果胶酶万

林怡灵[font=黑体][size=21px]目录[/size][/font]第1章 果胶的概述 31．1果胶的简介 31.1.1果胶 41.1.2果胶的性状 41.1.3果胶的发现 41.1.4果胶的用途 41.1.5果胶的分子结构特征 4第2章 果胶的食品化学性质及用途 52.1 果胶的性质 52.1.1 果胶的性质 52.1.2果胶的性质及用途[6]见图2 5第三章 与果胶质量有关的内在因素 73.1原料种类 73.2果胶酶 7第四章 果胶的提取技术 84.1 酸提取法 84.1.1 酸解提取法 84.1.2 离子交换树脂提取法 94 . 1.3 草酸铵提取法 94.1.4 微波助提法 94.1.5 高频电磁场提取法 104.1.6 超声浸提法 104.2 生物酶（微生物发酵）提取法 11第五章 果胶作为食品添加剂的使用标准与风险评估 115.1使用标准 115.2风险评估 11第六章 果胶的应用 12参考文献 15[align=center][font='calibri'][size=14px][color=#000000]第1章 [/color][/size][/font][font='calibri'][size=14px][color=#000000]果胶的概述[/color][/size][/font][/align][font='calibri'][size=14px]1．1果胶的简介[/size][/font][font='calibri'][size=14px]1[/size][/font][font='calibri'][size=14px].1[/size][/font][font='calibri'][size=14px].1果胶[/size][/font][font='宋体'][size=16px]果胶是一类广泛存在于植物细胞壁的初生壁和细胞中间片层的杂多糖，[/size][/font][font='宋体'][size=16px]1824[/size][/font][font='宋体'][size=16px]年法国药剂师[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]Bracennot[/size][/font][font='宋体'][size=16px]首次从胡萝卜提取得到，并将其命名为[/size][/font][font='宋体'][size=16px]“[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]pectin[/size][/font][font='宋体'][size=16px]”[/size][/font][font='宋体'][size=16px]。[/size][/font][font='宋体'][size=16px] [/size][/font][font='宋体'][size=16px]果胶主要是一类以[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]D[/size][/font][font='宋体'][size=16px]-[/size][/font][font='宋体'][size=16px]半乳糖醛酸（[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]D-Galacturonic Acids，D-Gal-A[/size][/font][font='宋体'][size=16px]）由[/size][/font][font='宋体'][size=16px] α-1,4-[/size][/font][font='宋体'][size=16px]糖苷键连接组成的酸性杂多糖，除[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]D-Gal-A[/size][/font][font='宋体'][size=16px]外，还含有[/size][/font][font='宋体'][size=16px]L-[/size][/font][font='宋体'][size=16px]鼠李糖、[/size][/font][font='宋体'][size=16px]D-[/size][/font][font='宋体'][size=16px]半乳糖、[/size][/font][font='宋体'][size=16px]D-[/size][/font][font='宋体'][size=16px]阿拉伯糖等中性糖，此外还含有[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]D[/size][/font][font='宋体'][size=16px]-[/size][/font][font='宋体'][size=16px]甘露糖、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]L[/size][/font][font='宋体'][size=16px]-[/size][/font][font='宋体'][size=16px]岩藻糖等多达[/size][/font][font='宋体'][size=16px]12[/size][/font][font='宋体'][size=16px]种的单糖，不过这些单糖在果胶中的含量很少。[/size][/font][font='宋体'][size=16px][1][/size][/font][font='calibri'][size=14px]1[/size][/font][font='calibri'][size=14px].1.2[/size][/font][font='calibri'][size=14px]果胶的性状[/size][/font][font='宋体'][size=16px]果胶为白色或带黄色或浅灰色、浅棕色的粗粉至细粉，几无臭，口感黏滑。溶于[/size][/font][font='宋体'][size=16px]20[/size][/font][font='宋体'][size=16px]倍水，形成乳白色粘稠状胶态溶液，呈弱酸性。耐热性强，几乎不溶于乙醇及其他有机溶剂。用乙醇、甘油、砂糖糖浆湿润，或与[/size][/font][font='宋体'][size=16px]3[/size][/font][font='宋体'][size=16px]倍以上的砂糖混合可提高溶解性。在酸性溶液中比在碱性溶液中稳定[/size][/font][font='宋体'][size=16px][2] [/size][/font][font='宋体'][size=16px]。[/size][/font][font='calibri'][size=14px]1[/size][/font][font='calibri'][size=14px].1.3[/size][/font][font='calibri'][size=14px]果胶的发现[/size][/font][font='宋体'][size=16px]1824[/size][/font][font='宋体'][size=16px]年法国药剂师[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]Bracennot[/size][/font][font='宋体'][size=16px]首次从胡萝卜提取得到[/size][/font][font='calibri'][size=14px]1[/size][/font][font='calibri'][size=14px].1.4[/size][/font][font='calibri'][size=14px]果胶的用途[/size][/font][font='宋体'][size=16px]果胶在食品中用做凝胶剂、增稠剂、组织成型剂、乳化剂和稳定剂。由于果胶分子的构成使果胶具有多种功能性质，因此果胶能够用于不同的食品中，比如制造果酱、果冻、果脯、凝胶软糖、蜜饯、面包、乳制品、罐头、果汁饮料等。果胶无毒，食用安全，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]FAO/WHO[/size][/font][font='宋体'][size=16px]食品添加剂联合委员会推荐果胶为不受添加量限制的安全食品添加剂。果胶用处很大，可以说是无处不在、无处不用[3]。[/size][/font][font='calibri'][size=14px]1.1.5[/size][/font][font='calibri'][size=14px]果胶的分子结构特征[/size][/font][font='calibri'][size=14px]果胶分子的结构特征[/size][/font][font='calibri'][size=14px][4][/size][/font][font='calibri'][size=14px]见图[/size][/font][font='calibri'][size=14px]1[/size][/font][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/06/202106112338562038_4289_1608728_3.jpeg[/img][align=center][font='calibri'][size=14px][color=#000000]第2章 果胶的食品化学性质及用途[/color][/size][/font][/align][font='calibri'][size=14px]2.1 [/size][/font][font='calibri'][size=14px]果胶的性质[/size][/font][font='calibri'][size=14px]2[/size][/font][font='calibri'][size=14px].1[/size][/font][font='calibri'][size=14px].[/size][/font][font='calibri'][size=14px]1 [/size][/font][font='calibri'][size=14px]果胶的性质[/size][/font][font='calibri'][size=14px]果胶是分子量在5万[/size][/font][font='calibri'][size=14px]~15[/size][/font][font='calibri'][size=14px]万之间的大分子物质[[/size][/font][font='calibri'][size=14px]5][/size][/font][font='calibri'][size=14px]，可溶于水而不溶于与有机溶剂，其溶解速率与温度、干燥技术、粉粒大小等有关。果胶的色泽随原料、生产工艺的不同而各不相同，从乳白色到淡黄褐色。果胶带负电荷，其分子中部分羧基被甲醇酯化，根据酯化度（D[/size][/font][font='calibri'][size=14px]E）[/size][/font][font='calibri'][size=14px]的不同，将D[/size][/font][font='calibri'][size=14px]E[/size][/font][font='calibri'][size=14px]大于5[/size][/font][font='calibri'][size=14px]0%[/size][/font][font='calibri'][size=14px]称为高酯果胶，小于5[/size][/font][font='calibri'][size=14px]0%[/size][/font][font='calibri'][size=14px]的称为低酯果胶，且酯化度对果胶的特性有很大的影响，尤其是凝胶强度和溶解度。[/size][/font][font='calibri'][size=14px]果胶性质的一大特点是凝胶化，在一定的条件下，果胶分子间可以交链成一种网状结构，水和可溶性固状物被封入其网目之中，从而完成凝胶作用。果胶的化学构造、p[/size][/font][font='calibri'][size=14px]H[/size][/font][font='calibri'][size=14px]值、温度、糖、钙离子等许多因素，影响着果胶的凝胶作用与凝胶程度。果胶根据酯化度的不同有高脂果胶与低脂果胶之分。甲酯化程度是影响果胶流变学性质的重要因素，同时也决定着果胶的应用途径。[/size][/font][font='calibri'][size=14px]同时凝胶程度也是衡[/size][/font][font='calibri'][size=14px]量成品果胶质量优劣的指标之一，温度对果胶凝胶强度没有多大影响。在脱水剂的含量和pH适当的情况下，在0～50℃范围内，温度对果胶凝胶的刚性模数只有极小的变化。果胶凝胶强度的主要影响因素是果胶的分子量及酯化度。 [/size][/font][font='calibri'][size=14px]2[/size][/font][font='calibri'][size=14px].1.2[/size][/font][font='calibri'][size=14px]果胶的性质及用途[[/size][/font][font='calibri'][size=14px]6][/size][/font][font='calibri'][size=14px]见图2[/size][/font][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/06/202106112338564209_6143_1608728_3.jpeg[/img][font='calibri'][size=14px]果胶的构造与其凝胶性质的关系[4]见图3[/size][/font][font='calibri'][size=14px]由图三可知，[/size][/font][font='calibri'][size=14px]P41凝胶脆而易碎, 而F43具有良好的塑性。[/size][/font][font='calibri'][size=14px]增黏与稳定化作用也是果胶重要的食品学性质。其中作为酸性乳饮料的稳定剂是果胶在食品工业中的主要用途之一。乳蛋白的主要成分酪蛋白在pH值4.0的酸性领域易发生凝集而产生沉淀。酸性乳饮料中加入果胶后, 由于果胶分子与酪蛋白之间的静电作用, 使得果胶分子吸附在酪蛋白胶束上而起到稳定酸性乳的作用。这一稳定化作用的效果也与果胶的种类、分子的甲酯化程度及甲氧基的分布状态有关。[/size][/font][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/06/202106112338566172_1352_1608728_3.png[/img][align=center][font='calibri'][size=14px]第三章 与果胶质量有关的内在因素[/size][/font][/align][font='calibri'][size=14px]3.1[/size][/font][font='calibri'][size=14px]原料种类[/size][/font][font='calibri'][size=14px] 研究表明，果胶在植物中蕴藏丰富，但不同原料来源的果胶质量（如含量、酯化度、胶凝力等）不同，柑橘类果皮（干基）中果胶含量为25%，苹果渣（干基）中果胶含量为15%～18%，用其制得的果胶酯化度为50%～75%，属高酯果胶[7]；向日葵盘（干基）中果胶含量为25%[8]，用其制得的[/size][/font][font='calibri'][size=14px]果胶[/size][/font][font='calibri'][size=14px]酯化度为11%，属低酯果胶[9]；甜菜渣（干基）中果胶含量为25%，用其制得的则是部分乙酰化的果胶，[/size][/font][font='calibri'][size=14px]Rombouts[/size][/font][font='calibri'][size=14px][10]报道了甜菜根果胶的分子量和酯化度低，尽管可以作为增稠剂，但其不适合作胶凝剂。虽然几乎每种植物都含有果胶，但目前真正具有工业化生产价值的原料主要是柑橘皮和苹果渣2种[11]，大规模商业化[/size][/font][font='calibri'][size=14px]生产果胶始于2[/size][/font][font='calibri'][size=14px]0[/size][/font][font='calibri'][size=14px]世纪4[/size][/font][font='calibri'][size=14px]0[/size][/font][font='calibri'][size=14px]年代。[/size][/font][font='calibri'][size=14px]3[/size][/font][font='calibri'][size=14px].2[/size][/font][font='calibri'][size=14px]果胶酶[/size][/font][font='calibri'][size=14px]在果实成熟衰老过程中，果胶甲酯酶（[/size][/font][font='calibri'][size=14px]Pectinesterase，PE[/size][/font][font='calibri'][size=14px]）、多聚半乳糖醛酸酶（[/size][/font][font='calibri'][size=14px]Poly-galacturonase，PG[/size][/font][font='calibri'][size=14px]）和果胶裂解酶（[/size][/font][font='calibri'][size=14px]Pectatelyase，PL[/size][/font][font='calibri'][size=14px]）是参与果胶降解的3种主要酶。[/size][/font][font='calibri'][size=14px]然而，在不同的原料中，果胶酶的种类与活性不同。在果实成熟衰老过程中，通常是[/size][/font][font='calibri'][size=14px]PE[/size][/font][font='calibri'][size=14px]活性增加，脱除甲氧基，随后[/size][/font][font='calibri'][size=14px]PG[/size][/font][font='calibri'][size=14px]活性增强，分解聚半乳糖醛酸链，最后[/size][/font][font='calibri'][size=14px]PL[/size][/font][font='calibri'][size=14px]将果胶酸分解成不饱和三聚体。大多数研究证实，在苹果、桃、番茄等果实成熟软化中，主要是[/size][/font][font='calibri'][size=14px]PG[/size][/font][font='calibri'][size=14px][12]起作用，[/size][/font][font='calibri'][size=14px]PG[/size][/font][font='calibri'][size=14px]的活性与水溶性果胶含量的提高及果胶分子量的下降存在着显著的正相关[13]。而[/size][/font][font='calibri'][size=14px]PE[/size][/font][font='calibri'][size=14px]的活性与作用在不同种类、不同品种 的果实中表现不同，在樱[/size][/font][font='calibri'][size=14px]桃、梨的软化中发现[/size][/font][font='calibri'][size=14px]PE[/size][/font][font='calibri'][size=14px]的活性是增加的[[/size][/font][font='calibri'][size=14px]14 15][/size][/font][font='calibri'][size=14px]，而在鳄梨和芒果的软化过程中活性却是下降的[[/size][/font][font='calibri'][size=14px]16 17][/size][/font][font='calibri'][size=14px]。在香蕉的软化中起主要作用的是[/size][/font][font='calibri'][size=14px]PL[/size][/font][font='calibri'][size=14px]，[/size][/font][font='calibri'][size=14px]Anurag Paysai[/size][/font][font='calibri'][size=14px][18][/size][/font][font='calibri'][size=14px]研究发现，香蕉在达到呼吸高峰时，[/size][/font][font='calibri'][size=14px]PL[/size][/font][font='calibri'][size=14px]活性最大，[/size][/font][font='calibri'][size=14px]PG[/size][/font][font='calibri'][size=14px]活性滞后。[/size][/font][align=center][font='calibri'][size=14px]第四章 果胶的提取技术[/size][/font][/align][font='calibri'][size=14px]在植物体中,果胶有3种形态,即原果胶、果胶、果胶酸。果胶一般以不溶于水的原果胶形式存在,它提取的基本原理是将不溶性果胶转变为可溶性果胶,并使可溶性果胶向液相转移从而分离出来。目前,果胶的提取技术大致分为酸提取及生物酶提取法2种。[/size][/font][font='calibri'][size=14px]4.1酸提取法[/size][/font][font='calibri'][size=14px]4.1.1酸解提取法[/size][/font][font='calibri'][size=14px]酸解提取技术是根据果胶在稀酸中加热可转变为水溶性果胶的原理,将原料粉碎、漂洗后加入适量的水，用酸将溶液pH调至1.5~3.0,温度在50~100°C范围内,时间1~4h,加热抽提[/size][/font][font='calibri'][size=14px]一[/size][/font][font='calibri'][size=14px]段时间,将大部分果胶提取出来。所用的酸多是硫酸、盐酸、磷酸等无机酸,为了改善果胶成品的色泽,也可用亚硫酸。酸解醇沉提取果胶的技术早在1925年就有报道。目前,国外在柑橘、苹果果胶的生产中普遍采用[/size][/font][font='calibri'][size=14px]。[/size][/font][font='calibri'][size=14px]酸解提取技术。我国在酸解提取果胶的技术研究方面也做了大量的工作,如张鸿发等[/size][/font][font='calibri'][size=14px][[/size][/font][font='calibri'][size=14px]19]用盐酸提取、乙醇沉淀的方法从柑橘皮中提取果胶,结果表明,在pH1.5,温度80°C,时间2h条件下果.胶获得率为13.88% 徐金[/size][/font][font='calibri'][size=14px]瑞[[/size][/font][font='calibri'][size=14px]20]比较了HCl,H[/size][/font][font='calibri'][size=14px]2[/size][/font][font='calibri'][size=14px]SO,HNO[/size][/font][font='calibri'][size=14px]3[/size][/font][font='calibri'][size=14px], HPO[/size][/font][font='calibri'][size=14px]4[/size][/font][font='calibri'][size=14px], H[/size][/font][font='calibri'][size=14px]2[/size][/font][font='calibri'][size=14px]SO[/size][/font][font='calibri'][size=14px]3[/size][/font][font='calibri'][size=14px]及各种酸与H[/size][/font][font='calibri'][size=14px]2[/size][/font][font='calibri'][size=14px]SO[/size][/font][font='calibri'][size=14px]3[/size][/font][font='calibri'][size=14px]的混合酸作萃取剂提取苹果果胶,结果表明,使用H[/size][/font][font='calibri'][size=14px]3[/size][/font][font='calibri'][size=14px]PO[/size][/font][font='calibri'][size=14px]4[/size][/font][font='calibri'][size=14px]与H[/size][/font][font='calibri'][size=14px]2[/size][/font][font='calibri'][size=14px]SO[/size][/font][font='calibri'][size=14px]3[/size][/font][font='calibri'][size=14px]混合酸作萃取剂的粗果胶获得率最高为14.5%,而且所得果胶色泽浅 陈雪峰等[/size][/font][font='calibri'][size=14px][[/size][/font][font='calibri'][size=14px]21]研究了不同pH对苹果果胶获得率的影响,发现在pH0.5时,无产品,pH3.5时,果胶获得率为6.5%,在pH2.0时,果胶获得率最高,为11.1%。[/size][/font][font='calibri'][size=14px]酸法提取果胶的过程受很多因素影响,如物料特性、温度、pH、时间、酸的种类、固液比等,在应用中，应予以重视并加以控制,否则易发生局部水解,致使果胶分子量降低,从而影响果胶的产率和质量。该法操作简单、生产成本低、适用性强,是目前工业生产上普遍采用的技术。[/size][/font][font='calibri'][size=14px]4.1.2离子交换树脂提取法[/size][/font][font='calibri'][size=14px] [/size][/font][font='calibri'][size=14px]离子交换树脂提取法就是将经预处理的原料,与离子交换剂和水在pH1.3~1.6条件下制成浓浆液,在65~95°C下加热2~3h,过滤,分离出不溶性的离子交换剂和废渣,即得到含有果胶的滤液。离子交换树脂的用量为原料皮重的10%~50%,尤以30%~40%为宜。Mg[/size][/font][font='calibri'][size=14px]2+[/size][/font][font='calibri'][size=14px],Ca[/size][/font][font='calibri'][size=14px]2+[/size][/font][font='calibri'][size=14px]等对果胶有封闭作用,影响果胶转化为水溶性果胶。因此,用离子交换法,可使提取液中离子交换到树脂上,而不影响果胶提取，使果胶获得率上升为7.2%~8.56%。[/size][/font][font='calibri'][size=14px]J M GHuang[/size][/font][font='calibri'][size=14px]等采用离子交换树脂的方法,使果胶获得率比用无机酸提取法高10%~35% ,胶凝度可达135~ 200度 张燕等[22]用离子交换树脂法提取橘皮中果胶,在单因素的基础上选定树脂类型、用量、pH、温度4个主要因素进行正交实验,确定了树脂使用型号为0.03*7,用量为干橘皮重的10%,提取剂pH1.5,温度90C,时间1.5h,果胶获得率为15.32%,好于常规不加离子交换树脂的工艺,并且酯化度为74.6%,比常规法提高了7.5%[23].。但由于此法生产成本高,在我国的果胶生产中尚无使用。[/size][/font][font='calibri'][size=14px]4.1.3草酸铵提取法[/size][/font][font='calibri'][size=14px] [/size][/font][font='calibri'][size=14px]果胶质通常是以部分甲基化的多聚半乳糖醛酸的钙盐或镁盐的形式存在,用草酸铵作萃取剂提取果胶,可将不溶的果胶酸钙转变为水溶性果胶，从而增加果胶的产率。陈改荣[/size][/font][font='calibri'][size=14px][[/size][/font][font='calibri'][size=14px]23]叫用草酸铵作为萃取剂提取胡萝卜中的果胶,将胡萝卜渣置于15倍的0.5%的草酸铵溶液中,加热至90°C ,并恒温搅拌1.5h,果胶产率为13.0%,酯化度为65.1%。而酸法提取的产率为10.0%, 酯化度为66.3%[/size][/font][font='calibri'][size=14px] [/size][/font][font='calibri'][size=14px]草酸铵提取法可使不溶性果胶酸钙转化为可溶性铵盐,Ca[/size][/font][font='calibri'][size=14px]2+[/size][/font][font='calibri'][size=14px]以草酸钙沉淀的形式除去。[/size][/font][font='calibri'][size=14px]4.1.4微波助提法[/size][/font][font='calibri'][size=14px] [/size][/font][font='calibri'][size=14px]微波是一种频率为300MHz~300GHz的电磁波。微波辅助提取是利用微波加热与样品相接触的溶剂,将所需化合物从样品基体中分离,进入溶剂中的一个过程。微波加热主要是根据被加热物质中的极性分子(如H20在微波电磁场中做定向排列,从而产生相互摩擦而发热,产生的热能使其内部压力超过细胞空间膨胀的能力,从而导致细胞破裂,细胞内物质自由流出,传递到周围被溶解。微波法用于天然成分的提取,选择性高操作时间短、溶剂耗量小、目标组分获得率高,并且能极大限度地保留分离组分的天然活性[/size][/font][font='calibri'][size=14px][[/size][/font][font='calibri'][size=14px]24]。龚冉等[/size][/font][font='calibri'][size=14px][[/size][/font][font='calibri'][size=14px]25]利用甜菜废粕为原料，得出提取果胶的最佳工艺为微波功率900W,萃取次数4次,每次萃取75s,pH2.0的盐酸溶液与废粕比为14:1，果胶获得率为97.63% ,胶凝度为63 侯春友[/size][/font][font='calibri'][size=14px][[/size][/font][font='calibri'][size=14px]26]以柑橘皮为原料,用盐酸萃取硫酸铝沉淀提取果胶,探讨了影响果胶获得的因素,确定了最佳工艺为pH2.0,微波辐射时间5min,辐射温度85C,料液比为1:13,提取率为26% 郑志花等[/size][/font][font='calibri'][size=14px][[/size][/font][font='calibri'][size=14px]27]用微波法提取向日葵盘果胶,并分别比较了微波加热技术和传统加热技术，结果表明，传统加热果胶获得率为7.3%,凝胶强度为113度,微波加热的获得率为9.5%,凝胶强度为133度,二者均比传统法高,主要是由于微波加热时间短,物料受热均匀,不易使果胶的苷键断裂而发生分解。[/size][/font][font='calibri'][size=14px]4.1.5高频电磁场提取法[/size][/font][font='calibri'][size=14px] [/size][/font][font='calibri'][size=14px]在高频电磁场作用下,生物材料可吸收电磁场辐射能量而转化为热量,增强热量和质量传递过程。肖凯军等[/size][/font][font='calibri'][size=14px][[/size][/font][font='calibri'][size=14px]28]认为,高频电磁场能提高果胶与水等极性物质温度,促进植物细胞变性,降低固液扩散阻力,增加平均扩散系数,提高浸取效率,获得高凝胶强度的果胶产品。研究结果表明,在高频电磁场辐射(恒定功率460W和频率2450Hz,料液比为1:3,pH2.0)下浸取15min的果胶量为32.819mg/ml,与传统加热法40 min的提取效果相当,浸取效率提高了2~3倍,所制得的果胶产品的凝胶强度(197)大于传统方法。[/size][/font][font='calibri'][size=14px]4.1.6超声波浸提法[/size][/font][font='calibri'][size=14px] [/size][/font][font='calibri'][size=14px]超声波是频率高于20kHz的机械波,它在媒质中传播时可产生空化现象,空化中产生的极大压力造成被破碎物在瞬间破碎,同时,超声波产生的振动作用加强了被破碎物的扩散及溶解。林曼斌等[29]主要研究了用超声波辅助盐析法从仙人掌中提取果胶,用JY96-超声波细胞粉碎机提取果胶,其最佳提取条件为提取功率60W,料液比为1:2.5,提取时间15min果胶获得率为9.15%。[/size][/font][font='calibri'][size=14px]4.2生物酶(微生物发酵)提取法[/size][/font][font='calibri'][size=14px]微生物法提取果胶是将原料放入发酵罐中,接种,经过静止、搅拌、低温(30[/size][/font][font='calibri'][size=14px]°[/size][/font][font='calibri'][size=14px]C左右)振荡培养15~20h,利用微生物产生的酶将果胶从植物组织中游离出来,这种酶能选择性分解植物组织中的复合多糖体,从而可有效地提取出植物组织中的果胶。日本的TakuoSakai等人研究出利用微生物发酵从中国蜜橘皮中萃取果胶的方法,不用对原料进行处理,避免了过滤时的麻烦[/size][/font][align=center][font='calibri'][size=14px]第五章 [/size][/font][font='calibri'][size=14px] [/size][/font][font='calibri'][size=14px]果胶作为食品添加剂的使用标准与风险评估[/size][/font][/align][font='calibri'][size=14px]5.1[/size][/font][font='calibri'][size=14px]使用标准[/size][/font][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/06/202106112338566238_6152_1608728_3.png[/img][font='calibri'][size=14px]5[/size][/font][font='calibri'][size=14px].2风险评估[/size][/font][font='calibri'][size=14px]欧盟对果胶的安全风险评估[/size][/font][font='calibri'][size=14px]1. 果胶不太可能被完整吸收, 而是被肠道微生物群发酵形成与果胶衍生物酸性寡糖 (p AOS) 相似的物质 [/size][/font][font='calibri'][size=14px]2. 果胶没有遗传毒性的迹象 [/size][/font][font='calibri'][size=14px]3. 在人体内6周的剂量为36 g/d (相当于515 mg/kgbw/d) 没有不利影响, 对于95%幼儿来说暴露量每天可达442mg/kg bw/d。[/size][/font][font='calibri'][size=14px]我国《食品添加剂使用卫生标准》（G[/size][/font][font='calibri'][size=14px]B 2760[/size][/font][font='calibri'][size=14px]-[/size][/font][font='calibri'][size=14px]2014[/size][/font][font='calibri'][size=14px]）中规定：果胶可作为乳化剂、稳定剂、增稠剂，按生产需要适量用于除果蔬外的各类食品，在果蔬中最大使用量为3[/size][/font][font='calibri'][size=14px].0g[/size][/font][font='calibri'][size=14px]/[/size][/font][font='calibri'][size=14px]kg[/size][/font][font='calibri'][size=14px]，[/size][/font][font='calibri'][size=14px]固体饮料按稀释倍数增加使用量。果胶可用于果酱、果冻的制造；防止糕点硬化；改进干酪质量；制造果汁粉等。高酯果胶主要用于酸性的果酱、果冻、凝胶软糖、糖果馅心以及乳酸菌饮料等。低酯果胶主要用于一般的或低酸味的果酱、果冻、凝胶软糖以及冷冻甜点，色拉调味酱，冰淇淋、酸奶等。[/size][/font][align=center][font='calibri'][size=14px]第六章 果胶的应用[/size][/font][/align][font='calibri'][size=14px]6.1食品[/size][/font][font='calibri'][size=14px]6.1.1烘焙[/size][/font][font='calibri'][size=14px]在面制品加工工艺中，水溶性亲水性聚合物胶体可用作面条食品改良剂和各种面包保水剂。果胶是高度亲水性胶体，可以溶解在冷水中并快速水合形成高黏度的分散体，因此在蛋糕中加入果胶可以改善其吸水性[30,31]。并且果胶能改变淀粉老化的进程，进而改善蛋糕的口感。在蛋糕的生产中发现，面粉中加入适量的果胶可以增加蛋糕的比体积，提高蛋糕糊的稳定性，并防止蛋糕老化、保持口感松软。果胶蛋糕可以长时间保持松软[32],因此果胶能够有效延长面包架售间。[/size][/font][font='calibri'][size=14px]冷冻影响面包的质量，酵母的活性降低并且面团的强度降低。添加果胶可以改变面包的质量，通过比较新鲜面包和冷冻面包，添加果胶的面团在最大拉伸强度方面有显著改善，因此可以判断，果胶的添加对酵母具有良好的保护作用[/size][/font][font='calibri'][size=14px][[/size][/font][font='calibri'][size=14px]33]。[/size][/font][font='calibri'][size=14px]6.1.2食品添加剂[/size][/font][font='calibri'][size=14px] [/size][/font][font='calibri'][size=14px] 果胶可用作饮料的增稠剂和稳定剂。通过向果汁饮料中添加适量的果胶溶液，可以悬浮果肉而不分层，使之保持较好的外观，并且改善口感[34]。果胶可增加鲜奶的黏度，防止牛奶变酸，果胶的保护性胶体特性在含酪蛋白的儿童食品或儿童乳中的生产中具有特殊价值[35]。将适量果胶加入儿童饮用的牛奶中，可以使沉淀的酪蛋白变成细小的胶粒，易被儿童消化吸收[36]。[/size][/font][font='calibri'][size=14px]不同类型的果胶具有不同的作用。例如，在酸奶的生产中， 加入高酯果胶能稳定酸奶的结构，加入低甲氧基果胶则能防止乳清的析出[37]。与淀粉和其他植物胶对比，以果胶为稳定剂的水果酸奶具有极好的风味和质地。如果生产果酱时原料中的果胶含量较低，可以加入果胶作为增稠剂。[/size][/font][font='calibri'][size=14px]6.2医药[/size][/font][font='calibri'][size=14px] [/size][/font][font='calibri'][size=14px] 果胶具有止泻、抗癌、降低胆固醇，抑菌、解毒、预防胆结石形成等作用，可单独使用或与其他药物联合用于治疗某些疾病，延长药物在体表的停留时间。果胶和其他膳食纤维一样， 不能在胃肠道内被消化，所以进入消化道后依然能够保持其胶体活性。在口服常规制剂后，药物在到达结肠之前就会被吸收，无法对病变部位起作用。因此，可以以果胶为载体，单独或与其他赋形剂组合配制成软膏、薄膜、栓剂、微胶囊等药物。[/size][/font][font='calibri'][size=14px] [/size][/font][font='calibri'][size=14px] 研究表明，酸性和钙化果胶在药物靶向系统中应用较广。果胶可以应用到结肠靶向给药系统中，它们仅能被结肠菌群所产生的果胶酶降解，这一特性可以很好地保护药物通过胃和小肠，从而在结肠部位释放，发挥药物作用[38]。果胶铋是一-种由果胶与铋生成的复合物，可以用来治疗慢性胃炎，阿莫西林联合果胶治疗慢性萎缩性胃炎可以提高疗效，减少副作用的发生[39]。柑橘果胶是一种水溶性聚合物，具有良好的生物降解性，可用于制造薄膜。该薄膜在食品和药品的涂层、包封和增稠方面具有潜在的应用价值[40][/size][/font][font='calibri'][size=14px]6.3果胶在动物[/size][/font][font='calibri'][size=14px]营养[/size][/font][font='calibri'][size=14px]中的作用[/size][/font][font='calibri'][size=14px]动物的肠道中存在分解和发酵果胶的酶，在果胶分解后，形成挥发性脂肪酸(主要是乙酸)，其在被动物体吸收后可以转化为能量[41]。饲料通常含有非淀粉多糖，其不能被单胃动物降解。果胶是一种非淀粉多糖，直接影响单胃动物对植物性食物的营养利用，是单胃动物的抗营养因子[42]。但添加果胶可降低猪(单胃动物)从消化道向淋巴吸收胆固醇和甘油三酯的速度。这表明果胶可以结合食物中的胆固醇和脂肪在消化道中，通过这种方式，可以减少进入淋巴的胆固醇量[43]。与单胃动物相比，果胶对反刍动物瘤胃环境的稳定性具有调节作用。果胶可以在瘤胃中快速分解，形成半乳糖醛酸，抑制酸性乳酸菌的发酵，使瘤胃液的pH值升高[44]。[/size][/font][font='calibri'][size=14px]6.4其他应用[/size][/font][font='calibri'][size=14px] [/size][/font][font='calibri'][size=14px] 果胶可提高土壤中养分的含量，提高养分利用率，增加土壤中有效态的重金属含量，减少重金属从植物根部到，上部的转运，促进植物生长[45]。根据果胶的结构特征，在甘蔗汁的絮凝和沉淀过程中添加少量混合果汁(果胶含[/size][/font][font='calibri'][size=14px]量[/size][/font][font='calibri'][size=14px]0.10% ~0.13%)會代替聚丙烯酰胺，沉淀和过滤的速度显著加快，随着混合汁量的增加，澄清果汁的纯度增加，表明混合果计中的果胶有絮凝作用[/size][/font][font='calibri'][size=14px][[/size][/font][font='calibri'][size=14px]45],试验发现，通过水解天然柑橘果胶获得的低分子量柑橘果胶可以在胃肠道中形成保护膜并渗透到血液中以促进酒精峰解[/size][/font][font='calibri'][size=14px][[/size][/font][font='calibri'][size=14px]47].果胶可用于制作食品的可食性包装膜，该薄膜可被生物降解，且易于回收利用[/size][/font][font='calibri'][size=14px][[/size][/font][font='calibri'][size=14px]48]采用胶凝技术，在海藻酸钠中入罗望子果胶，合成食用水球，其对DPPH的清除率为40%，超过维C对DPPH的清除率[49][/size][/font][font='calibri'][size=14px]。[/size][/font][font='times new roman'][size=21px][color=#000000]参考文献[/color][/size][/font][1] [font='宋体']果胶研究与应用进展．百度学术[/font] [[font='宋体']引用日期[/font]2019-10-14][2] [font='宋体']李凤林、黄聪亮、余蕾．食品添加剂．化学工业出版社，[/font]2008[3] [font='宋体']魏亚冉[/font].[font='宋体']果胶多糖的提取、分离与应用研究进展[/font][J].[font='宋体']中国食品添加剂，[/font]82.[4]William G T W,Knox J P,Mikkelsenc J D.Pectin:new insinghts into an old polymer are starting to gel[J].Trends Food Sci Technol,2006,17:97-104.[5][font='宋体']田三德，任红涛[/font].[font='宋体']果胶生产技术工艺现状及发展前景[/font][J].[font='宋体']食品科技，[/font]2003[font='宋体']（[/font]1[font='宋体']）：[/font]53-55[6]Hayashi Y,Hoshino T.Use of pectin for fruit containing processed food products[J].Foods Food ingredients J Jpn,2003,11:903-913[ 7 ] Gholamreza Mesbahia. A comparative study on functional properties of beet and citrus pectins in food systems[J]. Food Hydro-colloids 2005 19 :731- 738.[8][font='宋体']卢文清[/font].[font='宋体']果胶的制备及应用[/font][J].[font='宋体']安徽化工[/font],1988(4) 38-41.[9 ] Iglesias M T. Extraction and characterization of sunflower pectin[J]. Journal of Food Engineering 2004 ,62 :215- 223.[10]Rombouts F M. Feruloyated pectin substances from sugar beetpulp[J]. Carbohydrate Research ,1986 ,154 :177- 188.[11 ]Pagan J Ibarz A. Extraction and rheological properties of pectin from fresh peach pomace [J].Journal of Food Engineering,1999,2:193-201[12] [font='宋体']李玲[/font],[font='宋体']王如福[/font].[font='宋体']果蔬减压贮藏研究进展小山西农业科学[/font],2007,35(3) :72- 75.[13] [font='宋体']程杰山[/font],[font='宋体']沈火林[/font].[font='宋体']辣椒果实成熟过程中硬度及相关生理生化指标的变化[/font][D][font='宋体']华北农学报[/font], 2006,21 ([font='宋体']向[/font]:75- 78.[14]Barrett D M Gonzalez C. Activity of softening enzymes duringcherry maturation[J]. J Food Sci, 1994, 59:574- 577.[15]Bartley I M, Knee M, Casimir M A. Fruit softening I.Changesin cell wall composition and endo- polygalacturonase in ripen-ing pears[J]. J Exp Bot, 1982, 33:1248- 1255.[16]Awad M, Young R E. Avocado pectinmethylesterase activity inrelation to temperature[font='宋体']，[/font]ethylene and ripening [J]. J Am SocHortsci, 1980, 105:638- 641.[17] Abu- Sarra A F , Abu- Goukh A A. Changes in pectinesterase,poly galacturonase and cellulase activity during mango fruitripening[J].J Hort Sci, 1992, 67:561- 568.[18]Anurag Payasi. Pectate lyase activity during ripening of ba-nana fruit[J]. Phytochemitry, 2003, 1 :243- 248.[19][font='宋体']张鸿发[/font], [font='宋体']励建荣[/font],[font='宋体']周勤[/font], [font='宋体']等从柑橘皮中提取果胶的工艺研究[/font][J].[font='宋体']食品科技[/font], 2000 (6 :67- 69.[20][font='宋体']徐金[/font] [font='宋体']瑞苹果渣中果胶的提取及纯化技术研究[/font][D] [font='宋体']杨凌[/font]:[font='宋体']西北农林科技大学[/font], 2003.[21] [font='宋体']陈雪峰[/font], [font='宋体']詹雪英[/font], [font='宋体']杨大庆[/font].[font='宋体']苹果渣中提取果胶工艺研究[/font][[font='宋体']凹[/font]].[font='宋体']食品工业科技[/font], 2000(3) :19-21.[22][font='宋体']张燕[/font],[font='宋体']毛桂枝[/font],[font='宋体']刘蕴哲[/font].[font='宋体']离子交换树脂法提取桔皮中果胶[/font][[font='宋体']小食品研究与开发[/font], 2003 (8) :52- 54.[23][font='宋体']陈改荣[/font] [font='宋体']胡萝卜果胶最佳萃取工艺条件的研究即[/font].[font='宋体']河南化工[/font],1996(8 :18- 20.[24] [font='宋体']孔臻[/font],[font='宋体']刘钟栋[/font],[font='宋体']陈肇锬[/font].[font='宋体']微波法从苹果渣中提取果胶的[/font].[font='宋体']研究[/font][].[font='宋体']郑州粮食学院学报[/font], 2000,21 ([font='宋体']向[/font]:11-15.[25] [font='宋体']龚[/font]. [font='宋体']冉[/font],[font='宋体']杨海燕[/font],[font='宋体']贺昱[/font],[font='宋体']等[/font].[font='宋体']微波法萃取甜菜废粕中果胶的研究[/font][0.[font='宋体']新疆农业大学学报[/font], 2004 , 27 () :77- 80.[26][font='宋体']侯春友[/font] [font='宋体']微波条件下提取果胶的研究[/font][].[font='宋体']郑州粮食学院学报[/font],1999,20(2) :8-11[27][font='宋体']郑志花[/font],[font='宋体']曹瑞林[/font],[font='宋体']李永祥[/font].[font='宋体']用微波加热技术从向日葵盘中提取果胶[/font][D].[font='宋体']华北工学院学报[/font], 2003, 24 (4) :300- 302.[28][font='宋体']肖凯军[/font],[font='宋体']陈健[/font],[font='宋体']李巧玲[/font],[font='宋体']等高频电磁场强化浸取果[/font] [font='宋体']胶的研究[/font][J].[font='宋体']食品科学[/font], 2001,22(3) :50-53.[29][font='宋体']林曼斌[/font],[font='宋体']黄传香[/font].[font='宋体']超声波、盐析法提取仙人掌果胶的研究[/font][J.[font='宋体']广州食品工业科技[/font], 2003, 19(4 :50- 54. [ 7 ] Gholamreza Mesbahia. A comparative study on functional prop-erties of beet and citrus pectins in food systems[J]. Food Hydro-colloids 2005 19 :731- 738.[30][font='宋体']陶民强[/font].[font='宋体']果胶和[/font]CMC[font='宋体']对面包品质改良效果[/font][J].[font='宋体']食品工业，[/font]2001[font='宋体']，[/font]22[font='宋体']（[/font]6[font='宋体']）：[/font]30-31.[31][font='宋体']郝利平[/font].[font='宋体']食品添加剂[/font][M].[font='宋体']北京：中国农大出版社，[/font]2002[font='宋体']：[/font]241-247[32][font='宋体']夏红，曹卫华[/font].[font='宋体']蛋糕生产中添加果胶的作用研究[/font][J].[font='宋体']食品科技，[/font]2004(9):20-21[34][font='宋体']魏姜勉[/font].[font='宋体']果胶提取工艺优化及其对冷冻面包品质的影响[/font][J].[font='宋体']平顶山学院学报，[/font]2017[font='宋体']，[/font]32[font='宋体']（[/font]5[font='宋体']）：[/font]58-61[35][font='宋体']涂图云，王正武，王仲妮[/font].[font='宋体']果胶的制备与应用[/font][J].[font='宋体']食品与药品，[/font]2007(6)[font='宋体']：[/font]50-55.[36][font='宋体']张睿[/font].[font='宋体']甜菜果胶的提取方法及其应用[/font][J].[font='宋体']中国甜菜糖业，[/font]2015[font='宋体']（[/font]2[font='宋体']）：[/font]8-11.[37]Renard C M.G C.,Marie-Jeanne Creˊpeau,Thibault J F.Structure of the repeating units in the rhamnogalacturonic backbone of apple,beet and citrus pectins[J].Carbohydrate Research,1995(1):155-165.[38][font='宋体']赵春艳。果胶在食品中的应用及其生产工艺分析[/font][J].[font='宋体']现代食品，[/font]2016[font='宋体']（[/font]1[font='宋体']）：[/font]71-73.[39] [font='宋体']菅晓娟，张文博，牛津梁，等[/font].[font='宋体']果胶在结肠靶向给药系统中的应用[/font][J].[font='宋体']中国生化药物杂志，[/font]2006,27(3):188- -191.[40][font='宋体']黄慧民[/font].[font='宋体']阿莫西林联合果胶铋治疗慢性萎缩性胃炎的临床效果分析[/font][J] .[font='宋体']中国当代医药，[/font]2014[font='宋体']，[/font] 21 (12): 89-90.[41][font='宋体']胡艳，张文林，周志钦[/font].[font='宋体']柑橘果胶的生物学功能及其在生物医学中的应用[/font][J] .[font='宋体']果树学报，[/font]2016, 33 (12) :[42][font='宋体']郭艳丽，李发弟，郝正里[/font].[font='宋体']果胶在动物营养中的研究进展[/font][J].[font='宋体']中国畜牧兽医，[/font]2006, 33 (1): 10-12.[43][font='宋体']汇编[/font]. [font='宋体']木聚糖酶在饲料行业上的应用[/font][J] .[font='宋体']中国饲料添加剂，[/font]2005 (9): 51-52.[44] Bartnikowska EZabielski R. Dynamics of absorption ofdietary cholesterol from the alimentary tract as influencedby pectin in pigs [J] . Jourmal of Animal Physiology andAnimal Nutrition[font='宋体']，[/font]1990 (1-5): 174- -179.[45][font='宋体']刘源，崔二苹，李中阳，等[/font].[font='宋体']生物质炭和果胶对再生水灌溉下玉米生长及养分、重金属迁移的影响[/font][J] .[font='宋体']水土保持学报，[/font]2017, 31 (6): 245-251, 274.[46][font='宋体']陆海勤，唐玉玲，黄悦刚[/font].[font='宋体']混合汁中果胶的絮凝作用初探[/font][J].[font='宋体']轻工科技，[/font]1999 (4): 18-21.[47][font='宋体']浙江果源康品生物科技有限公司[/font].[font='宋体']小分子柑橘果胶的解酒功能[/font][J] .[font='宋体']食品安全导刊，[/font]2016 (12): 59- -61.[48] [font='宋体']张宇，刘晓飞，王鑫，等[/font].[font='宋体']超声波辅助盐析法提取橘子皮果胶的工艺研究[/font][J] .[font='宋体']农产品加工，[/font]2016 (3): 32-34[font='宋体']，[/font]37.[49] Paula Judith Perez Espitia[font='宋体']，[/font] Du Wen -Xian[font='宋体']，[/font]Roberto deJesus Avena -Bustillos[font='宋体']，[/font]et al. Edible films from pectin:Physical -mechanical and antimicrobial properties: A re- -view [J] . Food Hydrocolloids, 2014 (3): 287-296.[align=center][/align]

[align=center]几种酶的酶活力检测方法及结果分析[/align][align=center]西安国联质量检测技术股份有限公司[/align][align=center]安评中心：王涛[/align]大蒜属百合科葱属植物蒜的鳞茎，其风味独特，营养丰富，用途十分广泛。在生产上，大蒜不能通过杂交制种，只能采用其鳞茎繁殖，由于长时间的营养繁殖造成植株体内病毒积累，使得蒜头变小，品种退化，产量降低，大大降低了大蒜的商品价值。大蒜在长期的生长过程中，由于受到病原菌的植物的附着与侵入，会产生自身的抗性机制，其中的保护性反应是复杂的新陈代谢的结果，其生理反应是通过酶催化活动来实现的。这些酶包括抗病性酶超氧岐化酶SOD，多酚氧化酶PPO和过氧化物酶POD等，以及感病性酶纤维素酶和果胶酶。本文主要描述了大蒜苗中的SOD，PPO，POD，纤维素酶和果胶酶的酶活力检测方法，并从酶活的角度分析，大蒜茎尖脱毒技术可以有效提高SOD，PPO，POD等与植物抗病性有关的酶的活性，而与植物感病性有关的酶的活性如纤维素酶和果胶酶的活性有所降低，其中脱毒苗中的SOD，PPO和POD的活性分别比未脱毒苗相应地高出93.37 U/g，19.48 U/gmin和382.55 U/gmin，纤维素酶和果胶酶的活性则分别低出18.29 U/gmin和38.08 U/gmin。这就从植物生理的角度上验证了脱毒大蒜苗抗病和高产的原因。[b]1实验药品及仪器1.1缓冲液的配置[/b]1.1.1磷酸缓冲液的配置首先分别配置母液A、B，再根据质量分数分别取对应的母液，调pH即可。母液A：0.2 mol/L Na[sub]2[/sub]HPO[sub]4[/sub]溶液：称量71.63 g Na[sub]2[/sub]HPO[sub]4[/sub]12H[sub]2[/sub]O，定容至1 L。母液B：0.2 mol/L NaH[sub]2[/sub]PO[sub]4[/sub]溶液：称量31.21 g NaH[sub]2[/sub]PO[sub]4[/sub]2H[sub]2[/sub]O，定容至1 L。0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH7.8，内含1%PVP)：22.875 mL A +2.125 mL l B+1 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，稀释至100 mL。0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)：3.075 mL A + 21.925 mL B，稀释至100 mL。0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)：12.3 mL A + 87.7 mL B，稀释至200 mL。1.1.2醋酸缓冲液的配置同磷酸缓冲液一样，先配置母液。母液A：0.2 mol/L HAc溶液：吸取11.5 mL 醋酸溶液，定容至1 L。母液B：0.2 mol/L NaAc溶液：称量27.2 g 三水合乙酸钠，定容至1 L。0.2 mol/L (pH4.6) 醋酸缓冲液：51 mL A + 49 mL B混合均匀即可。0.2 mol/L（pH4.8）醋酸缓冲液：40 mL A + 60 mL B混合均匀即可。1.1.3其他试剂的配置100 umol/L EDTA-Na[sub]2[/sub]溶液：称取0.03721 g EDTA-Na[sub]2[/sub]，用磷酸缓冲液定容至1 L。20 umol/L核黄素：称取0.00753 g核黄素定容至1 L。130 mmol/L甲硫氨酸（Met）：称取1.9399 gMet，用磷酸缓冲液定容至100mL。750 umol/L氮蓝四唑（NBT）：称取0.06133 g NBT，用磷酸缓冲液定容至100 mL。0.1 mol/L邻苯二酚：称取1.1011 g邻苯二酚定容至100 mL。20%三氯乙酸（TCA）：称取20 g TCA定容至100 mL。二氧甲基酚即愈创木酚30%H[sub]2[/sub]O[sub]2 [/sub]3,5-二硝基水杨酸显色剂（DNS显色剂）：称取2.5 g DNS溶于水中，加入2.5 g氢氧化钠、50 g酒石酸钾钠和100 mL水，加热溶解后再加入0.5 g苯酚和0.125 g无水亚硫酸钠，待全部溶解后冷却，定容至500 mL，贮于棕色瓶中，放置一周后使用，用之前过滤[sup][/sup]。葡萄糖标准液：称取0.54 g葡萄糖定容至500 mL。纤维素底物（CMC）：称取0.625 g羧甲基纤维素钠溶于0.2 mol/L (pH 4.6) 醋酸缓冲液中，定容至100 mL。果胶底物：称取0.5 g果胶溶于0.2 mol/L (pH 4.8) 醋酸缓冲液中，定容至100 mL，放置冰箱内冷藏。D-半乳糖醛酸标准液：称取0.1 g D-半乳糖醛酸溶于0.2 mol/L (pH 4.8) 醋酸缓冲液中，定容至100 mL。[b]1.2主要实验仪器[/b]紫外分光光度计 上海精密科学仪器有限公司可见光分光光度计 上海第三分析仪器厂TCL-16C型台式离心机 上海安亭科学仪器厂超净工作台 上海博迅实业有限公司医疗设备厂电热恒温水浴锅 上海跃进医疗器材厂灭菌器 上海申安医疗器械厂海尔冰箱 青岛海尔集团电子分析天平 北京赛多莉斯天平有限公司数显pH计；恒温光照培养箱；制冰机；计时器；[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液枪[/color][/url][/color][/url]；试剂瓶；容量瓶。[b]2实验方法2.1材料[/b]大蒜脱毒试管苗：采用大蒜茎尖组织脱毒技术，经过3次继代培养所获得的生长健壮脱毒苗。大蒜苗植株：将市售山东金乡大蒜，分瓣去皮后，栽种于花盆中，日光照射，生长两个月之后所得植株。[b]2.2方法[/b]共测两组植株（第一组为大蒜脱毒苗，第二组为大蒜苗植株即未脱毒苗）的五种酶的酶活，这五种酶分别是超氧化物歧化酶、多酚氧化酶、过氧化物酶、纤维素酶和果胶酶，最后将两组酶活数据分别做对应比较。同一植株做三次平行实验，取平均值。[b]3酶活测定3.1超氧物歧化酶（SOD）活力的测定[/b]本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性的大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，这种自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙。后者在560 nm处有最大吸收，而SOD可清除超氧阴离子自由基，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。3.1.1粗酶液的提取取叶片于预冷的研钵中，加入1 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.8,内含1%PVP)在冰浴下研磨匀浆，匀浆液装入2 mL离心管中，在4000 r/min下离心10 min，取上清液，冷藏待用。3.1.2显色反应取7只5 mL透明度好的试管，用记号笔编号，1为空白管，2~4为测定管，5~7为对照管。各管按照表3-1依次添加试剂溶液，混匀后，将空白管置于暗处，其它各管置于4000 lx日光灯下反应20 min。[align=center]表1 测定SOD活性试剂添加量[/align][align=center]Table 1 The add content of reagent to SOD[/align][table][tr][td][align=center]试剂[/align][/td][td][align=center]用量/ mL[/align][/td][td][align=center]备注[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]0.05 mol/L磷酸缓冲液[/align][/td][td][align=center]1.5[/align][/td][td][align=center] [/align][/td][/tr][tr][td][align=center]130 mmol/L Met[/align][/td][td][align=center]0.3[/align][/td][td][align=center] [/align][/td][/tr][tr][td][align=center]750 umol/L NBT[/align][/td][td][align=center]0.3[/align][/td][td=1,2][align=center]总体积为3.0 ml，对照管与空白管加入缓冲液代替酶液[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]100 umol/L EDTA-Na[sub]2[/sub][/align][/td][td][align=center]0.3[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]20 umol/L 核黄素[/align][/td][td][align=center]0.3[/align][/td][td][align=center] [/align][/td][/tr][tr][td][align=center]酶液[/align][/td][td][align=center]0.05[/align][/td][td][align=center] [/align][/td][/tr][tr][td][align=center]蒸馏水[/align][/td][td][align=center]0.25[/align][/td][td][align=center] [/align][/td][/tr][/table]3.1.3活力测定与计算以暗处管为空白，分别测定其它各管在560 nm波长下的吸光度（OD）。以抑制NBT光化还原的50%作为一个酶活性单位（U）表示。按下式计算SOD的总活性：SOD总活性（U/g）=（A[sub]o[/sub]-A[sub]s[/sub]）*V[sub]t[/sub]/ A[sub]o[/sub]*0.5*W*V[sub]1 [/sub]（公式3-1）式中：SOD总活性以每克鲜质量的酶单位表示（U/g）；A[sub]o[/sub]-照光对照管的吸光度；A[sub]s[/sub]-样品管的吸光度；V[sub]t[/sub]-样品液总体积（mL）；V[sub]1[/sub]-测定时样品液用量（mL）；W-样品鲜质量（g）。[b]3.2多酚氧化酶（PPO）活力的测定[/b]多酚氧化酶是一种含铜的氧化酶，能使一元酚和二元酚氧化生成醌，其活性可以用比色法测量产物的形成，邻苯二酚是其常用的底物。3.2.1粗酶液的提取取叶片于预冷的研钵中，加入2 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH 6.0)，在冰浴下研磨匀浆，匀浆液装入2 mL离心管中，在4000 r/min下离心15 min，取上清液，冷藏待用。3.2.2活力测定与计算取2支试管，一支为空白对照管，对照管中加入1 mL酶液+3 mL 0.05 mol/L(pH 6.0)磷酸缓冲液；另一支为测定管，测定管中加入1 mL酶液+1 mL 0.1 mol/L邻苯二酚+2 mL 0.05 mol/L(pH 6.0)磷酸缓冲液。然后在37 ℃水浴保温10 min，立即冰浴，冷却下来之后，各管加入2 mL 20% TCA终止反应。立即在410 nm波长下测定吸光度，每min测一次，共测3 min。以每min内吸光度变化0.01为酶活性单位（U）。PPO活性（U/gmin）=ΔA*V[sub]0[/sub]/0.01W*V[sub]1[/sub]*t [sub] [/sub]（公式3-2）式中：ΔA = A[sub]s[/sub]-A[sub]o[/sub]；A[sub]o[/sub]-对照管的吸光度；A[sub]s[/sub]-测定管的吸光度；V[sub]0[/sub]-酶液提取总量（mL）；V[sub]1[/sub]-测定时酶液用量（mL）；W-样品鲜重（g）；t-反应时间（min）。[b]3.3过氧化物酶（POD）活力的测定[/b]选用愈创木酚法，即在过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测量生成物的含量。3.3.1反应混合液的制备量取50 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH6.0），加入28 uL二氧甲基酚，加热搅拌至溶解，冷却后再加入19 uL 30% H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]，混合均匀保存于冰箱中。3.3.2粗酶液的提取取叶片于预冷的研钵中，加入5 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 6.0)，在冰浴下研磨匀浆，匀浆液装入2 mL离心管中，在4000 r/min下离心15 min，取上清液，冷藏待用。3.3.3活力测定与计算取2只比色杯，一只加入2 mL反应混合液和1 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 6.0)，作为校零对照；另一只加入2 mL反应混合液和1 mL酶液，立即开启秒表计时器，在470 nm波长下测定吸光度，每隔1 min读数一次。以每min吸光度变化0.01为1个过氧化物酶活性单位（U）。POD活性=△A*Vt /0.01W* V[sub]1[/sub]*t （公式3-3）式中：△A-反应时间内吸光度的变化量；V[sub]t[/sub]-酶液总体积（mL）；V[sub]1[/sub]-测定时酶液用量（mL）；W-样品鲜重（g）；t-反应时间（min）。[b]3.4纤维素酶活力的测定[/b]选用DNS法测定纤维素酶活力。DNS法测定的是纤维素酶对羧甲基纤维素钠（CMC）的糖化能力，其水解产物如纤维二糖和葡萄糖是还原糖，可以将DNS还原成棕红色的氨基化合物，在一定浓度范围内，还原糖的量与该物质溶液颜色的深浅成比例，因此可以用分光光度计进行测定，该方法可表示纤维素酶的总活力。3.4.1绘制葡萄糖标准曲线取5支试管，用记号笔编号后，按表3-2量取试剂，每管分别加入1 mL 2 mol/L氢氧化钠和2 mL DNS显色液，摇匀后置于沸水浴中加热5 min，流水冷却，用蒸馏水定容至10 mL，静置20 min后以1号管为对照于490 nm波长处测吸光度，绘制标准曲线。[align=center]表2葡萄糖标准曲线制作表[/align][align=center]Table 2 Standard curve of Glucose[/align][table][tr][td][align=center]试管号[/align][/td][td]标准葡萄糖溶液（mL）[/td][td]0.2 mol.L[sup]-1[/sup]，pH4.6醋酸钠缓冲溶液（mL）[/td][td][align=center]试管中葡萄糖量（umol）[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]1[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][td][align=center]5.0[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]2[/align][/td][td][align=center]0.4[/align][/td][td][align=center]4.6[/align][/td][td][align=center]2.4[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]3[/align][/td][td][align=center]0.6[/align][/td][td][align=center]4.4[/align][/td][td][align=center]3.6[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]4[/align][/td][td][align=center]0.8[/align][/td][td][align=center]4.2[/align][/td][td][align=center]4.8[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]5[/align][/td][td][align=center]1.0[/align][/td][td][align=center]4.0[/align][/td][td][align=center]6.0[/align][/td][/tr][/table]3.4.2粗酶液的提取取叶片于预冷的研钵中，加入2 mL 0.2 mol/L醋酸缓冲液(pH 4.6)，在冰浴下研磨匀浆，匀浆液装入2 mL离心管中，在4000 r/min下离心15 min，取上清液，装入离心管中再离心10 min，定容至10 mL，冷藏待用。3.4.3活力测定与计算取3支试管，一支作为空白对照，另2支作为平行样品。样品管中加入50℃预热的酶液1 mL，底物溶液（CMC）4 mL；空白对照管加4 mL底物溶液（CMC）。3支试管放入50℃水浴中，5 min后取出，立即加入1 mL 2mol/L NaOH溶液和2 mL DNS显色剂。摇匀后，空白对照管中加入1 mL酶液，立即将3支试管放入沸水浴中，反应5 min后取出，流水冷却，定容至10 mL，在490 nm波长处测吸光度。用测得的OD值在标准曲线上差得相应的葡萄糖的量，代入下面公式计算活力。以每min催化纤维素水解成1 umol葡萄糖的酶量表示酶活大小（U）。纤维素酶活性（U/gmin）=葡萄糖量/5*E* W （公式3-4）式中：5为反应时间（min）；Ew为1 mL酶液中含有的酶量（g）；W-样品鲜重（g）。[b]3.5果胶酶活力的测定[/b]选用DNS法测定果胶酶活力。该方法是利用果胶酶在一定温度，时间和条件下水解果胶，释放出还原性D-半乳糖醛酸，与3,5-二硝基水杨酸共热产生棕红色的氨基化合物，即发生显色反应。在一定范围内，水解生成D-半乳糖醛酸的量与吸光度成正比，与果胶酶活力成正比，通过分光光度计测定吸光度，可以计算出果胶酶的活力。3.5.1绘制D-半乳糖醛酸标准曲线取6支试管，编号后依次按照表3-3加入试剂，摇匀后置于沸水浴中反应5 min后，冷却，用蒸馏水定容至10 mL，静置20 min后以1号管为对照于540 nm波长处测吸光度，绘制标准曲线。[align=center]表3[b] [/b]D-半乳糖醛酸标准曲线的绘制[/align][align=center]Table 3 Standard curve of D-Galacturonic acid[/align][table][tr][td][align=center]试管号[/align][/td][td]D-半乳糖醛酸标准液（mL）[/td][td]0.2 mol.L[sup]-1[/sup]，pH4.8醋酸缓冲液（mL）[/td][td][align=center]DNS显色液（mL）[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]1[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][td][align=center]4.0[/align][/td][td][align=center]2.5[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]2[/align][/td][td][align=center]0.2[/align][/td][td][align=center]3.8[/align][/td][td][align=center]2.5[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]3[/align][/td][td][align=center]0.4[/align][/td][td][align=center]3.6[/align][/td][td][align=center]2.5[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]4[/align][/td][td][align=center]0.6[/align][/td][td][align=center]3.4[/align][/td][td][align=center]2.5[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]5[/align][/td][td][align=center]0.8[/align][/td][td][align=center]3.2[/align][/td][td][align=center]2.5[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]6[/align][/td][td][align=center]1.0[/align][/td][td][align=center]3.0[/align][/td][td][align=center]2.5[/align][/td][/tr][/table]3.5.2粗酶液的提取与提取纤维素酶的方法相同。3.5.3活力测定与计算取5支试管，用记号笔编号。1、2号管为样品管，分别加入1 mL果胶底物，在48℃水浴中预热5 min，再分别加入4 mL 0.2 mol/L醋酸缓冲液(pH 4.8)，之后，1号管中加入1 mL酶液，立即摇匀，在48℃水浴中反应30 min；2号管中加入1 mL酶液，立即放入沸水浴中反应5 min，冷却。分别取1、2管中容液各2 mL于3、4管中，并加2 mL水，2.5 mL DNS显色剂，混匀，沸水浴反应5 min，流水冷却。5号管加入4 mL 0.2 mol/L醋酸缓冲液(pH 4.8)，2.5 mL DNS显色剂，静置20 min后以5号管为对照校零，在540 nm波长处测3、4管的吸光度；用测得的（OD[sub]3[/sub]-OD[sub]4[/sub]）值在标准曲线上查得相应的D-半乳糖醛酸的量，代入下面公式计算活力。以每min酶作用生成的D-半乳糖醛酸的量为一个酶活单位（U）。果胶酶活性（U/ gmin）=Y*3*N/t* W [sub] [/sub]（公式3-5）式中：Y-酶作用生成的D-半乳糖醛酸的量；3-测酶活取了反应液的1/3；N-样品稀释倍数；W-样品鲜重（g）；t-反应时间（min）[b]4标准曲线的绘制4.1葡萄糖标准曲线[/b]依照3.4.1步骤，最后测得各个试管中的吸光度依次为0，0.432，0.672，0.865，1.073。按照表4，以葡萄糖浓度为横坐标，490 nm处的OD值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线（如图1）。[align=center]表4葡萄糖标准曲线[/align][align=center]Table 4 Standard curve of Glucose[/align][table][tr][td][align=center]试管号[/align][/td][td][align=center]1[/align][/td][td][align=center]2[/align][/td][td][align=center]3[/align][/td][td][align=center]4[/align][/td][td][align=center]5[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]葡萄糖浓度umol[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][td][align=center]2.4[/align][/td][td][align=center]3.6[/align][/td][td][align=center]4.8[/align][/td][td][align=center]6[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]490 nm OD[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][td][align=center]0.432[/align][/td][td][align=center]0.672[/align][/td][td][align=center]0.865[/align][/td][td][align=center]1.073[/align][/td][/tr][/table][align=center][img=,580,219]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807010439441511_1108_2904018_3.png!w580x219.jpg[/img] [/align][align=center]图1葡萄糖标准曲线[/align][align=center]Figure 1 Standard curve of Glucose[/align][b]4.2 D-半乳糖醛酸标准曲线[/b]依照3.5.1步骤，最后测得各个试管中的吸光度依次为0，0.211，0.384，0.561，0.743，0.965。按照表5，以D-半乳糖醛酸的量为横坐标，540 nm处的OD值为纵坐标，绘制D-半乳糖醛酸标准曲线（如图2）。[align=center]表5 D-半乳糖醛酸标准曲线[/align][align=center]Table 5 Standard curve of D-Galacturonic acid[/align][table][tr][td][align=center]试管号[/align][/td][td][align=center]1[/align][/td][td][align=center]2[/align][/td][td][align=center]3[/align][/td][td][align=center]4[/align][/td][td][align=center]5[/align][/td][td][align=center]6[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]D-半乳糖醛酸的量mL[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][td][align=center]0.2[/align][/td][td][align=center]0.4[/align][/td][td][align=center]0.6[/align][/td][td][align=center]0.8[/align][/td][td][align=center]1.0[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]540 nm OD[/align][/td][td][align=center]0[/align][/td][td][align=center]0.211[/align][/td][td][align=center]0.384[/align][/td][td][align=center]0.561[/align][/td][td][align=center]0.743[/align][/td][td][align=center]0.965[/align][/td][/tr][/table][align=center][img=,579,188]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807010440011153_826_2904018_3.png!w579x188.jpg[/img] [/align][align=center]图2 D-半乳糖醛酸标准曲线[/align][align=center]Figure 2 Standard curve of D-Galacturonic acid[/align][b]5结果与分析[/b]将所测得的OD值，根据各个公式计算出SOD，PPO，POD，纤维素酶和果胶酶的酶活力，结果如表6所示。再将大蒜脱毒试管苗与未脱毒苗酶活测定结果做成柱状图进行比较，如图3所示。可以看出，脱毒试管苗中的SOD，PPO，POD的活性均高于未脱毒试管苗的对应酶的活性，而这三种酶都与植物的抗病性有关，说明在抗病性上脱毒试管苗强于未脱毒试管苗；纤维素酶和果胶酶的活性则是未脱毒苗比脱毒试管苗高。此外，作为植物抗氧化系统第一道防线的SOD，其活性大小在脱毒试管苗与未脱毒苗中相差93.37 U/g，前者比后者高出约1.5倍，说明经脱毒的试管苗抵御活性氧侵害的能力更高。PPO能催化木质素及其他酚类氧化物的形成，从而构成保护性屏蔽，抵抗抗病菌的入侵，也可以通过形成醌类物质直接发挥抗病作用。脱毒试管苗的PPO活性比未脱毒苗的PPO活性高出19.48 U/gmin，约2.45倍。说明脱毒苗在抵抗抗病菌的入侵方面，能力更强。在植物对病原菌侵染的防卫反应中，POD和SOD都有着极其重要的作用，SOD能有效的清除机体内的超氧自由基，它可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢，而POD可以将过氧化氢分解为完全无害的水，在脱毒试管苗与未脱毒苗中POD的活性均比较大，两者相差382.55 U/gmin，约1.7倍，说明经脱毒的试管苗可以更有效的抵御过氧化氢的毒害。而纤维素酶和果胶酶均与植物的感病性有关，其活性则是未脱毒苗比脱毒试管苗高，分别高出18.29 U/gmin和38.08 U/gmin，约2.4倍和1.2倍，说明脱毒苗的感病几率有所降低。POD不仅可以将过氧化氢分解为完全无害的水，而且还具有多种生理功能，如从叶绿体和细胞质中去除过氧化氢、氧化有毒化合物、合成细胞壁、对各种胁迫的应急、吲哚-3-乙酸的调控、乙烯的生物合成等，还参与了植物酚类的聚合和氧化以及木质素和植保素的合成。因此POD是植物体中活性较高的一种酶，从图3中也可以看出，POD的活性在五种酶中最高。[align=center]表6 大蒜脱毒试管苗与未脱毒苗酶活测定结果[/align][align=center]Table 6 Enzyme activity assay results between virus-free garlic in vitro and not virus-free plantlets[/align][table][tr][td][align=center]酶总活性[/align][/td][td][align=center]SOD[/align][align=center](U/g)[/align][/td][td][align=center]PPO[/align][align=center](U/gmin)[/align][/td][td][align=center]POD[/align][align=center](U/gmin)[/align][/td][td][align=center]纤维素酶[/align][align=center](U/gmin)[/align][/td][td][align=center]果胶酶[/align][align=center](U/gmin)[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]脱毒苗[/align][/td][td][align=center]157.46[/align][/td][td][align=center]27.43[/align][/td][td][align=center]610.95[/align][/td][td][align=center]7.77[/align][/td][td][align=center]31.97[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]未脱毒苗[/align][/td][td][align=center]64.09[/align][/td][td][align=center]7.95[/align][/td][td][align=center]228.40[/align][/td][td][align=center]26.06[/align][/td][td][align=center]70.05[/align][/td][/tr][/table][align=center][img=,564,289]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807010440223303_2970_2904018_3.png!w564x289.jpg[/img] [/align][align=center]图3大蒜脱毒试管苗与未脱毒苗酶活测定结果比较[/align][align=center]Table 3 Comparison of enzyme activity assay results between virus-free garlic in vitro and not virus-free plantlets[/align]