亲和素

内毒素亲和填料 内毒素是一种常见的蛋白污染物，它的存在使得蛋白的活性研究变得十分复杂，并且内毒素是一种对人类有害的化学物质，它能引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等一系列不良症状，因此，检测和去除蛋白中的内毒素有着十分重要的意义。 月旭Endotoxin rem Tanrose 4FF 内毒素亲和填料以自制的琼脂糖凝胶为基质、多占菌素B为配基，用于去除生物源蛋白类产品（包括多肽、抗体、多糖等）中的内毒素，但多占菌素B只对部分内毒素有抑制作用，而不能抑制所有内毒素。 技术参数 常见问题解决方案 #01 内毒素去除效率低，应当怎么做？ ①可能原因：样品pH值不在内毒素结合范围。解决方法：用0.1M NaOH或0.1M HCl调节pH至7-8。 ②可能原因：样品与填料接触时间短。解决方法：降低流速，增加样品接触时间。 ③可能原因：检测系统被内毒素污染。解决方法：确保所有试验用品均为无热源产品。 ④可能原因：内毒素与目的蛋白结合较强解决方法：优化样品pH，使样品能够与内毒素分离。 #02 样品被污染，应当怎么做？ ①可能原因：该填料纯化过其他样品。解决方法：增加接触时间；不要用使用过的填料来去除不同样品的内毒素。 #03 样品回收率低，应当怎么做？ ①可能原因：样品非特异性吸附在填料上。解决方法：增加样品和平衡液中的NaCl浓度。 ②可能原因：目的蛋白与内毒素结合一起被去除。解决方法：优化样品pH，使样品与内毒素分离。 订购信息

维生素B12（Vitamin B12）是唯一一种含主要矿物质钴的维生素，故又称钴胺素。维生素B12需要肠道分泌物的帮助才能够被吸收，主要的生理功能是参与制造骨髓红细胞，以及防止大脑神经受到破坏，严重缺乏可导致恶性贫血。本报告参考GB/T 5009.217-2008第二法-免疫亲和法，与直接提取法相比，免疫亲和法的检测限较低，可达到0.026 μg/g，比直接提取法低10倍左右。应用Primaide 系统，采用免疫亲和法进行样品前处理，对保健食品中的维生素B12进行了测定。样品中成功检测到维生素B12，且在样品中加入维生素B12标准品进行了加标回收率的测定。 标准样品测定例仪器配置 : Primaide 1110 泵，1210 自动进样器，1310 柱温箱，1410 紫外检测器。n 精密度GB/T 5009.217-2008中规定，重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对值不得超过算术平均值的20%。我们这里采用了计算相对标准偏差的方法，PM的重复性结果如上图所示，6次重复性实验，保留时间重现性RSD是0.07%，峰面积重现性RSD是0.26%，结果要优于标准规定。n 线性结果维生素B12在0.5 ~ 50.0 mg/L标准溶液的浓度范围R2 = 1.0000，线性关系良好。样品测定例n 样品前处理方法n 测定结果对维生素饮料和多维元素片中的维生素B12进行了测定，检测到两种样品中均含有维生素B12。为了验证准确性，进行加标回收率测定，在两种样品中加入维生素B12标准样品，进行回收率的测定，回收率分别为102%和87%，测定结果准确可靠。

应对霉菌毒素多毒素检测需求，普瑞邦推出多款多功能免疫亲和柱 Pribolab是面向全球提供霉菌毒素检测解决方案的服务商之一，针对霉菌毒素检测不断创新和研发检测新技术和新产品，近期举力推出多款使用价值较高的多功能/复合免疫亲和柱，包括：黄曲霉毒素,赭曲霉毒素多功能复合免疫亲和柱 3ml黄曲霉毒素,玉米赤霉烯酮,赭曲霉毒素多功能复合免疫亲和柱3ml呕吐毒素,玉米赤霉烯酮多功能复合免疫亲和柱3ml至此，普瑞邦公司真菌毒素免疫亲和柱形成的全系列产品：黄曲霉毒素总量免疫亲和柱、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M1、黄曲霉毒素B+G+M免疫亲和柱, 呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、伏马毒素、T-2/HT-2毒素免疫亲和柱；多功能复合免疫亲和柱包括：黄曲霉毒素总量/赭曲霉毒素多功能复合免疫亲和柱、黄曲霉毒素总量/赭曲霉毒素A/玉米赤霉烯酮复合免疫亲和柱、呕吐毒素＋玉米赤霉烯酮复合免疫亲和柱。此次Pribolab公司推出的霉菌毒素多功能免疫亲和柱，在利用免疫技术上创新实现了同时富集、净化多种霉菌毒素检测的要求，与之前的霉菌毒素多功能净化柱比较，其优势在于不仅实现了同时净化多种毒素的过程，尤其是净化效果优异，快速准确、灵敏度高，检测成本低廉, 保证了检测的高重现性和可靠性，完全符合多毒素检测的样品处理方向，是食品安全检测领域领先的新技术和新方向。为进一步推进霉菌毒素检测新技术的应用和推广，我公司携手普瑞邦针对新老客户开展优惠促销活动。如果您对霉菌毒素多毒素检测有需求和兴趣都可参加我们的优惠试用活动。。多功能复合免疫亲和柱的详细信息敬请来电索取！北京泰乐祺科技有限公司 客服热线：400-688-5349 13311089404联系电话：010-63380700，63395349, 52453170，57491886 QQ咨询：772836971 网址：www.rapid-bio.com 邮箱：taileqi@rapid-bio.com 关于普瑞邦: Pribolab?（普瑞邦）是面向全球提供霉菌毒素检测解决方案的主要服务商之一，凭借强大的研发团队和专业的霉菌毒素检测技术的研究，为全球农业生产、食品加工与粮食、饲料等行业提供专业的霉菌毒素检测技术与产品服务。PriboFast?霉菌毒素免疫亲和柱PriboFast?霉菌毒素多功能免疫亲和柱PriboMIPTM霉菌毒素分子印迹固相亲和柱PriboFast?霉菌毒素多功能净化柱PriboSpinTM霉菌毒素快速纯化小柱PriboFast?酶联免疫检测试剂盒PriboFast?KRC 光化学柱后衍生装置Pribolab?真菌毒素浓缩器PriboVitaTM维生素检测免疫亲和柱和ELISA试剂盒更多产品请登录公司网站查询或咨询当地授权销售商.

针对奶粉厂家普遍关注的黄曲霉素M1检测问题，磐合科仪于今年年初新引进了黄曲霉素M1免疫亲和柱，配合专业的全在线真菌霉素专用分析系统，可实现黄曲霉素M1 的连续、快速检测。 事件回放：一、2014年7月底，德州禹城的奶牛养殖户普遍反映，连续十多天，牛奶质量检测黄曲霉素超标非常严重，导致当地牛奶厂拒绝他们的奶源供应。其直接导火线是奶牛饲料的黄曲霉素超标（该批饲料检测的黄曲霉素数值是39.6，而国家允许的数值仅为10）；二、2014年七月初，半数花生酱样品检出黄曲霉素；三、2014年4月初，青岛海关破获14万吨花生走私案 ，其中强致癌物黄曲霉素超标；.......

杂色曲霉素是一种霉菌毒素，因结构与黄曲霉毒素相似，其毒性和致癌性受到世界各国的高度重视。本报告参考食品安全国家标准GB 5009.26-2016，应用日立 Chromaster系统测定了食品中的杂色曲霉素。样品经免疫亲和柱处理后，通过反相色谱法分离，在紫外检测器325 nm波长下对样品中的杂色曲霉素进行了检测。 ■ 标准品测定例?杂色曲霉素标准溶液在5.0~100.0 μg/L浓度范围内r2 = 0.9999 ，线性关系良好；对75.0 μg/L的标准样品，进行6次连续测试，保留时间RSD= 0.06%，峰面积RSD=0.35%，重现性良好。■ 样品前处理根据食品安全国家标准GB 5009.26-2016进行样品前处理，具体操作流程如下图所示：?■ 样品测定例对市售的大米、花生、玉米和黄豆等样品进行了测定，在确认未检出杂色曲霉素后，对样品添加了杂色曲霉素的标准品后进行分析，结果确认检出了杂色曲霉素。杂色曲霉素的加标回收率符合GB 5009.26-2016要求。 综上所述，日立高效液相色谱仪Chromaster对食品中杂色曲霉素进行检测，在选定的条件下，对标准样品溶液进行连续进样测定（n = 6），重复性良好。标准溶液在5.0 μg/L ～ 100.0 μg/L浓度范围内有良好线性关系（r2 = 0.9999）。样品的加标回收率结果也满足国标要求。结果表明，该方法适用于食品中杂色曲霉素的测定。

氨基糖苷类化合物（AGs）是由两个或两个以上氨基糖通过糖苷键与氨基环醇骨架连接而成的碱性低聚糖抗生素。这类抗生素包括：链霉素、新霉素、卡那霉素、庆大霉素、壮观霉素等。他们共同特点是水溶性好、性质稳定、抗菌谱较广，又因其价格低廉，在兽药领域应用广泛。AGs存在一定程度的耳毒性、肾毒性和神经肌肉阻滞作用。目前世界多个国家和组织建立了AGs在动物源食品中的相关限量标准，我国GB 31650-2019规定AGs在动物源食品中的限量如下所示：AGs检测方法及制约因素AGs分子中因富含氨基和羟基而呈强极性，其分子中缺少发色团和荧光团，反相色谱保留较差，因此动物源食品中 AGs的检测比其他抗生素更为复杂。目前 AGs的检测方法主要有免疫分析法、高效液相色谱-质谱/质谱法（HPLC-MS/MS）、液相色谱-串联质谱法（LC-MS-MS），其中免疫分析法方便快速更适合定性筛查检测，HPLC-MS/MS、LC-MS-MS定量准确、灵敏度高更适合确证检测。在乳及乳制品中，GB/T 22969-2008《奶粉和牛奶中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素残留量》，虽然只规定了链霉素、双氢链霉素和卡那霉素3种氨基糖苷类药物残留量的高效液相色谱-串联质谱测定的确证方法，但GB 31650-2019《食品中兽药最大残留限量》中还规定了其他氨基糖苷类药物包含大观霉素、安普霉素、庆大霉素、新霉素等，这些项目也是实验室对乳及乳制品安全检测过程的必检项目。目前HPLC-MS/MS、LC-MS-MS方法可对多种ＡＧｓ进行同时检测，但是一次性不能对多种氨基糖苷类药物富集净化是提高检测效率的主要制约因素之一！在动物组织中，GB/T 21323-2007《动物组织中氨基糖苷类药物残留量的测定 高效液相色谱-质谱/质谱法》规定了动物组织中大观霉素、潮霉素B、双氢链霉素、链霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、安普霉素、妥布霉素、庆大霉素和新霉素10种氨基糖苷类药物残留量的高效液相色谱-串联质谱测定的确证方法。但此检测AGs的方法前处理过程使用C18富集净化，检测限仅为20-100μg/kg。美正氨基糖苷类免疫亲和柱美正通过多年的积累，开发出一种使用氨基糖苷类免疫亲和柱前处理的方法，解决了动物源性食品中氨基糖苷类抗生素检测过程中前处理富集净化的难点。使用氨基糖苷类免疫亲和柱的前处理方法，可以将动物源食品中11种氨基糖苷类抗生素进行一次性特异性富集净化，能够更好地消除基质干扰，既提高了前处理富集净化效率又提高了分析的准确度和灵敏度。药物种类壮观霉素潮霉素B双氢链霉素链霉素丁胺卡那霉素卡那霉素安普霉素妥布霉素庆大霉素新霉素巴龙霉素产品特点特异性强：免疫学原理，对样本中AGs选择性高、特异性结合能力强；操作简单：可穿透式柱塞，使用便捷；性能优异：AGs加标回收率80-120%，准确度高样本类型动物源性食品，包括乳制品、动物组织及水产品等。药物残留类免疫亲和柱免费试用！美正在药物残留检测领域有更多的前处理富集净化方法，值美正十五周年之际，意向用户可对我司药物残留类免疫亲和柱进行免费试用。

据世界粮农组织的调查，世界上每年有25%粮食受到已确认的霉菌毒素的污染。霉菌毒素是霉菌在食品或饲料里生长所生产的代谢产物，对人类和动物都有害。霉菌也称丝状真菌，是菌丝体比较发达但没有较大子实体的小型真菌的统称，是微生物中的高级生物，其形态和构造比细菌复杂。月旭科技现特别推出Welchrom 新品复合型免疫亲和柱帮助大家轻松应对各种毒素的检测01 产品用途及原理Welchrom复合型免疫亲和柱用于从样品中分离、纯化真菌毒素，原理是基于抗原与抗体之间的特异性反应。免疫亲和柱中的抗体通过共价键作用悬浮在凝胶中，特异性吸附样品中的真菌毒素。如果供检测的样品中含有真菌毒素，样品通过免疫亲和柱时，毒素被抗体捕捉结合。所有其他物质，被从免疫亲和柱中清洗出去。甲醇作为洗脱液，将真菌毒素从抗体上洗脱。02 产品优势• 可同时测定多种真菌毒素含量，减少工作量。• 采用高特异性和高亲和力的的单克隆抗体。• 柱容量高，有效提高纯化效率。• 达到真菌毒素检测的国内外限量标准。• 良好的稳定性和可靠性，回收率高。• 纯化后直接用于ELISA法，高效液相色谱法，荧光光度法等。• 稳定性：12个月。• 可以用于复杂样品检测，包括食品、饲料、调味品等多种复杂基质。• 参考国家标准，检测结果准确可靠，满足客户的不同需求。03 样本处理步骤及亲和柱操作步骤（AOZ三合一免疫亲和柱为例）【样本处理步骤】（一）花生、玉米、大米、小麦及其制品、中药和饲料┅┅ 称取5g粉碎的样品，加入1g氯化钠，再加入甲醇-水（8：2）溶液20mL。┅┅ 涡旋或振荡提取20min。┅┅ 4000r/min离心5min或用定量滤纸过滤。┅┅ 取10mL滤液并加入40mLPBS混匀（中药材根据品种，可能需加入PBS-吐温20溶液），用玻璃微纤维滤纸过滤。┅┅ 取10ml过滤后液体过免疫亲和柱净化。稀释倍数：2（二）啤酒、黄酒等酒类┅┅ 称取脱气酒类试样(含二氧化碳的酒类样品使用前先置于4℃冰箱冷藏30min，过滤或超声脱气)或其他不含二氧化碳的酒类试样10g，用PBS定容至50mL，混匀。┅┅ 以均质器高速搅拌（10000r/min及以上，均质器速度较慢时，应适当延长提取时间），提取2min；也可采用摇床（200r/min以上）振荡、超声提取和涡旋提取20min的方式进行提取。用玻璃微纤维滤纸过滤。┅┅ 取10ml过滤后液体过免疫亲和柱净化。稀释倍数：0.5（三）酱油和醋等液体样品┅┅ 称取25g样品，以甲醇-水（8：2）溶液定容至50mL。┅┅ 以均质器高速搅拌（10000r/min及以上，均质器速度较慢时，应适当延长提取时间），提取2min；也可采用摇床（200r/min以上）振荡20min、超声提取20min和涡旋提取15min的方式进行提取。┅┅ 4000r/min离心5min或用定量滤纸过滤。┅┅ 取10mL滤液并加入40mLPBS缓冲液稀释，用玻璃微纤维滤纸过滤。┅┅ 取10ml过滤后液体过免疫亲和柱净化。稀释倍数：1【亲和柱操作步骤】┅┅ 将免疫亲和柱连接于10mL注射器下。按照样本处理步骤的上样量进行过柱。┅┅ 将空气压力泵与注射器连接，打开亲和柱下帽，调节压力使溶液以约1-2滴/秒的流速缓慢通过免疫亲和柱，直至液体排干。┅┅ 以10.0mL的PBS缓冲液淋洗柱子2次，弃去全部流出液，并通过5-10ml空气，吹干亲和柱。┅┅ 准确加入1.0mL洗脱液（甲醇-乙酸（98：2）溶液）洗脱，流速为1 mL/min ~2mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。【结果判定】经免疫亲和柱净化后，收集到的洗脱液可直接使用荧光计或者HPLC检测，也可使用薄层色谱或者酶联免疫试剂盒进行检测。洗脱液中各种毒素的检测结果乘以相应的稀释倍数，即为样品中对应毒素的浓度。04 色谱图经过AOZ三合一免疫亲和柱处理过的样品，在各自液相条件下的图谱：05 适用范围及性能用于检测谷物、酒类、中药等食品和饲料等样本中的真菌毒素。柱容量：AFB≥200ng，OTA≥100ng，DON≥1000ng，ZEN≥1000ng。回收率：≥80%。06 贮藏条件贮藏条件：可于2-8℃储存，不可冻存。保存期：该产品有效期为12个月。07 免疫亲和柱小贴士┅┅ 真菌毒素危害极大，应戴手套操作。┅┅ 不要使用过了有效日期的免疫亲和柱。┅┅ 洗脱液可以直接使用色谱级甲醇洗脱，但可能会降低赭曲霉毒素A回收率。┅┅ 多毒素检测中，呕吐毒素因为是水溶性，过柱操作时免疫亲和柱对有机溶剂耐受性低，所以组合中包含有呕吐毒素的免疫亲和柱前处理方法会相应复杂一些。黄曲霉毒素、玉米赤酶烯酮、赭曲霉毒素A的组合，前处理方法基本一致。08 相关标准OZ二合一免疫亲和柱：GB 5009.96-2016和中国药典的相应方法。DZ二合一免疫亲和柱：GB5009.111-2016、GB 5009.209-2016的相应方法。AZ二合一免疫亲和柱：GB 5009.22-2016、GB 5009.24-2016、GB 5009.202-2016和中国药典的相应方法。AO二合一免疫亲和柱：GB 5009.22-2016、GB 5009.24-2016、GB 5009.96-2016和中国药典的相应方法。AOZ三合一免疫亲和柱：GB 5009.22-2016、GB 5009.24-2016、GB 5009.202-2016、GB 5009.96-2016和中国药典的相应方法。AODZ四合一免疫亲和柱：GB5009.22-2016、GB5009.111-2016、GB 5009.209-2016、GB 5009.96-2016的相应方法。09 订货信息

继上篇《浅谈令人“爱恨交加”的Protein A亲和层析介质》（点击回顾）后，江必旺博士本期带我们了解影响Protein A层析介质的多种参数，供广大用户学习，也欢迎大家在评论区留言讨论。Protein A亲和填料的关键考核要素Protein A是用于抗体第一步分离纯化，其性能影响抗体生产的效率，成本，纯度等等，因此抗体厂家对Protein A 介质的要求较高。其关键点在Protein A 介质的载量，机械强度，耐碱性，使用寿命，纯度和回收率，配基脱落及HCP的残留及产品的质量和稳定供应等等。介质载量：层析介质的载量是药厂选择的重要参数，载量越高，同样柱体积填料可以处理更多的抗体料液，生产效率也就越高。但Protein A 亲和填料载量与柱保留时间有关，一般情况是柱留时间越长，测试的载量越大，也就是说流动相速度越快载量越低，这主要是因为抗体在介质微球中的扩散速度受限造成的。抗体的纯化生产效率与流动相速度有关，速度越快生产效率越高，但速度越快载量越低，上样量越少，因此要平衡好载量和流速以达到最高生产效率。评估亲和介质载量要看，其载量是在什么样的流速下测试的，理想的介质是在高流速条件下具有较高的载量。这样有利于兼顾生产效率和产量；抗体回收率和纯度：一般来说Protein A亲和层析介质用于抗体分离纯化回收率都比较高（一般都高于90%以上），回收率越高，成本越低。另外纯化后抗体的纯度也是药厂重点考虑的因素，Protein A 亲和层析往往是用于第一步捕获，一步亲和层析就可以把纯度提高到95%以上，通过第一步纯化后抗体纯度越高，后续精细分离的压力越小。抗体回收率和纯度往往更Protein A配基种类有关系，不同厂家采用的配基不同，会影响收率和纯度。介质寿命及耐碱性：亲和层析介质比离子交换介质价格高很多，而且使用寿命又比离子交换介质短很多，使得亲和层析介质在抗体的纯化介质中占据80%成本。因此亲和层析介质的寿命是抗体厂家要考虑的另外一个重要参数。高效服役时间的长短会在一定程度上影响纯化的经济性，也能从某种程度上避免更换填料带来的潜在问题；另外药物生产过程中，氢氧化钠被广泛用于层析介质及系统的清洗、消毒及存储等过程。采用氢氧化钠再生可避免不同cycle间的蛋白及核酸的交叉污染，也可有效降低Bioburden。当浓度大于0.1M时，可有效灭活Murine Leukemia Virus等病毒，杀灭细菌及芽孢杆菌，降低内毒素水平。因此Protein A 亲和层析介质的耐碱性对其寿命及纯化抗体的质量具有重大意义。一般Protein A 亲和层析介质需要耐受0.5 M NaOH溶液清洗，且在经过100 Cycles清洗后，动态载量仍要维持在95%以上； 表1氢氧化钠对不同病毒灭活的效果统计HIVBVDCPVBHVPOLSV-40MLVADV0.1M NaOHSpike2.0×1069.5×1062.0×1096.9×1097.1×1081.7×1082.6×1052.2×10820min5.8×1021.5×1049.6×1024.5×1012.0×1044.7×1044.0×1016.3×10160min5.8×1022.7×1045.0×1034.5×1012.1×1032.0×1044.3×1012.9×101Inactivat（log10)3.52.55.68.25.53.93.86.90.5M NaOH Spike2.0×1069.5×1062.0×1096.9×1097.1×1081.7×1082.6×1052.2×10820min5.6×1021.7×1021.5×1035.9×1012.0×1048.4×1034.7×1012.0×10160min6.7×1022.7×1025.0×1035.9×1016.2×1031.0×1035.5×1012.2×101Inactivation（log10)3.54.76.18.15。16.23.77Note：病毒浓度检测采用组织细胞感染计量TCID50大量的微生物如酵母细菌可干扰层析过程，同时可以造成筛板堵塞等问题，更重要的是微生物产生的内毒素和蛋白酶严重污染纯化料液。氢氧化钠可有效抑制、杀灭酵母及细菌等微生物。数据见下表。表2 氢氧化钠对不同病毒灭活的效果统计OrganismConc.NaOH(M)Time(hrs)Temp.E.coli0.0124/22℃S.aureus0.114/22℃C.albicans0.514/22℃A.niger0.514/22℃B.subtilis spores14822℃P.aeruginosa1122℃Note:细菌低于检测限度(3Organisoms/ml)所需要的时间内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁成分，主要是类脂多糖，也被称作热源。注射药物中含有纳克级含量即可使人体产生寒颤，高热甚至休克等不良反应。GMP生产的各环节严格控制热源，层析过程也是重点监控步骤。采用氢氧化钠对层析系统及填料进行SIP可确保把热源含量降至最小。下图是不同浓度氢氧化钠对于内毒素的灭活效果。机械强度：高机械强度的介质耐压性好，耐受更高的流速，从而提高生产效率，缩短纯化周期；另外高机械强度填料可装填更长柱子，从而提高批次处理量；高机械强度介质可以减少碎片避免筛板堵塞，降低压力；还有高机械强度的介质可以上高浓度，高粘度的样品；最后高机械强度有利于放大生产，越大的柱子，对介质机械强度要求越高，因此高机械强度的介质在大规模层析纯化过程中越不容易给压塌，可以确保生产的安全性。Protein A层析介质除了要考虑载量，机械强度，耐碱性及寿命外，还要考虑Protein A的 脱落及内毒素的控制及生产的批次稳定性等。下期，江必旺博士将为我们带来“Protein A 亲和层析介质的制备方法”干货文章，敬请期待。

新品上市Watbule P10：全自动免疫亲和纯化仪“还在手工操作免疫亲和柱纯化样品？手工过柱，手工过柱，手工过柱… 想要节约纯化时间，提高纯化效率？想要操作简单，自动化程度高，结果重现性佳？想要专用于免疫亲和纯化，稳定可靠？好的，月旭科技Watbule P10自动过柱来了！01免疫亲和柱技术免疫亲和柱的功能基于抗原与抗体间可逆的特异性结合反应，使其可从复杂样品基质中特异性地回收目标化合物。上样后，柱中以共价键形式偶联在凝胶上的抗体会与抗原（即目标化合物）特异性结合，杂质不会被结合，大部分随样品溶液流出小柱。通过淋洗的方式除去小柱内剩余杂质后，使用纯甲醇或其他洗脱液（根据对应产品说明书选择）进行洗脱即可得到洁净的目标化合物溶液，可直接用于后续检测。02免疫亲和柱的应用免疫亲和柱主要应用于以下两个领域，在食品、中药材和饲料等行业有广泛应用。● 食品、饲料、中药材中真菌毒素的测定（黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮）● 食品中农残、营养成分等其他检测项目。03全自动免疫亲和纯化仪Watbule P10产品结构和界面待纯化样品仓：用于放置待纯化样品纯化后样品收集仓：用于放置收集瓶收集盒：用于收集亲和柱的下柱帽清洗液瓶：用于存放清洗液（Rinsing）洗脱液瓶：用于存放洗脱液（Elution）04P10自动过柱与手工过柱对比采用加标样品进行P10自动过柱与手工过柱对比实验的结果如下：如上图所示，当样品量较少时，仪器所用时间与手工操作区别不大。当样品量增大时，仪器用时开始具有显著优势。因为仪器采用分步依次进行的原理，样品间的间隔时间是固定的，手工操作，当样品量超过操作架容纳量时，多出的部分需要在下一批次处理，时间相应延长。人工连续操作时间过长，容易出现错误，对实验员要求较高。增加操作员的数量，可以提高效率。如上表P10纯化仪平均值0.992mL，标准偏差0.0092，变异系数0.92%；手工操作平均值0.962mL，标准偏差0.0589，变异系数6.13%。P10表现出较明显优势。上图所示，P10纯化仪回收率比较稳定，回收率差异在3.41%，而手工操作时差异在7.07%。P10优势比较明显。05P10技术参数06产品信息Watbule P10免疫亲和纯化仪的货号为P10，亲和纯化仪的小柱货号如下所示：

球菌的细胞壁，与IgG的Fc片段具有非常强的特异性，分子量约为42×103，如图所示。一般在蛋白 A亲和层析中，配基在中性pH条件下结合抗体，在酸性pH条件下与蛋白解离。‍蛋白A与抗体IgG的Fc片段结合模式基于蛋白 A 亲和层析的抗体捕获工艺较为稳定，但也存在一些不足，主要包括：（1）介质成本高。（2）配基易脱落。（3）洗脱条件苛刻。（4）Protein A介质的再生比较困难。针对以上问题，部分商业化蛋白A亲和层析介质中使用的基本为改造的蛋白A配基，改善了天然蛋白A的缺点，提高了耐碱能力和洗脱 pH。月旭科技推出的耐碱抗体亲和介质-耐碱Protein A Solid/耐碱Protein A 4FF， 由大肠杆菌表达，经层析纯化获得，纯化过程不适用抗体柱亲和层析，避免了产品中掺入无关IgG的可能，改配基pH耐受0.5M NaOH和0.5M HCl处理，不降解，抗体结合能力不变。该介质适合从大批培养液捕获单克隆抗体或Fc融合蛋白，也适合与从腹水或者血浆中捕获多克隆抗体。技术参数‍应用实例订货信息

下游工艺先进性决定了药品的质量抗体药物生产是个非常复杂的过程，大致分为上游的发酵及下游的分离纯化：上游工艺主要包括细胞复苏、传代、发酵生产。而下游工艺主要包括膜过滤及多步层析分离纯化。过去十多年来，基因工程获得突飞猛进的进步，细胞培养的表达量从原来的不到0.5 g/L 到现在普遍达到5g/L，有的甚至超过10g/L。这些进步是由细胞表达载体的开发，克隆筛选以及细胞培养基优化等技术创新所驱动的。由于发酵产率的大幅度提升，使得上游细胞培养成本大幅度降低，下表是抗体生产成本与表达量的关系。表1.表达量与抗体生产成本关系Titer（g/L）Annualproduction（1000kg）DisposableMaterial物料成本（$/g）Cell Culture PurificationFacilitiesc厂房/设备/人工FormulationCost（$/Vial）Total Cost（$/Vial）100 mg 1 g0.51204100422 134244425413 435102410412 26与上游十多倍生产效率提升相比，下游分离纯化技术进步明显滞后，导致下游工序成为生产瓶颈，抗体主要生产成本也转移到下游。下游工艺在整个生物制药生产中占据60%以上生产成本，也被认为是最需要改进的技术领域。下游工艺先进性决定了药品的质量，及药品生产效率和成本，也成为生物制药企业的核心竞争力所在。由于生物分子由于结构复杂，对外部条件敏感，稳定性差，杂质多，浓度低等特点，且监管部门对生物药的纯度和质量要求越来越高。因此下游的分离纯化成为生物制药的瓶颈，也是生物制药成本最大的一块。层析技术由于具有分离纯化效率高，条件温和且容易保持目标分子的生物活性，因此层析是生物制药分离纯化最主要方法。层析介质的“皇冠之珠”——令人爱恨交加的Protein A生物大分子的层析方法主要分为亲和，离子交换，疏水作用及体积排阻。亲和层析是利用介质上的配基与目标蛋白分子有特异性结合，而对其它的蛋白质及杂质不吸附，因此杂质从层析柱中流出，被吸附的目标生物分子通过改变洗脱液的条件使被分离物质与配基解吸附，即可达到分离纯化的目的。亲和层析无疑是最理想的层析分离方法，其与其它分离方法如离子交换、疏水、体积排阻等最大的不同是由于亲和层析只与目标生物分子发生专一性吸附，其它杂质都不吸附，因此亲和层析分离纯化的工艺条件与杂质的组成及含量多少关系不大，从而大大简化亲和分离工艺开发方法，而其它分离方法如离子交换、疏水、体积排阻等都是基于目标分子跟杂质分子之间的大小，电荷及疏水强度的差异来分离的，因此即使分离纯化同样的目标分子，但不同样品的杂质组分不同，含量不同，纯化工艺方法就需要重新调整。Protein A填料由于与大多数抗体有特异性吸附，因此被广泛地用于抗体药物生产过程中，极大地提高了抗体的分离纯化效率，毫无疑问Protein A 亲和介质是层析介质的皇冠上的明珠，其价格也是普通层析介质的十几倍。Protein A 亲和层析介质之所以会成为层析介质的贵族与它对抗体有特异性吸附有关。Protein A 亲和层析是利用Protein A 配基与目标抗体具有专一亲和吸附作用从而达到分离纯化抗体的目的。因为配基与目标抗体的作用的专一性，其分离纯化与目标样品抗体纯度无关，也与样品杂质含量和种类多少无关，使用Protein A 填料一步纯化目标抗体就可以达到95%纯度以上，回收率达到90%以上。Protein A 层析介质的出现，让抗体的分离纯化步骤及方法大大简化，使得抗体的分离纯化比其结构简单多的生物分子都要简单。抗体分离纯化基本都是标准化的三步曲，第一步用Protein A进行抗体捕获，第二步用阳离子去除多聚体，第三步用阴离子精纯去除剩余少量杂质。Protein A亲和层析已经成为平台化技术，被广泛应用在抗体类分子捕获阶段。Protein A与抗体分子之间可特异性结合，特别对IgG1、IgG2、IgG4有较强亲和作用，使得抗体分子与发酵液中不具FC端结构的杂质如宿主蛋白与核酸等有效分离，进而达到纯化目的。亲和特异性赋予了Protein A填料捕获时可接受更宽泛的样品条件，如pH及电导率等。因此，发酵液通过离心、深层过滤后即可直接进行亲和捕获。另外与离子交换、疏水层析等方法相比，Protein A亲和层析纯化抗体料液可以获得更大的纯度，一步就可以获得抗体纯度大于98%，而且在回收率上也有明显优势，亲和捕获回收率可达95%。抗体工作者对Protein A 是爱恨交加，爱的是Protein A 亲和层析的出现大大简化抗体的分离纯化工艺开发,并大幅度提高抗体纯化效率和纯度，而且几乎适用于所有抗体的分离纯化。恨的是Protein A 亲和介质价格贵，寿命短，占据下游分离纯化成主要本。虽然很多科学家曾经致力于研究新的价廉抗体亲和配基以取代昂贵的Protein A亲和配基，但都没有成功找到一个可以取代Protein A 配基的分子。Protein A亲和层析因其高度特异性及同时具有浓缩的效果成为过去近30年里抗体纯化捕获的金标准。Protein A亲和层析介质贵的主要原因有两方面，一方面是Protein A 蛋白配基成本远比传统的小分子配基昂贵，另一方面，Protein A亲和填料寿命较短也是其成本过高的主要因素。一般离子交换填料使用寿命可高达1000次，而亲和填料寿命通常在100-200次。还有Protein A 介质贵与其一直处于高度垄断的局面也有关系，因此Protein A 亲和层析介质国产化以降低抗体的生产成本是必然的发展趋势。ProteinA结构及作用机制ProteinA蛋白是金黄色葡萄球菌细胞壁锚钉蛋白，其C端为细胞壁结合区域，抗体结合区域包括五个同源区域（E、D、A、B、C，N端顺序）。五个domain的序列同源率65-90%（图1）。图1 重组与天然ProteinA基本性质三维空间上，抗体FC端CH2-CH3区域与ProteinA蛋白B结构域上两条反相平行的α螺旋结构相互结合。抗体与ProteinA结合时，主要依靠的是疏水作用力，其次是氢键和双盐桥作用力。疏水作用主要来自于核心区域组氨酸残基。抗体上高度保守的组氨酸残基与ProteinA上的组氨酸残基发生相互作用。碱性或中性条件下，组氨酸残基不带电荷，其咪唑环的疏水效应的增强促进了FC端与ProteinA的结合。当pH降低至4.5以下时，组氨酸带上正电荷，于是两者产生静电排斥力，抗体从ProteinA上解离。除FC端恒定区域外，可变区VH3也参与了ProteinA结合及洗脱，影响洗脱pH（图2）。图2单抗分子结构 图3 抗体分子与ProteinA作用Protein A来源于金黄色葡萄球菌的一个株系，它含有5个可以和抗体IgG分子Fc段特异性结合的结构域，当其作为亲和配基被偶联到填料基质上后，可特异性地与样品中的抗体分子结合，使其他杂蛋白流穿，借助高效亲和层析仅需一步就可使目标抗体纯度超过95%，此外Protein A也可结合另一些免疫球蛋白，如可用于某些种属IgA、IgM的纯化。由于Protein A亲和层析基于天然存在的生物大分子之间特异性结合为分离机理，这种得天独厚的势使得Protein A亲和层析成为重组蛋白\抗体等分离纯化中的绝佳选择（图3）。下一期，江必旺博士将继续分享Protein A亲和填料的关键考核要素有哪些，敬请持续关注。

p style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em text-align: left text-indent: 2em "span style="text-indent: 2em "近期，中国计量科学研究院武利庆及其合作者杨屹、苏萍等发表系列文章（Anal.Bioanal.Chem. 412(2020)2777-2784、Talanta 178(2018)78-84、Microchem. J. 157(2020)104954），介绍了基于表面等离子共振光谱法和数字ELISA的蛋白质免疫亲和活性浓度绝对测量方法。/spanbr//pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em "蛋白质是一类重要的生物大分子，免疫分析是其常用的定量分析手段，在测量和质控中不仅关心目标蛋白的含量，更为关注它的活性与功能，其量值的准确对于保证人民大众健康与安全具有重要意义。活性浓度测量手段的匮乏限制了蛋白质产品活性量值的质控与标准的建立。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em "针对这一难题，作者以G2-EPSPS、人肌红蛋白为例，通过表面等离子共振，在部分传质限制条件下，通过扩散速率等测定直接计算出可被抗体识别的目标蛋白浓度，即免疫亲和活性浓度；或采用寡聚核酸标记抗体，借助邻位连接技术和数字PCR技术，以数字ELISA的方式直接测定样本中目标蛋白的免疫亲和活性浓度。两种方法均无需外部标准品，是一种绝对测量手段。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " /pp style="text-align: center"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 241px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202010/uepic/06042747-02ad-460f-82a4-752c907691ff.jpg" title="图片1.png" alt="图片1.png" width="600" height="241" border="0" vspace="0"//pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em text-indent: 0em text-align: center "图1 基于表面等离子共振技术的蛋白免疫活性浓度测定原理图span style="text-align: center text-indent: 0em " /span/pp style="text-align: center"img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202010/uepic/82c05090-1aa2-4789-9467-c4fd8c632095.jpg" title="图片2.png" alt="图片2.png"//pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em text-indent: 0em text-align: center "图2 基于数字ELISA技术的蛋白免疫活性浓度测定原理图/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " /pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em "蛋白质免疫亲和活性浓度的绝对测定将有助于准确表征蛋白质与其抗体之间的相互作用，保证免疫分析的准确可靠，同时有助于蛋白质产品的活性量值的质控与标准的建立。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em "2020年11月10-12日，中国计量科学研究院和国际计量局拟联合举办第三届 “药物及诊断试剂研发与质控——测量与标准，质量与安全（TD-MSQS 2020）” 国际研讨会，以期进一步促进该领域的学术交流和技术发展，提升企业的研发水平和产品质量。本次会议将在南京市政府的支持下，在江苏省南京市举行。/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em "本次会议可通过官方网站a href="http://tdmsqs.ncrm.org.cn" target="_blank"http://tdmsqs.ncrm.org.cn/a注册或扫描二维码注册，注册成功后请填写参会回执发送至会议邮箱pptd@nim.ac.cn。/pp style="text-align: center"img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202010/uepic/c475b4b8-ad00-4d02-bdea-04a9663c0909.jpg" title="图片5.png" alt="图片5.png"//pp style="margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em text-indent: 0em text-align: center "欢迎各位专家、同仁报名参会！/pp style="text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em "更多信息请关注会议官方网站：a href="http://tdmsqs.ncrm.org.cn。" _src="http://tdmsqs.ncrm.org.cn。"http://tdmsqs.ncrm.org.cn。/a /pp style="text-indent: 2em "span style="font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai "strong学者简介：/strong/span/pp style="text-indent: 2em "span style="font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai "武利庆，研究员，中国计量科学研究院前沿计量科学中心蛋白质室主任/span/pp style="text-indent: 2em "span style="font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai "杨屹，教授，北京化工大学化学学院/span/pp style="text-indent: 2em "span style="font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai "苏萍，副教授，北京化工大学化学学院/span/p

文/Tosoh Bioscience应用专家Jonas Wege 单克隆抗体是目前生物制药行业中成熟的靶向分子，适用于治疗各种疾病，且生产便捷、易于放大。然而，生物制药的创新者并没有安于现状，而是不断推动当前疗法背后的科学进步。抗体片段是目前最具前景的一种形式，不仅能够改善靶向点位，还能够提高亲和结合力。另外，工程技术的不断进步也推动了抗体片段重组生产变得更加经济。抗体片段是相对较新的技术，正确的分析和纯化对于为患者提供安全、有效的治疗至关重要。我们的生物制药合作伙伴不仅信赖Tosoh Bioscience高质量的色谱解决方案；他们还相信我们的专家能够帮助他们开发最具性价比效益的工艺流程。 减轻负担生物制药厂家一直致力于在抗体捕获阶段生产更高浓度的产品，继而保证后续所有操作（包括精制）具有更高的成本效益和时间效率。然而这是一个史无前例的挑战，因为片段无法与Protein A（依赖于Fc结合）等传统层析填料结合。目前来说，Protein L是应对这类纯化挑战的第一选择。Protein L填料基质表面的蛋白质通过Kappa轻链（存在于许多抗体片段中）与抗体结合来清除杂质。尽管Protein L非常适合纯化抗体片段，但与Protein A相比，Protein L仍然属于一种新型的层析介质。开发人员报告称，传统的Protien L填料表现出的动态吸附载量更低。简而言之，最终只有少量的靶向分子能够吸附到层析柱中，进而限制了层析柱的性能，导致抗体捕获步骤更加昂贵、更加费时。制造商面临的另一个潜在难题是填料在重复清洗过程中的化学稳定性较低。层析柱运行后，通常需要使用碱性溶液进行清洗。然而，传统Protein L填料化学稳定性差，往往会导致性能部分损失。为应对该问题，就需要在清洗少量次数后更换填料，导致成本升高、工作量增加。 为了应对挑战，东曹开发了一种行业领先的耐碱性Protein L层析填料——Toyopearl AF-rProtein L-650F。其设计首先考虑到了高动态吸附载量，意味着层析柱中的填料能吸附更多蛋白，纯化相同数量靶向分子需要的运行次数更少。事实上，我们的Protein L亲和填料对Fab的动态结合载量在任何驻留时间内都至少是其他市售填料的两倍以上，这显然更有助于提高生产效率和生产力。我们不仅研究了填料在抗体片段捕获步骤中的性能，还探讨了填料在整个纯化过程中的可重复使用性。由于提高了填料的耐碱性，因此可以在同一色层析柱上运行多次纯化循环。最后，我们还针对不同的清洗方案进行了广泛的试验，加上我们在填料方面的专业知识，极大地提高了产品的纯度和填料的寿命。因此，我们的生物制药合作伙伴所需的填料更少，能够将更多资源用于开发最有效的工艺过程，并且借助我们的专业知识尽快完成工艺开发。 成功背后的科学虽然我们的Protein L填料促进了抗体片段捕获工艺的革新，同时我们也认识到了持续改进的迫切性，对东曹来说，这意味着我们将持续专注于高质量的研发。事实上，不论是我们内部的独立研究，还是与外部伙伴的合作，我们一直奋战于多个更加广泛的研究项目，旨在优化整个工艺流程的生产效率。比如，目前我们正在评估如何将Protein L介导的捕获步骤转移到连续流色谱中。我们期望这种具有成效的、高效的选择能够为我们的客户带来无限可能。 最重要的是，东曹始终致力于开发更加高效的抗体片段纯化解决方案。凭借悠久的历史经验和丰富的技术专长，我相信我们是寻求节省成本和提高生产率的药物研发公司的最佳合作伙伴。解决方案 Wacker Biotech（瓦克生物技术）是WACKER Group下属的负责生物制药业务的公司。该公司在使用大肠杆菌作为表达系统生产抗体片段方面有着多年的经验。但这一过程并非没有挑战。这里，Wacker Biotech的业务发展经理Ilona Koebsch和下游工艺专家Thomas Walther就该公司面临的一些生产挑战，以及东曹是如何协助其开发解决方案方面进行了阐述。 最有趣的抗体片段亚型是什么？ Koebsch：抗体片段的尺寸、结构和功能各不相同。但是，从治疗角度来看，Fab和所有包含抗原结合位点的变体算得上是最有趣的抗体片段技术的代表。值得注意的是，片段尺寸足够小，才能穿透组织，这对于许多治疗和免疫组织化学来说是必不可少的。另外，由于这些片段相对较小，使用原核表达系统（如大肠杆菌）进行生产也更加容易，更加经济。生产Fab面临的主要挑战是什么？ Walther：根据结构的不同，Fab既可以是可溶性的，也可以组装成包涵体（聚集的结合蛋白）。生产厂家还必须在发酵及下游工艺中保持其折叠和结构，确保Fab具有生物活性。对于上游工艺，主要任务始终是找到表达系统（宿主和质粒）和培养参数的最佳组合，以实现高效、稳健的生产工艺。但是，在我看来，最关键的挑战是找到合适的模型来模拟特定结果，或是在实验室规模下模拟大规模生产过程。在下游工艺中，挑战主要包括样品结构的复杂性、开发时间的长短以及亲和填料对大多数常见清洗方案的低耐受性。WACKER是如何应对这些挑战的？ Koebsch：WACKER开发了两种独特的基于大肠杆菌的表达系统，能够高效生产不同的抗体片段。ESETEC是一种独特的表达系统，可控制发酵液中正确折叠的重组蛋白产品的分泌。简而言之，这有助于简化初级回收和纯化过程，从而降低产品成本。我们还针对疏水性抗体片段开发了FOLDTEC技术。该技术包括高效的大肠杆菌菌株、不含抗生素与噬菌体的质粒保持系统，以及全面的复性技术。我们没有相关的专利技术来解决下游工艺中存在的难题。高通量、良好的分辨率、低背压、易于操作（就柱填料而言）、洗脱时间短、使用寿命长、非特异性吸附低，这一切对于层析填料来说都是必不可少的！东曹是如何协助WACKER应对这些挑战的？ Walther：我们在一个项目中使用了我们以前的首选填料，但由于吸附载量太低而失败了。此时，我们在WACKER其他分公司同事的推荐下，使用了东曹的AF-rProtein L-650亲和填料。我们将东曹的填料与其他三种声称可以特异性结合Kappa轻链的填料进行了比较。我们发现，AF-rProtein L-650填料的结合能力明显高于竞品（约3倍），而且目标蛋白的回收率也更高。同时，蛋白杂质的含量也是测试填料中最低的。最后，AF-rProtein L-650的流速也明显优于其他测试填料，这使我们能够用更小的柱体积来装填填料，为我们的客户带来了真正的成本优势。我们还得到了东曹填料和技术销售专家的大力支持，在为填料产品选择合适型号的层析柱方面获得了建设性的建议。很明显，东曹Protein L对于其他同类填料是一个强大的竞争对手，它应该会让其他供应商重新考虑他们当前的产品阵容。文章来源：The Medicine Maker：https://themedicinemaker.com/fileadmin/issues/1021_TMM_Issue.pdf

近日，东曹(TOSOH)推出了新的专为单克隆抗体的分离纯化而设计的亲和层析填料TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F，其特点是具有高吸附载量，和优异的耐碱性能，主要适用于单克隆抗体(IgG1为主)、IgM和Fc融合蛋白的分析。和之前的具备高机械强度、高流速的A-650F不同，HC-650F的优势在于高载量，对抗体的吸附载量可达到68g/L以上。　　东曹还推出了新型的三款用于分析抗体药物中多聚体、二聚体、单体及抗体断片的硅胶基质SEC色谱柱，针对单抗类药物在其生产、贮存过程中容易形成二聚体或多聚体、抗体断片的问题，用于在药物研发以及纯化生产中检测和控制多聚体含量。　　其中TSKgel SuperSW mAb HR使用硅胶基质的4&mu m粒径填料，具有高分离度，并与TSK经典款色谱柱G3000SW具有同样的分离范围，非常适合用于单克隆抗体的二聚体、单体及片段的分离分析。　　TSKgel SuperSW mAb HTP适用于高速分离、高分离度的抗体分析。使用与SuperSW mAb HR相同的填料，仅需一半的时间就能达到相同的分离效果。　　TSKgel UltraSW Aggregate使用硅胶基质的3&mu m粒径填料。分子量排阻界限更高，适合用来分析抗体药物中三聚体及多聚体这种大分子量的蛋白。

p　　药物与受体相互作用研究在药物研发过程中发挥着非常重要的作用，其研究方法的便捷程度以及准确度直接影响a title="" style="color: rgb(255, 0, 0) text-decoration: underline " href="http://www.instrument.com.cn/application/industry-S22.html" target="_self"span style="color: rgb(255, 0, 0) "strong药物研发/strong/span/a的效率。一般研究药物受体的相互作用均采用放射配基结合分析法和亲和色谱法，但因放射配基结合分析法操作复杂，需要制备特定的放射性配基，使应用受到一定的限制 而通常的亲和色谱法需要制备一定数量及一定纯度的受体，难度较大，且可能会影响受体对药物的选择性。/pp　　1996 年，西安交通大学贺浪冲教授提出细胞膜色谱法(cell membrane chromatography，CMC)，经过20 年的不断发展，CMC法已逐步成为研究药物与膜受体亲和作用的有力工具之一。CMC系统将完整的细胞膜包覆于硅胶表面，在仿生理条件下制备成色谱柱进行成分受体相互作用研究，可以快速筛选中药复杂体系中的活性成分，并准确计算出其与受体间的配位亲和常数。/pp　　近日，西安交通大学王嗣岑教授等人在《药学进展》杂志发表文章“ 细胞膜色谱法用于药物与受体相互作用研究进展”，详细介绍了细胞膜色谱法的前世今生及相关应用。/pp　　传统的CMC方法经历了2 次“更新换代”：首先，原CMC 模型中分离鉴别采用离线方式完成，即通过筛选发现在特定细胞膜固定相上有保留的中药部位，采用人工方法将保留组分接收并进行下一步分离及鉴定。十几年来通过对CMC 模型的改造，现已成功构建集“ 活性识别- 色谱分离- 分析鉴定”于一体的CMC/HPLC(GC)/MS 在线二维分析系统 利用“ 双捕集环” 和“ 双富集柱”交替富集- 分析模式，将原有色谱系统成功改造为新的在线二维分析系统 并成功研制了在线阀控切换装置，真正实现了高通量筛选。其次，原CMC法中，靶细胞是通过生物组织和一般培养方法获得的，其细胞膜上的非“目标”受体的表达数量很多，而“目标”受体表达数量有限且不可控，由此建立的CMC 法对配体的特异性、敏感性和选择性受到了不同程度的限制。近年来，随着生物技术的不断发展，研究者利用现代分子生物学手段，利用外源重组质粒构建了稳定高表达野生型表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、血管内皮生长因子受体(vascular epidermal growth factor receptor，VEGFR)、成纤维生长因子受体-1 (fibroblast growth factor receptor-1，FGFR-1)等受体的人胚肾HEK293 细胞株，并以相应受体选择性拮抗剂为对照样品，成功建立了受体高表达CMC模型，发现了苦参、独活、虎杖、黄芪、川乌和红毛七中选择性作用于上述受体的活性组分 分子药理学实验证明筛选得到的化合物可以抑制相应受体蛋白的表达，并具有剂量依赖性。/pp　　药物-受体的亲和作用直接影响药物的代谢过程及药效学，细胞膜色谱作为一种全新的生物亲和色谱，实现了高效液相色谱分离和受体药理学的有机结合，用于表征药物- 受体的亲和作用并求解药物作用的解离常数。但这个过程往往不是几种简单理想的模型能够准确描述，所以如何避免测定中的干扰、增强方法的专属性是今后研究的重点所在。此外，细胞膜色谱有其特殊性，载体表面的细胞膜活性随时间不断衰减， 因此如何将亲和色谱理论应用到细胞膜色谱法中，在较短的时间内观察配体在细胞膜固定相上的保留特征，建立快速表征药物– 受体亲和作用的研究方法，也是一个非常重要的研究课题。/ppbr//p

Part 1研究背景在生物化学中，蛋白质二聚体是由两个蛋白质单体或单个蛋白质形成的大分子复合物，它们通常是非共价结合的。蛋白质二聚体是一种蛋白质四级结构。有些蛋白需形成同源或者异源二聚体才能发挥其特定的功能，且不同聚集体的亚型与不同靶蛋白特异性结合，如14-3-3蛋白。对聚集体的状态维持和解离研究能更加清楚的了解生物学过程，并且开发特异性的靶标药物，用于疾病的治疗。由于聚集体是蛋白的四级结构组成部分，因此，一般来检测聚集体的亲和力需要先形成蛋白单体，也就是极低的蛋白浓度，对于很多互作方法来说无法实现检测。下方这篇Cell文献介绍了MST成功检测蛋白的二聚体亲和力以及小分子对聚集过程的影响。Part 2研究内容美国斯坦福大学Paul A. Khavari小组使用葡萄糖解聚DDX21二聚体来调节mRNA剪接和组织分化。2023年1月出版的《Cell》杂志发表了这项成果。https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.12.004IF: 64.5 Q1葡萄糖是一种普遍的生物能量来源，此外，研究发现，葡萄糖可能重塑分化所需蛋白质的功能，使分化过程得以实现。DDX21是一种DEAD-box RNA解旋酶，为同源二聚体状态，DDX21调节黑素细胞干细胞的分化。然而，DDX21在表皮分化中的功能尚未不清晰。在该研究中，作者发现，葡萄糖结合DDX21的ATP结合域，改变其构象，进而造成DDX21解离。在分化过程中，DDX21以葡萄糖依赖的方式定位于mRNA内含子中特定的模体，并促进关键的促分化基因的剪接。为了更清楚地了解葡萄糖对DDX21二聚化的影响，作者需检测（不）结合葡萄糖时DDX21二聚体亲和力。MST技术上机检测的浓度可以低至pM-nM，保证DDX21为单体状态，进而获得准确的二聚体亲和力结果。此外，MST对缓冲成分没有要求，并且是检测达到平衡状态时的亲和力。因此，可以将葡萄糖作为缓冲成分加入到体系中，并且使葡萄糖和DDX21达到平衡后再进行检测。MST亲和力结果表明，葡萄糖显著抑制DDX21二聚化（降低了近7倍）。图1：微量热泳动（MST）检测DDX21的二聚化（黑色）以及存在350uM葡萄糖（红色）或者半乳糖（蓝色）时亲和力。Part 3技术优势在这篇工作中，通过MST技术确定了DDX21形成二聚体的亲和力，以及葡萄糖与DDX21的作用。对于分子互作亲和力的检测，MST上机浓度极低，保证蛋白的单一状态，同时节省样本。当检测多个分子互作时，可以孵育达到平衡，获得准确的多元的亲和力。

大家好，本栏目供稿来自于中山大学李惠琳课题组，以后将定期为大家带来质谱新技术、新方法领域的前沿文献与工作交流，欢迎评论互动。本周为大家分享一篇发表在mAbs上的文章，Non-targeted characterization of attributes affecting antibody-FcγRIIIa V158 (CD16a) binding via online affinity chromatography-mass spectrometry1，通讯作者是美国加利福尼亚州Amgen公司的Pavel V. Bondarenko。Fcγ受体（FcγR）是免疫球蛋白（Ig）超家族的膜结合糖蛋白，存在于免疫系统的许多造血细胞表面。这些受体可以结合IgG免疫复合物，在免疫反应的调节中发挥重要作用。FcγRIIIa（CD16a）是一种低亲和力Fc受体，与抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）有关。研究表明FcγRIIIa结合亲和力与治疗性单克隆抗体（mAb）的ADCC效力之间存在良好的相关性，测量这种相互作用的亲和力是体外评估单克隆抗体疗法ADCC效力的一个重要部分。Fc上保守N糖基化位点（N297）的聚糖组成对CH2结构域的构象动力学和灵活性有显著的影响，并进一步关系到该结构域与Fcγ受体的亲和力，这种亲和力的差异为区分单克隆抗体糖型提供了一种独特的方法。在文章中，作者描述了一种使用固定化FcγRIIIa受体的亲和层析方法，通过在线质谱（MS）和离线馏分收集，在单个非靶向大规模实验中研究影响FcγRIIIa亲和性的因素。一、基于Fcγ受体亲和层析的抗体糖型鉴别图1显示了利妥昔单抗的糖型分离。从个体保留时间来看，半乳糖基化在与受体的结合亲和力中起着重要作用，更高水平的半乳糖导致亲和力增加（图1b）。几种糖型在提取质谱图（XMC）中含有多个峰（图1c），例如G1F/G1F。这是因为可能存在质量相同的位置异构体（例如G1F/G1F和G0F/G2F含有相同数量的糖，但排列方式不同）。此外，一次只有一个Fc-聚糖与Fc-γRIIIa相互作用，因此不对称糖基化单抗的一侧比另一侧具有更高的亲和力，这可以表现为两个不同的亲和力峰。此外还检测到两种无核心岩藻糖基化物种（M5/M5和G0F/G0）。据报道，这些物种的亲和力和ADCC效价显著增加，但这似乎并未反映在本实验中的保留时间上。最值得注意的是，据报道，M5/M5糖型对FcγRIIIa的亲和力增加了4-6倍，但在所有糖型中洗脱时间最早。仅观察到相对于岩藻糖基化G0F/G0F，无岩藻糖基化G0F/G0糖型的亲和力略有增加，保留时间偏移的幅度与G1F/G1F糖型相当，而不是文献中报道的增加10-50倍。作者推测，与大多数已发表的结合研究中使用的糖基化FcγRs相比，这种偏离预期保留行为的现象可能源于柱上的FcγRIIIa受体是无糖基化的。观察到具有唾液酸化的抗体分子的洗脱时间比其无唾液酸化的对应物稍早。例如，在图1c中，糖型G0F/S1G1F的洗脱时间与G1F/G1F相同。G0F/S1G1F的结构类似于G0F/G2F，在一个半乳糖上带有末端唾液酸，但其洗脱时间更早（类似于G1F）。这表明唾液酸残基可能阻止或抑制第二半乳糖与FcγRIIIa的相互作用，使其更类似于G1F聚糖。图1 利妥昔单抗的FcγRIIIa亲和LC-UV-MS表征。（a） 整个样品的去卷积质谱；（b） 280 nm紫外检测的LC色谱图。星号表示A1G0F的洗脱。（c） 提取的质谱图（XMC）用于检测含有M5/M5、G0F/G0F、G0F/G1F、G1F/G1F、G1F/G2F和G2F/G2F聚糖的单个完整抗体分子。二、亲和层析结果与AlphaLISA结合分析结果的相关性 图2显示了根据平均加权保留时间（根据峰面积加权）排列的四种治疗蛋白质的亲和色谱图。图2b和c显示了平均保留时间与AlphaLISA结合试验的相对亲和力百分比之间的线性相关性。这两种试验报告了类似的趋势，其中糖基化Fc融合蛋白显示无结合，mAb3（IgG2）显示非常弱的结合，与mAb1相比，mAb2（具有高水平半乳糖基化的IgG1）的结合增加。这为使用FcγRIIIa亲和层析方法表征影响结合的产品属性的影响提供了验证。图2 （a） 四种具有代表性的治疗蛋白模式的FcγRIIIa亲和色谱图：无糖基化Fc融合蛋白（紫色）、IgG2单抗（红色）和两种具有不同糖基化模式的IgG1单抗（蓝色和绿色）。（b） 相关图显示了相对结合亲和力与平均加权保留时间之间的关系，去除了异常样本。（c） 相对结合亲和力与加权保留时间的相关图，包括异常样本。三、受体亲和力的差异导致IgG亚类效应器功能的变化IgG亚类（IgG1、IgG2、IgG3和IgG4）的Fc区域具有高度的序列同源性，但在几个关键残基上有所不同，这决定了它们与各种Fc受体的亲和力。为了探究不同Fc结构域的角色，作者对具有相同Fab结构域，但Fc结构域分别来自IgG1、IgG2和IgG4的mAb2变体，以及一种工程化稳定效应器无功能变体（SEFL2）进行亲和分离（图3b）。SEFL2变体是一种无糖基化IgG1变体（N297G），带有额外的工程铰链二硫键，设计为不具有ADCC功能。保留时间数据表明，工程SEFL2-IgG1模式的亲和力最低，其次是IgG2、IgG4，然后是IgG1，这些样品的整体洗脱顺序与已有文献报道的结果一致。然而，IgG4变体的洗脱时间似乎高估了结合亲和力，洗脱时间仅略早于IgG1变体。这种增加的表观亲和力或许与柱上受体的糖基化性质有关，不应用于评估FcγRIIIa对IgG4亚类单克隆抗体的亲和力。图3 （a） 人类IgG重链CH2区域的对齐序列（EU编号）。参与FcγRIIIa结合的IgG Fc残基以绿色突出显示（本研究中通过实验测量），蓝色和红色突出显示（文献报道），二硫键以黄色突出显示。与IgG1序列不同的残基以粗体显示。（b） 具有相同Fab区和不同Fc区的四种mAb2变体的紫外色谱图（λ=280 nm），对应于IgG1（蓝色）、IgG2（品红）、IgG4（褐红色）和带有N297G突变的IgG1 SEFL2（黑色）。插图显示了AlphaLISA测量的相对FcγRIIIa结合亲和力值。亲和力是相对于mAb2参考标准物质的IgG1变体测量的。四、二硫化物异构体对IgG2单抗中FcγRIIIa结合的影响鉴于IgG2亲和色谱图的异质性，作者选择具有二硫化物变体的IgG2（mAb3）进行进一步表征。该IgG2单抗存在几种天然的二硫键结构异构体，它们可以影响疗效和Fc受体结合行为。对二硫化物异构体的反相和FcγRIIIa亲和分离的并排比较（图4）。有趣的是，亲和分离方法中使用的类天然条件仍然能够区分这些结构异构体，这表明这些异构体对Fc和FcγRIIIa的结合亲和力也存在一定影响。图4 （a） 在280 nm处进行紫外检测的反相色谱图，显示天然产生的IgG2二硫化物变体和富集IgG2-a和IgG2-B的纯化样品的混合物分离。（B）相同样品的FcγRIIIa亲和紫外色谱图，显示IgG2二硫化物亚型的部分分辨率。六、在应力条件下识别对FcγRIIIa结合产生负面影响的修饰对受体结合位点或其附近的残基进行化学修饰可影响抗体-受体相互作用的亲和力，从而导致ADCC和疗效的变化。这种修饰可以在各种应激条件下诱导。本研究使用热应激利妥昔单抗样品（40°C，持续6周），通过LC-MS/MS肽图谱检测到200多个修饰。对比具有温度应力的样品和保持在4℃的对照样品的亲和色谱图，每个样品的主峰收集为四个组分（F1–F4）。40°C下的应力导致FcγRIIIa结合的最低亲和组分F1的峰面积略有增加（2%~4%）。对每个收集的组分进行肽图谱绘制，以确定组分中修饰相对百分比的趋势（图5）。馏分被分别赋值为0.1、0.2、0.3、0.4，以便斜率与R2进行比较，并且斜率的R2与绝对值之和可用作评分。具有正斜率的修饰（如半乳糖基化和唾液酸化）表明对受体结合有有利影响，而具有负斜率的修饰（如去酰胺化）表明对结合有不利影响。应激后，组分中的化学修饰斜率（N329脱酰胺）更高（图5b、d、f），而应激前后糖类的斜率（图5c、e、g）保持相似，表明斜率主要由聚糖对受体亲和力的影响以及组分中存在的糖类来定义。图5 （a）亲和色谱图突出显示了在40°C下热应激6周后，相对于4°C对照样品，mAb1峰值强度的变化。（b–g）FcγRIII亲和组分F1、F2、F3和F4中所选修饰的相对丰度变化。（h，i）R2与4°C组分中PTMs的百分比变化斜率的关系。R2与斜率的关系由组分中所有检测到的PTMs的线性回归确定。在所有面板中，红色表示热应力样本（40°C，6周），黑色表示4°C对照样本。所有统计分析中确定的关键属性汇总如表1所示。选择六个指标来评估数据的显著性，以确定修饰是否对FcγRIIIa结合至关重要。评估显示，利妥昔单抗P231（EU P227）、N301（EU N297）和N329（EU N325）三个残基上的11个修饰对结合的影响具有统计学意义。作者进一步分析了这些残基的空间分布，结果显示每个已鉴定的残基都与IgG1到FcγRIIIa的结合域非常接近，为确认这些属性对结合有重要影响提供了额外的信心。表1 确定关键性属性的统计分析总结撰稿：夏淑君编辑：李惠琳文章引用：1 Daniel W. Woodall, Thomas M. Dillon, Kevin Kalenian, et al. Non-targeted characterization of attributes affecting antibody-FcγRIIIa V158 (CD16a) binding via online affinity chromatography-mass spectrometry. mAbs, 2022, 14(1): 2004982.

大家好，本周为大家分享一篇发表在J Proteome Res.上的文章，Systematic Identification of Proteins Binding with Cisplatin in Blood by Affinity Chromatography and a Four-Dimensional Proteomic Method，该文章的通讯作者是华中科技大学药学院的杜支凤教授。以顺铂为代表的铂类抗癌药物广泛应用于治疗多种癌症肿瘤，如胃肠道癌、头颈部癌和卵巢癌等。在静脉滴注后，这些药物水解形成活性分子，与DNA结合并抑制DNA链的合成与复制，最终致使细胞死亡。然而，由于铂与硫醇的高亲和力，大多数铂在静脉注射后会与血液中的蛋白质结合；例如，人血清白蛋白 (HSA) 是含量最丰富的血清蛋白，也是血液中铂类药物的主要结合蛋白；另外，在红细胞中负责运输氧气的血红蛋白 (HB) 也被发现与铂结合，因此，有必要研究铂类药物在血液中的蛋白结合行为。先前的研究已经证明，利用质谱方法可以实现对高丰度蛋白质的可靠鉴定；然而，由于高丰度蛋白的干扰，占总蛋白的 80% 以上的低丰度蛋白则很少被鉴定。此外，由于缺乏足够信息，以及在胰蛋白酶消化过程中还原和烷基化剂的使用导致蛋白上的铂化位点无法被确定。更重要的是，目前排除假阳性结果的唯一方法是根据铂化肽的特征同位素模式，人工对比理论同位素和实验同位素，从而导致鉴定过程非常耗时并且具有较强的主观性。因此，有必要开发一种可靠、高效的方法来鉴定血液中铂类药物的结合蛋白质组。在血液蛋白质组学研究中，免疫亲和层析常用于消耗高丰度蛋白并富集低丰度蛋白。它有利于低丰度蛋白的鉴定和定量，从而可以提高血液中的蛋白质组覆盖范围。除了色谱分离外，离子淌度质谱 (IM−MS) 根据离子的迁移率差异进行分离，同样有助于低丰度蛋白质的分析。在金属化蛋白的鉴定中，金属化肽和游离肽的同位素分布模式明显具有差异，这有助于确定这些肽是否与金属药物结合。已经开发了一些数据处理软件程序来自动分配金属药物在已知蛋白质上的结合位点，如智能数字注释程序 (SNAP) 算法和 Apm2s 。本文结合高丰度蛋白分离和4D蛋白质组学方法 (IM-MS) ，系统、全面地鉴定了血液中顺铂的结合蛋白，并利用铂化肽的特征同位素模式和相似性算法来消除假阳性的识别。如图1所示，首先用超滤去除游离药物，然后使用多亲和去除柱分离血液样本中的高丰度和低丰度蛋白；用FAIMS Pro界面的nano-LC−MS/MS进行消化和分析；用MaxQuant对铂化的多肽和蛋白进行鉴定，用相似性算法Apm2s排除假阳性结果。在此基础上，采用基于平行反应监测 (PRM) 的方法测定了血浆中多肽与顺铂的结合率。本研究为系统鉴定血液中金属药物的结合蛋白提供了一种新方法，鉴定出的蛋白可能有助于了解铂类抗癌药物的毒性。图1 铂化蛋白的分离和鉴定以及用蛋白质组学方法测定顺铂与多肽之间的结合率的示意图本研究采用顺铂与人血浆的反应混合物建立了一种分析方法。为了与文献进行比较，样品的制备方法与文献中的制备方法相同1。选择CID作为碎裂方式，结果表明，从低丰度部分共鉴定出212个蛋白，从高丰度部分共鉴定出169个蛋白。在低丰度部分，共鉴定出1192个游离肽和208个铂化肽。其中，154个铂化肽被排除为假阳性结果，如文中表S1所示。高丰度部分的游离肽数和铂化肽数分别为1124个和169个，其中，144个铂化肽被排除为假阳性，如表S2所示。低丰度结合蛋白的鉴定在以往的研究中，由于高丰度蛋白的干扰，很少发现低丰度蛋白与铂的结合。本研究在高丰度蛋白被消耗后，从29个蛋白中共鉴定出54个铂化肽。APOA4中铂化肽的理论和实际质谱如图2所示，前体离子和铂化产物离子表现出特征的同位素峰。图片显示了关键的碎片离子的质谱图，用于分配铂化位点。在鉴定出的铂化蛋白中，CERU、FETUA、ITIH1和B4E1Z4有4个或更多的含铂肽，这表明铂可以与这些蛋白质的多条肽段结合。虽然低丰度蛋白只占血液中蛋白的一小部分，但它们具有非常重要的功能，对于维持正常生理活动不可或缺。例如，CERU可以将Fe2+氧化为Fe3+，并在铁代谢中发挥重要作用；B4E1Z4与补体激活相关。顺铂与这些蛋白的结合是否会对其功能产生影响仍有待进一步研究。图2 从低丰度蛋白部分鉴定出的铂化蛋白APOA4。(A)铂化肽的理论（左）和实验质谱（右）；(B)铂化肽的MS/MS和指示铂化位点的关键碎片离子的质谱图高丰度结合蛋白的鉴定IGHG1中一个铂化肽的理论和实验质谱如图3所示，其前体离子和铂化产物离子表现出特征同位素峰。根据关键的碎片离子确定了铂化位点。在已鉴定的蛋白中，ALBU（白蛋白）和CO3（补体C3）有4个或更多的含铂多肽。HSA负责血液中药物和小分子的运输，CO3在补体系统的激活中起着重要作用。高丰度蛋白与顺铂的结合已被用于提高肿瘤化疗的疗效和选择性，而新发现的高丰度结合蛋白有助于相关研究。与低丰度组分鉴定的铂化蛋白相比，大部分与低丰度组分蛋白不同，两个组分中仅共同检测到FETUA和CFAH作为铂化蛋白，这表明亲和层析对高丰度蛋白和低丰度蛋白的分离效果较好。图3 从高丰度蛋白部分鉴定出铂化蛋白IGHG1。(A)铂化肽的理论（左）和实验质谱（右）；(B)铂化肽的MS/MS和指示铂化位点的关键碎片离子的质谱图IM−MS分离铂化肽异构体如图4所示，通过nano-LC−IM−MS/MS成功分离了低丰度蛋白组分中FETUA的铂化肽异构体。同分异构体a和b是典型的铂化肽，由质谱图的同位素模式显示，它们被很好地分离。它们的MS/MS不同，根据关键碎片离子，异构体a和b的铂化位点分别被划分为M和H/T。这个例子显示了IM−MS对复杂样品的分辨能力。图4 用nanoLC−IM−MS/MS分离的低丰度蛋白组分中FETUA的铂化肽异构体。(A)m/z=764.67提取离子色谱和异构体a、b的质谱，理论质谱见中间；(B)异构体的MS/MS和关键碎片离子的质谱图结合蛋白的铂化位点在本文的两项研究中，His 和 Met 是首选的铂结合位点。此外，D、E、S和Y也被发现是铂结合位点。这也是合理的，因为血清蛋白的供氧氨基酸已被证明是顺铂的动力学首选结合位点。很少有Cys残基被鉴定为结合位点，这可能是由于没有还原和烷基化。肽的半胱氨酸常形成二硫键，不经还原和烷基化就无法识别，因此，序列覆盖率会很低。在未来的研究中，应使用替代还原剂来提高肽序列覆盖率。生物信息学分析 为了揭示铂化蛋白质的定位、功能和途径，将从高丰度和低丰度部分中鉴定的蛋白质组合起来并通过生物信息学工具进行分析。如图5A所示，GO分析表明大部分结合蛋白位于细胞外区域，发挥蛋白结合、金属离子结合、酶抑制剂等功能；因此，镀铂蛋白的定位证实了鉴定的可靠性。此外，这些蛋白质参与内肽酶活性、免疫系统过程、补体激活、炎症反应和凝血的负调节。为了阐明所涉及的途径，对鉴定的蛋白质进行了KEGG途径富集分析，结果表明最显着的富集途径是补体和凝血级联途径（图5B）。补体和凝血级联途径已被证明在造血干/祖细胞的动员中发挥关键作用，这对造血具有重要意义。顺铂的血液学毒性与其在补体和凝血级联途径中与血液蛋白的结合之间的相关性值得进一步研究。图5 (A)通过GO 分析确定的铂化蛋白的定位、分子功能和生物学过程；(B)铂化蛋白的富集途径血液蛋白与顺铂的结合率 由于未检测到一些铂化肽的游离形式，因此仅使用高丰度组分中的13种肽进行亲和力研究。可靠地计算了属于五种蛋白质的六种铂化肽的结合率。PRM分析中这些肽的信息见表S5，定量结果见图6。其中，富含组氨酸的糖蛋白的一种肽与顺铂的结合率最高，这可能是由于顺铂对含组氨酸和带负电荷的生物分子的高亲和力。Apoa1 蛋白的一个肽与顺铂的结合率最低。在本研究中可以确定结合率的铂化肽数量较少，这主要是由于某些肽的质谱响应低以及某些肽存在氧化形式。因此，这些肽的结合比率不能通过 PRM 方法确定。然而，与以往的研究相比，根据属于同一蛋白质的肽的质谱计数粗略估计某种蛋白质的丰度，这种方法可以更准确地确定高丰度肽与铂的结合率。图6 根据PRM分析多肽与顺铂的结合亲和力顺铂与血液蛋白的结合与其药代动力学、活性、毒性和副作用密切相关。然而，血液蛋白质组的复杂性限制了低丰度结合蛋白的鉴定。在本研究中，基于亲和色谱和nanoLC-IM-MS/MS 的 4D 蛋白质组学方法被用于分离低丰度和高丰度蛋白质并分析这两个部分。基于铂化肽的特征同位素分布和相似性算法，排除了假阳性鉴定。结果，共有 39 种蛋白质被鉴定为铂化蛋白质，这比之前研究中的数量要高得多。随后的生物信息学分析表明，这些结合蛋白位于细胞外区域，主要参与内肽酶活性、免疫系统过程、补体激活、炎症反应和凝血的负调控。最显着的富集途径是补体和凝血级联，这可能与顺铂的血液学毒性有关。高丰度部分的 PRM 分析表明，富含组氨酸的糖蛋白中的肽与高丰度组分中的顺铂的结合率最高。综上所述，本研究揭示了人类血液中与顺铂结合的蛋白质组，并计算了顺铂与血液蛋白的结合率。这种方法虽然在数据分析方面比较耗时，但它可以识别复杂系统中金属药物的低丰度结合蛋白，并且可以准确测量药物与血液蛋白的结合率。

研究背景膀胱癌(BLCA)是公认的泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，约占前列腺癌的10%。全世界每年有57万新bing例和21万例死亡。由于其复发倾向和持续监测和随访的必要性，它是经济负担最高的癌症之一。因此，探讨膀胱癌发生发展的机制，寻找诊断和治疗方法是十分必要的。研究内容武汉大学中南医院、武汉大学医学研究院王行环团队此前的研究显示POLD1是膀胱癌恶性转变过程中的一个关键分子。在此基础上，王行环团队证实POLD1在膀胱癌组织中较癌旁组织高表达，在肌层浸润性膀胱癌中较非肌层浸润性膀胱癌高表达，且与预后相关。团队在体内和体外实验中证明了POLD1能够促进膀胱癌的增殖和转移。进一步进行机制研究发现，POLD1通过与FBXW7竞争性结合MYC，从而减弱FBXW7介导的MYC泛素化降解。此外，机制研究还发现POLD1可以与MYC形成复合物参与MYC的转录调控，增强MYC的转录活性；另一方面，MYC能够转录激活POLD1，从而形成了一个POLD1-MYC正反馈回路，增强了对膀胱癌的促癌作用（图1）。这项研究成果于2023年发表在 Nature Communications 杂志。https://doi.org/10.1038/s41467-023-38160-xIF: 16.6 Q1研究人员首先通过CO-IP验证了POLD1与MYC的结合，而当去掉MYC中与FBXW7α结合的区域MB1后，就检测不到结合了。所以研究团队合成了MB1肽段，然后用NanoTemper公司的Monolith分子互作技术检测了POLD1与MB1肽之间的亲和力，并与 FBXW7α作对比，证明POLD1对MB1的亲和力比FBXW7α强，因此它可以与FBXW7α竞争结合MYC（图2）。在这个实验中，POLD1和FBXW7α 也都是与GFP融合表达在293T细胞，直接使用细胞裂解液作为target进行检测，无需纯化蛋白。图1：POLD1通过稳定MYC调节BLCA的增殖和转移，促进膀胱癌发生发展图2：MST技术检测293T细胞中过表达GFP-POLD1的裂解物与MYC-MB1 (WT)肽的结合亲和力技术优势Monolith系列仪器在检测分子间相互作用时，可以直接检测细胞裂解液中的靶标蛋白于配体的亲和力，无需纯化蛋白。这种方法特别适合检测难纯化，或纯化后不稳定的蛋白样品，为科研人员节省蛋白纯化的时间，减少工作量。

抗体是自然产生用于帮助免疫系统抵御细胞内外侵害的免疫球蛋白。免疫荧光法测定细胞水平的抗体亲和力大小是评价抗体效果非常重要的指标，当前主要的测定方法是利用流式细胞仪以实现相对定量。而countstar fl可通过间接免疫荧光法检测不同抗原抗体反应呈现的平均荧光强度直接定量评价抗体亲和力大小，同时也可检测细胞浓度、活率。此外，可获得细胞图片，实验过程中实时拍摄明场和荧光图像。countstar fl为客户在抗体药物筛选中提供了快速、准确、可靠的抗体亲和力检测方法。countstar fl（图1）是一个智能的、直观的细胞分析仪器用于多种细胞实验，包括细胞转染，细胞凋亡，细胞表面标志物，细胞活力，抗体亲和力和细胞周期的评估。该系统提供了强大的荧光定量结果。易于使用的自动化程序指导你完成从细胞图像采集到数据分析的过程。 材料：countstar 产品:countstar fl细胞分析仪/countstar样品板/0.2% 台盼蓝染色液 (cs0101001-50)其他材料cho细胞系/dmem细胞培养基(hyclone-sh30243.01)/胎牛血清(hyclone-sh30084.03)/胰蛋白酶(hyclone-sh30042.01)，其中，cho细胞系稳定表达x蛋白，用于评价原研药和仿制药的亲和力一抗：不同浓度梯度的002-bmk1,002-bmk2, ab1, ab2, ab3, ab4, ab5, ab6, ab7, ab8, ab9, pcsk-9。其中，002-bmk1,002-bmk2能特异性的与x蛋白结合（阳性抗体），pcsk-9是阴性对照抗体。二抗：alexa fluor 488 goat anti-mouse igg (biolegend)，5μg/ml软件graphpad prism5方法：细胞培养条件1. cho细胞培养在完全培养基中，组成为：500mldmem培养基，2 mm l-谷氨酰胺, 1.5 g/l 碳酸氢钠和10% 胎牛血清。于37°c, 5% co2培养箱中培养48小时；2. 消化收集细胞。染色步骤1. 使用台盼蓝计数测定细胞浓度；2. 准备3*10^5个细胞/每个反应；3. 细胞样品于400g下离心3-5分钟，去上清，用100μl pbs重悬；4. 轻轻混匀细胞样品，于400g下离心3-5分钟，去上清，用100μl cellstaining buffer重悬；5. 在细胞样品中加入不同浓度梯度的一抗，每种抗体最高浓度为10μg/ml，4倍梯度稀释，最低浓度为0.01μg/ml；6. 37℃下，避光孵育60分钟；7. 细胞样品于400g下离心3-5分钟，去上清，用100μl pbs重悬；8. 轻轻混匀细胞样品，于400g下离心3-5分钟，去上清，用100μl cellstaining buffer重悬；9. 在每个反应组内加入5μg/ml二抗；10. 常温下，避光孵育30分钟；11. 细胞样品于400g下离心3-5分钟，去上清，用100μl pbs重悬；12. 轻轻混匀细胞样品，于400g下离心3-5分钟，去上清，用100μl cellstaining buffer重悬；13. 混匀样品，加入20μl于细胞计数板中，上机检测。注：以上操作可使用ep管或96孔板。图像获取及数据分析1. 选用“台盼蓝计数”进行细胞浓度和活率测定；2. 单荧光模块的程序用于获取fitc通道下alexa fluor 488的图像；3. 每个样品采集1或3个视野（该实验检测1个视野）；4. 检测过程中直接呈现数据结果，图像获取和数据分析完成后，导出数据结果。抗体亲和力检测过程如图2。 图2.抗体亲和力检测过程 不同抗体梯度稀释添加剂量选用96孔板测定不同抗体与cho细胞反应的剂量效应实验，包括原研药、抗体药和阴性对照（图3）。一抗浓度按照下表指示梯度降低(10μg/ml-0.01μg/ml)。 图3. 96孔板中抗体浓度. 每孔中有cho细胞（30万个），二抗(5μg/ml)及图示一抗(0.01, 0.039, 0.156, 0.625, 2.5, 10μg/ml).其他孔为空. countstar fl系统图像获取 countstar fl内置的抗体亲和力检测程序进行明场，fitc通道下alexa fluor 488图像的获取。明场的图像作为一个参考标准对荧光场的图像进行分割，进而获取荧光场的信号。不同浓度梯度ab4，最高浓度pck9和002-bmk1样本图像结果如图3所示。 图4. 0.01, 0.039, 0.156, 0.625, 2.5, 10μg/ml ab4与cho细胞反应后的细胞图像.图像显示抗体浓度越高，荧光信号越强. 002-bmk1抗体能特异性的与x蛋白结合，pcsk-9为阴性对照抗体. 图像代表002-bmk1样品有较强的荧光信号，pcsk-9样品基本没有荧光信号. 抗体亲和力定量分析 不同抗原抗体反应呈现的平均荧光强度直接定量评价抗体亲和力大小。稳定表达x蛋白的cho细胞系应用于分析抗体亲和力，countstarfl可直接显示测试结果，并将数据导出进行分析。使用graphpad prism5对抗体的ec50进行分析(fig. 5a)。测试结果显示样品荧光强度随着一抗浓度升高而增加，平均荧光强度曲线代表不同浓度下每个抗体的反应活性，其中pcsk-9为阴性对照抗体，样品基本没有荧光信号。各抗体的logec50结果显示原研药的抗体亲和力比仿制药更好，而仿制药中ab2, ab3, ab4, ab6效果较好，可进行下一步实验(fig. 5b)。countstar fl系统为评价抗体亲和力提供直接可靠的结果。 图5. 抗体亲和力定量分析结果. a.不同浓度梯度抗体下不同抗原抗体反应中平均荧光强度.b.原研药和仿制药的分析结果比较. 总结： countstar fl系统提供了一个快速，直接，容易的方法评价抗体亲和力。此外，它是融合了电子显微镜，图像处理，自动细胞计数于一体的设备。另外，countstar fl提供扩展功能，用户可以根据自身需要进行定制。countstar fl是一款高度可移动的设备，内置多种预设程序，便于用户快速获取准确，稳定，可高度重现的数据。仪器中每个应用模块简单易用，大大简化了常规实验室的工作，给客户提供高质量的科研数据。countstar fl为客户开展抗体亲和力实验提供一个直接可靠的实验结果。

近日，赛分科技成功开发了首款亲和层析填料——MabPurix™ Protein A，该填料以琼脂糖凝胶为基质，表面键合配体Protein A，主要应用于生物制药领域——抗体的纯化。作为全球色谱产品最为完善的企业之一以及生物分离色谱的领航者，赛分科技十分重视新产品研发，目前的色谱分离填料已涵盖反相、正相、离子交换、手性、体积排阻、亲和、HILIC、离子排斥、配体交换等十几种类型，产品品种齐全，性能优越。其中，色谱填料产品包括硅胶基质和聚合物基质两大类，几十小类，可根据客户实际需要分别应用于不同的领域中。本次所开发的MabPurix™ Protein A填料是赛分科技推出的首款亲和层析填料，也是首次推出的以琼脂糖凝胶为基质的填料，此前，赛分科技的填料基质包括球形硅胶、不定形硅胶、聚甲基丙烯酸酯、PS/DVB等。与其它基质相比，琼脂糖基质填料具有更好的生物相容性。MabPurix™ Protein A的加入使得赛分科技的产品品种更加齐全，尤其对于生物分离色谱产品家族里，MabPurix™ Protein A的成功推出具有里程碑的意义。赛分科技的聚合物基质填料家族MabPurix™ 亲和层析填料 MabPurix™ 亲和层析填料专为大规模抗体纯化而设计，是由高纯度Protein A与高交联度琼脂糖偶联后的产物，用于从血清、腹水、细胞培养上清和细胞提取物中分离和纯化多种哺乳动物不同亚型的抗体或包含抗体Fc片段的基因工程重组蛋白。Protein A是金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白，单链，它通过与免疫球蛋白的Fc区相互作用，可结合大多数哺乳动物的IgG，尤其对人IgG1、IgG2、IgG4，小鼠IgG 2a和IgG 2b具有高亲和力。MabPurix™ Protein A亲和层析填料具有高稳定性、高选择性、高效率的特点，是抗体纯化的优选。● 可根据用户的需要提供各种规格的预装柱；● 强化基质保证了高流速、低背压；● 特殊设计的定向键合技术保证了高的载量；● 可耐受苛刻的在线清洗条件；● 可以很容易的由小规模的实验室制备向大规模的工业化生产进行线性放大。更多信息请登录：http://www.sepax-tech.com.cn/products/gytl/juhe/infinity/99.html关于赛分科技 赛分科技有限公司（Sepax Technologies, Inc）总部位于美国特拉华州高新技术开发区，致力于开发和生产药物与生物大分子分离和纯化领域的技术和产品。赛分科技是集研发、生产和全球销售为一体的实业型企业。公司主要产品为液相色谱柱及耗材、固相萃取柱（SPE）及耗材、液相色谱填料以及分离纯化仪器设备。在液相色谱领域里，赛分科技已开发出了100多种不同型号的液相色谱材料，涵盖了反相、正相、超临界（SFC）、手性（Chiral）、离子交换、体积排阻、亲和、HILIC等各种类别，为世界范围内液相色谱产品最为完善的企业之一。 赛分科技的创新技术使之生产出具有最高分辨率及最高效的生物分离产品，包括体积排阻、离子交换、抗体分离、和糖类化合物分离色谱填料和色谱柱，可广泛地应用于单克隆抗体、各种蛋白、DNA、RNA、多肽、多糖和疫苗等生物样品的分析、分离和纯化。赛分科技先进的技术和完善的产品线已使赛分成为全球生物分离的领航者。 公司网站：www.sepax-tech.com.cn www.sepax-tech.com

仪器信息网讯 2016年10月10日，第八届慕尼黑上海分析生化展(analytica China 2016)在上海浦东新国际博览中心盛大开幕，业内众多知名企业参展并展出2016年度最新上市产品。东曹生命科学携新品TSKgel Protein A-5PW亲和色谱柱参展。东曹(上海)生物科技有限公司　　近年来生物制药行业保持高速增长的趋势，目前全球销量排名前十的药物中生物制药占据8席，而其中6个为单克隆抗体药物。单克隆抗体药物的主要应用在癌症、免疫相关疾病的治疗领域。　　对单克隆抗体药物研发和表征的分析，从研发初期到下游纯化均需要对IgG含量进行快速且精确的定量。多年来，Protein A层析填料一直被用于单克隆抗体纯化工艺过程中的捕获阶段，分析型的Protein A色谱柱则被用于对细胞培养上清液中抗体的定量分析。　　2016年，东曹生命科学推出一款用于单克隆抗体药物分析的色谱柱——TSKgel Protein A-5PW亲和色谱柱。据介绍，该款色谱柱与亲和层析填料TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F具有相同官能团和相同的分离选择性，可应用于生物制药企业单克隆抗体药物的开发到生产每个阶段，帮助企业节省时间和成本。　　据介绍，TSKgel Protein A-5PW亲和色谱柱采用了多孔亲水性聚合物基质填料，表面键合了重组Protein A官能团，可用于IgG的快速、高分离度分析，并且对IgG有很高的动态吸附载量，定量范围款。TSKgel Protein A-5PW亲和色谱柱柱身采用PEEK材质，大大减少非特异性吸附。TSKgel Protein A-5PW亲和色谱柱

问新品Dianthus有哪些优势？答: 我们都知道，重要靶点和候选药物的亲和力筛选非常具有挑战性。当您的亲和力筛选项目涉及到PROTAC二元和三元复合物，片段化合物库及固有无序蛋白时，需要进行样品固定的SPR技术和样品消耗量大的ITC技术的检测难度会大大增加，而这些应用则是Dianthus所擅长的。问新品Dianthus具有怎样突破性的技术？答: Dianthus是首个使用光谱位移技术(Spectral Shift)的亲和力筛选平台。检测流程相当简单，您只需要对其中一个分子进行荧光标记，然后将其与梯度稀释的配体混匀。在用590nm的光激发样品后，仪器会同时监测双波长（650nm和670nm）下配体结合引起的光谱位移，通过双波长的荧光强度比值与配体浓度拟合，仅需1分钟即可精确计算样品间的kd值！问光谱位移技术对于实验筛选项目有什么好处和价值？答: 直击五大实验痛点，为您保驾护航。● 可在33分钟完成384孔板检测。● 可控平衡状态的溶液中检测，避免固定对样品的影响。在表征三元复合物时，二元复合物处于稳定状态，非常适用于PROTAC项目。● 检测不依赖于分子量，无需担心分子量过低而漏掉有价值的hits。● 样品均在溶液中独立检测，筛选共价结合配体时无需昂贵的耗材和繁琐的操作。● 基于微孔板检测，无微流控系统，无需清洗维护。Dianthus新品发布会邀您参与主题:突破性的光谱位移技术助您解决亲和力筛选的终极挑战概要：1.亲和力筛选面临的挑战2.光谱位移技术原理3.PROTAC三元复合体/共价结合配体/膜蛋白检测案例4.实验流程简介讲师：NanoTemper应用专家 张玺直播时间：2022年4月20日 （周三）14:00-15:00参加新品发布会方式：微信搜索并关注NanoTemper即刻预约可获得精美礼品！惊喜奖：高级旅行茶杯幸运奖：幸运小熊玩偶

下载： 上海安谱-Beacon免疫亲和柱限时大促销-买一赠一.pdf上海安谱科学仪器有限公司地址：上海市斜土路2897弄50号海文商务楼5层 [200030]电话：86-21-54890099传真：86-21-54248311网址：www.anpel.com.cn联系方式：shanpel@anpel.com.cn技术支持：techservice@anpel.com.cn

NanoTemper的愿景是致力于创造一个任何疾病都可以被治愈的世界。因此我们的使命是尽快研发出更有助于科研人员解决表征难题的生物物理工具。我们正与权威的生物制药公司展开合作，全新Dianthus的光谱位移技术检测效果超出了我们的预期——让我们一起对全新的Dianthus在整个行业的影响拭目以待吧！NanoTemper CEOPhilipp Baaske在日常工作中, 您的亲和力筛选项目如果也经常遇到以下问题：◆ 三元复合物检测体系不稳定◆ 分子量过低无法成功检测◆ 共价结合配体检测繁琐，成本高昂◆ 当SPR或ITC等传统筛选方法无法处理困难的分子相互作用，或者最多只能提供非常低质量的数据… 不用着急！看全新Dianthus如何利用光谱位移这项突破性技术，轻松应对这些传统技术难题，真正消除筛选复杂分子相互作用时遇到的障碍。● 33分钟完成384孔板检测● 可控平衡状态的溶液中检测，避免固定对样品的影响。在表征三元复合物时，二元复合物处于稳定状态，非常适用于PROTAC项目● 检测不依赖于分子量，无需担心分子量过低而漏掉有价值的hits● 样品均在溶液中独立检测，筛选共价结合配体时无需昂贵的耗材和繁琐的操作● 基于微孔板检测，无微流控系统，无需清洗维护更多内容，敬请参加今天下午的新品发布会，您将收获以下内容：主题:突破性的光谱位移技术助您解决亲和力筛选的终极挑战内容介绍：1. 亲和力筛选面临的挑战2. 光谱位移技术原理3. PROTAC三元复合体/共价结合配体/膜蛋白检测案例4. 实验流程简介直播时间：2022年4月20日 （周三）14:00-15:00参加新品发布会方式：微信搜索并关注NanoTemper公众号直播当天将随机抽取幸运听众，送出精美礼品！惊喜奖：高级旅行茶杯幸运奖：幸运小熊玩偶

大家好，本周为大家分享一篇发表在Angew. Chem. Int. Ed.上的文章，A Membrane-Permeable and Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) - Enrichable Cross-Linking Reagent to Advance In Vivo Cross-Linking Mass Spectrometry，该文章的通讯作者是德国莱布尼茨分子药理学研究所的Fan Liu教授。交联质谱 (XL-MS) 已被用于在全蛋白质组范围内表征蛋白质的结构和蛋白间相互作用。目前，由于能够穿透完整细胞的交联试剂和富集交联肽的策略的缺乏，体内交联质谱研究的深度远远落后于细胞裂解液的现有应用。为了解决以上限制，本文开发了一种含膦酸盐的交联剂-tBu PhoX，它能够有效地渗透各种生物膜，并且可以通过常规的固定化金属离子亲和色谱 (IMAC) 进行稳定富集。 文章建立了一个基于 tBu-PhoX 的体内 XL-MS 分析流程，在完整的人类细胞中实现了较高的交联识别数目，并大大缩短了分析时间。总的来说，本文开发的交联剂和 XL-MS 分析流程为生命系统的全面交联质谱表征铺平了道路。细胞蛋白质组通过广泛的非共价相互作用网络进行组织，表征蛋白质-蛋白质相互作用 (PPIs) 对于了解细胞的调节机制至关重要。交联质谱 (XL-MS) 是系统研究细胞 PPIs 的一种强有力的方法，在 XL-MS 中，天然蛋白质接触通过交联剂共价捕获，交联剂是一种由间隔臂和两个对特定氨基酸侧链具有反应性的官能团组成的有机小分子，交联样品经过蛋白酶水解后，可以通过基于质谱的肽测序来定位氨基酸之间的交联。由于交联剂具有确定的最大长度，检测到的交联揭示了蛋白质内部或蛋白质之间的氨基酸的最大距离。以上这些信息提供了对蛋白质构象、结构和相互作用网络的见解。虽然最初仅限于纯化的蛋白质组装，但如今 XL-MS 已经可以应用于复杂的生物系统——这是通过开发先进的交联搜索引擎、样品制备策略和交联剂设计而实现的。特别是，已进行的几项全蛋白质组范围的 XL-MS 研究表明，可以通过使用可富集的交联剂来改进交联产物的鉴定，例如，通过添加生物素或叠氮化物/炔烃标记，使得消化混合物中的交联肽段能够基于亲和纯化或点击化学富集。最近，一种基于膦酸的交联剂 PhoX 被引入作为现有生物素或叠氮化物/炔烃标记试剂的高效和特异性替代品。PhoX 可通过固定化金属离子亲和色谱 (IMAC) 实现交联富集，这是一种非常快速和稳健的富集策略。 然而，尽管 PhoX 已被证明可用于从细胞裂解液中进行交联鉴定，但它无法渗透细胞膜，因此不适合体内的 XL-MS检测。基于以上讨论，本文开发了交联剂 tBu-PhoX ，其中，膦酸羟基被叔丁基保护以掩盖负电荷（图 1）。为了检测 tBu-PhoX 的膜通透性，文章交联了各种膜封闭的生物系统，包括人 HEK293T 细胞、从小鼠心脏分离的线粒体和革兰氏阳性枯草芽孢杆菌，并在 SDS-PAGE 上监测了蛋白质条带的变化（图 2）。在SDS-PAGE中，观察到在交联剂浓度为0.5和1.0mM时，蛋白质向更高分子量的浓度依赖性迁移，这表明了有效的膜渗透和交联。相比之下，将 PhoX 应用于完整的 HEK293T 细胞将产生与非交联对照相同的条带模式。图1 tBu-PhoX交联剂图2 PhoX或tBu-PhoX交联HEK293T细胞的SDS-PAGE在证明了 tBu-PhoX 可渗透各种生物膜系统后，文章接下来开发了一种基于 tBu-PhoX 的体内 XL-MS 工作流程，相比于之前的全蛋白质组 XL-MS 策略，该工作流程提高了样品处理和交联富集的速度和效率（图 3）。首先，按照标准蛋白质消化方案将交联蛋白质消化成肽；其次，使用 IMAC 珠对消化混合物进行预清除步骤以去除内源性修饰（特别是磷酸化）；第三，预清除的消化混合物（从 IMAC 流出）在稀释三氟乙酸 (TFA) 溶液中孵育以去除叔丁基并暴露膦酸基团以进行二次 IMAC 富集。第四，使用标准 IMAC 程序丰富交联产物，最后通过 LC-MS 分析以进行交联产物鉴定。图3 与tBu-PhoX进行体内交联和后续样品处理的工作流程接下来，文章优化了体内 XL-MS 工作流程的几个分析参数，以最大限度地提高交联检测的效率。首先，通过使用 IMAC 珠预清除评估了去除磷酸肽的效率；之后，使用 tBu-PhoX 交联完整的 HEK293T 细胞，经酶切成肽后，并应用预清除 IMAC 步骤去除内源性磷酸肽。在去保护步骤之后，利用 IMAC 富集交联，并通过单次 120 min LC-MS 运行测量富集的样品。通过测量 IMAC 洗脱液中磷酸肽和交联产物的数量，发现第二个 IMAC 中只有数百条磷酸肽，而预清除 IMAC 中有 4,128 条磷酸肽，这突出了通过预清除 IMAC 步骤去除磷酸肽的效率。此外，与单阶段 IMAC 结果相比，使用预清除 IMAC 的工作流程鉴定了 22% 以上的交联（1165 对 952 交联），证明了该两阶段工作流程去除干扰修饰肽的好处（图 4A）。其次，文章在肽水平上研究了膦酸盐去保护的功效。使用 tBu-PhoX 制备了体内交联的 HEK293T 样品，并分析了在不同的酸度（TFA 浓度）和孵育时间下，去保护后交联的数量如何变化。结果显示，不同浓度的 TFA 下获得了相似数量的交联。为简化处理（即在接下来的IMAC富集步骤中保持相对较低的样品体积），选择 0.5% TFA 的去保护条件，持续两个小时（图 4B，C）。第三，文章测试了 Orbitrap Tribrid 质谱仪的不同采集参数如何影响交联识别，即在高场非对称波形离子迁移率质谱法 (FAIMS) 中应用的电荷态选择和补偿电压 (CVs)。当考虑电荷状态 +3 和更高时，确定了最多数量的 tBu-PhoX 交联肽（图 4D）。图4 样品处理和LC-MS参数的优化文章将优化参数后的体内 XL-MS 工作流程应用于完整的 HEK293T 细胞。使用 180 min的 LC 梯度和优化后的分析参数，文章从体内 tBu-PhoX 交联的 HEK293T 细胞中获得了 9,547 个交联（图 5A）。基因本体分析表明，交联蛋白参与了广泛的分子功能、生物过程和细胞成分，表明 tBu-PhoX 可以揭示所有细胞区域的 PPIs（图 5A）。另外，文章还考察了完整细胞的体内 XL-MS 是否捕获了与细胞裂解液的 XL-MS 不同的 PPIs。为了验证这一点，从 HEK293T 细胞中制备 tBu-PhoX 交联裂解液，并使用与体内 XL-MS 实验相同的工作流程处理样品。 结果显示，从五个 SEC 部分中确定了 9,393 个交联。这表明 tBu-PhoX 允许以类似的效率进行裂解和体内 XL-MS。比较本文的体内和裂解数据表明，在体内 XL-MS 实验中，蛋白质间交联的数量更高，从而产生了更加相互关联的 PPI 网络（图 5B，C）。这种效应可以通过细胞环境的拥挤来解释，其中蛋白质紧密堆积并参与多种相互作用，这些相互作用被细胞裂解和稀释部分破坏。文章在 8 种选定蛋白质复合物的已知 3D 结构上可视化了 145 个体内检测到的交联（图 5C），另外，还观察到 96.6% 的交联在 35 Å 的最大距离限制内（图 5D），表明此 XL-MS 工作流程对内源性蛋白质复合物的体内结构分析的适用性。最后，文章比较了 tBu-PhoX 与 PhoX 在表征细胞裂解液的 PPI 网络方面的性能。使用与上述 tBu-PhoX 裂解液交联实验相同的交联条件从 HEK293T 细胞制备 PhoX 交联裂解液。为了去除内源性磷酸肽，在单阶段 IMAC 富集之前，用碱性磷酸酶处理消化的肽两小时。使用与 tBu-PhoX 相同的 LC-MS 方法进行 LC-MS 分析。该实验产生了 2,117 个交联，与使用 tBu-PhoX 识别的交联数量（1,942 个交联）相比略高。然而，基于 PhoX 的 XL-MS 流程需要更长的样品制备时间，因为需要进行碱性磷酸酶再处理和之后的额外脱盐步骤。行体内交联综上所述，本文开发并应用了一种新型的、可富集的、用于体内 XL-MS 的膜渗透交联剂 tBu-PhoX。在广泛使用的交联条件下（交联剂浓度为 1-5 mM），tBu-PhoX能够有效地穿透各种生物膜，为完整的细胞器和活细胞提供交联的机会。tBu-PhoX上的叔丁基基团使得高效的两阶段IMAC样品制备方案成为可能；首先，使交联剂对 IMAC 呈惰性，以促进基于 IMAC 快速而彻底地提取不需要的磷酸化肽，然后，通过去除叔丁基暴露膦酸基团，从而有效地二次 IMAC 富集交联剂修饰的肽。通过随后的 SEC 分馏，可以进一步富集交联肽段以进行 LC-MS 分析。XL-MS 在表征生命系统中的蛋白质结构和相互作用方面发挥着越来越重要的作用。为了促进这一发展，迫切需要有效的体内 XL-MS 方法。文章报告的体内 XL-MS 工作流程满足了这一需求，提供了与之前基于裂解液的 XL-MS 研究类似的交联识别能力，但需要的测量时间不到之前报告的十分之一。这一结果突出表明，本文开发并应用的 tBu-PhoX 交联剂和集成样品制备流程为推进体内相互作用组学和结构生物学提供了一种非常有前景的化学方法。

东曹生命科学（Tosoh Bioscience）在今年的2017美国匹兹堡分析化学和光谱应用会议暨展览会上，凭借其新推出的液相色谱柱产品——TSKgel Protein A-5PW 荣获“Pittcon Today” 卓越奖铜奖。 该奖项的设置旨在识别今年展会上的创新，并为参展商提供一个新的渠道以展示他们的研究进展和技术进步。本次奖项由来自学术、工业和贸易媒体组成的评委团评选，主要考察产品的独创性、创造力、实用和结果，以及该产品在行业和广泛公众中的影响力。评委们从80多份申报书中选定了最后的获奖名单。东曹生命科学美国公司的产品经理Cara Tomasek表示，“我们非常高兴Pittcon Today奖项的评委团能够认同TSKgel Protein A-5PW的创新性，并授予我们这个十分荣耀的奖项。由于抗体药物在初期研发阶段需要对细胞培养液中的IgG含量进行快速且精确的定量，所以越来越多的研发人员渴望借助一款能实现高通量分析的工具。东曹生命科学于去年推出的TSKgel Protein A-5PW 亲和色谱柱凭借其高流速高通量，以及相对较长的使用寿命，成为单克隆抗体分析的理想解决方案。”该款色谱柱已于2016年8月全球同步上市。铜奖： TSKgel Protein A-5PW 亲和色谱柱（Tosoh Bioscience LLC）

2020年2月29日，月旭科技董事长兼总经理屠炳芳先生、国际市场总监赵枭先生前往访问耶鲁大学医学院实验室（Yale University School of Medicine）。针对耶鲁大学医学院实验室使用月旭科技蛋白纯化系列产品进行研究的情况，与研究学者展开了深切的沟通和交流。具体探讨了关于研究过程中产品使用心得及建议等问题，并就未来如何更好的为海外提供优质的产品进行了讨论。本次耶鲁大学医学院实验室中，采用了月旭科技预装NTA和IDA镍亲和层析柱。柱子采用1/16英寸接口可以直接与AKTA蛋白纯化仪相配套使用，也可随实验条件不同与注射器、恒流泵或其他色谱系统配套使用，性能稳定，重复性好、使用简单。月旭PreCot Ni 6FF（NTA）5ml和PreCot Ni 6FF（IDA）5ml两款预装柱可以满足大多数实验室级别的小量纯化His-tag融合蛋白的需求。同时也可以根据客户的需求预装不同规格的预装柱，方便客户进行规模化放大。下面，就跟着小编一起来具体了解一下吧！层析柱参数NTA和IDA填料性能对比注：二价的镍离子有六个螯合价位，Ni-NTA螯合了四价，剩余两价；而Ni-IDA螯合三价，剩余三价，因此Ni-IDA结合能力要比Ni-NTA强，在同样条件下Ni-IDA的载量要比Ni-NTA的高，但Ni-NTA更稳定，耐受更强的还原剂，镍离子不易脱落。因此需要根据不同纯化条件选择纯化所需的镍柱，以达到纯化的zui佳效果。此次交流活动，不仅收获了耶鲁大学医学院实验室和科研学者对月旭产品的一致认可。也标志着月旭科技在开拓海外市场中迈出了更加成功的一步。正如我们所倡导和坚信的，国产仪器及产品在某些方面比进口产品更好。而月旭科技作为民族品牌，励志要将国产产品推出国门，并通过不断创新和自我勉励，生产出更优质的产品，为我国的科学仪器事业发展贡献出自己的一份力量！并将“让国货在海外的舞台上发光发亮”的愿景铭记于心，脚踏实地走好每一段奋斗拼搏的路！

2019年3月17日至3月21日，全球科学仪器行业内历史悠久、享誉盛名的Pittcon展会(匹兹堡分析化学和光谱应用会议暨展览会)在美国费城宾夕法尼亚会议中心盛大召开。 在第三届Pittcon Today卓越奖名单中，东曹公司的高效液相亲和色谱柱TSKgel FcR-ⅢA-NPR获得了银奖。该色谱柱是专为快速测定单克隆抗体的ADCC活性而开发。 Pittcon Today奖项的设置旨在识别今年展会上的创新，并为参展商提供一个新的渠道以展示他们的研究进展和技术进步。本次奖项由来自学术、工业和贸易媒体组成的评委团评选，主要考察产品的独创性、创造力、实用和结果，以及该产品在行业和广泛公众中的影响力。奖项根据各公司申报的销售额分为三个类别，分别评选出了金奖、银奖和铜奖。 东曹生命科学美国分公司的产品经理Cara Tomasek表示：“我们非常高兴Pittcon Today奖项的评委团能够认同TSKgel FcR-ⅢA-NPR的创新性，并授予我们这个十分荣耀的奖项。随着生物制药行业的发展，越来越多的研究人员在寻求一种可以在短时间内快速分离并且测定单克隆抗体的ADCC生物活性的方法。TSKgel FcR-ⅢA-NPR色谱柱正好满足了这一需求，不仅可以应用在研发前期的细胞株筛选、抗体发酵工艺条件优化，也可应用在过程监控分析和最终产品批次的质量控制中。”银奖：TSKgel FcR-ⅢA-NPR高效液相亲和色谱柱（Tosoh Bioscience LLC）

事件回顾10月5日，黑龙江鸡东县发生一起因家庭聚餐食用酸汤子引发的食物中毒事件，9人食用后死亡。根据黑龙江省卫健委食品处发布的消息，经流行病学调查和采样检测后，在玉米面中检出高浓度米酵菌酸，同时在患者胃液中亦有检出，定性为由椰毒假单胞菌污染产生米酵菌酸毒素引起的食物中毒事件。10月19日，国家卫健委发布慎吃长时间发酵的酵米面类食品的提示，并指出，2010年至今，全国已发生此类中毒14起，84人中毒，37人死亡。原本应该团团圆圆的家庭聚餐却以悲剧结尾，除了不制作、不食用酵米面类食品外，作为分析检测从业者，助力食品企业做好食品检测，一直激励着我们坚持产品质量不松懈。 毒素检测净化柱 默克作为生命科学行业的先行者，旗下的Supelco，分析化学业务下的Supelco品牌早期便推出了用于毒素检测的固相萃取小柱——SupelTM Tox 毒素检测净化柱。该小柱是专门针对毒素检测的基质净化而开发的快速、便捷的样品前处理产品。 和免疫亲和柱相比，SupelTM Tox：1.显著缩短样品制备时间，提高重复性2.更加方便使用3.Supel™ Tox SPE方法需要更少的设备和耗材，节省成本 详细信息见下表1表2为 SupelTM Tox AflaZea SPE和免疫亲和柱在分析花生酱中黄曲霉毒素的样品前处理方法比较：图1为黄曲霉素标准品色谱图，B1&B2 (4 ppb) G1&G2 (16 ppb) 图2为花生酱加标色谱图，B1&B2 (4 ppb) G1&G2 (16 ppb)实验条件 色谱柱Ascentis Express C18, 100 mm x 2.1 mm, 2.7 µm （53823-U）流动相(A) H2O (B) ACN (C) MeOH (74:13:13, A:B:C) with 0.780 g KBr and 230 µL HNO3流速0.4 mL/min检测器FLD, Ex 360 nm, Em 440 nm进样量40 µL 图3为花生酱中黄曲霉毒素的前处理免疫亲和柱和SupelTM Tox回收率比较 与免疫亲和柱的多步骤“结合和洗脱”策略不同，Supel™ Tox AflaZea、DON和Tricho SPE柱采用“干扰物去除”方法，在分别洗脱黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和单端孢霉烯（A型和B型）之前无需清洗步骤，从而节省时间其特点和优点如下： 1． 有效去除毒素分析中的杂质2． 重现性高于目前市售的商品化免疫亲和柱 3． 样品处理时间是免疫亲和柱的十分之一 4． 处理方法简便、快捷，无需繁琐的方法开发 5． 产品的热稳定性促成了比免疫亲和柱更长的保质期，并且不需要在低温条件下进行运输和储存