裸胞壳属

[size=16px]克隆形成实验[/size][size=16px]及划痕实验[/size][size=16px]、[/size][size=16px]流式细胞术[/size][size=16px]操作步骤[/size]软琼脂克隆形成实验检测单细胞克隆形成能力软琼脂克隆形成实验适用于悬浮生长的细胞。1. 配胶液：用蒸馏水和琼脂糖粉配制浓度为 0.3% 的琼脂糖液，高压灭菌，置于42℃ 水浴锅中，目的是为了使其保持融化状态。2. 配制含 20% FBS 的 2×1640 培养基，用 0.22 ?m 的滤器过滤除菌。3. 铺下层胶：将 0.6% 的琼脂糖胶液与 2×1640 培养基等体积混合，以每孔 1.5mL 加至 6 孔板中，室温等其凝固。4. 细胞计数：将细胞用 PBS 洗一遍，离心，加入新的培养基混匀稀释，计数。H69-NC、H69-shMSI1-1、H69-shMSI1-2、H82-NC、H82-shMSI1-1、H82-shMSI1-2、H526-NC、H526-shMSI1-1、H526-shMSI1-2 均以 1×104/孔铺入 6 孔板。5. 铺上层胶：将 0.3% 的琼脂糖胶液与 2× 培养基 1：1 混合，加入 100 μL 细胞悬液，混匀后，每孔加入 1.5 mL 混合液。6. 放入 37℃，5%CO2 培养箱培养，约 2-3 周后终止培养。7. 比较细胞克隆形成能力的差异，利用 Graphpad prism5 作图计算两种细胞克隆形成能力的差异。平板克隆形成实验检测单细胞克隆形成能力平板克隆形成实验适用于贴壁生长的细胞。1. 细胞处理：将 SW1271-NC、SW1271-shMSI1-1、SW1271-shMSI1-2 细胞，用 PBS洗一遍，用胰酶消化并计数。2. 接种细胞： 将细胞接种于 6 孔板中， SW1271-NC 、SW1271-shMSI1-1 、SW1271-shMSI1-2 接种密度为 3×103/孔，注意一定让细胞均匀分布。于 37℃，隔离CO2 静置培养 2-3 周（终止培养时间以不小于 2 周且克隆之间不发生融合为标准）。3. 出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去旧培养基， 用 PBS 清洗 2 次，用 4% 多聚甲醛固定液固定 20 min，吸除固定液，用蒸馏水清洗 2 次后加适量结晶紫染色15-20 min，用蒸馏水洗去结晶紫，自然风干，用扫描仪扫描成图片。4. 在低倍镜下计数大于 50 个细胞的克隆数。5. 计算克隆形成率。细胞划痕实验1. 用记号笔在 12 孔板底部划两条平行线做为标记。2. 将 SW1271-NC、SW1271-shMSI1-1、SW1271-shMSI1-2 细胞接种至 6 孔板。3. 待细胞汇合度为 90% 左右时，用 10μL 枪头垂直于两条平行标记线进行划痕。4. 吸除培养基，1xPBS 漂洗 2 次，并换用无血清培养基培养。5. 分别在划痕后培养 0h，12h，24h，48h，72h 观察细胞迁移情况并拍照。流式细胞术1. 收集 H69、H82、H526、SW1271 的对照组和实验组细胞(包括培养上清中的细胞)，收集 1 - 10 ×105 个细胞，用预冷 PBS 离心洗涤。用双蒸水稀释 5 ×Binding Buffer为 1 × 工作液，取 500 μl 1 × Binding Buffer 重悬细胞。2. 每管加入 5 μl Annexin V-APC 和 10 μl 7-AAD。3. 轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育 5 分钟。4. 上机进行分析。

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“多吃蔬菜，其中深色蔬菜量最好达到一半。”哪些蔬菜是深色蔬菜？怎么吃蔬菜才健康？也许你想知道，那请关注吧！　　·何为深色蔬菜？　　深色蔬菜指深绿色、红色、桔红色、紫红色蔬菜。常见的深绿色蔬菜有：菠菜、油菜、芹菜叶、空心菜、芥菜、西兰花、茼蒿、韭菜、萝卜缨。　　常见的红色、桔红色蔬菜有：西红柿、胡萝卜、南瓜、红辣椒等。常见的紫红色蔬菜有：红苋菜、紫甘蓝、蕺菜等。　　·深色健康蔬菜最好煮熟吃　　吃蔬菜理想的方式是，颜色深的蔬菜大部分熟食，颜色浅而质地脆嫩的蔬菜生吃。温度不要过高，烹调方式应清淡少油。　　熟吃蔬菜的益处是：　　1、提高绿叶蔬菜和橙黄色蔬菜中维生素K和类胡萝卜素的利用率，因这两类物质只溶于油脂，热烹使细胞壁软化，促进胡萝卜素、番茄红素的溶出，提高吸收率。　　2、提高蔬菜中钙、镁元素利用率，在烹调加工当中，只要经过焯烫，炒制或凉拌，即可除去大部分草酸。　　3、大幅度地提高蔬菜的食用数量，生吃尽管营养素无损失，但总食用数量很难提高，如果要求每日吃500克蔬菜，那么全靠生吃蔬菜很难达到这个数量要求。假如有一半蔬菜熟吃，则完成这个数量轻而易举。　　4、烹调可以软化纤维，对于肠胃虚弱、消化不良、胃肠胀气、慢性腹泻等嘈偷娜擞幸妗　　5、熟吃蔬菜比较卫生。加热能杀灭病菌和虫卵，大肠杆菌之类也很难耐受沸水或热油的洗礼。一些抗营养因素和破坏维生素的氧化酶类，也能在加热的过程中被灭活。　　·深色蔬菜营养价值高　　叶类蔬菜是我国膳食中钙、胡萝卜素、铁、核黄素、抗坏血酸及纤维素等的主要来源，几乎是人人每餐必备的菜肴。　　一般来说，叶菜类的叶子颜色愈深，所含钙、铁、胡萝卜素、维生素B2及维生素C也愈多，如油菜（青菜）、乌菜（塌棵菜）、荠菜、雪里蕻（雪里红）等叶菜，它们每100克含钙在140~420毫克之间、铁在1.4~6.3毫克之间、胡萝卜素在3.05~3.20毫克之间、维生素B2在0.14~1.11毫克之间、维生素C在51~83毫克之间，远比浅色的大白菜（黄芽菜）多得多，大白菜每100克含钙仅41~61毫克、铁0.5~0.6毫克、胡萝卜素0.1~0.4毫克、维生素B2为0.04毫克及维生素C19~20毫克，比颜色居中的卷心菜（包心菜、洋白菜、莲花白）及鸡毛菜（白菜秧）等也多。其中钙和铁的含量深色菜叶比浅色者一般要多1~2倍到数十倍；胡萝卜素、维生素B2及维生素C要多5~10倍或10倍以上。叶菜类的叶片越薄营养成分也越高。　　·深色蔬菜烹饪示范　　白灼芥蓝：芥蓝切段在水里焯熟，捞起蘸酱油、醋或辣椒酱，若从健康角度考虑，则越清淡越好。水豆豉Χ南瓜：日本锦绣南瓜，1500克左右，颜色黄得泛红，口感不很甜，粉粉的。南瓜切长条；用烧热的砂锅加少量油，姜末爆香，倒入南瓜条翻炒，加水豆豉及少量盐、酱油，再加入米酒半碗（无甜味），盖上锅盖，焖烧10分钟左右，等汤水收干、南瓜变软即可。

作者：丁香园网友Docofsoul《每日科学》2011年9月1日报道——由瑞士联邦理工学院（ETH）Yaakov Benenson教授与麻省理工Ron Weiss教授率领的研究小组成功地将生物“计算机”诊断网络导入人类细胞。该网络有识别某些肿瘤细胞的能力，利用五种肿瘤特异性分子因子的逻辑组合，进而触发肿瘤细胞毁灭过程。http://img1.jiansuo.net/cms/upload/userfiles/image/2011/09/04/1315042501_small.jpg细胞微机布线图：所有五种因子必须处于相应的正确状态，由此触发细胞死亡（图片来源：y Benenson Y. 教授 R. Weis教授）开发活体细胞内运作的生物电脑，是ETH苏黎世分院合成生物学教授Yaakov (Kobi) Benenson孜孜以求的目标，其职业生涯的大部分时间都倾注于此。他想建立既能侦测细胞生存状况、又能在细胞异常时对相应信息进行处理以提供合适的治疗响应的生物微机。目前，通过与麻省理工教授Ron Weiss以及团队成员（包括博士后学者Zhen Xie 与 Liliana Wroblewska、博士生Laura Prochazka）合作，他向这一目标迈出了重大一步。这一研究成果已发表于《Science》（见本文所附参考文献），论文介绍了一种多基因合成“电路”；此电路负责鉴别正常细胞与肿瘤细胞、继而进一步摧毁肿瘤细胞。其工作方式是：对细胞内五种肿瘤特异性分子因子及其出现频率进行抽样与综合；只有当所有这些因子在细胞内同时出现时，该电路才会作出正识别响应。这种方式使得侦测肿瘤的准确率非常高。研究者希望这一成果能够为高特异性抗癌治疗奠定基础。对肿瘤细胞的选择性破坏本研究对实验室培养的两种类型人类细胞进行了基因网络测试：海拉细胞（子宫颈癌细胞）与正常细胞。当基因生物微机被导入这两种不同的细胞类型时，只有海拉细胞被摧毁，而正常细胞则安然无恙。当然，取得这一结果需要做大量的基础工作。首先必须找出海拉细胞特有的分子组合。Benenson及其他小组成员在属于小RNA分子（MicroRNA或miRNA）这一类化合物的分子中找，终于确认其中一个miRNA组合（或者说“可识别属性”）只有海拉细胞才有，其它健康细胞类型内则不存在。发现这种可识别属性是一项颇具挑战性的任务。人体内既存在250种不同的健康细胞类型，此外也存在为数众多的肿瘤细胞的变异型（其中数百种可作实验室培养）。但miRNA多样性则更是不让须眉花样繁多，人类细胞中已得以描述的即达500到1000不同种类。Benenson指出：“每种健康或病损细胞类型都有其不同的miRNA分子处于开放或关闭状态。”可识别肿瘤属性中的五种因子确立一种miRNA“可识别属性”与发现一组症状以可靠诊断一种疾病有所不同。教授说：“一种症状，比如说发热吧，不可能由此概括出一种疾病。医生获得的信息越多，其诊断才越可靠。”　一年半前他从哈佛大学到ETH后，研究小组找到了几种因子，可由此可靠地将海拉细胞从所有其它健康细胞中鉴别出；结果表明，仅仅五种特定miRNA的组合（其中某些以高水平出现，某些则以极低水平出现）就足以将海拉细胞从其混迹的健康细胞中揪出来。与微机运作相似的网络Benenson介绍说：“这些miRNA因子在细胞内进行逻辑代数运算；该生物微机运用诸如‘与’与‘非’等逻辑操作将这些因子进行组合，并且，当全部因子的整体运算结果为逻辑‘真’值时，只产生所需要的结果——那就是细胞死亡。”　确实，研究者已经能够显示该网络在活体细胞内可以非常稳定地运作，可正确组合所有细胞内因子并给出正确的诊断。Benenson认为，这一成果代表该领域的一项重大成就。动物模型与基因疗法该研究小组想在下一步在合适的动物模型上测试该细胞计算方法，以期在未来创建诊断与治疗工具。这听起来可能象科幻小说，但Benenson相信其可行性；不过，仍有不少棘手的问题需要解决。比如，如何有效、安全地将外源基因导入细胞？这种DNA递送在目前情况下颇具挑战性。尤其是，该方法需要将外源基因暂时而不是永久导入细胞。现有的病毒导入法或化学导入法均未充分开发，需要进一步完善。Benenson说：“为人类提供一种功能完善的治疗方法还非常遥远。不过这一工作是重要的第一步，显示了单一细胞水平上这样一种选择性诊断方法具有可行性。”参考文献：1. Z. Xie, L. Wroblewska, L. Prochazka, R. Weiss, Y. Benenson. Multi-Input RNAi-Based Logic Circuit for Identification of Specific Cancer Cells. Science, 2011; 333 (6047): 1307 DOI: 10.1126/science.1205527

大家好。有一个疑问：克伦特罗的标准品市场上已经不供应，只有盐酸克伦特罗，但是标准方法中都写的是克伦特罗，大家应该都注意到了，问题就来了：我们测定的是盐酸克伦特罗，结果要报克伦特罗，该怎么做呢？有的写的也很含糊，感觉是不是两个本来就是一个东西呢？请各位给予解答。

克罗地亚政府27日通过了《京都议定书》,承诺在2012年以前温室气体排放量减少5%。 　　《京都协议书》1997年12月在日本京都举行的《联合国气候变化框架公约》第3次缔约方大会上通过,旨在限制发达国家温室气体排放,抑制全球变暖,规定从2008年到2012年期间,主要工业发达国家的温室气体排放量要在1990年的基础上平均减少5.2%,其中欧盟6种温室气体排放量削减8%,美国削减7%,日本削减6%。克罗地亚1999年已签署《京都议定书》,但当时政府表示正处于市场经济过渡时期,需要时间研究如何履行协议书。经8年讨论,昨天议会终于通过了议定书。目前,巴尔干地区只有克罗地亚和斯洛文尼亚批准了该议定书。

羅伯特 • 虎克 Robert Hooke （ 1635-1703 ） 另一位在顯微鏡技術方面做出重大貢獻的科學家是大名鼎鼎的羅伯特 • 虎克。虎克由於從小就體弱多病，因而並沒受到過多少正規的教育。當時的英國正規學校教育主要指的是人文科學、神學和醫學等，其中側重的是理論教育，而對實驗或其他操作技能則不太關注。因此虎克缺乏系統的理論修養對他日後與牛頓等科學家的論辯產生了非常不利的影響。他很難辯倒對方，並且很難說服一般的讀者或聽眾。不過胡克動手的能力卻相當強，這與英國的工匠傳統和大哲學家F• 培根（Francis Bacon）所倡導的理論與實驗的結合有著密切的關係。虎克可以算是 17世紀最偉大的科學實驗儀器發明家和設計者。他發明和改進的物理儀器、天文儀器和航海儀器相當出名。在生物學儀器方面，他改進的複式顯微鏡不僅在當時是非常先進的，而且直到一百多年後才被人明顯地加以修改。 虎克本人還是個出色的科學活動家。倫敦的英國皇家學會是 1662年正式成立的，他被委任為“儀器部主任”，後來擔任皇家學會秘書，職責是為每次開會準備三至四項他本人或其他人的實驗。他展示的儀器及演示的實驗豐富又出色，一直受到很高的讚賞。雖然對生物的顯微觀察，並不是他主要關心的，但他演示的複式顯微鏡和顯微技術，以及他對於英國以外所做的顯微研究的介紹，對於推廣和擴展顯微解剖研究起了非常大的作用。1665年，虎克出版了《顯微術 / Micrographia 》一書。書中介紹了他所製作能夠放大到 140倍的複式顯微鏡，還包括大量繪製的動植物顯微觀察圖譜，這些圖繪製的相當漂亮和準確，被人引用了很長時間。 跳蚤 海草及迷迭香葉子的表面 1665年的一天，虎克用自製的顯微鏡來觀察軟木薄片時，發現到軟木薄片上有無數個蜂窩般的小房間，像夜空裏的星星那樣佈滿在軟木片上。虎克把這些“小房間”稱作“細胞”（空室的意思）。細胞（cell）在英文中有小室的意思，當時他認為這些小室起著和動物身體中血管類似的作用，有液體在其中流動以運送營養。事實上，他當時看到的只是已經死亡的植物細胞的細胞壁。但他的發現卻具有極其重要的意義，使人們對生物體結構的觀察和研究進入了一個新的領域。虎克還發現了植物活細胞中的物質： “我已用我的顯微鏡，十分清晰地發現了那些充滿液汁的小室或孔，並且發現其中有的汁液在逐漸地滲出。”在往後的日子，雖然細胞這一概念有了不斷的發展，但依然沿用了虎克首創的這一辭彙。軟木薄片 虎克所做的一些動物顯微觀察和描繪也是相當重要的。是他第一次描述了苔蘚動物的形態與結構，他繪製了精緻圖示，展現魚的鱗、蜜蜂的蟄刺和蒼蠅的肢等，他對於鳥類的羽毛的顯微觀察和描繪直到 19世紀仍是最出色的，而且他對於蚊子的幼蟲、蒼蠅的複眼也進行了觀察。虎克還利用顯微觀察了化石，並對化石的起源嘗試過理論上的探索，其中包括一些比較正確的觀點。[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=9479]羅伯特 • 虎克[/url]

何为细胞外泌体？　　外泌体最早发现于体外培养的绵羊红细胞上清液中，是细胞主动分泌的大小较为均一，直径为40~100纳米，密度1.10~1.18 g/ml的囊泡样小体。细胞外泌体携带多种蛋白质、mRNA、miRNA，参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程并且有可能成为药物的天然载体，应用于临床治疗。　　然而，测量技术手段的局限限制了外泌体在这些领域的研究进展。所以，在这篇文章中，作者总结了外泌体的纯化方法（离心法、过滤离心法、密度梯度离心法、免疫磁珠法以及色谱法），比较了现存各种外泌体测量技术（电子显微镜、动态光散射技术及纳米微粒追踪分析术）在外泌体尺寸和表征研究中的应用。原文点击——综述：细胞外泌体颗粒表征测量技术新进展

【序号】：7【作者】： 廖筱梅罗兴前代蕾【题名】：脂肪间充质干细胞-壳聚糖凝胶复合物治疗大鼠深Ⅱ度烫伤创面实验研究【期刊】：中国修复重建外科杂志. 【年、卷、期、起止页码】：2019,33(01)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CJFD&dbname=CJFDLAST2019&filename=ZXCW201901022&uniplatform=NZKPT&v=NwTO9rDkQZHRHjdT8XMlNEkusJwTTn_j3NCCQSy80VBl1u9Qgb0WwKYdE5UVI499

牛奶体细胞数的英文为somatic cell count,SCC。牛奶体细胞数是指每毫升牛奶中的细胞总数，多数是白细胞，通常由巨噬细胞、淋巴细胞、多形核嗜中性白细胞和少量乳腺组织上皮细胞等组成，约占牛体细胞数的95%，其余是乳腺组织死去脱落的上皮细胞。体细胞数反映了牛奶质量及奶牛的健康状况,在正常情况下,牛奶中体细胞数一般在20万～30万个/mL。

概念：细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。基本步骤：1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率 =（克隆数/接种细胞数）×100%平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

2010年《GB 19301-2010 食品安全国家标准 生乳》发布，该标准出台后即被冠以 “挤奶时相当于苍蝇到处乱飞”、“中国牛奶倒退25年”、“中国生乳标准全球最差”等各种标签。时隔6年，生乳标准被再一次掀起波澜：今年4月份，中国农垦乳业联盟召开《中国农垦生鲜乳生产和质量标准》发布会，会议指出该标准菌落总数与欧盟和美国标准一致，并且按照欧盟标准规定了体细胞数。同期，黑龙江省奶业协会《黑龙江省生乳团体标准》，标准根据蛋白、脂肪、菌落总数、体细胞数对生鲜乳分了特级、一级、二级三个等级，并且提出特级标准已比肩欧美。为什么我国的生乳标准时至今日还被热议，菌落总数和体细胞指标有什么意义，我国和欧美针对这两项的规定到底有什么不同？以下将进行详细分析。[b]1. 指标解读：菌落总数[/b]菌落总数是指在一定微生物培养条件下每克（或每毫升）检样所生长出来的细菌群落总数。生乳中菌落总数的多少是评定质量的重要指标，目前被各国广泛采用。它可用来判定产品被细菌污染的程度及卫生质量，以便做出适当的卫生学评价。造成菌落总数超标的原因很多，挤奶环节控制不严是导致超标的主要原因，如挤奶器具不卫生特别是散户人工挤奶的情况，将会直接导致菌落总数不合格。[b]体细胞数[/b]牛奶体细胞数是指每毫升牛奶中的细胞总数，它是牛奶中的白细胞和脱落上皮细胞的总称。体细胞数是衡量牛乳房健康状况和原料奶质量的重要指标，它的升高可导致乳制品货架期缩短，风味发生改变。体细胞数高说明奶牛乳腺感染了微生物病原菌，通过不同的微生物检测或根据体细胞数升高状况诊断是否患有隐性乳房炎，此外，若奶牛患病也会因为系统免疫反应导致体细胞升高。2。[b] 标准比较：我国标准[/b]我国生乳现行标准GB 19301-2010，标准中对生乳的脂肪、蛋白质等理化指标，及微生物、污染物等指标做了规定，其中菌落总数要求为200万CFU/mL，但是并没有体细胞数的要求。[b]欧盟法规[/b]欧盟拥有完善的乳品质量安全监管体系，在其法规EC 853中对生乳的体细胞和菌落总数做了详细规定。 [table=100%][tr][td=1,1,25%] 类别项目[/td][td=1,1,20%] 生牛乳[/td][td=1,1,21%] 其他动物的生乳[/td][td=1,1,33%] 其他动物的生乳（用于加工乳制品，且加工过程中无加热工序）[/td][/tr][tr][td=1,1,25%] 菌落总数，万CFU/mL[/td][td=1,1,20%] ≤10[/td][td=1,1,21%] ≤15[/td][td=1,1,33%] ≤5[/td][/tr][tr][td=1,1,25%] 体细胞数，万个/mL[/td][td=1,1,20%] ≤40[/td][td=1,1,21%] /[/td][td=1,1,33%] /[/td][/tr][/table]欧盟非常注重标准的科学性，基于牛和其他动物如山羊的养殖条件、养殖规模等不同，分别设定了不同的微生物要求，虽然其他动物的生乳限量表面看来更低一些，但是如果用于生产无加热工艺的产品，则要求非常高。欧盟标准科学性的另一点体现在生产和收奶会设定不同限量。对于到达工厂后经过混合的牛乳，该法规指出其指标限量可以是牧场环节的三倍。因此准备生产乳制品的原料乳菌落总数限量为≤30万CFU/mL（如果该牛乳已经经过一定的加工，那么需要低于10万CFU/mL）。[b]美国法规[/b]美国《联邦法规》（CFR）第7卷对原料乳的指标限量、检测方法、不合格整改措施都做了具体规定，其中包括体细胞数和菌落总数。 [table][tr][td=1,1,155] 类别项目[/td][td=1,1,126] 生牛乳[/td][td=1,1,151] 山羊乳[/td][td=1,1,187] A级原料乳[/td][/tr][tr][td=1,1,155] 菌落总数，万CFU/mL[/td][td=1,1,126] ≤50[/td][td=1,1,151] ≤50[/td][td=1,1,187] ≤10（单个样本）≤30（杀菌前的混合样本）[/td][/tr][tr][td=1,1,155] 体细胞数，万个/mL[/td][td=1,1,126] ≤75[/td][td=1,1,151] ≤150[/td][td=1,1,187] ≤75[/td][/tr][/table]美国是非常提倡实施安全整改措施的国家，联邦法规中就有明显的体现。如对生乳中菌落总数的要求，法规规定每个奶户每月至少要有1次随机抽样，一旦出现不合格就会被警告，如果4次连续抽检中有两次不合格，那么将会在随后的3至21天再抽一个样品，如果仍然不合格，就需要整改直至获得满意的结果才可以继续对外供应牛乳。[b]Grade “A” Pasteurized Milk Ordinance[/b]除了CFR的要求，美国还有一个非常重要的法令《Grade “A” Pasteurized Milk Ordinance》，该标准适用于优级乳制品，标准包含收奶、运输、加工、包装等各环节的规范，可操作性非常强。标准中指出单个奶户的奶中菌落总数不得超过10万CFU/mL，不同奶户的奶经混合后，在杀菌前不得超过30万CFU/mL；体细胞方面，该法令指出单个奶户的奶中不得超过75万个/mL。和CFR一样，该标准也规定了不合格的处理措施。联邦政府以及各州会定期检查工厂，一旦发现问题就会临时吊销生产许可证，此后连续3周每周不少于2次取样检查，直至合格才准予恢复正常生产。[b]总结[/b]1. 我国设定的指标限量低于欧美，这与当时的制定背景息息相关。但实际上，由于最近几年政府和企业对生乳质量意识的提高，我国生鲜乳尤其是自有牧场的生乳的质量远高于国家标准规定。很多牧场逐步开始监控体细胞数量，优质牧场平均体细胞数可达10万个/mL以下。同时部分地区也根据当地生乳的质量优势，制定了一些高于国家要求的标准。2. 我国在指标设定方面的科学性有待提高，如上面提到的欧美在收奶及加工时设定不同指标限量，而我国目前收奶、贮奶都是一个限量，不利用保护奶农利益，更不利于指导企业实际生产。3. 缺乏对奶农的系统监管，如美国政府机构会长期监控每个奶场的生乳，制定整改措施并监控整改效果，这点值得我国学习。

【序号】：3【作者】：朱琳邹德庆范作卿【题名】：蚕蛹羧甲基壳聚糖对小鼠成纤维细胞增殖与生长的影响【期刊】：蚕业科学. 【年、卷、期、起止页码】：2017,43(03)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=3uoqIhG8C44YLTlOAiTRKibYlV5Vjs7iAEhECQAQ9aTiC5BjCgn0RurLuDBf62EN5lCHC3tB7EA_NCYlyZxEZRugsuO02raR&uniplatform=NZKPT

[font=-apple-system, BlinkMacSystemFont, &][size=18px]中央网信办部署开展“清朗网络暴力专项治理行动”，主要聚焦网络暴力易发多发、社会影响力大的18家网站平台。[/size][/font]

[font=宋体]流式细胞术，作为一种先进的生物技术，已经在生物医学研究中占据了举足轻重的地位。这种技术以其高精度、高速度以及多参数同时检测的能力，广泛应用于细胞生物学、免疫学、肿瘤学等多个领域。流式细胞术不仅可以对单个细胞进行多参数定量分析和分选，还能够对细胞内部的蛋白质、核酸、细胞受体以及细胞表面抗原等进行检测。因此，它在疾病诊断、药物筛选、细胞功能研究等方面具有广泛的应用前景。本文将对流式细胞术的检测原理、应用领域以及发展前景进行详细介绍，旨在为读者提供对这一技术全面而深入的了解。流式细胞术可以检测什么？下面是具体检测信息及应用：[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=Calibri]1.[/font][font=宋体]细胞表型检测[/font][/font][/b][font=宋体]免疫细胞表型是流式细胞术最突出应用。[/font][font=宋体][font=宋体]通过检测免疫细胞群的表面或细胞内标志物，对其进行鉴定和表征。流式细胞术能够精确鉴定和分类免疫细胞群，例如[/font] [font=Calibri]T [/font][font=宋体]细胞、[/font][font=Calibri]B [/font][font=宋体]细胞、[/font][font=Calibri]NK [/font][font=宋体]细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、血小板和粒细胞等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]研究人员可以识别和量化异质群体中的各种免疫细胞亚群。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]临床医生可以诊断和监测各种血液系统疾病、进行免疫免疫评估（[/font][font=Calibri]8[/font][font=宋体]大类免疫细胞构成与肿瘤预后）。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=Calibri]2.[/font][font=宋体]细胞活力检测[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]流式细胞术能够定量测量群体内和体外培养的活细胞和非活细胞。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]通过使用选择性标记活细胞或死细胞的荧光染料，流式细胞术可以提供精确可靠的活力测定，有助于确定细胞活力百分比。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]流式细胞术可以根据特定的标志物或染料区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞，从而更详细地了解细胞的健康和状态。通过将活力染料与细胞表面抗原、细胞内蛋白或功能测定的标记物相结合，研究人员可以在特定细胞类型或实验条件下获得有关细胞活力及其发生机制的全面信息。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]最常用的活性检测染料[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]死细胞：碘化丙啶（[/font] [font=Calibri]propidium iodide[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]PI[/font][font=宋体]）和[/font][font=Calibri]7-AAD[/font][font=宋体]，与[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]结合，但只能进入膜受损的细胞，使死细胞发出荧光。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]凋亡细胞：[/font][font=Calibri]annexin V[/font][font=宋体]：对磷脂酰丝氨酸具有强结合亲和力的蛋白质，在细胞凋亡的早期阶段暴露在质膜的外表面[/font][font=Calibri]annexin V+PI[/font][font=宋体]是常用区分凋亡细胞和坏死细胞的组合。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]活细胞：[/font][font=Calibri]calcein AM[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]CFDA[/font][font=宋体]（[/font][font=Calibri]carboxyfluorescein diacetate[/font][font=宋体]）、[/font][font=Calibri]FDA [/font][font=宋体]（[/font][font=Calibri]fluorescein diacetate[/font][font=宋体]） ：进入活细胞，但只有在与细胞内酶相互作用时才会发出荧光[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]细胞体内增殖：[/font][font=Calibri]CFSE(CFDA-SE)[/font][font=宋体]穿透细胞膜，在活细胞内与胞内蛋白共价结合，水解后释放出绿色荧光。在细胞分裂增殖过程中，它的荧光强度会随着细胞的分裂而逐级递减，标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半，根据这一特性，它可被用于检测细胞增殖，细胞周期的估算及细胞分裂等方面。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=Calibri]3.[/font][font=宋体]细胞周期分析[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]从流式细胞术的早期开始，细胞周期分析就成为有价值的应用。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]原理是基于荧光和核酸的量之间的关系。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]常用核酸结合染料：碘化丙啶（[/font][font=Calibri]PI[/font][font=宋体]），[/font][font=Calibri]Hoechst[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]DAPI[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]7-AAD[/font][font=宋体]，溴化乙锭等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]流式细胞术细胞周期分可以有很多方面的应用，例如，[/font][font=Calibri]DNA/Ki67[/font][font=宋体]测定可以将表型选择与细胞周期分析相结合，用于监测[/font][font=Calibri]p53[/font][font=宋体]细胞周期停滞，评估抗癌活，多药耐药性等。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=Calibri]4.[/font][font=宋体]离子通道测定[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]钙作为关键的第二信使，在许多细胞信号通路中起着至关重要的作用。它在免疫细胞活化中尤为重要，包括[/font][font=Calibri]T[/font][font=宋体]细胞、[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞和[/font][font=Calibri]NK[/font][font=宋体]细胞。[/font][/font][font=宋体]此外，钙信号传导还参与肥大细胞脱颗粒、神经元兴奋性、突触传递和神经递质释放至关重要。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]细胞脱颗粒的早期测量值是通过使用钙离子载体[/font][font=Calibri]A23187[/font][font=宋体]的流式细胞术确定的。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]常用荧光染料：[/font][font=Calibri]fluo-3 [/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]indo-1[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]虽然[/font][font=Calibri]Ca2+[/font][font=宋体]通道测量是最常见的应用之一，但其他离子如镁、钾、钠和氢也可以使用流式细胞术进行监测。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=Calibri]5.[/font][font=宋体]细胞功能检测[/font][/font][/b][font=宋体]最早的检测是细胞酯酶。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]使用响应氧化态变化的活性染料检测粒细胞的氧化电位。例如，氢乙啶（[/font][font=Calibri]hydroethidine[/font][font=宋体]）用于中性粒细胞呼吸爆发。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]二乙酸二氯荧光素（[/font][font=Calibri]dichlorofluorescein diacetate[/font][font=宋体]），已被用于吞噬细胞功能研究。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]效应细胞杀伤功能，是流式细胞术的另外一个重要应用。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]细胞因子是免疫细胞功能的重要执行分子，对科学研究，免疫细胞治疗，临床诊疗都及其关键。基于流式细胞术开发的多重细胞因子检测，已经有广泛应用。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=Calibri]6.[/font][font=宋体]蛋白质工程[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]流式细胞术和分选传统上不是蛋白质工程中最常用的技术之一。然而，近年来，在该领域的应用越来越多。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]流式细胞术被用于酶学蛋白质研究，包括细胞色素[/font][font=Calibri]P450[/font][font=宋体]、葡萄糖氧化酶、几丁质酶、纤维素酶、过氧化物酶、酯酶、转移酶、β半乳糖苷酶、硫代内酯酶等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]蛋白质工程，包括在基因水平上引入突变（随机或特异性），以创建由数千到数百万个单个蛋白质变体组成的文库（如上图），使用流式细胞术[/font] [font=宋体]每天能够分析多达[/font] [font=Calibri]10^8[/font][font=宋体]–[/font][font=Calibri]10^9 [/font][font=宋体]个克隆，并对具有所需特性的克隆进行分类。[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]7.[/font][font=宋体]哺乳动物细胞和细菌细胞分选[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]细胞分选是流式细胞的重要应用之一，哺乳动物细胞相对成熟，不做赘述。细菌细胞方面的应用，也逐渐开始建立。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]与耗时的传统琼脂铺板检测方法相比，流式分选可以快速检测和分选悬浮液中的单个细菌细胞。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]尽管细胞分选仪具有高性能，但它们在微生物学中的应用一直受到限制。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]这主要是由于微生物体积小，因此很难将它们与培养基中的细胞碎片或背景颗粒区分开来。另一个潜在的问题是，通常没有细菌菌株特有的抗体。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]限制细胞分选仪在细菌检测和分选中的适用性的其他因素主要与分选仪硬件功能本身有关，在流式细胞术仪器的早期，数量有限的激光器和检测器，限制一次只能使用一种或两种荧光染料。随着最新仪器的发展，多激光器和检测起的仪器被开发：包括赛默飞世尔的[/font][font=Calibri]Bigfoot[/font][font=宋体]光谱细胞分选仪，[/font][font=Calibri]BD FACSAria III[/font][font=宋体]分选仪，索尼[/font][font=Calibri]MA900[/font][font=宋体]细胞分选仪和贝克曼库尔特的[/font][font=Calibri]MoFlo Astrios EQ[/font][font=宋体]等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]此外，部分致病性细菌，需要在[/font][font=Calibri]BSL2[/font][font=宋体]以上的实验环境下进行，现在部分流式细胞术带有[/font][font=Calibri]BSL 2 hood[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=Calibri]8.[/font][font=宋体]液滴微流体[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]液滴微流体是一个相对较新的领域，专注于皮升体积中含有细胞或[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的离散液滴的形成，操作和分析，应用于生物学、化学、材料科学和医学。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在生物学中，液滴微流体可实现单细胞分析、生物分子的高通量筛选、细胞异质性研究和药物发现。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]流式细胞术分析是研究单细胞的强大技术，可提供有关各种参数的宝贵信息。然而，它的测量仅限于直接连接到细胞的分子，例如表面或细胞内标记物，限制研究由细胞分泌或由[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]分子产生但不物理附的分子。液滴微流体提供了一种克服这一限制的新方法。将细胞或[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]封装在单个液滴中会产生离散的区室，从而能够分析由封装实体释放或产生的化合物。[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]9.[/font][font=宋体]下一代生物制剂[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]生物制药已经占据了药物市场的重要份额，包括治疗性蛋白质（[/font][font=Calibri]65%[/font][font=宋体]），疫苗（[/font][font=Calibri]20%[/font][font=宋体]）等。通过测序（[/font][font=Calibri]NGS[/font][font=宋体]）进行单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞库分析和克隆扩增鉴定，直接从人类幸存者克隆免疫球蛋白基因，分离出高亲和力中和抗体，加快了单克隆抗体药物的研发，然而，这种方法比较昂贵，且依旧需要后续的功能验证等。新策略可使用流式细胞术、[/font][font=Calibri]MACS[/font][font=宋体]或微流体将单细胞分离与功能筛选相结合，降低开发成本并消除失败的候选药物，是流式细胞术新的应用开发方向。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/flow-cytometry-service][b]流式细胞检测技术服务[/b][/url]，拥有[/font][font=宋体][font=宋体]①具有 [/font][font=Calibri]20,000 [/font][font=宋体]次以上流式抗体筛选鉴定经验及多年流式诊断抗体研发经验，在实验方案设计、样品制备、数据分析等方面确保科学性、准确性和可靠性[/font][font=Calibri] [/font][/font][font=宋体][font=宋体]②拥有 [/font][font=Calibri]1,000 [/font][font=宋体]余株自产精品流式抗体，覆盖细胞膜、胞内、核内及分泌抗原；[/font][/font][font=宋体][font=宋体]③自产 [/font][font=Calibri]Annexin V/7-AAD [/font][font=宋体]凋亡检测试剂盒，并储备多种流式检测常用试剂，大大节约购买试剂的等待时间和实际费用；[/font][/font][font=宋体][font=宋体]④可以提供近 [/font][font=Calibri]200 [/font][font=宋体]种细胞系选择，省去细胞样本寄送过程中的风险，并可以免费提供健康人外周血细胞对照品。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/flow-cytometry-service[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=Calibri] [/font]

第 一 部 分 流式细胞术的一般介绍概念流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。流式细胞仪（Flow Cytometer)集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。流式细胞仪特点[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2008/11/200811302229_121122_1769204_3.gif[/img]

橘子富含葡萄糖、果糖、维生素、苹果酸、柠檬酸、蛋白质、矿物质等，且橘子含有丰富的类黄酮抗氧化剂，能抑制致癌物发生作用，橘子还有降血压、抗动脉硬化等作用，对于防止心血管疾病的发生有极大功效。　　小小橘子浑身都是宝！橘子不仅营养丰富，作为水果食用，此外，橘子的橘子的叶、皮、络、实、核都可以入药。　　橘叶　　橘叶可以疏肝理气、消肿散毒。　　橘皮　　橘子皮可以美容、除茶锈、除臭，《本草纲目》中说陈皮（橘子皮）“同补药则补；同泻药则泻；同升药则升；同降药则降。”可见在古代，人们就已经认识到橘子的药用价值了。陈皮可以理气、除燥、利湿、化痰、止咳、健脾、和胃。　　橘络　　橘瓤上的网状经络叫橘络，有通络化痰、顺气活血的功效，常用于治疗痰滞咳嗽等症。橘络中的维生素P含量高，因此可以有效防治高血压，老人平时多吃橘子对身体健康有很大好处。　　橘肉 橘子味甘酸、性温，入肺、胃经; 具有开胃理气，止渴润肺的功效；治胸隔结气、呕逆少食、胃阴不足、口中干渴、肺热咳嗽及饮酒过度。　　橘核　　橘子的果核（种子），性微温味苦平，有理气散结止痛之功效。对睾丸胀痛、疝气疼痛、乳房结块胀痛、腰痛等有良效。

[size=18px]流式细胞术[/size][size=18px]及平板克隆[/size][size=16px]（[/size][size=16px]1[/size][size=16px]）铺板[/size][size=16px] [/size][size=16px]取[/size][size=16px]对数生长期[/size][size=16px] H446[/size][size=16px]、[/size][size=16px]H[/size][size=16px]69[/size][size=16px]、[/size][size=16px]H[/size][size=16px]526[/size][size=16px]、[/size][size=16px]D[/size][size=16px]MS114[/size][size=16px]细胞，[/size][size=16px]计数，分别接种等量细胞至[/size][size=16px]6[/size][size=16px]孔板，[/size][size=16px]“[/size][size=16px]十字形[/size][size=16px]”[/size][size=16px]晃动，使细胞分布均匀，[/size][size=16px]继续[/size][size=16px]培养。[/size][size=16px] [/size][size=16px]（[/size][size=16px]2[/size][size=16px]）药物处理[/size][size=16px] [/size][size=16px]待细胞融合率约[/size][size=16px]80%[/size][size=16px]，[/size][size=16px]加入[/size][size=16px]不同浓度（[/size][size=16px]0[/size][size=16px]、[/size][size=16px]IC20[/size][size=16px]、[/size][size=16px]IC50[/size][size=16px]）[/size][size=16px]西达本胺处理[/size][size=16px]4[/size][size=16px]8[/size][size=16px] [/size][size=16px]h[/size][size=16px]。每组均设置[/size][size=16px]D[/size][size=16px]MSO[/size][size=16px]对照组。继续培养[/size][size=16px]4[/size][size=16px]8[/size][size=16px] [/size][size=16px]h[/size][size=16px]后采用[/size][size=16px]Annexin V-FITC /PI[/size][size=16px]双染法对细胞进行染色。[/size][size=16px]（[/size][size=16px]3[/size][size=16px]）准备：[/size][size=16px]冰[/size][size=16px]PBS[/size][size=16px]、流式细胞术专用试管、凋亡试剂盒（[/size][size=16px]10[/size][font='arial'][size=16px]×[/size][/font][size=16px] [/size][size=16px]Annexin V[/size][size=16px]结合缓冲液用[/size][size=16px]DD[/size][size=16px]水稀释[/size][size=16px]1[/size][font='arial'][size=16px]×[/size][/font][size=16px]）[/size][size=16px]（[/size][size=16px]4[/size][size=16px]）对照组的设置：阴性对照（[/size][size=16px]未染色细胞[/size][size=16px]）、[/size][size=16px]FITC Annexin V[/size][size=16px]（[/size][size=16px]无[/size][size=16px]PI[/size][size=16px]）单[/size][size=16px]染细胞[/size][size=16px]、[/size][size=16px]PI[/size][size=16px]单[/size][size=16px]染[/size][size=16px]（[/size][size=16px]不含[/size][size=16px]FITC Annexin V[/size][size=16px]）细胞。[/size][size=16px]（[/size][size=16px]5[/size][size=16px]）染色：[/size][size=16px]a[/size][size=16px].[/size][size=16px]将细胞[/size][size=16px]用冷[/size][size=16px]PBS[/size][size=16px]洗涤[/size][size=16px]3[/size][size=16px]次，然后[/size][size=16px]重悬细胞[/size][size=16px]在[/size][size=16px]密[/size][size=16px]度为[/size][size=16px]1.5[/size][font='arial'][size=16px]×[/size][/font][size=16px]10[/size][font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font][size=16px]/[/size][size=16px]mL[/size][size=16px]的[/size][size=16px]1[/size][font='arial'][size=16px]×[/size][/font][size=16px]结合缓冲液中。[/size][size=16px]b[/size][size=16px].[/size][size=16px]将[/size][size=16px]100[/size][size=16px] [/size][size=16px]μ[/size][size=16px]L[/size][size=16px]的溶液[/size][size=16px](1×10[/size][font='times new roman'][size=16px]5[/size][/font][size=16px]个细胞[/size][size=16px])[/size][size=16px]转移到[/size][size=16px]5[/size][size=16px] mL[/size][size=16px]培养管中。[/size][size=16px]c[/size][size=16px].[/size][size=16px]加入[/size][size=16px]1[/size][size=16px] [/size][size=16px]μ[/size][size=16px]L [/size][size=16px]FITC Annexin V[/size][size=16px]和[/size][size=16px]1[/size][size=16px] [/size][size=16px]μ[/size][size=16px]L[/size][size=16px] PI[/size][size=16px]。[/size][size=16px]d[/size][size=16px].[/size][size=16px]轻轻[/size][size=16px]拍打[/size][size=16px]细胞，[/size][size=16px]避光、室温[/size][size=16px] [/size][size=16px](25°C)[/size][size=16px] [/size][size=16px]孵育[/size][size=16px]15[/size][size=16px] min[/size][size=16px]。[/size][size=16px]e[/size][size=16px].[/size][size=16px]向每管中加入[/size][size=16px]400[/size][size=16px] [/size][size=16px]μ[/size][size=16px]L[/size][size=16px]的[/size][size=16px]1[/size][font='arial'][size=16px]×[/size][/font][size=16px] [/size][size=16px]Annexin V[/size][size=16px]。[/size][size=16px]1[/size][size=16px] h[/size][size=16px]内进行流式细胞仪分析。[/size][size=18px]克隆形成实验[/size][size=16px]H446[/size][size=16px]、[/size][size=16px]DMS114[/size][size=16px]采用平板克隆实验，[/size][size=16px]H69[/size][size=16px]、[/size][size=16px]H526[/size][size=16px]采用软琼脂克隆实验。[/size][size=16px]用公式[/size][size=16px]克隆形成率[/size][size=16px]=[/size][size=16px]克隆形成数[/size][size=16px]/[/size][size=16px]接种细胞数[/size][font='arial'][size=16px]×[/size][/font][size=16px]100[/size][size=16px]%[/size][size=16px]计算克隆形成率。[/size][size=16px]（[/size][size=16px]1[/size][size=16px]）铺板[/size][size=16px] [/size][size=16px]取[/size][size=16px]对数生长期[/size][size=16px] H446[/size][size=16px]、[/size][size=16px]H[/size][size=16px]69[/size][size=16px]、[/size][size=16px]H[/size][size=16px]526[/size][size=16px]、[/size][size=16px]D[/size][size=16px]MS114[/size][size=16px]细胞，[/size][size=16px]计数，分别接种等量细胞至[/size][size=16px]6[/size][size=16px]孔板，[/size][size=16px]“[/size][size=16px]十字形[/size][size=16px]”[/size][size=16px]晃动使细胞分布均匀，[/size][size=16px]继续培养[/size][size=16px]。[/size][size=16px] [/size][size=16px]（[/size][size=16px]2[/size][size=16px]）药物处理[/size][size=16px] [/size][size=16px]待细胞融合率约[/size][size=16px]80[/size][size=16px] [/size][size=16px]%[/size][size=16px]，[/size][size=16px]用[/size][size=16px]不同浓度（[/size][size=16px]0[/size][size=16px]、[/size][size=16px]IC20[/size][size=16px]、[/size][size=16px]IC50[/size][size=16px]）[/size][size=16px]西达本胺处理细胞[/size][size=16px]4[/size][size=16px]8[/size][size=16px] [/size][size=16px]h[/size][size=16px]后进行克隆形成实验。每组均设置[/size][size=16px]D[/size][size=16px]MSO[/size][size=16px]对照组。[/size][size=16px]（[/size][size=16px]3[/size][size=16px]）平板克隆形成实验[/size][size=16px]此方法[/size][size=16px]适用于贴壁生长的细胞[/size][size=16px]。[/size][size=16px]a[/size][size=16px].[/size][size=16px]西达本胺处理[/size][size=16px]4[/size][size=16px]8[/size][size=16px] [/size][size=16px]h[/size][size=16px]后[/size][size=16px]的[/size][size=16px]H[/size][size=16px]446[/size][size=16px]、[/size][size=16px]D[/size][size=16px]MS114[/size][size=16px]细胞，用胰酶消化[/size][size=16px]并计数。[/size][size=16px] [/size][font='times new roman'][size=16px]b.[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]接种细胞：将细胞接种于[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]孔板中，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]H[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]446[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]接种密度为[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]4[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]×[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]0[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]3[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]/[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]孔，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]D[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]MS114[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]接种密度[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]500[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]/[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]孔，注意一定让[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]细胞均匀[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]分布[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]。于[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] 37℃[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]5% CO2 [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]静置培养[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]-[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]3[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]周（终止培养时间以不于[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]周而且克隆之间不发生融合为标准）。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]c[/size][/font][font='times new roman'][size=16px].[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]旧培养基[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#4472c4] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px]用[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]PBS [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]清[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]洗[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]次[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]4%[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]多聚甲醛[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]固定液[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]固定[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] 20[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] min[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]，随后[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]去除固定液，加适量结晶紫染色[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]30[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] min[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]，用[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]蒸馏水[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]洗去[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]结晶紫[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]晾干，用扫描仪扫描成图片。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]d[/size][/font][font='times new roman'][size=16px].[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]在低倍镜[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]下[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]计数大于[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]50[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]个细胞的克隆数。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]e.[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]计算克隆形成率。[/size][/font][size=16px]（[/size][size=16px]4[/size][size=16px]）[/size][size=16px]软琼脂[/size][size=16px]克隆形成实验[/size][font='times new roman'][size=16px]适用于悬浮生长的细胞以及繁殖较快的贴壁细胞。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]a[/size][/font][font='times new roman'][size=16px].[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]配胶液：[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]用蒸馏水[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]和琼脂糖粉配制浓度为[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]0.6%[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]和[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]0.3%[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]的[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]琼脂糖液，高压灭菌[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]置于[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]42[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]℃[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]水浴锅中，目的是为了使其保持融化状态。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]b[/size][/font][font='times new roman'][size=16px].[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]配制含[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]20%[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]FBS[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]×[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]双抗的[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]×[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1640[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]培养基，用[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]0.22[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]m[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]的滤器过滤除菌。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]c[/size][/font][font='times new roman'][size=16px].[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]铺下层胶：[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]将[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]0.6%[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]的琼脂糖胶[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]液[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]与[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]×[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1640[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]培养基[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]等体积[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]混合，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]以[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]每孔[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1.5[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] mL[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]加[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]至[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]孔板中，室温[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]等其[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]凝固。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]d.[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]细胞计数：将细胞用[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]PBS[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]洗一遍，离心，加入新的培养基混匀稀释，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]计数。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]H[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]69[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]以[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]8[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]×[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]0[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]3[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]/[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]孔铺入[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]孔板，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]H[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]526[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]以[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]5[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]×[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]0[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]3[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]/[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]孔铺入[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]孔板。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]e.[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]铺上层胶：[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]将[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]0.3%[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]的琼脂糖胶[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]液[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]与[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]×[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]培养基[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]：[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]混合，加入[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]100[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]μ[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]L[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]细胞悬液[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]混匀后，每孔加入[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1.5[/size][/font][font='times new roman'][size=16px] mL[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]混合液[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]f.[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]放入[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]37℃[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]5%CO[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]培养箱培养，约[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]-3[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]周后[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]终止培养[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]g.[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]计数比较对照组与实验组的细胞数量，计算克隆形成率。[/size][/font]

普洛帝水中颗粒物计数仪OPC-2300说明书谁有

生鲜乳中体细胞数(SomaticCellCount，简称SCC)反应生鲜乳卫生状况和奶牛乳房健康的状态。体细胞通常由巨噬细胞、淋巴细胞、脱落上皮细胞和中性白细胞等组成。当乳腺被感染或受机械损伤后，体细胞会上升，受感染乳区的乳汁中大约99%的细胞是白细胞。　　1、高体细胞数对乳制品的影响主要有：(1)牛奶味道变异;(2)牛奶贮存期缩短;(3)乳清量增加、酪蛋白收缩性降低，导致奶酪的产量下降。　　2、引发高体细胞数原因有：(1)可能有隐性乳腺炎发生 发生隐性乳腺炎时，感染牛很少有临床症状，肉眼观察乳汁正常，故常常误将感染乳区的乳作正常牛奶处理，造成生鲜牛奶中体细胞的升高。(2)牛群结构偏老 一般而言，胎次越小的牛只体细胞越低。因为老龄牛只长期接触乳腺炎病原菌，免疫功能下降，有更多的被感染机会。　　3、降低生鲜乳中SCC，重点应从以下方面着手：(1)减少乳房机械性损伤。牛床、运动场、挤奶厅、饲槽、水槽等奶牛活动区域无尖锐物品，机械挤奶时不可过挤，以避免引起乳房损伤。(2)减少病原菌等生物侵袭。加强环境消毒，及时杀灭环境中的有害微生物。(3)日粮营养充足、均衡，提高机体抗感染能力。(4)定期(至少每月1次)进行牛群隐性乳房炎检测，及时进行乳房炎预防。(5)隔离患有传染性乳房炎的奶牛，淘汰患有慢性乳房炎的母牛等。

2012 辽宁的盐酸克伦特罗的能力验证，有谁做的啊，下周三报结果。。。互相参考参考

研究人员报告说，以能检测到皮肤中的外来入侵物而最为出名的一组免疫细胞也能通过代谢环境中的化学物质而促进肿瘤的生长。包括皮肤及那些覆盖许多身体表面的上皮组织形成了一种抵御微生物及可以引起癌症的化学毒素的关键性的屏障。（在人类中，90%的癌症起源于上皮组织。）这些组织常常充满了树突状细胞，其中包括一个叫做朗格汉斯细胞的亚组细胞，这些细胞可识别抗原并将它们“穿戴”在其表面以警示T细胞进行防御反应。这些抗原可以是微生物，或它们也可来自肿瘤。然而，令人感到惊讶的是，缺乏朗格汉斯细胞的小鼠则可不受化学性致癌作用的侵害，而Badri Modi及其同事希望能找出其原因。他们如今用一种鳞状细胞癌的小鼠模型揭示了朗格汉斯细胞可驱使健康的皮肤细胞转变成为癌性细胞。朗格汉斯细胞在对致癌物7,12二甲基苯丙蒽（DMBA）进行回应时会增加其对某种叫做CYP1B1酶的表达，这种酶会将DMBA代谢成为一种可诱导细胞内突变的化合物。文章的作者指出，DMBA是一种聚芳烃，或PAH，而这些烃类化合物一般在工业污染中非常普遍。他们说，含有PAH的颗粒物质可能是人类皮肤癌中的一种未得到正确评价的环境因素。 —————————————————————————————————————————— 令人震惊的比例（人类90%），不过PAHs尤其是苯并芘（BAP）是强致癌物倒是听说过！

流式细胞术是一项基于激光和免疫荧光的单细胞检测技术。当带有荧光标记的细胞或其它颗粒流动通过检测点时，激光与荧光素分子相互作用，产生的光信号可以定性或定量的表征细胞中被标记的成分。由于细胞的特异性主要由

一、细胞因子的概念细胞因子(cytokine)是由机体多种细胞分泌的小分子蛋白质，通过结合细胞表面的相应受体发挥以调节免疫应答为主的生物学作用。细胞因子具有 非常广泛的生物学活性，包括促进靶细胞的增殖和分化，增强抗感染和细胞杀伤效应，促进或抑制其它细胞因子和膜表面分子的表达，促进炎症过程，影响细胞代谢 等。二、细胞因子的命名细胞因子按其来源可分为：由单个核吞噬细胞产生的细胞因子称为单核因子(monokine)；由淋巴细胞产生的细胞因子称为淋巴因子 (lymphokine)等。按其作用可分为干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、生长因子和趋化因子等。部分由不同细胞分泌的细胞因子，其基因及编码蛋 白与结构清楚者，在免疫调节、造血和炎症中发挥重要作用，又称为白细胞介素(interleukin，IL)。也可以依据结构或者其受体结构分类，我们的 趋化因子目前没有受体产品。三、细胞因子的特征1、低分子量；一般为＜60kD的多肽或糖蛋白。多以单体形式存在，少数为二聚体，三聚体。2、天然细胞因子由抗原、丝裂原或其他刺激物活化的细胞所分泌，通过旁分泌(paracrine)、自分泌(autocrine)或内分泌(endocrine)方式在局部发挥短暂作用。3、一种细胞因子可由多种细胞产生，同一种细胞可产生多种细胞因子。4、需通过与靶细胞表面相应受体结合后发挥其生物学效应。5、具有高效性、多效性、叠性、拮抗性、协同性和网络性。四、细胞因子的分类1、白细胞介素(interleukin，IL-s)最初是指由白细胞产生又在白细胞间发挥作用的细胞因子。2、干扰素（interferon,IFN)最早发现的细胞因子，有干扰病毒感染和复制的能力。分α、β和g三种类型。3、肿瘤坏死因子超家族(tumor necrosis factor，TNF)1975年发现的一种能使肿瘤发生出血坏死的物质。4、集落刺激因子(colony-stimulating factor，CSF)指能够刺激多能造血干细胞和不同造血祖细胞增殖分化，在半固体培养基中形成相应细胞集落的细胞因子。包括G-CSF（粒细胞）、M-CSF（巨噬细胞）、 GM-CSF（粒细胞、巨噬细胞）、Multi-CSF（多重）（IL-3）、红细胞生成素(EPO)、干细胞生长因子(SCF)、血小板生成素 (TPO)等。5、趋化因子(chemokine)主要功能是招募血液中的单核细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等进入特定的淋巴器官和组织以及感染发生的部位。根据趋化因子近N端半胱氨酸(Cys)的位置、排列方式和数量，可分为CC、CXC、C、CX3C四个亚家族。6生长因子(growth factor，GF)生长因子(GF)是具有刺激细胞生长作用的细胞因子。五、细胞因子的生物学活性1.介导自然免疫、参与抗肿瘤和抗感染2.调节T、B细胞活化、生长和分化，介导细胞免疫和体液免疫3.刺激造血生成、刺激骨髓祖细胞生长和分化为各种成熟血细胞4.在炎症、感染和内毒素血症中的作用5.在超敏反应和自身免疫病中的作用6.细胞因子通过激活其相应受体（CKR），导致细胞的增殖与分化或分泌某种蛋白质。六、四种蛋白表达体系比较表达细胞优点缺点原核E. coli繁殖快、成本低、产量高遗传背景及基因表达调控机制清楚易于大规模培养，成本低廉蛋白常为包涵体，纯化困难无糖基化（分泌蛋白，细胞膜上蛋白不可用），生物活性不定无翻译后修饰，内毒素含量高酵母Pichia使用简单，表达量高，His-tag便于纯化，一定的翻译后加工可进行糖基化修饰，操作简单，适合大规模生产可诱导表达，也可分泌表达，产物便于纯化有时会出现蛋白切割问题糖基化不能满足要求昆虫High-5产量高 ，翻译后加工与哺乳动物相似对于部分有毒性或较难表达蛋白有优势无内毒素污染蛋白活性不如哺乳动物适合表达激酶等定位于细胞内的真核蛋白哺乳CHO HEK293完善的翻译后加工，活性接近天然蛋白周期长、技术要求高表达产量低

果蔬中的α-胡萝卜素能显著降低死亡风险 对于很多关心自身健康的人来说，富含蔬菜和水果的天然饮食促进健康和延年益寿功效已不是新闻。与天然饮食相对，充斥着合成化学物、氢化脂肪酸以及盐分和糖分的食物会破坏我们的基因完整性，从而引起新陈代谢功能的紊乱。我们的身体喜欢摄取天然营养成分，居住在远离污染物和人造毒素的环境。研究者现在发现富含蔬菜和水果的饮食能降低39%任何死亡风险。α-胡萝卜素水平与低死亡风险α-胡萝卜素是一种强力抗氧化剂，只需消费富含蔬菜和水果的饮食即可获得。该超级营养素在天然果蔬的色彩缤纷的皮肉中很多。刊登在《内科医学档案》(Archives of Internal Medicine)中的一项对15万名男性和女性血液中的α-胡萝卜素水平进行18年追踪调查的研究发现血液中α-胡萝卜素饱和度和死亡风险有直接联系。健康饮食降低39%各种死亡风险研究者对α-胡萝卜素水平进行测量以确定死亡风险，发现高血液α-胡萝卜素饱和度的个人与低饱和度的相比，死于任何原因的风险降低了39%。经常食用蔬菜和水果的参与者的血液中α-胡萝卜素水平最高，而消费加工食品的参与者中几乎没有可测量的该抗氧化剂。该研究发现α-胡萝卜素能有效地预防心血管疾病以及脑癌、肝癌和皮肤癌。