺[6]/strong/pp　　Mabselect SuRe可以达到99%以上的抗体纯度，亲和洗脱峰使用Capto adhere的流穿模式进行精纯：使抗体分子流穿而聚合体、HCP、脱落的Protein A配基等杂质结合在柱上加以去除。这样仅用两步层析就可以得到符合药用级质量要求的高纯度抗体产品，大大缩短了工艺时间，提高了生产效率，同时增加了收率，降低了生产成本。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/3ef7b3a2-9f79-4e74-8a71-6a6cbcbea5ec.jpg" title="图2.png" alt="图2.png"//pp style="text-align: center "strong表2 两步法用于多种抗体的纯化结果(括号内数值为纯化前)[4]/strong/pp　　2. 抗体药物下游技术最新研究进展/pp　　2.1 样品澄清/pp　　2.1.1 中空纤维膜过滤技术/pp　　中空纤维膜是近年来发展起来的新型切向流膜分离技术,与盒式膜包相比,中空纤维膜可以直接处理高固含量和高黏度的粗料液,具有容尘量高、速度快、剪切力小、成本低等优点。目前,中空纤维微滤膜已经广泛用于生物制药的各个领域[7]。/pp　　对于动物细胞培养液,可以将高密度的培养液直接用中空纤维微滤膜(0.22或0.45μm)进行澄清,而无需事先经过离心和预过滤,步骤少,速度快,收率高,成本低。和离心机比较,具有极高的澄清度,因此中空纤维澄清后的细胞培养液可直接Protein A亲和层析进行纯化。/pp　　中空纤维膜澄清细胞培养液的优势有：(1)步骤少,速度快,收率更高(通过有效的洗滤可使样品收率稳定而且高于离心机)，同时最大程度上避免抗体降解而影响产品均一性。(2)成本低：不仅省去了连续流高速离心机昂贵的前期投资和运转的日常维护成本，还节省了离心后死端过滤的成本。中空纤维膜物理化学性质稳定，可以通过清洗而反复使用，成本低廉。(3)有利于内毒素控制：中空纤维膜稳定的化学性质可以耐受1M NaOH 40-50℃和氧化剂NaClO的清洗，从而有效去除内毒素 封闭的系统，也更有利于生产过程中内毒素的控制。此外，大部分中空纤维滤柱还可以进行高压灭菌。(4)低剪切力：中空纤维采用低剪切力的开放式流道，不仅可以处理含有高固含量的料液，还避免了蛋白质活性分子在高剪切力下的聚集变性，有利于抗体的稳定。(5)工艺耐用性强：相比死端过滤，中空纤维澄清具有很好的操作灵活性和耐用性，可以通过调整操作参数(流速、TMP)处理不同性质的细胞培养液。(6)易于线性放大：通过维持切向流速、TMP 等参数恒定，方便地进行线性放大，生产规模的处理量可达几千升料液，目前国内销售最大的中空纤维膜过滤系统已达400m2且生产稳定[8]。/pp　　2.1.2 深层过滤介质/pp　　深层过滤采用两种机制去除颗粒。首先是拦截，颗粒由于自身的物理尺寸在过滤器内被截留。它们可能被困在过滤器表面，因此根本没有进入基质，或在通过深层过滤基质的曲径时被俘获(筛选)。颗粒拦截伴随过滤器压差增高，因为它的基质被不断累积的颗粒堵塞。第二种机制是吸附，比过滤器拦截精度更小的颗粒能够从流体中被吸附去除。这种机制是通过深层过滤基质上的净电荷实现的[26]。/pp　　目前应用比较广泛的双层膜深层过滤介质有Millipore公司的Millistak+HC、Sartorius公司的Sartobran-P、Pall公司的Supradisc HP等。Millistak+HC深层过滤介质由纤维素和无机助滤剂(聚丙稀粘合的硅藻土)组成，包裹在聚丙烯外壳内 它由两层全厚度深层滤板(上游一层粗过滤和下游一层精细过滤)组成，附带一层RW01纤维素膜终过滤。Sartobran-P深层过滤介质由醋酸纤维素滤膜、聚丙烯外壳和支撑层组成，加强型的滤膜有良好的机械强度，有利于在反复的过滤和灭菌过程中保持完好无损 采用了折叠膜，在体积小巧的同时还保证了超大的过滤面积。Supradisc HP深层过滤介质由纤维素、硅藻土、带正电荷树脂和聚丙烯组成 也由两层全厚度深层滤板(上游一层粗过滤和下游一层精细过滤)组成。/pp　　2.2最新抗体捕获技术/pp　　2.2.1 MabSelect介质/pp　　MabSelect是第一个使用高流速琼脂糖凝胶作为骨架的新型Protein A层析介质，专为大规模抗体纯化而设计，适合快速高效的进行抗体生产和放大，已经成为单抗纯化和放大的标准介质。/pp　　MabSelect的特点有：(1)更高的流速和动态载量：Protein A经基因工程改造，C端含一个半胱氨酸，形成一个定向的硫酯键，同时增加了对IgG的有效结合。Protein A和凝胶偶联时采用了全新的单点偶联工艺，降低了空间位阻，因此可以在使用更高流速的条件下增加动态载量：在线形流速为500cm/hr和柱床高度为20cm(停留时间2.4min)的条件下，每毫升MabSelect的动态载量可以达到 30mg IgG。(2)更低的非特异性吸附，抗体纯度更高：Mabselect介质高度亲水性的琼脂糖骨架最大程度上降低了非特异性吸附，使得洗脱峰中杂蛋白和DNA更少，有利于后期抗体的精细纯化。著名的抗体生产商IDEC公司以及R.Hahn的研究显示，Mabselect对CHO细胞HCP的吸附比其它Protein A介质低7倍[9-10]。R.L.Fahrner等的研究显示，Mabselect所得抗体的DNA残留量比其它Protein A介质低30%[11]。(3)更低的Protein A脱落：MabSelect由于通过新型环氧共价交联技术，Protein A的脱落比其它同类介质低，这不仅有利于抗体纯化，还延长了介质的使用寿命，降低了生产成本。(4)更易于工艺的线性放大：通过实验室条件的优化，MabSelect 可以在保持线性流速和上样比例等参数不变的条件下，通过增加柱直径进行线性放大。(5)MabSelect 易于清洗与除菌，寿命更长、更经济：在长期连续的生产中，有效的在位清洗(CIP)有助于延长介质使用寿命，但一般的Protein A介质往往不能耐受NaOH，只能使用高浓度的尿素或盐酸胍进行清洗，效果远不如NaOH且成本非常高。而MabSelect的CIP和除菌程序简单，用很常规、经济的试剂如50mM NaOH+1M NaCl或50mM NaOH+0.5M Na2SO4就可以有效去除沉淀和变性物质 用非离子去污剂或酒精可以去除通过疏水作用结合的物质 用0.1M醋酸和20%酒精可以在位灭菌(SIP)。经测试，Mabselect配合CIP(50mMNaOH+1M NaCl)纯化三百次后，抗体产品纯度与收率不变[12]。/pp　　2.2.2 MabSelect Xtra介质/pp　　Mabselect Xtra介质是在Mabselect介质的基础上优化而来，是目前市场上所有的商品化Protein A介质中载量最高的亲和层析介质之一。它除了具有MabSelect介质的全部特点外，还具有载量最高和非特异性吸附更低的特点。/pp　　Mabselect Xtra介质使用孔径更大的多孔高流速琼脂糖作为骨架，同时减小介质粒径。这样不仅增加了比表面积和配基密度，还降低了传质阻力，从而有效的增加了动态载量。其动态载量超过41mg/ml，在工艺生产过程中可以有效减少层析柱的体积，从而降低生产成本。R.Hahn的研究显示，Mabselect Xtra对CHO细胞HCP的吸附比其它Protein A介质更是低了近10倍[13]。/pp　　2.2.3 MabSelect SuRe介质/pp　　MabSelect SuRe介质也是在Mabselect介质的基础上优化而来，是目前市场上唯一耐强碱的Protein A亲和层析介质，寿命最长，稳定性最好[10]。它除了具有MabSelect介质的全部特点外，还具有以下特点：(1)可以耐受0.1-0.5M NaOH：MabSelectSuRe具有不同于其它Protein A介质的同型四聚体配基-SuRe配基，即使在强碱条件下也不易变性或脱落，可以用高达0.5M NaOH进行CIP和SIP，能有效去除沉淀和变性物质，大大降低了抗体产品被内毒素污染和批间交叉污染的风险，有利于延长介质使用寿命，同时还大大降低了CIP和SIP的成本。(2)更温和的洗脱，避免抗体聚集，提高收率：同型四聚体配基避免了不同配基与抗体Fc段亲和性的差异，也消除了某些域对Fab段的亲和作用，使得洗脱条件更加均一而温和。Mabselect SuRe介质可以用更高的pH进行洗脱，有效避免了抗体在低pH下的聚集，产品纯度和均一性更高，浊度也更低[14]。(3)不同抗体洗脱所需pH差异小：由于消除了对抗体Fab段的亲和作用，使得同一种属亚型的不同抗体分子洗脱所需的条件更接近，有利于平台技术的建立，进一步降低了不同的抗体分离纯化工艺的研发成本。(4)SuRe 配基稳定性更好：SuRe配基对碱和蛋白酶更稳定，纯化过程中脱落更少( 10ppm)，有利于后期脱落配基的进一步去除。/pp　　2.2.4 ProSep-vA Ultra介质/pp　　ProSep-vA Ultra介质是将自然界非动物性来源的Protein A交联于700Å 的多孔性玻璃珠骨架上，是刚性和不可压缩的介质。ProSep-vA Ultra介质具有如下特点：低反压性 不收缩、不溶胀 高动态载量 极低的Protein A脱落 高重复使用性，标准化的清洗和除菌操作[27]。/pp　　2.2.5 ProSep Ultra Plus介质/pp　　ProSep Ultra Plus介质是在ProSep-vA Ultra介质基础上优化而来，也是目前市场上所有的商品化Protein A介质中载量最高的亲和层析介质之一。它除了具有ProSep-vA Ultra介质的全部特点外，还具有载量最高、纯化效率更高、工艺更易于放大、成本更低等特点[28]。/pp　　2.2.6 MEP Hypercel介质/pp　　MEP Hypercel复合作用模式介质是一种灵活的层析介质设计，也称之为疏水电荷诱导层析(HCIC)，用于捕获和纯化从实验室到生产规模的抗体和各种重组蛋白。MEP Hypercel介质由一个独特的连接4-巯基乙基吡啶(4-MEP)的刚性纤维素骨架组成。纤维素骨架赋予高孔隙率、化学稳定性和低非特异性吸附。平均直径80-100μm，在低反压下有优良的流速特性。MEP Hypercel介质在大规模使用时具有显著优势，基于它的配基结构，可选择性地捕获免疫球蛋白。组合其它传统的方法如离子交换、疏水作用，甚至用在Protein A之后从不同的料液中直接捕获或中度纯化抗体，以增强对宿主DNA、HCP和聚合体的清除。MEP Hypercel介质有助于建立一个简化的工艺流程，节省操作步骤(例如洗滤、超滤等) 预计有更长的使用寿命，因为它可以耐受苛刻的CIP方法(0.5-1M NaOH，30-60分钟接触时间)，而所有因素都有利于降低成本[29]。/pp　　2.3最新精细纯化技术/pp　　2.3.1 CaptoFamily系列介质/pp　　新型的Capto S，Q系列介质是以高流速琼脂糖为骨架，同时交联了非常“柔软”的葡聚糖链，这样不仅增加了比表面积，同时降低了传质阻力和空间位阻，使得介质在高流速下的动态载量大大增加，有利于提高生产效率，降低成本。/pp　　Capto S，Q系列介质可以装填在直径60cm的工业层析柱中使用高达500cm/h 的流速进行纯化(柱高30cm)。这样不仅有利于工艺放大后大规模层析柱的填装，还大大提高了生产效率，每步层析更短的操作时间也有效避免了抗体分子在分离纯化过程中产生各种变体和聚合体，使得收率更好，终产品的活性更高、性质更均一。/pp　　2.3.2 Captoadhere介质/pp　　为了进一步减少抗体分离纯化步骤，提高特定杂质的去除效率，以满足日益增长的治疗用抗体的生产需要，2007 年初，GE Healthcare公司推出了新型复合作用模式的强阴离子交换介质：Capto adhere介质。Capto adher介质专为治疗用抗体的分离纯化而设计，其配基综合了阴离子交换、氢键和疏水等多种复杂的作用方式，因此对于抗体的聚合体具有非常独特而高效的去除能力。此外，通过有效的实验设计(DoE)，流穿模式的Capto adher介质还可以同时有效去除脱落的Protein A配基、HCP、宿主DNA、内毒素和潜在的病毒，并使得结合MabSelect SuRe的抗体两步层析纯化工艺成为现实(表3)。Capto adhere还具有很强的病毒去除能力，如MVM病毒的去除能力可达5.9个Log。目前，新型的两步法抗体层析纯化工艺已经被国内外诸多知名药企广泛用于多种抗体的分离纯化，各项指标均符合治疗用抗体的要求。Capto adher层析还可以和阴离子交换(Capto Q)和疏水层析等结合使用，以达到更高的质量要求[15]。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/282961ea-e704-47d1-aabd-f044e108f59c.jpg" title="图3.png" alt="图3.png"//pp style="text-align: center "strong表3 两步层析纯化工艺对污染物的去除效果[15]/strong/pp　　2.3.3膜层析技术/pp　　PALL Life Science公司自10余年前颠覆性地开发出独一无二的层析产品-Mustang膜层析系列产品后，经过不断地技术改造，于近年推出全新Mustang Q XT家族，扩展了膜层析工艺放大产品线。膜层析技术，相对于传统的柱层析，无需层析填料和层析柱等复杂构件，直接通过膜式过滤器，经过简单的过滤环节即可达到纯化目的。Mustang Q以16层超级打褶的聚醚砜过滤膜作为基架，上面偶联了季胺基等功能基团，可以使生物分子流经的时候与功能位点迅速结合，具有高流速和高动态载量等优点。/pp　　Sartorius Stedim公司也开发出了一整套膜层析技术，包括Sartobind S,Q,C和D离子交换、Sartobind IDA(亚氨基二乙酸)金属螯合、Sartobind醛、Sartobind环氧基和Sartobind Protein A(重组)等膜层析系列产品。Sartobind在很多蛋白和病毒纯化应用中可以取代传统耗时、繁琐的层析步骤。膜吸附器的快速纯化特点使蛋白分离可以在高流速下获得高收率，较传统柱层析流速最高能提高100倍，达到20-40 CV/min。传统颗粒胶95%以上的结合位点集中在颗粒胶内部。Sartobind膜层析的结合位点是均一地交联到交叉偶联的增强纤维素骨架内0.5-1μm厚的薄层上。大孔结构和快速吸附结合特性使膜吸附器可以忽略扩散时间因素。同时多微孔膜结构不存在传统颗粒胶的孔内扩散问题。在对流情况下，流动相的分子运动只由泵压力决定。因此，膜吸附器具有操作周期极短、流速和处理能力极高的特点[30]。/pp　　与离子交换柱层析相比，离子交换膜层析技术已经被证明利用高动态结合能力吸附大量的生物分子，如病毒、HCP和宿主DNA。最近，阴离子交换膜层析技术已经被作为柱层析技术的替代技术用于Protein A亲和捕获后的mAb中微量污染物的去除[16]。/pp　　2.4终产品的浓缩洗滤/pp　　多维纯化得到的洗脱峰可以用Kvick Lab/Process盒式膜包进行快速浓缩和缓冲液置换。Kvick盒式膜包的优点有：(1)无热原：很多时候，仅用0.5M NaOH 清洗难以彻底去除膜表面的热原。Kvick盒式膜包化学性质非常稳定，可以使用1M NaOH在40-50℃下进行彻底的SIP/CIP，避免最终超滤浓缩时引入热原而影响产品质量。(2)孔径均一、速度快：Kvick盒式膜包孔径更均一，甚至可以使用50-100K的膜包进行抗体浓缩而不漏过，速度更快，大大节省了操作时间。(3)易于线性放大：通过保持流速、TMP等参数恒定，可以直接线性放大到生产规模。/pp　　Amicon Ultra系列超滤离心管可以用来进行抗体的快速浓缩、脱盐及缓冲液置换。它具有如下特点：(1)效率高：一步法离心达到25到80倍浓缩。(2)节省时间：垂直结构的膜，避免堵膜，减少浓差极化，可以用超快离心速度极短时间完成 最少10分钟即可完成浓缩、脱盐或缓冲液置换。(3)收率高：独特的反转离心设计，有利于取得最大回收率且避免了人为移液误差 低吸附滤膜和聚丙烯内壳，使回收率高达90%以上。(4)不漏液、无损失：100%完整性测试确保不漏液 独特的死体积设计避免过度离心至干，没有样品损失。(5)广泛的化学相容性：与广泛的溶剂兼容，适用于pH1-pH9，热封膜杜绝了粘合剂和下游溶出物污染。/pp　　Vivaspin系列超滤离心管同样是进行蛋白质快速浓缩和缓冲液置换的常用产品。获得专利的垂直膜配合狭长的流道设计，有效地避免滤膜堵塞，提高浓缩速度 同时在浓缩管底部设计有死端结构，确保即使离心时间过长也不会发生样品被甩干的现象。Vivaspin可灵活选用三种不同材质的超滤膜：聚醚砜、三醋酸纤维和Hydrosart。它的另一个特点是有两种回收浓缩液的方法，既可以直接用移液器从浓缩管底部吸取，也可以将浓缩液反转离心到回收管内，加盖密封保存，这两种方法都保证了高回收率。Vivaspin经过一次离心，最高可以将蛋白溶液浓缩300倍。/pp　　2.5终产品的除菌除病毒过滤/pp　　浓缩后的样品，最终经过0.22μm无菌滤器进行除菌过滤。ULTA Pure SG，HC除菌滤器具有过滤速度快、化学稳定性好、载量高和溶出物少等优点，细菌挑战实验表明其除菌能力大于7log。除菌过滤过程的优化主要从三个方面入手：操作过程中过膜压力的控制、过膜流速以及单位膜载量控制，这三个参数优化以后，可以在同种类型、材质的NFF膜上进行线性放大，否则很容易影响收率。/pp　　Durapore除菌级亲水性滤膜由亲水性PVDF材料制造，具有可靠的除菌保证以及低蛋白吸附量、低析出、无纤维脱落、广泛的化学兼容性等优点，是常用的除菌滤膜。Durapore 0.22μm亲水性滤膜用于液体除菌或去除微粒，0.1μm亲水性滤膜用于液体中去除微粒、微生物和支原体。装有Durapore亲水性滤膜的滤器有Millipak、Opticap XL、Opticap XLT、筒式滤器和Optiscale等。Millipak滤器独特的堆叠盘状设计使残留量最小并且无颗粒脱落，因此适合于高附加值产品的终端过滤和灌装。Millipak和Opticap XL滤器都有O型圈垫片和软管倒钩连接的上游排气阀和排空阀设计，使操作简单易控。Opticap XL和XLT滤器的结构设计，特别耐高温、高压条件，在除菌过程中提供更高的稳定性和可靠性，同时更易清洗。Optiscale一次性滤器专为小规模工艺筛选和工艺放大所设计，是工艺评估的理想工具。/pp　　目前被广泛应用的生物制品病毒去除的方法是纳米膜过滤。纳米膜过滤有如下优点：(1)针对性强，实用性广：纳米膜过滤只与病毒和目的蛋白的大小有关，无论病毒是否有脂包膜外壳、是否耐热，纳米膜过滤都能将之去除。(2)毒性小，下游污染少：能有效去除杀灭病毒后可能留下的如抗原和核酸蛋白混合物等病毒标志物，有效降低下游污染，是纳米膜的另一特点。大多数病毒灭活处理都使用有毒或致突变的理化试剂，从而必须在使用后从蛋白质溶液中清除，而纳米膜过滤不存在毒性问题，只是在验证中要考虑到滤器浸出物的风险。(3)蛋白活性高，回收率高：纳米膜过滤是在正常条件下的pH、渗透压和温度下进行的温和的生产步骤，其蛋白回收率和活性都很高，通常在90%—95%。基于体外分析、实验研究和临床经验，纳米膜过滤试验都没有显示出蛋白质改变或是新抗原的产生。纳米膜过滤不改变制品特性，这一特点促进了监管机构认可和产品的注册。/pp　　日本Asahi Kasei公司于1989年推出了第一款专门为清除生物制药产品中病毒颗粒而设计的过滤器Planova，由亲水铜铵再生纤维素制成的中空纤维微孔膜，装入聚碳酸酯壳体中。Millipore公司的Viresolve NFP膜是一种复合PVDF膜，过滤盒被设计来从高纯蛋白溶液中移除小型病毒，如B19，蛋白质溶液中，B19的去除量通常 4 log。PALL Life Science公司的Ultipor VF DV50和DV20膜式过滤器可以从生物流体中去除显著数量级的病毒，同时目标蛋白可以很好地通过。滤芯由三层独特的亲水、低蛋白吸附的PVDF滤膜经新月型打褶方式构成，过滤面积大，具有可靠、安全和高流量等特点。Sartorius Stedim生产的Virosart CPV为聚醚砜过滤器，能去除 4 log的PPV和 6 log的逆转录病毒。/pp　　2.5扩张柱床吸附层析技术/pp　　扩张柱床吸附层析技术(EBA)是上世纪九十年代初期进入下游生产，整合了发酵和下游纯化的技术。新一代STREAMLINE Direct扩张柱床设备及介质是EBA技术中最成熟的产品。通过条件优化，STREAMLINE能直接从浑浊的发酵液中捕获目标生物分子，细胞碎片及不吸附的杂质穿过扩张床内悬浮的介质被冲洗掉，将以往澄清、浓缩、捕获等步骤整合为一步，达到粗纯化的效果(图2)[17]。/pp　　STREAMLINE的操作过程如下[17-18]：(1)起始：将STREAMLINE介质倒入扩张柱中。(2)平衡：从下向上流的缓冲液，将STREAMLINE柱内的吸附介质悬浮起来，形成稳定的、充分平衡好的扩张床。(3)上样：发酵液带菌体从柱底进入，目标生物产品吸附在STREAMLINE介质上 不吸附的宿主杂质及菌体碎片随液流从柱顶排出。(4)淋洗/穿透：进一步用缓冲液将不吸附的杂质洗掉。(5)洗脱：洗脱液洗脱目标生物产品。(6)CIP/再生：用1M NaOH+1M NaCl进行CIP。整个操作过程如图3所示。/pp　　/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/dba748ae-d64e-479c-8fb1-ea738ef437da.jpg" title="图4.jpg" alt="图4.jpg"//pp style="text-align: center "strong图2　传统纯化工艺与STREAMLINE [17]/strong/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/0f71d1a8-a218-43f5-8c1f-917bd4f432a5.jpg" title="图5.png" alt="图5.png"//pp style="text-align: center "strong图3 STREAMLINE的基本工作原理和操作过程[18](箭头示液体过柱时的流向)/strong/pp　　STREAMLINE介质是一系列包裹着石英芯，以琼脂糖为骨架的介质。特殊设计的STREAMLINE扩张柱床可以产生稳定的向上拔的扩张液流，每一颗不同比重的STREAMLINE介质，悬浮在自身重力和扩张升力平衡的位置原地扰动。STREAMLINE技术是稳态扩张，样品流均匀分布整个床体，目标产物吸附均匀，穿透小，回收率高，类似于固定床吸附性层析[19]。/pp　　3. 抗体最新下游技术应用实例/pp　　Lonza Biologics公司是全球最大的抗体合同生产商之一，为了开发一个稳定的20000L的抗体生产工艺，其纯化开发部门对多个不同的抗体亲和层析凝胶进行了有效的比较，他们发现Mabselect SuRe的动态载量高、使用寿命最长、Protein A脱落最低，实验数据明确支持放大到1.4m直径的柱子用于20000L培养规模的经济生产[4]。/pp　　德国的Roche公司一种用于肿瘤治疗的单抗已进入临床Ⅲ期。他们将目前几种Protein A介质进行充分的比较之后，选择了高载量、更易于装柱和寿命更长的Mabselect。目的抗体是通过无血清培养的转染的杂交B淋巴细胞表达的IgG1。将过滤后的无细胞上清上样到Mabselect填充的FineLINE柱，直径300cm，柱高20cm，上样的浓度是30mg/ml。洗脱后，洗脱液立即用磷酸钾中和pH值到6.8-7.0，再用凝胶过滤检测，结果表明比活超过90%，纯度在95%以上[20]。/pp　　Cytheris公司是法国一家生物制药公司，目前正在研制一种用CHO细胞表达的免疫调节剂(临床Ⅱ期)。原先的工艺采用传统层析法，但不能稳定去除病毒。改进后，在工艺的第一步使用Mustang Q对污染物进行捕获，取得了25%去除率的良好结果 同时对MVM、MLV和Re03三种病毒也达到超过4个Log的滴度降效果，而整个工艺对病毒的去除效率普遍提高了7-11个Log。说明Mustang Q的使用对下游层析起到了很好的保护作用。/pp　　在第五届生物制药工艺优化大会上，Crucell公司介绍了他们对腺病毒(AAV)纯化工艺的摸索。与传统的层析填料相比，Mustang Q膜层析的开放孔道的设计使对病毒的动态载量大大提高30倍左右，回收率在80%以上。用40L的膜层析柱相当于1000L的传统层析柱的效果，节省了验证工作，提高了工艺经济性，十分有利于放大生产。/pp　　德国的Boehringer Mannheim公司生物制药部，用STREAMLINE技术代替传统工艺生产400L CHO细胞培养的Fc融合蛋白，结果样品回收率提高14%，缓冲液减少25%，时间缩短47%[17]。/pp　　世界最大的制药公司-GlaxoSmithKline公司，使用特别设计的BioProcess全自动层析系统和STREAMLINE扩张柱生产药用脂蛋白疫苗，比原工艺产品体积缩小2倍，纯化系数1.5，内毒素减少100倍[17]。/pp　　日本YOSHITOMI公司正在使用多套STREAMLINE 1000系统生产人重组白蛋白，与原生产工艺产品纯度相同，产率提高30%，时间减少一半，年产量为12.5吨[17]。/pp　　AVECIA公司重新设计临床Ⅲ期药品生产工艺，选用STREAMLINE技术及SOURCE新型凝胶，生产效率提高12倍，回收率提高1倍[17]。/pp　　2001年，ILEX制药公司的CAMPATH获得FDA批准。该单克隆抗体使用Sartobind Q离子交换层析模块以流穿的方式进行精制，这是膜吸附器首次被批准应用于治疗性蛋白的生产，证明了膜层析技术通过了证实和测试[30]。/pp　　4. 展望/pp　　随着抗体产品上游大规模高效培养技术的进一步发展,实验室规模哺乳动物细胞表达水平可以达到25g/L，如果这一水平能够有效放大到生产,将对下游生产纯化带来更大的压力。所以下游纯化工艺的技术发展也是势在必行。/pp　　以下一些发展方向可能成为下游工艺未来发展的重要关注点：(1)刚性更好、载量更高、耐碱性更好的完全亲水琼脂糖凝胶的开发[4]。(2)优化操作次序，降低缓冲液消耗的更大规模生产线的应用[21]。(3)通过单抗的氨基酸序列预测下游工艺关键参数：亲和层析洗脱pH条件、离子交换层析洗脱pH和盐浓度条件、病毒灭活pH等[22]。(4)下游工艺的成本消耗占全部成本的50-80%，亲和捕获是下游工艺的最关键步骤，通过改进亲和配体，提高捕获能力，节省成本[23]。(5)新型层析系统全程实时控制纯化过程，在线检测HCP、宿主DNA、Protein A等的含量[24]。(6)由于在去除杂质方面的优势，膜层析将会得到飞速的发展，未来工艺甚至可能完全基于膜层析而不是柱层析[25]。/pp　　参考文献/pp　　[1] 刘亚明,薛章.生物制药：迎接抗体药物的黄金时代.医药细分子行业研究报告,2009./pp　　[2] 陈志南.基于抗体药物的我国生物制药产业化发展前景.2008中国药学会学术年会暨第八届中国药师周论文集,2008./pp　　[3]Gail Dutton.Trends in Monoclonal AntibodyProduction.Feature Articles,2010, 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1.氰化高铁血红蛋白HiCN测定法：除SHb外推荐参考方法，具有操作简单、显色快、结果稳定可靠、读取吸光度后可直接定值等优点。致命的弱点是氰-化钾(KCN)试剂有剧-毒，使用管理不当可造成公害。氰化高铁血红蛋白测定法操作(1)直接测定法①加转化液：试管内加5ml?HiCN转化液②采血与转化：取全血20μl，加到盛有转化液的试管底部，用上清液反复冲洗吸管3次，充分混合，静置5min。③测定：以符合WH0标准的分光光度计，波长540nm处，光径(比色杯内径)1.000cm，HiCN转化液或蒸馏水调零，测定吸光度(A)。④计算：根据样本的吸光度(A)直接计算出血红蛋白浓度(g/L)(A为测定管吸光度，44为毫摩尔消光系数，64458/1000为1mol/L Hb溶液中所含Hb克数，251为稀释倍数。)(2)HiCN标准液比色法测定HiCN参考液(50g/L、100g/L、150g/L、200g/L)，分别测得540nm处的吸光度，以参考液血红蛋白含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线或求出K值。①标准曲线绘制和K值计算②样本吸光度③通过标准曲线查出样本血红蛋白浓度，或用K值计算，血红蛋白浓度Hb(g/L)=K×A。 注意事项(1)HiCN贮存：转化液贮存在棕色有塞玻璃瓶中，不能贮存在塑料瓶中，否则会使CN-丢失，测定结果偏低。HiCN转化液在4℃保存一般可数月，不能在0℃以下保存，因为结冰可使高铁氰-化钾还原，试剂失效。(2)标本：异常血浆蛋白质、高脂血症、白细胞数超过30×109/L、脂滴等可产生浊度，干扰Hb测定。(3)HiCN转化液是一种低离子强度、pH近中性的溶液(7.2±0.2)。样本中白细胞过高或球蛋白异常增高时，HiCN比色液会出现浑浊。(4)氰-化钾试剂是剧，测定后的废液应收集于广口容器中，首先以水稀释废液(1:1)，再按每升上述稀释液加次氯酸钠35ml，充分混匀，敞开容器，放置15h以上，使CN-氧化成C02和N2挥发，或水解成C032-和NH4+，再排入下水道。废液不能直接与酸性溶液混合，因为氰化-钾遇酸可产生剧毒的氰氢酸气体。2.十二烷基-硫酸钠血红蛋白SDS测定法：具有操作简单、呈色稳定、准确性和精-确性符合要求、无公害等优点。但由于摩尔消光系数尚未最后确认，不能直接用吸光度计算Hb浓度，而且SDS试剂本身质量差异较大，会影响检测结果。3.HiN3最大吸收峰542nm，显色快，结果稳定。