芴甲氧羰基谷氨酸

味精颗粒　　杂味的味精　　小王是个挺较真的人。最近他和朋友到一家饭馆吃饭，觉得菜比往常咸了很多。服务员解释说可能是味精放多了。服务员的这番解释让小王感到非常奇怪，菜炒咸了，跟味精有什么关系呢?较真的小王回到家就上网查了起来。　　小王：在网上了解会往里边掺加一些盐、糖或者是淀粉其它一些东西。　　小王在网上查询后了解到，味精，学名“谷氨酸钠”，成品为白色柱状晶体，可以增加食物的鲜度，不应该有咸味。同时，小王还发现，有很多网友爆料说，味精里其实并不全是“谷氨酸钠”。真得是这样吗?为了了解更多，小王又到市场走了一圈，发现了一些他以前不知道的事。　　小王：我到市场以后，通过跟商户交谈，商户就跟我说这味精里边，它的谷氨酸钠的含量都不够，里边它本身就是，往里边掺很多东西。　　“炒菜不用放盐了”　　小王打听到，这些大包装的袋装味精虽然都标注了谷氨酸钠大于等于99%，但是里面却并非都是纯粹的谷氨酸钠，那都加了什么呢?按照小王提供的信息，记者走访了青岛市的两个批发市场。　　在青岛市抚顺路蔬菜副食品批发市场里有数十个批发调味料的摊位，每家都有几种牌子的味精在卖。记者在市场里看到，这里销售的味精有三种，无盐味精、加盐味精和增鲜味精，三种味精当中的谷氨酸钠含量也各不相同。摊主告诉记者，这种2.5公斤装的“无盐味精”，谷氨酸钠含量能达到99%以上，销量最好。　　记者：这种一般你一个月能走多少?(好了能走200袋，不好能走150袋。)　　商户：这一个月我光在这个地方就十几吨吧。　　商户告诉记者，这种2.5公斤装的味精，普通家庭并不常用，主要供应酒店、饭馆等一些餐饮机构。　　商户：这个货就可以呀，一般酒店用都用这种。　　商户：基本都是川菜馆。　　商户：饭店都吃。　　商户：反正就是周边这几个饭店，还有学校，那些大学，大学那一要就一大包。　　记者在市场上发现，虽然都是2.5公斤装的无盐味精，可是价格却不同，从十八九元到二十八九元不等，一袋味精的价格竟然能相差近十元钱，这是为什么呢?　　商户：你去检验去吧，里边全是盐，你不用看，都是一个厂家的，你不信拿着上工商吧，你这两袋都拿着，你去检验去吧，我给你出钱不要紧。　　味精里加盐?这不是无盐味精吗?怎么会加盐呢?怕记者不信，商铺老板还认真地指给记者看，袋子里一粒粒的细碎的小颗粒，老板说那就是盐了。　　商户：看见没有?这都是盐，你看盐的晶体，炒菜不用放盐了呗，这个绝对不用放盐。　　果然，这种售价为22元标称为谷氨酸钠含量99%以上的无盐味精里除了针状的结晶外，还有一些圆形的小颗粒，跟味精的的形状完全不同，尝起来咸咸的。　　这位经营者说，加盐是为了降低生产成本，盐掺得越多，自然厂家赚得也就越多。　　商户：这个五斤味精里边掺上半斤盐，(半斤盐差多少钱?)它那五元多钱一斤一下子成了多少?一下减了三四元，你掺上一斤呢，好味精的话五斤掺上一斤盐没问题的，绝对没问题。　　包装是一回事实际含量是另一回事　　记者走访发现，其实，往无盐味精里掺盐在市场上已经是个公开的秘密了。在青岛市城阳蔬菜调味品交易批发市场，一些经营者告诉记者，因为味精里掺了大量的盐，所以，一些饭馆里的厨师炒菜根本不再放盐，只放味精就行了。而且，很多杂牌味精都是买了别家的纯谷氨酸钠味精自己再勾兑包装后出售的。　　商户：等于就是说这些味精，全是买它家的味精作原料，然后勾兑的，再做成的味精，就它家是原料。　　商户：(一般都加啥呀?)加盐加糖和淀粉，(那不能看出来吗?)你要是亮度不好的话，发黑的话里边就加了，盐它根本就不像味精那么亮，加上盐它没那么亮。　　虽然在外包装上标注的，都是谷氨酸钠含量达99%以上的无盐味精，但商户们心里很清楚，包装上标的是一回事，里面实际含量又是另一回事。关键还要看价格。　　商户：我说要是便宜的你就算呗，肯定是加盐加的就多，越便宜加盐越多，没听懂啊?盐便宜，盐才一元来钱一斤。　　商户：6.5元一斤，盐才几角钱一斤，这不就钱出来了。　　记者在市场上还了解到，由于近一段时间市场加强了管理，工商部门要求产品都要由厂家提供检验合格证书才能销售，所以许多味精厂把过去的产品包装换掉了，本来是标称99%的谷氨酸钠味精，现在都标成了80%。　　发苦的味精　　其实味精掺假，不仅仅局限在加盐上，还有其它的东西!因为味精颗粒有大小之分，而盐和淀粉的颗粒比较细，所以厂家一般会掺到小颗粒的味精里。那么大颗粒的味精里又会掺些什么东西呢?　　记者购买了一些元味苑牌的无盐味精，它标称谷氨酸钠达到99%以上。但记者打开包装后发现，里有一些形状与味精相似的结晶体，个头要比味精的颗粒大些，尝起来有一点苦涩的味道。随后，记者在青岛建航牌的无盐味精中也发现了这种味道发苦的大个晶体。　　小王：有的味精颗粒比较小，里边会掺加一些盐、糖，这都能看出来，还有一些颗粒比较大的，长粒的跟味精很相似的一种味精，但是颜色上不一样，用嘴一尝呢，它略微有种发苦的味道，跟味精的味道是不一样的，所以我就怀疑我说这种是什么东西。　　这个形状跟味精相似，味道却大不一样的晶体到底是什么呢?除了盐、糖以外，味精里还加了其它的东西吗?　　这袋名为元味苑的味精，是由青岛知味居味精有限公司生产的，记者按照包装上的厂址找了过去。但到了村口打听了很久，也没人听说过有家味精厂，几经周折，记者终于在一个深深的胡同当中，发现了一栋有厂房的大院，但院门口却没有挂任何的名牌和标志。村民们告诉记者，这里就是知味居味精厂。　　村民：它家一直就是味精厂。　　这个神秘的知味居味精厂位置并不显眼，也不挂任何厂牌，工作人员也很是神秘，不知道它们生产的东西到底加了什么。　　添加物不止是盐、淀粉、石膏　　记者又来到了一家生产“六合香”味精的厂家，这里的销售人员给记者讲述了一些业内的秘密。　　销售人员：因为假的比较多，以次充好的比较多，非常乱，(味精能假到哪去?)加东西嘛，主要是盐，也有加其它的东西，包括最厉害的是在市场上出现的，加乱七八糟不能吃的东西，包括食品添加剂里边的东西。　　这位销售员对味精里添加的不能吃的东西欲言又止，接着，他又给我们拿出了一盒他们自己从市场上搜集来的其它厂的掺假味精，并告诉我们，这些产品不论标称谷氨酸钠含量是99%，还是80%，基本上都没有达标。　　销售员：(谷氨酸钠百分之八十这个能达到多少?)达到七十四点几吧，百分之七十五吧。　　销售员说，别看只比标准低几个点，利润就是这样省出来的。　　销售员：它的含量低五个点，每低一个点的味精，它加上盐之后，就得省八十元钱一吨，一个点，你说它差这五个点，它说八十的，给你的是七十五的，那五个点就等于说是四百元钱，这个它还是合算的，一样的钱它多赚四百元钱。　　这位销售人员告诉我们，除非他们这些专业人士，不然一般人是看不出来味精里到底有没有掺假。　　销售人员：这个里边道道很多，小商贩它越小，猫腻越多，往里边加了很多东西，(都加什么呀?)不好说，有一些业内的一些东西呀，不太想透露，就是对这个行业不好。　　在记者的一再追问下，销售员打开了电脑，给记者查起了网页。我们看到了盐、淀粉、石膏等这些添加物。　　销售人员：还有厉害的。　　除了盐、淀粉、石膏外，还有更厉害的添加物，到底是什么呢?销售人员给记者打开了一个名为味精状硫酸镁的图片。　　销售人员：这个就是味精状硫酸镁，一模一样啊，所以说你刚才看那个晶体或怎么样，你根本看不出来是吧，(你发现过有人加了吗?)我发现过。　　据这位销售员说，某些小企业，会往味精中添加一种名为味精状硫酸镁的东西。那么，记者和小王在味精中发现的这些针状晶体就是味精状硫酸镁吗?　　打破砂锅问到底，小王把自己买到的这种元味苑味精，拿到了当地的通标标准技术服务有限公司进行了检测。国家标准中，没有关于“硫酸镁“的检验方法。因此，检测单位对硫酸根和镁分别进行了检测，结果是，样品中谷氨酸钠的含量只有69.2%，与标称的99%相差30%，每100克味精中，镁的含量达到了2.3毫克。　　五、六百元的硫酸镁不可能是食品级的　　这些镁是怎么进入味精的呢，记者在网上搜索了一些生产味精状硫酸镁的厂家，它们大都宣称这是味精专用添加剂，记者给其中一些厂打了电话。　　记者：味精状的，(你要要，最便宜495一吨)，有没有味精厂用过你这个东西?(有，有用过的，他们回去还得掺别的东西。)　　记者：你那有硫酸镁吗?(有，550元每吨)，供没供过味精厂?(味精厂，多，差不多味精厂都用这个，有的味精厂大点的，一个月差不多七八十吨。)　　记者共打了近十个厂家的电话，其中有五六家说自己给味精厂提供过硫酸镁，但一位生产食品级硫酸镁的厂家销售员却说，五、六百元的硫酸镁不可能是食品级的，是不能食用的。　　销售员：我觉得500元不可能是食品级的，一到食品级它就不一样了，就比较差的食品级，也得一两千元了，应该就差在，它的卫生各个方面不达标，就是重金属，还有各个细菌，大肠杆菌之类的，还有重金属类的都会超标。　　味精的国家标准中要求，谷氨酸钠味精中，谷氨酸钠的含量要达到99%，那么，记者发现的那两种有杂质的味精是否能达到这个标准呢?它里面到底添加了什么呢?　　记者在批发市场上购买了两个品牌的无盐味精，分别是青岛市知味居有限公司生产的元味苑牌味精，和青岛建航味精有限公司生产的建航牌味精。两袋味精都标称自己的谷氨酸钠含量为99%，记者把这两袋味精送到了北京市理化分析测试中心进行了检测。　　结果显示，元味苑牌味精的谷氨酸钠含量只有70.9%，与99%的要求相差近30%，味精中硫酸盐的含量超出了国家标准，大于0.05%，而且，镁的含量达到了每公斤102毫克。　　建航牌味精的谷氨酸钠含量只有63.8%与标准要求相差35%左右，同样，它的硫酸盐含量也大于0.05%，镁含量甚至达到了每公斤143毫克。

谷氨酸钠作为调味品在人类的饮食生活中是不可或缺的，通常对原料的检测，采用高氯酸非水溶液滴定法，即以a-萘酚苯基甲醇作为指示剂，滴定溶液至绿色为其终点。 此外，也有采用高氯酸指示剂滴定法测定鸡精中谷氨酸钠含量，但对于指示剂的选择使用有严格要求，并且不同的样品有可能会影响指示剂的终点判定。如果采用禾工CT-1Plus全自动电位滴定仪和PH值非水相电极对方便面酱包中的谷氨酸钠含量进行测试，就可以有效地排出了对指示剂的选择使用要求及用指示剂法进行滴定时基本产生的终点判定干扰。 CT-1PLUS多功能全自动滴定仪可以根据滴定过程中电极电位的变化来自动确定终点，对于电位变化不明显的反应，也可自动根据摄像头采集的颜色变化来自动判断滴定终点，大大简化和降低的认为的操作和判断误差，提高的测试的准确性。 利用电位滴定法能快速、准确地测定方便面酱包或其它调料包中的谷氨酸钠含量,对科研开发及方便面生产厂家在线监测具有较强的实际应用价值。

在阿尔茨海默病（AD）进展中，存在beta淀粉样蛋白（β-Amyloid，Aβ）的积累。Aβ在受影响的脑组织区域形成病理性聚集，被认为与AD的发生、进展和表型密切相关。多种翻译后修饰（如磷酸化、硝基化、糖基化等）对Aβ的病理性聚集及体内生物活性具有重要且不同的调控作用。在AD患者脑内，多种病理相关蛋白的糖基化位点、数量和水平都发生了显著性改变，表明了糖基化修饰在AD发生和发展中的重要意义。2011年，科学家对AD病人脑脊液中的Aβ片段进行鉴定，检测到之前未在哺乳动物中发现的酪氨酸O-糖基化修饰，然而由于天然来源的翻译后修饰蛋白丰度低、微观不均一等困难，Aβ糖基化修饰的生物学功能及在疾病中的作用尚未能得以阐释。　　近日，中国科学院上海有机化学研究所生物与化学交叉研究中心刘聪课题组与北京大学药学院董甦伟课题组合作，在J. Am. Chem. Soc.上发表题为O-Glycosylation Induces Amyloid-β to Form New Fibril Polymorphs Vulnerable for Degradation的研究论文，利用化学合成策略构建了一系列含不同O-糖基化修饰的均一结构Aβ，并系统研究了糖基化修饰对Aβ病理性聚集的调控作用及其构效关系。　　该研究中，研究人员首先合成了三种O-糖修饰的酪氨酸砌块，糖基分别是α-GalNAc, Galβ1-3GalNAc和Neuα2,3Galβ1-3GalNAc。然后，通过固相多肽合成策略将上述三种酪氨酸砌块制备相应的Aβ糖肽。然而，Aβ含有较多大位阻氨基酸，且自身疏水性强、容易聚集，再加上糖基的引入，给Aβ糖肽的合成带来了不少困难。为了克服这些合成难题，研究人员利用微波辅助的合成策略以及多赖氨酸亲水标签等方法，以较高效率获得了结构均一、含有不同O-糖修饰的Aβ糖肽。他们进一步对三种Aβ糖肽和不含糖链的Aβ多肽进行性质表征，发现糖基化修饰能够显著抑制Aβ的聚集，并且抑制效果与糖链结构相关。通过对Aβ聚集/解聚动力学的进一步研究，表明糖基修饰可以降低纤维结构的稳定性。在酶解实验中，糖基修饰的Aβ纤维表现出了更差的酶解稳定性。　　为进一步阐述糖基化修饰降低Aβ纤维稳定性的分子机理，研究人员通过冷冻电镜技术（Cryo-EM），获得了Galβ1-3GalNAc糖型Aβ纤维的3.1埃近原子级分辨率结构。糖基修饰的Aβ组装形成了一种全新的淀粉样纤维结构，其纤维核心由6-42位氨基酸残基组成，并且在Tyr10残基侧链附近可以观察到修饰糖基的电子密度。通过与未修饰的Aβ纤维核心结构进行比较，研究发现Tyr10的糖基化会增大其与相邻氨基酸残基的空间位阻，从而导致整个Aβ纤维核心结构的重排。相较而言，糖基化Aβ纤维的结构具有更小的原纤维间交互界面，且仅由两对盐桥（Asp23和相邻原纤维的Lys28）所维持。这为糖基化修饰降低Aβ纤维稳定性提供了分子层面的解释。　　该工作首次发现糖基化修饰在动态调控Aβ病理性聚集方面的重要功能，为后续研究不同糖基修饰对神经退行性疾病病理蛋白聚集的生物活性及病理毒性的调控作用，提供了有利的研究工具及新的研究思路。该工作得到了国家自然科学基金委、北京市自然科学基金委和中科院稳定支持基础研究领域青年团队计划的资助。　　论文链接

可比性研究|使用HR-MAM方法对原研药与其生物类似药进行可比性研究关注我们，更多干货和惊喜好礼可比性研究生物类似药通常指与参考分子（原研药）高度类似的治疗性生物产品1。世界各地的监管机构，如美国食品药品监督管理局(United States Food and Drug Administration, USFDA), 欧洲药品管理局（European Medicines Agency, EMA）和中国市场监督管理总局（National Medical Products Administration, NMPA）均发布了指导规则，要求证实生物类似药与原研药之间在药品安全性/功效性等方面的相似度1。 随着高分辨质谱（HRAM MS）逐步成为创新药和生物类似药表征必不可少的分析工具，在氨基酸序列确认和化学/翻译后修饰等鉴定中，均起到不可或缺的作用2。2015年，Rogers 等2在公开发表的文献中提及可将基于肽图分析的Multi-Attribute Method (MAM) 工作流程用于多重PQA的监控与定量，与此同时还可进行新组分检测（new peak detection）2，进而提供更多产品质量相关信息，并提高生产率。由此，MAM在质量控制（QC）实验室中替代传统分析手段的潜力，引起越来越多生物制药行业和监管机构越来越多的关注2 3。2019年，US FDA的Rogstad等在发表的文献中提及可以考虑使用MAM替代一些常规的QC分析方法4。图1 赛默飞HR-MAM工作流程（点击查看大图）本期我们介绍赛默飞HR-MAM (图 1)工作流程的zui新进展：对未经处理/不同强制降解条件下的生物类似药与利妥昔原研药进行可比性研究，对多个选定PQA进行有效的鉴定、相对定量和监控，以减少分析实验所花费的时间，并提高生产率。 多PQA选定助力原研药与生物类似药结构相似性确证： PQA通常在药物安全性与有效性方面起到重要作用，基于肽图分析表征可以选择适合的PQA，如：糖基化（glycosylation），脱酰胺化（deamidation），琥珀酰亚胺化（succinimide formation），异构化（isomerization），氧化（oxidation），重链C-末端赖氨酸截断（C-terminal lysine truncation），N-末端焦谷氨酸环化（N-terminal pyroglutamate）。 所有被选中的PQA可在BioPharma Finder软件中创建为一个包含该PQA肽段保留时间/质荷比/价态/所有电荷态等信息的工作簿，随后此工作簿被导入至变色龙软件中，用于后续的MAM数据分析。使用HR-MAM工作流程，即使是含量约0.1%的组分，也可通过高分辨质谱平台提供的数据获得高重现性的定性与定量结果。在本文的研究中，选定了下列PQA来证实HR-MAM工作流程用于目标肽段定量的能力，进而评估利妥昔原研药与生物类似药之间的结构相似性：重链 N55 脱酰胺化和琥珀酰亚胺化 重链 N388和N393 脱酰胺化 重链 N388和N394 琥珀酰亚胺化 重链 M256 氧化 重链 D284 异构化 重链N-糖基化 重链C-末端赖氨酸截断和轻/重链N-末端焦谷氨酸环化。 PQA相对定量兼具稳健性与重现性，MAM展现独特潜力： 由于C-末端赖氨酸截断与N-末端焦谷氨酸环化等末端修饰会影响单克隆抗体产品的电荷异质性5，所以在结构可比性研究中需要对其进行评估。以本文中涉及的PQA为例，利妥昔原研药和两个不同批次的生物类似药，其重链C-末端赖氨酸截断与轻/重链N-末端焦谷氨酸环化的比率均在可比范围内（图2）。值得注意的是，所有定量结果三针技术重复的变异系数（coefficients of variation, CVs）均小于2%，显示了优异的重现性。图2. 利妥昔原研药/生物类似药在未经强制降解/强制降解条件下常见末端修饰相对定量结果。图中每个条柱均代表三针技术重复的平均值，误差线代表三针技术重复的标准偏差（下同）。（点击查看大图） N-糖基化可能会影响单克隆抗体产品的免疫原性、药效、抗体依赖的细胞介导细胞毒性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC）、补体依赖的细胞毒性（complement-dependent cytotoxicity, CDC）、血清清除率和药代动力学5。在生物类似药的开发和生产过程中，为了确保产品的安全性和有效性，N-糖基化必须被密切监控并严格控制。对于生物类似药开发厂商而言，生物类似药的糖基化异质性分布必须与其原研药具有可比性，以避免扩大临床试验的规模。 在本方案涉及的实验所用的原研药和生物类似药样品中，总共鉴定到15种不同糖型，这些糖型的相对含量在不同样品之间并没有明显区别（图3）。与传统N-糖链定量方法相比，未发生糖基化修饰的肽段相对含量也可在HR-MAM工作流程中同时被监控，这是传统方法无法做到的，展现了其独到价值。对所有糖型的相对定量结果同样显示了优异的重现性和灵敏度。例如，对于相对含量约0.3%的糖型A2S1G0F ，其技术重复之间的CV5.5%。图3. 利妥昔原研药/生物类似药在未经强制降解条件下重链EEQYNSTYR 15种糖型相对定量结果（三针平行技术重复）。（点击查看大图） 对于其他选定PQA，借助于赛默飞高分辨质谱平台的高灵敏度和高选择性，结合Vanquish UHPLC系统和Accucore Vanquish C18 +色谱柱提供的高重现性分离，均可实现兼具稳健性与重现性兼具的相对定量。 zui新应用方案，码上下载想要深入了解详细实验结果、参数设置、MAM优势，立即下载zui新Application Note相关阅读• 客户案例｜辉瑞在多个实验室同时部署MAM• HR Multi-Attribute Method Workflow 化繁为简,有规可循|为生物制药表征和质量控制保驾护航 参考文献：[1] US Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Scientific Considerations in Demonstrating Biosimilarity to a Reference Product. Guidance for Industry. April 2015. [2] Liu, H., et al. A high-resolution accurate mass multi-attribute method for critical quality attribute monitoring and new peak detection. APPLICATION NOTE 72916. [3] Rogstad, S., et al. Multi-Attribute Method for Quality Control of Therapeutic Proteins. Anal. Chem. 2019, 91, 14170−14177.[4] US Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Scientific Considerations in Demonstrating Biosimilarity to a Reference Product. Guidance for Industry. April 2015. [5] Beck, A., et.al. Characterization of Therapeutic Antibodies and Related Products. Anal. Chem. 2013, 85, 715−736. 如需合作转载本文，请文末留言。扫描下方二维码即可获取赛默飞全行业解决方案，或关注“赛默飞色谱与质谱中国”公众号，了解更多资讯+了解更多的产品及应用资讯，可至赛默飞色谱与质谱展台。https://www.instrument.com.cn/netshow/sh100244/

一、鸡蛋与豆浆同食降低营养价值　　人们经常食用豆浆冲鸡蛋，认为两者都富含蛋白质，食之对身体有益，从科学饮食角度讲，豆浆性味甘平，含植物蛋白、脂肪、碳水化合物、ELISA试剂盒维生素、矿物质等很多营养成分，单独饮用有很好的滋补作用。　　但两者不宜同食。因为生豆浆中含有胰蛋白酶抑制物，它能抑制人体蛋白酶的活性，影响蛋白质在人体内的消化和吸收，鸡蛋的蛋清里含有粘性蛋白，可以同豆浆中的胰蛋白酶结合，使蛋白质的分解受到阻碍，从而降低人体对蛋白质的吸收率。二、吃未熟鸡蛋易引起腹泻　　鸡蛋蛋白含有抗生物素蛋白，会影响食品中生物素的吸收，使身体出现食欲不振、全身无力、肌肉疼痛、皮肤发炎、脱眉等症状。鸡蛋中含有抗胰蛋白酶，影响人体对鸡蛋蛋白质的消化和吸收。未熟的鸡蛋中这两种物质没有被分解，因此影响蛋白质的消化、吸收。鸡蛋在形成过程中会带菌，细菌会穿过蛋壳上的小孔，进入蛋内，而未熟的鸡蛋又不能将细菌杀死，轻则会引起腹泻。因此鸡蛋要经高温煮后再吃，不要吃未熟的鸡蛋。　　生鸡蛋的蛋白质结构致密，有很大部分不能被人体吸收，只有煮熟后的蛋白质才变得松软，人体胃肠道才可消化吸收。生鸡蛋有特殊的腥味，会引起中枢神经抑制，使唾液、胃液和肠液等消化液的分泌减少，从而导致食欲不振、消化不良。三、炒鸡蛋放味精破坏鲜味　　鸡蛋中含有氯化钠和大量的谷氨酸，ELISA试剂盒这两种成分加热后天生谷氨酸钠，有纯正的鲜味。味精的主要成分也是谷氨酸钠，炒鸡蛋时假如放进味精，会影响鸡蛋本身合成谷氨酸钠，不但破坏鸡蛋的鲜味，对菜肴起不到增加鲜味的作用。四、吃煮老的鸡蛋影响吸收　　鸡蛋煮老未必更好，因为一项研究文献表明，鸡蛋煮老后会增加营养素的损失和脂肪的氧化。研究发现，煮老的蛋和炒鸡蛋相比，其维生素E的损失要大16%，而且脂肪氧化程度要高30.4%。研究者还发现，对于富含omega-3脂肪酸的鸡蛋来说，烹调会增加其脂肪氧化程度3-9倍之多。鸡蛋煮得时间过长，蛋黄表面会形成灰绿色硫化亚铁层，很难被人体吸收。蛋白质老化会变硬变韧，鸡蛋会变得很硬，既不好吃，又影响消化吸收。　　煮蛋小贴士:把鸡蛋放冷水中，大火煮开之后，马上转最小火，四五分钟之后把火关掉，用余热把鸡蛋焖熟。这样煮出来的鸡蛋，蛋清柔嫩，蛋黄滋润，吃起来就美味多了。五、鸡蛋与糖同煮导致血液凝固　　因为在长期加热的条件下，鸡蛋中的氨基酸与糖之间会发生化学反应，结果生成一种叫糖基赖氨酸的化合物，破坏了鸡蛋中对人体十分有益的氨基酸成分。所产生的化合物不仅不容易被人体所吸收，还带有毒性，而且这种物质有凝血作用，ELISA试剂盒进进人体后会造成危害。　　如需在煮鸡蛋中加糖，应该等稍凉后放进搅拌，味道不减。

胰岛素样生长因子(IGFs)是一种促有丝分裂的生长因子多肽，能刺激各种细胞，包括肌肉、骨和软骨组织在体外的增殖和存活。虽然多种组织可在不同时间产生IGFs，但是IGFs主要由肝脏产生。IGFs属于胰岛素基因家族，其中还包含胰岛素和松弛素(relaxin)。IGFs与胰岛素的结构和功能相似，但其促生长活性远高于胰岛素。IGF-II的表达受胎盘催乳素的影响，而IGF-I的表达受生长激素的调节。IGF-I和IGF-II都可以通过酪氨酸激酶I型受体（IGF-IR）传递信号，但IGF-II也可以通过IGF-II受体/甘露糖-6磷酸受体传递信号。成熟的IGFs由无活性的前体蛋白(含有N-末端和C-末端前肽区)经蛋白水解而得。重组人IGF-I和IGF-II为球状蛋白质，分别含有70和67个氨基酸，并均含及3个分子内二硫键。IGF-I LR3是人IGF-I的类似物，包含完整的IGF-I序列，但用精氨酸替代IGF-I第三位的谷氨酸，并在N末端加上13个氨基酸的延伸肽。 由于体外设计的高生物活性，IGF-I LR3在体内的半衰期比IGF-I长，而且更易与天然蛋白结合，使其非常适用于研究和大规模的培养。重组人IGF-I LR3是分子量为9.1 kDa，含有83个氨基酸残基的非糖基化单链多肽。可用于科研和大规模培养特异性地工程改造，较胰岛素有更高的促进生长活性半衰期长，更易与天然蛋白结合适合于多种类型细胞，如HEK293、CHO、成纤维细胞等提高重组蛋白产量产品名称 货号 规格 目录价(￥) Human IGF-I LR3 100-11R3-200 200 μg 960 Human IGF-I LR3 100-11R3-1000 1000 μg 2340 阅读原文：http://www.liankebio.com/ProductCenterShow/articleID/2014070013.html

近日，中国科学院大连化学物理研究所生物分离分析新材料与新技术研究组研究员叶明亮团队和上海有机化学研究所生物与化学交叉研究中心研究员刘聪团队合作，将硼酸化学引入到甲基化蛋白质组分析方法中，并巧妙利用精氨酸残基上不同修饰基团的位阻差异，实现高效的精氨酸二甲基化肽段富集，显著提高了蛋白质甲基化的分析能力；利用此新方法，系统分析了蛋白质分相过程中精氨酸二甲基化的变化，揭示了此类修饰的发生会降低蛋白质的分相能力。　　蛋白质精氨酸甲基化是一种调控蛋白质功能的重要翻译后修饰，与较多疾病的发生发展相关。研究表明，精氨酸二甲基化会影响一些神经退行性疾病相关蛋白的液-液相分离，以及相分离所驱动的无膜细胞器的产生。然而，受限于目前精氨酸二甲基化蛋白质组分析技术覆盖率不足，这类研究仅聚焦于少数几个蛋白，尚未系统性探究精氨酸甲基化对蛋白质相分离的影响。　　本研究发现，不同甲基化修饰的精氨酸残基在与邻二酮类化合物反应时，由于位阻不同，反应活性差异巨大。合作团队据此设计了一种精氨酸二甲基化肽段的富集方法：先利用环己二酮选择性的封闭无修饰精氨酸残基，随后利用丙酮醛选择性的在二甲基化精氨酸残基上修饰顺式邻二羟基，从而使得硼酸材料可以选择性的富集精氨酸二甲基化肽段。相比传统的免疫亲和富集方法，该方法拥有较强的精氨酸二甲基化肽段富集能力，特别是在鉴定RG/RGG序列上的精氨酸二甲基化位点方面有更高的灵敏度。合作团队将该方法应用于分析蛋白质相分离过程中精氨酸甲基化的变化，发现包括G3BP1，FUS，hnRNPA1、KHDRBS1在内的一些与无膜细胞器或神经退行性疾病相关的蛋白质上的精氨酸二甲基化程度发生了显著变化；系列实验验证发现，精氨酸甲基化会显著降低这些蛋白质的分相能力，且上述蛋白质组分析中鉴定到变化的甲基化位点是调控蛋白质相分离的关键因素。本工作开发了基于化学反应的精氨酸二甲基化蛋白质组分析方法，并利用这一方法揭示了精氨酸二甲基化对蛋白质液-液相分离具有重要的调控作用。　　叶明亮团队致力于蛋白质磷酸化、糖基化、甲基化等翻译后修饰分析新方法的研究，发展了基于可逆酶促化学标记的O-GlcNAc糖肽无痕富集方法，克服了标记基团对糖肽质谱检测的干扰，实现了O-GlcNAc糖基化的高灵敏分析（Angew. Chem. Int. Edit.）；利用不同糖肽的同一肽段骨架具有相似碎裂规律的特点，发展出基于“模式识别”的肽段序列鉴定新方法，实现了谱图拓展，显著提高了N-链接位点特异性糖型的鉴定灵敏度，并可发现未知的糖链及糖链修饰（Nat. Commun.）。　　相关研究成果以Global profiling of arginine dimethylation in regulating protein phase separation by a steric effect-based chemical-enrichment method为题，发表在《美国国家科学院院刊》（PNAS）上。研究工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、大连化物所创新基金等的支持。

p　　单克隆抗体的生产方式赋予了它们复杂且具有异质性的分子特点。通常需要借助多种正交分析技术才能全面表征各种变体。 在本应用纪要中，我们使用质谱这种强大的工具对阿达木单抗进行了表征。/pp　　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "简介/span/strong/pp　　Humira® (阿达木单抗)是一种FDA和EMA批准的抗TNFα抗体，被用于治疗多种炎症性疾病，包括类风 湿性关节炎、幼年特发性关节炎、银屑病关节炎、银屑病和克罗恩病。它是2014年销量最高的单克隆抗体产品，全球销售额超过130亿美元。/pp　　阿达木单抗是由CHO细胞表达的完全人重组抗体。 和所有通过重组DNA技术制备的蛋白质一样，其最终产品是不同变体的混合物。我们必须全面表征产品的异质性，因为这会影响其安全性和功效。/pp　　质谱是目前被广泛使用的生物药物表征技术之一。得益于硬件和软件的创新，该技术现已得到常规应用。在本应用纪要中，我们将使用质谱对Humira® 进行不同水平的表征。/pp　　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "完整阿达木单抗的表征/span/strong/pp　　利用质谱分析单克隆抗体最简单的方式就是测定完整蛋白质的分子量。该检测可提供有关蛋白质鉴定和糖基化谱图的有用信息。/pp　　测定时需要对抗体脱盐，去除制剂缓冲液中的非挥发性盐类。脱盐步骤可使用超滤装置离线完成，但该过程非常耗时。配备反相色谱柱的液相色谱是一种替代方法：盐类在死体积内洗脱并被导入废液，然后用乙腈水溶液梯度将单克隆抗体洗脱到质谱仪的离子源中。/pp　　典型分析条件如表1所示。应当注意，考虑到传质限制，须采用较高的柱温以改善峰形，进而提高MS灵敏度。/pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "表1：阿达木单抗完整质量数测定的分析条件/span/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/83d0cd65-f7b9-4177-b0f7-5ff513e8505b.jpg" title="1_副本.jpg"//pp　　所得电喷雾质谱图为包络迹线，其中包括不同电荷态的蛋白质。使用MaxEnt® 算法进行去卷积处理，得到更容易解析的谱图(见图1)。通过去卷积谱图可轻松确定糖基化谱图。/pp　　在阿达木单抗上观察到的主要糖型为G0F/G0F和G0F/G1F，质量精度通常低于20 ppm。/pp　　如果需要测定不含糖基的蛋白质的分子量，为了简化谱图，可进行去糖基化。通常采用PNGase F酶去糖基化，但反应时间相当长(需要数小时甚至过夜)。为了加快分析速度，我们选用了Rapid PNGase F酶(纽英伦生物技术公司)。在50 ° C下温育10～15 min后， 获得完全去糖基化的抗体。该反应可在大多数制剂缓冲液中直接进行，无需更换缓冲液。对应的质谱图如图2所示。由于质谱图得以简化，我们可轻松观察到其它修饰，例如C端赖氨酸剪裁。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/da262e93-2bdb-4c3b-b5df-dfcf6b1eb709.jpg" title="2_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图1：完整阿达木单抗的电喷雾质谱图(A)和MaxEnt® 去卷积质谱图(B)。/span/ppstrongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "/span/strong/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/175a864c-b84f-4c37-bd2f-de937b179ade.jpg" title="3_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　strong　span style="color: rgb(0, 112, 192) "/span/strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "图2：N-去糖基化阿达木单抗的电喷雾质谱图(A)和MaxEnt® 去卷积质谱图(B)。/span/pp　　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "IdeS酶解后的阿达木单抗亚基分析/span/strong/pp　　尽管完整质量数测定(经过或不经过去糖基化处理)已经能够快速简单地鉴定抗体及确定糖基化分布，高分离度对于色谱分离和质谱测定而言通常也很有价值。/pp　　完整抗体的大小(约150 kDa)限制了分离度。还原二硫键可得到轻链和重链，但在低丰度变体的测定中，重链(约50 kDa)仍然是一个问题。/pp　　IdeS酶(Genovis，商品名FabRICATOR® )是采用质谱法表征单克隆抗体时的重要工具。酶解并还原二硫键之后得到的肽段(见图3)分子量约为25 kDa，因此可采用LC/MS分析，而且色谱分离度和质量精度极佳。 此外，样品制备仅需不到一小时。该方法通常被称为 “自中而上”策略。/pp　　或者，也可使用IdeS和Rapid PNGase F(后者须在还原条件下反应)进行连续酶解，获得去糖基化的肽段。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/b21e335e-8fd8-445a-a855-c340edabcbd1.jpg" title="4_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图3：用IdeS酶解mAb之后还原二硫键/span/pp　　为了大限度提高色谱分离度，我们优化了分析条件。 最关键的参数是色谱柱的性质以及流动相中所用的改性剂。 使用不同色谱柱获得的色谱图如图4所示。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/d4c71121-5a2b-4cc0-b26d-53ba57dfce8f.jpg" title="5_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图4：使用不同HPLC色谱柱分离经IdeS酶解和二硫键还原所得的阿达木单抗肽段的结果比较/span/pp　　由图可观察到明显差异，购自Thermo的MabPac RP色谱柱所得的结果最佳。我们在该色谱柱上测试了两种改性剂： 甲酸(FA)和三氟乙酸(TFA)，以及这两种改性剂的混合物。/pp　　最佳分析条件如表2所示。图5展示了用IdeS酶解阿达木单抗之后，还原或不还原二硫键所得的色谱图。测得分子量的质量精度低于1 Da。得益于良好的色谱分离度，我们还可分离并定量各种变体，例如N端焦谷氨 酸、无糖基化变体或氧化物质。/pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "表2：阿达木单抗亚基分析条件/span/pp style="text-align: center"br//pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/6afe117f-4c86-4523-8404-641d94e12497.jpg" title="无标题_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图5：经IdeS酶解和DTT还原的阿达木单抗样品的LC/MS分析结果/span/pp style="text-align: left "　　该方法还可用于研究抗体氧化。我们使用不同浓度的H2O2 进行了强制氧化研究。在20 ° C下温育45分钟后， 用IdeS酶解样品，然后用DTT还原，最后通过LC/MS 进行分析。所得液相色谱图如图6所示。/pp　　不同峰的质谱鉴定非常简单直接。可明确测得Fc/2和 F(ab’)2 区域的氧化物质浓度增加。/pp　　在稳定性研究中，这种分析方法非常适用于监测单克隆抗体的氧化。亚基水平的分析能够粗略定位氧化位点。更精确的定位可通过肽图分析实现。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/e3b20720-c738-41e3-91c0-9912e87e02a5.jpg" title="6_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　span style="color: rgb(0, 112, 192) "　图6：色谱图随H2O2 浓度增加发生的变化/span/pp　　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "通过UPLC-UV-MSsupE/sup肽图分析对阿达木单抗进行鉴定和目标纯度分析/span/strong/pp　　肽图分析策略涉及使用特定的蛋白酶(例如胰蛋白酶) 得到小分子肽，再利用LC与UV和/或MS检测联用的方法分析所得的肽混合物。/pp　　随着液相色谱和质谱技术不断进步，采用肽图分析法分析单克隆抗体现在已经能够达到接近100%的序列覆盖率，同时详尽表征翻译后修饰。 如今，人们在常规分析中使用亚2 µ m色谱柱获取高分离度肽图，而借助高分辨率质谱则能够以低于 5 ppm的质量精度实现肽的鉴定。/pp　　除了质量测定以外，还可使用MSE模式记录碎片数据。 在MSE采集模式下，仪器每秒交替采集低能量和高能量谱图，因此几乎可以同时获得分子质量和序列信息 (图7)。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/fbe321ec-3274-4d6b-acb9-2fe1c51b3e85.jpg" title="7_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图7：MSE采集模式的原理。/span/pp　　过去MS检测通常仅用于方法开发，但随着功能强大且经过验证的软件被开发出来，质谱法现在也被应用于常规分析中。/pp　　放大后的阿达木单抗肽图分析基峰离子(BPI)色谱图如图9所示。这些数据使用表3所列的分析条件获得。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/4fac9c35-d14d-446a-89bb-bbf9abfa6226.jpg" title="yaji_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "表3：阿达木单抗肽图分析的分析条件/span/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/d1e374ea-bc16-4db0-a1c8-2da8667c190f.jpg" title="8_副本.jpg"//pp　　使用UNIFI软件解决方案(沃特世)基于分子量对每个峰进行鉴定(质量数容差5 ppm)，进而计算出序列覆盖率 (图8)。 必要时，可使用碎片数据(MSE)确证胰蛋白酶肽的鉴定结果。图10展示了碎片离子谱图的一个示例(MSE-高 能量)。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/b0cc8c39-7298-4968-af6d-87b4ec76d53a.jpg" title="9_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图8：利用UPLC-UV-MSE对阿达木单抗进行肽图分析并采用UNIFI软件解决方案处理数据之后所得的序列覆盖图/span/pp　　肽图分析法还可用于评估单克隆抗体的纯度。完整质量数测定和亚基分析能够提供单克隆抗体纯度的大体情况，肽图分析法则能够进行目标纯度分析。可评估的主要修饰包括：/pp　　■ 脱酰胺化/pp　　■ 氧化/pp　　■ 糖基化/pp　　■ N端焦谷氨酸/pp　　■ C端赖氨酸截断/pp　　即使UPLC肽图的分离度再高，色谱分离度通常也不足以通过UV检测对修饰进行相对定量。因此，我们使用MS数据进行定量分析。该过程可使用UNIFI等软件解决方案完全自动化地完成。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/daf3b1a7-ab1b-4c9c-ac80-08dea0ac6ed9.jpg" title="10_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图9：阿达木单抗的肽图(BPI色谱图)/span/pp　　使用该方法分析阿达木单抗样品，获得了如下结果：/pp　　■ 序列覆盖率：100%(质量数容差10 ppm)。/pp　　■ 使用更苛刻的标准(质量数容差5 ppm， 至少以2b/y碎片离子确证鉴定结果)所得的序列覆盖率仍然非常高(93%)。/pp　　■ 重链上2.9%的N端谷氨酸以焦谷氨酸形式存在。/pp　　■ 大部分重链都不含C端赖氨酸(89%)。/pp　　■ 在轻链的152N上观察到了显著的脱酰胺化。/pp　　■ 观察到的主要糖型为G0F、G1F和G2F，相对强度分别为75%、23%和2%(基于糖肽EEQNSTYR)。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/93a63c98-dd03-4921-a7cf-236379984a3c.jpg" title="11_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图10：阿达木单抗轻链T1肽的高能量MSE谱图(带标注)/span/pp　　利用UPLC与荧光检测和高分辨率质谱检测联用的方法对阿达木单抗进行N-糖分析/pp　　大多数治疗性单克隆抗体都是IgG类抗体，在重链的Fc 区氨基酸297N处有一个糖基化位点(见图11)。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/30b15311-c672-40c6-aa50-920177aaee2e.jpg" title="12_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图11：单克隆抗体中常见的N-糖/span/pp　　糖基化是单克隆抗体的一项关键品质属性，因为Fc区 域的N-糖特征可影响抗体与Fc受体的结合，从而调控 ADCC和ADCP活性。末端半乳糖对于补体依赖性细胞毒性(CDC)也很重要。最后，糖基还会影响治疗性抗体的安全性。/pp　　因此，必须采用灵敏且可重现的方法来表征单克隆抗体的糖基化以及批次间一致性。得益于优异的分离度和重现性，使用亚2 µ m色谱柱分析2-AB标记的N-糖成为了表征单克隆抗体的首选方法。不同游离寡糖的相对定量通常采用荧光检测法。/pp　　该方法的两个缺点是样品制备时间长(通常为2～3天)， 且很难鉴定低丰度游离寡糖。/pp　　我们对方案进行了优化，将样品制备时间缩短为不到一天，并结合高灵敏度MS/MSE和荧光检测建立了自动化MS工作流程。包括数据处理和报告在内的整个流程可在24小时内完成(见图12)。表4汇总了分析条件。/pp　　阿达木单抗的UPLC/FLUO色谱图如图13所示。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/448b85af-dfca-4b58-a3af-3513a8a0c928.jpg" title="13_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图12：N-糖分析工作流程/span/pp　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "表4：阿达木单抗游离N-糖的分析条件/span/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/df32e840-8042-4c12-a9a9-bffa7781485a.jpg" title="Ntang_副本.jpg"//pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/8bd603a8-3e4d-4b31-8107-a23999844b42.jpg" title="15_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图13：阿达木单抗N-糖分析所得的UPLC/FLUO色谱图/span/pp　　鉴定不仅基于游离寡糖的分子量，还基于“葡萄糖单元 ”(GU)校准。大多数情况下，将这两种方法相结合都能准确鉴定N-糖。必要时，可使用MSE模式下采集的碎片数据来确证鉴定结果，或者在两个假定结果之间做出选择。GlycoWorkbench应用程序可用于解析碎片谱图。带标注的MSE谱图示例如图14所示。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/3092e407-ec1b-42c8-b670-c1ca726e5f52.jpg" title="16_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图14：分析阿达木单抗样品中的2-AB标记G0F游离寡糖所得的高能量MSE谱图(带标注)/span/pp　　检出的主要N-糖(占所有检出N-糖的95%)列于表5中。/pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "表5：阿达木单抗样品中检出的主要N-糖/span/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/de10208a-c2b3-41e2-91a2-acf08569e5c8.jpg" title="17_副本.jpg"//pp　　有趣的是，使用本应用纪要所列的不同方法测得的要糖型比率非常一致(仅考虑所有方法都能检出的糖型，即G0F、G1F和G2F)，如表6所示。/pp　　表6：使用不同方法获得的阿达木单抗糖型测定结果比较/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/753139b8-e6e8-4a94-9a6e-a0411df6303b.jpg" title="18_副本.jpg"//pp　　strong注：本文引自Quality Assistance的应用文章。/strong/ppbr//p

ALADDIN的优势多肽在基础生理学、生物化学和医药研究，尤其是医药行业新药筛选中起关键作用，新的短链肽和模拟肽在新药研发中为新药提供了较强的生物活性和蛋白酶水解抗性。短肽还可以作为分子探针，更好的阐述生物系统的功能。因此肽合成在化学生物学领域所占份额越来越大。阿拉丁为你提供高质固相和液相肽合成的一站式服务，包括带有Fmoc、Boc和Cbz保护基团的天然或非天然氨基酸合成砌块、偶联试剂、预装树脂、Linker、N-保护试剂。产品列表多肽固相合成管固相多肽合成预装树脂N-保护试剂耦合试剂Fmoc修饰的氨基酸及氨基酸衍生物列表Boc修饰的氨基酸及氨基酸衍生物列表更多相关产品耗材产品列表多肽固相合成管货号品名包装容量外径螺纹口砂板孔隙度P3597-01-1EAP3597-01 多肽固相合成管1个25ml25mm25G2P3597-02-1EAP3597-02 多肽固相合成管1个25ml25mm25G3 试剂产品列表固相多肽合成预装树脂货号品名规格包装 A116077Fmoc-Arg(Pbf)-Wang resin100-200 mesh, 1%DVB1g,5g,25g A116080Fmoc-Asn(Trt)-王氏树脂 100-200 mesh, 1%DVB，Substitution 0.41g,5g,25g A116082Fmoc-Asp(OtBu)-王氏树脂100-200 mesh, 1%DVB，Substitution 0.1g,5g,25g A118255Fmoc-氨基酸-王树脂100-200 mesh, 1%DVB，Substitution 0.3-0.8mmol/g5g,25g A118270AminoMethyl Polystyrene Resin0.5~1.5mmol/g, 100~200 mesh5g,25g,100g C110262氯甲基化聚苯乙烯树脂1% DVB交联 1.0~1.24mmol/g , 100~200 mesh, 1% DVB5g,25g,100g C1182692-Chlorotrityl Chloride Resin0.8-1.5mmol/g, 100~200 mesh5g,25g,100g G116092Fmoc-Glu(OtBu)-王氏树脂 100-200 mesh, 1%DVB，Substitution 0.1g,5g G116094Fmoc-Gly-Wang resin100-200 mesh, Substitution 0.3-0.8mmol/g5g,25g L116104Fmoc-Leu-王氏树脂100-200 mesh, Substitution 0.3-0.8mmol/g5g,25g L116107Fmoc-Lys(Boc)-王氏树脂 100-200 mesh, 1%DVB,Substitution 0.3-1g,5g,25g M118256Fmoc-Met-王氏树脂100-200 mesh, 1%DVB，Substitution 0.3-0.1g,5g,25g M118275MBHA Resin0.3~0.8mmol/g, 100~200 mesh, 1% DVB1g,5g,25g P118257Fmoc-D-Phe-王氏树脂 100-200 mesh, 1%DVB，Substitution 0.3-0.5g,25g P118258Fmoc-Phe(4-Cl)-Wang resin100-200 mesh, 1%DVB1g,5g,25g P118261Fmoc-Pro-王氏树脂 100-200 mesh, 1%DVB，Substitution 0.3-0.8m5g,25g R118279Rink Amide-AM Resin 0.3~0.8mmol/g, 100~200 mesh, 1% DVB1g,5g,25g R118280聚合物键合型 Rink 酰胺 4-甲基二苯甲胺0.3~0.8mmol/g, 100~2001g,5g,25g S118282Sieber 酰胺树脂0.3~0.8mmol/g, 100~200 mesh, 1% DVB5g,25g,100g T118264Fmoc-Thr(tBu)-王氏树脂100-200 mesh, 1%DVB，Substitution 0.31g,5g,25g T118267Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin100-200 mesh, 1%DVB，Substitution 0.5g,25g T118281Fmoc-Threoninol(tBu) DHP HM Resin 0.3~0.8mmol/g, 100~200 mes5g,25g V118268Fmoc-Val-Wang resin100-200 mesh, 1%DVB，Substitution 0.3-0.85g,25gN-保护试剂氨基保护是合成化学和肽合成中必须部分，有效的保护基团可以从合成的化合物易于添加和除去。货号品名规格cas号包装 B105737氯甲酸苄酯 96%,含约 0.1% 碳酸钠稳定剂501-53-125g,100g,500g,2.5kg D106158二碳酸二叔丁酯 98%24424-99-525g,100g,500g,1kg D106159二碳酸二叔丁酯 99%24424-99-525g,100g,1kg D106160二碳酸二叔丁酯 96%24424-99-5100g,500g F1061739-芴甲基-N-琥珀酰亚胺基碳酸酯 98%82911-69-15g,25g,100g F113338芴甲氧羰酰胺 99%84418-43-95g,25g,100g I105738氯甲酸异丁酯 98%543-27-125g,100g,500g耦合试剂由于肽合成中较低的消旋化是固相肽合成的一个关键指标，阿拉丁为你提供各种高质量偶联试剂，包括碳化二亚胺、脲类和磷型的偶联试剂，可以快速、有效和无消旋的缩合货号品名规格cas号包装 A1133452-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N' ,N' -四甲基脲四氟硼酸盐 98%873798-09-55g,25g,100g B106161卡特缩合剂 98%56602-33-65g,25g,100g,500g B1093122-溴-1-乙基吡啶四氟硼酸盐 98%878-23-95g,25g B113336溴代三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐 98%50296-37-21g,5g,25g B113343三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸盐 98%132705-51-21g C109314N,N' -羰基二咪唑 &ge 97.0% (T)530-62-12.5kg,25g,100g,500g C109315N,N' -羰基二咪唑 99%530-62-11kg C113337N,N' -羰基二(1,2,4-三氮唑) 96%41864-22-65g,25g,100g H1061761-羟基苯并三唑一水合物 &ge 97.0%123333-53-925g,100g,250g,500g H1061773-羟基-1,2,3-苯并三嗪-4(3H)-酮 98%28230-32-25g,25g,100g H106354N-羟基邻苯二甲酰亚胺 98%524-38-92.5kg,25g,100g,500g H1093281-羟基-7-偶氮苯并三氮唑 99%39968-33-75g,25g,100g,500g H109329N-羟基-5-降冰片稀-2,3-二酰亚胺 99%21715-90-210g,50g,250g H109330N-羟基琥珀酰亚胺 98%6066-82-62.5kg,25g,100g,500g H109337N-羟基硫代琥珀酰亚胺 钠盐 98%106627-54-71g,5g,25g N102772N-琥珀酰亚胺基-N-甲基氨基甲酸酯 97%18342-66-05g,25g N113351TNTU 98%125700-73-41g,5g,25g,100g C113347多肽试剂TCTU 98%330641-16-25g,25g,100g C1171602-氯-1,3-二甲基咪唑六氟磷酸盐 98%101385-69-71g,5g,25g D1028482-(2-吡啶酮-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐 99%125700-71-21g,5g,25g D106162N,N' -二异丙基碳二酰亚胺(DIC) 98%693-13-010ml,25ml,100ml,500ml D106171N,N' -琥珀酰亚胺基碳酸酯 98%74124-79-15g,25g,100g D106284N,N-二甲基丙烯基脲(DMPU) 99%7226-23-525g,100g,500g D109331二吡咯烷基(N-琥珀酰亚氨氧基)碳六氟磷酸盐 98%207683-26-91g,5g,25g O113352TOTT 98%255825-38-85g,25g,100g P1091051-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮 99%89-25-82.5kg,100g,500g W111795伍德沃德氏试剂K 98%4156-16-51gFmoc修饰的氨基酸及氨基酸衍生物列表货号品名规格cas号包装 A107817Fmoc-L-天冬氨酸 4-烯丙酯 98%146982-24-31g,5g,25g A140203N-Fmoc-8-氨基辛酸 &ge 98.0%(HPLC)126631-93-41g,5g B116715N-Boc-N' -Fmoc-D-赖氨酸 97%115186-31-75g,25g B121679N-Boc-顺式-4-Fmoc-氨基-L-脯氨酸 97%174148-03-91g,5g C115874FMOC-&beta -环己基-L-丙氨酸 98%135673-97-11g,5g,25g C115932Fmoc-Cys(Mbzl)-OH 98%136050-67-41g,5g,25g D115880N&alpha -Fmoc-L-2,3-二氨基丙酸 97%181954-34-71g,5g,25g F100409Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸 98%103213-32-75g,25g F100413Fmoc-O-叔丁基-L-谷氨酸 98%71989-18-95g,25g F100419Fmoc-L-谷氨酸 98%121343-82-65g,25g F100746N-Fmoc-N' -Boc-L-鸟氨酸 96%109425-55-01g,5g,25g F100759Fmoc-Val-OSu 97%130878-68-15g,25g F100801Fmoc-L-天冬氨酸 98%119062-05-41g,5g,25g,100g F100805Fmoc-L-缬氨酸 98%68858-20-85g,25g,100g F100808Fmoc-L-亮氨酸 98%35661-60-05g,25g,100g F101115FMOC-L-炔丙基甘氨酸 98%198561-07-81g,5g,250mg F101121FMOC-D-炔丙基甘氨酸 96%220497-98-31g,250mg F101195Fmoc-D-烯丙基甘氨酸 96%170642-28-11g,250mg F101202FMOC-D-3-(4-吡啶基)-丙氨酸 98%205528-30-91g,5g F101214Fmoc-3-(3-吡啶基)-L-丙氨酸 98%175453-07-31g,5g,250mg F101220FMOC-L-3-(2-吡啶基)-丙氨酸 97%185379-40-21g,250mg F101223FMOC-D-3-(2-吡啶基)-丙氨酸 98%185379-39-91g,5g F101459Fmoc-2-氨基异丁酸 97%94744-50-05g,25g F101574FMOC-L-4-甲基苯丙氨酸 98%199006-54-71g,250mg F101598FMOC-L-3-甲基苯丙氨酸 98%211637-74-01g,250mg F101600FMOC-D-3-甲基苯丙氨酸 98%352351-64-51gBoc修饰的氨基酸及氨基酸衍生物列表td style="padding-left: 12px "98%货号品名规格cas号包装 B100726BOC-O-苄基-L-酪氨酸 98%2130-96-35g,25g,100g B100799Boc-L-谷氨酰胺 98%13726-85-75g,25g B101207BOC-D-3-(3-吡啶基)-丙氨酸 98%98266-33-21g,5g,250mg B101451BOC-D-丙氨酸 98%7764-95-65g,25g B101478Boc-D-酪氨酸 70642-86-31g,5g,25g,100g B101548BOC-L-4-甲基苯丙氨酸 98%80102-26-71g,5g,250mg B101595BOC-L-3-甲基苯丙氨酸 98%114873-06-21g,5g B101597BOC-D-3-甲基苯丙氨酸 98%114873-14-21g,5g B101616BOC-L-2-甲基苯丙氨酸 98%114873-05-11g B101623BOC-D-2-甲基苯丙氨酸 98%80102-29-01g B101627BOC-D-4-溴苯丙氨酸 98%79561-82-31g B101633BOC-L-2-溴苯丙氨酸 98%261165-02-0500mg B101661BOC-L-3,4-二氯苯丙氨酸 98%80741-39-51g,5g,250mg B101686BOC-L-2-氯苯丙氨酸 98%114873-02-81g,5g B101696BOC-D-2-氯苯丙氨酸 98%80102-23-45g B102424Boc-L-脯氨酸酰胺 97%35150-07-31g,5g B102427N-BOC-L-苯丙氨醛 97%72155-45-41g,250mg B102428Boc-L-脯氨醛 97%69610-41-91g,5g B1024361-(Boc-氨基)环戊烷羧酸 98%35264-09-61g,5g B102447N(&alpha )-Boc-L-2,3-二氨丙酸 97%73259-81-11g,5g B102996BOC-L-异亮氨酸 99%13139-16-75g,25g,100g B103072N-Boc-N' -Cbz-L-赖氨酸 98%2389-45-95g,25g,100g B103084N-Boc-4-氧-L-脯氨酸甲酯 97%102195-80-21g,5g,250mg B103160(S)-N-BOC-4-溴苯丙氨酸 98%62129-39-91g,5g,25g更多产品请访问阿拉丁官网

2018 年，关于肿瘤免疫的那些事儿6 月：国内首款 PD-1 单克隆抗体药物获批，中国跨入肿瘤免疫时代10 月：诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家詹姆斯艾利森 (James Allison) 与日本科学家本庶佑 (Tasuku Honjo) ，以表彰他们在癌症免疫治疗方面所做出的贡献12 月：国内首款国产 PD-1 单克隆抗体药物获批，开启肿瘤免疫治疗“亲民”时代肿瘤免疫治疗的火爆让单克隆抗体药物（下文简称单抗）的研究越来越受到关注，今天我们就来聊聊单抗的一大特性——电荷异质性。抗体是指能与相应抗原特异结合的具有免疫活性的球蛋白，而单抗是由单一 B 细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。同其它蛋白一样，单抗常常存在广泛的翻译后修饰和降解，如糖基化、碳端赖氨酸丢失、脱酰胺化、二硫键错配、糖化和氧化等。几乎这些所有的翻译后修饰都会直接或间接的引起单抗表面电荷的变化，这就是单抗的电荷异质性。电荷异质性影响单抗的体外及体内的活性、安全性、可行性和质量，在新药研发和生物类似药的开发中都非常重要。电荷异质性的检测通常采用基于电荷分离的技术手段，如离子交换色谱、毛细管等电聚焦（CIEF），以及成像毛细管等电聚焦（iCIEF）等。与主峰 (Main peak) 相比，这些变异体峰通常被称为酸性峰 (Acidic variants) 和碱性峰 (Basic variants) 。大部分的人源 IgGs 具有碱性的等电点，因此，阳离子交换色谱通常被用于分离。在主峰前面的峰通常称为酸性峰，因为其带有的正电荷较少，洗脱较快；在主峰后面的峰称为碱性峰。酸碱峰的鉴定采用离线收集鉴定或多维液相-质谱联机在线鉴定。图 1. 阳离子交换色谱分离酸碱峰示例图毛细管等电聚焦（CIEF）是电荷异质性表征的主要手段，但采用 CIEF 分离时收集馏分用于鉴定非常困难，所以 CIEF 通常用于监控电荷异质性而不能用于表征。质谱检测虽然广泛应用于单抗的表征，但是将 CIEF 和 MS 联机一直是非常大的挑战。质谱在线检测的缺失也限制了 CIEF 在蛋白电荷异质性的表征上的应用。将 CIEF 分离的高分辨特性和质谱的表征能力结合起来是电荷异质性表征迫切需要的技术。Agilent 7100 CE-QTOF 联机的特点无与伦比的毛细管分离的分辨率：甘油改性剂降低非 CIEF 电泳迁移和区带展宽两性电解质：兼顾电泳分辨率和质谱灵敏度质谱友好的阳极液和阴极液优化的鞘流液组成：有效的聚焦、迁移和电喷雾离子化纳流级别的鞘流液流速：基于电渗流技术的纳流鞘流液最大限度提高检测灵敏度优化的 CIEF 运行参数：进样量、电场强度、压力灵敏度高、抗污染的质谱：Agilent 6200 系列 TOF，6500 系列 Q-TOF图 2. Agilent 7100 CE-QTOF 联机图CIEF-MS 的方法可行性及卓越表现采用等电点标记物（pI markers）进行验证，等电点和迁移时间之间具有良好的线性相关性 (R^2=0.99)。此外，CIEF-MS 方法采集的四种单抗的电荷变异体分离的轮廓图也通过成像毛细管等电聚焦紫外方法比对验证一致。pI markers 的绝对迁移时间的相对标准偏差小于 5%（n=4）。贝伐单抗三次进样的相对迁移时间 RSD 小于 1%，绝对迁移时间小于 2.3%，峰面积的 RSD 小于 7%。并且，单抗的电荷变异体可通过质谱直接测得其分子量。CIEF-MS 采集的电荷变异体轮廓分布和 iCIEF-UV 检测具有高度的一致性。iCIEF-UV 通过全柱成像检测去除了等电聚焦后分析物迁移到检测器端的步骤，CIEF-MS 和 iCIEF-UV 检测结果的高度一致性证明了在线 CIEF-MS 分析单抗电荷变异体史无前例的高分辨率。除了高分辨率之外，该方法具有非常好的重现性。CIEF-MS 电荷异质性分析的应用实例大集结贝伐珠单抗的分析CIEF-MS 和 iCIEF-UV 分析得到的酸碱峰比例接近，分别为酸性峰: 主峰: 碱性峰= 23% : 72% : 5% 和 27% : 68% : 5%。除了 CE 的高分离度之外，质谱数据优异的原始谱图是实验分析制胜的关键，尤其是在鉴定跟主峰质量差别很小的变异体时，如在分析一个脱酰胺 (+1Da) 质量差时，一款性能优异的质谱是 CIEF-MS 分析的必备之选。贝伐珠单抗的主峰分子量为 149 202 Da，碱性峰 B1 和主峰之间的质量差为 +128 Da，和碳端赖氨酸 (+128 Da, +1K) 异质性匹配；碱性峰 B2 (?=-17Da) 和氮端焦谷氨酸环化修饰 (-17Da) 匹配；酸性峰 A1 (?= 1Da) 和脱酰胺修饰匹配。酸性峰 A1 和主峰只有 1 Da 的质量差别，虽然我们会担心质谱准确度因素带来的不确定性，但酸性峰的位置和正好 1 Da 的质量差让我们有理由相信酸性峰 A1 是脱酰胺的修饰峰。A2 峰的信号非常弱，可能是高糖基化修饰的峰。图 3. 贝伐珠单抗 CIEF-MS 分析结果图曲妥珠单抗的分析曲妥珠单抗和贝伐珠单抗的电荷异质性分布的差异较大。iCIEF-UV 测得的低含量碱峰在CIEF-MS上未检出，同时其对酸峰的分离效果也优于 CIEF-MS 分离。质谱检测结果清晰的展示了酸性峰中四种主要的糖型变异体。曲妥珠单抗的主峰分子量为148 224 Da，酸性峰 A1 (?m = +1Da) 和酸性峰 A2 (?m = +2Da) 和脱酰胺修饰匹配，并且和 2D CZE-MS 的结果一致。图 4. 曲妥珠单抗 CIEF-MS 分析结果图英夫利昔单抗的分析英夫利昔单抗的三个电荷变异体峰在 CIEF-MS 上有良好的分离。解卷积结果显示两个碱峰为碳端赖氨酸变异体，碱性峰 B1 (?m = +258 Da) 和两个赖氨酸匹配；碱性峰 B2 (?m = +129 Da) 和一个赖氨酸匹配；酸性峰 A (?m = +5 Da) 小的质量偏差显示其可能为脱酰胺的修饰。图 5. 英夫利昔单抗 CIEF-MS 分析结果图西妥昔单抗的分析西妥昔单抗是人鼠嵌合的 IgG-1 单抗，具有高度的微观不均一性，该特性主要源于高度复杂的糖基化修饰。西妥昔单抗重链的 Fab 和 Fc 上各有一个糖基化位点，同时有碳端赖氨酸的不完全剪切，这些高度的异质性会造成分离上的困难。采用 CIEF-MS 实现了八个电荷变异体的良好分离，不仅和 iCIEF-UV 的结果一致，同时也和文献报道一致。但是由于西妥昔单抗复杂的糖基化修饰，通过质谱获得的分子量信息不足以反应修饰的情况。图 6. 西妥昔单抗 CIEF-MS 分析结果图西妥昔单抗亚基水平的分析针对西妥昔单抗这类具有复杂异质性的抗体，通过 IdeS 酶切和 DTT 还原降低其复杂程度，更利于质谱检测。通过高分辨质谱检测，IdeS 酶切后的八个变异体峰及 IdeS 酶切同时 DTT 还原后得到的 11 个变异体都得以检测。研究发现，西妥昔单抗的电荷异质性主要源于 Fc 区末端赖氨酸的异质性、Fd’ 区 N-羟乙酰神经氨酸和可能存在的脱酰胺修饰。轻链上未发现有电荷异质性。图 7. 亚基水平 CIEF-MS 分析流程图安捷伦 CE-QTOF 解决方案不仅兼顾了毛细管电泳的高效分离，离子源接口的高灵敏度和高分离度，也实现了质谱的高灵敏高分辨检测。在完整蛋白分析的层次上增加亚基水平的解决方案，即使是具有高度复杂异质性的抗体分析也能轻松应对。访问安捷伦药典系列文章，了解更多信息。参考文献：1. 安捷伦应用文献 5994-0672EN2. Jun Dai,*,? Jared Lamp,? QiangweiXia,? and Yingru Zhang?, Capillary Isoelectric Focusing-Mass SpectrometryMethod for the Separation and Online characterization of Intact Monoclonal AntibodyCharge Variants. Anal Chem. 2018 Feb 6 90(3):2246-22543. Jun Dai, and Yingru Zhang, AMiddle-Up Approach with Online Capillary Isoelectric Focusing-Mass Spectrometryfor In-depth Characterization of Cetuximab Charge Heterogeneity. Anal. Chem.,2018, 90 (24), pp 14527–14534扫描下方二维码，关注“安捷伦视界”公众号，获取更多资讯。

南方医科大学研究团队发表相关论文，英文题目：GinsenosideRg1 mitigates morphine dependence via regulation of gut microbiota,tryptophan metabolism, and serotonergic system function。中文题目：人参皂苷Rg1通过调节肠道菌群、色氨酸代谢和血清素能系统功能减轻吗啡依赖研究背景吗啡依赖是一种毁灭性的神经精神疾病，可能与肠道菌群失调密切相关。人参皂苷Rg1(Rg1)是从人参根中提取的活性成分，对神经系统具有潜在的保健作用。然而，它在物质使用障碍中的作用仍不清楚。该文探索了Rg1在对抗吗啡依赖中的潜在调节作用。研究结果1.人参皂甙 Rg1 抑制吗啡诱导的小鼠的条件位置偏好（CPP）调理训练后各组小鼠体重略有增加，但是未观察到显著差异（图1C）。使用Smart3.0软件在15分钟内跟踪小鼠头部并记录它们的轨迹和停留时间。对照组和其他组之间的轨迹或CPP分数没有显着差异。在吗啡注射后在白室中花费的时间与基线相比以及在盐水处理后在白室中花费的时间显着增加（图1C，D），表明吗啡成功诱导CPP在实验小鼠中。MRH和MRL组与模型组相比，MRL和MRH小鼠在药物配对隔室的停留时间和轨迹显着减少。然而，在单独用人参皂甙Rg1治疗的小鼠中，没有观察到CPP评分和活动途径的变化。2.人参皂甙Rg1改善CPP小鼠肠道菌群失调阿片类药物成瘾通常与肠道菌群失调有关。为了进一步探索Rg1介导的抗成瘾机制，对粪便进行了16S rRNA 基因扩增子测序，以评估有或没有Rg1处理的CPP小鼠肠道微生物群的组成。维恩图显示了对照组和其他组小鼠共有476个OTU（图2A）。然而，对照组有1108个OTU，M组有1304个，MM组有19个，MRL组有548个，MRH组有1702个，CR组有195个。这些数据暗示了吗啡治疗诱导的肠道微生物群紊乱和人参皂苷Rg1给药后的部分恢复。值得注意的是，使用Chao1指数进行的α多样性分析显示，Rg1阻止了吗啡引起的细菌丰富度下降（图2B）；然而，各组之间的香农指数没有差异（图2C）。通过Bray-Curtis主坐标分析(PCoA)研究肠道菌群的整体结构表明，吗啡组的细菌组成发生了变化，与对照组不同，表明肠道菌群失调吗啡处理诱导了微生物群（图2D）。然而，MRL、MRH、MM和CR组显示了四种不同的细菌组成簇。值得注意的是，MRL中的微生物群与MRH组中的微生物群更紧密地聚集在一起。我们在门水平上进一步分析了每组的肠道细菌组成。人参皂甙Rg1显着增加吗啡诱导的拟杆菌门和厚壁菌门相对丰度的降低（图2E），并显着降低吗啡诱导的蓝藻和变形杆菌的相对丰度增加。在家族水平上的进一步分析显示，吗啡处理导致随着叶绿体和线粒体的增加，拟杆菌属、Sutterellaceae和Tannerellaceae的相对丰度急剧下降。在MRL和MRH组中，吗啡诱导的丰度变化不同程度地逆转（图2F，G）。此外，Kruskal-WallisH检验用于评估指定组之间在物种水平上的差异的显着性，并观察到15个优势物种（图2H）。考虑到报告显示吗啡依赖模型中拟杆菌属的丰度低于对照，我们专注于拟杆菌属物种B.vulgatus、B.xylanisolvens和B.acidifaciens。吗啡显着降低了B.acidifaciens、B.vulgatus和B.xylanisolvens 的丰度。值得注意的是，B.vulgatus的相对丰度在Rg1给药后显着增加（图2I）。除了16SrRNA 测序外，我们还用B.vulgatus特异性引物进行了定量PCR，证实吗啡显着降低了丰度，人参皂苷Rg1处理后丰度显着增加（图2J）。图片图片图23.人参皂甙 Rg1抑制肠道微生物群衍生的水平和CPP小鼠血清色氨酸代谢物在药物依赖期间，肠道代谢谱发生变化，宿主代谢途径可能发生改变。我们假设人参皂苷Rg1可能通过肠道微生物发酵过程中产生的代谢物影响CPP。基于这一理论，我们使用非靶向代谢组学来识别可能在小鼠血清和肠道中改变的关键代谢物和代谢途径。MRL组和MRH组对吗啡诱导的CPP的疗效没有观察到统计学差异；然而，行为分析数据显示，MRH组的疗效优于MRL组。因此，我们选择MRH组作为非靶向代谢组学分析的代表性药物干预组。在血清和粪便中分别鉴定出1955和559种代谢物。偏最小二乘判别分析(PLS-DA)模型分别在血清和粪便中的CONTROL、MODEL和MRH组中显示出显着的聚类分离(图3A、G)。热图分析显示，CPP导致代谢物发生显着变化，小鼠粪便和血清中共有177种代谢物（96种上调和81种下调）和69种代谢物（44种上调和25种下调）分别显着改变（图3D和J)。此外，对代谢物途径的分析表明，与对照组相比，CPP小鼠的以下途径发生了显着变化：色氨酸、α-亚麻酸、甘油磷脂、精氨酸和脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸代谢。值得注意的是，色氨酸代谢受到粪便和血清中吗啡的显着影响（图3B和H）。将MRH与MODEL组进行比较，在人参皂苷Rg1处理后，粪便和血清中的195种代谢物（94种上调和101种下调）和115种代谢物（60种上调和55种下调）分别显着改变（图3E和K）。代谢组学图显示色氨酸代谢受到Rg1补充的显着影响（图3C和I）。色氨酸代谢在微生物组-肠-脑轴中起关键作用。在这种情况下，我们专注于色氨酸代谢相关的代谢物。具体而言，色氨酸代谢相关代谢物的热图分析表明，参与色氨酸代谢的四种主要中间代谢物L-色氨酸、吲哚、N' -甲酰基犬尿氨酸和血清素是对吗啡的反应最显着增加的代谢物，它们的水平在Rg1处理后，粪便或血清中的含量降低。具体来说，我们发现与模型组相比，Rg1处理的肠道色氨酸和血浆血清素水平下调（图3F和L）。4.人参皂甙 Rg1 改善 CPP 小鼠海马 5-羟色胺能系统的变化血清色氨酸浓度会影响大脑的血清素系统。我们推测宿主色氨酸代谢物的变化可能与CPP小鼠的海马血清素能系统和其他神经递质有关。为了验证这一假设，使用酶联免疫吸附法检测海马和外周血清中谷氨酸、多巴胺、γ-GABA和5-HT的表达水平。在海马中，相对于对照组，CPP小鼠表现出显着升高的多巴胺水平和降低的γ-GABA水平（图4C）。然而，组间谷氨酸和血清素的浓度没有差异（图4A）。与M组相比，MRH组海马中GABA含量增加。此外，在MRL和MRH小鼠中观察到多巴胺水平显着下降。注射吗啡后血清中血清素和多巴胺水平升高，γ-GABA水平降低。所有CPP诱导的变化都被Rg1处理逆转（图4B、D、S2B）。为了进一步探索Rg1介导的抗成瘾机制，我们使用qPCR检测了小鼠海马中奖赏相关基因mRNA的相对转录水平，包括脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养酪氨酸激酶受体2型(TrkB)和血清素受体。与Rg1治疗组的转录水平相比，吗啡组中5-羟色胺受体（5-HTR1B和5-HTR2A）、BDNF和TrkB的转录水平因人参皂苷Rg1给药而下调（图4E、F）。这些数据表明人参皂甙Rg1可能通过抑制血清素系统来改善吗啡依赖。5.肠道微生物组的调控影响人参皂甙 Rg1 对吗啡诱导的小鼠 CPP 的抑制作用为了研究肠道菌群失调对吗啡诱导的小鼠行为的影响，我们在进行吗啡依赖性CPP训练之前，给BALB/cSPF 小鼠施用了不可吸收的抗菌剂或无菌水的混合物7天，然后进行CPP测试（图5A）。ATM治疗后各组小鼠体重下降，调理训练后略有增加；然而，各组之间没有观察到差异（图5B）。ABX与对照组相比，同时给予多种抗生素后，所有抗生素治疗小鼠在药箱中的停留时间均增加。此外，与ABX组相比，AM组在药物配对隔室中的停留时间明显增加。令人惊讶的是，小鼠在AMRL、AMRH和AMM组的药物配对隔室中的停留时间与AM组没有显着差异（图5D）。我们在鼠标头部轨迹中观察到相同的现象（图5C）。为了评估抗生素暴露后小鼠肠道微生物群发生的变化，通过16SrRNA 基因测序测定了粪便细菌组成。抗生素治疗极大地改变了微生物组并减少了细菌负荷（图5E）。为了研究肠道菌群失调对吗啡诱导的小鼠行为的影响，我们使用了维恩图显示了对照组和其他抗生素治疗小鼠共享的476个OTU；然而，1606个OTU是对照组独有的，48-68个OTU是其他六个抗生素治疗组独有的。随后用抗生素混合物治疗导致肠道微生物群显着消耗，细菌多样性显着降低。PCoA显示抗生素治疗的小鼠与对照小鼠相比具有显着不同的微生物群落（图5F）。但ABX、AM、AMRL、AMRH、AMM和AR组的细菌多样性没有显着变化，说明抗生素治疗根除大部分共生菌，吗啡和人参皂苷Rg1治疗后没有显着变化.我们在ABX小鼠的粪便中发现了几种细菌门，这些细菌门相对于对照组的粪便发生了改变（图5G）。优势门不同，伴随着Proteobacteria的丰度显着增加，而Verrucomicrobiota、Cyanobacteria、Firmicutes和Deferribacterota的丰度在抗生素处理后下降。然而，用抗生素治疗小鼠并没有改变拟杆菌的相对丰度，尽管抗生素治疗耗尽了肠道微生物组成。最后，我们用B.vulgatus特异性引物进行了定量PCR，并证实与对照组相比，抗生素治疗组的细菌显着减少了数百至数千倍（图5H）。此外，吗啡和人参皂甙Rg1并没有改变B.vulgatus对抗生素的反应。6.肠道微生物组的消耗影响色氨酸代谢并抑制 Rg1 诱导的基因表达接下来检测了抗生素混合物治疗对吗啡诱导的CPP小鼠代谢物和代谢途径的影响。偏最小二乘判别分析(PLS-DA)模型显示，在粪便中的代谢物方面，对照组和ABX组之间的簇显着分离（图6A）。值得注意的是，抗生素治疗后ABX、AM和AMRH组之间没有明显的代谢物聚集。我们专注于色氨酸代谢途径，并观察到参与色氨酸代谢的代谢物被ATM显着改变。然而，在ABX、AM和AMRH中未观察到显着变化。因此，这些数据表明抗生素治疗强烈降低了粪便中色氨酸代谢物的水平（图6C），并且由吗啡和Rg1引起的代谢改变被消除。此外，在血清中，PLS-DA结果显示四组（对照组、ABX、AM和AMRH）的代谢物谱不同（图6B）。ATM显着改变了色氨酸代谢物。值得注意的是，与 ABX小鼠相比，注射吗啡的小鼠的代谢物发生了相当大的变化。具体而言，与 AM组相比，色氨酸代谢物在Rg1处理后没有显示出显着变化（图6D）。我们发现 Rg1治疗组和模型组在ABX治疗后肠道色氨酸和血浆血清素水平没有差异（图6E和F）。随后，我们发现微生物组消耗抵消了 Rg1在CPP小鼠海马体中诱导的变化（图6G-L）。Rg1治疗未能逆转5-HT、多巴胺、5-HTR1B/5-HTR2A 和BDNF-TrkB信号通路。7.B.vulgatus 协同增强人参皂苷 Rg1 抑制吗啡诱导的小鼠 CPP因为肠道B.vulgatus 减少和增加与吗啡诱导的CPP增加和Rg1降低CPP一致，并且在抗生素处理的小鼠中消除了人参皂苷Rg1对CPP的改善，我们探讨了B.vulgatus 是否在吗啡中起作用依赖。作为典型的拟杆菌属物种，普通拟杆菌是小鼠肠道中的主要细菌物种，我们试图确定普通拟杆菌是否会影响CPP进展。我们首先使用抗生素治疗来消耗肠道微生物群，然后再用B.vulgatus 定植。在吗啡诱导的CPP小鼠模型中检查B.vulgatus 对吗啡成瘾的影响（图7A）。抗生素治疗或B.vulgatus 移植没有显着改变体重（图7B）。单独使用B.vulgatus (AMBV) 进行灌胃显着降低了白框中的停留时间和轨迹百分比，而吗啡则增加了该百分比（图7C、7D）。值得注意的是，与B.vulgatus 和人参皂苷Rg1(AMBVR)共同治疗的小鼠在药物配对隔室中的停留时间和轨迹百分比显着降低。这些数据清楚地表明AMBVR在抑制CPP方面比AMBV取得了更好的功效。值得注意的是，在我们的研究中，用“吗啡”微生物组(AMF)进行肠道再定殖并没有诱导CPP行为。8.B.vulgatus 可以改变肠道微生物组成小鼠粪便样本的16SrRNA 基因测序揭示了用活的B.vulgatus灌胃肠道微生物群组成的变化。拟杆菌门的相对丰度从AM组的不到20%增加到AMBV组的40%和AMBVR组的60%（图7E）。定量PCR证实，与对照组相比，AMBV和AMBVR组灌胃后肠道中的细菌显着过度生长数百至数万倍（图7F）。这些数据表明，人参皂甙Rg1提高了CPP小鼠中普通双歧杆菌的丰度。9.B.vulgatus 改变了肠道微生物群衍生和宿主色氨酸代谢物对小鼠的粪便和血清进行了代谢组学分析。偏最小二乘判别分析(PLS-DA)显示AM、AMBV和AMBVR组之间完全分离（图8A和D）。热图分析显示，仅用B.vulgatus灌胃导致CPP小鼠代谢物发生显着变化，粪便中有332种代谢物（211种上调和121种下调），血清中有82种代谢物（58种上调和24种下调）。我们对具有已知KEGGID 的332和82种显着不同的代谢物进行了KEGG途径富集分析，并分别鉴定了14和11种富含色氨酸代谢的代谢物。同时，将AMBVR与AM组进行比较，粪便中的313种代谢物（237种上调和76种下调）和血清中的82种代谢物（44种上调和38种下调）在与普通芽孢杆菌和人参皂甙Rg1共同处理后显着改变。在粪便中发现了13种代谢物，血清中发现了11种代谢物富集到色氨酸代谢，AMBV和AMBVR都改变了肠道微生物群衍生和宿主色氨酸代谢。我们随后检查了粪便和血清中由AMBV和AMBVR改变的色氨酸代谢物的相对丰度（图8B，C）。用B.vulgatus 灌胃下调色氨酸和血清素水平（图8E-I和9B）。10.B.vulgatus 协同增强人参皂甙-Rg1 诱导的吗啡诱导的海马 5-羟色胺能变化的抑制作用最后，为了证实人参皂甙Rg1通过影响肠道微生物群衍生的色氨酸代谢-血清素途径来减轻吗啡依赖，我们测定了海马和血清中5-HT、多巴胺和GABA的水平。CPP小鼠中血清素和多巴胺的血浆浓度较低，而GABA的血浆浓度高于单独用普通双歧杆菌灌胃或与Rg1共同治疗的小鼠（图9A-D）。值得注意的是，AMBVR小鼠的海马5-HT浓度显着低于AM小鼠。qPCR进一步证实了血清素受体和BDNF-TrkB的mRNA水平升高。我们观察到5-HTR1B、5-HTR2A和BDNF-TrkB的表达被B.vulgatus 定植和Rg1处理有效抑制（图9E、F）。研究结论该研究表明人参皂苷Rg1对吗啡依赖的改善作用与肠道微生物群有关。此外，我们发现微生物组的消耗和拟杆菌的补充可以影响吗啡依赖性并影响Rg1的功效，伴随着色氨酸代谢和5-羟色胺的变化。该研究结果提供了一个新的框架来理解中药通过肠道微生物群-色氨酸代谢和血清素能系统拮抗吗啡成瘾的机制，可能会带来新的诊断和治疗策略。

瓜氨酸化是影响蛋白质结构和功能的关键的翻译后修饰。尽管它与各种生物过程和疾病发病紧密相关，但由于缺乏有效的方法来富集、检测和定位该翻译后修饰，其潜在机制仍然知之甚少。近期，威斯康星大学麦迪逊分校李灵军教授课题组报道了生物素硫醇标签的设计和开发，该标签能够通过质谱法对瓜氨酸化进行衍生化、富集来实现可靠的鉴定。作者对小鼠组织的瓜氨酸化蛋白质组进行了全局分析并且从432种瓜氨酸化蛋白质中识别出691个修饰位点，这是迄今为止最大的瓜氨酸化数据集。作者发现并阐述了这个翻译后修饰的新的分布和功能并且表示该方法有希望为进一步破译瓜氨酸化的生理和病理作用奠定基础。这项工作以“Enabling Global Analysis Of Protein Citrullination Via Biotin Thiol Tag-Assisted Mass Spectrometry”为题发表在国际化学权威杂志Analytical Chemistry上 (https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c03844)，文章作者为Yatao Shi#, Zihui Li#, Bin Wang#，Xudong Shi , Hui Ye, Daniel G. Delafield, Langlang Lv, Zhengqing Ye, Zhengwei Chen, Fengfei Ma，Lingjun Li*。此外，李灵军教授课题组进一步拓展了此方法的实用性。作者通过应用二甲基化亮氨酸(DiLeu)等重标记策略第一次实现了瓜氨酸化的高通量定量研究，并利用这一方法揭示了瓜氨酸化在人体细胞DNA损伤及修复过程中的重要作用。相关成果以“12-Plex DiLeu Isobaric Labeling Enabled High-Throughput Investigation of Citrullination Alterations in the DNA Damage Response”为题同样发表在Analytical Chemistry上(https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c04073)，文章作者为Zihui Li, Bin Wang, Qinying Yu, Yatao Shi, Lingjun Li*。　　研究的主要内容　　作者设计了一种生物素硫醇标签，它可以很容易的以低成本合成并且可以与瓜氨酸残基和2,3-丁二酮发生特异性反应(图 1a)。这种衍生化不仅增加了质量转移以允许更可靠的鉴定，而且还引入了生物素部分，使修饰分子的后续富集成为可能。该生物素硫醇标签设计具有紧凑的结构，在高能碰撞解离 (HCD) 期间仅产生两个碎片/诊断离子(图 1b)。 因此，肽主链可以保持良好的裂解效率，并在 HCD 或电子转移解离 (ETD) 期间分别产生丰富的b/y或c/z离子系列。在 HCD(图 1c)、ETD或电子转移/高能碰撞解离(EThcD)碎裂下，衍生化肽标准品的序列收集质谱图几乎完全覆盖相应的肽序列。实验结果表明生物素硫醇标签衍生的瓜氨酸化肽可以产生用于解析及标注的高质量的串联质谱图，并且与各种裂解技术相结合时可以提高瓜氨酸化位点的识别可信度。　　图1|用于瓜氨酸化分析的生物素硫醇标签设计。a，使用生物素硫醇标签和 2,3-丁二酮对瓜氨酸肽进行衍生化。 b，HCD、ETD 或 EThcD 片段化后生物素硫醇标签衍生的瓜氨酸化肽的片段化位点。c，HCD 裂解后生物素硫醇标签衍生的瓜氨酸肽标准品 SAVRACitSSVPGVR 的串联质谱图。　　在接下来的实验中作者使用该生物素硫醇标签和基于质谱的自下而上的蛋白质组学方法对瓜氨酸化进行分析(图2a)。作者在体外利用 PAD(一种可以催化瓜氨酸化的酶)催化的人组蛋白 H3 蛋白来验证这个过程。作为未被PAD催化的阴性对照，未发现组蛋白的肽段被鉴定为瓜氨酸化，证明了生物素标签反应的高特异性(图 2b)。在体外 PAD 处理后，作者 发现许多精氨酸残基被催化为瓜氨酸，并且大量的位点被高可信度的鉴定为瓜氨酸化位点(图 2c)，进一步表明该方法的高效性。在 HCD 碎裂后，其产生了一系列丰富的 b/y 离子，可以帮助准确的表征在同一肽段上单个(图 2d)以及多个(图 2e)瓜氨酸化位点。　　图2|使用生物素硫醇标签进行体外瓜氨酸化分析。a，使用生物素硫醇标签进行蛋白质瓜氨酸化分析的实验工作流程。b、c，在体外 PAD 处理之前 (b) 和之后 (c) 组蛋白 H3 蛋白的瓜氨酸化分析。 已识别的瓜氨酸化位点在序列中以蓝色字母突出显示。 序列下方的红色矩形表示鉴定的瓜氨酸化肽，而瓜氨酸化位点以蓝色显示。 d，PAD处理的组蛋白 H3 (R64Cit) 的已鉴定瓜氨酸化肽的串联质谱图示例。 e，PAD 处理的组蛋白 H3 的同一肽上鉴定的两个瓜氨酸化位点(R70Cit 和 R73Cit)的串联质谱图示例。　　接下来，作者们尝试利用所开发的方法对复杂的生物样本中的瓜氨酸化进行全局分析，并希望能够以此提供阐明生物体中瓜氨酸化调节机制的依据。首先，作者对小鼠的六个身体器官和五个大脑区域进行了深入的瓜氨酸组分析，生成了第一个小鼠瓜氨酸组组织特异性数据库。作者从432种瓜氨酸化蛋白质中以高置信度的方式鉴定了691个瓜氨酸化位点(图 3a)。更重要的是，这些蛋白质中约有 60% 未曾在UniProt 数据库检索并被报道，这一结果极大地扩展了对瓜氨酸化以及这些底物蛋白质如何受到瓜氨酸化影响的理解。作者发现结果中与 UniProt 数据库的已知的瓜氨酸位点重叠部分较少(图 3b)，这可能是因为 UniProt 中描述的近 40% 的瓜氨酸化位点是基于相似性外推理论而没有实际的实验证据。此外，许多报道的位点位于组蛋白上，尤其是蛋白质末端，可能会逃过自下而上质谱策略的检测(图 3b)。图 3c 展示了单位点瓜氨酸化和多位点瓜氨酸化蛋白质分布情况，其中 70% 的已鉴定蛋白质仅有一个瓜氨酸化位点被检测到。　　这个新发现的瓜氨酸化蛋白质组为推测瓜氨酸化的调控机制提供了宝贵的资源。例如，作者在髓鞘碱性蛋白(MBP)上鉴定到了九个瓜氨酸化位点，而在 UniProt 数据库中只有四个(图3d)。作者的结果提供了高质量的串联质谱图，不仅证实了已知修饰位点的存在(图3e)，而且还高可信度的识别了未知的位点(图 3f)。然后作者进行了瓜氨酸化肽段的序列分析，发现在鉴定的瓜氨酸化位点两侧并没有高度保守的氨基酸序列模式(图3g)，但是谷氨酸残基更频繁地出现在瓜氨酸的N末端侧附近。这与Fert-Bober 等人报道的小鼠瓜氨酸组分析结论一致。另一方面，Tanikawa 等人发现在人体组织和血浆中大约五分之一的 PAD4 底物含有 RG/RGG 基序。同样，Lee 等人及相关研究人员观察到天冬氨酸和甘氨酸残基在瓜氨酸化位点出现频率偏高。值得注意的是，这些研究使用了不同的人源细胞系或组织，因此作者的结果可能表明在不同物种之间瓜氨酸化位点周围的序列模式是不同的。为了更好地辨别瓜氨酸化蛋白质所涉及的功能，作者展示了基因本体论(GO)富集分析的热图，其显示了二十个最显著富集的细胞成分(图3h)以及KEGG途径(图3i)。作者发现小鼠大脑组织和身体器官之间存在明显差异，而瓜氨酸蛋白更多地参与大脑功能。具体来说瓜氨酸化蛋白质集中在轴突、髓鞘、核周体和突触中，因此在中枢神经系统中可能发挥着重要的作用。　　图3|不同小鼠组织的大规模瓜氨酸组分析。a，不同小鼠组织中已鉴定的瓜氨酸化蛋白和瓜氨酸化位点的数量。 b，本研究中鉴定的瓜氨酸化位点与 UniProt 数据库中报告的位点比较。 c，每个鉴定的瓜氨酸化蛋白质的瓜氨酸化位点数量分布。d，本研究中确定的瓜氨酸化位点与 UniProt 数据库中关于髓鞘碱性蛋白的瓜氨酸化位点的比较。e、f，在髓磷脂碱性蛋白 R157Cit (e) 和 R228Cit (f) 上鉴定的两个瓜氨酸化位点的示例串联质谱图。g，鉴定的瓜氨酸化肽的序列。瓜氨酸化位点位于中间的“0”位置。字母的高度表示每个氨基酸在特定位置的相对频率。 h,i，使用 Metascape 生成的热图显示不同小鼠组织中显着丰富的(p 值 0.01)细胞成分 (h) (KEGG) 通路 (i)。　　为了进一步拓展该方法的实用性，作者应用了二甲基化亮氨酸(DiLeu)等重标记策略，第一次实现了对瓜氨酸化进行高通量的定量研究。作者首先使用瓜氨酸化标准肽段进行测试，证明在优化反应条件下DiLeu标记和生物素硫醇标记反应可以分步进行而不互相干扰(图 4B，4C)。同时，将标准肽段按照已知比例进行4-plex DiLeu标记并混合，再进行生物素硫醇标记和瓜氨酸化分析，结果显示了非常好的定量准确性(图5)。作者进一步优化了运用该方法在复杂生物样品中进行定量分析的实验方法，并且证明此方法依然可以实现极佳的定量准确度和精确度(图6)。　　图4|瓜氨酸化标准肽段测试DiLeu标记和生物素硫醇标记分步反应的特异性和效率　　图5|瓜氨酸化标准肽段测试DiLeu标记和生物素硫醇标记定量分析的准确性　　图6|复杂生物样品测试DiLeu标记和生物素硫醇标记定量分析的准确度和精确度　　作者接下来应用该方法对DNA损伤中瓜氨酸化的作用进行了研究。作者在MCF7细胞中用三种方法造成了DNA损伤，并定量分析了蛋白质瓜氨酸化的变化。作者一共鉴定到63种瓜氨酸化蛋白以及其包含的78个瓜氨酸化位点，并发现三个实验组中的瓜氨酸化表达相比于对照组呈现出非常不同的趋势(图7A)，这一结果表明瓜氨酸化在不同类型的DNA损伤模型中具有差异性的作用。通过对实验组中显著变化的瓜氨酸化蛋白进行生物过程网络分析，作者发现瓜氨酸化主要对DNA代谢，蛋白结构变化，翻译以及DNA修复等过程进行调控(图 7B，7C)。该实验结果表明蛋白瓜氨酸化对DNA损伤以及相关发病机理具有非常重要的作用。　　图7|高通量定量分析研究瓜氨酸化在DNA损伤中的变化及作用(来源：Anal. Chem.)　　小结　　本文章介绍了一种生物素硫醇标签的设计和开发，该标签可与瓜氨酸化肽段发生特异性反应并极大地提高了瓜氨酸化的富集和检测效率。在使用标准肽和重组蛋白证明该方法的有效性后，作者进一步优化了从复杂生物样品中检测瓜氨酸化的实验过程。通过此方法对小鼠五个大脑区域和六个身体器官的蛋白质瓜氨酸化进行分析，作者鉴定出432个瓜氨酸化蛋白以及691个瓜氨酸化位点，这是迄今为止最大的数据集。该研究揭示了这种翻译后修饰可能在神经系统中发挥的关键作用，并表明它们在包括呼吸和糖酵解在内的许多代谢过程中也可能发挥着重要作用。总的来说，实验结果表明蛋白质瓜氨酸化在不同组织中具有广泛分布并参与各种生物过程，这扩展了目前对蛋白质瓜氨酸化生理作用的认知和理解。此外，作者进一步拓展了此方法的实用性，通过应用DiLeu等重标记策略第一次实现了瓜氨酸化的高通量定量研究，并利用这一方法揭示了瓜氨酸化在人体细胞DNA损伤及修复过程中的重要作用。更重要的是，该方法可以提供一种普适、简单而强大的检测方法来明确鉴定蛋白质瓜氨酸化，这也将启发和有益于未来对这种翻译后修饰在生理和病理条件下的功能作用的研究。　　相关研究成果近期发表在Analytical Chemistry上的两篇文章中, 通过生物素硫醇标签辅助质谱法对蛋白质瓜氨酸化进行全局分析文章的共同第一作者是威斯康星大学麦迪逊分校博士生石亚涛，李子辉，王斌，并与中国药科大学叶慧教授课题组合作 应用二甲基化亮氨酸等重标记策略进行蛋白质瓜氨酸化高通量定量研究文章的第一作者是威斯康星大学麦迪逊分校博士生李子辉，两篇文章通讯作者为李灵军教授。更多关于李灵军教授研究团队的最新研究进展欢迎登陆课题组网站：https://www.lilabs.org/

合成生物学正在引领第三次生物技术革新，其作为底层技术将驱动多个领域的创新发展，包括医药、食品、农业、材料、环境甚至信息存储等。合成生物学是生物学工程化高度交叉的前沿学科研究域，包含几个不同的研究层次：认识生命、改造生命和创造生命；要想实现其终极目标，还需要在生命本质探索及相关技术的不断创新与应用上持续深入。我们将紧跟合成生物学领域的前沿研究进展，为大家系列解读该领域的最新科研成果。本期分享植物酶功能研究新方法，酶功能的深入认识将为下一步异源设计细胞工厂提供重要依据。研究成果来自中国科学院深圳先进技术研究院合成基因组学研究中心的赵乔研究员课题组在 Molecular Plant 上发表的题为“Glycosides-specific metabolomics combined with precursor isotopic labeling for characterizating plant glycosyltransferases”的研究论文[1]，为大家介绍一种特异针对糖基化合物的代谢组（glycosides-specific metabolomics，GSM）和同位素标记前体化合物示踪（precursor isotopic labeling，PIL）相结合的方法，可以高效、准确鉴定糖基转移酶（glycosyltransferases，GTs）在植物体内的产物，解析 GTs 在特定代谢通路中的作用。该方法极大缩小了目标化合物的范围，在糖基化合物定性、方法可靠性方面较传统生化手段或非靶向方法有较大提升，为植物糖基转移酶的功能解析提供了新手段。专家解读核心信息赵乔研究员中国科学院深圳先进技术研究院合成所合成基因组学研究中心主任。于美国俄亥俄州立大学植物系 Iris Meier 实验室取得博士学位后，在美国 Noble Foundation 美国科学院院士 Richard Dixon 实验室从事博士后研究。主要研究领域是植物天然产物的合成以及调控机制。已在该领域取得了一系列重要的成果，共发表 SCI 论文 30 余篇，累计他引 1500 次，其中第一或通讯作者的文章发表在包括 Molecular Plant、PNAS、Plant Cell 以及 Trends in Plant Science 等国际专业期刊上。“植物的次生代谢物种类繁多且修饰丰富，其中糖基化修饰在提供结构基础的同时也为其多样化的生物学功能发挥了重要作用。为了有效鉴定糖基化过程，需要使用高分辨质谱进行非靶向的特异性代谢组学研究，同时结合同位素标记来跟踪不同糖苷代谢物在突变体中的示踪结果以分析 UGTs 的功能，进而全面表征植物糖基化修饰的次级代谢物，为拓展天然化合物的高效生物合成提供依据。”酶功能研究及植物次级代谢产物鉴定的挑战植物中含有丰富的次级代谢产物，种类超过 40 万种。糖基化是一种常见的修饰方式，赋予化合物复杂且多样的结构，形成种类繁多的糖基化产物。糖基化修饰可以改变相应苷元的催化活性、溶解性、稳定性及其在细胞中的定位，在调节激素的稳态平衡，外源有害物质解毒，抵御生物和非生物胁迫中都发挥着重要的作用。同时，糖基化修饰可以改变天然产物的药理活性和生物利用率等性质，这些糖苷类化合物是天然药物的重要来源。植物 UGTs（UDP 糖基转移酶）以多基因家族的形式存在，它们能够利用不同的糖基供体，糖基化多种多样的植物小分子化合物。目前的研究多数集中在生化功能的确定上，UGTs 具有底物杂泛性和催化杂泛性，同一个 UGT 在体外可以催化结构不同的底物，且不同的 UGTs 可以识别同一种的底物。此外，由于植物体内的底物可得性和特殊且复杂多变的细胞环境，这些通过生化方法对 UGTs 活性、生理功能等的研究结果往往不能反映 UGTs 在植物体内的真实功能。GSM-PIL 方法实现对植物糖基化修饰次级代谢物的高效、准确鉴定非靶向特异性代谢组学（GSM）：基于内源碰撞诱导解离（ISCID）的中性质量丢失模式建立非靶向特异性代谢组学方法，以对糖基化修饰的次级代谢物进行针对性分析。该 GSM 方法可将受到 UDP 糖基转移酶（以 UGT72Es 为例）影响的代谢物范围从 1000 种缩小至 100 个。同位素标记前体化合物示踪（PIL，代谢流）：使用同位素标记的苯丙氨酸前体对 UGT72E 在特定的苯丙氨酸代谢通路中的作用进行示踪分析，可进一步将目标产物范围缩小到 22 个。图 1. GSM-PIL 方法解析 UGT72Es 在植物体内的功能GSM-PIL 方法的适用性及可靠性通过 GSM-PIL 方法，不但可以鉴定到已发表的两种木质素单体糖基化产物，还发现 UGT72E 家族参与植物苯丙烷通路中其他 15 种化合物的糖基修饰作用。进一步通过 UGT72Es 的体外酶活分析，植物内源基因过表达以及遗传互补等实验证实 UGT72Es 对这些化合物的糖基化作用，验证了 GSM-PIL 方法的可靠性。同时，该研究还发现了 UGT72Es 在植物体内对香豆素的糖基化作用，进而在植物碱性缺铁胁迫环境下发挥重要作用。最后，通过 UGT78D2 的功能解析，展示了 GSM-PIL 方法的普遍适用性。高分辨质谱结合数据高效提取软件协助 GSM-PIL 方法建立为了确保糖基化修饰的次级代谢物以及同位素示踪化合物的的高效检测，本研究采用安捷伦 6546 QTOF LCMS 系统进行数据采集；进一步结合 MassHunter、Profinder 数据处理软件对代谢组和同位素示踪数据进行有效提取和解析。图 2. 基于高分辨质谱的 GSM-PIL 方法建立 结 语 综上，基于液相-高分辨质谱的 GSM-PIL 方法可以高效解析 UGTs 在植物体内的功能。相对于传统一对一“钓鱼”式地探索 UGTs 功能，GSM-PIL 方法可以“捕鱼”式地一网打尽 UGTs 的产物，全面鉴定未知的底物或糖基化产物，解析 UGTs 在植物中未知的生理功能，揭示了植物中的糖基化网络比我们想象中更复杂。同时该方法可用于探索其他代谢途径，帮助人们进一步了解、进而利用植物合成途径，为拓展天然化合物的高效生物合成提供依据。参考文献：[1] Jie Wu, Wentao Zhu, Xiaotong Shan, Jinyue Liu, Lingling Zhao and Qiao Zhao. Glycosides-specific metabolomics combined with precursor isotopic labeling for characterizating plant glycosyltransferases. Molecular Plant 15, 1517-1532.

大家好，本周为大家分享一篇在Analytical Chemistry上发表的文章：Hydrogen−Deuterium Exchange Epitope Mapping of Glycosylated Epitopes Enabled by Online Immobilized Glycosidase[1]，文章的通讯作者是来自弗罗里达大学的Patrick R. Griffin教授。　　氢氘交换质谱(HDX-MS)是一种常用的抗体表位定位方法。在典型的HDX-MS实验中，目标蛋白在D2O缓冲液中孵育，使氢与氘在设定的时间内交换。随后通过添加低pH“猝灭”缓冲液，在低温(0 ̊C)并保持pH接近2.7的情况下猝灭氘代反应， 使得氘化酰胺氢的回交速率最低。蛋白质结构的不同特征可以影响氘交换速率，其贡献因素包括溶剂可及性和酰胺骨架的氢键。蛋白质被耐受低pH慢交换条件的蛋白酶消化，所得肽通过液相色谱联用质谱(LC-MS)分析。通过比较氘代肽段与未暴露于D2O的对照肽的同位素分布的m/z位移，用质谱法监测肽水平上的氘交换程度。　　蛋白糖基化可导致HDX-MS中肽覆盖范围的减少，这是由于多糖对肽的异质修饰。为了获得可以通过质谱监测的确定的糖肽质量，在HDX-MS实验之前，必须首先通过专门的糖蛋白组学方法解决糖肽的结构。此外，糖基化氨基酸通常在每个位点被多个糖型修饰，这可能导致糖肽的质谱信号被稀释。聚糖酰胺基团也可能参与交换和影响氘摄取测量，这个问题很明显，特别是对于病毒刺突蛋白，它们已经进化到通过N-聚糖的广泛修饰来逃避免疫检测。在许多涉及SARS-CoV-2的HDX-MS研究中，特别是当快速结果至关重要时，糖基化位点从分析中被省略。SARS-CoV-2 RBD(受体结合区域)含有N331和N343两个N-聚糖，几个靶向RBD并且识别包括N343在内的表位的中和单抗(例如S309、SW186、SP1-77和C144)的对应信息在HDX-MS中均无法被识别。　　酶解后去除氘代肽段上的N-聚糖是一种很有前途的方法，可以避免与糖基化相关的问题。最近发现了从PNGase A和PNGase H+到高活性的PNGase Dj和PNGase Rc，并应用于HDX的一系列有活性的耐酸酶。这些酶通常用于糖肽溶液中进行去糖基化。本文中作者将PNGase Dj固定在醛修饰的聚合物树脂上，并封装在HPLC保护柱中，该柱可直接并入典型的HDX平台。并应用该系统获得了S蛋白RBD的全序列覆盖，并显示了mAb S309的广泛作用位点，包括RBD的N343聚糖位点。　　作者首先在大肠杆菌32中表达PNGase Dj，并将其固定在POROS树脂上，这是一种具有大表面积的聚合物树脂，HDX实验室通常使用这种树脂固定胃蛋白酶和其他蛋白酶。POROS 20 Al是一种醛修饰树脂，可以通过席夫碱形成和随后的氰硼氢化物还原与赖氨酸侧链偶联。虽然猪胃蛋白酶A通常固定在POROS树脂上，但它只含有1个赖氨酸，必须在pH 5.0固定，这低于偶联反应的最佳pH。作者认为含有7个赖氨酸且在中性pH下稳定的PNGase Dj可能更有效地与树脂偶联。在pH为6.5的条件下固定化树脂，洗涤后的树脂装入微孔保护柱中，然后PNGase Dj在树脂上的活性用酶解糖基化比色法测定。1 mg树脂对PNGase Dj的活性为0.79 μg [95% CI: 0.66, 0.92]。作者探究了不同的缓冲体系对于色谱柱活性的影响(图1)。固定化酶最容易受到胍HCl的抑制，并对还原剂TCEP表现出抗性。　　图1. 固定化PNGase Dj的糖肽脱糖基化研究。(A)不同缓冲液中糖肽的去糖基化。x轴上的数字对应于去糖基化条件的列表。(B)在PNGase Dj处理的样品中，去糖基化肽的信号大大增强。(C)图中每对柱状图显示了chaotrope/TCEP注射后分别注射了参考缓冲液。(D)糖肽在50 mM NaH2PO4和25 mM TCEP中在12°C下的代表性EICs。强度根据每个地块进行缩放。　　在确认PNGase Dj的活性后，作者评估了三种糖蛋白的去糖基化柱:HRP(horse radish peroxidase)，牛胎蛋白A和AGP(α-1-acid glycoprotein)。由于糖肽的去糖基化速度比完整的蛋白质快，作者采用了双柱设置，蛋白质首先通过胃蛋白酶柱，然后进入去糖苷酶柱。为了简化设置，还使用了混合柱，其中单柱含有9:1的胃蛋白酶和PNGase Dj树脂混合物。与胃蛋白酶和PNGase Dj混合柱也可能促进蛋白质水解，去糖基化使胃蛋白酶进一步进入裂解位点。可以观察到N-聚糖位点的覆盖(图2)，而这些位点在单独用胃蛋白酶消化时缺乏覆盖。用PNGase Dj处理的样品显示N-聚糖天冬酰胺脱酰胺，而单独用胃蛋白酶处理的样品未检测到脱酰胺肽。在所有情况下，PNGase Dj的加入提高了覆盖率，混合床的结果与双柱的结果相当。混合柱系统还显示末端靠近N-聚糖位点的肽，表明去糖基化可能允许胃蛋白酶在聚糖位点附近进一步切割。　　图2. 糖蛋白AGP、胎蛋白A和HRP的LC - MS/MS肽覆盖。(A) AGP肽覆盖图。n -聚糖位点用箭头标记。(B)检测到的脱酰胺肽数。(C)每个糖蛋白序列的覆盖率百分比。　　接下来，作者使用HDX-MS分析SARS-CoV-2 RBD序列与单克隆抗体的相互作用。S309是从先前感染SARS-CoV-1的患者的B细胞中分离出来的抗体，与SARSCoV-2交叉反应。S309与S三聚体之间的相互作用通过低温电子显微镜(cryo-EM)进行了表征，结果显示S309能够识别靠近N343聚糖的RBD上的一个表位，包括与聚糖本身的接触。作者用混合床胃蛋白酶/ PNGase Dj柱对RBD-Fc融合蛋白进行酶切，并与胃蛋白酶柱进行比较。发现混合柱可以完全覆盖RBD序列，而胃蛋白酶柱在N331和N343聚糖区域缺乏覆盖(图3)。　　图3. 与单独使用胃蛋白酶相比，胃蛋白酶/PNGase Dj混合床的SARS-CoV-2 RBD肽覆盖率。多肽的Mascot ionscore≥20。胃蛋白酶消化在N331和N343聚糖附近没有覆盖。RBD-Fc蛋白的RBD区域如图所示。　　随着RBD序列的全面覆盖，作者进行了差分HDX-MS实验，评估在存在和不存在S309的情况下RBD上的氘代情况。HDX-MS结果显示，在序列上的所有N-聚糖位点都检测到去糖基化肽，并且N343和N630两个位置都显示有多个重叠的去糖基化肽。S309的结合使得氘交换减少，这种保护作用最大程度的集中在N343聚糖周围，从残基338到350。ACE2受体结合基序(RBM，由438~506残基组成)边界上的434~441残基也有被保护效应。RBD以Fc融合蛋白的形式存在，但在Fc标签中没有观察到显著的HDX差异。这些结果与通过冷冻电镜鉴定的表位一致。该工作的作者鉴定出RBD残基337~344、356~361和440~444是S309的表位，此外，还观察到RBD的C端附近残基516~533的氘交换减少。虽然该序列不直接与S309相互作用，但RBD上的2个残基521~527与358~364广泛接触，这可能引起了S309结合后的变构变化。　　总的来说，作者认为PNGase Dj固定在POROS树脂上提供了一种增加序列覆盖的直接方法，使得HDX-MS分析糖蛋白时，允许氢氘交换后去糖基化。这里采用的固定方法可能也适用于其他体系，例如PNGase Rc。此外，研究的结果显示，将PNGase Dj与胃蛋白酶混合使用的序列覆盖率要高于单独使用胃蛋白酶。PNGase Dj可以识别RBD中与S309结合的的糖基化表位，并且结果与冷冻电镜结构密切一致。　　撰稿：李孟效　　编辑：李惠琳　　文章引用：Hydrogen−Deuterium Exchange Epitope Mapping of Glycosylated Epitopes Enabled by Online Immobilized Glycosidase　　参考文献　　1. O'Leary, T.R.R., Balasubramaniam, D., Hughes, K., et al. Hydrogen-deuterium exchange epitope mapping of glycosylated epitopes enabled by online immobilized glycosidase. Analytical Chemistry，2023.

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry的文章，In-Depth Characterization of mAb Charge Variants by On-Line Multidimensional Liquid Chromatography-Mass Spectrometry[1]。本文的通讯作者是中国复宏汉霖生物制品有限公司的刘卓宇博士。　　重组单克隆抗体(mAbs)正成为肿瘤和自身免疫性疾病最成功的治疗方法之一。与传统的小分子药物不同，抗体在电荷、大小和糖型上都非常不均匀。单克隆抗体的电荷异质性通常是由细胞培养、纯化和储存过程中发生的翻译后修饰(PTM)引起的。电荷变异由于其对单克隆抗体的安全性和有效性的潜在影响而引起了人们的注意。CEX通常用于组分收集，以收集纯化的变体进行结构征，然而，在CEX分离中使用的非挥发性离子试剂与MS检测器直接耦合时，往往会造成电离抑制和污染。为了避免这些问题，CEX馏分应在进一步LC-MS分析之前进行脱盐和浓缩。传统的峰收集、纯化和随后的组分表征方法是劳动密集型和耗时的，组分在这么长的时间里不稳定。此外，传统CEX-MS在分析分子量变化较小PTMs时难以进行表征。 在最近的研究中，基于CEX和MS的多维液相质谱技术，已经在研究电荷变异体上展现了诸多优点。通过CEX的组分收集和MS的分析，多维液相质谱实现了对电荷变异体的实时表征，在缩短了检测时间的同时，也减少了由于传统手工方法诱导的人工PTMs，并且能够得到之前无法检测到的不稳定的中间体。该技术具有较好的重现性和灵敏度，对PTM的序列可实现高覆盖率的表征。在所开发的方法中，在1D CEX上分离的11种电荷变体在自动进样器中被收集到96孔板中。随后，通过多次进样，将单个馏分装入二维柱上进行预浓缩，以收集适当的量。这种新方法能够自动收集低丰度的多种电荷变体，然后通过不同的在线过程进行彻底的表征，包括分子量分析、肽图谱和Fc-γ-RIIIa受体亲和力评估。　　图1. mAb-A1和mAb-A2的CEX谱。通过优化的纯化工艺去除mAb-A1中的B5-B8峰，以消除信号肽相关变异，命名为纯化抗体mAb-A2。　　如图1所示，mAb-A的CEX图谱显示出较高的电荷异质性，PTM引起的mAb-A1电荷异质性可能对产品的安全性和有效性构成潜在风险。虽然不需要的电荷变体可以通过下游净化过程消除，但变体的去除会显著降低产量，从而增加成本。因此，需要对mAb-A1电荷变体进行深入研究，以确定其对产品质量的影响，并为工艺优化提供信息。研究中，先通过2DLC(CEX × RP-C4)-MS分析鉴定了11个mAb-A1电荷变体，包括2个AP (A1和A2)， 1个MP和8个BP (B1-B8)。一方面，2DLC(CEX × RP-C4)-MS方法具有时间效率，每个峰只需40分钟。另一方面，2DLC(CEX × RP-C4)-MS法省力。省去了传统脱机分析所需的超滤、预富集、脱机还原等人工操作。　　变体在亚单位水平上通过高分辨率质谱初步鉴定。如图2所示，重链的TIC图谱在所有电荷变体中是一致的 通过对HC1和HC2峰的质谱分析，确定了HC上的PTMs，这些PTM是常见的，已报道对抗体的安全性和有效性影响不大。去卷积质谱显示，B5、B6、B7和B8的LC1峰被RVHS-LC2 (Arg-Val-His-Ser-LC2, MWLC2 + 479.5 Da)和TRVHS-LC2 (Thr-Arg-Val-His-SerLC2, MWLC2 + 580.6 Da)的信号肽相关变体所覆盖。由于这些物种在精氨酸残基位点易被色氨酸切割，因此可能在肽图谱中被错误地识别为含有VHS的变异。通过2DLC(CEX × RP-C4)-MS分析，可以很容易地在亚基水平上获得mAb-A1未截断的RVHS和TRVHS变体。　　图2. 2DLC(CEX × RP-C4)-MS分析mAb-A1及其电荷变体的降低分子量。(A)总离子色谱图。(B) LC1的去卷积质谱。在mAb-A1的B5-B8变体中，LC1与未截断的RVHS和TRVHS分离。　　通过4DLC(CEX × RP-C4 × Trypsin×RP-C18)-MS分析鉴定出7个mAb-A2的电荷变体，包括3个ap、1个MP和3个bp。在变体中获得的PTMs包括脱酰胺(图4B)、Pyro Q(图4C)、c端Lys截断/Pro酰胺化(图4D)和Met氧化(图4E)。所有ap均发现HC N55脱酰胺。据报道，HC N55的脱酰胺会影响抗原-抗体结合活性据报道，Fc氧化会影响FcRn结合，对药代动力学(PK)产生负面影响。4DLC(CEX × RP-C4 × Trypsin×RP-C18)-MS的数据采集在1天内完成，以小于0.5 mg的样品表征了mAb-A2的7个变体。mAb-A2的肽图谱序列覆盖率达到90%。　　图3. 4DLC(CEX × RP-C4 × Trypsin×RP-C18)-MS在线肽图谱。(A)经鉴别的重叠色谱图mAb-A2主峰的肽段。(B)所有mAb-A2变异的HC N55脱酰胺。(C) N端谷氨酰胺环化成在所有mAb- A2变异体中HC Q1的焦谷氨酸。(D)在所有mAb-A2变体中，C端HC K450的赖氨酸截断和HC P448的脯氨酸酰胺化。(E) HC M255下蛋氨酸氧化。　　由于Fc-γ-RⅢa的结合亲和力一般与ADCC效价具有良好的相关性，且Fc-γ-RⅢa的结合能力可以反映在Fc-γ-RvⅢa柱上，通过2DLC(CEX × Fc-γ-RⅢa)分析间接监测了mAb-a的电荷变体的生物活性。APs中峰3的丰度高于MP和bp，表明酸性峰具有更好的Fc-γ-RⅢa亲和力。对Fc-γ-RⅢa色谱中mAb-A2的三个峰进行分离，并进行离线N-聚糖分析，以获得准确的糖型分布结果。在峰1、峰2和峰3中观察到聚焦化和半乳糖基化的含量逐渐增加。集中化已被广泛报道可增强ADCC的活性有趣的是，观察到半乳糖基化对Fc-γ-RⅢa亲和力的积极影响，这与先前的研究一致。　　图4 (A)Fc-γ-RⅢa亲和谱图2DLC(CEX×Fc-γ-RⅢa)分析。(B)mAb-A2的N-聚糖谱及其Fc-γ-RⅢa亲和组分 (峰1、峰2、峰3)。　　综上，利用MDLC-MS系统深入表征电荷变体的结构和生物活性，包括分子量、PTMs和Fc-γ-RⅢa亲和力。该过程可以在发现和工艺开发阶段对单克隆抗体进行电荷变异分析。MDLC-MS可以在研发中发挥重要作用，使从DNA序列到新药研究(IND)申请的时间流程缩短。　　撰稿：李孟效　　编辑：李惠琳　　文章引用：In-Depth Characterization of mAb Charge Variants by On-Line Multidimensional Liquid Chromatography-Mass Spectrometry　　李惠琳课题组网址www.x-mol.com/groups/li_huilin　　参考文献　　1. Liu, Z., Y. Cao, L. Zhang, Y. Xu,Z. Zhang.(2023).In-Depth Characterization of mAb Charge Variants by On-Line Multidimensional Liquid Chromatography-Mass Spectrometry. Analytical chemistry.

CellRes. | 突破!黄超兰与高福团队描绘新冠刺突蛋白糖基化图谱,揭示“O-Follow-N”糖基化新规律　　蛋白质糖基化修饰是生物体内最重要的翻译后修饰之一，发生在细胞50%-70%的蛋白上。病毒囊膜蛋白的糖基化修饰具有广泛的功能，包括调控蛋白质稳定性、病毒的趋向性、和保护潜在的抗原表位免受免疫监视等。深入了解新型冠状病毒(SARS-CoV-2)刺突蛋白(Spike, S)的糖基化修饰对于新型冠状病毒肺炎(COVID-19)发病机制的探索，疫苗和治疗药物的设计开发，以及检测试剂盒的生产具有重要意义。此前研究者在体外纯化表达的S蛋白胞外域和从病毒颗粒中提取的S蛋白中共鉴定到了22个N-糖基化修饰位点1,2。而由于技术和样本来源的限制，已有研究仅在纯化的S蛋白上鉴定到了一些O-糖基化修饰位点，截止目前，尚未进行病毒颗粒上S蛋白的O-糖基化修饰的研究。近日，北大-清华生命科学联合中心黄超兰团队，和中国科学院院士高福团队，中国科学院天津工业生物技术研究所高峰团队等开展合作研究，采用基于质谱的糖基化鉴定技术，首次揭示了病毒颗粒上提取的S蛋白O-糖基化修饰图谱，并提出了“O-Follow-N”的O糖基化修饰规律。该研究以“O-glycosylation pattern of the SARS-CoV-2 spike proteinreveals an “O-Follow-N” rule”为题于2021年8月2日线上发表在Cell Research期刊上。为获得天然状态下S蛋白的N-和O-糖基化修饰完整图谱，研究者从SARS-CoV-2病毒颗粒上获得S蛋白，用多种蛋白酶酶解成肽段，采用纳升液相色谱以及具有超高分辨率的Orbitrap Eclipse Tribrid三合一质谱联用仪，利用阶梯能量HCD (stepped collisional energy SCE)，HCD (Higher-energy collisional dissociation) 以及HCDpdEThcD三种碎裂方法进行质谱分析。本研究中，研究者不但成功鉴定到了此前已报道的22个N-糖基化修饰位点，还首次从SARS-CoV-2病毒颗粒中提取的S蛋白上鉴定到了17个O-糖基化修饰位点。值得注意的是，研究者发现在这17个位点中，有11个位点位于糖基化的天冬酰胺(Asn)附近。研究者将NxS/T共有基序内糖基化的Asn每一侧的3个氨基酸定义为“N±1-3”。分析结果显示，11个O-糖基化修饰位点分布在“N±1-3”的位置上，位点信息确定的位点数有10个，其中7个位点分布在“N+2”的位置上。研究者还通过开展定点突变实验进一步证实Asn糖基化修饰的存在是“N±1-3”的位置上出现O-糖基化修饰的先决条件。综上，研究者提出SARS-CoV-2病毒S蛋白的糖基化修饰存在O-糖基化修饰追随N-糖基化修饰发生的现象，并将这一现象命名为“O-Follow-N”规律。　　图. SARS-CoV-2病毒S蛋白的糖基化修饰遵循“O-Follow-N”规律 本研究基于前沿的质谱鉴定技术，揭示了S蛋白的O糖基化修饰谱，提出了O糖基化修饰的“O-Follow-N”规律，这一规律可能适用于其它蛋白，提示O-糖基化修饰具有潜在的新机制，特别是N-和O-糖基化修饰之间可能存在的协同作用，未来有望在极大程度上推动糖生物学领域的研究。此前，黄超兰主任领衔的多组学中心团队还与高福院士领衔的多学科团队紧密合作，揭示早期的新冠感染患者存在显著的免疫抑制，并首次提出COVID-19的发病机制或存在“两阶段”模式3。多组学中心在黄超兰教授的带领下，将继续基于临床，前沿技术和基础学科的深度交叉融合，深耕前沿技术方法开发，为推动基础生物学和临床领域的创新研究提供最有质量保证的蛋白质组和质谱技术手段。中国科学院微生物研究所高福院士，北大-清华生命科学联合中心、北京大学医学部精准医疗多组学研究中心黄超兰教授，北京大学医学部精准医疗多组学研究中心陈扬副研究员，中国科学院天津工业生物技术研究所高峰教授为本文的共同通讯作者 北京大学医学部精准医疗多组学研究中心田文敏博士，中国科学院天津工业生物技术研究所李德林博士，北京大学医学部精准医疗多组学研究中心博士研究生张楠，中国科学院天津工业生物技术研究所博士研究生白桂杰、原恺博士为本文的共同一作。 原文链接：https://www.nature.com/articles/s41422-021-00545-2

新突破新guan肺炎自2019年暴发以来，给全社会带来了灾难性的影响，不仅对quan世界人民的健康造成了巨大威胁，还对全球经济产生了震荡性的影响。因此，对新guan肺炎的研究也显得愈发重要。近期，来自北京大学医学部jing准医疗多组学研究中心的黄超兰团队、中国科学院院士高福团队以及中国科学院天津工业生物技术研究所高峰团队，通过采用基于质谱的糖基化修饰鉴定技术，对新guan肺炎颗粒上S蛋白的O-糖基化修饰图谱进行了整体描绘，进而提出了“O-Follow-N”的O糖基化修饰规律，为新guan肺炎的致病机制探索提供了研究基础。而这项出色的研究，也于2021年8月2日以“O-glycosylation pattern of the SARS-CoV-2 spike protein reveals an“O-Follow-N” rule”为题发表在了Cell Research期刊上。糖基化修饰（Glycosylation）是蛋白质主要的翻译后修饰类型，其广泛参与细胞黏附、识别、信号转导等重要过程，影响蛋白质的分泌、运输和稳态调控，可发生在细胞50-70%的蛋白质上，2021年糖基化修饰鉴定被Nature Methods评为zui值得关注的技术之一。根据糖苷链类型，蛋白质糖基化修饰可以分为四类：（1）N-连接糖基化；（2）O-连接糖基化；（3）C-连接糖基化；（4）糖基磷脂酰肌醇锚定。其中O-糖基化修饰，是在高尔基体中产生。它在人体中有70余种常见糖型，无特定氨基酸结构域。目前，对O-糖基化修饰研究存在许多困难，比如：1糖基化修饰的糖链形成无固定模版；2受200多种糖基转移酶的复杂调控；3糖基化肽段剂量水平低；4规模化糖链结构解析通量低；5糖链构成微不均一性，定性与定量困难；6功能性糖基化位点及关键糖结构指认困难。受这些因素影响，对O-糖基化修饰的研究也是少之又少。现阶段，对于大规模、高通量的蛋白质翻译后修饰的研究，zuihao的途径就是利用基于高分辨质谱的蛋白质组学技术。在这篇报道中，黄教授等团队，就是通过基于质谱的蛋白质组学技术，克服一系列困难，shou次对新guan病毒上S蛋白的O-糖基化进行了综合性描绘。实验中，研究者为获得天然状态下S蛋白的N-和O-糖基化修饰完整图谱，首先从SARS-CoV-2病毒颗粒上获得S蛋白，并使用了LysC+Trypsin, Chymotrypsin, GluC, Elastase 以及 alpha-Lytic等多种蛋白酶将S蛋白酶解成肽段。而对于这种复杂糖蛋白酶解后产生的肽段，普通质谱很难进行检测。研究者则采用了具有超高分辨率的Orbitrap Eclipse 三合一质谱仪，并利用三合一仪器多种碎裂功能中的阶梯HCD（stepped collisional energy SCE），HCD（Higher-energy collisional dissociation）以及组合式的HCDpdEThcD三种碎裂方法进行质谱分析。图1. Orbitrap Eclipse 三合一质谱仪Orbitrap Eclipse三合一质谱仪是一台不仅拥有着CID, HCD, ETD HD, EThcD HD, ETciD, UVPD, PTCR等多种碎裂模式的质谱仪，而且还具有高达50万的分辨率，能够对多种形式的修饰肽段进行jing准定性与定量，为研究者提供了更坚实的硬件基础。研究中，研究者共鉴定到了39个糖基化修饰位点。其中包括此前已报道的22个N-糖基化修饰位点，以及17个O-糖基化修饰位点。值得注意的是，这17个O-糖基化修饰位点是shou次从SARS-CoV-2病毒颗粒中提取的S蛋白上鉴定到的。并且通过深入分析这些位点，研究者发现在这17个位点中，有11个位点位于糖基化的天冬酰胺（Asn, N）附近。为了更准确的对这一现象进行挖掘，研究者将NxS/T共有基序内糖基化的N每一侧的3个氨基酸定义为“N±1-3”。分析结果显示，11个O-糖基化修饰位点分布在“N±1-3”的位置上，位点信息确定的位点有10个，其中7个位点分布在“N+2”的位置上。研究者还通过开展定点突变实验进一步证实N糖基化修饰的存在是“N±1-3”的位置上出现O-糖基化修饰的先决条件。基于以上分析，研究者提出SARS-CoV-2病毒S蛋白的糖基化修饰存在O-糖基化修饰追随N-糖基化修饰发生的现象，并将这一现象命名为“O-Follow-N”规律。图2.新guan病毒S蛋白上符合“O-Follow-N”规律的O糖基化修饰（点击查看大图）小结Summary研究基于前沿的质谱分析技术，通过使用超高分辨的三合一质谱仪Orbitrap Eclipse，揭示了新guan病毒上S蛋白的O糖基化修饰谱，进而提出了O 糖基化修饰的“O-Follow-N”规律，同时这一规律也可能适用于其它蛋白。这个规律提示O-糖基化修饰具有潜在的调控新机制，特别是N-和O-糖基化修饰之间可能存在的协同作用，未来有望在极大程度上推动糖生物学领域的研究。黄超兰（北京大学医学部jing准医疗多组学研究中心主任）问根据您的经验，O-糖基化修饰鉴定的难点在哪里？答对于所有的蛋白翻译后修饰鉴定都普遍存在着几个相同的难点：（1）修饰丰度相对较低，难以直接鉴定，往往需要进行修饰富集，因此对样本量等要求较高；（2）修饰调节为动态变化过程，鉴定重复性会相对低一点。而对于O-糖基化修饰，因其特殊性，又有几个其他因素影响：（1）糖基化修饰的糖链形成无固定模版，且受多种糖基转移酶的复杂调控；（2）规模化糖链结构解析通量低，定性与定量困难；（3）功能性糖基化位点及关键糖结构指认困难。问Orbitrap Eclipse Tribrid三合一质谱联用仪在该研究中发挥了怎样的作用？答在我们的实验体系中，使用了多种蛋白酶对S蛋白进行处理，因此会产生长短不一，形式各异的肽段，而这就要求配套的质谱仪器能够具有多种碎裂模式，而 Orbitrap Eclipse质谱仪就很好地满足了我们的需求。并且Orbitrap Eclipse具有很好的分辨率以及稳定性，这对我们的实验提供了很大帮助。问新guan病毒颗粒上提取的S蛋白O-糖基化修饰图谱的揭示对新xing冠状病毒肺炎的研究有哪些帮助？答我们在实验中发现了“O-Follow-N”变化规律，这对研究糖基化的变化具有很好的提示作用。并且这个规律也显示O-糖基化修饰具有潜在的调控新机制，特别是N-和O-糖基化修饰之间可能存在的协同作用，未来有望在极大程度上推动糖生物学领域的研究。专家介绍黄超兰教授长期致力于质谱和蛋白质组学前沿新技术和方法的研究开发，应用范围包括生物学基础、医学和临床研究，是高度跨界，善于交叉学科整合，战略规划制定和人员管理的quan方位技能科学家。如需合作转载本文，请文末留言。这样的应用图书馆不来了解一下？点击进入小程序完成注册即刻抽取盲盒好礼

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软毛青霉素及相关青霉菌毒素近期，日本著名药企小林制药被推上了风口浪尖，部分消费者在服用该公司含有红曲成分的保健品后，出现肾脏等方面的健康问题，导致小林制药已撤回8种红曲保健品作为功能性标识食品的备案，其中3种商品已经召回。图片图片来源：财经网一般情况下，红曲类保健食品会检测是否含有已知的真菌毒素—桔青霉素。小林制药表示，他们选择的红曲菌不携带能产生桔青霉素的基因，在原材料测试报告中也的确没有检测到桔青霉素。3月29日，小林制药公司向日本厚生劳动省报告，其红曲产品中导致问题的成分可能为“软毛青霉酸（Puberulic acid）”。软毛青霉酸是在发酵过程中由青霉菌产生的天然毒素。据文献报道，从青霉菌发酵液中已分离出软毛青霉酸（Puberulic acid）、密挤青霉酸（Stipitatic acid）及其三种类似物Viticolins A–C等环庚三烯酚酮类（Tropolone）毒素。青霉菌毒素具有耐高温和侵害实质器官的特性，加热烹调也很难使其毒性减弱。目前，有关软毛青霉酸等青霉菌毒素导致的肾脏毒性报道较少，仍需进行相关研究。由于红曲菌在发酵过程中并不能产生软毛青霉素，有专家推测小林制药的红曲产品可能因为原料受到了青霉菌的污染而产生了软毛青霉酸，但具体原因还需后续的调查确认。相信该事件的发生将进一步促进红曲类食品检测的加强，相关检测标准将在不远的将来应运而生。红曲及其用途图片来源：财经网红曲也叫红曲红、红曲霉、红曲米，其作为一种天然发酵产物，成分复杂，包括多种具有生物活性的物质。红曲可应用于制药、酿酒、食品着色等方面，具有悠久的历史和公认的保健价值，特别是在降血脂、降胆固醇方面具有积极效果。目前，国内生产的红曲主要有三类，分别是酿酒红曲、色素红曲和功能红曲。▶ 酿酒红曲的糖化力高、酯化力强、有独特的曲香，广泛用于各种黄酒、白酒、醋、酱的酿造；▶ 色素红曲的色价很高，是纯天然的食品着色剂，通常用于肉制品、腐乳等食品的着色。▶ 功能红曲是指以大米为原料，用纯培养的红曲菌发酵生成的莫纳可林K（又称洛伐他汀，结构式见下图）等生物活性物质的红曲，常被用作防治心血管疾病的保健品和药品的原材料。各大厂商包括小林制药已将红曲米类食品开发为具有降血脂、降胆固醇功能的保健食品。我国对红曲类产品的使用要求红曲色素，属于复合色素，常用红曲添加剂为大米的红曲酶发酵产物或其提取物，为多种天然色素的混合物。目前, 已确定出化学结构的红曲色素主要有6种，包括黄色素、橙色素和红色素，结构如下：随着科学认识的不断深入和对食品安全要求的提高，我国对红曲及其制品的应用和管理日趋严格。国家食品药品监督管理局在《关于以红曲等为原料保健食品产品申报与审评有关事项的通知》中规定，红曲推荐量每日暂定不超过2g，产品中洛伐他汀应当来源于红曲，总洛伐他汀推荐量每日暂定不超过10mg，且不适宜在少年儿童、孕妇、哺乳人群使用等；《GB 2760-2024食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》红曲米及红曲红作为着色剂可用于腐乳、碳酸饮料、果冻、糕点、配制酒等多种食品中，其中风味发酵乳中的最大使用量不得超过0.8g/kg，糕点中的使用量不得超过0.9g/kg，焙烤食品馅料及表面用挂浆不得超过1.0g/kg；另外，《GB 5009.150-2016食品安全国家标准 食品中红曲色素的测定》规定了对风味发酵乳、果酱、腐乳、干杏仁、糖果、方便面制品等食品中红曲红素、红曲素、红曲红胺3种红曲色素的测定方法。值得注意的是，红曲色素（又称红曲红）是发酵产生的多种天然色素的混合物，由于发酵工艺的不同，市售红曲色素所含的色素成分及其含量不尽相同，也并非上述所有常见成分均可检出。另外，GB 5009.150-2016和SN/T 3843-2014标准中将红曲红胺的CAS号3627-51-8写为126631-93-4，而后者对应的名称为N-芴甲氧羰基-8-氨基辛酸（N-Fmoc-8-Aminooctanoic acid），对应的结构式见下图。尽管该化合物的分子式和分子量与红曲红胺完全相同，导致二者在一级质谱的分子离子峰完全相同（均为[M+H]+ = 382, [M-H]- = 380），然而二者的化学结构却差别巨大，因此其核磁谱图和二级质谱上的碎片离子峰有显著差别，在HPLC上的出峰时间和UV吸收也有明显的区别。检测人员在标准物质选择、采购和使用中应多加注意，避免产生错误的检测结果。红曲在发酵过程中可能因菌株变异或污染产生桔青霉素，其有很强的肾脏毒性，摄入过量会导致肾损害，因此桔青霉素是红曲类产品必检项。《GB 1886.181-2016食品安全国家标准 食品添加剂 红曲红》中规定红曲红中桔青霉素的限量为0.04 mg/kg。《GB 1886.66-2015食品安全国家标准 食品添加剂 红曲黄色素》中规定红曲黄色素中桔青霉素的限量为1.0 mg/kg。阿尔塔科技作为被CNAS认可的食品安全检测有机标准物质生产制造商，根据科研单位检测热点，快速响应，积极研发软毛青霉酸、桔青霉素、红曲色素及其相关产品，助力食品安全检测，为守护广大消费者的身体健康保驾护航。 红曲发酵过程可能产生的相关毒素标准品：了解更多产品或需要定制服务，请联系我们

近年来，随着人们对医疗健康行业需求的不断增长，生物制药行业也在随之蓬勃发展。近两年的新冠疫情全球大流行，在改变人们日常生活的同时更是催生了生物制药行业对于先进分析技术的需求。蛋白质分离、纯化和分析是生物治疗药物开发中的关键组成部分，但该过程可能复杂且极具挑战性。而全柱成像等电毛细管电泳（whole column imaged capillary isoelectric focusing, WC-iCIEF）技术，可以根据蛋白质的等电点（isoelectric point, pI）差异将其分离，在此基础上，将iCIEF与高分辨质谱联用，可以借助质谱的高灵敏度、高分辨率和高质量精度使各种蛋白质变异体的鉴定更容易、更准确。从2021年6月开始，我们与蛋白质成像技术专家 Advanced Electrophoresis Solutions Ltd (AES)宣布达成协议，将蛋白质分离技术与质谱相结合，通过简化表征来推进治疗性蛋白质药物的开发。到目前为止，通过将iCIEF技术与高分辨质谱联合使用，我们已经对单抗、ADC和融合蛋白等多种产品进行了各种层面的表征。下图1~3展示了iCIEF技术对单抗\ADC\融合蛋白的分离结果，可见对于不同种类的重组生物治疗性产品，均可根据pI差异将其电荷变异体进行分离，且系统具有优异的稳定性与重现性。图1 iCIEF-UV分析帕博利珠单抗电荷变异体，8针平行进样（点击查看大图）图2 iCIEF-UV分析恩美曲妥珠电荷变异体，3针平行进样（点击查看大图）图3 iCIEF-UV分析依那西普电荷变异体，3针平行进样（点击查看大图）滑动查看更多我们使用的CEInfinite iCIEF平台（AES）除了高质量的iCIEF-UV功能外，还可以与高分辨质谱直接在线串联，直接测定电荷变异体的分子量，无需额外转换接口。下图4展示了我们使用iCIEF-MS直连技术分析帕博利珠单抗的结果，可见即使是pI仅差0.02的碱峰B1和主峰，也可以在iCIEF上得到基线分离，随后的高分辨质谱分子量测定结果显示该碱峰与主峰相比，主要差异是其中一条重链的N端未发生焦谷氨酸环化。另外观察原始质谱谱图不难发现，得益于Orbitrap高分辨质谱的灵敏度，即使是强度比主峰低2~3个数量级的碱峰B3，仍可得到糖型分布清晰的谱图。图4 iCIEF-MS在线直联分析帕博利珠电荷变异体。上，iCIEF-UV分离图谱。中，碱峰B1与主峰解卷积结果镜像图对此。下，主峰与所有碱峰原始质谱图对比。（点击查看大图）与市面上其他供应商相比，AES的CEInfinite iCIEF平台具有一个独特优势：可以实现全自动的馏分收集。我们选择了帕博利珠单抗，对其电荷变异体的每个峰离线收集后进行酶解，随后上样至高分辨液质联用平台进行肽图分析。图5展示了酸/碱峰中各种CQA含量的变化，可见轻重链末端、重链糖型和侧链常见PTM的变化趋势。另外通过表1中分离之前/之后特定CQA含量对比可以很明显的发现，经iCIEF分离后，酸/碱峰中特定修饰的比率有明显增高，可见基于pI差异，将生物治疗性产品的电荷变异体进行分离后，接下来采用肽图进行深入表征的分析策略，能够帮助研究人员将导致电荷异质性的修饰精确定位到氨基酸位点的层面。图5 iCIEF-MS离线收集馏分，酶解肽图分析酸/碱峰中各种CQA含量的变化。上，末端修饰变化。中，重链糖基化修饰变化。下，侧链修饰变化（点击查看大图）表1 iCIEF分离前/后特定CQA含量变化情况对比（点击查看大图）这部分工作已经在2021年的美国质谱年会上发表，有兴趣的读者扫描一下二维码下载原文：在精zhun医疗概念兴起的推动下，对生物治疗性产品表征的需求不断增长，将高分辨质谱与基于电荷异质性的iCIEF蛋白质分离技术相结合，将支持我们的客户实现更精确的分析，在持续开发生物治疗性产品的进程中发挥重要作用。如需合作转载本文，请文末留言

style type="text/css".TRS_Editor P{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }.TRS_Editor DIV{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }.TRS_Editor TD{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }.TRS_Editor TH{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }.TRS_Editor SPAN{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }.TRS_Editor FONT{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }.TRS_Editor UL{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }.TRS_Editor LI{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }.TRS_Editor A{margin-top:0px margin-bottom:12px line-height:1.8 font-family:宋体 font-size:10.5pt }/stylep　　DNA总是受到内源或外源环境中多种损伤因子的攻击，例如DNA复制错误、细胞代谢产物、电离辐射、紫外线照射和化疗试剂等，这些因素都会引起DNA损伤的产生。如果不能够及时有效修复DNA损伤，将导致基因组不稳定性，进而诱发多种人类疾病，如肿瘤、神经退行和出生缺陷。为维持基因组稳定性，生物体进化出一套保护机制来监控DNA损伤并及时修复，这一机制即为DNA损伤应答。/pp　　中国科学院北京基因组研究所郭彩霞研究组与中科院动物研究所唐铁山研究组合作，通过质谱技术发现跨损伤合成DNA聚合酶Polη第457位苏氨酸能发生一种新的蛋白质翻译后修饰：氧连糖基化修饰（O-GlcNAcylation）。已知在紫外线辐射或顺铂等化疗试剂暴露条件下，跨损伤合成DNA聚合酶Polη被招募到复制叉处替换高保真性DNA复制酶，在相应的损伤DNA模板对侧整合正确的核苷酸，从而促进复制叉的继续前行。但与高保真的DNA复制酶相比，Polη复制未损伤DNA模板的错误率显著升高（10sup-2/sup~10sup-3/sup），极易导致遗传信息不能够正确地从亲代细胞传递到子代细胞中，因此它到复制叉的招募和移除必须受到严格调控，然而关于Polη在TLS完成后如何从复制叉解离尚不清楚。研究发现，干扰Polη的氧连糖基化修饰虽不影响其被招募到受阻复制叉处及其在损伤DNA模板对侧整合核苷酸的能力，但显著削弱Polη与CRL4supCDT2/sup E3泛素连接酶之间的相互作用，降低第462位赖氨酸的多泛素化修饰水平，进而抑制p97-UFD1-NPL4复合体所介导的Polη与复制叉分离的过程，导致细胞内突变率上升、细胞对紫外线和顺铂试剂敏感性增强、DNA复制叉移动速率变缓等。该项研究工作揭示了Polη 氧连糖基化修饰与泛素化修饰之间的互作关系，以及DNA复制过程中多种DNA聚合酶转换的分子机制。Polη在多种肿瘤细胞中表达显著升高，与顺铂等化疗药物的耐药性产生密切相关，也与非小细胞肺癌患者的生存期呈负相关。/pp　　该发现首次报道氧连糖基化修饰参与调控细胞跨损伤合成过程并维持基因组稳定性，从DNA损伤应答角度揭示了对营养水平敏感的氧连糖基化修饰调控基因组稳定性和肿瘤耐药性的分子机制，为解决顺铂等化疗药物的耐药性提供新的思路和策略，有望改善部分肿瘤患者的生存状况。/pp　　研究工作以emPolη O-GlcNAcylation governs genome integrity during translesion DNA synthesis/em为题，在线发表在emNature Communications/em上。研究工作获得了国家自然科学基金委、科技部等的资助。/pp style="text-align:center "img alt="" oldsrc="W020171212545298381499.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201712/uepic/afc0a60a-899a-40ca-87bc-2c12afb7ef13.jpg" uploadpic="W020171212545298381499.jpg"//pp style="text-align: center "O-GlcNAc糖基化修饰调控Polη与复制叉解离的分子机制示意图/p

昨天，央视网发出的一条微博引发网友关注。该微博在其他新闻网站转发时，被起了个极为“惊悚”的标题：《别吃方便面，有毒》，微博中称“方便面、乳饮料、薯片、冰激凌、饼干等食品所含的添加剂最多。一包方便面最多可有25种食品添加剂!”事实上，方便面含添加剂不是什么秘密，但多到“有毒”的程度，这让不少年轻网友心惊胆战。　　探访　　一袋方便面20多种添加剂很常见　　不管怎样，央视的这条微博确实引发了不少网友关注。那么，南京市场销售的种类繁多的方便面，是不是每种都含有这么多添加剂呢?昨天，扬子晚报记者进行了探访。　　面饼添加剂写得清楚料包酱包却含糊其辞　　扬子晚报记者注意到，不管是哪种口味的方便面，其配料表都有一大堆的添加剂。关于具体的添加剂的多少，扬子晚报记者选取了不同价位的方便面进行比较。　　价格为1.2元一袋的方便面是南京本地的品牌。在其成分表里，面饼的食品添加剂包括碳酸钠、六偏磷酸钠、三聚磷酸钠、瓜尔胶 调味包里的食品添加剂5'-曾味核苷酸二钠。添加剂中并没有网帖提到的柠檬酸和谷氨酸钠等。　　价格为2.4元一袋的方便面光面饼里就标注了14种食品添加剂。而网帖提到的谷氨酸钠、焦糖色、柠檬酸则添加在酱包、粉包里。扬子晚报记者粗略地数了一下添加剂数量，数量真如网帖所说，高达二十多种。　　价格为6.5元一桶的方便面是国外某知名品牌。这款方便面的面饼里也标注了7种食品添加剂，包括磷脂、三聚磷酸钠、焦磷酸钠、碳酸钠、β-胡萝卜素、谷氨酸钠和柠檬酸。因此，网帖中提到的谷氨酸钠和柠檬酸是直接添加在面饼里的。　　记者在探访中发现，最为头疼的问题是：方便面的添加剂种类并不是“一口气”标注的，而是在包装袋外分为“面饼、料包、酱包”等各自标注。不少品种“面饼”添加剂写得很清楚，但料包、酱包则含糊其辞。

虽然造成新冠肺炎（COVID-19）的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）主要是呼吸道病毒，但这种疾病会累及全身的器官。除了肺部损伤和呼吸困难外，新冠肺炎患者还表现出神经、肾、肝和血管受损的症状。 研究表明，新冠肺炎患者具有与健康对照者不同的、提示代谢紊乱和血脂异常的代谢谱，且它们也与疾病的严重度相关联。这提升了利用代谢组学来识别具有最高重症风险的新冠肺炎患者的可能性。然而，大多数此类研究只是将新冠肺炎患者与健康对照者进行比较，导致无法确定这种关联是新冠肺炎特有的，还是只是提示危重疾病的普适性标志。 来自德国吕贝克大学的研究人员，通过将接受重症监护室（ICU）治疗的新冠肺炎患者，与在同一ICU进行心源性休克治疗的患者进行比较，研究了代谢谱的特异性。 近乎完美的区分 研究人员分析了5名接受ICU治疗的新冠肺炎患者、11名新冠病毒检测阴性的心源性休克患者，以及58名健康对照者的代谢和脂蛋白谱。他们在布鲁克Avance IVDr平台*（配备TXI探头的布鲁克核磁共振代谢分析系统）上总共分析了276份血清样品。初步的非靶向NMR代谢组学和脂质组学研究表明，新冠肺炎患者与健康对照者及心源性休克患者之间都存在差异。通过针对性分析，研究人员能够量化来自NMR谱图的代谢物和脂蛋白，并识别引起最大差异的代谢物类别。这些分析实现了对新冠肺炎患者与健康对照者及心源性休克患者近乎完美的区分。 为了进一步研究新冠肺炎的代谢影响，研究人员对代谢物和脂蛋白进行了比对分析。结果显示，有许多与能量状态紊乱、肝损伤和血脂异常相关的一致变化。 与其他重症患者截然不同的代谢谱 被识别出的一些关键特征包括低谷氨酰胺/谷氨酸比值，这是由分解代谢疾病状态下谷氨酰胺消耗增加所导致的。这一重症感染的典型指标与新冠肺炎有关联，但与心源性休克无关联。 苯丙氨酸是新冠肺炎患者出现上升的另一特征参数。该氨基酸通常在肝脏中代谢，其水平上升提示肝功能受损。 一些标志物提示能量代谢严重紊乱和代谢抑制，包括葡萄糖水平升高，以及组氨酸、蛋氨酸和乳酸水平降低。但是，这些变化只是新冠肺炎患者相比健康对照者所存在的差异，而与心源性休克患者相比没有这些差异，这表明它们可能不是新冠肺炎所特有的，而是提示危重患者能量状态紊乱的普适性指标。 根据之前的研究，研究人员还发现，新冠肺炎患者的脂蛋白谱严重紊乱，提示心血管疾病风险上升。该脂蛋白谱中很大一部分都与心源性休克患者不同。尤其要提到的是，新冠肺炎患者的极低密度脂蛋白（VLDL）、小颗粒VLDL组分及中密度脂蛋白水平上升——它们相比更大的低密度脂蛋白颗粒更易导致动脉粥样化；因此是引起心血管疾病和心脏损伤的风险因素。此外，新冠肺炎患者的甘油三酯水平相比健康对照者和心源性休克患者都有上升。 惊人的关联 该研究还研究了无症状感染或轻症之后持续发生的代谢变化。为此，研究人员分析了来自18个具有新冠病毒抗体的人的34份血清样本，并与来自相同年龄和性别的、不具有新冠病毒抗体的对照者的样本进行了比较。两组患者在采血前的急性冠状病毒感染检测均为阴性。 主成分分析（PCA）显示，两组之间的代谢谱和脂蛋白谱无显著差异，区分度很低，说明总体血清谱无显著差异。研究人员表示，这意味着新冠肺炎感染康复之后代谢谱回归正常。 然而，在来自曾经的轻症感染者的样本中，发现了抗体滴度和代谢健康标志物之间的关联。例如，抗体滴度与心血管风险标志物（包括小颗粒LDL-6、胆固醇和磷脂）呈负相关。还发现抗体滴度与作为代谢健康标志物的甘氨酸呈正相关。研究人员指出，他们无法从现有数据中确定因果关系，但拥有健康的代谢状态的个体可能更有可能对病毒产生有效的免疫反应，使得感染后的抗体滴度更高。 总之，研究人员表示，他们的发现表明新冠肺炎重症患者的代谢高度紊乱，包括分解代谢状态、肝损伤和严重血脂异常等。这一信息表明，基于NMR的代谢组学研究可被进一步用于患者的识别和分层，以帮助预测新冠肺炎的严重度。 *布鲁克核磁共振波谱仪仅供研究人员使用，不能用于临床诊断。 参考资料 Schmelter F, Foeh B, Mallagaray A et al. (2021) Metabolic markers distinguish COVID-19 from other intensive care patients and show potential to stratify for disease risk. medRxiv preprint. doi: https://doi.org/10.1101/2021.01.13.21249645.

● 快讯近日，同济大学医学院附属上海市第十人民医院神经内科赵延欣教授及刘学源教授课题组在细胞外囊泡与神经退行性疾病关系研究领域取得了新的进展。该项研究从小细胞外囊泡的角度为阿尔兹海默症中发生的兴奋抑制失衡提供了新见解。相关研究成果已发表在国际知名期刊《Journal of Nanobiotechnology》（IF:10.435，JCR 2区）。图1｜国际知名期刊《Journal of Nanobiotechnology》（IF:10.435，JCR2区）细胞外囊泡 (EV) 是由细胞释放到细胞外环境中的小囊泡。EVs 由脂质双层膜组成，该膜包裹着小的无细胞器的细胞质。根据它们的大小，通常分为三种类型，小EVs (sEVs) (50-150 nm)、大EVs (100-1000 nm) 和凋亡小体 ( 5 μm)。其中，sEVs 通常可通过血脑屏障 (BBB)，成为中枢神经系统 (CNS) 细胞之间通讯的关键介质，有证据表明，sEV 中的微小RNA (miRNA)参与到众多细胞和生物过程，例如神经元细胞的生长和凋亡。目前，E/I（兴奋/抑制）失衡假设被概念化为谷氨酸能和氨基丁酸（GABA）能突触输入之间的不平衡。E/I 失衡被认为是神经退行性疾病脑功能障碍的基础，包括阿尔茨海默病 (AD)、帕金森病 (PD)、精神分裂症和其他神经疾病。谷氨酸兴奋性毒性和 GABA 能神经元功能障碍似乎是 AD 中发生的神经元细胞死亡的关键原因。但是关于 E/I 失衡对AD的影响，其中的机制仍不明确。为了对该机制进行进一步阐释，赵延欣教授及刘学源教授团队在本研究中用谷氨酸/GABA/PBS 处理原代培养的神经元，并分离出 sEV。然后，将不同来源的 sEV 添加到用 Aβ（β淀粉样蛋白）处理的神经元或注射到 AD 模型小鼠中。此后对经 Aβ 治疗的小鼠和神经元进行了评估。经GABA 处理的神经元释放的 sEVs 减轻了 Aβ 诱导的损伤，而谷氨酸处理的神经元释放的 sEVs 加重了 Aβ 的毒性。此外，本研究通过 miRNA 测序比较了从谷氨酸/GABA/PBS 处理的神经元中分离的 sEV 的 miRNA 组成。该研究进一步表明，sEV 中 miR-132 的变化加速了表征病理的生化改变。图2｜实验方案示意图分离原代神经元后，用谷氨酸/GABA/PBS 处理原代培养的神经元，并分离出 sEV。将不同来源的 sEV 添加到用 Aβ 处理的神经元或注射到 AD 模型小鼠中，并对小鼠进行MWM测试。文章中，在评估在小鼠体内系统传递的 sEVs 的分布的实验中，使用了博鹭腾AniView100多模式动物活体成像系统拍摄。该实验中使用近红外染料DiR进行标记，同时进行了阴性对照实验（仅注射 DiR，不注射 sEV）。通过 APP/PS1 小鼠的尾静脉注射 DiR 标记的 sEV，使用Aniview100活体成像系统在注射后 24 小时拍摄小鼠的图像并评估分布情况。在带有 DiR 标记的 sEV 的小鼠的大脑和重要器官中均检测到荧光。随后，处死小鼠，取出器官并成像，目的为识别荧光信号来源的器官并使信号干扰最小化。此外，为了排除游离染料干扰实验结果的可能，在收集器官前用不含 sEV 的游离 DiR处理小鼠。实验结果显示，脑、心、肝、肺、脾、肠、肾均呈不同程度荧光。图3｜sEV的体内外分布情况在注射 DiR 标记的 sEV 后 24 小时，使用活体成像系统对A - C活小鼠进行成像。a)、小鼠背面成像b)、小鼠腹侧成像c)、收集指定器官后使用活体成像系统成像本研究中证明了 sEV 的功能可以受神经递质平衡状态的调节，并对神经元中的 Aβ 毒性有不同的影响。并且该研究从 sEV 的角度为 AD 中发生的 E/I 失衡提供了新见解，并表明通过GABA 能系统对 sEV 进行生物学改造可能是预防或减轻 AD 发病机制的治疗途径。论文链接：https://doi.org/10.1186/s12951-021-01070-5

各有关单位：根据工业和信息化标准制修订工作总体安排，工业和信息化部编制完成了2023年第一批行业标准制修订和外文版项目计划。现印发给你们，请认真组织落实。具体要求如下：一、标准起草单位要注意做好标准制定与技术创新、试验验证、知识产权处置、产业化推进、应用推广的统筹协调。二、有关行业协会（联合会）、标准化技术组织、标准化专业机构等主管单位要尽早安排，将文件及时转发至主要起草单位，并做好标准组织起草、征求意见和技术审查等工作，把好技术审查关。三、部机关相关司局、相关地方行业主管部门要做好行业标准制修订、外文版研制过程的管理工作，确保标准的质量和水平。四、计划执行过程中，如需对标准项目进行调整，按有关规定办理。工业和信息化部办公厅2023年4月17日（联系电话：010-68205240）附件下载相关标准如下：序号计划编号项目名称标准类别制修订代替标准项目周期(月)1.2023-0202T-HG工业用乙酸钴产品修订HG/T 2032-1999182.2023-0203T-HG工业用乙酸锰产品修订HG/T 2034-1999183.2023-0205T-HG纤维素材质深层过滤滤芯产品制定244.2023-0206T-HG邻苯二胺产品修订HG/T 3310-2017185.2023-0207T-HG塑料 阻燃聚苯醚专用料产品修订HG/T 2232-1991186.2023-0211T-HG抗菌和抗病毒涂料产品修订HG/T 3950-2007187.2023-0214T-HG抗氧剂 2-甲基-4,6-二[（辛基硫基）甲基]苯酚（1520）产品制定188.2023-0215T-HG硫化剂 N,N'-间苯撑双马来酰亚胺（MPBM）产品制定189.2023-0216T-HG塑料屏蔽料用导电炭黑产品制定2410.2023-0242T-YS铝及铝合金彩色涂层板、带材产品修订YS/T 431-20091811.2023-0243T-YS铝塑复合管用铝及铝合金带、箔材产品修订YS/T 434-20091812.2023-0246T-YS熔融态铝及铝合金产品修订YS/T 1004-20141813.2023-0250T-YS选矿药剂 仲辛基黄药产品修订YS/T 355-19941814.2023-0281T-QB母婴用品质量追溯体系规范管理制定2415.2023-0282T-QB轻工业企业数字化供应链管理通则管理制定2416.2023-0283T-QB轻工智慧园区评价通则管理制定2417.2023-0284T-QB日用化学用品质量追溯体系规范管理制定2418.2023-0285T-QB食用植物油产品质量追溯体系规范管理制定2419.2023-0292T-QB厨房家具产品修订QB/T 2531-20101820.2023-0294T-QB储水式电热水器内胆产品修订QB/T 4101-20101821.2023-0296T-QB家用和类似用途净饮机产品修订QB/T 4991-20161822.2023-0297T-QB家用和类似用途前置过滤器产品修订QB/T 4695-20141823.2023-0298T-QB家用和类似用途嵌入式制冷器具产品修订QB/T 4683-20141824.2023-0299T-QB家用和类似用途软水机产品修订QB/T 4698-20141825.2023-0301T-QB使用环保天然制冷剂生产家用和类似用途房间空调器的特殊要求产品修订QB/T 4975-20161826.2023-0302T-QB使用可燃性制冷剂房间空调器运输的特殊要求产品修订QB/T 4976-20161827.2023-0307T-QB异麦芽酮糖醇产品修订QB/T 4486-20131828.2023-0308T-QB贝类罐头产品修订QB/T 1374-20151829.2023-0309T-QB混合水果罐头产品修订QB/T 1117-20141830.2023-0310T-QB炊饭机产品修订QB/T 4027-20101831.2023-0312T-QB食品包装纸产品修订QB/T 1014-20101832.2023-0313T-QB金属管切割器产品修订QB/T 2350-19971833.2023-0316T-QB工业氯化镁产品修订QB/T 2605-20031834.2023-0317T-QB食盐用水质量控制技术规范管理制定2435.2023-0318T-QB植脂末产品修订QB/T 4791-20151836.2023-0320T-QB黑糖产品修订QB/T 4567-20131837.2023-0321T-QB黄方糖产品修订QB/T 4566-20131838.2023-0322T-QB黄砂糖产品修订QB/T 4095-20101839.2023-0323T-QB金砂糖产品修订QB/T 4563-20131840.2023-0324T-QB精幼砂糖产品修订QB/T 4564-20131841.2023-0325T-QB块糖产品修订QB/T 4562-20131842.2023-0326T-QB全糖粉产品修订QB/T 4565-20131843.2023-0327T-QB糖霜产品修订QB/T 4092-20101844.2023-0328T-QB制糖综合利用加工助剂 固定化酵母产品修订QB/T 4568-20131845.2023-0329T-QB非接触食物搪瓷制品 通用要求产品修订QB/T 1855-19931846.2023-0333T-BB包装容器 聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）瓶坯产品修订BB/T 0060-20121847.2023-0334T-BB纸管产品修订BB/T 0032-20061848.2023-0363T-HG工业溴化钙产品制定2449.2023-0364T-HG工业溴化锌产品制定2450.2023-0365T-HG工业用钴锰复合水溶液产品制定2451.2023-0366T-HG分子筛对挥发性有机物（VOCs）动态吸附容量测定方法方法制定2452.2023-0371T-HG化工研发中试安全风险管控指南管理制定2453.2023-0372T-HG硫化促进剂 二异丙基黄原四硫醚（DIPT）产品制定1854.2023-0373T-HG紫外线吸收剂 2-（2'-羟基-5'-叔辛基苯基）苯并三氮唑（UV-329）产品制定1855.2023-0374T-HG胶乳伸缩管产品制定1856.2023-0375T-HG橡胶胶丝 试验方法方法修订HG/T 2487-20111857.2023-0376T-HG橡胶配合剂 沉淀水合二氧化硅 干燥样品灼烧减量的测定方法修订HG/T 3066-20081858.2023-0377T-HG橡胶配合剂 沉淀水合二氧化硅 水悬浮液pH 值的测定方法修订HG/T 3067-20081859.2023-0449T-QB家用和类似用途馒头机产品制定2460.2023-0453T-QB家用和类似用途自动炒菜机产品制定2461.2023-0455T-QB商用电动洗碗机产品制定2462.2023-0462T-QB瓦楞纸箱生产线产品制定2463.2023-0474T-QB食盐中 pH 值的测定方法制定2464.2023-0475T-QB制盐工业通用检测方法 色度的测定方法制定2465.2023-0476T-QB制盐工业通用检测方法 锶的测定方法制定2466.2023-0477T-QB制盐工业通用检测方法 碳酸盐、碳酸氢盐、氢氧化物的测定方法制定2467.2023-0478T-QB制盐工业通用检测方法 微量溴的测定方法制定2468.2023-0479T-QB制盐工业通用检测方法 硒的测定方法制定2469.2023-0480T-QB单一溶剂型凹版通用塑料复合油墨产品制定2470.2023-0481T-QB油墨剥离力的测定方法方法制定2471.2023-0482T-QB蔗渣浆产品制定2472.2023-0484T-QB焙烤食品用糖浆产品制定2473.2023-0485T-QB焙烤食品预拌（混）粉产品制定2474.2023-0486T-QB焙烤用植物蛋白上色液产品制定2475.2023-0487T-QB蛋黄酥产品制定2476.2023-0488T-QB绿豆糕产品制定2477.2023-0489T-QB杏仁饼产品制定2478.2023-0490T-QB杂粮谷物糕团产品制定2479.2023-0491T-QB氨基酸、氨基酸盐及其类似物 第13部分：β-丙氨酸产品制定2480.2023-0492T-QB氨基酸、氨基酸盐及其类似物 第14部分：L-谷氨酸产品制定2481.2023-0493T-QB氨基酸、氨基酸盐及其类似物 第15部分：L-盐酸鸟氨酸产品制定2482.2023-0494T-QB氨基酸、氨基酸盐及其类似物 第16部分：L-瓜氨酸产品制定2483.2023-0495T-QB包埋型 益生菌产品制定2484.2023-0496T-QB蛋黄球蛋白粉产品制定2485.2023-0497T-QB冻干食品通则基础制定2486.2023-0498T-QB发酵法丁二酸产品制定2487.2023-0499T-QB发酵液中麦角硫因的测定方法制定2488.2023-0500T-QB非变性 II 型胶原蛋白产品制定2489.2023-0501T-QB胍基丁胺产品制定2490.2023-0502T-QB核苷（酸）及其衍生物 第1部分：尿嘧啶核苷产品制定2491.2023-0503T-QB褐藻胶裂解酶制剂产品制定2492.2023-0504T-QB麦芽糖淀粉酶制剂产品制定2493.2023-0505T-QB膜过滤乳（膜分离乳）产品制定2494.2023-0506T-QB葡萄糖氧化酶制剂产品制定2495.2023-0507T-QB漆酶制剂产品制定2496.2023-0508T-QB食品中 2'-岩藻糖基乳糖的测定 离子色谱法方法制定2497.2023-0509T-QB食品中茶多糖分子量及其分布的测定 凝胶色谱法方法制定2498.2023-0510T-QB食品中茶褐素的测定-分光光度法方法制定2499.2023-0511T-QB食品中壳寡糖的测定 离子色谱法方法制定24100.2023-0512T-QB食品中乳铁蛋白的测定 酶联免疫吸附法方法制定24101.2023-0513T-QB食品中透明质酸钠的测定高效液相色谱法方法制定24102.2023-0514T-QB食品中维生素 B12 的测定预包被微孔板式微生物法方法制定24103.2023-0515T-QB熟制与生干山龙眼果（夏威夷果、澳洲坚果）和仁产品制定24104.2023-0516T-QB速溶支链氨基酸粉产品制定24105.2023-0517T-QB脱油蛋黄粉产品制定24106.2023-0518T-QB预制菜 第1部分：预制凉菜产品制定24107.2023-0519T-QB预制菜 第2部分：食用高汤产品制定24108.2023-0520T-QB预制菜 第3部分：佛跳墙产品制定24109.2023-0521T-QB植物基食品通则基础制定24110.2023-0522T-QB自热火锅产品制定24111.2023-0523T-QB自热米饭产品制定24112.2023-0524T-QBα-乳白蛋白产品制定24113.2023-0525T-QB风味面团产品制定24114.2023-0526T-QB聚葡萄糖产品制定24115.2023-0527T-QB醪糟产品制定24116.2023-0528T-QB乳清蛋白肽（水解乳清蛋白）产品制定24117.2023-0529T-QB乳酸菌发酵葡萄糖制品产品制定24118.2023-0530T-QB食品中低聚糖的测定 第1部分：母乳低聚糖含量的测定方法制定24119.2023-0531T-QB食用发酵微藻 第1部分：蛋白核小球藻产品制定24120.2023-0532T-QB食用菌剂体外模拟消化道的活菌率检验方法方法制定24121.2023-0533T-QB微生态制剂术语和分类基础制定24122.2023-0534T-QB玉米发酵核苷酸酱产品制定24123.2023-0535T-QB番茄调味类罐头产品制定24124.2023-0536T-QB鱼胶罐头产品制定24125.2023-0537T-QB坚果与籽类食品设备 术语基础制定24126.2023-0538T-QB坚果与籽类食品设备 型号编制方法基础制定24127.2023-0539T-QB可微波食品接触用复合膜、袋产品制定24128.2023-0540T-QB食品包装用聚烯烃阻隔复合膜、袋产品制定24129.2023-0541T-QB食品包装用流延聚苯乙烯多层复合片产品制定24130.2023-0542T-QB鱼松产品制定24131.2023-0543T-AH高分子复合板桩产品制定24132.2023-0552T-BB包装制品中淀粉粘合剂含量的测定（酶化-重量法和酶化-比色法）方法制定24133.2023-0553T-BB热收缩标签产品制定24

01使用环境要求仪器需要整体放置在培养箱内，在20℃下进行5天BOD测试。所以培养箱内部需要具备为仪器供电的电源插口，内部容积不小于41×40×75cm（宽×深×高）。02仪器开机操作1.仪器操作面板和显示屏如下图：2.打开仪器电源。在6个通道全部是CLEAR或END状态下，可以对仪器进行设置操作。同时按住左右箭头键5秒钟以上，会出现设置菜单。分别按6个通道键可以选择设置年、月、日、小时、分钟及培养天数(5、7、10天)，通过左右键来进行更改。03不同样品的分析操作流程及结果计算针对不同的样品，有不同的操作流程来进行样品准备和结果数据处理。也可以用不同的样品瓶组合使用不同的流程，但是只能选择相同的培养天数。(一)简易流程：针对不需要进行接种、加入营养盐或缓冲液的样品。如生活污水厂进厂水和出厂水、地表水等。对数据精确度要求不高时也可以使用这个流程。具体步骤如下：1.将样品温度加热或冷却到19-21℃。如果样品中有沉淀或悬浮物，需要搅拌均匀。2.预估样品的BOD浓度，根据下表用量筒量取不同体积的样品。加入两包营养缓冲盐胶囊，混匀，加入干净、干燥的样品瓶中。3.在样品瓶中放入一个搅拌子。4.将密封杯插入样品瓶瓶口。用小勺往密封杯内添加2 粒氢氧化钾。5.对每个样品瓶重复以上步骤。6.将样品瓶放在仪器基座上，并与相应通道的管子连接，拧紧盖子。7.将仪器放入培养箱。培养箱温度必须为20±1℃。插上电源，仪器通电。确保所有搅拌子都在旋转。如搅拌子不旋转，则将样品瓶拿起再放下进行调整。8.按与样品瓶对应的通道编号选择通道。按 ON（开）键。此时将显示浓度范围选择菜单。使用箭头键选择测试范围。使用左箭头键选择0-35mg/L或者0-70mg/L，使用右箭头键选择0-350mg/L或者0-700mg/L。9.按住ON（开）键5秒以上，仪器进入测量界面，开始测试。此时仪器状态显示为DELAY（延迟），有一个小时的样品均匀时间。一个小时后，仪器状态变成RUN（运行），将正式开始采集数据并显示曲线图。10.重复步骤8和9，为每个通道的样品瓶设置范围，开始测试。如样品少于6个，则不需要启动所有6个通道。11.五日培养结束后，直接读取仪器上各通道的五日数据，即为样品的BOD值。(二)哈希GGA(葡萄糖/谷氨酸)流程：使用葡萄糖/谷氨酸标准溶液进行仪器准确性验证。样品测量精度要求高时，也可以使用这个流程。具体步骤如下：1.准备3000mg/L葡萄糖/谷氨酸标准溶液（溶液中葡萄糖和谷氨酸浓度都是3000mg/L）。2.准备合适的接种液。生活污水厂内经过沉淀的进水或经初步澄清的出水是大多数样品首选的晶种来源。请参照BOD分析国家标准选取其他接种溶液。3.标准溶液样品准备：依下表，在200mL量筒中加入30mL蒸馏水、8mL葡萄糖/谷氨酸标准溶液、适量接种液(如20mL)、2包营养缓冲盐胶囊，再加入蒸馏水至总体积160mL。4.接种液空白准备：除了不加8mL葡萄糖/谷氨酸标准溶液，其他步骤和上面第3步样品准备完全相同。5.将标准溶液样品和接种液空白分别加入不同的样品瓶中，继续从简易流程的第三步开始完成后面的操作。浓度范围选择0-350mg/L。6.五日培养结束后，直接读取仪器上标准溶液和接种液空白的五日数据，二者相减，即得到标准溶液的BOD值。这个数值应该在235±11mg/L之间。(三)哈希标准流程：针对需要接种或者加入营养盐缓冲液的样品。具体步骤如下：1.将样品温度加热或冷却到19-21℃。如果样品中有沉淀或悬浮物，需要搅拌均匀。2.准备合适的接种液。生活污水厂内经过沉淀的进水或经初步澄清的出水是大多数样品首选的接种液来源。请参照BOD分析国家标准选取其他来源的接种溶液。3.根据预估的样品浓度，参照下表选取测试范围。在样品瓶中精确加入要求体积的样品，再加入接种液适量（如20mL）、2包营养缓冲盐胶囊，用蒸馏水补足至最终体积。以35mg/L范围的样品为例，在样品瓶中加入样品370mL，接种液20mL，再加入30mL蒸馏水，使得样品瓶中最终液体体积为420mL。4.根据每个样品，需要进行相同量程的接种液空白测试。将第3步中的样品变成蒸馏水，其他条件不变，即得到接种液空白溶液。5.将接种过的样品溶液和接种液空白分别加入不同的样品瓶中，继续从简易流程的第三步开始完成后面的操作。6.五天培养结束后，读取样品和接种液空白的5日BOD仪器数值，二者相减，所得差值乘以上表中对应的稀释系数，即得到样品的真实BOD结果。04仪器维护样品瓶使用后应用热肥皂水洗干净，再用蒸馏水冲洗干净后晾干备用。05主要试剂和备件

工业微生物常用于重要的生物和化学制品的生产，优良菌株的选育是生物产业的核心工作之一。近年来合成生物技术的快速发展使得高性能工业菌株基因型的理性构建性显著增加，但如何从海量候选菌株库中高通量筛选到规模生产用的工业菌株仍面临挑战。多孔板（MTP）筛选系统和流式细胞术（FACS）是研究者常用的筛选手段，但MTP通量较低，而FACS难以用于检测胞外分泌的代谢物。液滴微流控技术在微生物育种领域的应用，成功实现了大容量突变库的全面评价以及高效筛选，不仅在筛选通量方面实现了大幅度提升，有效提高了菌株选育工作效率，而且在筛选成本方面也展现出巨大优势，可显著降低筛选过程中试剂耗材的用量，将单克隆的筛选成本降低至十分之一或百分之一，实现高通量、低消耗的优良工业菌株选育。天木生物基于液滴微流控技术开发了皮升级单细胞分选平台--DREM cell（Droplet entrapping microfluidic cell-sorter）具有体积小、通量高、体系封闭、无交叉污染等特点，越来越成为科学研究和企业生产的重要技术手段。近日，清华大学张翀、安徽工程大学薛正莲研究团队应用DREM cell将液滴微流控技术与基因编码荧光生物传感器相结合，成功实现了高产谷氨酰胺酶突变株的超高通量筛选，相关研究成果以“Combining genetically encoded biosensors with droplet microfluidic system for enhanced glutaminase production by Bacillus amyloliquefaciens”为题，发表在生物化工领域专业期刊《Biochemical Engineering Journal》上。研究团队开发了一种利用谷氨酸拟荧光蛋白传感器 iGluSnFR 的谷氨酰胺酶荧光检测方法，相较于传统的高效液相色谱法，速度提高了700倍。基于iGlusnFR传感器，结合DREM cell单细胞分选平台实现谷氨酰胺酶生产菌株的高通量筛选，单次实验可筛选10万克隆，效率远远超过传统孔板筛选技术。最终项目团队对常压室温等离子体（ARTP）诱变的解淀粉芽孢杆菌全基因组突变文库进行超高通量筛选，成功获得了一株谷氨酰胺酶产量提高47%以上的突变株。该筛选平台，与微孔板筛选系统相比，筛选率提高500倍，试剂用量减少2万倍，并且可以节省大量的多孔板、培养皿、枪头等耗材。▲图丨液滴微流控高通量筛选平台流程图背景信息研究团队所使用的液滴微流控细胞分选仪（DREM cell）是天木生物基于液滴微流控技术开发的皮升级液滴微流控单细胞分选平台，可将待筛选细胞进行包被形成单细胞微液滴，结合荧光筛选模型，可以在细胞水平完成微生物的高通量分离、培养、检测、分选等。▲图丨液滴微流控细胞分选仪（来源：天木生物）高通量皮升级液滴单细胞分选系统（DREM cell）相比于传统筛选方法，筛选效率可提升1万倍，试剂消耗量可下降至百万分之一，在筛选通量显著提升的同时，单克隆筛选成本大幅度降低。该仪器不仅可广泛应用于细菌、酵母、动物细胞等的高通量筛选，还可以应用于蛋白、核酸、抗体等生物大分子筛选等相关研究领域。项目技术参数液滴体积1-1000pL荧光激发与检测可选波段：（1）激发波长488nm，检测波长525±15nm，灵敏度1μM荧光素/单液滴（2）激发波长532nm，检测波长578±11nm，灵敏度100nM试卤灵/单液滴液滴生产频率0-10000个/s液滴分选频率0-1000个/s微注入速度0-1000个/s样品低温控制系统4℃恒温控制，±0.5℃工作环境常压状态下，室温，30%≤湿度≤80%，洁净暗室整机功率600W应用范围细胞、酵母、细菌、蛋白、核酸等

从地沟回流餐桌，谁来守住地沟油链条的最后一道防线?　　地沟油的检测一直是一道“世界性的难题”。由于地沟油成分复杂，众多科研单位经过艰苦研究，依然难以寻找到可靠有效的检测方法。　　去年12月，卫生部食品安全风险评估中心第二次向全国征集地沟油检测方法。近日卫生部透露，已初步圈定了7种检测方法，正对这7种检测方法的真实性和可靠性进行评估、考核，但目前仍未公布。　　地沟油检测方法仍未揭开神秘面纱。为什么地沟油检测这么难?真的能找到可靠有效的检测方法?检测方法真的能守住地沟油回流餐桌的最后一道防线吗?　　本期科技能见度为您解开地沟油检测之谜。　　身披隐形衣　　地沟油来源复杂，混入成分不一，且经水洗、蒸馏、脱色等加工处理，或与食用植物油掺兑，很难通过感官分析和一些理化指标进行区分，常规性检测指标基本无效　　2011年，公安部破获一起横跨多省的特大地沟油制售食用油案，警方在浙江宁海查获了大量地沟油，但送检的10个样品中，居然只有两个样品被检出不合格。　　2011年底，重庆警方侦破西南首例制售地沟油大案。然而，该案中已经被警方确认为是用餐厨垃圾炼成的地沟油，按照我国食用油检测的主要检测指标进行检测，却几乎全部合格。　　这就是我国的地沟油检测方法目前正遭遇的尴尬。　　由于地沟油来源复杂，混入的成分不一致，且经水洗、蒸馏、脱色等加工处理后，或与食用植物油掺兑后，已很难通过感官分析和一些理化指标进行区分。　　根据国家食用植物油卫生标准的分析方法(GB/T5009.37-2003)，这些检测主要是对地沟油的感官、水分含量、酸价、过氧化值、羰基价、碘值等进行测定。　　2011年5月《职业与健康》的一篇论文里，江苏省泰州市疾病预防控制中心工程师刘波指出，地沟油经碱炼、脱水、脱色和脱臭精炼工艺，可以使酸价、水分、感官等指标符合国家食用油卫生标准。而对于过氧化值的指标，因为过氧化物易遇热分解，油脂加热后过氧化值比加热前反而更低，因此常规性检测指标只能判定油脂优劣，无法判定是否为地沟油。　　国家食品安全风险评估中心专家王竹天也指出，现在的地沟油精炼的程度已经很高，想象中存在某些污染的地沟油已经跟现在高度精炼出的地沟油完全不是一回事。　　他在接受媒体采访时表示，“比如说一些污染物，它完全能通过精炼去掉，所以根本不可能再测出来，也就是为什么按照我们现在的一些检测方法，比如卫生指标、质量指标，以及可能污染物指标统统都检不出来。”　　中国疾病预防控制中心营养与食品安全所化学污染监控室主任吴永宁甚至表示，一旦政府公布了检测指标，对手很可能迅速地把这一指标从地沟油里悄无声息地抹掉，从而导致检测无效。　　武汉大学化学与分子科学学院教授刘志洪在接受南方日报记者采访时表示，地沟油最大的问题是致癌的黄曲霉素。“虽然目前的技术能够检测出黄曲霉素，但并不是每一种地沟油里黄曲霉素都超标。”　　这也是目前每一个检测方案所遭遇的困境。　　2011年9月18日，卫生部发布消息，全力组织科研攻关研究鉴别地沟油检验方法。但征集到的7家技术机构研制的5种地沟油检测方法均以失败告终，原因是“专家论证发现这些方法特异性不强”。　　这其中就包括了之前被寄予厚望的北京食品安全监控中心做出的“北京方案”。入选这个方案的地沟油特异性指标包括“多环芳烃、胆固醇、电导率、特定基因”四大类。其中，致癌物多环芳烃被认为是目前地沟油中已被证实的最大危害成分。　　这是北京食品安全监控中心的检测人员花了将近3个月时间，综合运用色谱分析、光谱分析、理化分析及基因鉴定技术等现代分析测试手段，先后对80余个技术指标进行了全方位的筛选才确定的。　　但经卫生部组织的专家组论证后，仍然未获通过。在实际测试中，专家们发现，以检测多环芳烃为侧重点的“北京方案”，居然对某些地沟油样本束手无策，原因是“经过人为特殊处理后，并不是所有地沟油都含有多环芳烃”。　　面对科研人员的全力围剿，狡猾的地沟油却如同披了一件隐身衣。　　难觅特异性　　现有350多种检测方法，可以称为“所有的方法都有效，但所有的方法都不适合用于所有的地沟油”，都难以达到“既不错怪好油，又不放过坏油”的理想效果　　在新一轮的方法征集里，国家食品风险评估中心提出了地沟油检测方法的3条筛选原则：首先正常植物油样品不应被误判 其次地沟油样品的正确检出率高 再次，能够将勾兑的地沟油样品从高到低依梯度顺序检出。　　针对地沟油的检测方法，其实国内早就有了不少的研究，通过实验，提出了很多地沟油的特异性指标。　　“北京方案”里“胆固醇、电导率”等两项指标，其实也早就被众多研究者所讨论过，被认为是鉴别地沟油的重要有效依据。　　地沟油与食盐，味精、地下金属管道、废旧铁桶等接触，金属离子严重超标，尤其是钠、铁离子超标显著。此外，餐饮业废油脂在酸败过程中也会产生一些小分子极性物质，与各种金属离子一起影响油脂的导电性。　　有研究结果显示，合格食用植物油电导率较低，而地沟油电导率较大，是菜籽毛油的3倍，是大豆色拉油的11 倍，猪油的28倍。研究者据此认为，可以通过导电性来对地沟油与食用油进行检测。　　地沟油成分复杂，在回收使用过程中不可避免地混有动物油脂。动物脂肪中普遍含有大量胆固醇，而在植物油中一般不含胆固醇。有研究显示，大豆油、菜籽油中胆固醇的含量均为0.031 mg/g，而纯地沟油中胆固醇含量为0.429mg/g。　　但这些指标其实都可能对地沟油“网开一面”。科学松鼠会成员、食品工程博士“云无心”指出，如果一批地沟油只是炸过薯条或者油条的，那么它也完全可能不含电解质，电导率也很低。　　对于胆固醇的测定，同样如此：成分主要是植物油的地沟油也完全可以过关。再加上与合格食用油进行勾兑，可以进一步稀释地沟油内胆固醇的含量。　　研究者们还寻找了其他的突破口。氯化钠、谷氨酸钠是食品烹调时最常用调味成分，可随食物残渣残留于煎炸废油、潲水油等废弃油脂内，使普通油与废弃油中氯化钠和谷氨酸钠含量有显著差异。在《现代科学仪器》2010年的一篇论文中，研究者在地沟油中检出平均钠离子含量远远高于合格食用油。　　还有研究者研究得出，合格食用油不含人工合成的化学物质十二烷基苯磺酸钠，而地沟油是从餐饮业餐具洗涤系统中收集，且与地下生活污水接触，含有大量洗涤剂烷基苯磺酸钠。　　有研究者测定地沟油中挥发性成分，发现样品油中含有16种挥发性有害成分，其中15种为脂肪烃，1种为己醛。而己醛是油脂氧化变质二级产物，可以当作判别地沟油一个重要依据。　　有的研究者通过薄层色谱法研究发现，潲水油和煎炸老油的薄层色谱有明显的拖尾斑，而食用植物油则没有。经柱色谱分离并进行红外分析拖尾斑成分，发现潲水油、煎炸老油的拖尾成分是合格食用油所不含的醛、酮类化合物。　　还有研究指出，脂肪酸组成的测定每种食用油都有其特征脂肪酸图谱，脂肪酸相对含量一定。地沟油是一个混合油体系，含有多种动植物油脂。对掺伪地沟油的食用油体系来说，此种食用油的脂肪酸相对组成被打乱，通过与其正常的脂肪酸图谱对比，可判断是否掺伪。　　但刘志洪分析认为，这些方法都或多或少存在一些问题，难以达到“既不错怪好油，又不放过坏油”的理想效果。什么成分都有的地沟油让人摸不着头脑。大连市产品质量监督检验所研究员潘炜坦言，现有的350多种检测方法，可以称为“所有的方法都有效，但所有的方法都不适合用于所有的地沟油”。　　科学争议：地沟油检测真的无解?　　目前，卫生部还未公布所选定的7种检测方法，但包括刘志洪、杜斌和李里特在内的多位专家均对此持谨慎态度。　　“地沟油是分析检测上特别复杂的样本。”分析化学专业教授刘志洪感叹，目前确实没有一个成熟的方法来检测地沟油。华南农业大学食品学院副教授杜斌接受南方日报记者采访时也断言，“检测地沟油目前基本没什么好方法。”　　科学松鼠会成员、食品工程博士“云无心”解释，检测必须是针对一种确定的物质。按照目前的分析技术，只要能够列举出来的成分，基本上就可以检测出来。但是，能够检测一个指标，跟用它来进行判定，完全是两回事。　　“云无心”表示，要可靠地检测一种东西，就需要这种东西有相对明确一致的组成与性质。地沟油并非如此。作为一种废料，其组成千差万别。此外，把地沟油掺杂到正常油中，更可以控制任何一个指标的数值，使之符合“检测标准”。　　在接受南方日报记者采访时，中国农业大学食品科学与营养工程学院教授、国家食品与营养咨询委副主任李里特表示，地沟油的定义不清晰是导致检测“地沟油”难的原因之一。　　“‘地沟油’一词所涵盖的内容太多了。从下水道里收集来的油被称为地沟油，厨房里面用过的油也被称为地沟油，动物内脏炼制的油还被称为地沟油。”　　他指出，这样定义不清晰的后果就是检测变得难上加难，因为检测很难包罗万象。刘志洪也持有同样的观点，他认为地沟油难以检测，是由于“来源太复杂”了。　　刘志洪表示，卫生部初步确定的7种方法肯定也是对里面存在的多种指标进行检测，比如黄曲霉素，多环芳烃、重金属，胆固醇等指标。“这些东西如果单独拿出来看，每一种都有检测方法，但把它合在一起装在不同的地沟油里，有的含这些指标，有的又不含，有的有这个超标，有的是那个超标。”　　对地沟油检测方法已经潜心研究两年的上海市粮食科学研究所所长曹文明甚至表示，地沟油所共有且特有的特征指标可能并不存在。也就是说，至少短期内无法找到一种定性地沟油的方法。　　“用一个单独的方法想把它鉴别出来，我觉得可能性不大。”刘志洪明确表示，如果想要检出地沟油，必须先把地沟油的成分搞清楚，再针对这些成分提出检测方法，而且一定要综合多种指标多种检测方法联用组合。　　“监管部门不要执着于地沟油的检测。”李里特教授在接受南方日报采访时强调，从技术上进行地沟油检测不但不可行，而且也并非是杜绝地沟油的有效方法。　　刘志洪则明确表示，地沟油根本就不是靠科学家来解决的问题，“地沟油问题并不是科技上的问题。食品安全本身也不是科学上的问题。”　　刘志洪说，地沟油其实有很多其他的用途，可以做成燃料等其他产品，关键在于建立一套将其变废为宝的制度。

卫生部初步确定7种检测方法，学界普遍认为尚无有效检测指标　　从地沟回流餐桌，谁来守住地沟油链条的最后一道防线?　　地沟油的检测一直是一道“世界性的难题”。由于地沟油成分复杂，众多科研单位经过艰苦研究，依然难以寻找到可靠有效的检测方法。　　去年12月，卫生部食品安全风险评估中心第二次向全国征集地沟油检测方法。近日卫生部透露，已初步圈定了7种检测方法，正对这7种检测方法的真实性和可靠性进行评估、考核，但目前仍未公布。　　地沟油检测方法仍未揭开神秘面纱。为什么地沟油检测这么难?真的能找到可靠有效的检测方法?检测方法真的能守住地沟油回流餐桌的最后一道防线吗?　　本期科技能见度为您解开地沟油检测之谜。　　◎身披隐形衣　　地沟油来源复杂，混入成分不一，且经水洗、蒸馏、脱色等加工处理，或与食用植物油掺兑，很难通过感官分析和一些理化指标进行区分，常规性检测指标基本无效　　2011年，公安部破获一起横跨多省的特大地沟油制售食用油案，警方在浙江宁海查获了大量地沟油，但送检的10个样品中，居然只有两个样品被检出不合格。　　2011年底，重庆警方侦破西南首例制售地沟油大案。然而，该案中已经被警方确认为是用餐厨垃圾炼成的地沟油，按照我国食用油检测的主要检测指标进行检测，却几乎全部合格。　　这就是我国的地沟油检测方法目前正遭遇的尴尬。　　由于地沟油来源复杂，混入的成分不一致，且经水洗、蒸馏、脱色等加工处理后，或与食用植物油掺兑后，已很难通过感官分析和一些理化指标进行区分。　　根据国家食用植物油卫生标准的分析方法(GB/T5009.37-2003)，这些检测主要是对地沟油的感官、水分含量、酸价、过氧化值、羰基价、碘值等进行测定。　　2011年5月《职业与健康》的一篇论文里，江苏省泰州市疾病预防控制中心工程师刘波指出，地沟油经碱炼、脱水、脱色和脱臭精炼工艺，可以使酸价、水分、感官等指标符合国家食用油卫生标准。而对于过氧化值的指标，因为过氧化物易遇热分解，油脂加热后过氧化值比加热前反而更低，因此常规性检测指标只能判定油脂优劣，无法判定是否为地沟油。　　国家食品安全风险评估中心专家王竹天也指出，现在的地沟油精炼的程度已经很高，想象中存在某些污染的地沟油已经跟现在高度精炼出的地沟油完全不是一回事。　　他在接受媒体采访时表示，“比如说一些污染物，它完全能通过精炼去掉，所以根本不可能再测出来，也就是为什么按照我们现在的一些检测方法，比如卫生指标、质量指标，以及可能污染物指标统统都检不出来。”　　中国疾病预防控制中心营养与食品安全所化学污染监控室主任吴永宁甚至表示，一旦政府公布了检测指标，对手很可能迅速地把这一指标从地沟油里悄无声息地抹掉，从而导致检测无效。　　武汉大学化学与分子科学学院教授刘志洪在接受南方日报记者采访时表示，地沟油最大的问题是致癌的黄曲霉素。“虽然目前的技术能够检测出黄曲霉素，但并不是每一种地沟油里黄曲霉素都超标。”　　这也是目前每一个检测方案所遭遇的困境。　　2011年9月18日，卫生部发布消息，全力组织科研攻关研究鉴别地沟油检验方法。但征集到的7家技术机构研制的5种地沟油检测方法均以失败告终，原因是“专家论证发现这些方法特异性不强”。　　这其中就包括了之前被寄予厚望的北京食品安全监控中心做出的“北京方案”。入选这个方案的地沟油特异性指标包括“多环芳烃、胆固醇、电导率、特定基因”四大类。其中，致癌物多环芳烃被认为是目前地沟油中已被证实的最大危害成分。　　这是北京食品安全监控中心的检测人员花了将近3个月时间，综合运用色谱分析、光谱分析、理化分析及基因鉴定技术等现代分析测试手段，先后对80余个技术指标进行了全方位的筛选才确定的。　　但经卫生部组织的专家组论证后，仍然未获通过。在实际测试中，专家们发现，以检测多环芳烃为侧重点的“北京方案”，居然对某些地沟油样本束手无策，原因是“经过人为特殊处理后，并不是所有地沟油都含有多环芳烃”。　　面对科研人员的全力围剿，狡猾的地沟油却如同披了一件隐身衣。　　◎难觅特异性　　现有350多种检测方法，可以称为“所有的方法都有效，但所有的方法都不适合用于所有的地沟油”，都难以达到“既不错怪好油，又不放过坏油”的理想效果　　在新一轮的方法征集里，国家食品风险评估中心提出了地沟油检测方法的3条筛选原则：首先正常植物油样品不应被误判 其次地沟油样品的正确检出率高 再次，能够将勾兑的地沟油样品从高到低依梯度顺序检出。　　针对地沟油的检测方法，其实国内早就有了不少的研究，通过实验，提出了很多地沟油的特异性指标。　　“北京方案”里“胆固醇、电导率”等两项指标，其实也早就被众多研究者所讨论过，被认为是鉴别地沟油的重要有效依据。　　地沟油与食盐，味精、地下金属管道、废旧铁桶等接触，金属离子严重超标，尤其是钠、铁离子超标显著。此外，餐饮业废油脂在酸败过程中也会产生一些小分子极性物质，与各种金属离子一起影响油脂的导电性。　　有研究结果显示，合格食用植物油电导率较低，而地沟油电导率较大，是菜籽毛油的3倍，是大豆色拉油的11 倍，猪油的28倍。研究者据此认为，可以通过导电性来对地沟油与食用油进行检测。　　地沟油成分复杂，在回收使用过程中不可避免地混有动物油脂。动物脂肪中普遍含有大量胆固醇，而在植物油中一般不含胆固醇。有研究显示，大豆油、菜籽油中胆固醇的含量均为0.031 mg/g，而纯地沟油中胆固醇含量为0.429mg/g。　　但这些指标其实都可能对地沟油“网开一面”。科学松鼠会成员、食品工程博士“云无心”指出，如果一批地沟油只是炸过薯条或者油条的，那么它也完全可能不含电解质，电导率也很低。　　对于胆固醇的测定，同样如此：成分主要是植物油的地沟油也完全可以过关。再加上与合格食用油进行勾兑，可以进一步稀释地沟油内胆固醇的含量。　　研究者们还寻找了其他的突破口。氯化钠、谷氨酸钠是食品烹调时最常用调味成分，可随食物残渣残留于煎炸废油、潲水油等废弃油脂内，使普通油与废弃油中氯化钠和谷氨酸钠含量有显著差异。在《现代科学仪器》2010年的一篇论文中，研究者在地沟油中检出平均钠离子含量远远高于合格食用油。　　还有研究者研究得出，合格食用油不含人工合成的化学物质十二烷基苯磺酸钠，而地沟油是从餐饮业餐具洗涤系统中收集，且与地下生活污水接触，含有大量洗涤剂烷基苯磺酸钠。　　有研究者测定地沟油中挥发性成分，发现样品油中含有16种挥发性有害成分，其中15种为脂肪烃，1种为己醛。而己醛是油脂氧化变质二级产物，可以当作判别地沟油一个重要依据。　　有的研究者通过薄层色谱法研究发现，潲水油和煎炸老油的薄层色谱有明显的拖尾斑，而食用植物油则没有。经柱色谱分离并进行红外分析拖尾斑成分，发现潲水油、煎炸老油的拖尾成分是合格食用油所不含的醛、酮类化合物。　　还有研究指出，脂肪酸组成的测定每种食用油都有其特征脂肪酸图谱，脂肪酸相对含量一定。地沟油是一个混合油体系，含有多种动植物油脂。对掺伪地沟油的食用油体系来说，此种食用油的脂肪酸相对组成被打乱，通过与其正常的脂肪酸图谱对比，可判断是否掺伪。　　但刘志洪分析认为，这些方法都或多或少存在一些问题，难以达到“既不错怪好油，又不放过坏油”的理想效果。什么成分都有的地沟油让人摸不着头脑。大连市产品质量监督检验所研究员潘炜坦言，现有的350多种检测方法，可以称为“所有的方法都有效，但所有的方法都不适合用于所有的地沟油”。　　科学争议　　地沟油检测真的无解?　　目前，卫生部还未公布所选定的7种检测方法，但包括刘志洪、杜斌和李里特在内的多位专家均对此持谨慎态度。　　“地沟油是分析检测上特别复杂的样本。”分析化学专业教授刘志洪感叹，目前确实没有一个成熟的方法来检测地沟油。华南农业大学食品学院副教授杜斌接受南方日报记者采访时也断言，“检测地沟油目前基本没什么好方法。”　　科学松鼠会成员、食品工程博士“云无心”解释，检测必须是针对一种确定的物质。按照目前的分析技术，只要能够列举出来的成分，基本上就可以检测出来。但是，能够检测一个指标，跟用它来进行判定，完全是两回事。　　“云无心”表示，要可靠地检测一种东西，就需要这种东西有相对明确一致的组成与性质。地沟油并非如此。作为一种废料，其组成千差万别。此外，把地沟油掺杂到正常油中，更可以控制任何一个指标的数值，使之符合“检测标准”。　　在接受南方日报记者采访时，中国农业大学食品科学与营养工程学院教授、国家食品与营养咨询委副主任李里特表示，地沟油的定义不清晰是导致检测“地沟油”难的原因之一。　　“‘地沟油’一词所涵盖的内容太多了。从下水道里收集来的油被称为地沟油，厨房里面用过的油也被称为地沟油，动物内脏炼制的油还被称为地沟油。”　　他指出，这样定义不清晰的后果就是检测变得难上加难，因为检测很难包罗万象。刘志洪也持有同样的观点，他认为地沟油难以检测，是由于“来源太复杂”了。　　刘志洪表示，卫生部初步确定的7种方法肯定也是对里面存在的多种指标进行检测，比如黄曲霉素，多环芳烃、重金属，胆固醇等指标。“这些东西如果单独拿出来看，每一种都有检测方法，但把它合在一起装在不同的地沟油里，有的含这些指标，有的又不含，有的有这个超标，有的是那个超标。”　　对地沟油检测方法已经潜心研究两年的上海市粮食科学研究所所长曹文明甚至表示，地沟油所共有且特有的特征指标可能并不存在。也就是说，至少短期内无法找到一种定性地沟油的方法。　　“用一个单独的方法想把它鉴别出来，我觉得可能性不大。”刘志洪明确表示，如果想要检出地沟油，必须先把地沟油的成分搞清楚，再针对这些成分提出检测方法，而且一定要综合多种指标多种检测方法联用组合。　　“监管部门不要执着于地沟油的检测。”李里特教授在接受南方日报采访时强调，从技术上进行地沟油检测不但不可行，而且也并非是杜绝地沟油的有效方法。　　刘志洪则明确表示，地沟油根本就不是靠科学家来解决的问题，“地沟油问题并不是科技上的问题。食品安全本身也不是科学上的问题。”　　刘志洪说，地沟油其实有很多其他的用途，可以做成燃料等其他产品，关键在于建立一套将其变废为宝的制度。

—抗体药、蛋白质药、N-末端甲硫氨酸缺失或焦谷氨酸环化封闭等—? 目前，在制药领域，生物药得到越来越多的关注。生物药是利用DNA重组、细胞融合、细胞培养等生物技术开发出的蛋白质药物、抗体药物等。几乎所有蛋白质合成都起始于N-末端，其序列组成对于蛋白质整体的生物学功能有着重要的影响力，因此蛋白质的序列分析对于生物药效果非常关键。 2015版《中国药典》三部人用重组DNA技术产品总论对生物药的生产及质量控制方面，，针对其蛋白质结构提出技术要求，应测定目标产品的氨基酸序列，并与其基因序列推断的理论氨基酸序列进行比较。因此，N-末端氨基酸序列分析是很多已上市生物药的年检项目，如重组人促红素注射液（CHO细胞） 、重组人粒细胞刺激因子注射液等。此外，国际法规中也有对于生物药N-末端氨基酸序列测定的要求。药品注册的国际协调组织颁布的指导法规ICH-Q6B规定，生物药进行申报时，必须提供N-末端氨基酸序列信息。《欧洲药典》中规定，生物仿制药申报也必须提供N-末端序列。 Edman降解法是蛋白质N-末端测序的常用方法，岛津公司的蛋白质测序仪（Protein Sequencer）PPSQ以Edman降解法为基础，将蛋白质从N-末端顺次切断进行序列分析。此方法具有直接测定、可靠性高的优势。近期，岛津推出新型的蛋白质测序仪PPSQ 51A/53，配备SPD-M30A高灵敏度检测器、软件满足FDA 21 CFR Part 11数据完整性的要求。PPSQ 51A/53梯度系统更是在等度系统基础上，提高检测灵敏度，适合微量样品的氨基酸序列分析。我们应用岛津PPSQ 51A/53A开发了单克隆抗体药、重组蛋白药的N-末端氨基酸序列分析方法，另外，也开发了具有特殊结构的生物药N-末端氨基酸序列分析方法，如甲硫氨酸缺失、焦谷氨酸环化封闭等样品，编写了《蛋白质测序仪PPSQ在生物药N-末端氨基酸序列分析的应用》文集：包括经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离轻链和重链，从而测定N-末端氨基酸序列的单克隆抗体药贝伐单抗和曲妥珠单抗等；含有特殊结构的如N-末端部分甲硫氨酸缺失的重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子注射液原液、N-末端焦谷氨酸环化封闭类单克隆抗体帕尼单抗、含有二硫键的溶菌酶和催产素；用自制的脱盐装置分析具有高浓度盐的蛋白质药物重组人促红素原液（CHO细胞）和重组人粒细胞刺激因子注射液。关于岛津 岛津企业管理（中国）有限公司是（株）岛津制作所于1999年100%出资，在中国设立的现地法人公司，在中国全境拥有13个分公司，事业规模不断扩大。其下设有北京、上海、广州、沈阳、成都分析中心，并拥有覆盖全国30个省的销售代理商网络以及60多个技术服务站，已构筑起为广大用户提供良好服务的完整体系。本公司以“为了人类和地球的健康”为经营理念，始终致力于为用户提供更加先进的产品和更加满意的服务，为中国社会的进步贡献力量。