去垢剂

大家好，本周为大家分享一篇来自Angewandte Chemie - International Edition的文章：Infrared Multiphoton Dissociation Enables Top-Down Characterization of Membrane Protein Complexes and G ProteinCoupled Receptors[1]，文章的通讯作者是牛津大学化学系的Carol V. Robinson教授。　　非变性质谱(Native MS)是结构生物学中一个成熟的工具。在电喷雾电离过程中使用非变性缓冲液可以保存多组分蛋白质复合物之间的非共价相互作用，以及它们的配体、辅因子或其他结合蛋白。它可以用于探究蛋白质复合物的相互作用和功能，因为结合事件导致质量变化，可以在质谱仪中跟踪和剖析。然而，由于膜蛋白的疏水性，使得它们在传统的非变性质谱缓冲液中不溶且容易聚集，因此在非变性质谱中呈现出独特的挑战。目前采用的方法是将蛋白质复合物溶解到膜类似物中，例如：去垢剂、纳米脂质盘、两性聚合物等，再将这些膜类似物通过碰撞激活去除。其中去垢剂是应用的最广泛的一种。然而由于碰撞激活的能量在应用中受到限制，该方法并不能在质量分析前很好地去除去垢剂。此外，在非变性质谱条件下，键的断裂也受到非共价相互作用强度的影响(例如蛋白质-蛋白质、蛋白质-去垢剂剂以及去垢剂胶束内的相互作用)。　　基于光子的方法，如紫外光解离(UVPD)和红外多光子解离(IRMPD)已被证明有利于可溶性蛋白质及其复合物的Top-Down质谱分析。与此同时，基于光子的膜蛋白Top-Down模式的应用正在兴起。原理上，激光束路径中的离子被连续地驱动到振动激发态。因此，在基于光子的方法中，能量储蓄通常与前体离子的电荷状态和分子量无关。然而，电荷状态和分子量仍然会影响肽键解离需要的输入能量。先前报道的通过UVPD对79 kDa的五聚体的大电导机械敏感通道(MscL)Top-Down的断裂得到了令人印象深刻的54%的序列覆盖。然而，对于氨通道(AmtB)一个127 kDa的同源三聚体，通过碰撞激活和UVPD两种不同的方式破碎，仅实现了20%的序列覆盖率。事实上，相对较低的序列覆盖率是由于大分子量以及三聚体中增加的非共价相互作用影响的结果。尽管这些工具能够在非变性状态下实现Top-Down质谱分析，但其在膜蛋白表征中的应用仍不广泛。这就要求建立一种能使低电荷密度的高分子量蛋白质稳定地产生蛋白质序列离子的方法，而膜蛋白嵌入异质膜或膜类似物则使这一问题更加复杂。虽然IRMPD之前被用于从去垢剂中释放膜蛋白，但使用IRMPD对非变性的膜蛋白进行测序的研究相对较少。　　图1. (A)改进的Orbitrap Eclipse Tribrid的原理图，其中包括一个红外激光器直接进入四极线性离子阱(QLIT)的高压细胞。离子化的蛋白质胶束被转移到高压QLIT中，在那里整个离子群受到红外光子的照射，然后被转移到Orbitrap进行质量分析。通过调节激光输出功率(W)和照射时间(ms)，可以使膜蛋白从去垢剂胶束中完全解放出来。(B)三聚氨通道(AmtB)在3.0 W输出功率和200ms辐照时间下的非变性质谱。(C)在3.3 W输出功率和200ms辐照时间下AmtB的非变性质谱。　　因此，作者利用改进的Orbitrap Eclipse Tribrid质谱仪，与连续波远红外(IR) CO2激光器连接，使光束聚焦到双四极杆线性离子阱(QLIT)的高压池中(图1A)。红外激活可以有效地去除蛋白质复合物中的去垢剂胶束，随后通过IRMPD使得膜蛋白碎片化。在这种安排下，由纳米电喷雾电离产生的蛋白质复合物被转移到高压池中。在转移到Orbitrap进行检测或m/z分离和随后的碎片化之前，整个离子群将受到943cm-1红外光子的照射。利用红外的方法去除去垢剂胶束，红外激光有两个可调控参数:激光输出功率(高达60瓦)和照射时间(毫秒到秒)。因此，可以更好地控制从蛋白质胶束中释放膜蛋白，确保非变性复合物的保存，同时完全去除包裹复合物中的去垢剂。通过对激光输出功率和照射时间的优化，作者发现红外激活的参数是高度可调的，不同的激光功率和照射时间的组合也可以产生分辨率相当的谱图。其中例如在3.3 W下照射200 ms时，可以得到多个电荷态的三聚体峰(~6500 m/z)，也可以观察到三聚体与脂质结合的峰，而且对于图谱中的单体也能观察到与脂质结合的峰(图1C)。作者还对不同的去垢剂产生分辨率较高的图谱所需要红外参数进行了评估，从而评价了这几种去垢剂得到高分辨率图谱的难易程度(图2)。　　图2. 红外辐射去除膜蛋白离子中的去垢剂是高度可调的。增加激光输出功率对三种常用的MS兼容去垢剂(C8E4, G1和DDM) AmtB三聚体峰外观的影响。辐照时间固定为200 ms，激光输出功率分别为2.1、2.4、3.0和3.6 W。去垢剂在真空中按易去除的顺序显示，这是由完全释放膜蛋白复合物所需的激光输出功率决定的，从而在m/z光谱中产生良好分辨的电荷状态峰。为了探究IRMPD分离蛋白质和去垢剂胶束的机制，作者对三种不同的去垢剂：四聚乙二醇单辛醚(C8E4)、树突状低聚甘油(G1)和十二烷基-β-D-麦芽糖苷(DDM)的溶液相和气相红外光谱进行了表征，并利用密度泛函理论(DFT)计算得到了C8E4头部基团的红外谐波光谱，用来验证所得到的红外吸收光谱会受到振动耦合的影响，对于质子化的去垢剂离子，氢键和富氧去垢剂内的质子共享可以改变观察到的振动频率。结果表明C8E4胶束的溶液相吸收光谱包含一个与预期激光波数943cm-1重叠的显著带，这就解释了为何较低的激光能量可以将去垢剂胶束和蛋白质复合物分离。而在谐波光谱中在预期的激光波数处的确产生了峰，并推测该峰来自于O-H伸缩、C-C伸缩，C-H弯曲和C-O伸缩振动的耦合。而G1和DDM的最大吸收则偏离了943cm-1的预期波数，作者认为这是不同去垢剂氢键作用的结果。而蛋白质在真空中的红外吸收能力较弱，由此推测在IRMPD的过程中，去垢剂是主要的吸收对象。所以仅需要较低的能量就可以使蛋白质从复合物中剥离而不至于破坏蛋白质的非共价作用。完整的蛋白质离子还支持串联质谱的实验，为了得到蛋白质的序列信息，作者分离了m/z在6674处(电荷态为+19)的AmtB三聚体蛋白，并将其置于高激光输出功率(9 W)下照射5 ms，在m/z 1750~4000之间产生密集的多电荷态离子片段，并得到了26%的序列覆盖，这优于之前基于碰撞激活的方法(20%的序列覆盖率)。此外，在MS2的谱图中并没有观察到单体的峰，这说明共价键的断裂比蛋白质的展开和亚基的分离更快，这种效应也在之前的可溶性蛋白和膜蛋白研究中呈现。为了探究位点裂解的偏好，作者将片段离子丰度通过电荷态进行了归化一，发现了高频的断裂位点来自于经典的选择性断裂位点X|P和D|X，而剩余的断裂往往发生在A|G、F|G和V|G的位点，说明N端到甘氨酸有更高的断裂偏好。为了观察断裂的位置和蛋白质的二级结构之间的关系，作者沿着氨基酸序列构建了每个片段相对于原点位置的相对丰度图，多个电荷态的离子则通过归化一的方法进行求和。(图3)由此观察到了大多数的片段断裂出现在跨膜区域的α-螺旋处，其中8号α-螺旋的T|P和V|G，以及6号α-螺旋的L|G和F|G断裂产生了丰度最高的几个片段。此外，将这些片段的相对丰度映射到三聚体的结构上发现，片段来自于蛋白质的内部而非表面。分子动力学的研究表明了其中的机制，在高温下蛋白质的跨膜区域的α-螺旋保持了稳定的结构，而非跨膜区域的α-螺旋则失去了大部分的螺旋结构。先前的研究表明了α-螺旋外侧的质子化的氨基酸可以稳定α-螺旋的结构。由此，作者推测质子不光可以稳定蛋白质的螺旋结构，而且可以沿着蛋白质的骨架迁移来诱导电荷远程破碎。　　图3. 三聚体AmtB的IRMPD。(A)在m/z 6674处分离19+电荷态离子阱后，IRMPD后观察到的碎片离子MS2谱。多重带电碎片被高亮显示 来自相同地点的重复片段用虚线分组。为了清楚起见，许多指定的离子没有注释 (B)片段丰度相对于裂解原点(残基数)的条形图，其中丰度表示来自每个位点的片段归化一强度之和。条形图的颜色强度表示每个片段的加权平均电荷。将AmtB的拓扑域叠加在条形图上 α-螺旋跨膜区域用黄色方框表示，编号为1到11。跨膜区由质周环和细胞质环连接，用灰色线表示。(C)主干裂解位点覆盖在AmtB (PDB: 1U7G)的结构上。蓝色和红色阴影区域分别代表b型和y型离子。颜色强度对应于所分配片段的丰度。从气相分子动力学模拟中得到的高温(500 K)下的跨膜螺旋快照用虚线圈标出。为了验证这一个推测，作者又对另外两种GPCR蛋白：β -1-肾上腺素能受体(β1AR)和腺苷A2A受体(A2AR)用IRMPD进行了MS2图谱的测定，结果也观察到了片段离子相似的二级结构定位，在跨膜结构区域有着高丰度的片段，但是在二硫键相连的螺旋中并没有观察到丰富的离子片段。并再次利用分子动力学模拟研究了两种GPCR的结构对断裂的影响。在500 K下的最终结构中显示，两种GPCR中都保留了α-螺旋特征，并与观察到的裂解位点密切相关。此外，还对这两种蛋白进行了HCD和IRMPD的比较分析。对于β1AR, IRMPD产生的片段离子平均分子量为8866 Da，高于HCD产生的5843 Da。IRMPD产生的片段离子也保留了更高的平均电荷(4.7 + vs 3.6+ z)。最终，IRMPD的碎片化导致β1AR的序列覆盖率更高，为28%，而HCD为17%。在A2AR中也观察到类似的趋势，IRMPD的覆盖率为19%，而HCD为9%。　　总的来说，作者证明了可以在改进的Orbitrap Eclipse质谱仪的高压QLIT下，通过红外照射可以完全释放一系列去垢剂胶束中的膜蛋白。然后，通过增加激光输出功率，获得直接从膜蛋白及其复合物中释放的序列信息片段离子，证明红外光去除去垢剂是通用的和高度可控的，为保存和鉴定膜蛋白和配体之间脆弱的非共价相互作用构建了一个可靠的方法。而且还对片段离子的产生机制做了阐述，即质子可以通过沿蛋白质骨架迁移来稳定和诱导连续的肽键裂解。　　撰稿：李孟效　　编辑：李惠琳　　文章引用：Infrared Multiphoton Dissociation Enables Top-Down Characterization of Membrane Protein Complexes and G ProteinCoupled Receptors　　参考文献　　Lutomski, C.A., El-Baba, T.J., Hinkle, J.D., et al. Infrared multiphoton dissociation enables top-down characterization of membrane protein complexes and g protein-coupled receptors[J]. Angewandte Chemie-International Edition，2023.

01研究背景膜蛋白生命活动中具有重要作用，也是重要的药物靶点，而膜蛋白在进行互作研究过程中会有许多难点：1. 膜蛋白一般需要去垢剂来模拟脂质生物环境。对于基于固定的互作技术，去垢剂会增加背景信号，或者存在参比通道和样品通道背景不同的可能。2. 膜蛋白结构复杂，且与配体结合后可能发生变构。因此研究互作时，膜蛋白的正确构象至关重要。基于固定的技术可能阻碍变构过程，或者在固定和再生过程中破坏膜蛋白的构象。3. 膜蛋白的表达量低、纯化难，因此需要消耗量少的方法进行检测。本期文献解读，讲述如何利用MST及nanoDSF的手段来进行膜蛋白互作研究的故事。02研究内容2024年3月15日，上海科技大学张璐研究员/饶子和院士团队在Nature Microbiology发表题为“Structural analysis of phosphoribosyltransferase-mediated cell wall precursor synthesis in Mycobacterium tuberculosis”的研究，解析结核分枝杆菌全新药物靶标——膜蛋白磷酸核糖转移酶Rv3806c与其受体底物DP和供体底物PRPP结合复合物的精细三维结构，为研究Rv3806c作为新靶点的靶向性药物研发提供了重要的理论基础。https://doi.org/10.1038/s41564-024-01643-8IF: 28.3 Q1通过对Rv3806c与供体底物PRPP复合物结构分析，推测可能影响Rv3806c结合和酶活的位点，并通过MST进行大量突变Rv3806c亲和力检测进行验证。Rv3806c为膜蛋白，并且在脂质环境中以三聚体形式组装。实验种共有10种突变体需进行Kd检测，每次实验均进行了5次重复。MST进行一次亲和力检测时，仅需32pmol、1μg的膜蛋白Rv3806c，大大节约蛋白消耗量。此外，MST技术是在溶液条件下进行，无需固定，且兼容去垢剂，使膜蛋白能保持正确的构象，甚至可以完成nanodisc或者膜提取物形式的膜蛋白亲和力检测，从而可以轻松表征膜蛋白Rv3806c多种突变体与底物PRPP的亲和力。图示：MST测定PRPP与WT-Rv3806c及突变体的结合亲和力此外，研究发现，供体底物PRPP通过一个Mg2+结合在TM螺旋束-1的空腔。为了研究Mg2+对Rv3806c结合供体底物PRPP的作用，作者使用MST和nanoDSF技术检测存在或不存在Mg2+时，Rv3806c与底物PRPP的结合。NanoDSF技术通过监测蛋白内源荧光的变化来表征蛋白结构，无需加入外源荧光染料，兼容去垢剂。使用GDN纯化的Rv3806c完成MST亲和力实验和nanoDSF的热迁移实验，结果显示Mg2+对于PRPP的结合至关重要。图示：MST分析在Mg2+存在或不存在的情况下，PRPP与Rv3806c的结合亲和力。在没有Mg2+的情况下，结合亲和力急剧下降，而在金属螯合剂EDTA的存在下，没有检测到结合。图示：在Mg2+、PRPP和EDTA存在或不存在的情况下，纯化后的Rv3806c的nanoDSF热稳定性分析。PRPP-Mg2+存在时Rv3806c表现出最高的热稳定性。03技术优势在这篇工作中，通过MST技术及nanoDSF技术，确定了膜蛋白Rv3806c与PRPP结合的关键残基，以及Mg2+在互作过程中的关键作用。对于分子互作亲和力的检测，Monolith系列仪器无需固定样品，且不限制缓冲条件，蛋白用量少，可以在溶液中表征膜蛋白与小分子的亲和力。Promethus系列仪器，以nanoDSF技术为核心，通过检测蛋白内源荧光监测蛋白的稳定性，无需外源荧光染料，兼容去垢剂，低浓度也可轻松表征，在膜蛋白稳定性分析和TSA互作定性研究上具有显著优势。-Monolith分子互作检测仪--PR Panta蛋白稳定性分析仪-

01研究背景稳定的、高纯度、单分散的生物样品显示出更高的结晶倾向[1]。早期阶段识别那些更有可能产生晶体的结构或变体能够节省大量的人力和时间成本。目前的很多方法，如凝胶过滤、DSF等技术可以帮助识别最优性质的样品，但是存在样品消耗量大或者外源染料与溶剂不兼容等问题。NanoTemper开发的nanoDSF差示扫描荧光技术，基于蛋白的内源荧光检测Tm值，通过Tm值的绝对数值和变化来确定优先结晶的缓冲条件或者蛋白变体等。接下来，我们通过两篇文献来了解nanoDSF如何助力结晶条件的筛选。02案例解读https://doi.org/10.1038/s41467-023-35915-4IF: 16.6 Q1非特异性磷脂酶C (NPC) 是植物特有的一类磷脂酶。尽管对NPCs的研究揭示了其在植物生长发育中的基本作用，但相比于其它磷脂酶（A1/A2/D/PI-PLC）水解底物的分子机制研究，NPCs是迄今为止唯一一类尚未被阐明的磷脂酶。湖北洪山实验室、作物遗传改良全国重点实验室蛋白质科学研究团队联合油菜团队的研究成果解析研究了NPC4的晶体结构和工作机制，为真核生物磷脂水解酶家族的分子机制提供了新见解。 研究中获得了NPC41-415和NPC41-496 两组结晶，对比结晶结果，发现NPC41-415没有磷酸化，且CTD结构域没有观察到电子密度。SDS-PAGE结果显示，蛋白在结晶过程中被部分降解，可能导致晶体中缺少CTD结构域。对比结晶条件发现NPC41-415的结晶中不存在KH2PO4，同时KH2PO4不影响NPC4活性。因此，作者推测KH2PO4可能会增强NPC4的稳定性。NPC4为膜蛋白，一般膜蛋白的表达和纯化得率均比较低，因此需要使用蛋白消耗量少的热稳定分析技术以最大程度的节约膜蛋白样品。nanoDSF技术样品检测浓度可低至5ug/ml，10μl，大大节约蛋白样品。研究人员利用nanoDSF技术检测了KH2PO4对NPC蛋白热稳定性的影响，每个条件仅需5.6ug NPC4蛋白样品。加入KH2PO4后，Tm值从51.1℃提高到55.3℃，表明NPC4在KH2PO4存在下更稳定，也解释了缺少KH2PO4时蛋白降解的原因。图示：KH2PO4提高NPC41-496 稳定性：nanoDSF结果显示，NPC41-496 Tm为51.1℃；在有50mM KH2PO4 存在下提高到55.3℃03案例解读https://doi.org/10.1038/s41598-023-41616-1IF: 4.6 Q2水通道蛋白2（APQ2）调控水的重吸收进而调控机体的水代谢平衡。AQP2基因的点突变可能导致肾性尿崩症(NDI)。为了进一步了解AQP2突变导致NDI的分子机制，作者通过对三种AQP2突变体(T125M、T126M和A147T)进行结晶，以了解突变AQP2的结构和功能关系，为NDI背后的机制提供了分子见解。为了提前了解突变对AQP2蛋白稳定性以及其对后续结晶的影响，研究人员使用nanoDSF技术比较了三种突变体的热稳定性差异。需要注意的是AQP2同样为膜蛋白，其储存溶液中含有去垢剂OGNG等成分，而nanoDSF技术是基于蛋白的内源荧光进行Tm检测，对去垢剂等兼容，无需优化检测条件，可快速获得重复性高的Tm结果。nanoDSF结果显示所有的热变性曲线显示出相似的形状。然而，Tm和Tonset在不同突变体之间存在差异。野生型AQP2的稳定性最高，其次为T126M和T125M， A147T的热稳定性最低。 图示：nanoDSF检测WT AQP2以及其突变体的热稳定性接下来，作者对AQP2以及其突变体进行结晶。在与野生型AQP2相同的条件下，只有T125M和T126M产生了足以用于结构测定质量的晶体，与野生型AQP2的结构高度相似。T126M晶体的衍射分辨率最高，为(~ 3-3.3 &angst )，其次是T125M (~ 3.7-4 &angst )。A147T晶体质量最低，衍射x射线约为5-7 &angst 。结晶结果与三种蛋白质结构的热稳定性非常一致，即蛋白质的热稳定性降低可能会降低其成功结晶的能力[2][3]。03案例小结&技术优势在上述两篇文献中，作者使用nanoDSF技术检测了膜蛋白在不同缓冲条件或者突变体的热稳定性，并且均可与后续的结晶结果对应。nanoDSF对缓冲溶液兼容，如去垢剂，无需额外优化条件，仅需非常少量的样品，即可快速完成Tm检测。明星产品PR Panta更是整合了4大检测模块（DLS、SLS、Backreflection和nanoDSF），仅需一份样品即可获得多种参数，更清楚了解结晶前样品情况，挑选最佳条件蛋白或条件进行结晶。PR Panta蛋白稳定性分析仪[1] Zulauf M, D'Arcy A (1992) J Cryst Growth 122:102–106[2] Dupeux, F (2011) Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 67, 915–919.[3] Deller, M. C. (2016).Acta. Crystallogr. F Struct. Biol. Commun. 72, 72–95.

本广告产品仅用于工业及科研，不用于临床诊断。冷冻电镜Cryo-EM技术顺利斩获诺奖，其重要突破就在于可在非结晶的溶液状态中直接对蛋白结构进行观察和分析，而数据分析的前提，就是样品构象的高度纯化与均一性，这一切均有赖于90年前的一项诺奖技术——AUC分析超离技术。AUC分析超离技术开创了上世纪前半页的蛋白质大分子研究传奇年代，领衔DNA半保留复制和染色体超螺旋结构研究，定义了70S、28S等一系列亚细胞器组分。自从1926年AUC拿到第一个诺贝尔奖以来，直到今年的冷冻电镜，几乎每隔十来年，就有一个诺奖与之密切相关。如今，中国的冷冻电镜蛋白质结构鉴定独步全球，AUC已成其标配伴侣；免疫治疗中的两大重点：单抗药物的制剂开发和CAR-T病毒载体鉴定质控，均依赖AUC给出核心数据；离不开AUC分析的HPV、HEV等VLP疫苗的发明与上市，更是改写教科书式的成就，先斩拉斯科奖 [1]，诺奖也将唾手可及。时值新一届诺奖颁布之际，经清华大学蛋白制备和分析平台主管李文奇老师的多年盛情邀请，有AUC分析圣经之称的《Basic Principles of Analytical Ultracentrifugation》一书作者，来自NIH的Peter Schuck教授，亲自率领该书第2和第4作者，以及来自法国和日本的两位顶级AUC研究科学家团队，访问清华，与国内各家AUC用户和感兴趣人员一起，举办了为期一周的AUC专题研讨会和技术培训班。Peter Shuck教授首先就AUC的SV分析在多组分复杂复合物研究分析中的优势和分析技巧做了主题报告。Peter多年来一直致力于AUC数据分析的实验和算法优化，其领导的NIH团队编写的SEDFIT系列免费分析软件，已成为AUC用户的标配程序。来自大阪大学的Susumu Uchiyama教授紧接着给大家，包括我们贝克曼公司送上一份震撼大礼：他们实验室至今还保留着一台Model E，贝克曼公司1927年推出的第一代AUC！70年来，Susumu实验室利用一代又一代的AUC产品，对抗原抗体的相互作用进行了深入研究，并通过AUC分析了各种抗体在不同制剂环境中的聚集和作用情况，协助日本近20家药厂上市或申报了大量重组蛋白和单抗药物。此后，报告精彩纷呈：NIH的Huaying Zhao教授利用荧光AUC技术，深入研究了血浆等复杂环境中的抗原抗体相互作用；生物物理所的Ping Chen教授和NIH的Rodolfo Ghirlando教授均把注意力集中在染色质核小体的体外体内组装过程；法国IBS的Christine Ebel教授对膜蛋白的结构分析作出了大量优化，并详细分析了不同类型去垢剂对膜蛋白提取和构象改变的影响；厦门大学Shaowei Li教授首创原核表达和组装的VLP类病毒颗粒疫苗，彻底改写了教科书中对于病毒组装过程的表述，他们研发的HEV、HPV等疫苗均已成功上市或进入临床[2]；中科大Xiaodong Ye教授另辟蹊径，把AUC用于生物传感器的研究，动态监测DNA分子在不同环境中的构象改变……最后，作为活动主办方，清华大学蛋白平台的Wenqi Li、Xianyang Fang和Jianfei Ma博士分别阐述了他们使用AUC等多种技术联合，应用与蛋白结构研究、大分子RNA 3D结构和超大蛋白复合物组装等领域的经验：AUC作为Cryo-EM和SAXS的样品质控早已成为共识，此外AUC还可为后期蛋白结构计算和解析提供重要参数；当SEC、SPR、DLS等多种技术结果出现差异时，由于AUC更接近体内，可作为相关结果的仲裁；反之，DLS等的数据也可为AUC的数据分析提供优化参考。多技术融合互补，让科研更接近于生物体内的真实。第一天的国内外顶尖学术盛宴意犹未尽，NIH三位教授再度联手，为国内30多位AUC用户提供了为期4天的AUC技术和Sedfit分析技巧深度培训。从原理到实验设计，从数据分析到算法优化，培训班上各人就各种蛋白复合物的检测、抗体药物稳定性和聚集性研究、去垢剂等复杂溶液环境中的分析优化、膜蛋白沉降模型等话题，展开了广泛而深入的讨论，为国内的AUC用户深化了技巧、开拓了思路。NIH教授在授课研讨会部分照片3年多的梦想与努力，国际顶级AUC科研和培训团队终于实现首度来华，印证了近年来国内各AUC用户的前进步伐已逐渐赶上国际前沿。让我们继续努力，让百年AUC技术在我们手中，再度绽放诺奖级光华！参考资料：[1] 拉斯克奖官方网站 [2] 厦门大学新闻网

进出口化妆品中二恶烷残留量的测定气相色谱串联质谱法实验室配套产品 根据行业标准SN/T 1784-2006 二恶烷别名二氧六环，常态下为稍有香味的无色液体。主要用做乳化剂，去垢剂，作溶剂等。吸入，食入或经皮吸收后有麻醉和刺激作用，并会在体内蓄积。该方法通过试样在顶空瓶中经过加热提取后，用气相色谱/质谱法（GC/MS）进行测定，外标法定量，采用选择离子检测进行测定。 货号 名称 品牌 规格 报价（RMB） CDCT-C12865000# 1，4-二恶烷标准品 Dr 5ml 360.00 CFAA-33147-5ML# 1,4-二恶烷、1,4-二氧六环&ge 99.5% aNPEL 5ml 120.00 CBAC-36519-500G# 农残级无水氯化钠 Fluka 500g 450.00 CAEQ-4-003302-4000# HPLC级甲醇 CNW 4L 230.00 GAEQ-554421 CD-5MS气相毛细管色谱/质谱柱 CNW 30m*0.25mm*0.25um 5515.00 VBAP-320020E-2375-100# CNW 20mm钳口20mL平底透明顶空样品瓶 （带书写） for Carlo Erba/Dani/Fisons/Agilent CNW 100个/盒 310.00 VBAP-320020EA-2375-100# CNW 20mm钳口20mL圆底透明顶空样品瓶 （带书写） for CTC/Varian/Gerstel/Atas/Shimadzu/Triplus HS CNW 100个/盒 370.00 VEAP-5140F-20-100# 20mm钳口瓶用银色铝盖、含PTFE/丁基橡胶隔垫 （max to 100℃） CNW 100个/袋 350.00 VGAP-9300-20# 用于20mm钳口瓶的手动压盖器 CNW把 1900.00 VGAP-9320-20# 用于20mm钳口瓶的手动启盖器 CNW 把 2000.00 EKMD-PW124 PW214分析天平（最大量程：210g，可读性误差： 0.0001g，内部校准） Adam 台 10500.00 EDAA-2150TH# 2150 TH数控加热超声波清洗器（容量：6L，温控范围：室温-80℃） ANPEL 台 4580.00

霸王旗下中草药洗发露、首乌黑亮洗发露以及追风中草药洗发水，经过香港公证所化验后，均含有被美国列为致癌物质二恶烷。　　14日消息，据香港《壹周刊》报道，霸王旗下中草药洗发露、首乌黑亮洗发露以及追风中草药洗发水，经过香港公证所化验后，均含有被美国列为致癌物质二恶烷。　　美银美林发表研究报告，就《壹周刊》有报道指霸王洗发水含致癌成份二恶烷，该行指若证实报道，相信必将影响其品牌所有产品销售，进而可能导致品牌形象受损及影响高性能产品的推售，该行表示，今日霸王必受到市场的负面回应。　　霸王公司首席执行官万玉华对此回应称，该物质在原料上出现，但称全行业大部份洗头水均有，强调含量少对人体无害。　　据了解，类似事件曾有发生。2009年3月，强生的婴儿香桃沐浴露中便被中国国家质检总局检出微量的二恶烷。强生曾回应称，二恶烷在一些原材料中自然存在无法避免，并指出“强生婴儿香桃沐浴露含的二恶烷符合国家标准”。　　名词解释　　二恶烷，有机化合物，别名二氧六环、1，4-二氧己环，无色液体，稍有香味。属微毒类，对皮肤、眼部和呼吸系统有刺激性，并且可能对肝、肾和神经系统造成损害，急性中毒时可能导致死亡。主要用作溶剂、乳化剂、去垢剂等。　　延伸阅读　　“霸王式危险”源自安全标准的空白与落后 　　霸王声明强调产品安全 将委托第三方做产品检测　　霸王4小时发17条微博澄清 七成网友表示不再买

作者：钟丹丹博士，蒙敏博士超滤技术专题系列 生命科学实验室的超滤设备密理博提供的实验室超滤全套解决方案尽管切向流过滤Amicon Ultra的超速装置，提供优良的性能（使用水平吊篮转子尤佳）。更多的用于与大规模操作，但密理博为您开发了附有垂直膜面的生命科学实验室用超滤离心装置，常见的有 Amicon Ultra 离心超滤装置密理博公司的Amicon离心超滤装置是一种理想的工具，可以用来对盐分、糖类、核酸、非水溶剂及其它一些低分子量物质进行去除和更换。它们还可以用来分离未结合上的游离标记物。 密理博离心超滤装置具有快速、方便、回收率高的特点，可替代并优于透析及乙醇沉淀。盐分通过滤膜的效率很高且不依赖于微溶质的浓度和大小。Amicon Ultra内置超滤装置图解 Amicon Ultra 超滤离心管的使用方法蛋白质样品: 把蛋白质样品加到Amicon Ultra的内管中，然后只需要10到20分钟的离心时间，就可把不需要的缓冲液和小分子超滤到外管里，从而在内管中获得高达30倍到80倍浓缩倍数的样品。其它样品处理方法，请点击此处查看Amicon Ultra使用示意图 Amicon Ultra 超滤离心管的应用 蛋白质样品浓缩、脱盐及缓冲液置换 样品中去垢剂的去除 双向电泳样品的制备 纯化血清多肽做生物标志物 抗体的快速浓缩 未结合标志物的去除 尿液的浓缩 核酸样品浓缩及脱盐 法医鉴定分析样品的预处理 更多有关生命科学实验室的超滤解决方案，请咨询：china_bioscience_marketing@millipore.com 或本文版权为密理博所有，欢迎转载或提出宝贵意见，转载时请注明密理博中国博客并附原文链接

基于结构的药物发现(Structure-based drug discovery, SBDD)是设计和优化创新药的必要方法。本篇综述将深入探讨冷冻电镜(cryo-EM)在SBDD领域中的快速崛起及它的主要作用，以及阐释它如何为高价值药理学靶点提供丰富的全新结构信息。冷冻电镜技术相比X射线晶体学的主要优势在于，它可以跳过繁琐的结晶步骤，从而直接对玻璃化的生物大分子进行成像；冷冻电镜也可以提供更多维度的信息，包括异质性和动态性。此外，本综述还将讨论冷冻电镜近期和未来的发展，并探讨该技术将在SBDD的管线中产生何种广泛的影响。冷冻电镜时代的SBDDSBDD是一种基于靶点的原子级结构基础信息，针对该靶点进行理性药物设计的研发方法。20世纪80年代，随着Captopril卡托普利和多佐胺Dorzolamide等酶靶向药物获批上市，SBDD方法初露锋芒。这一批由FDA批准的药物结合了晶体结构模型与计算机辅助分子建模这两大新兴技术，并成功解决了传统湿实验室的高通量筛选方法(HTS)所面临的昂贵、耗时及低回报率等问题。此后，随着计算技术的不断革新，大量药物靶点的晶体结构得以解析，SBDD方法进入了飞速发展阶段。从1999年到2013年，在113个获批的first-in-class药物中，有78个是基于SBDD方法发现的。尽管SBDD的发展足够迅速，但学界及制药行业内对它的期望显然更高。SBDD方法往往能另辟蹊径，对过往认为不可成药的靶点进行验证，并进一步开发新药。如K-Ras(G12C)靶点，它利用晶体学结构确定了一个以前未知的结合口袋，以避免与皮摩尔亲和力的GDP/GTP竞争。由于靶点验证是发现和开发工作中的主要难题之一，first-in-class药物分子可以为靶点的有效性和疾病应用提供新的见解，例如bromodomain溴结构域抑制剂(+)-JQ-1和I-BET762，这些化合物被成功用于表征和验证溴结构域在各种疾病中的重要性，并催生了大量的临床候选药物。即使是FDA批准的已知药物靶点，临床上也常常需要进一步的SBDD，比如有些药物需要进行更好的选择性的优化设计。厄菲替尼(erdafitinib)在经过针对性的设计改造后，表现出了相对于原先药物对成纤维生长因子受体更高的选择。此外，有一些药物可能需要优化效力或疗效，或提供特定受体亚型的选择性，如改善鞘氨醇-1-磷酸(S1P)抑制剂西波尼莫德(siponimod)对S1P1而非对S1P3的选择性，是提高其在疗效和安全性上优于非选择性S1P抑制剂的关键。该药物靶向S1P1，而非S1P3，此外，许多抗病毒、抗菌和抗癌药物正面临着抗药性问题，SBDD方法能够基于产生耐药性的靶点结构，对药物进行持续改进。SBDD工作的瓶颈在于获取高分辨率的生物靶点结构信息。虽然一些小而有序的生物分子满足X射线晶体学的研究范畴，但大部分已知靶点中的蛋白质，例如跨膜受体或动态复合物，都难以结晶，导致这些靶点蛋白无法利用晶体手段进行高分辨率结构解析。此外，X射线晶体学往往会对靶点蛋白进行改造，如进行截短体设计、引入热稳定性突变或插入一段外源的结构域，从而影响后续的SBDD结构信息分析。还需要考虑的一个关键因素是，大量的靶点蛋白性质上达不到结晶的条件要求。不过，上述的这些难点正被冷冻电镜技术逐一攻克。冷冻电镜技术的分辨率已足够高，其产生的大量数据也可用于计算辅助药物设计(CADD)方法，这也是本综述的核心议题。与X射线晶体学不同的是，冷冻电镜无需对目标靶点进行结晶：纯化过的靶点生物大分子会被瞬间冻结在一层薄薄的非结晶玻璃体冰中，再经由透射电镜成像以记录下几十万到几百万个冷冻电镜颗粒数据，用于重构三维静电势图并对大分子进行精确建模。因此，这种技术很适合于蛋白质复合物、热稳定性较低和动态运动较高的蛋白质以及脂质胶束中的跨膜蛋白质的结构测定。随着分辨率的不断提高，冷冻电镜已经成为药物设计的强大工具。冷冻电镜与药物发现在2014年之前，冷冻电镜几乎无法解析出优于4.0Å分辨率的结构，这直接导致它无法对SBDD工作提供有效的数据支持。然而，在过去的几年里，冷冻电镜方法的爆炸性突破产出了大量高分辨率的结构数据，这在以前是无法实现的。这一质的飞跃要归功于许多技术革新，如用于记录图像的直接电子探测器、改进的计算方法和处理大型数据集的硬件集群，这些技术的飞跃在其他文献内有详细回顾。此外，作为一种直接可视化的技术，冷冻电镜能够快速判断样品的聚集性和稳定性等问题，从而通过遗传和生物化学手段，用互作因子稳定蛋白、或通过优化去垢剂从细胞膜环境中提取膜蛋白等方法来快速改善样品质量。综合以上，在PDB中的分辨率为4.0Å或更高的冷冻电镜结构的数量已经从2014年之前的合计16个增长到仅2020年一年提交1753个新结构的规模(图1, A)。在新上传的结构中，分辨率高于4.0和3.5 Å的比例分别从2015年的36%和12%增加到2020年的75%和50%。更振奋人心的是，截止2020年，分辨率高于3.0Å和2.5Å的冷冻电镜结构比例，分别达到了18%和3%，实现了冷冻电镜结构解析前所未来的突破(图1, B)。为了系统评估冷冻电镜对SBDD领域的影响，我们(作者)调查了2018年美国200种最常用处方药的靶点相关结构数据。72%的靶点在PDB数据库中含有结构信息。细分而言，这些结构信息是通过X射线晶体学技术(42%)、冷冻电镜技术(15%)或两者结合(15%)而确定的(图1, C)。通过冷冻电镜技术解析的靶点涵盖了许多跨膜蛋白，如离子通道(GABAA、CaV、NaV和KATP)、激活态的G蛋白偶联受体(GPCRs)和转运体蛋白(5-羟色胺转运体、NaCl转运体)。图1.冷冻电镜分辨率的提高及其对蛋白质药物结构表征的贡献。(A) PDB中上传的低于特定分辨率的冷冻电镜结构的绝对数量；(B) PDB中上传的低于特定分辨率的冷冻电镜结构的百分比的。(C)2018年200个热门处方药的靶点图，按靶点的结构特征分类；(D)44个热门GPCRs处方药的靶点图，按结构特征分类；(E)2018年200个销量最高的药物的靶点图(作为新药的代表)，按靶点的结构特征分类。2020年的数据是由Njardarson实验室公示的2018年200种最受欢迎的处方药和200种销量最高的药物的蛋白质靶点(如果适用)，然后在PDB中确定相关结构，进行人工筛选。在200多种最常见的处方药中，GPCRs占据了44种，这些药物包括靶向GPCRs的激动剂、拮抗剂和反向激动剂(图1, D；注意，拮抗剂和反激动剂在药理学上不同，但在这里我们(作者)把它们统一归为拮抗剂)。这些GPCRs中的32个(73%)已经进行了某种形式的结构解析，包括与拮抗剂(44%)或激动剂(7%)结合的晶体结构，与激动剂(9%)结合的冷冻电镜结构，或由X射线晶体学和冷冻电镜手段共同进行的结构解析(20%)。值得注意的是，GPCR的高度动态结构使其难以获得高质量的晶体，因此大多数的GPCR晶体结构都是与拮抗剂结合后才得以进行结构解析的。综上所述，冷冻电镜技术在针对市场上已经存在多年的处方药中中具有深刻影响。为了更加深入了解冷冻电镜技术在未来药物发现中的作用，我们(作者)还调查了2018年取得最高利润的200种药物，以代表那些市面上新进发现的药物(图1, E)，我们简称新药。这批新药和之前提到的那些最常用的药物之间存在明显的差异。相当一部分新药已经用晶体学进行了表征，反映了结构数据在当今药物研发工作中的重要性：即便不是由结构驱动的，也很少有不追求结构的情况，因为结构信息可以为先导化合物的优化和进一步发现提供关键数据。此外，考虑到漫长的药物开发时间，冷冻电镜这一最近几年才崛起的新技术在这份名单中的占比虽小，但贡献仍相当可观。这些药物和靶点包括生物制药、离子通道和GPCRs，以及其他不适合结晶的高活性大分子。冷冻电镜对SBDD的贡献解析新型结构虽然有许多FDA批准的药物靶点结构可被X射线晶体学解析，冷冻电镜正在为越来越多的难结晶、甚至不可结晶的靶点打开大门，如分子量更大、更动态的蛋白质和蛋白质复合物。冷冻电镜也显著降低了对细胞内复合体的研究难度，如病原体的核糖体、染色质修饰复合体和转录机器。例如冷冻电镜技术近期解析了一种与线粒体体RNA聚合酶复合体相关的first-in-class 抑制剂的结构。值得注意的是，在膜蛋白领域，冷冻电镜的贡献无可比拟。不管是传统的药物，还是新型处方药，很多药物靶向针对GPCRs、离子通道和转运体蛋白。然而，利用X射线晶体学手段来解析膜蛋白的结构非常困难。尽管脂质立方结晶在GPCR领域取得了一些进展，但在结晶过程中，GPCR蛋白通常需要进行热稳定突变，或融合其他蛋白进行改造，以促进晶体的形成。并且，为了获取某种改造后的稳定的构象，还需要对克隆构建、实验方法及条件进行大量繁琐复杂的筛选。相比之下，冷冻电镜结构可以直接用来解析经过去污剂或纳米盘处理后的在生化上性质稳定的膜蛋白，并获得处于或者接近生理状态的蛋白的结构。冷冻电镜的在解析庞杂的膜蛋白的结构中能力势不可挡，并且已有大量的高分辨率结构被成功解析。长久以来膜蛋白一直都是获批药物的热门靶点，它们的结构也只是近期才被冷冻电镜揭示(图2)。图2. G蛋白偶联受体、转运体(上排)和离子通道(下排)，每个受体有相应的FDA批准的配体分子(蓝框)。利用冷冻电镜解析膜蛋白结构的突出进展，部分原因受益于新试剂的设计和使用。这些试剂可以在体外纯化过程中维持跨膜蛋白的结构，在冷冻制样过程中保护蛋白，并为高分辨率的结构解析提供均质样品。去垢剂如正十二烷基β-D-麦芽糖苷(DDM)和月桂基麦芽糖新戊二醇(LMNG)，可以有效地从细胞膜上溶解跨膜蛋白，并维持蛋白质的生理状态构象。去垢剂的使用也会产生一些问题，如去垢剂形成的空胶束和与包裹蛋白质的去垢剂同时存在存在会引起样品的不均一，对后期的数据处理处理产生影响；也可能会导致冷冻样品制备时的气液界面收到破坏，产生一些不好的结果。脂质纳米盘是去垢剂的一种替代品，原则上可以为结构和生物物理研究提供接近胜利状态的脂质双分子层。脂质纳米盘在膜蛋白药物靶点上的应用已经非常关键和广泛。举例而言，将纳米盘与冷冻电镜技术相结合，成功阐明了TRPV1和TRPV5离子通道(在TRPV1的情况下，脂质对抑制剂的结合至关重要)、GABAA配体门控离子通道、人类P-糖蛋白以及GPCR-β-arrestin复合物的高分辨率结构和机制。关于纳米盘的进一步介绍可查阅。冷冻电镜还可以用来解析嵌入脂质体中的蛋白质的结构，允许在更接近生理状态的的电化学梯度中对离子通道以及孔蛋白进行可视化研究。在过去的几年中，冷冻电镜也在生物制药领域产生了巨大影响。在较新的药物中，生物制药的占比正越来越高。如果仅将目光聚焦于药物靶点识别这一领域，生物制药的结晶技术确实称得上有所改善。然而，冷冻电镜已经为一些关键的生药物研发提供了基于全长蛋白的结构信细节息胰岛素受体一种二聚化的酪氨酸激酶受体蛋白，在调节人体的葡萄糖平衡方面起着关键作用。胰岛素受体信号通路的失调会引起一些疾病，如II型糖尿病，全球约有9.3%(4.63亿人)受到影响两个独立的研究小组利用冷冻电镜在胰岛素受体结构解析方面取得了突破进展；第一个小组以4.3Å和7.2Å的分辨率分别解析了与一个或两个胰岛素分子结合的胰岛素受体胞外结构域结构，第二个小组以3.1Å的分辨率获得了与四个胰岛素分子结合的胰岛素受体胞外结构域结构(图3, A)。这些结构解释了胰岛素受体结合胰岛素的不同结合位点，以及激活这一关键药物靶点所进行的构象变化。类似的例子比比皆是：从HER2-trastuzamab-pertuzumab复合物到SARS-CoV-2和中和抗体的结构解析，冷冻电镜为生物治疗的新老靶点提供了新的视点，为进一步发现和开发仿制药和first-in-class药物铺平了道路。另一个值得注意的例子是B淋巴细胞抗原CD20，它是治疗白血病和自身免疫性疾病的一个重要的治疗靶点，尽管其功能作用仍不清楚。尽管CD20的分子量较小，只要35kDa左右，但分别与单克隆抗体利妥昔单抗(rituximab)、奥法图单抗(ofatumumab)和奥比努单抗(obinutuzumab)的Fab结合形成复合物后，都解析获得分辨率较高的CD20复合物结构(图3, B)。负染结果显示，利妥昔单抗与CD20结合后，可诱导形成高度有序的高级结构，这一发现对激活先天免疫的补体系统提供了全新见解。由于复合物中的高度动态和跨膜结构域的存在，利用结晶手段结构解析几乎不可能实现，冷冻电镜技术的应用实现了这一可能。图3.冷冻电镜(cryo-EM)在小分子和生物制药发现方面的效用。(A)与胰岛素结合的胰岛素受体(PDB ID 6PXV)和(B)CD20与利妥昔单抗复合物(PDB ID 6VJA)冷冻电镜密度图。(C)使用GemSpot(PDB ID 6CVM)将小分子PETG精确地建模到β-半乳糖苷酶的冷冻电镜图像中。(D)基于片段的PKM2的发现，冷冻电镜密度允许正确识别和放置发现片段(PDB ID：6TTF)尽管冷冻电镜在膜蛋白结构测定领域已经迈出了一大步，但短板仍然存在。其中一个短板是解析小于50-70kDa的没有明显的胞内或胞外结构域的单体膜蛋白，由于几乎没有胞外结构域特征，因此难以对去垢剂胶束或脂质纳米盘进行降噪处理，以这种方式收集到的数据难以产出高分辨率结构，比如解析没有上下游偶联蛋白的处于非活性状态的的GPCR结构。然而，大量的蛋白质属于这一类型，解析这一类型的的膜蛋白因此也成为了一个重要的研究领域。目前，有一些解决方案正处于研究阶段，且已经取得了一定程度的成功，如前文所述的CD20。随着利用增加融合蛋白、抗体片段、纳米抗体、纳米抗体衍生物或其他支架蛋白以增加靶点蛋白的分子量等方法的应用，预计冷冻电镜在膜蛋白结构测定方面会有更多进展。计算赋能冷冻电镜冷冻电镜单颗粒技术利用数百万个颗粒的可视化投影来重建静电势图，这通常涉及数十万亿字节的原始数据。因此，该方法从计算方法的快速发展中获益匪浅，这些计算方法同时满足了对更高的分辨率的需求并加深了对粒子动力学的理解。然而，与X射线晶体学相比，冷冻电镜在获取配体-靶点复合物的高可信度模型时仍然面临着一些难题。其中一个难题是冷冻电镜难以解析得到高于2.5Å的蛋白结构，而这通常是建模人员能够精确放置配体并解析出结合位点处水分子的最低分辨率。此外，冷冻电镜的结构建模流程与晶体学完全不同：在晶体学中，模型和密度图之间有一套严格而完善的统计测量方法，该方法能够提供和模型精度相关的关键信息。而在冷冻电镜方法中，基于密度图的建模是一个完全独立的过程，仅适用收集的电镜投影来进行密度图重构，然后基于密度图进行结构建模和实空间下的微调。该过程的独立性使得模型的精度被降低了。这一问题在最近已得到改善。此外，两种方法之间还存在一些物理上的差异，如晶体学依赖电子密度图，而冷冻电镜依赖静电势图。这些差异加在一起，使得晶体学的模型验证工具无法应用于冷冻电镜模型。因此，我们可能需要为精确性开发一些新的指标。一种解决方案是使用强大的计算技术和精确的分子力场对大分子及其配体在冷冻电镜结构中的相互作用进行模拟。比如PHENIX软件包结合实空间和傅里叶空间微调和OPLS3e力场的分子动力学模型，从而生成生物分子和小分子的几何统计精修模型。OPLS3e微调工具已经被整合进到我们(作者)的自研软件GemSpot，它将各种计算方法整合为一个工作流程，从而提高冷冻电镜密度图中配体位置的准确性(图3C)。新的计算工具也推动冷冻电镜在基于片段的药物发现(Fragment-based drug discovery)中发挥作用，其中高溶解度的小片段化合物被浸泡在由多个不同结构的化合物组成的生物分子靶点中。解析复合体的结构可以解释配体与结合口袋之间关键位点的相互作用，然后可以将其组合成一个先导化合物。然而，这种方法要求配体密度质量高、分辨率高，才能正确区分配体的姿态和原子类型，目前对于冷冻电镜来说还是一个难题。最近，Saur等人在高度棘手的β-半乳糖苷酶和颇具治疗意义和挑战性的激酶PKM2的场景中成功地将冷冻电镜用于FBDD。尽管他们为了将配体置放于密度图中，而不得不将干法和湿法实验结合，但他们成功地建立了一个与β-半乳糖苷酶结合的大约150kDa的精准片段模型。更令人印象深刻的是，他们能够从四种化合物的鸡尾酒中确定哪些片段与PKM2结合(图3, D)。因此，不断发展的计算方法为冷冻电镜密度图的构建提供了一个强大的平台，可以在高分辨率下对大分子复合物进行建模。冷冻电镜的快速发展可及性与通量的提升冷冻电镜是极为精密且昂贵的仪器，需要大量的费用和人力成本来搭建、维护与操作。这一特性在很大程度上限制了冷冻电镜的发展，并将冷冻电镜的机时资源集中在了那些受政府资金扶持的大型机构上。因此，在科研界中，冷冻电镜资源的获取门槛极高。然而，这一门槛正在被逐渐降低：许多国家级设施都启动了冷冻电镜人才培养计划，以降低冷冻电镜运维的人力成本。一些大型制药公司也开始进行内部投资，设立最先进的冷冻电镜设施。此外，冷冻电镜设施的可复制性远超晶体学极其昂贵的同步加速器和线性加速器，使得该技术更有发展前景。随着100kV电子束技术的发展，未来可能会出现性价比极高的冷冻电镜，增加其在药物发现领域中的应用场景。鉴于2018年FDA批准的药物中有49%来源于中小型公司，降低冷冻电镜的成本将使冷冻电镜技术得到更广泛的应用。最近对SARS-CoV-2相关蛋白的结构表征证明了冷冻电镜的无限潜力。在病毒爆发后的几个月内，科学家们利用冷冻电镜，以极快的速度解析了新冠病毒刺突蛋白的几种构象，以及它与人源血管紧张素转换酶或许多中和人源抗体片段的复合物的结构。最近获得FDA批准的用于治疗COVID-19的再利用药物瑞德西韦(Remdesivir)与SARS-CoV-2 RNA聚合酶结合的结构也已被冷冻电镜解析。鉴于X射线晶体学一直是病毒RNA聚合酶结构测定的传统方法，对新冠病毒的冷冻电镜结构解析是一个颠覆性的创新，凸显了冷冻电镜的高时效性特点在快速反应研究中的应用。此外，冷冻电镜的分辨率仍在大幅提高，最近的一份报告指出，作为冷冻电镜的代表性复合物结构，去铁蛋白apoferritin的分辨率达到了1.25Å，该分辨率足以对单个原子进行精准定位，在某些情况下甚至可以解析氢原子和质子化态。毋庸置疑，在样品制备良好的情况下，冷冻电镜的不断改进将持续打破结构解析的分辨率记录。冷冻电镜在药物发现和开发方面的应用将进一步受益于该技术的全面自动化。在载网准备方面，一些自动化工具正在出现，以解决不可重复性和样品浪费的难题。这些技术的改进不仅会提高自动化的程度和可及性，还可能解决冷冻电镜载网制备中的其他难题，如减少颗粒在空气及水中的暴露程度。此外，机器学习方法和深度神经网络也是提高颗粒筛选速度和准确性的关键。这些自动化方法甚至有望在未来成为冷冻电镜的核心技术，从而推动冷冻电镜在药物发现领域的发展。主流硬件和软件的改进也有望提高冷冻电镜在SBDD领域的可及性。例如，更高效的检测设备能显著提高冷冻电镜的产能。在一个标准的数据收集过程中，老式的检测器相机可以每次收集1个影像，每小时产生50个影像，而较新的检测器可以每次收集9-16个影像，每小时可以产生超过200个影像，进而转化为每24小时收集的数百万颗粒投影数据。此外，虽然今天许多最高分辨率的结构是用300kV冷冻电镜获得的，但这些机器非常庞大，且前期和维护成本昂贵。在许多情况下，对于单颗粒分析中使用的薄样品，200kV的显微镜可能就足够了，甚至100kV的显微镜也可以用来获得分辨率高达3.4 Å的结构。分子动力学的新窗口结合硬件和数据处理方面的改进，冷冻电镜的潜力将进一步被释放。当X射线晶体学受限于结晶条件而无法解析时，冷冻电镜的低样品需求大幅降低了数据收集的门槛，使我们得以看到样品的构象连续体或一系列不同的能量最低状态，为大分子动力学提供了新的窗口。图4.单一的冷冻电镜数据集，投影的三维分类显示了两种不同的构象，代表了两种不同的G蛋白偶联受体-G蛋白相互作用的状态，代表了两种热力学上可比较的构象。在典型状态下(左边，PDB ID 6OS9)，受体以典型的方式与G蛋白结合，其中核苷酸结合口袋为GTP结合做准备。在非经典状态下(右图，PDB ID 6OSA)，G蛋白异源三聚体与经典状态相比旋转了45°，代表了沿G蛋白偶联途径的中间配体结合受体状态。缩写：α-N=G蛋白的N端α螺旋；cryo-EM=冷冻电镜；TM=跨膜螺旋。一些计算工具，例如二维和三维分类以及子区域的重点细化，能够利用数据集内颗粒的异质性来模拟大分子活性成分的运动。在我们(作者)小组最近的一个例子中，对神经紧张素1受体的冷冻电镜单颗粒分析结果揭示了先前识别的G蛋白、激动剂结合状态和G蛋白偶联通路上的一个新的中间状态(图4)。最近，我们(作者)还将AI深度学习网络应用于冷冻电镜数据集，揭示了26S蛋白酶体的构象动态，使解析出的结构细节达到了前所未有的原子级水平。随着分辨率和分类工具的不断改进，我们将获得更精细的构象变化。有了以上这些技术，再加上分子动力学模拟和机器学习方法等计算技术，我们将得以对配体结合的复杂过程进行更精确的建模，从而揭示全新的、可成药的中间状态。结语尽管冷冻电镜已经在SBDD领域取得了飞跃性的进展，但它的潜力远不止于此。在三维分析重构及深度学习算法等领域，若能将计算工具与更大、更高质量的数据集结合并进行训练，我们将能够描述蛋白质甚至其配体的更小幅度、更高分辨率的动态运动。我们还期望冷冻电镜在时间维度上的结构解析方法将使人们对大分子复合物的结合和解离过程有更深了解，为靶向药物的研发提供更多思路和机会。目前晶体学和大多数冷冻电镜结构所提供的只是能量最小值的瞬间结构，但对于开发新的药物作用模式而言，对机制和中间状态的理解至关重要，所以我们若能获取构象的动态信息，则对理性药物设计具有突破性意义。在综合了冷冻电镜的软硬件及方法的快速发展之后，我们可以得出结论：冷冻电镜有望为药物发现和人类健康做出巨大贡献。词表：1. 激动剂一种通过增加受体活性以产生生物反应的物质。2. 拮抗剂(也称中性拮抗剂)一种能阻断激动剂或反向激动剂的物质，在不存在激动剂或反向激动剂的情况下便没有活性3. 生物制药在生物活体中制造的药物，可能含有重组蛋白、糖类、基因疗法或核酸。4. 电子密度图电子密度与晶体中每一个晶胞位置的关系图，以二维或三维表示，由解析X射线衍射图案得出。5. 静电势图(即库仑势图)即样品中电荷分布的二维或三维表示。在电子显微镜中，静电势图由电子被与样品相互作用时产生的库仑力散射而产生。6. 基于片段的药物发现FBDD一种药物筛选方法，以评估小分子量的化学片段与期望靶点相结合的能力的方式，确认后续的药物化学实验方向。7. 反向激动剂一种通过减少受体的基础活性以产生生物反应的物质。8. 脂质立方相结晶基于脂立方相的蛋白结晶技术，采用脂立方相模拟生物膜环境，膜蛋白可以在脂质双分子层中相互接触，在合适的条件下形成晶体。9. 脂质纳米盘一个纽扣电池形状的盘状脂质双层，由两个环绕的两亲性螺旋蛋白(膜支架蛋白)稳定并使其可溶于水。10. 冷冻电镜负染一种将重金属盐染色剂嵌入并固定在生物标本上，并在室温下进行电子显微镜成像的技术方法。尽管只能在低分辨率(~2纳米)下观察标本的形状，但这种技术对于简单和快速评估样品质量是很有价值的。11. 时间分辨的冷冻电镜方法在动态构象转变的特定时间间隔内对生物样本进行速冻，并使用冷冻电镜技术进行可视化的方法。

内源差示扫描荧光技术如何应用到多功能蛋白质稳定性分析北京佰司特贸易有限责任公司蛋白质是生物体中广泛存在的一类生物大分子，具有特定立体结构的和生物活性以及诸多功能，根据这些功能我们可以将其应用于蛋白质的分子设计、蛋白质功能的改造、疾病的基因治疗以及新型耐抗药性药物的开发与设计甚至是发现生物进化的规律等先进科研领域上。因此，蛋白质具有非常重要的研究价值。进行蛋白质性质和功能研究的前提是获得稳定的蛋白质样品，而由于蛋白质自身性质的复杂性，难以保证获得的蛋白质样品是否具有正确的三维结构以及功能，因此急需一种技术手段或设备，对蛋白质的稳定性进行分析，确定获得蛋白质最ZUI适宜的缓冲液条件、蛋白质的长期储存稳定性等。另外在进行蛋白质-配体小分子相互作用研究时，因为需要筛选的小分子配体数量巨大，因此也急需一种技术手段或设备，可以高通量的对配体结合进行筛选。蛋白中的色氨酸和酪氨酸可以被280 nm的紫外光激发并释放出荧光，其荧光性质与所处的微环境密切相关。蛋白变性过程中，色氨酸从疏水的蛋白内部逐渐暴露到溶剂中，荧光释放的峰值也从330 nm逐渐转移到350 nm。内源差示扫描荧光技术（intrinsic fluorescence DSF），通过检测温度变化/变性剂浓度变化过程中蛋白内源紫外荧光（350 nm/330 nm比值）的改变，获得蛋白的热稳定性(Tm值)、化学稳定性（Cm值）等参数。相比传统的方法，无需添加染料，通量高，样品用量少，数据精度高。 多功能蛋白质稳定性分析仪PSA-16是一款无需加入荧光染料、高通量、低样品消耗量检测蛋白质稳定性的设备。该设备基于内源差示扫描荧光技术（intrinsic fluorescence DSF），通过检测温度变化/变形剂浓度变化过程中蛋白内源紫外荧光的改变，获得蛋白质的热稳定性(Tm值)、化学稳定性（Cm值）等参数。可应用于蛋白缓冲液条件筛选及优化、小分子与蛋白结合情况的定性测定、蛋白质修饰及改造后的稳定性测定、蛋白变/复性研究、不同批次间蛋白稳定性对比等多个方面。基于内源差示扫描荧光技术（intrinsic fluorescence DSF），在无需添加外源染料的条件下，对蛋白进行升温变性，通过内源荧光和散射光的变化与三级结构变化的关系，PSA-16可用于测定不同buffer中蛋白的Tm值变化，获得蛋白质正确折叠的最ZUI优buffer条件；测定不同detergent条件下膜蛋白Tm值，进行detergent筛选；测定不同添加剂对蛋白稳定性的影响；测定添加配体后Tm值变化进行配体结合筛选；测定蛋白中变性部分的比例，进行质量控制；测定蛋白Tm值与浓度的相关性，获得最ZUI优蛋白浓度进行后续结晶等实验；测定蛋白去折叠过程，进行蛋白复性条件筛选；测定蛋白folding enthalpy，研究蛋白的长期稳定性；测定不同批次和存储后的蛋白的稳定性，并进行相似性评分，对蛋白进行质量控制。多功能蛋白质稳定性分析仪PSA-16，无需对蛋白进行荧光标记，可以直接测定蛋白在不同缓冲液条件中的Tm值，进行缓冲液筛选和优化；同时还可以测定添加不同配体化合物对蛋白稳定性的影响，通过Tm值变化进行配体结合筛选。PSA-16满足我们目前对于蛋白质稳定性分析的迫切需求。多功能蛋白质稳定性分析仪PSA-16可用于评估蛋白（抗体或疫苗）热稳定性、化学稳定性、颗粒稳定性等特性，实现非标记条件下的高通量的抗体制剂筛选、分子结构相似性鉴定、物理稳定性、长期稳定性、质量控制、折叠和再折叠动力学研究等功能。★ 蛋白热稳定性分析★ 蛋白化学稳定性分析★ 蛋白等温稳定性分析★ 蛋白颗粒稳定性分析★ 免标记热迁移实验（dye-free TSA）★ 蛋白去折叠、再折叠、结构相似性分析★ 蛋白质量控制分析 多功能蛋白质稳定性分析仪PSA-16基于内源差示扫描荧光（ifDSF）技术，广泛应用于蛋白质稳定性研究、蛋白质类大分子药物（抗体）优化工程、蛋白质类疾病靶点的药物小分子筛选和结合力测定等领域，具有快速、准确、高通量等诸多优点。蛋白质中色氨酸/酪氨酸的荧光性质与它们所处的环境息息相关，因此可以通过检测蛋白内部色氨酸/酪氨酸在加热或者添加变性剂过程中的荧光变化，测定蛋白质的化学和热稳定性。PSA-16采用紫外双波长检测技术，可精准测定蛋白质去折叠过程中色氨酸和酪氨酸荧光的变化，获得蛋白的Tm值和Cm值等数据；测定时无需额外添加染料，不受缓冲液条件的限制且测试的蛋白质样品浓度范围非常广（10 µ g/ml - 250 mg/ml），因此可广泛用于去垢剂环境中的膜蛋白和高浓度抗体制剂的稳定性研究。此外，PSA-16具有非常高的数据采集速度，从而可提供超高分辨率的数据。同时PSA-16一次最多可同时测定16个样品，通量高；每个样品仅需要15 uL，样品用量少，非常适合进行高通量筛选。PSA-16操作简单，使用后无需清洗，几乎无维护成本。★ 非标记测试★ 10分钟内完成16个样品的分析★ 仅需10μL样品，浓度范围0.005mg/ml—200mg/ml★ 15-110℃温控范围，升温速率0.1-7℃/min★ 适用于任意种类的蛋白分子★ 无需清洗和维护★ 可增配机械手臂实现全自动工作 性能参数：★ 直接检测蛋白质内源紫外荧光，测定时无需额外添加染料，不限制蛋白缓冲液。★ 可同时测定16个样品。★ 样品管材质：高纯度石英管，8联排设计，可使用多通道移液器批量上样，亦可单管使用。★ 样品体积：15 μL/样品。★ 样品浓度范围：0.01 mg/mL–250 mg/mL。★ 温控范围：15-110℃可选。★ 升温速度范围：0.1-15℃/分钟可调。★ 温控精度：+ 0.2℃。★ 采样频率：1 HZ，1/60 HZ可选。★ 应用范围：热稳定性实验、化学稳定性实验、等温稳定性实验、温度循环实验、TSA实验。★ 软件具备比对功能，可通过热变性曲线对蛋白进行相似性评分。★ 测定参数：Tm、Ton、Cm、ΔG、Similarity。★ Tm测定精度：0.5% CV。★ 仪器使用时无需预热及预平衡，实验完成后无需清理，无后续维护费用。★ 一体机，可以通过触摸屏进行试验设置，实时采集数据和显示数据，生成详细的结果报告。应用领域：多功能蛋白质稳定性分析仪PSA-16应用涵盖植物、生物学、动物科学、动物医学、微生物学、工业发酵、环境科学、农业基础、蛋白质工程等多学科领域。蛋白质是最终决定功能的生物分子，其参与和影响着整个生命活动过程。现代分子生物学、环境科学、动医动科、农业基础等多种学科研究的很多方向都涉及蛋白质功能研究，以及其下游的各种生物物理、生物化学方法分析，提供稳定的蛋白质样品是所有蛋白质研究的先决条件。因此多功能蛋白质稳定性分析系统在各学科的研究中都有基础性意义。 1. 抗体或疫苗制剂、酶制剂的高通量筛选2. 抗体或疫苗、酶制剂的化学稳定性、长期稳定性评估、等温稳定性研究等3. 生物仿制药相似性研究（Biosimilar Evaluation）4. 抗体偶联药物（ADC）研究5. 多结构域去折叠特性研究6. 物理和化学条件强制降解研究7. 蛋白质变复性研究（复性能力、复性动力学等）8. 膜蛋白去垢剂筛选，膜蛋白结合配体筛选（Thermal Shift Assay）9. 基于靶标的高通量小分子药物筛选（Thermal Shift Assay）10. 蛋白纯化条件快速优化等

01前言Thermal shift assay（TSA），也被称为差示扫描荧光法（DSF）是表征蛋白热稳定性的常用方法之一，广泛应用于蛋白配体互作表征，突变体、缓冲液、去垢剂筛选等领域。但DSF的实验操作较繁琐，需要根据蛋白的特性及去垢剂兼容性选择合适的染料，优化蛋白和染料的比例，在配制样品时还要考虑染料自带的有机溶剂对蛋白的影响。替代性技术：nanoDSF技术时下被行业深度认可的无标记的TSA验证方法-也称nanoDSF技术，可解决DSF技术的局限性，样品无需加染料就可以直接上机检测了。下面我们一起通过用户的文献案例来进一步了解。02NanoTemper用户应用案例解读检测样品：Cas9，gRNA使用仪器：PR系列蛋白稳定性分析仪涉及技术：nanoDSF技术https://doi.org/10.1016/j.isci.2023.106399CRISPER - Cas9介导的基因编辑能够帮助人们在动物和细胞模型中实现广泛的靶向敲除(KO)或敲入(KI)，例如单点或多点KO、点突变、报告基因KO或KI等。然而，CRISPR-Cas9的切割效果和准确性仍是基因编辑面临的主要挑战，它们特别受到核糖核蛋白复合物 (RNP)的组装配比的影响。2023年3月，法国南特大学的研究人员近期发表了研究成果：Excess of guide RNA reduces knockin efficiency and drastically increases on-target large deletions，作者借助PR系列蛋白稳定性分析仪搭载的nanoDSF技术，一种无需标记和固定化的方法，证明了Cas9和gRNA的等摩尔比是形成RNP复合物的最佳条件。研究结果作者通过CRISPR/Cas9 KI将双等位纯合子GFP hiPSCs转化为BFP表达细胞，通过细胞表型分析证明在Cas9的最佳浓度为0.4 mM时，增加ssODN浓度有助于降低KO率，提高KI率，而增加dgRNA对KO和KI没有影响。0.4 mM的Cas9、等摩尔Cas9/gRNA比例和2 mM的ssODN是在hiPSC中实现高效GFP到BFP转换的最佳选择。 在此之前，有一些研究曾表明过量的gRNA对于靶向切割有帮助，而本文作者的实验结果则与之产生了矛盾。于是作者使用NanoTemper公司的nanoDSF技术建立了一套体外实验方法学，用来评估RNP复合物的形成效率，从而佐证他们的结论。通过nanoDSF这种无标记技术，可在升温过程中检测蛋白中的色氨酸和酪氨酸的自发荧光。随着升温，仪器同步采集在350 nm和330 nm处的最大发射光位移，并自动拟合出蛋白的热展开曲线。NanoDSF能够检测蛋白的构象变化导致的热稳定性差异，并由熔解温度(Tm)来表征蛋白的热稳定性。由于Cas9是一种含有色氨酸和酪氨酸残基的变构酶， 因此利用nanoDSF技术可以简单、直观地检测导致Cas9重排的RNP复合物的形成。 为了确定hiPSC中使用的dgRNA靶向GFP位点(dgRNA GFP)形成RNP复合物的有效性，作者使用恒定浓度的Cas9 (0.75 mM)与一定浓度范围内的dgRNA, 通过nanoDSF检测，作出升温诱导的蛋白变性曲线检测 (图1A)。根据一阶导数，可以确定Cas9单独的Tm(TmCas9 = 43.2C)，以及Cas9/dgRNA摩尔比为1/1至1/5 的Tm：1/1 时TmRNP = 49.6 C、1/2 时TmRNP = 50.0 C、1/3时 TmRNP = 49.9C、1/5 时TmRNP = 49.8 C (图1B)。相比只有Cas9时， Cas9/dgRNA摩尔比为1/1至1/5 时的Tm都有明显增加，但Cas9/dgRNA不同摩尔比之间的Tm并没有显著差异（图1C）。这反映了RNP复合物的形成情况。另外，当Cas9/dgRNA为等摩尔比时，是检测不到游离Cas9的。因此，可以认为Cas9/dgRNA等摩尔比是形成RNP复合物的最优条件。图1作者在大鼠胚胎上使用点突变模型来验证等摩尔Cas9/dgRNA是否能得到最佳的KI率，以及过量的dgRNA是否会影响KI效率。 他们先使用nanoDSF检测大鼠胚胎中Cas9过量、等摩尔Cas9/dgRNA或dgRNA过量这几种情况下，RNP复合物的形成情况(图2A)。在所有条件下，添加dgRNA靶向的环氧化物水解酶2基因(dgRNA rEphx2)，与单独Cas9相比，Tm都显著增加，表明RNP复合物的形成 (图2B)。 在Cas9/dgRNA摩尔比为 5/1和2/1时，可以看到变性曲线中包含了两个热变性峰，分别可表示为TmCas9和TmRNP。与单独Cas9相比(TmCas9 = 43.2℃)， TmCas9对这两种RNP的比例差异不显著(TmCas9 RNP 5/1 = 43.0℃ TmCas9 RNP 2/1 = 43.3℃, p分别= 0.4809和0.9353)，而TmRNP为(TmRNP RNP 5/1 = 48.0℃ TmRNP RNP 2/1 = 48.9℃, p 都= 0.029)。这些结果表明，在两个条件下，RNP复合物已经形成，而游离Cas9仍然存在。当等摩尔比(RNP 1/1)或dgRNA rEphx2过量(RNP 1/2, 1/3和1/5)时，只观察到一个热变性峰(TmRNP RNP 1/1 = 49.7℃ TmRNP RNP 1/2 = 49.9℃ TmRNP RNP 1/3 = 49.8℃ TmRNP RNP 1/5 = 49.7℃)，这些Tm之间差异不显著。此外，与dgRNA rEphx2相比，RNP 1/1比例的TmRNP与RNP 2/1比例的TmRNP显著不同(TmRNP RNP 2/1 = 48.9℃ TmRNP RNP 1/1 = 49.7℃, p = 0.0206)，与单独Cas9也显著不同 (TmCas9 Cas9 = 43.2℃ TmRNP RNP 1/1 = 49.7C, p0.0001)。这说明大多数Cas9形成了RNP复合体，RNP 1/1和dgRNA过量。由此同样佐证了作者的结论，等摩尔比Cas9/gRNA这个条件限制了游离Cas9，可能也限制了游离dgRNA，最终有效形成RNP复合物。图203关于PR系列蛋白稳定性分析仪德国NanoTemper公司自2014年推出PR系列蛋白稳定性分析仪，以nanoDSF技术为核心，通过检测蛋白内源荧光，无需标记即可检测蛋白Tm值，快速精确评估蛋白在不同条件下的热稳定性变化。2020年NanoTemper推出新一代PR Panta仪器，并于2022年整合四大技术模块nanoDSF/Backreflection/DLS/SLS，可实时同步评估蛋白热稳定性，胶体稳定性，聚集体与粒径等信息，为科研人员在蛋白质量控制、复合物分析、化合物筛选、制剂优化等方面提供强大助力。今年年初，公司凭借自身不断创新的科学技术，推出新品型号：PR Panta + 机械臂自动上样器，这款新品拥有独立且包罗万象的系统，包含机械臂、外框架、计算机和监视器。可装载多达4个384微孔板，用于检测所有蛋白质候选分子热变性、胶体稳定性和化学变性的全自动操作。可针对高通量或配方筛选实验场景，无需手动即可完成多达1536个样品的检测。PR系列产品

2020年度慕尼黑生化分析展（简称：Analytica China）即将于11月16-18日在上海新国际博览中心举办。作为《财富》杂志美国500强企业Avantor旗下品牌VWR，是一家致力为制药、生物技术、工业和教育行业的实验室以及生产型客户提供广泛产品服务和解决方案的供应商。时隔两年，VWR China再次亮相本次展会。一起先来了解下吧~时间11月16日（周一）09:00-17:0011月17日（周二）09:00-17:0011月18日（周三）09:00-16:00地址上海新国际博览中心（上海市浦东新区龙阳路2345号）展位号：E4 4602 展会亮点生命科学高品质解决方案VWR Life Science作为高纯生化试剂的生产商和供应商，为生命科学领域发展提供高纯度、高品质、高性能、高效率的解决方案。- 缓冲液- 氨基酸- 螯合剂- 去垢剂- 盐类- 染料- 酶类- 保护剂- 还原剂- 糖类色谱柱产品解决方案（Avantor ACE 及AvantorHichrom U/HPLC 色谱柱）Avantor生产领先的U/HPLC系列色谱柱以及经典款色谱柱。符合ISO 9001/ISO 14001英国认证生产标准。细胞培养解决方案生长和传代- 血清和培养基- 细胞培养容器- 表面包被试剂和内皮细胞培养基- 抗生素和培养基添加剂- 二氧化碳培养箱- 滚瓶系统转染- 转染试剂- 高通量培养容器- RNAi- 电转化仪收获- 消化液- 细胞刮刀- 过滤器分析- 显微镜- 分析试剂- 细胞网筛- 细胞计数器- 细胞计数板- 流式细胞仪存储- 低温冻存- 液氮罐- 冻存液 通用实验室解决方案样品保存- 冰箱- 超低温冰箱样品采集- 微生物采样器- 空气采样器- 浮游菌采样仪样品称量- 天平- 移液器样品前处理- 磁力搅拌器- 振荡器- 离心机- 水浴- 冻干机- 真空离心浓缩仪样品培养- 恒温恒湿箱- 摇床观察检测- 显微镜- 紫外分光光度计- 电化学测试仪 Avantor Services多方位服务实验室&生产支持- 科学服务- 实验室&生产支持- 库存管理- 化学品管理- 精益六西格玛流程改进采购外包服务- 采购和供应商资源开发- 开放式采购需求系统- 供应商管理- 监管支持- 支出管理- 数据分析仪器设备管理服务- 设备安装- 故障维修- 预防性维护- 延长保修- 验证服务- 资产管理- 设备搬迁临床服务- 临床设备和辅助用品管理（由MESM提供）- 生物样本存储库服务（由EPL Archives提供）- 定制用品（由Therapak提供）

FastPrep-24™ 5G仪器能够处理各种类型的样本，包括所有类型的人类、动物和植物组织；细菌、酵母和真菌细胞，以及环境和宏基因组样本。当然，样本有不同，裂解介质就要各异。为此，我们准备了16种裂解介质，让你可根据实验需要来灵活选择。如何选择？你应考虑大小、形状以及硬度和密度等因素。大小 研磨颗粒越小，得到的样本颗粒越小。研磨后得到的样本颗粒直径小于研磨颗粒。因此，在选择裂解介质时，应考虑你希望得到的样本颗粒的大小。例如，如果您想得到完整有功能的细胞器，就需要选择一个大一点的裂解介质。相反，如果是较小的结构，如病毒粒子和芽孢，可选择较小的裂解介质。形状 形状也大有讲究，它决定了裂解后样本组分的形态。球体等钝的裂解介质，主要依靠碰撞力来裂解样本；而锋利的裂解介质主要依靠剪切力来裂解样本。剪切力呢，就像一把双刃剑，更有利于破碎难裂解的样本，但也可能会破坏RNA和一些易降解的蛋白质。因此，对于DNA、稳定的蛋白质、多糖结构及小分子物质，剪切力还是很实用的。硬度和密度 裂解介质的成分决定了两个非常重要的参数：硬度和密度。裂解介质的的硬度必须比样本的硬度高，这一点，MP Bio的裂解介质都能达到要求，因此密度是一个重要参数。密度越大，对于孢子等难处理样本的研磨效果越好。此外，裂解介质颗粒的密度需要比研磨的溶液更大，否则裂解介质漂浮在表面不能发挥裂解或者匀浆作用。 说了这么多，你也许有了大概的印象，但不清楚具体选择哪一种。没关系，请看下图，根据样本类型和应用需求进行选择。你可以单独购买裂解介质管，并使用你自己常用的缓冲体系，也可以购买整套的纯化试剂盒，以获得理想效果。裂解管有多种规格供选择：2 mL、4.5 mL、15 mL和50 mL管和96孔板。 配合不同样品数量、大小和温度的需求，FastPrep-24™ 5G有11种适配器可供选择。除了适合室温下样品处理的5种适配器，还有3款适配器适合冷冻条件下的样品处理，这对于酶活等分析可是福音。冷冻的样品裂解管装在适配器上后，可直接在FastPrep-24™ 5G上运作，无需额外的处理。 此外，我们还推出了新型的全金属适配器，适合高度传染性的样本。由于全金属适配器可耐受450oC的高温，因此可通过高温和高压灭菌。在这种情况下包括细菌、病毒、真菌、寄生虫、类病毒、朊病毒都可以被消除。所有的全金属适配器都可以耐受去垢剂和其他溶剂，容易保养和维修。 配合FastPrep-24™ 5G的使用，我们也提供各种纯化试剂盒，用于DNA、RNA和蛋白质的提取。根据样本种类和提取物质的不同，试剂盒包含适当的裂解介质管、独特的缓冲液和纯化体系，可快速、重复地裂解和纯化样本。 如果你手头刚好有难以处理的样本，那不妨试试FastPrep-24™ 5G。现在可申请免费试用哦，抓紧机会。

01研究背景Eurofins Discovery是全球领先的早期药物研发服务平台，拥有超过40年的药物发现研究经验。作为业内领导者，Eurofins Discovery为研究者提供包括但不限于药物化学、合成化学、体外药理学、安全性药理学与功效、ADME-Tox（药物吸收、分布、代谢、排泄和毒性研究）以及定制蛋白质和检测服务。Eurofins Discovery支持多种药物发现，如GPCRs（G蛋白偶联受体）、激酶、离子通道、核激素受体以及其他蛋白质和酶。在药物研发领域，GPCR家族因其在细胞信号传导中的重要作用而备受关注。近日，Eurofins Discovery团队利用前沿的生物物理技术--光谱位移（Spectral Shift, SpS），在属于GPCR家族的人类腺苷A2A受体（A2AR）上发现了新拮抗剂片段，为GPCR药物设计提供了新视角。与此同时，该研究也利用了来自NanoTemper公司专利的MST（微量热泳动）、TRIC（温度依赖的荧光强度变化）和nanoDSF技术设计GPCR配体。这项研究不仅为GPCR药物开发提供了新策略，也为基于片段药物发现设计（FBDD）带来了新「组合拳」！02技术亮点基于Eurofins Discovery片段文库和Eurofins CALIXAR专利的去垢剂，利用MST-TRIC和超灵敏光谱位移技术，可以在单剂量实验中，从2342个片段库快速筛选出826个片段，作为第一轮初步Hits筛选。之后，利用MST-TRIC和光谱位移技术进行第二轮Hits确认。利用Echo MS声滴喷射技术，实现了在384孔板中的纳升级精确分配，确保了数据的稳健性。利用nanoDSF技术作为正交检测手段，进一步确认这些片段Hits的稳定性。最后进行A2AR与参考化合物和片段苗头化合物的分子对接研究（Docking Studies）。点击此处，解锁海报全文 Eurofins Discovery | 片段药物发现新「组合拳」 原创_诺坦普科技（北京）有限公司 (instrument.com.cn)03关于NanoTemperNanoTemper的愿景是致力于创造一个任何疾病都可以被治愈的世界！NanoTemper是全球领先的科学仪器制造商，2008年成立于德国慕尼黑，历经十余载发展，在全球13个国家设立分支机构。卓越的产品和优质的服务使NanoTemper成为全球成千上万的制药公司、学术研究机构及科技公司的首选合作伙伴。Dianthus 高通量筛选平台 可直接在溶液中检测亲和力，无需固定 检测一个Kd仅需1min 标准规格384孔板，单次运行可检测32个Kd 无微流控系统，无需清洗维护 专利技术加持：TRIC（温度依赖的荧光强度变化），Spectral Shift（光谱位移）PR Panta 蛋白稳定性分析仪 高数据质量，超高分辨率，多参数精准表征 天然条件下检测，无需染料标记 检测浓度范围广，低样品消耗量 可同时支持四大技术模块：nanoDSF，DLS，SLS，背反射

由明星成龙、王菲代言的霸王洗发产品卷入“致癌”风波。据港媒披露，霸王品牌旗下产品含有致癌物质二恶烷。消息一出，霸王股价7月14日暴跌14%后停牌。尽管霸王集团紧急回应力证所有产品安全，北京各超市目前仍在正常销售，但网上调查已显示，有超过7成被调查者表示“不会再购买霸王洗发水”。　　事件 霸王发现致癌物　　香港媒体壹周刊昨天报道称，“霸王”旗下的中草药洗发露、首乌黑亮洗发露以及追风中草药洗发水，经香港公证所化验发现均含有被美国列为致癌物质的二恶烷。　　当日下午，霸王官方网站挂出声明称：对香港壹周刊以“霸王致癌”为题的文章作夸张失实之恶意报道表示震惊。集团所有产品经过严格的质量监控并通过多项质量检验及测试程序和广州出入境检疫检验局检查，绝对符合中国及香港的质量及安全要求，集团产品也同时符合世界包括欧盟及美国FDA所定的标准，客户可放心使用。　　霸王还表示，二恶烷是目前国内外清洁类、洗涤类产品中普遍存在且不可避免的物质。二恶烷是在原料中出现的，非刻意添加而技术上无法避免由原材料残留的微量二恶烷，在欧盟法例是允许的，“不过含量少对人体无害”。　　坚信质量没问题的霸王集团强硬表示，不会因为产品所含少量二恶烷而进行下架处理，暂时也不接受退货要求。　　据悉，霸王已将样品送交第三方检验机构进行检验，将尽快公布检验结果。　　进展 超市卖场暂不下架　　在北京各大超市的洗发产品区域，几乎都能见到霸王产品的身影。记者看到，多款霸王外包装上都标着“天然植物洗发露”，所含中药成分有何首乌、天麻、地黄、苦参等，没有二恶烷字样。　　物美、家乐福等卖场负责人均表示，正在密切关注霸王事件，但在没有国家相关部门的明确说法之前，暂时不下架。　　霸王品牌洗发水在中国内地市场占有率约为7.6%，而在中草药洗护发市场占有率则超过46%。美银美林公司昨天发表研究报告称，若报道被证实，必将影响霸王品牌所有产品销售，进而可能导致品牌形象受损。　　调查 超7成人不想买霸王　　记者今天上午10时看到，在新浪财经进行的5万3千多人的相关调查中，有超过65%的受访者“相信霸王洗发水含致癌成分”，不相信的只占9.2% 超过70%的人表示“不会购买霸王洗发水”，只有14.4%的人表示“会买”。　　观点 霸王有误导嫌疑　　“不管二恶烷是因什么原因出现在洗发水中，霸王最起码存在宣传不当问题”，维权律师邱宝昌昨天表示，其产品宣称是“天然植物洗发水”，普通消费者理解的“天然植物”的概念就是不会含有化学合成的有致癌危险的物质。因此即使霸王产品是安全的，“天然植物”的说法也有误导消费者的嫌疑。记者 杨滨　　新闻链接　　化妆品二恶烷含量无限制标准　　去年强生婴儿香桃沐浴露也被曝含有二恶烷。强生回应称，二恶烷在一些原材料中自然存在无法避免，并指出“强生婴儿香桃沐浴露含的二恶烷符合国家标准”。　　国家药监局于当年4月3日公布了针对强生等化妆品的检测结果——强生等部分化妆品中检出含有微量二恶烷。药监局专家组认为，根据我国现行化妆品监管法规，二恶烷为化妆品中的禁用原料，但由于技术上的原因，有可能作为杂质随原料带入化妆品中。　　化妆品中含微量二恶烷不会对人体产生伤害，但是到底多少才是“微量”?朝阳医院职业病与中毒医学科主任郝凤桐告诉记者，我国对于洗发产品当中二恶烷的含量没有明确的限制标准。上世纪70年代末，美国食品和药品管理局(FDA)就开始对化妆品中的二恶烷含量进行监测。从1992年至1997年，监测到一些化妆品中二恶烷含量达0.079%。，美国FDA认为，这种含量水平不会对消费者健康产生危害。　　二恶烷是什么　　朝阳医院职业病与中毒医学科主任郝凤桐告诉记者，二恶烷通常由乙二醇和浓磷酸共同蒸馏脱水而制得，是一种常温下为无色，带有醚味的透明液体，最常见的用途是溶剂、乳化剂、去垢剂等，还可以用于生产农药、医药产品、染料等的溶剂。　　二恶烷属于微毒类物质，生物学活性和其他众多化学品一样，取决于接触剂量。生产领域也对职业人群的二恶烷接触有所限制。但是目前世界各国在技术上无法完全避免微量二恶烷作为杂质带入产品。　　二恶烷毕竟属于具有有害作用的化学品，在日常生活、工作中应当避免直接接触。如果一旦发生意外接触，需要做好紧急处理措施。比如皮肤接触的应脱去被污染的衣着，用肥皂水和清水彻底冲洗皮肤 眼睛接触的应立即提起眼睑，用流动清水或生理盐水冲洗 呼吸道吸入的应迅速脱离现场至空气新鲜处，保持呼吸道通畅 消化道摄入的应及早催吐、洗胃。大量接触二恶烷就需要及时就医了。

昨日，有香港媒体报道称，霸王旗下洗发水产品含有致癌物质二恶烷。霸王集团昨日发表声明称，上述媒体报道失实，霸王洗发水产品对人体健康不会构成影响。霸王集团股票昨日大跌，午后停牌。　　霸王发声明强调产品安全　　香港一家周刊昨日报道中称，霸王旗下中草药洗发露、首乌黑亮洗发露以及追风中草药洗发水，经过香港一家公证所化验后，均含有被美国列为致癌物质的二恶烷。报道中说，是通过一家叫通用公证行的机构做了这个测试。　　昨天，霸王集团声明称，报道所指产品含有的微量二恶烷远低于世界安全指引，绝对不会对人体健康构成影响。公司高度重视产品品质及安全标准，所有产品均严格按照中国现行法律、法规及标准之要求规范生产，经过严格的品质监控并通过多项质量检验及测试程序及广州出入境检疫检验局检查，绝对符合中国及香港的品质及安全要求 产品也同时符合世界包括欧盟及美国FDA所定的标准。　　该声明还称，公司将对相关媒体对本集团产品做夸张失实之恶意报道表示震惊，将对其所带来的影响保留采取进一步法律行动的权利。　　将委托第三方做产品检测　　除声明以外，霸王国际集团公关部经理杨政书昨日透露，“为发布公正、公开的检测信息，公司将委托第三方权威机构做产品检测。”记者了解到，霸王将于近期召开新闻发布会，并提供相关资料。　　二恶烷是否为化妆品禁用物质?根据2007年卫生部颁发的《化妆品卫生规范》要求，二恶烷属于化妆品中禁止使用物质。《化妆品卫生规范》中的禁用成分，是指禁止作为生产原料物质添加入化妆品。如果技术上无法避免禁用物质作为杂质带入化妆品时，在按照国家核准的化妆品说明书规定的正常使用范围内，微量杂质不会对人体产生危害。　　霸王集团副总沈小迪在接受香港有线电视新闻台采访时表示，二恶烷是原材料遗留，同类产品都会含有，但是量是有控制的，不会影响到身体健康。　　相关　　北京超市“霸王”产品暂不下架　　霸王洗发水客服称，产品对人体无害，暂不接受退货　　霸王旗下三款洗发水被曝含有致癌物质二恶烷。昨天，记者从北京各家大型超市了解到，目前霸王的各个系列产品都在正常销售中，在没有得到官方权威说法之前，暂时不会对霸王的产品进行下架。　　在丰台亿客隆、华堂商场、家乐福、物美超市里，洗发水柜台里，依然能见到霸王洗发水。超市销售人员称，他们也是刚刚听说了这个消息，但今天的销售还没有受到太大影响。　　沃尔玛、家乐福、物美、天虹百货都向记者表示，作为超市来说，对各方媒体公布的信息不太好判断，而且产品检测的真实性也尚未得到定论，因此超市将以政府相关部门的公告通知为准，再采取相应措施，不会轻易下架。　　物美负责人还提醒消费者，可以先保留好购物小票，等待官方的权威说法或检测出来。　　记者昨天致电霸王洗发水客服热线，工作人员告知，霸王产品对人体无害，对各地退货要求暂不接受，产品不会进行下架处理。　　举措　　霸王微博细说二恶烷　　昨日，霸王集团通过微博就“二恶烷”连续发布17条解释说明：2007年2月，卫生部曾就现行化妆品法规中禁用物质的概念专门作出了解释，我国《化妆品卫生标准》和《化妆品卫生规范》规定的禁用物质是指不能作为化妆品生产原料即组分添加到化妆品的物质。　　影响　　股票大跌停牌　　霸王集团被指含有致癌物二恶烷。受此消息影响，霸王集团股价昨日早盘低开低走，下午临时申请在港交所停牌。截至停牌前，霸王股价下跌14.12%报收5.05港元。　　恒丰证券港股评论员梁渊表示，如果被证实含有致癌物质的话，对霸王集团的品牌形象、股价影响很大，后续可能还会涉及产品下架等问题。　　背景资料：二恶烷资料　　二恶烷，有机化合物，别名二氧六环，无色液体，稍有香味。属微毒类，对皮肤、眼部和呼吸系统有刺激性，并且可能对肝、肾和神经系统造成损害，急性中毒时可能导致死亡。主要用作溶剂、乳化剂、去垢剂等。　　健康危害：本品有麻醉和刺激作用，在体内有蓄积作用。接触大量蒸气引起眼和上呼吸道刺激，伴有头晕、头痛、嗜睡、恶心、呕吐等。可致肝、皮肤损害，甚至发生尿毒症。侵入途径有吸入、食入，也可通过皮肤吸收。

分子相互作用技术是创新药物研发与产业化中必不可少的研究工具，贯穿药物开发的全过程。北京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室的分子相互作用技术平台有13台大型仪器，包括表面等离子共振仪、生物膜干涉分析仪、等温滴定量热仪、微量热泳动仪、石英晶体微天平、蛋白纯化系统、动静态光散射和差示扫描荧光等。现就分子相互作用技术在创新药物研发中的实践进行分享。分子相互作用技术平台发展1.表面等离子共振（SPR）技术SPR技术是法规与药典推荐的药物活性评价方法，可实时、原位检测各种生物分子如蛋白、核酸、多糖、多肽、脂类、病毒、纳米药物、小分子、离子之间的结合与解离过程，提供亲和力、动力学、特异性、活性浓度、作用机制研究（竞争/别构/表位）等信息。SPR技术具有较高的精度、灵敏度和稳定性，广泛应用于药物靶点发现与确认、天然产物活性组分发现、药-靶亲和力和动力学检测、高通量药物筛选、杂交瘤筛选与定量、抗体生物活性分析、仿药一致性评价、免疫原性检测、药物生产过程中的质控等。2.生物膜干涉（BLI）技术BLI技术也是药典里药物结合活性检测的推荐方法，主要用于生物分子间相互作用的亲和力、动力学性质以及蛋白浓度测定。近两年，基于BLI开发的垂钓方法也可以实现中药活性组分发现与验证以及靶标垂钓。BLI通过浸入即读的方式提高了检测速度，具有实时分析、高通量、样品适用性广、操作简便灵活、耗材成本低、样品可回收等优点。3.等温滴定量热（ITC）技术ITC技术是基于热量检测的通用技术。通过检测分子结合过程中吸收或放出的热量，得到亲和力KD、化学计量比N以及全套热力学参数（焓值∆ H、熵值∆ S 和吉布斯自由能∆ G）。其中，∆H反映了氢键和范德华力等特异性相互作用的贡献，∆S反映了疏水效应的贡献以及构象改变、位阻的影响，因此能为分子间相互作用提供全面而深入的作用信息。4.微量热泳动（MST）技术MST技术是基于分子热泳动现象。在MST实验中需要给其中一个分子标记荧光。MST的优势在于样品无需固定，能保持样品天然状态，并且样品消耗量低，检测速度快，不受缓冲液限制。对于难表达纯化或不稳定的蛋白，可以通过基因转染方法给细胞内目的蛋白标记his tag或GFP，然后无需纯化、直接使用细胞裂解液进行相互作用检测。此外，有些样品的相互作用需要提前孵育一段时间，这样的样品也适合用MST进行检测。分子相互作用实验使用心得1. 样品质量高质量的样品对于获取高质量的分子相互作用数据至关重要。对于蛋白样品，实验前可以通过圆二色谱、动静态光散射、差示扫描荧光或差示扫描量热技术对蛋白进行分析，以确保蛋白结构和活性没问题。对于核酸样品，实验前可采用加热变性和缓慢冷却复性来保证其空间结构。对于难溶性小分子样品，需保证小分子在最高浓度下完全溶解，不能出现沉淀或析出。2. 缓冲液选择缓冲液常用PBS、Hepes或Tris体系。为了保持样品活性，有时需要额外调整缓冲液成分，包括pH、盐离子、盐浓度、去垢剂、还原剂、表面活性剂等。3. 分子互作技术和实验方法选择通常根据样品具体情况（类型、数量、多少、标签、纯度等）选择合适的分子互作技术和实验方法。分子相互作用实验，需要在实验过程中边做边摸索和优化条件。多种分子互作技术可以优势互补，相互验证。北京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室-王静 博士王静，副主任技师，2016年博士毕业于中科院国家纳米科学中心，2016年8月起在北京大学医学部药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室大型仪器平台工作，负责生物分子相互作用技术平台的建设管理、测试服务和新方法新体系开发。利用表面等离子共振仪（SPR）、生物膜干涉分析仪（BLI）、等温滴定量热仪（ITC）、微量热泳动仪（MST）、差示扫描荧光（nanoDSF）等技术建立了靶标垂钓、中药活性成分发现、药物筛选与验证、竞争抑制研究、表位分析、分子相互作用的亲和力检测等一系列新方法新体系。主持一项国家自然科学基金面上项目和一项国家自然科学基金青年项目。近年来以第一作者/通讯作者在Nat. Commun., Adv. Mater., J. Am. Chem. Soc., Theranostics, Anal. Chem.等国际著名期刊上发表科研论文13篇，其他作者论文20余篇。申请发明专利一项，授权发明专利一项。如有技术干货、科研成果、仪器使用心得、生命科学领域热点事件观点等内容，欢迎相关行业朋友投稿。投稿邮箱：zhaoyw@instrument.com.cn

组织透明化和光片显微镜诞生的必要性生物组织的三维特性使得生命科学的研究都需基于3D空间信息而进行分析，如脑部神经投射、血管分布以及肿瘤微环境等。传统组织学检测包括对冰冻或者石蜡包埋的组织样本进行切片，从而产生微米级别的切片，研究者可以对该切片进行免疫组化染色从而获得细胞层面信息。生物学家早就认识到组织薄切片比厚组织观察起来更加容易，显微切片机将组织切割成微米厚度的二维切片，通过二维切片我们可以获得单细胞层面的信息(Richardson & Lichtman, 2015)。但是三维组织结构可以让人们全面理解器官在正常功能和病理状态下的关键信息，例如神经系统就迫切需要进行三维结构的成像，因为大多数单个神经元向许多方向延伸，它们的真实性质和功能无法通过二维切片来确定；此外，发育生物学需要在三维结构上才能更好的认识器官甚至整个动物的形态发生(Chung et al., 2013)。因此获取完整生物组织在单细胞分辨率尺度上的三维结构一直是生命科学领域的重要目标之一。怎样才能获得组织的三维层面信息？一种方法是通过将一系列连续的切片输入电脑进行三维结构重建，但是这种方法在技术上具有挑战性，因为组织在此过程会被撕裂、折叠、压缩或拉伸从而导致组织某个部分的损失或变形，由于剖面不完整，最终的体积重建可能无法还原最原始的三维结构(Oh et al., 2014)。还有一种方法是使用光学切片技术进行整体成像，比如激光共聚焦、双光子显微镜和转盘显微镜等成像显微镜的使用，这些成像显微镜可以对小组织进行三维结构成像，但是这些现代的显微技术没办法解决组织太厚带来的严重速度滞后问题，以及强激光造成的光漂白、光毒性等问题。光学成像与细胞荧光标记相结合，因其具有良好的空间分辨率和高信噪比，是收集器官或组织单细胞分辨率信息的实用方法之一。然而，组织不透明是全组织和全器官光学成像的主要障碍之一，因此要进行光学成像就要进行组织透明化。那么是什么原因导致组织不够透明？在组织中，生物物质如水、脂类、蛋白质和矿物质通常以不均匀的混合物存在，它们的不均匀分布导致光发生强烈的横向散射，此外，生物物质有时会在细胞内外形成不均匀的结构，包括脂质颗粒和细胞器（如线粒体）、大的蛋白质簇（如胶原纤维）、甚至全细胞体积（如红细胞），当光被分子、膜、细胞器和组织中的细胞反射时，本来应该以直线传播的光线会发生多次偏移，因此光不能直接穿过组织从而形成光的散射(Tuchin, 2015 Wen, Tuchin, Luo, & Zhu, 2009)。组织不透明的另一个原因是光的吸收，血红蛋白、肌红蛋白和黑色素是生物组织中吸收可见光的主要分子，血红蛋白存在于所有脊椎动物（除了鳄鱼、冰鱼）和许多无脊椎动物中，样品内的光吸收可以限制激发光进入组织和荧光发射返回到探测器(Richardson & Lichtman, 2015)。正是由于光的散射和光的吸收，导致光的分布加宽、光的强度衰减，特别是在组织的深层区域，最终导致组织不透明，无法进行全组织三维结构光学成像。因此，组织透明化的目的主要是减少光的散射和吸收，以获得更好的光学成像效果（图1）(Gracie Vargas, 2001)。图1 实现组织透明化的关键步骤 (Susaki & Ueda, 2016)当光穿过组织时，由于脂质、色素的存在，导致光发生散射和吸收，从而组织不透明；组织透明化最主要的目的是通过脱脂、脱色等步骤从而减少光的吸收和光的散射。三种组织透明化方法类型：有机溶剂型、水溶剂型、水凝胶型经科学家的不断研究和突破，多种组织透明化方法相继被提出和优化。组织透明步骤包括：①样本固定；②样本透化（依据组织特性选择脱脂、脱钙、脱色、脱水或水化）；③折射率匹配。有机溶剂型透明化方法还涉及到组织脱水过程，根据组织成像需要还要涉及到样本免疫标记(图2)(Almagro, Messal, Zaw Thin, van Rheenen, & Behrens, 2021)；为了避免组织发生形变以及检测目标丢失，在透明化之前必须进行样本固定，但是固定程度需要控制，如果固定太弱，组织会软榻，如果固定过头，会阻碍免疫标记；一般使用多聚甲醛（PFA）、戊二醛（GA）进行组织固定，PFA可以均匀的固定大于500微米直径的样品，GA比PFA固定效果好，但是速度慢（分子较大，扩散速度慢），SWITCH方法通过改变pH提高GA效率，GA一般适合固定脆弱以及蛋白表达较弱的组织；在组织切片中我们通过抗原修复减少醛固定时造成的抗原表位封闭（二硫键），在水性透明化方法SHIELD采用聚甘油-3-聚缩水甘油醚（P3PE）既能固定组织又能保存蛋白质；透化过程中用到的试剂主要有三种类型：①有机溶剂；②高水化试剂；③脱脂试剂；随后用高折射率的物质替换组织液体进行折射率匹配，实现组织透明。(Park et al., 2018)。图2 组织透明化基本流程(Almagro et al., 2021)(a) 不同来源样本获取。(b) 用不同方式（去垢剂、醇类化学试剂、电泳）增加组织通透性。(c) 组织标记（抗体、染料、凝集素）以及透明化（有机溶剂型透明化方法、水溶剂型透明化方法）。(d) 组织成像（三维数据、定量分析）。依据各透明化方法中使用的溶剂及其作用原理将现有的组织透明化方法主要分为三类：有机溶剂型、水溶剂型、水凝胶型（图3）(Matryba et al., 2020 Ueda et al., 2020b)。基于有机溶剂的组织透明化方法通过使用高折射率（RI）的有机溶剂将不同成分的RI均质，从而获得极好的组织透明度。BABB组织透明化方法可以完全透明胚胎和幼鼠大脑(Dodt et al., 2007)，但该方法中乙醇脱水作用会导致内源性GFP信号淬灭，无法透明有髓组织。通过引入四氢呋喃（THF）和二苄醚（DBE）, 3DISCO能够实现大多数成年啮齿动物器官的良好透明度，并将FPs保存几天，虽然DBE能有效保护内源荧光信号，但是DBE降解产物如过氧化氢、醛类物质会对荧光蛋白产生有害干扰(Erturk et al., 2012)。与3DISCO相比，uDISCO能够实现全身透明化和成像，并在数月内保持内源性FPs(Pan et al., 2016)。a-uDISCO是uDISCO的改良版本，通过调节pH条件提高荧光强度和稳定性(Li, Xu, Wan, Yu, & Zhu, 2018)。然而，uDISCO和a-uDISCO都不能有效的透明化高度着色的器官和硬组织。为了解决这些限制，赵瑚团队开发了聚乙二醇(PEG)相关溶剂系统(PEGASOS)，该系统可以透明所有类型的组织，同时保留内源性荧光(Jing et al., 2018)。朱丹教授团队通过温度和pH值调节开发了一种基于3DISCO，称为FDISCO，FDISCO有效的保存了FPs和化学荧光示踪剂，并允许在几个月内重复拍摄样品(Qi et al., 2019)。最近开发的sDISCO通过添加抗氧化剂稳定DBE，进一步保留了荧光信号。蛋白质也可以通过免疫标记来观察。由Renier等人开发的iDISCO可以对小鼠胚胎和成年器官进行全贴装免疫标记和体积成像(Renier et al., 2014)。vDISCO是一种基于纳米体的全身免疫标记技术。该技术将FPs的信号强度增强了100倍以上，并揭示了Thy1-GFP-M小鼠的全身神经元投射(Cai et al., 2019)。虽然有机溶剂方法表现出出色的透明性能，并实现了亚细胞分辨率的全身成像，但也存在一些不足，例如样品的大幅收缩、大多数有机溶剂的毒性和荧光蛋白的猝灭。由于油性透明化方法存在诸多缺点，水性透明化方法诞生，水性与油性透明化方法最大区别在于水性试剂具有强亲水性，更有利于荧光信号的保存，适用于自带荧光的组织样本进行透明化。水性透明化试剂主要包括：单纯浸泡透明化和高水化脱脂透明。ClearT是基于甲酰胺的浸泡型透明化方法，速度快，但是会导致组织膨胀且荧光信号会淬灭。PEG可以稳定蛋白质构象，继而发展了可保留荧光蛋白的ClearT2透明化技术，但该方法透明度比ClearT低。SeeDB技术以果糖和硫代甘油为主要成分，可以在几天内将组织透明化，但果糖粘度过高导致组织内渗透性低，在此基础上衍生出FRUIT透明化方法，尿素的使用降低了果糖粘度，提高试剂流动性和渗透性。浸泡型透明化方法不能去除脂质，因此样本透明度有限。SDS、Triton X-100可以有效去除脂质，水化法通过在透明化过程中去除脂质，利用水化作用降低样本折射率进而实现组织透明化。Scale技术利用尿素水化作用进行透明化，可保留荧光信号，但该方法操作时间较长，易导致组织破碎。CUBIC在Scale基础上添加了胺基醇，可以去除血红素使组织脱色,也可以保留荧光信号(Tian, Yang, & Li, 2021)。水凝胶解决了高浓度去垢剂导致样本形变的问题，水凝胶与样本中蛋白质和核酸分子形成共价连接便可以固定和保护细胞结构。水凝胶型组织透明化方法是一种基于水凝胶的组织透明化方法，利用丙烯酰胺凝胶将生物分子固定在它本来的位置，用水凝胶来替换组织中的脂类，让溶液中的单体进入组织，然后对其稍微加热，上述单体开始凝聚为长分子链，在组织中形成高分子网络，这一网络能够固定组织的所有结构，但不会结合脂类，随后快速将脂类抽出，便获得了完整透明的立体组织，如脑组织中的神经元、轴突、树突、突触、蛋白、核酸等都完好的维持在原位。这种独特的组织脱脂方法能够最小化结构破坏和生物分子损失。该方法的脱脂方式主要有两种：电泳和简单被动脱脂，均能有效去除脂质，从而大大提高了水凝胶组织的光学透明度和大分子通透性(Chung et al., 2013 Treweek et al., 2015)。CLARITY透明化方法利用凝胶包埋样本，并利用电场力去除脂质使样本快速透明；SHIELD通过环氧化物P3PE固定组织实现蛋白的保护，之后使用SDS进行被动或主动脱脂。水性透明化方法虽然可以部分解决荧光蛋白易淬灭的问题，但是也存在透明时间长，透明能力低的缺点，一般适用于小样本组织透明化。水凝胶透明化方法操作过程复杂，且需要一定的设备。图3 组织透明化方法的主要类型 (Ueda et al., 2020b)(A) 有机溶剂型透明化方法通过使用有机溶剂依次将组织进行脱水、脱脂、折射率匹配，在短时间内可使组织完全透明。然而，有机溶剂会快速漂白荧光蛋白的信号并且使组织皱缩。(B) 水溶剂型透明化方法以水溶性试剂对组织依次进行脱色、脱脂、折射率匹配，从而使组织完全透明。该方法具有更高的生物安全性和兼容性。(C) 水凝胶型透明化方法通过凝胶将生物分子固定在原来的位置，随后对组织进行脱色、脱脂、折射率匹配操作，从而使组织透明。基于水凝胶的方法可以保留足够的RNA用于分析，如荧光原位杂交；由于水凝胶网会固定组织，因此会使组织体积扩大几倍。组织透明化方法的选择（对于不同检测目标、不同组织、含有特定化学成分的组织选择的组织透明化方法以及试剂不同）组织透明化从2014年兴起以来，前期主要在神经科学领域广泛应用，随着透明化方法的不断改进，目前在发育生物学、免疫学、肿瘤学研究中也被广泛应用。检测目标不同，透明化方法中的试剂选择不同，水凝胶适用于不稳定分子如RNA的保存，CLARITY方法中用到的化学试剂单丙烯酰胺或双丙烯酰胺对细胞内部结构进行很好的固定，使得在后期脱脂等处理后组织内部结构依然保持；常用的样本固定试剂是甲醇，在使用过程中可以较好的固定蛋白质（表1）(Almagro et al., 2021)。表1 不同试剂适用于不同检测目标(Almagro et al., 2021)水性试剂蔗糖和尿素对内源性荧光试剂、脂类试剂比较友好；而有机溶剂苄醇-苯甲酸苄酯(BABB)会造成脂质洗脱和蛋白质荧光基团淬灭，所以不能用于脂肪组织的检测；聚乙二醇(PEG)是有机溶剂型透明化方法PEGASOS中用到的试剂，可以有效保护内源性荧光；此外在有机溶剂型透明化方法中可以通过调节pH、温度达到保护荧光的效果，如FDISCO在四氢呋喃(THF)中，维持碱性pH和低温下，EGFP荧光信号可以维持数月（表2）。此外，免疫标记中使用的小分子染料（如细胞核染料DAPI、碘化丙啶、RedDot和SYTO）、凝集素、抗体对目标进行标记，其中抗体被动扩散速度非常慢，免疫染色可以通过优化抗体浓度、温度、孵育时间等提高染色效率；我们也可以通过减小样品体积、用小分子荧光染料代替抗体增强染色效果。也可以通过改变荧光标记的亲和属性如SWITICH方法，让它们在组织中自由扩散再进行结合；通过电泳的方式也可以提高染色效率(Almagro et al., 2021)。 表2不同试剂对于荧光信号的保留(Almagro et al., 2021)此外，某些组织中含有较难去除的成分如色素、脂肪，其中血红素是组织中较难去除的色素，仅仅通过灌注PBS不足以去除肾脏、心脏、肌肉、肝脏中的血红素，可以选择含有漂白剂成分的试剂进行脱色如双氧水，并且能去除自发荧光，但是过氧化物处理会损伤目标荧光蛋白，所以荧光标记一般在漂白之后进行；前列腺和乳腺富含脂肪，会阻碍抗体进入、光线穿透，可以选择含有去垢剂成分的组合如TritonX-100、SDS、CHAPS等进行脱脂，去污剂可以破坏脂质双层使组织形成可以运输出组织的胶束，SHANEL方法中的CHAPS能生成较小的胶束，能更快的从组织中析出，具有有效的去脂效果。当组织较大时，被动去脂速度就比较慢，这时可以通过电泳的方式加快进程；电泳组织透明设备（ETC）和随机电子迁移（使用旋转电场或在单向电场内旋转样品）可以加速去脂。其它类型组织如硬组织骨骼，其中含有的钙化矿物质阻碍光的穿透，50%-70%的骨骼由遍布蛋白基质的钙化羟基磷灰石（HAP）晶体组成，这时可以选择含有钙螯合剂组合的方法如乙二胺四乙酸（EDTA）中性缓冲液，进行脱钙处理（表3）(Almagro et al., 2021)。表3不同试剂对于细胞组分去除(Almagro et al., 2021)组织透明化方法的应用范围不同组织在透明化方法的选择上都有所不同，根据组织成分、检测目标、组织类型选择不同的透明化方法，下表是不同透明化方法在不同健康以及肿瘤组织上的应用实例，对于组织在选择方法的时候可以借鉴这些实例，从而更好的避开长时间的摸索（表4）。表4 不同透明化方法应用到不同肿瘤组织举例(Almagro et al., 2021)此外，利用组织透明化方法可以实现人类器官三维成像（图4）(Ueda et al., 2020a)。图4 人类胚胎组织以及器官透明化三维结构图(Ueda et al., 2020a)(a) 胚胎周围神经三维图像。(b) 泌尿系统中的肾脏和Wolffian管。(c) 胚胎背部、手臂、头部肌肉。(d)手部脉管系统。(e)手部三种感觉神经。(f)肺上皮小管。参考文献Almagro, J., Messal, H. A., Zaw Thin, M., van Rheenen, J., & Behrens, A. (2021). Tissue clearing to examine tumour complexity in three dimensions. Nat Rev Cancer, 21(11), 718-730. doi:10.1038/s41568-021-00382-wCai, R., Pan, C., Ghasemigharagoz, A., Todorov, M. I., Forstera, B., Zhao, S., . . . Erturk, A. (2019). Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nat Neurosci, 22(2), 317-327. doi:10.1038/s41593-018-0301-3Chung, K., Wallace, J., Kim, S. Y., Kalyanasundaram, S., Andalman, A. S., Davidson, T. J., . . . Deisseroth, K. (2013). Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature, 497(7449), 332-+.Dodt, H. U., Leischner, U., Schierloh, A., Jahrling, N., Mauch, C. P., Deininger, K., . . . Becker, K. (2007). Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods, 4(4), 331-336. doi:10.1038/nmeth1036Erturk, A., Becker, K., Jahrling, N., Mauch, C. P., Hojer, C. D., Egen, J. G., . . . Dodt, H. U. (2012). Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc, 7(11), 1983-1995. doi:10.1038/nprot.2012.119Gracie Vargas, M., Kin F. Chan, PhD, Sharon L. Thomsen, MD, and A.J. Welch, PhD. (2001). Use of Osmotically Active Agents to Alter Optical Properties of Tissue: Effects on the Detected Fluorescence Signal Measured Through Skin.Jing, D., Zhang, S., Luo, W., Gao, X., Men, Y., Ma, C., . . . Zhao, H. (2018). Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Res, 28(8), 803-818. doi:10.1038/s41422-018-0049-zLi, Y., Xu, J., Wan, P., Yu, T., & Zhu, D. (2018). Optimization of GFP Fluorescence Preservation by a Modified uDISCO Clearing Protocol. Front Neuroanat, 12, 67. doi:10.3389/fnana.2018.00067Matryba, P., Sosnowska, A., Wolny, A., Bozycki, L., Greig, A., Grzybowski, J., . . . Golab, J. (2020). Systematic Evaluation of Chemically Distinct Tissue Optical Clearing Techniques in Murine Lymph Nodes. J Immunol, 204(5), 1395-1407. doi:10.4049/jimmunol.1900847Oh, S. W., Harris, J. A., Ng, L., Winslow, B., Cain, N., Mihalas, S., . . . Gerfen, C. R. (2014). A mesoscale connectome of the mouse brain. Nature, 508(7495), 207-+.Pan, C., Cai, R., Quacquarelli, F. P., Ghasemigharagoz, A., Lourbopoulos, A., Matryba, P., . . . Erturk, A. (2016). Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat Methods, 13(10), 859-867. doi:10.1038/nmeth.3964Park, Y. G., Sohn, C. H., Chen, R., McCue, M., Yun, D. H., Drummond, G. T., . . . Chung, K. (2018). Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers. Nat Biotechnol. doi:10.1038/nbt.4281Qi, Y., Yu, T., Xu, J., Wan, P., Ma, Y., Zhu, J., . . . Zhu, D. (2019). FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Sci Adv, 5(1), eaau8355. doi:10.1126/sciadv.aau8355Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., & Tessier-Lavigne, M. (2014). iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell, 159(4), 896-910. doi:10.1016/j.cell.2014.10.010Richardson, D. S., & Lichtman, J. W. (2015). Clarifying Tissue Clearing. Cell, 162(2), 246-257. doi:10.1016/j.cell.2015.06.067Susaki, E. A., & Ueda, H. R. (2016). Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chem Biol, 23(1), 137-157. doi:10.1016/j.chembiol.2015.11.009Tian, T., Yang, Z., & Li, X. (2021). Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. J Anat, 238(2), 489-507. doi:10.1111/joa.13309Treweek, J. B., Chan, K. Y., Flytzanis, N. C., Yang, B., Deverman, B. E., Greenbaum, A., . . . Gradinaru, V. (2015). Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nature Protocols, 10(11), 1860-1896.Tuchin, V. V. (2015). Tissue Optics and Photonics: Light-Tissue Interaction. Journal of Biomedical Photonics & Engineering, 98-134. doi:10.18287/jbpe-2015-1-2-98Ueda, H. R., Erturk, A., Chung, K., Gradinaru, V., Chedotal, A., Tomancak, P., & Keller, P. J. (2020a). Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nat Rev Neurosci, 21(2), 61-79. doi:10.1038/s41583-019-0250-1Ueda, H. R., Erturk, A., Chung, K., Gradinaru, V., Chedotal, A., Tomancak, P., & Keller, P. J. (2020b). Tissue clearing and its applications in neuroscience (vol 21, pg 61, 2020). Nature Reviews Neuroscience, 21(5), 298-298.Wen, X., Tuchin, V. V., Luo, Q. M., & Zhu, D. (2009). Controling the scattering of Intralipid by using optical clearing agents. Physics in Medicine and Biology, 54(22), 6917-6930.

p　　7月20日，生命中心颜宁研究组在《细胞》(Cell)期刊在线发表题为《来自电鳗的电压门控钠离子通道Nav1.4-β1复合物结构》(Structure of the Nav1.4-β1 complex from electric eel)的研究论文，首次报道了带有辅助性亚基的真核生物电压门控钠离子通道复合物可能处于激活态的冷冻电镜结构。该成果是电压门控离子通道(voltage-gated ion channel)的结构与机理研究领域的一个重要突破。br//pp style="text-align: center "img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201708/noimg/006bf0f0-14f4-4b4b-9249-e21d7cbe96f4.jpg" title="1.jpg" width="460" height="329" style="width: 460px height: 329px "//pp style="text-align: center "图1. 电压门控钠离子通道Nav1.4-β1复合物结构示意图/pp　　电压门控钠离子通道(以下简称“钠通道”)位于细胞膜上，能够引发和传导动作电位，参与神经信号传递、肌肉收缩等重要生理过程。顾名思义，钠通道感受膜电势的变化而激活或失活。对于可激发的细胞，细胞膜两侧由于钠离子、钾离子、钙离子、氯离子等离子的不对称分布，产生跨膜电势差。在静息状态下，细胞膜内电势低，膜外电势高，3-5纳米厚的细胞膜两侧电势差大概为-70毫伏左右。通常情况下，钠通道在细胞膜去极化状态，也就是细胞内相对电势升高时激活(即钠通道中心通透孔道打开，钠离子由高浓度的胞外侧流向胞内)，从而引发动作电位的起始 而其又具备特殊的结构特征，使之在激活的几毫秒内迅速失活，从而保证通过与钾离子通道的协同作用结束动作电位，以及由钠钾泵介导的静息电势的重建，为下一轮的动作电位产生做好准备。/pp　　真核生物的钠通道主要由负责感受膜电势控制孔道开闭进而选择性通透钠离子的α亚基和参与调控的β亚基组成。在人体中共有9种钠通道α亚型(分别命名为Nav1.1-1.9)和4种β (β1-4)亚基，特异分布于神经和肌肉组织中。由于其重要的基本生理功能，钠通道的异常会导致诸如痛觉失常、癫痫、心率失常等一系列神经和心血管疾病。至今为止，已经发现了1000多种与疾病相关的钠通道突变体。另一方面，很多已知的包括蝎毒、蛇毒、河鲀毒素在内的生物毒素以及临床上广泛应用的麻醉剂等小分子均通过直接作用于钠通道发挥作用。钠通道是诸多国际大制药公司研究的重要靶点，其结构为学术界和制药界共同关注。/pp　　颜宁研究组十年来一直致力于电压门控离子通道的结构生物学研究，取得了一系列重要成果，包括来自细菌中的钠通道NavRh的晶体结构 (Zhang et al., 2012)。而近两年更是相继报道了与钠离子通道有同源性的世界上首个真核电压门控钙离子通道复合物Cav1.1 (Wu et al., 2016 Wu et al., 2015)以及首个真核钠通道NavPaS (Shen et al., 2017)的高分辨率冷冻电镜结构，为理解真核电压门控离子通道的结构与功能提供了重要基础。/pp　　在该最新研究中，颜宁研究组首次报道了真核钠通道复合物Nav1.4-β1的冷冻电镜结构，整体分辨率达到4.0 ，中心区域分辨率在3.5 左右，大部分区域氨基酸侧链清晰可见。该蛋白来自于电鳗(Electrophorus electricus)，它具有一个特化的肌肉组织称为电板(electroplax)，在受到刺激或捕猎时能够放出很强的电流 电流产生的基础即为钠通道的瞬时激活。因而该器官富集钠通道，其序列与人源九个亚型中的Nav1.4最为接近，因此命名为EeNav1.4。值得一提的是，电鳗中的钠通道正是历史上首个被纯化并被克隆的钠通道，已经具有半个世纪的研究历史，是钠通道功能和机理研究的重要模型，因此该蛋白一直以来也是结构生物学的研究热点。/pp　　在本研究中，研究组成员利用特异性的抗体从电鳗的电板组织中提纯出Nav1.4-β1复合物，通过对纯化条件和制样条件的不断摸索和优化，获得了性质稳定且均一的蛋白样品，并进一步制备出优质的冷冻电镜样品，最终利用冷冻电镜技术解析出其高分辨三维结构。与此前解析的钠通道NavPaS相比，该结构展示了三大新的结构特征：/pp　　1)该结构中带有辅助性亚基β1，首次揭示了辅助性亚基与α亚基的相互作用方式，有助于更好的理解β亚基对钠通道功能的调控机制 /pp　　2)与钠通道快速失活相关的III-IV 连接片段的位置与之前在Cav1.1和NavPaS结构相比有一个十分显著的位移，特别是与快速失活直接相关的IFM元件插入到了中间孔道结构域的内外两层之间。这一新的结构刷新了我们之前对钠通道失活机制的理解，却与历史上大量基于电生理的突变体分析十分吻合。本论文就此提出了一个解释钠通道快速失活的新的变构阻滞机制(allosteric blocking mechanism) /pp　　3)该结构特征与预测的激活态基本吻合，极有可能揭示了首个处于开放状态的真核钠通道的结构，实属意外之喜。由于钠通道蛋白在提纯后会很快失活，理论上处于开放状态的结构是极难甚至不可能捕捉到的。进一步分析电子密度发现，有一团疑似去垢剂分子的密度堵在胞内门控区域，帮助稳定了钠通道的开放状态。因此该结构整体呈现的极有可能是完全没有预料到的激活态。这一难得的构象有助于更好地理解电压门控离子通道最基本的机电耦合机理问题(electromechanical coupling mechanism)。除此之外，该结构还为基于结构的药物设计和功能研究提供了全新的模板。/pp　　颜宁教授为本文的通讯作者。清华大学医学院博士后闫浈、医学院副研究员周强、生命学院博士生王琳、生命学院博士毕业生吴建平为本文的共同第一作者 清华大学冷冻电镜平台雷建林博士指导数据收集。本研究获得了清华大学冷冻电镜平台工作人员李小梅和李晓敏的大力支持。国家蛋白质科学中心(北京)清华大学冷冻电镜平台和清华大学高性能计算平台分别为本研究的数据收集和数据处理提供了支持。生命科学联合中心、北京市结构生物学高精尖创新中心、膜生物学国家重点实验室、科技部、基金委为本研究提供了经费支持。(来源：生命科学联合中心)/pp　　原文链接：http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(17)30758-4/ppbr//p

文章来自果壳网，方程佰金公司再次编辑作者Andy Coghlan 本文主要编译自World' s first biolimb: Rat forelimb grown in the lab，部分段落根据原论文进行了一些增补。文中图片来源：B J Jank, Ott Laboratory。这看起来像是一截被砍断的老鼠爪子，不过正确答案可能比你想象的更加振奋人心：这截大鼠前肢其实是科学家们在实验室中用活体细胞培育出来的人工产物。尽管尚不完美，但这一技术可能会在未来帮助人们研制出真正具有生物学功能的义肢。 “我们目前将研究的重点放在前臂与手掌上，用于模型系统的建立与基本原理的验证。”波士顿马萨诸塞州综合医院的哈拉尔德奥特（Harald Ott）是培植这条大鼠前肢的主要功臣之一。“不过，同样的技术还可应用于腿和胳膊等其他四肢部位。”“这就像现实版的科幻小说。”佛蒙特大学医学院的丹尼尔维斯（Daniel Weiss）如是说，他正在研究肺脏的再生。“这是一项激动人心的新技术，但如何制作一条功能齐备的肢体将是一大挑战。”许多接受了截肢手术的患者身上安装的义肢在外观上毫无问题，但却无法像真正的四肢那样发挥功用。现在，市面上又出现了一些利用仿生学的人工义肢，它们可以发挥功能，但不自然的外观依旧是个硬伤。手部移植手术是另外一种解决方案，目前也有不少成功的案例，但为了防止身体出现排异反应，接受移植的患者也需要终生服用免疫抑制药物。而生物肢体（biolimb）一旦成功，以上诸多问题都将迎刃而解。这种肢体由患者自身的细胞“培植”而成，因此不需要免疫抑制药物的辅助，而且它在外观和运动功能上都将与自然状态的肢体十分接近。“这是对生物肢体培育的初次尝试，而且据我所知，目前尚无其他技术培养的复合组织能够达到我们的复杂度。”奥特说。如何做出一条前肢？制作这条大鼠前肢的技术叫做“decel/recel”（分别是decellularization和recellularization的缩写，意为“脱细胞化”与“再细胞化”），之前在实验室中，这种技术已经被用于研制人造心脏、肺脏和肾脏。利用该技术制作的一些简单器官——例如气管和声带——已经被用于移植手术，并在不同程度上取得了成功。不过，它也遭到了一些非议。人造器官的第一步是“脱细胞化”：供体的器官/肢体经过去垢剂处理，剥离了全部的软组织，仅留下由惰性的胶原蛋白构成的器官“支架”，从而完好地保留它们原有的复杂结构。在此次培植大鼠前肢的实验里，血管、肌腱、肌肉和骨骼处的胶原蛋白结构在此步操作之后被存留了下来。第二步就是“再细胞化”，这时要将接受移植个体的细胞“种”在“器官支架”上，然后将它们放在生物反应器中培养，让新的组织细胞依附支架生长起来，最终使器官重新恢复“有血有肉”的状态。最终，新的器官上不会留下任何带有供体细胞特征的软组织，所以它也不会被到受体的免疫组织识别为“异己”。这样一来，排异反应就可以避免了。同样是利用脱去细胞再培养的方法，造出一条前臂可比培养气管难得多，因为前者需要培育更多种类的细胞。为了解决这个问题，奥特首先将脱细胞后的大鼠前肢“骨架”置于生物反应器当中，并利用一套人工循环设备为其提供养分、氧气以及电刺激。随后，他将人类内皮细胞注入血管的胶原支架，1个小时之后，内皮细胞重新附着在血管表面。这一步非常关键，他说，因为这样能使新长出来的血管更加结实，而不会在内有液体循环的情况下出现破裂。接下来，他将小鼠成肌细胞、小鼠胚胎成纤维细胞以及人类内皮细胞混合在一起，注入前肢支架中原本被肌肉组织占领的空位。2~3周后，血管和肌肉的重建完成。最后，奥特给前肢实施了皮肤移植手术，终于大功告成。不过，这条前肢的肌肉能用吗？为了验证这一点，研究团队利用电脉冲刺激肌肉，发现大鼠爪子真的会做出抓握动作，而且肌肉的强制性张力达到了新生大鼠肌肉的80%。“这说明我们能实现手掌的弯曲与伸展。”奥特说。他们还为若干只大鼠进行了移植手术，实际检测了这种生物肢体的功效。血管连接完成后，受体大鼠的血液顺利流入了人造前肢的血管，并且能记录到血流的脉动。不过，他们并没有在活体大鼠上测试肌肉运动功能或排异反应。 前路漫漫奥特表示，尽管他们已经完成了近百条大鼠前肢的脱细胞化，又给其中至少一半的支架“种”上了新的细胞，但目前需要做的工作还有很多。首先，他们需要在肢体里种上组成硬骨、软骨等其他组织的细胞，观察这些细胞能否再生。下一步，他们必须证明神经系统也能完成重建。前人的手部移植手术结果表明，受体的神经组织能够延伸并穿入新接上的手掌，最终实现对新器官的控制。而人工培植的生物肢体是否也能做到这一步，还有待进一步实验验证。除此之外，奥特和同事们还在论文中展示了灵长类动物前臂成功被脱细胞化（见下图）的成果。目前，他的团队已经开始在灵长类动物的“支架”上培育人类血管细胞，这是通往人类生物肢体技术的第一步。与此同时，他们也开始在大鼠试验用人类成肌细胞替代小鼠成肌细胞并观察效果。不过，奥特指出，大量的后续工作必不可少，在满足人体测试要求的生物肢体出现之前，我们至少还需要等上10年。脱细胞处理的灵长类肢体。“这是一次值得瞩目的进步，而且具备坚实的科学基础，不过，哈拉尔德的团队还需要解决一些技术上的难题。”宾夕法尼亚州匹茨堡大学的史蒂芬﹒巴蒂拉克（Steven Badylak）评论说，他曾经在猪肌肉组织制成的支架上进行移植体培育，并在13名病人当中成功实现了腿部受损肌肉的再生。“在所有这些问题当中，血液循环可能是最棘手的一个，而且你必须确保内皮细胞能覆盖到最细小的毛细血管，这样它们才不会塌陷并导致血栓，”他说道，“不过，将已知的生物学基本原理投入实际应用其实是一个工程问题，工程师们就是这么做的。”其他一些研究者提出了更多批评意见。“对于手这样的复杂器官而言，其中的组织和结构实在太多了，因此这种方法肯定是不现实的。”奥地利维也纳大学的奥斯卡﹒埃兹曼（Oskar Aszmann）说，他曾经发明了一种可以用“意念”控制的仿生手。“而且，要想让一只手实现有意义的功能，就必须让它长满成千上万的神经，这在目前依旧是一个无法逾越的难关。所以，尽管这是一项很有价值的工作，但它在当前只能停留在基础研究阶段，而无法进入临床实践。”奥特设想，将来人类的器官捐赠计划或许也将囊括四肢捐赠。用于再生血管的细胞可以从受体的小血管中获得，而肌肉细胞则可从大腿等部位的大型肌肉中取得。“如果提取大约5克（的肌肉组织），就能从中培养出人类骨骼肌成肌细胞。”仅仅在美国就有150万的截肢者，因此此项肢体再生研究具有重要的意义，奥特如是说。“目前，如果你失去了胳膊腿，或是因为癌症治疗、烧伤等缘故损伤了部分软组织，能供你选择的治疗方案是很有限的。”（编辑：窗敲雨）

-- timsTOF fleX™ 为空间定位组学配置ESI/MALDI双源-- timsTOF Pro™ 系统进一步增强用于4D蛋白质组学的MBR-ddaPASEF和diaPASEF性能-- timsTOF Pro超高灵敏度的4D蛋白质组学和4D脂质组学性能推进单细胞生物学研究-- 用于4D蛋白质组学的新消耗品、软件合作伙伴及软件产品 2019年6月3日亚特兰大，在第67届美国质谱学会年会（ASMS）上，布鲁克宣布推出高度创新的新型质谱产品和工作流程： A. 空间定位组学（SpatialOMx™ ）生命科学和转化质谱成像布鲁克推出新型timsTOF fleX™ 质谱仪，包括适配于ESI timsTOF Pro™ 质谱的软件可切换的MALDI源。这种新型ESI /MALDI组合功能，可在单台质谱上实现空间定位组学SpatialOMx™ 。 timsTOF fleX配备布鲁克独有的10 kHz SmartBeam™ 3D激光源，具有真正的像素保真度，可在高空间分辨率下进行快速、无标记的MALDI成像，同时完全保持timsTOF Pro在ESI模式下无与伦比的4D蛋白质组学和表型组学的灵敏度。 利用这种独特的SpatialOMx方法，研究人员可以深入洞悉MALDI成像组织中的空间分子分布，从而指导4D组学分子表达研究，例如蛋白质、低水平癌抗原肽、脂质、聚糖、代谢物或那些用传统染色或标记技术无法观察到的分子。 在MALDI指导下的SpatialOMx方法中，使用者可用随后由ESI-TIMS/PASEF的dda（数据依赖采集），或者dia（非数据依赖采集） 4D蛋白质组学或4D脂质组学/代谢组学的数据，来开展细胞亚群的特异性靶向研究。两者现在都可以在同一台强大的仪器上进行，即timsTOF fleX，具有推进单细胞生物学研究所需的超高灵敏度，成为用RNA测序（RNA-seq）进行单细胞转录组学研究的完美补充。 南卡罗来纳医科大学蛋白质组学中心主任Richard Drake教授表示：“使用新型timsTOF fleX系统运行的样本，其数据在空间分辨率和聚糖覆盖深度方面是前所未有的。聚糖已成为组织和血清中潜在的临床标志物，用以监测身体的免疫状态，正常或非正常的衰老，timsTOF fleX的独特功能将大大加速该研究进程。 timsTOF fleX使得我们可将为癌症和免疫疗法的组织和生物流体分析开发的方法汇集在一个平台上。我可以看到这款仪器在许多研究领域中的无限应用，比如快速聚糖组织成像和生物流体4D组学分析。”布鲁克道尔顿执行副总裁Rohan Thakur博士补充说：“大多数组织蛋白质组学研究融合了来自不同亚群的细胞，其不期望的平均效应掩盖了许多重要的生物学和病理生物学信息。 在timsTOF fleX上，MALDI引导的SpatialOMx方法能够在空间上对指定的组织区域进行分析，从而允许随后的4D蛋白质组学选择性地对细胞类型的亚群进行靶向分析。功能强大、具有超高灵敏度的timsTOF fleX，在同一仪器上还提供nanoLC-TIMS-MS/MS，从而弥合了分子组织成像和体液分析间的鸿沟。这种独特的组合将使timsTOF fleX成为宝贵的研究工具，用于空间分辨的4D蛋白质组学和表型组学，并推动单细胞生物学、药物蛋白质组学和大细胞数量或患者队列的转化4D交叉组学的工作流程。 ” 布鲁克还推出IntelliSlides™ 样本智能载玻片，专门用于timsTOF fleX工作流程的自动化。IntelliSlides预先在导电表面上刻有软件可读的“示教标记”，以指示放置组织样本的位置、条形码和跟踪编号。 智能化的IntelliSlides消除了样本加载的低效率问题，因为它们本身就具有正确标记和正确定位，只需按一下按钮即可完成MALDI图像登记。 借助专业软件，IntelliSlides现在可以让每个人都能轻松完成MALDI成像。 此外，布鲁克推出SCiLS Lab 2020 MALDI成像软件，现已与MetaboScape5.0对接，可在spatialOMx中对组织分子图像中脂质和代谢物进行自动注释。这种独特的组合可自动将组织上测量的离子与代谢组学和脂质组学工作流程中的分子信息相匹配，从而在MALDI成像中突出显示生物学相关的通路信息。 Helmholtz药物研究所（HIPS）助理教授Daniel Krug博士评论说：“我们在药物研究和空间代谢组学领域使用质谱技术；尤其是分析新型天然产物的粘细菌次级代谢组。我们实验室多年来一直使用布鲁克的仪器和软件，特别是SCiLS Lab和MetaboScape；新分子成像工作流程集成了这两种软件解决方案，极大地简化并加速了整个MALDI成像流程。该流程将离子图像转换为分子图像，并提高了注释分子式的置信度。”新的集成成像和代谢组学工作流程还支持布鲁克scimaX™ MRMS平台以及新型timsTOF fleX的数据。 MetaboScape独特的T-ReX 2D算法在MALDI成像数据集中完成特征提取，识别同位素和离子解卷积。在MetaboScape中，使用SmartFormula™ 和来自公共数据库（如HMDB和LipidMaps）的分子信息，以精确质量和同位素保真度为基础，对分子特征进行注释。MetaboScape现在还提供了通过集成timsTOF分析的精确TIMS碰撞横截面（CCS）来提高ID得分置信度的独特能力；分子识别数据再送回到SCiLS Lab，获得分子成像的完整注释。SCiLS Lab是市场领先的质谱成像软件，而MetaboScape是识别代谢物标志物和通路映射的首选软件解决方案。 B. 4D蛋白质组学和4D表型组学创新diaPASEF和MBR-ddaPASEF在4D蛋白组学方面的研究进展通过将PASEF与数据非依赖采集（DIA）相结合，布鲁克公司与Matthias Mann，Ruedi Aebersold，Ben Collins和Hannes Roest科研团队合作，推出了革命性的diaPASEF技术，用于新一代的nLC-TIMS-MS/MS 4D蛋白质组学研究。虽然数据依赖采集（DDA）结合PASEF后具有无与伦比的离子利用率，使用短的nanoLC运行可大幅提高灵敏度和覆盖深度，但DDA的随机性会导致缺失值，通过diaPASEF工作流程、或用于ddaPASEF的Match Between Run（MBR），该问题得到显著改善。在2019年ASMS会议展示的新型diaPASEF工作流程，使用离子淌度域和质量数双重隔离窗口来触发MS/MS，可有效地用四极杆高灵敏度地传输母离子。利用PASEF固有的高离子利用率优势，新的diaPASEF工作流程通常可进一步提高30％离子利用率。如今该工作流程在分析200 ng的HeLa酶解液的120分钟单次实验中，定量了超过7,000种蛋白质。该实验的数据分析使用新的Mobi-DIK软件，它基于多伦多大学Hannes Roest教授组开发的OpenSWATH软件，可实现质量数、保留时间、离子淌度和信号强度的4D特征校准。布鲁克蛋白质组学副总裁Gary Kruppa博士解释说：“增加diaPASEF工作流程是解决自下而上蛋白质组学缺失值问题以及改进非标记定量（LFQ）的重要一步。 timsTOF Pro迅速赢得了使用短梯度获得组学更高覆盖深度的声誉，并由于其正交源和双TIMS漏斗设计提供了业界领先的仪器稳用性。此外， timsTOF Pro可获得稳定的肽段碰撞截面积（CCS）值，保证了diaPASEF工作流程中离子筛选和匹配的准确性，是增加蛋白质鉴定数量的基础，并且在ddaPASEF中使用CCS进行4D的Match Between Run（MBR），以进一步提高低丰度蛋白鉴定的数据完整性和LFQ性能。我们要感谢研发合作伙伴Matthias Mann，Ruedi Aebersold，Ben Collins和Hannes Roest团队在diaPASEF上最富有成效的合作，以及Juergen Cox博士对MBR-ddaPASEF进一步发展的贡献。马克斯-普朗克研究所的Juergen Cox 博士说: "我们为 timsTOF Pro 数据集开发了一种高度并行的4D 特征检测算法, 该算法提取离子的同位素峰型, 然后对m/z使用非线性拟合重新进行m/z校准, 并对保留时间、离子淌度、信号强度进行多维对齐。通过MS1 级CCS的Match Between Run (MBR), 可大大减少批量样品的蛋白非标记（label-free）定量中的缺失值问题,显著提高了分析的精确度和准确度。”用于4D 蛋白质组学的新耗材和软件Bruker和PreOmics公司宣布了一项共同开发和共同市场合作协议，该协议将重点关注timsTOF Pro上的PreOmics iST样品制备技术。 inStageTip（iST）技术可去除去垢剂，聚合物，盐，脂类和其他污染物，并具有出色的肽回收率。与常规试验方法相比，新的iST方法可实现稳定且可重现的样品制备，并具有显著的时间优势（节省超过40小时），iST适用于集成在半自动化，高通量样品制备的方案中。PreOmics公司董事总经理 Nils Kulak 博士和 Garwin Pichler 博士评论说: “我们非常高兴能与布鲁克合作开展端到端的工作流程合作，使蛋白质分析变得更高效，同时向我们高度重视的全球学术和生物制药的客户分享这些改进。我们相信，timsTOF Pro在4D蛋白质组学研究中的强大功能能够完美匹配我们的iST样品处理技术。”在蛋白质组学软件方面，布鲁克和Genedata宣布与Genedata Expressionist软件平台建立合作伙伴关系，该平台现在支持timsTOF Pro 4D组学数据格式。对最新timsTOF Pro数据文件原始格式的支持，简化并自动化分析流程，为蛋白质组学、代谢组学和生物治疗研究的数据分析提供了新的机会。利用timsTOF Pro的快速梯度进行智能的母离子选择获得深度的蛋白质组覆盖，结合Genedata Expressionist的可扩展性和速度，实现了新一代宿主细胞蛋白（HCP）的分析平台。布鲁克生命科学软件经理Peter Hufnagel博士进一步阐述：“我们的API驱动的开放数据文件格式理念，正在帮助加速将timsTOF数据应用到许多重要的第三方软件解决方案中。纳入Genedata Expressionist是生物制药客户要求进行HCP分析的重要步骤，由于我们的开放文件格式架构，Genedata迅速实现了这一目标。”Genedata Expressionist业务部负责人Markus Brosch博士说：“Genedata Expressionist建立在其经过验证的蛋白质组学分析能力的基础上，可以在检测限水平鉴定和定量宿主细胞蛋白质（HCP）。它独特地分析性能，支持广泛的HCP搜索和分析策略，为处理批量复杂蛋白质组学数据提供前所未有的分析速度和可扩展性。我们的合作客户现在不仅可以自动化、快速地进行HCP分析，还可以利用该软件平台满足蛋白质组学，代谢组学和生物治疗学表征的所有需求。“全新超高灵敏度4D脂质组学工作流程基于MetaboScape和CCSPredict™ 成功的基础，布鲁克宣布在timsTOF Pro和timsTOF fleX平台上推出了超高灵敏度4D脂质组学工作流程，展示了它在LC-TIMS-MS/MS分析时的高通量和高灵敏度。经过优化的全新PASEF 4D脂质组学方法现在在单次分析中可以鉴定的脂质数量几乎翻倍，同时获得阿托摩尔灵敏度。使用nanoLC-TIMS-PASEF这一创新工作流程，仅需数千个细胞，可以定量大约500种脂质，并且结果具有非常高的准确度和重现性；此外还可构建一个包含来自人血浆、小鼠肝脏和人类癌症细胞的1000多个具有精确CCS值的代谢物库。Max-Planck生物化学研究所的博士后和该研究的资深成员 Florian Meier博士补充说：“我们的研究建立了4D脂质组学方法，为使用高灵敏度PASEF技术的脂质组学铺平了道路。除了PASEF生成的全面MS / MS信息外，还可以利用TIMS能获得的高精度和高准确度CCS值来提高脂质的鉴定。此外，高精度CCS值为仪器学习技术提供了基础，并更准确地预测CCS值，并扩大脂质CCS值预测的应用范围。” 1. Parallel accumulation serial fragmentation combined with data independent acquisition (diaPASEF): Bottom up proteomics with near optimal ion usage, by Florian Meier, Andreas-David Brunner, Max Frank, Annie Ha, Eugenia Voytik, Stephanie Kaspar-Schoenefeld, Markus Lubeck, Oliver Raether, Ruedi Aebersold, Ben C Collins, Hannes L Rost, and Matthias Mann. 2. MaxQuant software for ion mobility enhanced shotgun proteomics, by Nikita Prianichnikov, Heiner Koch, Scarlet Koch, Markus Lubeck, Raphael Heilig, Sven Brehmer, Roman Fischer, Jürgen Cox. 3. Trapped ion mobility spectrometry (TIMS) and parallel accumulation - serial fragmentation (PASEF) enable in-depth lipidomics from minimal sample amounts, by Catherine G Vasilopoulou, Karolina Sulek, Andreas-David Brunner, Ningombam Sanjib Meitei, Ulrike Schweiger-Hufnagel, Sven W. Meyer, Aiko Barsch, Matthias Mann, and Florian Meier.

“我们通过冷冻电镜技术拿到了核孔复合体高分辨率的密度图。然后借助于 AlphaFold 结构预测，搭建出核孔复合体胞质环的精细模型。通过原子模型，为解释细胞核的运输机制，理解细胞生命活动的基本过程提供了重要的结构基础，同时也能为非常多相关的疾病提供重要的线索。”美国国家科学院院士、哈佛大学医学院生物化学及分子药理学教授团队表示。6 月 10 日，该课题组在 Science 上发表题为《核孔复合体胞质环的结构》的论文 [1]。图 | 相关论文（来源：Science）董颖、皮雄、彼得罗丰塔纳（Pietro Fontana）担任共同第一作者，吴皓担任通讯作者。图|吴皓（来源：吴皓个人主页）利用单颗粒低温冷冻电子显微镜和 AlphaFold 预测，确定了来自非洲爪蟾卵母细胞中一个接近完整的结构对于在该研究中 AlphaFold 所起到的作用，董颖表示，此次解析的核孔复合体（NPC，nuclear pore complex）是真核生物中最大的膜蛋白复合物之一，它位于核膜上，介导核膜内外的物质转运。由于其分子量巨大，组成成分复杂，动态变化多样，这使得电镜解析图谱的分辨率很有限（6-7 埃），并且搭建分子模型困难重重。但是 AlphaFold 的出现很好地弥补或一定程度上解决了图谱分辨率不足的问题，它可以预测很多没有结构的蛋白亚基，从而补充解释蛋白复合物结构里缺失的结构单元的高分辨信息；还可以预测部分亚基相互作用界面，从而说明亚基作用的结构基础以及生物学意义。另一方面，AlphaFold 预测也并非万能，它给出了诸多的可能性之后，课题组也需要理性分析哪一种结果最为合理，最能解释得清楚相关生物学现象。论文共同作者皮雄表示：“AlphaFold 能够预测出相互作用的蛋白亚基，与我们通过冷冻电子显微学计算出来的比较相符，从而大大方便了我们确定相互作用的蛋白亚基，进而加速我们模型搭建的过程。”图 | 皮雄（来源：皮雄）据悉，核孔复合体是细胞质和细胞核之间双向物质运输的管道。该团队利用单颗粒低温冷冻电子显微镜和 AlphaFold 预测，确定了来自非洲爪蟾卵母细胞的核孔复合体胞质环的一个接近完整的结构。使用 AlphaFold 预测核孔蛋白的结构，并以突出的二级结构密度作为指导，将核孔蛋白的结构拟合到中等分辨率的图谱中。利用 AlphaFold 进行复杂的预测，还可以进一步建立或证实某些分子间的相互作用。课题组鉴定了 Nup358 的 5 个拷贝的结合模式，这是最大的核孔复合体亚基，具有 Phe-Gly 重复序列，并预测它包含一个线圈-线圈结构域，在一定条件下可能作为成核中心辅助核孔复合体形成。核孔复合物是真核细胞核膜中的分子管道，可以调节细胞核和胞质溶胶之间生物分子的进出口，脊椎动物核孔复合体的分子量约为 110 至 125 MDa，直径约为 120 nm。核孔复合体被分为四个主环：胞质侧的细胞质环（CR，cytoplasmic ring），核膜平面上的内环（Inner Ring, IR）和管腔环 (Luminal Ring, LR)，以及面向细胞核的核环 (Nuclear Ring, NR)。每个环具有相似的八重对称，并由不同的核孔蛋白的多个副本组成。核孔复合体参与了许多生物过程，其功能障碍与越来越多的严重疾病有关。尽管在过去的 20 年里，许多团体进行了开创性的研究，但人们仍然缺乏对核孔复合体的组织、动态和复杂性的充分理解。图 | 董颖（来源：董颖）（来源：Science）预测核孔复合体中最大的蛋白 Nup358 具有 s-形球状结构域此次研究中，该团队使用非洲爪蟾卵母细胞，作为结构表征的模型系统，因为每个卵母细胞都有大量的NPC颗粒，因此这些颗粒可以在没有去垢剂提取的帮助下，在天然核膜上可视化。据悉，课题组使用单颗粒冷冻电子显微镜，来分析不同倾斜角度的数据并进行三维重建，之后用 AlphaFold 进行模型构建和结构预测，重建了 X.laevis NPC 的 6.9 和 6.7埃分辨率的全 CR 原聚体和一个核心区域，并使用 AlphaFold 预测了单个核孔蛋白的结构。对于任何模糊的亚基相互作用，该团队也预测了复杂的结构，这进一步指导了 CR 原聚物的模型拟合。他们将核孔蛋白或复杂结构置于 CR 密度中，以获得一个几乎完整的 CR 原子模型，由内部和外部 Y复合物、两个 Nup205 拷贝、两个 Nup214-Nup88-Nup62 复合物拷贝、一个 Nup155 和 5 个 Nup358 拷贝组成。值得注意的是，课题组预测了核孔复合体中最大的蛋白 Nup358 具有 s 形球状结构域，一个线圈结构域和一个含有苯丙氨酸-甘氨酸（FG）重复序列的 c 端区域，而先前显示形成的一个凝胶样的凝析相，可用于选择性物质通道。其中，四个 Nup358 拷贝夹在内部和外部 y 复合体周围以稳定 CR，第五个 Nup358 位于夹子簇的中心。另据悉，AlphaFold 还预测了一个同源低聚物，可能是 Nup358 的五聚体、卷曲螺旋结构，这可能为 Nup358 募集到核孔复合体提供亲合力，并降低 Nup358 在核孔复合体生物发生中凝聚的阈值。可以说，此次研究提供了一个整合的低温冷冻电子显微镜和结构预测的例子，可作为从中等分辨率密度图中、获得更精确的兆道尔顿蛋白复合物模型的新方法。该论文提出的更准确、以及几乎完整的 CR 模型，扩展了他们对NPC分子相互作用的理解，代表了向完整的NPC分子结构迈出的实质性一步，对NPC的功能、生物发生和调控具有影响。（来源：Science）有望成为结构生物学的规范该团队在论文中表示，几乎完整的 NPC CR 模型揭示了其内部的分子相互作用及其生物学意义。CR 组装的一个意想不到的方面是，他们观察到了 Nups 之间的组成和绑定模式的不对称性：其一，两个 Y 配合物之间的构象差异；其二，两个 Nup205 分子与 Y 配合物的结合模式不同；其三，两个 Nup214-Nup88-Nup62 配合物并排放置；其四，5 个 Nup358 配合物具有不同的结合模式。因此，这种不对称性是代表 CR 的基础状态、还是由放线菌素 D(Actinomycin D，ActD) 的结合引起的，以及它是否会是 NR、IR 或 LR 结构中的共同特征？这将是一个很有趣的问题。而研究人员的 X.laevis NPC 样本来自单倍体卵母细胞，这可能与体细胞中的核孔复合体有更大的不同。该团队认为，Nup358 的多个拷贝、及其低聚卷曲螺旋关联，解释了其在细胞质中卵发生过程中，作为NPC组装的关键驱动因素的作用，这不同于有丝分裂后和较慢的间期NPC组装。这一过程发生在内质网（ER，endoplasmic reticulum）的堆叠膜片上，称为环状膜层（AL，annulate lamellae），其苯丙氨酸-甘氨酸（FG，Phenylalanine-glycine）重复序列中的 Nup358复合物作为紧固件，从开始空间就可指导核孔复合体生物发生。这说明，Nup358 的低聚结构可能会降低 Nup358 复合体形成的阈值，从而有助于解释其在不同 Nups 中的成核作用。此外，课题组还提出了一种综合的方法，利用冷冻电子显微镜和 AlphaFold 结构预测的最新发展，从而带来了更精确的核孔复合体建模。在学界最近发表的论文或预印本论文中，也使用了类似的方法来确定核孔复合体的结构。AlphaFold 预测与传统结构建模不同，这是基于人工智能的建模方式。实现高分辨率的目标，是获得尽可能好的最佳模型。而在建模过程中，包含来自 AlphaFold 的信息，可能类似于该领域之前对立体化学约束所做的事情。随着复杂预测的能力更加普遍，该团队预计这种方法不仅有助于新结构的建模，而且有助于重新绘制以前的中分辨率低温电子显微镜图，成为结构生物学的规范。（来源：Science）董颖表示：“很多时候，我们采取科学的验证方式——用一系列生化实验对 AlphaFold 预测结果进行反向验证。我们利用人工智能，冷冻电镜与传统生物化学综合研究方式，推动了我们对复杂、动态的生物大分子的结构和功能的进一步理解。由此可见，AlphaFold 的出现给我们研究科学问题的方式也带来了革命性影响。我们在未来的科学研究中，只要大胆尝试，多方位思考，总能碰撞出美妙的火花！”担任论文共同作者的傅天民，目前在俄亥俄州立大学药学院，担任生物化学与药理学助理教授。其表示，该课题由他之前在吴皓教授实验室发起。他介绍了该研究的背后故事：2019 年初，吴皓教授与实验室的学生们，在佛罗里达参加美国生物化学与分子生物学年会。会后，吴老师带着学生们去吃火锅，饭桌上大家聊起结构生物学最重大的问题还有哪些，傅天民提出核孔复合物的结构是一个重要且没完全解决的问题，这个提议得到了吴皓教授的支持。回到波士顿后，王隆飞打算用酵母细胞来研究核孔复合物，傅天民则着手用非洲爪蟾的卵母细胞来研究。之所以选定爪蟾卵母细胞主要因为这类细胞易于获取，而且细胞核上有丰富的核孔复合物。后来，傅天民要去俄亥俄州立大学建立自已的实验室，课题转交给两个新来的博后董颖和 Pietro，他们两个紧密合作，克服了一系列技术难题，初步拿到了一些高质量的样品，收集了一些数据。随后，皮雄博士加入课题。皮雄博士和董颖博士通过大量的数据处理，为冷冻样品优化提供了正确的方向。最后通过大家几个月不懈的努力，利用进一步优化的高质量样品，收集了几万张冷冻电镜照片。最终皮雄博士通过冷冻电镜三维重构技术得到了高分辨率的密度图。Alex 利用 AI 结构预测对结构模型搭建起了重要作用。吴皓教授整个过程的支持、指导是课题得以成功的决定力量。董颖表示：“NPC是我进入吴老师实验室的第一个课题。现在回想起来整个研究经历都有些百感交集。当时我们‘白手起家，从零开始’。我从未接触过动物实验，我只能查找文献，自己摸索一切实验流程。中途可谓困难重重，我时常在解剖镜前解剖蛙卵，铺膜制样，一坐就是一整天。制样优化样品周期很长，我们寻找了各式各样的载网（因为不是所有载网在高角度拍摄的条件下都稳定），我做了很多载网稳定性的分析，光是优化样品就花了半年多。优化中途，陆续已有相关研究报道出现，当时我们整个团队几乎都要放弃。就在这时，皮雄博士通过大量的计算，得到了七埃左右分辨率的密度图。同时吴老师提议我们为模型搭建寻找新的切入点——恰逢AlphaFold横空出世，我们一不做二不休，立刻开启寻找冷冻电镜与AlphaFold对接的可能。”经过几个月没日没夜的计算、预测、模型搭建，课题组惊奇地发现新的研究方式带来了意想不到的研究结果。功夫不负有心人，最终他们非常有幸地与来自不同研究组的科学家们同台展示了研究结果。皮雄表示：“核孔复合体作为细胞生命活动的‘南天门’，严密调控着细胞的生命活动。作为一个功能如此复杂，形态巨大的复合体，它的精细结构是如此的严密和复杂。拿到它的精细结构也是非常困难。作为一个如此困难的课题，需要团队每个成员紧密合作，协同前进。每一部分工作都包含了团队每个成员的巨大努力。研究中，我主要负责冷冻电镜的数据处理，拿到高分辨率的核孔复合体的密度图，同时也参与了冷冻样品的优化。”（来源：Science）对于该成果的应用，董颖表示：“已经有相关研究报道说明NPC结构和功能的异常和许多疾病相关，例如神经退行性疾病阿尔兹海默症，介导了一些病毒如HIV的入侵，甚至会诱导一些癌症的发生。由于核孔复合体介导了很多重要物质的转运，其研究一直是近几年来科学界研究的一大热点。目前针对它的研究还处于相对基础的阶段，这主要受到它的复杂性，和动态性的局限。但就它推广到应用的可能性来讲，我认为只要我们能够把它‘看’得足够清楚，运动的原理理解的足够清楚，我们就有可能对它进行靶向药物设计，调节它的底物转运。给治疗人类疾病提供更多可能。最近几年来随着冷冻电镜技术和人工智能的进步，相信二者能共同推动其成为新兴药物靶点，逐步应用到疾病治疗。”对于后续计划，董颖表示：“我们队 NPC 的研究还只是冰山一角，后续有很多有趣的研究方向——现举几个例子：（1）由于核孔复合体底物众多，但出核和入核的底物的识别和转运机制如何？NPC 转运物质的孔道呈现有趣的胶状结构，这一结构高度动态，很可能在底物转运过程中发生相分离，我们可以借助单分子荧光标记来细化这些转录途径。（2）研究 NPC 的某些特定的活动状态，已经有研究报道酵母中可能存在多种 NPC 的状态和组装形式，这些结构组成具体参与了怎样的生物学功能还不清楚。（3）NPC 组装和解聚如何发生，特定组装状态下有哪些多辅助分子参与稳定其状态，这些我们可以联合质谱技术来鉴定新的作用亚基。”澳大利亚莫纳什大学药物科学研究所曹剑骏评价称，在本文中，该团队首先利用核孔复合体在非洲角蟾卵母的极高丰度这一特质，对天然膜环境中地核孔复合体进行直接观察，避免了可能存在人为纯化干扰。同时，课题组使用倾斜样品的方式，解决了膜蛋白样品在膜中的受限的角度分布，从而实现蛋白结构的三维重建。此过程中，该团队以令人敬佩的毅力手工选取了 20 万单颗粒样品，以实现整个核孔复合体的低分辨率（19 埃）结构，并集中于胞质环的局部结构解析得到中等分辨率（~7 埃）的电子云密度图。但这一分辨率依旧只能辨别大致的二级结构特征，而存在建模困难。因此，该团队尝试借助最新的 AlphaFold 基于序列的结构预测功能，由单个亚基、多亚基局部预测出发，实现整个胞质环的结构解析。该团队同时将基于 AlphaFold 的结果与传统的同源结构预测相对比，为蛋白结构工作者提供了一个优秀范例，展示了如何借助 AlphaFold 这一新工具解析未知蛋白结构。研究中，课题组同样也得到了核内环的信号，但是尚未得以解析，想来将来会由相应的工作面世，从而完备整个核孔复合物的结构信息。同时，该论文的蛋白结构分辨率受制于天然核孔结构的非均一性和单颗粒的人工手动筛选通量，而后者有希望得到 AI 辅助单颗粒筛选软件的帮助，从而解放研究人员双手实现以更多的单颗粒数据收集，最终有望解析出各类不同状态的核孔复合体结构，进一步阐述这一精妙的分子复合体的调节机制。-End-支持：Ren参考：1、Pietro Fontana et al., Structure of cytoplasmic ring of nuclear pore complex by integrative cryo-EM and AlphaFold. Science (2022) DOI: 10.1126/science.abm9326

科学进步所依赖的因素，按先后顺序可能是这几个：新技术，新发现，新思想。　　——悉尼博伦纳　　物理学离不开对撞机 天文学离不开望远镜 生物学离不开 PCR 仪。在人类科学进步的历程中，新技术的出现是新发明和新思想诞生的基石和前奏。　　岁末年初，The Scientist 杂志照例评选出了2016年生命科学领域的十大技术/仪器创新成果。其中既有足以颠覆基础生命科学研究、新药研发和临床检验的新平台，也有在既有技术基础上更进一步的重要新产品。　　值得一提的是，今年的10大创新成果榜单中，出现了更多与临床相关的发明。3D打印肾脏在培养皿中重现了人体器官的各项性质，精密设计的检测系统可以同时量化检测多个样品中多种类型的生物标记物：这些成果不仅可以助力实验室研究，也将改变我们的临床实践。这些进步让我们明白，技术创新所能造福的不仅仅是制造业、发明者和学术界，也包括全人类。第十名Thermo Fisher Scientific 公司GeneArt Platinum Cas9 核酸酶　　Thermo Fisher Scientific 公司在 CRISPR 试剂方面的一项突破成果——GeneArt Platinum Cas9 核酸酶，入选了今年的十大创新成果。在大肠杆菌中纯化的重组酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9 蛋白，即 GeneArt Platinum Cas9 包含了一段核定位序列，使其可以进入靶细胞的细胞核中。　　“我们一直坚信，稳定的性能、活性和纯度是十分重要的，”Thermo Fisher 的高级科学家、基因编辑工具和合成生物学研发经理 Jason Potter 说，“所以我们通过大量的检测，保证我们拥有十分稳健的纯化过程。”Thermo Fisher 下属 Potter 团队于2015年发表了一篇文章，显示 GeneArt Cas9 在多种细胞系中表现出高达85%的切割率(J Biotech, 208:44-53, 2015)。　　斯坦福大学干细胞生物学家 Matthew Porteus 在他利用体外基因编辑治疗血液疾病的研究中，使用了 GeneArt Platinum Cas9。目前他还在小鼠细胞中进行实验，但已经与 Thermo Fisher 公司达成了合作关系，希望将成果推向临床试验。在使用 CRISPR/Cas9 系统进行高效特异的基因编辑时，“我们遇到的问题是，已有的商业化 Cas9 酶是有毒性的，”他说。“[GeneArt Platinum Cas9] 现在已经成为了一种金标准，让我们能够获得其他试剂无法实现的结果。”　　25 µg 包装的 GeneArt Platinum Cas9 核酸酶售价150美元，顾客还可以联系 Thermo Fisher 的专家寻求实验设计帮助或讨论操作流程。Thermo Fisher 副总裁，生物合成业务总经理 Helge Bastian 说：“做基因编辑这一行的小技巧就是，手把手的告诉顾客用量和方法，告诉他们如何去获得更好的结果。”　　WILEY：该技术避免了基于载体的 Cas9 表达，至少在特定细胞系中大大加快了典型 CRISPR-Cas9 系统的工作流程。第九名Photometrics 公司Prime sCMOS 照相机　　有了现代显微镜，研究者们还需要高性能的照相机来记录样品图像。“每一年，这些照相机都变得越来越好，”Photometrics 产品经理 Rachit Mohindra 说(Photometrics 是一家专注于显微镜照相机和其他生命科学研究用图像系统的公司)，“它们基本上可以说是完美的。”要提升它们的完美程度是一项艰巨的任务，但是他认为他和他的团队通过4.2兆像素 Prime sCMOS 照相机做到了。　　这款产品在2016年初发布，其内置算法可降低散粒噪声(光学显微镜成像的固有波动)，这个过程不需要获取多个临时图像后综合处理，也不需要增加激光强度而破坏样品。Mohindra 说：“有了这个照相机，就可以保持低强度光照，让被观察细胞存活更久，获得更好的数据。”Prime照相机将信噪比提高了三到五倍，“这相当于把光强降低了10倍。”　　Prime sCMOS 照相机的内置算法还可以减少研究者需要采集数据的总量，缩短处理和分析时间。Mohindra 说：“不联网的情况下，每帧图片需要30秒的处理时间。”“如果你的照相机每秒可以摄取100帧，那么就需要花费5分钟来处理这1秒钟的数据。”但是如果使用 Prime 照相机，可以立即完成处理过程。　　“Photometrics 公司 Prime sCMOS 照相机的实时过滤和高帧性能，甚至可以使其捕捉到超分辨率显微镜的图像，更好的显示染色体结构变化，”瑞士洛桑联邦理工学院的 Kyle Douglass 在公司网站上写到。这款照相机售价15,950美元。　　STR?MVIK：高质量科研图片需求的增长伴随着对信息处理能力需求的增加。在照相机上安装现场可编辑逻辑门阵列是一条可行之路。第八名Horizon Discovery 公司Turbo GFP 标记 HAP1 细胞　　Horizon 公司的 HAP1 细胞已经连续三年入选年度十大创新成果榜单。2014年，CRISPR 编辑敲除细胞系入选(后被 Haplogen 公司出售) 2015年，用户定制敲除细胞系入选。2015年10月，Horizon 推出了 Turbo GFP 标记 HAP1 细胞，这种可在无需过表达特定基因的情况下对目的蛋白进行荧光标记的细胞系入选2016年度十大创新成果。　　Horizon 公司细胞系高级产品经理 Daniella Steel 说，相比于抗体标记，该技术的最大优势在于其简便性。“有别于抗体技术，使用该技术不需要鉴定和优化，可以直接对活细胞进行观察。”　　瑞典皇家理工学院的 Emma Lundberg 最近正在她的人类蛋白质图谱项目的工作中使用这种细胞。Emma 主管共聚焦显微镜下蛋白质亚细胞定位工作，她说基因的过表达有时会导致蛋白定位的假阳性或假阴性结果。“而现在你能看到你的标记物在哪里，并且知道它们是内源表达的，”她说，“HAP1 细胞操作起来很简单，很适合细胞成像工作。”　　由用户定制的此种细胞系售价3,400美元，制作周期大约16周。Horizon 还推出了一些用荧光标记蛋白标记特定细胞器的细胞系，售价1,450美元。Lundberg 认为，考虑到实验室中培养和鉴定细胞所花费的时间，这个价格很合理。　　Platt：这种基因改造细胞的进步在于，利用 CRISPR-Cas9 技术，这种细胞用 Turbo GFP 来标记基因??无需后续的免疫标记操作。　　Fishman：利用 CRISPR-Cas9 自释放标签，使用者可以得到 Turbo GFP 标记的蛋白。蛋白质的内源性标记优于外源性标记，并且更加可靠和经济。第七名908 Devices 公司ZipChip 微流体可分离质谱接口　　ZipChip 是一款从本质上加速了质谱分析方法的微流体设备，它将所需样品体积最小化，同时拓展了质谱分析可处理的样本范围。这个不足一英尺长的小盒子可以直接接入质谱仪，并通过其内置的载玻片大小的微流体芯片对样品进行处理。　　通常，准备质谱样品是一个耗时且容易出错的过程。ZipChip 减少了潜在复杂情况的发生。908 Devices 共同创始人，ZipChip 开发者 Chris Petty 说，“使用我们的前端设备，样品几乎不需要经过任何准备过程，即使样品中含有盐粒子、去垢剂或者其他基质，检测过程都不会受到影响。”　　Petty 说，使用毛细电泳法，ZipChip 可以在两到三分钟内分离出样品中的化合物，而液相色谱法需要长达一个小时。她还说，这一设备提供了更好的样品分离方法，可以对蛋白质、抗体以及抗体药物复合物等较难分离的分子进行分离。而且这种方法只需要几纳升样品。目前该设备售价30,000美元，配备自动进样器另加20,000美元。　　纽约大学代谢组学研究者 Michael Pacold 说，将 ZipChip 引入实验室拓展了他的研究项目，ZipChip 能够更加快速的获得数据，也可以测量更多来源的样品。“许多临床研究都只能从样品库中获得几微升的血浆样本，”他说，“如果没有 ZipChip 这样的技术，这些实验不可能开展。而现在不可能已经成为了可能。”　　Platt：毛细管电泳、样品分离和直接向质谱单元加样使小体积样品(ZipChip 可用几纳升)测定成为可能，并且可能在减少准备时间的同时降低检测成本、提高样品识别率。　　Unger：这一发明使用集成微流体技术作为质谱分析的前端，极大的提升了质谱分析的速度，同时还保留了样品的完整性。这将进一步促进质谱技术的普及，使其在研究领域和生物医疗领域得到更广泛的应用。第六名NanoStringTechnologies 公司nCounter Vantage 3D Panels　　2008年 NanoString 首次推出了 nCounter 分析系统，这个可以识别特定分子荧光条形码的自动化显微成像系统，可以对 mRNA 进行单分子定量检测。NanoString 计划将该技术从 mRNA 拓展至 DNA 序列和蛋白质的单分子定量。2016年，该公司终于达成这一目标，推出了 nCounter Vantage 3D Panels。　　“升级后的 Vantage 检测系统可以对 mRNA、DNA、蛋白质甚至蛋白质磷酸化位点进行电子计数，”NanoString 研发部高级副总 Joe Beechem 说。2016年4月，NanoString 推出了第一款 Vantage 检测系统，该系统可用于对肺癌和白血病样本的 RNA 电子计数，也可用于实体瘤释放的蛋白质和免疫细胞信号分子，以及 DNA 单核苷酸位点突变的检测。　　德克萨斯大学 MD安德森肿瘤中心系统生物学部主任 Gordon Mills 帮助研发了 Vantage 系统，并在安德森肿瘤中心扎耶德研究所将其应用于癌症的个性化治疗。“可用于实验室检测的平台很多，”他说，“但是没有一个能够和 nCounter Vantage 一样拥有结果稳定性和操作简便性，并且可以同时检测患者样本中的DNA、RNA 和蛋白质。”　　nCounter 分析系统售价149,000至280,000美元，使用 nCounter Vantage 3D Panels 测量单个样本需花费275美元或更多。不久的将来，NanoString 和 Mills 实验室计划推出能在单细胞水平上测绘生物分子空间分布的新版 Vantage 系统。　　Wiley：这项技术可以同时测量少量样品中的 DNA、RNA 和蛋白质丰度，凭借这一点，它有可能成为今年最大的技术突破。　　Str?mvik：这项技术推动了当前的肿瘤学研究，将来还有可能被应用于其他领域。这是一台能够测定多达800种指定 DNA、RNA 或蛋白质的设备。第五名Thermo Fisher Scientific 公司LentiArray CRISPR 文库　　CRISPR-Cas9 技术非常实用，被誉为使基因编辑大众化的革命性技术。Thermo Fisher Scientific 公司的 LentiArray CRISPR 文库于2016年9月面世，使这一技术在筛选性实验中的应用变得更加方便。该公司推出了一系列试剂，当它们被加入到任何人类来源细胞(无论是海拉细胞还是诱导多能干细胞)中时，每个细胞中会有一种基因被 CRISPR 敲除。　　美国西北大学的 Simone Sredni 主要研究一种名为恶性横纹肌样瘤的高侵袭性儿童肿瘤，最近她参与了该文库的黑盒测试。Simone 使用这一技术来筛查160种激酶突变后患者肿瘤细胞中产生的变化，从而找出影响细胞增殖和生长的突变。三个月后她得到了大部分的数据，并且发现了一些突变后可以减慢细胞生长的基因。“真的很快，”她说。仅仅用了一年多一点的时间，她就已经开始使用动物模型在体内测试这些激酶抑制剂的效果了。“如果没有这种筛查技术，我是绝对不可能做到的。”　　该文库有多个版本。用户可以从19个不同的基因集中任意挑选，定制属于自己的筛选方案，或者对18,000个基因进行无差别筛选。“它不仅是市场上最高效的筛查技术，还在为不同需求构建不同实验方案上给出了很大的可操作空间，”Thermo Fisher Scientific 合成生物学研发部高级主管 Jon Chesnut 说道。　　Sredni 说，每个文库售价10,000美元，可能有点小贵，但是对于想要从事高效筛选的实验室来说，物有所值。　　Str?mvik：任何将 CRISPR 技术带入高通量水平的工作都是值得关注的。　　Wiley：这是一个很好的辅助系统。虽然你也可以自己组建文库，但这个系统提供了一种寻找基因生理功能的合理方法。第四名Axion BioSystems 公司Lumos 光传输系统　　Axion BioSystems 公司于2015年10月发布的新产品 Lumos 光传输系统，让体外光遗传学操作变得更加精确和可重复。该装置上有48个孔，每孔中有4个可独立控制的 LED 灯，可以分别以百万分之一秒的精度闪出不同波长的光(蓝、绿、橙和红色)。将装置放置在下方配有记录仪的微阵列培养平皿之上，研究者可以利用设置好的程序对多个培养体系中的细胞进行刺激、操纵和测量。　　哥伦比亚大学遗传学家 David Goldstein 正在使用 Lumos，他利用这一技术研究带有不同致癫痫突变的体外培养人神经元细胞网络。他说：“长期以来，在癫痫精准医疗的大环境下，我们都在寻找一种中等复杂度，但是仍然高效的，可供我们筛选化合物的体外模型。”　　体外培养神经元网络倾向于同步产生突触放电，这就大大减少了研究者们能从这一体系中收集到的神经元行为数据。“更加复杂的细胞交流行为可能会揭示突变的致病机制，想要获得这些信息，我们就需要调制和测量神经元的行为。”Goldstein 同时表示，他对 Lumos 在接下来一年中的表现十分期待。“这个系统能帮我们做到这些。”　　Lumos 售价26,000美元。　　Unger：这一高通量光学激发系统是逐渐成形的生物光子学领域中的首个大规模实用装置。　　Platt：这个平台赋予研究者们精确掌控的能力。多光频大功率 LED 灯增加了光刺激的可控性，为研究特异性光控蛋白创造了更多的操作空间。第三名Pacific Biosciences 公司Sequel 测序系统　　Sequel 测序系统是 Pacific Biosciences 公司最新推出的一款单分子、实时(SMRT)测序仪，这款新测序仪的体积和重量不到该公司原始款长读长测序仪(long-read sequencer)的三分之一，而价格则是其一半。　　Sequel 在2015年秋季首次亮相，它可以提供与其同公司前辈 SMRT 测序仪 PacBio RS II 一样的长读长单分子测序服务。纽约市西奈山伊坎医学院的 Robert Sebra 从2015年10月开始使用这一系统，他认为与 PacBio RS II 相比，Sequel“是一款更高效的 SMRT 测序仪，在相同时间中可以得到更多的数据，满足更大规模的基因组学和生物学研究对分子层面的更高要求，同时也可以更加高效的进行宏基因组样本的分析。”　　2007年到2012年，Sebra 在 PacBio 公司工作的六年时间中，使用 SMRT 技术进行过多种实验研究，其中还包括人类基因组从头测序。“这种技术非常灵活，不管是用于研发(R&D)还是产物测序都很好用，”他说。“本质上来说，这一技术没有系统误差，可以在长读长测序中得到高质量的数据，从而更容易发现那些之前未被描述过的基因。”　　Sequel 测序技术在宏基因组学研究和感染性疾病研究中也有部分应用。Jonas Korlach 是 PacBio 公司的首席科学官，也是 SMRT 测序技术的共同发明人(Nature, 538:243-47, 2016)，他说这项技术最近被应用于制作一个韩国个体的参考基因组序列。2016年10月，万种脊椎动物基因组计划(G10K)和万种鸟类基因组计划(B10K)的领导者都积极宣布，将选择 SMRT 测序技术作为他们的一项主要技术。　　350,000美元的价格使得 PacBio 测序仪能够被更多的实验室接受。Korlach 说：“现在的 SMRT 已经人人可用了。”　　Fishman：Sequel 测序系统是在 Pacific Biosciences 之前版本基础之上的一大进步，它有更高的效率、更大的延展性，同时价格更加低廉。　　Str?mvik：虽然小型的实验室仍然负担不起，但这样的高效长读长测序技术是任何大型复杂基因组学研究、宏基因组学研究和宏转录组学研究都必不可少的。第二名Organovo 公司ExVive 3D 打印人类肾脏　　评估候选化合物是否具有肾毒性是药物研发的一个重要环节，但原有的细胞模型和动物模型只能近似的模拟人类肾脏。Organovo 公司研发的 ExVive 人类肾脏组织使用 3D打印技术构建，能够模拟人类肾脏近曲小管。这一发明为药物研发者提供了可靠的肾毒性测试方法。　　目前为止，几乎没有临床前实验可以确定潜在药物是否具有针对人类的毒性，这使得临床试验变得危险。识别肾毒性可以减低临床试验的风险。更重要的是，“这意味着可以保护参与临床试验的患者免受伤害，”Organovo 首席科学官 Sharon Presnell 说。　　3D生物打印与 3D塑料打印原理大致相同，Presnell 解释道，“不过我们放入打印机中的是小量聚合的细胞，而不是高分子聚合物粉末。”2014年，Organovo 出品的 ExVive 肝组织就在当年的十大创新成果榜中占据了一席之地，该公司依据具体合同为用户提供组织样本，具体价格根据客户需求的数量和种类有较大范围的浮动。　　Presnell 还说，替代性肾组织不仅可以用于毒理学研究，也可以为不能通过其他手段实现的肾组织研究提供平台。　　Ardea Biosciences 公司的新陈代谢和药物代谢动力学研究人员 Caroline Lee 对这种人造肾脏组织的转运蛋白表达进行了描述性研究，她表示：“这种组织的表现和真实肾脏组织几乎完全一样”。她发现组织中的定向转运蛋白可以正确地排列在膜上。“你可以看到药物沿着正确的方向被转运，”她说。“这很了不起。”　　Unger：这种从形态和功能上复制肾组织的方法十分新颖和大胆，这一发明打破了传统细胞培养模式在组织层面对药物毒性评估的限制。　　Fishman：这种技术可以用以替代临床前动物实验，减少我们在新药测试中对实验动物的依赖。通过在新药肾毒性测试中更好的模拟人类肾脏的生物学特性，它具有改变药物研发过程的可能。第一名ProteinSimple 公司Milo 单细胞蛋白质表达定量分析系统　　能够进行单细胞蛋白质印迹(Single-cell Western blotting)的仪器已经上市。这款名为 Milo 的台式仪器由加州大学伯克利分校的 Amy Herr 研究组发明，可以一次性对1,000 个单细胞中的特定蛋白质进行检测。使用者将细胞悬液滴加到一个1乘3英寸的玻璃载玻片上。这个特制的载玻片上覆盖着一层30微米厚的凝胶层，在其表面有约6,400个微孔。当细胞被滴加在凝胶层上时，细胞将进入这些微孔，有些微孔中会没有细胞，而大约1,000个微孔会被单个待测细胞填充。加入裂解细胞和使蛋白质变性的试剂后，施加电流使蛋白质进入孔间的凝胶中，并用紫外线激活凝胶中的化学试剂，使蛋白质被锁定在其中。　　Herr 实验室毕业研究生，ProteinSimple 公司现任市场总监 Kelly Gardner 说：“传统的蛋白印迹检测不能体现细胞间的异质性，因为传统技术是从集体层面分析样本的。Milo 让研究者们可以区分细胞亚群。”2014年6月对这项技术的概念描述首次发布时，学术界就对其产生了广泛的兴趣。在这种热烈响应的激励下，Herr、Gardnerand 和他们的同事 Josh Molho 创建了 Zephyrus Biosciences 公司，2016年3月该公司被 ProteinSimple 公司的母公司 Bio-Techne 收购。Bio-Techne 拒绝公开 Milo 的准确报价，但宣称每台 Milo 的价格与台式流式细胞仪相近，有意购买的研究者可以通过网站询价。由于产品刚刚问世，目前公司也还无法提供用户评论。　　Unger：新型的特制盖胶玻片省去了转膜的步骤，并且可以同时进行上千个单细胞的高效大规模分析。随着仪器价格的下降，对很多问题蛋白(例如电泳能力较差的蛋白)进行更加细致高效的研究成为可能，研究者们也能获得更多关于单细胞响应的信息，这是现在研究中非常重要的领域。　　Fishman：这是对已知技术进行低成本小空间改造一个榜样。通过同时测量细胞间蛋白质表达的异质性，这一技术大大节省了研究者的时间。　　评审小组成员JENNIFER FISHMAN　　麦吉尔大学生物医学伦理学部、医学社会学系副教授，社会学系及健康与社会政策研究所成员。毕业于加州大学旧金山分校，获得社会学博士学位。H. STEVEN WILEY　　西太平洋国家实验室资深研究员。参与建立了最早的部分受体调节计算机模型，因其在多种生物化学和光学定量分析方法方面的研究而闻名，这些模型和方法是评价细胞进程的基础计算模型。MANU PLATT　　佐治亚科技大学副教授，佐治亚理工大学Coulter生物工程学专业及艾莫利大学招生招聘主任。主要研究组织重塑、系统生物学，并借助计算和实验对多种疾病进行研究。BARRY UNGER　　波士顿大学行政管理副教授。创建或任职于库兹威尔电脑(即后来的 Xerox Imaging Systems)等多家公司。他还是MIT企业论坛的共同创始人和荣誉主席。MARTINA STR?MVIK　　麦吉尔大学副教授、麦吉尔生物信息中心植物学系主任。主要从事玉米和森林植物基因表达后功能学解剖结果研究。　　最终结果由评审小组从众多公司及使用者提名的入围产品中评选得出。评审小组完全独立于The Scientist 杂志，并对生命科学研究仪器及技术高度熟知。小组成员均与参评公司及产品无任何财务关系。

p　　2016年的十大创新产品包括了大胆的新平台，有望为基础生物学、药物研发和临床实验领域带来更多新发现。遗传学家们可能会陶醉于一台单分子长读长的测序新平台，而合成生物学家正渴望着CRISPR-Cas9技术的发展 这就如同生物学它本身，生物科学技术往往超过其各部分之和。/pp style="text-align: center"img style="width: 248px height: 400px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201612/insimg/934e051e-cc16-46be-8a49-001c2d987d9e.jpg" title="1.jpg" hspace="0" height="400" width="248" vspace="0" border="0"//pp　　值得一提的是，今年的十大创新产品名单中，出现了越来越多的临床相关技术，如合成人肾组织给培养皿里的组织赋予了器官特性。这些发明提醒着我们，创新和发展出现的时候，得益的不仅是生产商、开发商和学者，得益的还有人类。/pp　　从单细胞Western blotting机器，到简化质谱的微流控设备，今年的十大创新产品榜单是革命性的生物科学进步的颁奖礼。/pp　strong　ProteinSimple 》 Milo/strong/pp style="text-align: center"img style="width: 450px height: 241px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201612/insimg/6f28e7d4-c5ba-4ee4-a60e-a9ceb966e9ad.jpg" title="2.jpg" hspace="0" height="241" width="450" vspace="0" border="0"//pp　　Milo由加州大学的Amy Herr实验室研发，是一部单细胞Western blotting台式机器，研究者可以一次性在约1，000个单细胞找到特定的蛋白，他只需用移液枪加一滴细胞液到1x3英寸的玻片上，玻片上覆盖有30 um厚、点有6，400个微孔的凝胶层。细胞加到凝胶后，约有1，000个孔能够收集到单独的细胞，用于分析。然后实验人员加试剂，化学裂解细胞，让蛋白变性 用电荷把蛋白拉入孔间，再用UV灯激活凝胶里的化学药物，固定蛋白条带。/pp　　ProteinSimple的市场总监说：“传统Western不能体现异质性，而Milo可以鉴定亚单位。” Zephyrus Biosciences公司没有给出Milo的具体价格，只表明它与一部台式流式细胞仪的价格差不多。/pp　　strong评价员观点：/strong/pp　　Unger(下称U)评价：价格降下来的话，Milo可以用于蛋白的高效检测，并得到单个细胞的应答信息，这是现今很重要的一个探究领域。/pp　　Fishman(下称F)评价：这是让已有的技术价格更低，所占空间更小的一个例子，同时还节约了研究者检测细胞样本中蛋白表达异质性的时间。/pp　　strongOrganovo 》 ExVive Human Kidney Tissue/strong/pp style="text-align: center"img style="width: 600px height: 152px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201612/insimg/5dbf78f3-be5f-4b89-993b-af6a0f392846.jpg" title="3.jpg" hspace="0" height="152" width="600" vspace="0" border="0"//pp　　药物开发的一个关键是检测药物是否会损害肾脏，但现有的细胞培养和动物模型只能近似于人类的肾脏。来自Organovo 公司的ExVive Human Kidney Tissue是一种使用3D生物打印的肾脏近端小管复制品，为药物开发人员提供了一种可靠的肾毒性测试方法。/pp　　目前，很少有临床前测试可以确定一个药物对人体是否有毒，投资临床测试对研发商来说是一项风险，如果在早期发现肾毒性，就能让风险降低，更重要的是知道你在做的事对将要进行临床实验的患者真的没有危害。 生物打印的工作原理类似于3D塑料打印，但放进打印机不是聚合物珠子，而是小的细胞聚体。这个肾组织复制品还可应用于毒理学意外的领域，作为一个肾组织实验平台。/pp　　“它似乎和天然的肾组织一样完整。”Caroline Lee说。她是Ardea Biosciences的代谢和药物动力学研究员，检测人工组织中的转运蛋白表达。她发现定向运输蛋白可以沿着膜准确定向。“你可以看到药物往正确的方向走，这非常了不起。”/pp　　strong评价员观点：/strong/pp　　U评价：用一个这么创新且大胆的方法，复制形态和功能都有的肾组织，这项产品远优于传统的细胞培养法，具备了组织水平的预测能力。/pp　　F评价：这项技术可替代临床前动物试验，减低我们对实验动物检测新化合物的依赖性，有望更好地模拟人类肾脏生物学、检测新药物的肾毒性，给药物研发带来一场变革。/pp　　strongPacific Biosciences 》 The Sequel System/strong/pp style="text-align: center"img style="width: 318px height: 300px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201612/insimg/dda0f7b7-13e3-4fec-b759-1d2423e2c322.jpg" title="4.jpg" hspace="0" height="300" width="318" vspace="0" border="0"//pp　　Pacific Biosciences最新推出的单分子实时(SMRT)测序仪Sequel System比它家原始的长读长测序仪尺寸和重量至少小了1/3，价格减少了一半。/pp　　Sequel在去年秋天推出，与称为PacBio RS II的老SMRT测序仪有着相同的长读长和单分子分辨率，但它是SMRT的高通量版本，产出更快，能应对更大的基因组和更高的分子深度需求，如宏基因组样本。/pp　　PacBio的员工Sebra在过去的6年将SMRT技术应用于多个实验，包括人类基因组从头测序，他说：“它能灵活应用于研发和生产测序，基本上没有系统误差，做到了高质量测序数据与长读长融合，帮助发现新的基因组特征。”/pp　　Jonas Korlach，SMRT测序的发明人之一，说Sequel特别适用于宏基因组和传染病研究，最近用于韩国个体参考基因组的研究中(Nature， 538：243-47， 2016)。10月份，Genome 10K (G10K) 和Bird 10，000 Genomes (B10K)的领导人宣布选择SMRT测序作为主体技术。/pp　　PacBio测序仪在价格表上为US$350，000，将惠及更多的实验室。/pp　strong　评价员观点：/strong/pp　　Str.mvik(下称S)评价：虽然小的实验室很难负担，但是高通量、长读长测序仪是任何团队研究大型和复杂的基因组、宏基因组和宏转录组所必需的。/pp　　strongAxion BioSystems 》 Lumos/strong/pp style="text-align: center"img style="width: 450px height: 262px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201612/insimg/c93382bd-5eea-4597-beb7-e63fea8e53e2.jpg" title="5 (2).jpg" hspace="0" height="262" width="450" vspace="0" border="0"//pp　　Axion BioSystems在2015年12月首次发布的Lumos light-delivery system使体外光遗传学比以往更精确、重复性更好。这项设备上有48个孔，每个都有4个单独可控的LED，能闪烁不同波长的光：蓝、绿、橙、红，精确至微秒。把它放微阵列培养皿(microarray culture plate)上，recorder在下方固定，研究者就能刺激、操纵和测量各种细胞。/pp　　遗传学家David Goldstein已准备利用Lumos在他哥伦比亚大学的实验室里研究癫痫突变神经元网络的行为，他说：“我们已经花了很长时间找一个精准的癫痫药物环境，用于体外配培养基模型中，同时有足够高的通量可以筛选化合物。”/pp　　培养神经元网络趋于与它们的突触发射(firing)同步，这样实验者从它们的行为中获得的信息数量就会变少。为了获得更多的复杂行为，揭示突变带来的影响，研究者想要在检测应答的时候优化网络里的活动，而Lumos有望帮助研究者达到这个效果。/pp　　Lumos价格为US$26，000。/pp　strong　评价员观点：/strong/pp　　U评价：这个在多孔培养皿中的高通量光学刺激系统，是新兴的生物光子学领域出现的首台大范围的实用的仪器。/pp　　strongThermo Fisher Scientific 》 LentiArray CRISPR Libraries/strong/pp style="text-align: center"img style="width: 450px height: 250px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201612/insimg/34f19386-91e0-4b6a-8e82-57f865af6d0e.jpg" title="5.jpg" hspace="0" height="250" width="450" vspace="0" border="0"//pp　　CRISPR-Cas9技术因其易用性，被誉为让基因编辑大众化的技术。Thermo Fisher Scientific 九月推出的LentiArray CRISPR库，让筛选实验变得更简单。Thermo研发的试剂适用于多种人类细胞，从HeLa到诱导多能干细胞，都能使用CRISPR将基因逐个敲除。/pp　　来自美国西北大学的Simone Sredni正研究横纹肌样瘤(rhabdoid tumor)。她参与了这文库的优化测试，筛选患者肿瘤细胞中突变的160种激酶的作用，找出其中影响细胞增殖和生长的激酶。她在3个月后得到了原始数据，有几种酶的损伤确实使生长变慢。她说，这真的很快。她花费了一年多一点的时间，做到了体内动物模型这一步，检测抑制这几种酶之后的效果。她认为没有这个筛选实验的话，她无法找到这几种酶。/pp　　这个文库有不同的款。客户可以选择19个不同的基因集，定制化芯片，或者进行约18，000个基因的筛选。Thermo的合成生物学研发总监说：这不仅是市面上最高效的筛选技术，还为我们各种实验提供了更多选择。/pp　　Sredni认为，一个文库US$10，000起步有点贵，但是对实验室进行高通量筛选来说还是值得的。/pp　strong　评价员观点：/strong/pp　　S评价：任何将CPISPR运用到高通量水平的技术，至少值得一看!/pp　　strongNanoString Technologies 》 nCounter Vantage 3D Panels/strong/pp style="text-align: center"img style="width: 450px height: 385px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201612/insimg/80704840-5aa3-4ddd-b596-8f06954e90e9.jpg" title="6.jpg" hspace="0" height="385" width="450" vspace="0" border="0"//pp　　在2008年，当NanoString首次推出它的nCounter分析系统：一台能计算与靶分子结合的彩色条码的自动显微镜，目的是让量化 mRNA和DNA序列、蛋白计数的技术更成熟。今年，NanoString达到了这个目的，发布了nCounter Vantage 3D Panels。/pp　　Vantag试验扩展到能数字计数mRNA、DNA、蛋白，甚至同时检测蛋白的磷酸化情况。4月份，NanoString发布了首个Vantag试验，用于数字计数肺癌白血病样本的RNA、实体瘤生物学和免疫细胞信号通路相关蛋白，以及DNA的单个核酸突变。/pp　　Gordon Mills是安德森癌症中心的系统生物学系主任，参与研发Vantage panels，并应用于安德森个性化癌症治疗研究所。他说：“有很多平台可以用于人类样本检测，但是它们中没有谁具有nCounter Vantage system的鲁棒性、易用性和同时处理DNA、RNA和蛋白的能力。”/pp　　nCounter analysis system价格范围为US$149，000~$280，000，而nCounter Vantage 3D Panels每个样本的运行价格为US$275或以上。在不久的将来，NanoString 和Mills的实验室计划开展新的Vantage panels，添加单细胞范围的分子组成空间定向检测维度。/pp　　strong评价员观点：/strong/pp　　Wiley评价：这项产品可能是同时检测一个小样本中的DNA、RNA和蛋白丰度的最大的技术突破。/pp　　strong908 Devices 》 ZipChip/strong/pp style="text-align: center"img style="width: 450px height: 265px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201612/insimg/ffcec052-2324-4cf9-8ee5-2108826562b3.jpg" title="7.jpg" hspace="0" height="265" width="450" vspace="0" border="0"//pp　　zipchip是一个微流控装置，彻底地加快质谱的速度，只需要最小的样本量，扩大了质谱仪能掌握的样本范围。这个小盒子，不到1英尺长，直接搭载到质谱仪，能在一个显微镜玻片大小的微流控芯片上处理样本。/pp　　一般来说，准备质谱样本十分耗时，且容易出错。ZipChip减少了这种情况的发生。ZipChip的创造者Petty说：“有了这个前端，我们可以几乎不用怎么处理样本就进行分析，即使含有盐、去垢剂或其他基质。ZipChip利用毛细管电泳能在2~3分钟内分离样本组分，而液相色谱柱起码需要1 个小时。这个设备能更好地分离样本，例如蛋白、抗体、抗体和药物的交联物，这些都是其他技术很难分离的。不仅如此，它只需要几纳升的样本量。”这个设备售价US$30，000，自动进样器另外需要US$20，000。/pp　　Michael Pacold在纽约大学研究代谢组学，他说实验室里有一台ZipChip能让他的课题范围更广阔，因为他能从更多的资源中更快地获得数据。“很多临床实验你只能从库里拿到几纳升的血浆，没有像ZipChip这样的设备，无法完成这些实验。”/pp　　strong评价员观点：/strong/pp　　Platt评价：毛细管电泳，分离样品，只需一点样本就能直接快速完成质谱，费用可能更低，减少样本准备时间还能提高实验的准确性。/pp　　strongHorizon Discovery 》 Turbo GFP Tagged HAP1 Cells/strong/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201612/insimg/6d07e04b-06b1-4a05-b13a-89eda14b1347.jpg" title="8.jpg"//pp　　Horizon的HAP1细胞已经连续第3年赢得了The Scientist的十大创新产品称号了。在2014年，CRISPR基因敲除细胞系(由Haplogen发售)赢得了此称号 去年，Horizon的定制敲除细胞出现在十大榜单上 去年的10月，Horizon推出Turbo GFP Tagged HAP1细胞，不需要基因过表达就能让目标蛋白带上荧光标签，让Horizon又登上今年的榜单。/pp　　Horizon的细胞株产品经理说，使用这些细胞而不用抗体标记的其中一个主要原因就是简便。你不需要像使用抗体那样进行筛选和优化，你可以看到这些细胞活着的动态。/pp　　瑞典皇家理工学院的Emma Lundberg最近收到一批用于她的人类蛋白质图集计划(Human Protein Atlas project)工作的细胞。她负责使用共聚焦显微镜进行蛋白亚细胞定位，她说过表达有时会导致人工蛋白或蛋白的错误定位。而这些细胞产品的好处就是知道标签在哪里，且内源表达的时候它会在哪里。/pp　　strong评价员观点：/strong/pp　　F评价：Turbo GFP使用CRISPR-Cas9 self-releasing tag，内源标签蛋白比外源模型更好，结果更可信，价格更低。/pp　　strongPhotometrics 》 Prime sCMOS Camera/strong/pp style="text-align: center"img style="width: 450px height: 276px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201612/insimg/5cbf1917-067f-4981-a6c7-f5322f6ca89e.jpg" title="9.jpg" hspace="0" height="276" width="450" vspace="0" border="0"//pp　　研究者利用现代显微镜的高性能相机捕获样本的图片。Photometrics的产品经理Mohindra说：“每一年这些相机都变得越来越好，接近完美。”他承认，做到完美是很难的，但是他认为他和同事的研发的4.2 megapixel Prime sCMOS camera做到了。在2016年初发布的这台相机有内置的算法，能减少快门噪音，而无需增加光强度导致样本损伤。Mohindra说：“你可以维持低的光度，让细胞存活得更久，获得更好的数据。”Prime camera将信噪比提高了3至5倍，等于让光下调至10分之1。/pp　　Prime sCMOS camera的内置算法还减少了研究者收集的数据总量，加快运行和分析的次数。脱机加工时每一帧费时30秒，如果你的相机每秒获得100帧，那就需要50分钟来处理1秒的有效数据。如果使用Prime camera，研究者就能马上完成数据处理。/pp　　Photometrics Prime sSMOS camera的实时过滤和高帧速率可以捕获更多的超像素显微镜数据，更好地鉴别出染色体结构的变化。它的售价为US$15，950。/pp　strong　评价员观点：/strong/pp　　STR.MVIK评价：对高质量科学成像的需求同时增加了需要处理的信息。添加field-programmable gate array-technology到相机上，似乎可行。/pp　strong　Thermo Fisher Scientific 》 GeneArt Platinum Cas9 Nuclease/strong/pp style="text-align: center"img style="width: 450px height: 218px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201612/insimg/53fdc3ee-e56b-44cb-a9b0-abae4cbd464e.jpg" title="10.jpg" hspace="0" height="218" width="450" vspace="0" border="0"//pp　　除了LentiArray CRISPR Libraries，Thermo的另一个突出的CRISPR试剂同时获得了今年的十大创新产品——GeneArt Platinum Cas9 Nuclease。从E. coli提取的重组Streptococcus pyogenes Cas9 蛋白研发的GeneArt Platinum Cas9含有核定位信号，有助于靶细胞的核呈递。/pp　　Thermo的基因编辑研发经理Potter说：“我们知道这项产品最重要的是稳定的质量、活性和纯度，所以我们通过大量的试验确保提取的过程是高效的。”Potter的团队去年发表的文章表明GeneArt Cas9对多种细胞株的切割效率达到了85% (J Biotech， 208：44-53， 2015)。/pp　　Matthew Porteus是斯坦福大学的干细胞生物学家，他将GeneArt Platinum Cas9用于他的血液疾病活体外(ex vivo)基因编辑研究，目前使用的是小鼠细胞，已与Thermo合作进行临床试验。使用CRISPR/Cas9系统完成基因组编辑是高效而且具特异性的。他说：“我们的问题在于商用的Cas9蛋白前期准备，这对它们有毒性。GeneArt Platinum Cas9确实成为了金标准蛋白，我们获得了用其他试剂达不到的效果。”/pp　　一管25g的GeneArt Platinum Cas9 Nuclease售价US$150，客户可以咨询Thermo的专家，进行实验设计和整个实验步骤的咨询。/pp　　strong评价员观点：/strong/pp　　WILEY评价：这个试剂无需Cas9载体表达，至少能在特定的细胞株中极大的加快传统CRISPR-Cas9的工作流程。/pp　　strong评价员/strong/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201612/insimg/71dbc5d9-75bf-4de7-9f7e-5dd2851b9981.jpg" title="11.jpg"//pp style="text-align: center "strongJENNIFER FISHMAN/strong/pp　　Associate Professor in the Biomedical Ethics Unit and the Department of the Social Studies of Medicine and an Associate Member of the Sociology Department and the Institute for Health and Social Policy at McGill University. Fishman holds a Ph.D. in Sociology from the University of California， San Francisco./pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201612/insimg/31de23f3-626c-4ec7-ba7b-da8189c9d3d9.jpg" title="12.jpg"//pp style="text-align: center "strongBARRY UNGER/strong/pp　　Associate Professor of Administrative Services at Boston University. Unger has founded and participated in numerous companies， including Kurzweil Computer Products， Inc.， which became Xerox Imaging Systems. He is also cofounder and chair emeritus of the MIT Enterprise Forum./pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201612/insimg/19173ecc-1744-4a12-aa50-2fae2e9ecb86.jpg" title="13.jpg"//pp style="text-align: center "strongMARTINA STR.MVIK/strong/pp　　Associate Professor and Chair of the Department of Plant Science at McGill University' s McGill Centre for Bioinformatics. Str.mvik studies functional anatomy resulting from gene expression in crop and forest plants./p

近日，市民沈先生在三里屯“那匹萨”意大利餐厅就餐，喝下一杯服务员倒的“温开水”后嘴唇发麻，全身发抖，被送医抢救，医院诊断为服食除垢剂中毒。　　昨日，“那匹萨”负责人张女士承认因清洁工失误导致服务员将除垢剂倒给顾客，餐厅承诺承担沈先生治疗期间的所有费用，并就赔偿问题与沈先生家人进行协商。　　顾客喝“温水”后腹部剧痛　　沈先生妻子余女士回忆，2013年12月30日下午3点多，他跟沈先生去这家西餐厅吃饭，点完菜后要了两杯温水，结果服务员端来两杯凉柠檬水，沈先生让服务员换成温水。随后服务员倒了一满杯水给沈先生，沈先生先喝了一大口。　　“嘴巴都麻了、喉咙烧得厉害”，昨日已逐渐恢复的沈先生称，他当时全身都抖起来了，腹部剧痛。　　余女士立即叫来救护车，“一开始送到朝阳医院，医院了解情况后认为是中毒，必须送解放军307医院抢救，307医院诊断为除垢剂中毒，需要进一步治疗”。　　家属出具的一份307医院检验报告单显示，沈先生服食的液体pH值为2，含有苯甲酸。余女士介绍，截至昨日，沈先生的中毒症状逐渐好转，但对沈先生的内脏的损伤程度还需要胃镜检查后才知道。　　服务员误将除垢剂当开水　　在警方的帮助下，余女士了解到沈先生喝下去的是餐厅清洁用的除垢剂。在余女士保留的除垢剂的图片中，外包装上显示，“勿直接与皮肤接触、勿食、远离儿童”。　　昨日，餐厅法人代表张女士承认这次事故是餐厅的责任。据她介绍，事发当日下午3点左右，清洁工以为营业结束，于是将除垢剂加入热水壶除垢，没有标记就自行离开。这导致3点来接班的服务员在不知情的情况下将除垢剂加热，当做普通热水倒给了客人。　　中毒顾客将起诉西餐厅　　张女士表示，目前，西餐厅已将餐具的消毒除垢时间明确为每天晚上营业结束之后 改用食用白醋高温加热的方式除垢 同时对事故相关人员予以相应处罚。　　餐厅已承诺承担沈先生治疗期间的所有费用，目前正在就后期赔偿问题与沈先生家人进行协商。　　昨日，余女士表示，经过多次与餐厅沟通，均未达成赔偿协议。他们决定对餐厅提起诉讼。文章转载自：新浪网

一、项目基本情况项目编号：CLF0123ST00ZC17项目名称：2023年度汕头市质计所实验室试剂耗材采购项目采购方式：公开招标预算金额：1,185,918.00元采购需求：合同包1(2023年度汕头市质计所实验室试剂耗材采购项目（包组一）):合同包预算金额：389,196.00元品目号品目名称采购标的数量（单位）技术规格、参数及要求品目预算(元)1-1化学试剂和助剂标准品、标准溶液1(项)详见采购文件389,196.00本合同包不接受联合体投标合同履行期限：自合同签订之日起1年或者结算金额达到采购预算为止，以先到者为准。合同包2( 2023年度汕头市质计所实验室试剂耗材采购项目（包组二）):合同包预算金额：223,159.00元品目号品目名称采购标的数量（单位）技术规格、参数及要求品目预算(元)2-1化学试剂和助剂试剂1(项)详见采购文件223,159.00本合同包不接受联合体投标合同履行期限：自合同签订之日起1年或者结算金额达到采购预算为止，以先到者为准。合同包3( 2023年度汕头市质计所实验室试剂耗材采购项目（包组三）):合同包预算金额：573,563.00元品目号品目名称采购标的数量（单位）技术规格、参数及要求品目预算(元)3-1化学试剂和助剂实验室综合耗材1(项)详见采购文件573,563.00本合同包不接受联合体投标合同履行期限：自合同签订之日起1年或者结算金额达到采购预算为止，以先到者为准。二、获取招标文件时间： 2023年03月23日 至 2023年03月30日 ，每天上午 09:00:00 至 12:00:00 ，下午 14:30:00 至 17:30:00 （北京时间,法定节假日除外）地点：广东省政府采购网https://gdgpo.czt.gd.gov.cn/方式：在线获取售价： 免费获取三、对本次招标提出询问，请按以下方式联系。1.采购人信息名称：广东省汕头市质量计量监督检测所地址：汕头市东厦北路155号联系方式：0754-885322472.采购代理机构信息名称：采联国际招标采购集团有限公司地址：汕头市韩江路市自然资源局龙湖分局大楼4楼（汕头分公司）联系方式：0754-87290928、0754-872999283.项目联系方式项目联系人：纪女士电话：0754-87290928、0754-87299928

湖南某单位是一家俄语区国家实验室耗材、成套设备及通风系统的配套商，现需采购一批仪器设备及试剂，需要国内优质的生产企业对接，满足要求的生产厂商可与之联系。同时该单位将于2022年4月25日下午的“后疫情时代国产仪器的出海机会”网络研讨会上进行线上的采购交流会，届时会现场讲解采购需求及注意事项，满足要求的国内生产厂商也可点击报名参与下。采购产品清单如下（联系方式见文末）：Маркер гидрофобный ImmEdge Pen 免疫组化笔RNA Cleanup Kit (10 μg)трис(гидроксиметил)аминометан/Tris base, 99% 三羟甲基氨基甲烷Агароза 高纯度低电渗琼脂糖1-е антитела第一抗体Ligation Sequencing Kit (Q20+) 连接测序试剂盒 (Q20+)MinION Flow Cell (R10.4) 测序芯片Ultra-Long DNA Sequencing Kit超长DNA测序试剂盒Spermine tetrahydrochloride精胺四盐酸盐Short Read Eliminator Kit XL短读消除试剂盒 XLShort Read Eliminator Kit 短读消除试剂盒Gentra Puregene Tissue Kit组织试剂盒NEBNext RNA Depletion Core Reagent Set RNA 去除核心试剂套装NEBNext Small RNA Library Prep Set 1 小 RNA 文库制备套装 1Monarch HMW gDNA Tissue Lysis Buffer Monarch HMW gDNA 组织裂解缓冲液Monarch Protein Separation Solution Monarch 蛋白分离Monarch gDNA Wash Buffer RIPA裂解液Monarch gDNA Elution Buffer II gDNA 洗脱缓冲液 IIMonarch DNA Capture BeadsMonarch Bead RetainersMiSeq Reagent Kit v2 (50 cycle) 基因测序试剂盒v2 （50循环）Glycerin (glycerol), 50% (v/v) Aqueous Solution 甘油（甘油），50% (v/v) 水溶液Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous) 乙醇，纯（200 证明，无水）Вода UltraPure, не содержащая ДНКаз / РНКаз 不含 DNase/RNase 的超纯水Картридж BluePippin 2% агароза, без крас.,100-600 п.о., 层析柱 BluePippin 2% 琼脂糖，无染料，bp 100-600，Картридж BluePippin 3% агароза, без крас.,100-200 п.о., 层析柱BluePippin 3% 琼脂糖，无染料，bp 100-200，1-Bromo-3-chloropropane 1-溴-3-氯丙烷c dna synthesis kitc DNA合成试剂盒Reliance Select cDNA Synthesis cDNA 合成试剂盒N,N-Dimethylformamide N,N-二甲基甲酰胺MiSeq Reagent Kit v3 MiSeq 试剂盒 v3SP6 RNA Polymerase (20 U/µL) SP6 RNA 聚合酶 (20 U/µL)dUTP Solution (100 mM） dUTP 溶液（100 mM）Epredia™ Neg-50™ Frozen Section Medium Epredia™ Neg-50™ 冷冻切片培养基Обратная транскриптаза Mint 逆转录酶Эмбриональная бычья сыворотка (FBS, происхождение Южная Америка), 500 мл (-20°) 胎牛血清（FBS，原产南美），500 毫升（-20°）Agarose, low gelling temperature Type VII-A, 琼脂糖，低胶凝温度 VII-A 型，Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline, Dulbecco 的磷酸盐缓冲液Sony Sorting Chip-70um for SH800 and MA900 (box of 40) 适用于 SH800 和 MA900 的 Sony Sorting Chip-70um（40 盒）GM 6001 伊洛马司他 基质蛋白酶抑制剂Aphidicolin 艾菲地可宁Glutaraldehyde solution 戊二醛溶液Click-iT™ EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor™ 488 dyeGreen features 细胞增殖检测试剂盒Grid-Stick Glue (For recoating Grid-Stick)HEPES 4-羟乙基哌嗪乙磺酸High Sensitivity DNA Kit高灵敏度 DNA 试剂盒RNA 6000 Pico Kit RNA 6000 Pico 试剂盒RNA 6000 Nano Kit RNA 6000 纳米试剂盒Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 546 山羊抗大鼠 IgG (H+L) 交叉吸附二抗，Alexa Fluor™ 5465ml tips 吸头Axygen TF-1000Axygen T-300Стекла предметные Superfrost plus с углами 90° со шлифованной кромкой с зоной для маркировки белого цвета Superfrost plus 带有 90° 角的幻灯片和带有白色标记区域的磨边шт Планшет для 25 предметных тонких стекол, прозрачная крышка, ПЭ, 用于 25 个薄载玻片的板、透明盖、PE、Планшет на 50 ст. тонких предм. стекол, ПЭ, прозрачная крышка, белый, 用于 50个薄载玻片的板、白色、透明玻璃Grid-Stick KitGrid-Stick, uncoated 无涂层Staining Pipettes with 2 plugs 带 2 个塞子的染色移液器Filter Tips 10μl, 50 racks 带滤芯吸头Filter Tips 200μl, 50 racks 带滤芯吸头Filter Tips 1000μl, 50 racks 带滤芯吸头Дозатор 0,5-10 мкл, 8 каналов, biohit proline plus 8通道移液器Дозатор 10-100 мкл, 8 каналов, biohit proline plus8通道移液器Дозатор 30-300 мкл, 8 каналов, biohit proline plus8通道移液器Охлаждающий ПЦР-штатив, 0,2мл 低温PCR架 有机玻璃Охлаждающий ПЦР-штатив, 2мл 低温PCR架 有机玻璃Система обратного осмоса Angstra R-5C 实验室反渗透纯水机Редуктор давления 隔膜式减压阀 DRVN 1.5-6 barМанометр 压力表Картридж B150 Миди 滤芯椰壳活性炭 140X330Мешок 20л储水袋Комплект промывки 反渗透及管路清洗组件УФ лампа 双波长紫外灯Картридж умягчителя软化柱картридж сверхчистой воды 超纯化柱Патрон предварительной обработки预处理柱2 модуля обратного осмоса (RO модуля)反渗透柱SterilePlus (стерильный фильтр, Sartopore 2 150)Galileo 1214 Mini Gel Unit 水平电泳迷你凝胶系统 Pbs без кальция и магния Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline D5652-10L杜氏磷酸盐缓冲盐水 PBS 不含钙和镁Пробирки с оптически-прозрачной плоской крышкой объемом 0,2 мл 带光学透明平盖的试管，0.2 mlСуспензия магнитных частиц CleanMag DNA - 5 мл (пробирка 1 мл - 5 шт) BC35S 磁性粒子悬浮液 CleanMag DNA - 5 ml（管 1 ml - 5 pcs）пробирка 1 мл 悬浮液管1mlШтатив RA-20002 Компания Хеликон Артикул RA-20002 pcr变色冷冻盒Магнитный штатив для пробирок объемом 1.5-2.0 мл pcr PCR冷冻盒Суспензия магнитных частиц CleanMag DNA - 5 мл (пробирка 1 мл - 5 шт) BC35S磁力冷冻盒Штатив RA-20002 Компания Хеликон Артикул RA-20002 离心管托盘VWR (Amresco) Агароза (Biotechology Grade) Am-O710-0.5 500г VWR（Amresco）琼脂糖（生物技术级）Am-O710-0.5 500gEncyclo полимераза PK002L 0X смесь полимераз Encyclo, 5 x 100 мкл10X Encyclo буфер, 5 x 600 мкл 1000 р-ций объемом 25 мкл环聚合酶 PK002L 0X 环聚合酶混合物，5 x 100 µl10X Encyclo 缓冲液，5 x 600 µl 1000 25 µl p-tions 采购单位：湖南中星科技有限公司联系人：樊先生（总经理）联系电话：15388055177邮箱：282794290@qq.com还需要其他的试剂，请优质生产厂家直接发英文目录至邮箱，或添加微信（同手机号）。

“我们已经听到了这个消息，正在做相关的准备工作。”18日，一家民营诊断试剂企业的负责人对记者表示，生物试剂将被纳入今年的集中招标采购，目前企业已经成立了专门的政府事务团队研究此事。　　而高值耗材的集中采购，也在延迟2年后重新启动，在2011年重新进入卫生部的集中采购系统。高值专科医用耗材，一般指对安全至关重要、生产使用必须严格控制、限于某些专科使用且价格相对较高的消耗性医疗器械。　　“卫生部此举是为了降低医疗成本。”19日，一位接近卫生系统的人士对记者表示。　　集中采购延迟2年　　卫生部官员在近日召开的全国卫生系统纪检监察暨纠风工作会议上透露，2011年力争把试剂、耗材特别是高值医用耗材纳入集中采购。这是卫生部第一次把试剂纳入集中招标采购，而高值医用耗材在2008年已经启动过一次集中招标，但其后一直暂停。　　2004年，卫生部在北京、上海、浙江、广东等8省市进行高值医用耗材集中采购试点工作，目的是挤掉流通环节的价格水分，减轻患者的医疗费用负担。试点的范围为普遍使用的心脏介入类医用耗材、心脏起搏器、人工关节三大类产品。经过集中采购，耗材价格确有下降：心脏介入类耗材降价37.6%，人工关节降价24.3%，心脏起搏器降价15.2%。　　2007年6月，卫生部发布了《关于进一步加强医疗器械集中采购管理的通知》。《通知》规定，“甲类大型医用设备配置工作由卫生部审批，其集中采购由卫生部统一负责组织。心脏起搏器、心脏介入类等高值医用耗材临床应用的医疗机构少，各地采购价格差异大，价格虚高问题较为突出，由卫生部统一负责组织。”　　2008年，卫生部进行了第一次高值医用耗材集中采购，这也是卫生部第一次大规模采购医用耗材。这次集中采购，实现了部分医疗器械产品的全国统一价格，为全国制定统一的医疗服务收费价格奠定了基础。　　2008年的采集供应周期当时定为一年：从2008年10月1日至2009年10月1日。按以往惯例，最迟到2009年八九月份时应该再进行一次为2010年度准备的集采。但这一拖就拖到了今天。　　“一方面是集中采购牵涉的精力太多，药品的招标还没做好，卫生部就把器材这块先放一放，希望能够更谨慎一些做这件事。”业内人士告诉记者，其间的拖延还有一个重要原因，就是卫生部原打算把骨科这类器材从此前的各省市招标改成全国统一采购，但最终由于骨科器材的生产厂家多达上百家而未能实现，这项讨论最终无疾而终。　　延迟近2年后，卫生部此次再推高值医用耗材的集中采购，据知情人士透露，此次集中采购的模式还是采取各省市集中采购，而非全国性的。“毕竟，各省市的经济状况、实际情况差别较大，很难完全按一个标准进行采购。而且集中采购，出钱的是地方政府，采购权也理所当然归地方政府。”　　企业观望　　生物诊断试剂产业龙头铭源医疗市场部总经理董杰告诉记者，卫生部集中采购，将减少企业产品进入终端销售的流通环节，产品价格预计会有明显下调，这将对企业利润产生影响。“集中采购招标，不是一厂一价，最后往往是价格低的品种入标，造成企业间的竞争单纯以价格论，这是我们企业不希望看到的。”　　他坦言，2011年试剂进入卫生部集中采购，再进入国家统一的招标体系，是与铭源医疗过去的销售方式不同的新模式，但公司的多个产品拥有独立的知识产权，在集中采购上也会享有一定的优势。　　“政府集中招标采购的目的在于降低价格，但是如果导致过低的中标价，企业的正常利润也得不到保证，会影响产品的安全性。”另一家企业的负责人对记者表示，集中招标采购在一定程度上增加了企业负担，企业要重新设立一套班子与政府沟通，人力物力都要投入，“是企业所不希望的。”　　对此，北京秦脉医药科技发展有限公司总裁王波表示，集中采购，相当于“团购”，有利于降低药物和器材的价格，这项政策本身是没有问题的。但的确在执行过程当中有走偏的情况，比如低价品种“一中标就死”，“唯价格论”等，这些问题都需要在以后的执行中逐步规范。　　美敦力医疗用品技术公司一位业务经理对记者表示，集中招标采购，主要应用在适用范围较广，使用时间较长的医用耗材上，比如心脏起搏器和骨科等产品，目的是为了控制成本和规范使用。此次重新启动集中采购一事，政府此前的确已经跟企业做过沟通和了解，要求企业配合参与。　　业内人士指出，集中采购，直接目的就是降低价格，对产品价格偏高的外资企业的产品影响较大。对此，王波表示，短期内对外资企业的影响较大，高价产品受到了冲击。“但从另一个角度讲，如果外资企业的产品降到了与国内企业差不多的程度，他们的产品无疑更有竞争力。”　　董杰也指出，外资企业的产品的确比国内要贵。以铭源医疗的产品为例，价格只有罗氏、雅培等外资厂家的70%，如果卫生部集中采购要求降价，可能也会促使外资企业从高端市场向中低端市场进军。

到饭店吃饭，很多人都担心是否吃的是地沟油。9月25日，记者从中国农业大学食品科学与营养工程学院获悉，被卫生部今年5月份认可的3种有效快检“地沟油”方法之一的“地沟油多参数综合快速筛查方法”——“检测试剂盒”小包装，即将生产和销售。这种试剂盒能在半小时内快速测出“地沟油”。对此研发方表示，“检测试剂盒”只是初次筛选检验，准确率为80%，如果需要进一步确认是否是地沟油，还需要精密仪器检测。　　原理：让地沟油成分露出马脚　　据了解，国家卫生部关于地沟油的检测方法相关研究在经过广泛征求意见和反复的专家论证之后，目前已初步确定了4个仪器法和3个可现场使用的快速法，可用于“地沟油”的初筛，但目前这7种方法还在进一步验证和完善中。　　昨天，“检测试剂盒”的研发方，中国农业大学食品与营养工程学院食品安全快速检测中心、北京智云达科技有限公司的负责人告诉记者，这个检测原理是根据极性组分的指标，“地沟油”与食用油相比，其经过反复煎炸或高温加热等会产生一些物质，即便精炼也难以被取出，被称为“极性标志物”。通过检测“极性标志物”的多少，可以作为判定是否为“地沟油”的重要指标。极性标志物可与极性检测试剂反应显红色，极性标志物含量越高则红色越深。操作：有些复杂，半小时出结果。　　虽然说是“快速筛查”，但记者了解到，实验方法还是有些复杂。据介绍，这种试剂盒包含4个指标检测试剂，共需4个实验，分别得出结果后综合判断是否为地沟油。第一个实验用吸管取油样6滴置于试管中，向试管中加入1毫升检测液，摇动30秒钟，再将试管放入沸水中加热5分钟，取出后与标准管对比，呈现的红颜色深于标准颜色的，则被判定为阳性，即80%的可能性为“地沟油”。整个实验过程需要半小时。　　此外，还有3个实验分别对动物油脂、酸价腐败指标、水等只有“地沟油”可能含有的物质进行检测，通过4个实验的结果综合比对，确认是否为“地沟油”。　　市民吴女士在得知地沟油快速筛查方法出台后，不由心动，打算也买一个，以后到饭店吃饭，一测就知道是否是地沟油了。可是仔细研究完这个方法后，她放弃了这个念头。“太复杂了，还要放在沸水中加热，并不太适合老百姓使用。”　　效果：只能作为初筛，正确率80%　　今年5月，卫生部公布了7种有效的“地沟油”检测方法，其中3种为快速检测法，当时卫生部新闻办的工作人员表示，检测“地沟油”的方法是否有效，要通过“盲样测试”实验来进行考核。即将食用油和不同浓度的“地沟油”样品标号，给提供方法的科研机构检测，通过甄别出其中含“地沟油”的样品正确率，来确认其方法是否有效。研发方负责人反复向记者强调，“检测试剂盒”的准确率并不是100%，只能作为初筛，如果需要进一步确认是否是地沟油，还需要精密仪器检测。在卫生部“盲检”的40个样品中，快检试剂的正确率80%，算是一种较有效的检测方法。　　价格：“试剂盒”小包装约200元　　据了解，这种被卫生部认可的“地沟油多参数综合快速筛查方法”已完成实验室准备阶段，将正式投入生产和销售。据研发方透露，小包装试剂盒将在淘宝等网上渠道销售，销售价格是200元。　　反应：监管人员检测将更方便　　南京市食品药品监督管理局餐饮安全监管处处长陈滨告诉记者，对于基层监管人员来说，确定了地沟油检测方法之后，在日常的执法过程中将更加方便和便捷。快速检测方法虽然不能作为执法依据，但能够对餐馆的所用油品进行一个初步筛选，确定油品有问题之后，进一步送到实验室进行分析。在目前，南京药监部门的工作人员只能从源头进行监管，追溯餐馆购买食用油的渠道是否正规。　　链接：地沟油检测难度有多大　　地沟油的检测是个老大难问题，卫生部征集检测方法至今才有了初步结果。与此同时，网上也曾经一度流传一些辨别地沟油不靠谱的技巧。　　地沟油检测为什么这么难?据了解，当前我们所说的地沟油，实际上已不单单是字面意义上，从下水道打捞上来的油脂，而是作为废弃食用油的统称，包括地沟油、潲水/泔水油、煎炸老油、劣质动物油等。　　江南大学的油脂专家介绍，虽然质监部门和科研机构一直致力于找出各类废弃食用油脂的共通点，但是，由于废弃食用油的来源各不相同，经过各种加工和勾兑，结果，不仅包含的物质五花八门，含量也不尽相同。这给检测也带来了一定的困难。　　目前地沟油也分为“三六九等”，加工工艺好的地沟油拿到实验室里各项指标都很“漂亮”，大部分符合国家标准。　　专家告诉记者，地沟油和食用油都是以甘油酸脂为主要基本成分，但其他的油脂机体复杂，干扰因素多，而且目前造假者已经到了相当高的水平。

p　　今年政府工作报告提出，要充分尊重和信任科研人员，赋予创新团队和领军人才更大的人财物支配权和技术路线决策权。全国政协委员，华中科技大学基础医学院院长、同济医学院副院长鲁友明认为，我国研发(R& D)经费投入规模仅次于美国，研发经费投入强度达到2.12%，但科研管理水平，特别是科研仪器和试剂釆购体系仍然存在不少短板，亟需补齐。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201903/uepic/4a3d0c10-4f43-44bf-a877-deed43e7c0c4.jpg" title="f9dcd100baa1cd116c91c6f011f0b6f8c2ce2d25.jpeg" alt="f9dcd100baa1cd116c91c6f011f0b6f8c2ce2d25.jpeg"//pp　　鲁友明委员指出，当前我国在科研仪器和试剂釆购方面还存在诸多不足：/pp　　strong一是科研资金管理权限分散。/strong高校用于购置科研仪器设备的经费渠道主要包括学校自筹经费、国家专项、各类基金等。不同来源的项目经费由不同部门负责管理和分配，学校不能进行统筹，为科学合理的采购计划增加了难度。/pp　　strong二是经费下拨周期长，使用时效短。/strong每年9月财政下拨年度科研经费，同年12月必须执行完成。使用单位无法完成制定采购计划、编制采购预算、购置论证、技术标书编写、招标采购、合同签订等复杂程序的采购工作。同时，有关部门要求每年上报下一年度购置200万元以上科研仪器清单。这易导致当年急需科研仪器无法购买。落后的管理制度造成了有钱无法用、仪器无钱买和科研经费无法用等严重浪费的现象。/pp　　strong三是进口科研试剂采购时间长，质量低劣，价格昂贵。/strong目前高等院校和科研院所科研用试剂超过90%依赖进口，所采购的进口科研用试剂主要来于遍布全国近500家不同大小的试剂公司，采购时间周期过长，一般超过30天，而一般科研试剂需要6天内使用，不能满足科研需求。很多中介公司缺乏科研用试剂运输能力，导致运输过程中的试剂损坏。同时，一般进口试剂价格比国外生产厂商出口价格平均上涨至少一倍以上(如在美国售价280美元的抗体，在国内购买至少需要5000元)，严重浪费了科研经费。/pp　　为改善科研仪器和试剂釆购与管理，鲁友明委员提出建议。一是统筹管理，建立内控制度。财政部门和教育部门协调科研经费使用统筹管理，优化资源配置，提高资金使用效率。行政管理部门树立服务意识，建立内控制度，如“一次性告知制”“限时办结制”。二是延长经费使用时效。有关部门应取消每年上报下一年度购置200万元以上科研仪器清单的管理制度。前期已完成编制预算，正在进行的采购工作，应预留财政经费的额度以及延长使用时效，保证所采购的设备款项能够正常支付。三是对于高等院校进口科研用试剂，可考虑给予其加快海关通关及税费减免优惠等政策。/p

一、项目基本情况 项目编号：XJCC-ZB-2023-046 项目名称：新疆生产建设兵团医院医用试剂采购项目 预算金额（元）：12381053.75 最高限价（元）：561.60，32.00，22136.284，61104.997，19.80，520697.00，7865.00 采购需求： 标项一 标项名称: 新疆生产建设兵团医院医用试剂采购项目（第一包：国产医用试剂） 数量: 1 预算金额（元）: 549956.00 简要规格描述或项目基本概况介绍、用途：具体参数要求详见招标文件。 备注： 标项二 标项名称: 新疆生产建设兵团医院医用试剂采购项目（第二包：国产医用试剂） 数量: 1 预算金额（元）: 12800.00 简要规格描述或项目基本概况介绍、用途：具体参数要求详见招标文件。 备注： 标项三 标项名称: 新疆生产建设兵团医院医用试剂采购项目（第三包：国产医用试剂） 数量: 1 预算金额（元）: 489847.11 简要规格描述或项目基本概况介绍、用途：具体参数要求详见招标文件。 备注： 标项四 标项名称: 新疆生产建设兵团医院医用试剂采购项目（第四包：国产医用试剂） 数量: 1 预算金额（元）: 978820.59 简要规格描述或项目基本概况介绍、用途：具体参数要求详见招标文件。 备注： 标项五 标项名称: 新疆生产建设兵团医院医用试剂采购项目（第五包：进口医用试剂） 数量: 1 预算金额（元）: 10912.05 简要规格描述或项目基本概况介绍、用途：具体参数要求详见招标文件。 备注： 标项六 标项名称: 新疆生产建设兵团医院医用试剂采购项目（第六包：进口医用试剂） 数量: 1 预算金额（元）: 10017851.00 简要规格描述或项目基本概况介绍、用途：具体参数要求详见招标文件。 备注： 标项七 标项名称: 新疆生产建设兵团医院医用试剂采购项目（第七包：国产医用试剂） 数量: 1 预算金额（元）: 320867.00 简要规格描述或项目基本概况介绍、用途：具体参数要求详见招标文件。 备注： 合同履约期限：包 1、2、3、4、5、6、7，按院方要求供货 12个月。 本项目（否）接受联合体投标。二、获取招标文件 时间：2023年09月22日至2023年10月07日 ，每天上午00:00至12:00 ，下午12:00至23:59（北京时间，法定节假日除外） 地点：政采云平台线上获取（政采云平台https://www.zcygov.cn/） 方式：供应商登录政采云平台https://www.zcygov.cn/在线申请获取采购文件（进入“项目采购”应用，在获取采购文件菜单中选择项目，申请获取采购文件） 售价（元）：0 三、对本次采购提出询问，请按以下方式联系 1.采购人信息 名 称：新疆生产建设兵团医院 地 址：乌鲁木齐市天山区青年路232号 传 真： 项目联系人：夏丽 项目联系方式：0991-7580593 2.采购代理机构信息 名 称：新疆诚成工程项目管理有限公司 地 址：乌鲁木齐市水磨沟区红光山路2588号绿地中心101栋1806室 传 真： 项目联系人：赵雅琦 李颖 项目联系方式：19990210962 18690136275新疆生产建设兵团医院医用试剂采购项目-公开招标文件2023.9.18改后（发布版）.zip