培养管

经常会做小体积的液液萃取，一般都在离心管里完成后再离心分离的。但是进口的玻璃离心管实在太贵了，二百块钱一支。进口的玻璃培养管（比如Corning或者Pyrex的）很便宜。可以把培养管当离心管用吗？（离心转速一般不超过4000rpm)。谢谢～～

1、搅拌式动物细胞培养罐　　搅拌式培养罐靠搅拌桨提供液相搅拌的动力，它有较大的操作范围、良好的混合性和浓度均匀性，因此在生物反应中被广泛使用。但由于动物细胞没有细胞壁的保护，因此对剪切作用十分敏感，直接的机械搅拌很容易对其造成损害，传统的用于微生物的搅拌培养罐用作动物细胞的培养显然是不合适的。所以，动物细胞培养中的搅拌式培养罐都是经过改进的，包括改进供氧方式、搅拌桨的形式及在培养罐内加装辅件等。　　(1)供氧方式的改进　　一般情况下搅拌式培养罐还常伴有鼓泡，为细胞生长提供所需氧分。由于动物细胞对鼓泡的剪胞生长提供所需氧分。由于动物细胞对鼓泡的剪切也很敏感，所以人们在供氧方式的改进上做了许多工作。笼式供氧是搅拌式动物细胞培养罐供氧方式的一种，即气泡用丝网隔开，不与细胞直接接触。培养罐既能保证混合效果又有尽可能小的剪切力，以满足细胞生长的要求。北野昭一报道了一个经过改进的搅拌式动物细胞培养罐，整体呈梨形，搅拌置于培养罐底部，在搅拌轴外装了一个锥形不锈钢丝网与搅拌轴一起转动。轴心处的鼓泡管在丝网内侧鼓泡，丝网外侧的细胞不与气泡直接接触。　　(2)搅拌桨的改进　　搅拌桨的形式对细胞生长的影响非常大，这方面的改进主要考虑如何减小细胞所受的剪切力。有人对搅拌桨的形式作了改进，并在反应器内加装了辅件，实验证明改进后的反应器适用于对剪切力敏感的细胞进行高密度培养。反应器采用了一个双螺旋带状搅拌桨，顶部的法兰盖上安装了3块表面挡板。每块挡板相对于径向的夹角为30°，垂直插入液面。挡板的存在减小了液面上的旋涡。这个反应器维持了较小的剪切力，实验中用于昆虫细胞的培养，最终的培养密度达到6×106个/mL，成活率在98%以上。　　2、非搅拌式动物细胞培养罐　　搅拌式细胞培养罐用于动物细胞培养存在的最大缺点是剪切力大，容易损伤细胞，虽然经过各种改进，这个问题仍很难避免。相比之下，非搅拌式培养罐产生的剪切力较小，在动物细胞培养中表现出了较强的优势。　　(1)填充床反应器填充是在反应器中填充一定材质的填充物，供细胞贴壁生长。营养液通过循环灌流的方式提供，并可在循环过程中不断补充。细胞生长所需的氧分也可以在反应器外通过循环的营养液携带，因而不会有气泡伤及细胞。这类反应器剪切力小，适合细胞高密度生长。　　(2)中空纤维反应器中空纤维培养罐由于剪切力小而广泛用于动物细胞的培养。这类培养罐由中空纤维管组成，每根中空纤维管的内径约为200μm，壁厚为50～70μm。管壁是多孔膜，O2和CO2等小分子可以自由透过膜扩散，动物细胞贴附在中空纤维管外壁生长，可以很方便地获取氧分。　　(3)气升式细胞培养罐气升式生物反应器(airliftbioreactor)也是实现动物细胞高密度培养的常用设备之一，其特点是结构简单，操作方便。有人在气升式反应器中利用微载体培养技术，研究了Vero细胞高密度培养的工艺条件。证明气升式反应器中悬浮微载体培养Vero细胞，在加入适量保护剂、营养供应充足的情况下，细胞可以正常生长至长满微载体表面，终密度可达1.13×106个/mL。

大家在工作中怎样培养的高效工作的习惯?

对于微生物培养，大家常用的是恒温培养箱、霉菌培养箱、震荡培养箱、恒温水浴箱、发酵罐等，满足了日常工作需要；当然，这都是针对好氧菌而言。 而对于厌氧菌和兼性好氧菌，则需要考虑选用合适的厌氧、微好氧/低氧培养装置（如厌氧培养盒/袋、厌氧罐以及专业的厌氧培养箱、厌氧工作站、微好氧/低氧培养箱、厌氧发酵罐/反应池等）。 常规的动物细胞培养，一般选用CO2培养箱、滚瓶培养装置、悬浮培养装置、生物反应器/细胞培养罐等。为更接近或模拟体内微环境，三气培养箱（即CO2培养箱加配O2传感器）逐渐为人们所熟知！当然，更专业的Biospherix 系列O2/CO2控制器加培养盒、H35微好氧/低氧细胞培养箱、X vivo 一体化细胞工作站等三气培养装置也给大家提供了更多的选择！

1、生化培养箱外壳应可靠接地。 2、生化培养箱要放置在阴凉、干燥、通风良好、远离热源和日晒的地方。放置平稳，以防震动发生噪音。 3、为保证冷凝器有效地散热，冷凝器与墙壁之间距离应大于100mm。箱体侧面应有50mm间隙，箱体顶部至少应有300mm空间。 4、生化培养箱在搬运、维修、保养时，应避免碰撞，摇晃震动;最大倾斜度小于45度。 5、仪器突然不工作，请检查熔丝管(箱后)是否烧坏，检查供电情况。 6、本生化培养箱制冷工作时，不宜使箱内温度与环境温度之差大于25度。

生化培养箱是生物、遗传工程、医学、卫生防疫、环境保护、农林畜牧等行业的科研机构、大专院校、生产单位或部门实验室的重要试验设备生化培养箱维护和培养： 1、生化培养箱外壳应可靠接地。 2、培养箱要放置在阴凉、干燥、通风良好、远离热源和日晒的地方。放置平稳，以防震动发生噪音。 3、为保证冷凝器有效地散热，冷凝器与墙壁之间距离应大于100mm。箱体侧面应有50mm间隙，箱体顶部至少应有300mm空间。 4、培养箱在搬运、维修、保养时，应避免碰撞，摇晃震动；最大倾斜度小于45度。 5、仪器突然不工作，请检查熔丝管(箱后)是否烧坏，检查供电情况。 6、生化培养箱制冷工作时，不宜使箱内温度与环境温度之差大于

数显生化培养箱是生物、遗传工程、医学、卫生防疫、环境保护、农林畜牧等行业的科研机构、大专院校、生产单位或部门实验室的重要试验设备 数显生化培养箱维护和培养： 1、数显生化培养箱外壳应可靠接地。 2、培养箱要放置在阴凉、干燥、通风良好、远离热源和日晒的地方。放置平稳，以防震动发生噪音。 3、为保证冷凝器有效地散热，冷凝器与墙壁之间距离应大于100mm。箱体侧面应有50mm间隙，箱体顶部至少应有300mm空间。 4、培养箱在搬运、维修、保养时，应避免碰撞，摇晃震动；最大倾斜度小于45度。 5、仪器突然不工作，请检查熔丝管(箱后)是否烧坏，检查供电情况。 6、数显生化培养箱制冷工作时，不宜使箱内温度与环境温度之差大于25度。

[align=center][b][size=14pt][font=等线]如何做好细胞培养？[/font]—实验室细胞培养技术面面观[/size][/b][/align][align=center][size=11pt]会议时间[/size][size=11pt]：[/size][size=11pt]2020年[/size][size=11pt]4[/size][size=11pt]月[/size][size=11pt]17[/size][size=11pt][font=等线]日[/font]1[/size][size=11pt]4[/size][size=11pt]:00[/size][/align][b][size=12pt]内容[/size][size=12pt]介绍：[/size][/b][size=10.5pt]1. 细胞培养简介[/size][size=10.5pt]；[/size][size=10.5pt]2. 细胞培养实验室[/size][size=10.5pt]：实验室安全等级、培养设备[/size][size=10.5pt]/耗材[/size][size=10.5pt]、无菌技术；[/size][size=10.5pt]3. 细胞培养基础[/size][size=10.5pt]：细胞系、细胞培养环境（[/size][size=10.5pt]PH，CO2浓度，温度，湿度）[/size][size=10.5pt]；[/size][size=10.5pt]4. 细胞培养方案[/size][size=10.5pt]：贴壁细胞传代、悬浮细胞传代、细胞冻存、细胞复苏、细胞计数；[/size][size=10.5pt]5. 细胞培养常见问题[/size][size=10.5pt]：细胞污染、细胞太稀、细胞消化过度、细胞复苏状态不佳。[/size][b][size=12pt]讲师[/size][size=12pt]介绍：[/size][size=11pt]雷俊[/size][size=11pt]:[/size][/b][size=11pt]北京大学细胞生物学博士博士研究生期间，主要从事细胞周期事件与肿瘤发生关系的研究，具有细胞生物学、蛋白质组学等学科背景，精通分子细胞生物技术、成像技术等研究手段。现任瑞沃德生命科技有限公司细胞产线产品经理。[/size][b]报名地址：[/b][url=https://www.instrument.com.cn/webinar/meeting_10287.html][u][font='Times New Roman'][color=#0000ff]https://www.instrument.com.cn/webinar/meeting_10287.html[/color][/font][/u][/url]

细胞培养FAQ： 1 冷冻管应如何解冻？ 取出冷冻管后， 须立即放入37 °C 水槽中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿， 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须注意安全， 预防冷冻管之爆裂。 2 细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO？ 除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后， 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。 3 可否使用与原先培养条件不同之培养基？ 不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基， 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。 4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？ 不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源， 所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清， 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。 5 何谓FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼， 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。 6 培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？ 一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统， 而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时， 则应使用5 % CO2 培养细胞。 7 何时须更换培养基？ 视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。 8 培养基中是否须添加抗生素？ 除于特殊筛选系统中外， [font=宋

01糖发酵管：包括蔗糖发酵管，乳糖发酵管，水杨苷发酵管等等02 ONPG培养基：现常配制成现成的生化管03西蒙氏柠檬酸盐培养基 04缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR和VP试验用) 05克氏柠檬酸盐培养基 06丙二酸钠培养基 07葡葡糖铵培养基 08 Hugh-Leifson培养基(O/F试验用) 09 马尿酸钠培养基 10营养明胶 11苯丙氨酸培养基 12 氨基酸脱羧酶试验培养基 13蛋白胨水(靛基质试验用) 14 硫酸亚铁琼脂(硫化氢试验用) 15 尿素琼脂 16 氰化钾(KCN)培养基 17 氧化酶试验 18 硝酸盐培养基 19 细胞色素氧化酶试验 20 过氧化氢酶试验 21 过氧化物酶试验 22 磷酸盐缓冲液 23明胶磷酸盐缓冲液 24 乳酸-苯酚溶液 25 肉浸液肉汤 26肉浸液琼脂 27牛肉(或牛心)消化汤 28血消化汤 29豆粉琼脂 30血琼脂 31营养琼脂 32营养肉汤 33 乳糖胆盐发酵管 34乳糖发酵管 35 EC肉汤 36 缓冲蛋白胨水(BP) 37 氯化镁孔雀绿增菌液(MM) 38 四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB) 39 四硫磺酸钠煌绿增菌液(换用方法) 40 亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC) 41 GN增菌液 42 肠道菌增菌肉汤 43 亚硫酸铋琼脂(BS) 44 DHL琼脂 45 HE琼脂 46 SS琼脂 47 WS琼脂 48 麦康凯琼脂 49 伊红美蓝琼脂(EMB) 50三糖铁琼脂(TSI) 51 三糖铁琼脂(换用方法) 52 克氏双糖铁琼脂(KI) 53 克氏双糖铁琼脂(换用方法) 54 葡萄糖半固体发酵管 55 5%乳糖发酵管 56 CAYE培养基 57 Honda氏产毒肉汤 58 Elek氏培养基(毒素测定用) 59 氯化镁孔雀绿羧苄青霉素培养基 60 胰蛋白胨水 61 Rustigian氏尿素培养液 62 氯化钠结晶紫增菌液 63 氯化钠蔗糖琼脂 64 嗜盐菌选择性琼脂 65 3.5%氯化钠三糖铁琼脂 66 氯化钠血琼脂 67 3.5%氯化钠生化试验培养基 68 改良磷酸盐缓冲液(小肠结肠炎耶尔森氏菌专用) 69 CIN-1培养基 70 嗜盐性试验培养基

01糖发酵管：包括蔗糖发酵管，乳糖发酵管，水杨苷发酵管等等02 ONPG培养基：现常配制成现成的生化管03西蒙氏柠檬酸盐培养基 04缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR和VP试验用) 05克氏柠檬酸盐培养基 06丙二酸钠培养基 07葡葡糖铵培养基 08 Hugh-Leifson培养基(O/F试验用) 09 马尿酸钠培养基 10营养明胶 11苯丙氨酸培养基 12 氨基酸脱羧酶试验培养基 13蛋白胨水(靛基质试验用) 14 硫酸亚铁琼脂(硫化氢试验用) 15 尿素琼脂 16 氰化钾(KCN)培养基 17 氧化酶试验 18 硝酸盐培养基 19 细胞色素氧化酶试验 20 过氧化氢酶试验 21 过氧化物酶试验 22 磷酸盐缓冲液 23明胶磷酸盐缓冲液 24 乳酸-苯酚溶液 25 肉浸液肉汤 26肉浸液琼脂 27牛肉(或牛心)消化汤 28血消化汤 29豆粉琼脂 30血琼脂 31营养琼脂 32营养肉汤 33 乳糖胆盐发酵管 34乳糖发酵管 35 EC肉汤 36 缓冲蛋白胨水(BP) 37 氯化镁孔雀绿增菌液(MM) 38 四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB) 39 四硫磺酸钠煌绿增菌液(换用方法) 40 亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC) 41 GN增菌液 42 肠道菌增菌肉汤 43 亚硫酸铋琼脂(BS) 44 DHL琼脂 45 HE琼脂 46 SS琼脂 47 WS琼脂 48 麦康凯琼脂 49 伊红美蓝琼脂(EMB) 50三糖铁琼脂(TSI) 51 三糖铁琼脂(换用方法) 52 克氏双糖铁琼脂(KI) 53 克氏双糖铁琼脂(换用方法) 54 葡萄糖半固体发酵管 55 5%乳糖发酵管 56 CAYE培养基 57 Honda氏产毒肉汤 58 Elek氏培养基(毒素测定用) 59 氯化镁孔雀绿羧苄青霉素培养基 60 胰蛋白胨水 61 Rustigian氏尿素培养液 62 氯化钠结晶紫增菌液 63 氯化钠蔗糖琼脂 64 嗜盐菌选择性琼脂 65 3.5%氯化钠三糖铁琼脂 66 氯化钠血琼脂 67 3.5%氯化钠生化试验培养基 68 改良磷酸盐缓冲液(小肠结肠炎耶尔森氏菌专用) 69 CIN-1培养基 70 嗜盐性试验培养基

细胞培养知识1 冷冻管应如何解冻？ 取出冷冻管后， 须立即放入37 °C 水槽中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿， 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须注意安全， 预防冷冻管之爆裂。 2 细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO？ 除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后， 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。 3 可否使用与原先培养条件不同之培养基？ 不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基， 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。 4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？ 不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源， 所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清， 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。 5 何谓FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼， 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。

1．厌氧缸法。接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。2．厌氧袋（Bio-bag）即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。塑料袋透明而不透气，内装气体发生管（有硼氢化钠的碳酸氢钠固体以及5%柠檬酸安瓿）、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。先折断气体发生管，后折断美兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育。3．厌氧手套箱（Anaerobie glovebox）是迄今为止国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之一。它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作，故名。箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着。欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气和换气（H2，CO2，N2）达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门。箱内保持厌氧状态，也是利用充气中的氢在钯的催化下和箱中钱残余氧化合成水的原理。该箱可调节温度，本身是孵箱或孵箱即附在其内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的大量培养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。金属硬壁型厌氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均系自动调节。4.厌氧盒：原理同厌氧袋，有成品销售。5.生物耗氧法：在一密闭的容器内放以生物（多是植物），消耗氧气，同时产生二氧化碳，供细菌生长用。6.焦性末食子酸法：在一洁净的玻片上铺上纱布或滤纸，均匀撒上焦性末食子酸，然后再混入NaHCO3粉末或NaOH溶液，迅速将已接种细菌的平板倒扣在上面，用融化的白蜡封边，造成一个封闭空间。焦性末食子酸与碱反应后耗氧。该法用于厌氧不严格的厌氧菌的培养，简单。如有梭状芽孢杆菌。7.疱肉培养基：本身就是一个不需特殊设备的厌氧培养法。疱肉和肉汤装入大试管，液面封凡士林，造成无氧环境。

做粪大肠菌群的时候，初发酵就需要15个管子，再加上管架等，如果一次10多个样、、、这培养箱该多大呢？

大多数细菌均可以通过人工方法培养，而衣原体和病毒的分离培养往往需要活组织、鸡胚、特殊细胞株及动物接种。只有将微生物培养出来才能对它进行研究、鉴定和应用。一、接种与分离方法根据待检标本的性质、培养目的和所用培养基的种类，采用不同的接种方法。1．平板划线分离培养法对混有多种细菌的临床标本，采用划线分离和培养，使原来混杂在一起的细菌沿划线在琼脂平板表面分离，得到分散的单个菌落，以获得纯种。临床送检的标本如痰、咽试子、泌尿生殖道的分泌物和粪便等细菌检验均需要借助琼脂平板划线分离目的菌。平板划线分离法通常有两种方法：（1）分区划线分离法：此法常用于含菌量较多的标本如痰、泌尿生殖道的分泌物和粪便或混合细菌的分离。先用接种环挑取标本涂布于琼脂平板1区（占培养基总面积的¼）并作数条划线，再于2、3、4区依次划线。每划完一个区域，均将接种环烧灼灭菌1次，冷后再划下一区域，每一区域的划线均与上一区域的划线交接1~3次。一个成功分区划线的平板，培养后分别观察1区形成菌苔，2区菌落连成线，3区和4区可分离到单个菌落。（2）连续划线分离法：此法常用于含菌量不多的标本或培养物中的细菌分离培养。方法是先将接种物在琼脂平板上1/5处轻轻涂抹，然后再用接种环或拭子在平板表面曲线连续划线接种，直至划满琼脂平板表面。琼脂斜面接种法主要用于菌落的移种，以获得纯种进行鉴定和保存菌种等。用接种环（针）挑取单个菌落或培养物，从培养基斜面底部向上划一条直线，然后再从底部沿直线向上曲折连续划线，直至斜面近顶端处止。生化鉴定培养基斜面接种，用接种针挑取待鉴定细菌的菌落，从斜面中央垂直刺入底部，抽出后在斜面上由下至上曲折划线接种。3．穿刺接种法此法多用于半固体培养基或双糖铁、明胶等具有高层的培养基接种，半固体培养基的穿刺接种可用于观察细菌的动力。接种时用接种针挑取菌落，由培养基中央垂直刺入至距管底0.4cm处，再沿穿刺线退出接种针。双糖铁等有高层及斜面之分的培养基，穿刺高层部分，退出接种针后直接划线接种斜面部分。4．液体培养基接种法用于各种液体培养基如肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等的接种。用接种环挑取单个菌落，倾斜液体培养管，在液面与管壁交界处研磨接种物（以试管直立后液体淹没接种物为准）。此接种法应避免接种环与液体过多接触，更不应在液体中混匀、搅拌，以免形成气溶胶，造成实验室污染。5．倾注平板法本法主要用于饮水、饮料、牛乳和尿液等标本中的细菌计数。取纯培养物的稀释或原标本1ml至无菌培养皿内，再将已融化并冷却至45~50℃左右的琼脂培养基15~20ml倾注入该无菌培养皿内，混匀，待凝固后置37℃培养，长出菌落后进行菌落计数，以求出每毫升标本中所含菌数。先数6个方格（每格为1cm2）中菌落数，求出每格的平均菌落数，并算出平皿直径，然后按下列公式计数，求出每毫升标本中的细菌数。全平板菌落数=每方格的平均菌落数×лr2每ml标本中的细菌数=全平板菌落数×稀释倍数6．涂布接种法本法多用于纸片扩散法药敏试验的细菌接种。将一定量或适量的菌液加到琼脂培养基表面，然后用灭菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反复涂布，使被接种液均匀分布于琼脂表面，然后贴上药敏纸片，或直接培养，本法经培养后细菌形成菌苔。

培养结核杆菌的培养基，从性状上分主要有固体培养基、液体培养基、半流体培养基、固液双相培养基等类型，这些培养基各有特点。　　1.1 固体培养基 最常用的是罗氏（Lownstein-Jenson，L-J）培养基，也是最具代表性的一种，其他的还有小川辰次（Tatsujiogawa）鸡蛋培养基和Middle brook 7H10、7H11等琼脂培养基等。在固体培养基中，由于可以直接观察菌落的形态并可做鉴别用，因此常用于临床标本的分离培养、鉴别、保存菌种及对抗结核药物的敏感性测定等方面，缺点是结核菌生长缓慢。　　1.2 液体培养基 常用的有苏通（Sauton）培养基、Middle brook 7H9等液体培养基。结核杆菌在液体培养基中能够更广泛的接触营养成分，因此在液体中生长相对较快,主要在液体表面生长，搅动时下沉至管底，可获得大量的结核杆菌。主要缺点是：在对临床标本的收集、采样、运输方面有不利的一面；不能根据肉眼观察菌落形态；培养基污染机会多，影响结核杆菌的生长，污染时不易与结核杆菌鉴别，需涂片染色镜检判断结核杆菌是否生长。　　1.3 半流体培养基 改良苏通半流体琼脂培养基是一种人工综合培养基，基质透明，呈半流体状态，生长的结核杆菌形成白色颗粒状菌落悬浮于培养基中段，便于观察。　　1.4 固液双向培养基 Septi-Check AFB双相培养基是国外应用较早的一种培养基，采用BD专利式封闭式固液双相一体化培养基设计。液相为Middle brook 7H9分枝杆菌专用增菌培养基，可迅速繁殖分枝杆菌，固相为3种固体培养基平面：Middle brook 7H11和改良的L-J培养基用于及时将增菌肉汤内分枝杆菌进行分离纯化以获得单个菌落，巧克力琼脂用于早期发现污染菌，避免时间浪费。由于有液相作为基础，因此结核杆菌生长较快，也是一种非常有效的培养基。国内有用平菇制备的平菇双相培养基是利用平菇浸出液为基础，加小牛血清、琼脂等成分而配制的一种培养基，根据琼脂的量不同制成液相、固相培养基。在国内应用较少，主要特点是成本低，制备简单，适合于基层使用，有一定的研究价值。

请问一下做微生物时所用的接种环是什么样子，是自制还是购的。再就是经初发酵后用接种环将培养物转接到EC培养液中，这里说的培养物是不是初发酵后，试管里面产酸产气的“倒管（小玻璃管）”？ 请教啦.....

名称：细胞培养操作规程关键词：细胞培养目的：建立一套适用的培养操作规程，进行无污染条件下体外细胞扩大培养。主体内容：操作步骤：1、紫外灯照射超净台30分钟（根据实际情况，可适当延长或缩短照射时间，但时间长一点总比时间短一点安全。）2、将培养液、PBS、胰酶放在37℃水浴中温育（每次用多少，温育多少，这样既可节约温育的时间，又可延长药品的使用期限。）3、超净台照射30分钟后，关闭紫外，打开照明，打开排风10分钟后再次进入细胞培养室。（注意：要打开排风10分钟后再进行操作，这样才能保证循环的风是无菌的。同时还会避免有菌的风直接吹到人的呼吸道中，对人体也有一定的保护作用）4、戴上口罩及手套（有条件的最好戴上帽子，不过也没关系，我们实验室就没戴）5、用70-75%的酒精擦试实验物品，然后拿入超净台中。6、操作时注意以下几点：尽量在酒精灯火焰附近操作，但如果管子里有细胞就要离火焰有一定距离了，否则细胞要烫死了；不要重复使用移液管（即吸一次后，就换新的管）；不要在敞开的容器上方操作；手上的酒精不要擦太多，否则靠近酒精灯时容易把手烧到（我想很多人都有过被烧的经历吧）；其实操作是很简单的，但一定要仔细。尤其是第2步许多人都不注意，细胞平时放在37℃培养，如果加入的PBS或胰酶温度太低，会对细胞有操伤的，虽然这种损伤短期内察觉不到，但时间长了，就会显现出来。

注意事项： 1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。2.安装蔡式滤器时通常使用孔径 0.45 微米 和 0.22 微米滤膜各一张，放置位置为 0.45 的位于 0.22 微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。 3.配制 RPMI1640 培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液 PH 值最终为 7.2 ，可在配制时调 PH 至 7.4 。 细胞培养的一般过程 一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。R 理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置 4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。 三、培养将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的 PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和 CO2浓度也要定时检查。一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。四、冻存及复苏为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度?－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入 37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。

将乳糖胆盐发酵的产气产酸的管接种到伊红美蓝培养基上是用接种环挑取一环到其培养基上去培养，先要将接种环在酒精灯上灼烧灭菌，再插入待接种的样液，用划z字形的方式在培养基上划线，一般是划三个部分，划完了第一部分后，接种环为什么又要重新过一下酒精灯的火焰， 冷却后再接种划第二次，再过一下酒精灯的火焰，冷却，再划第三部分呢，不明白划每一小部分接种环为什么要再过一下火焰，冷却

**提供生化培养箱使用于环境保护、卫生防疫、药检、农畜、水产等科研、院校、生产部门。是水体分析和BOD测定，细菌、霉菌、微生物的培养、保存、植物栽培、育种试验的专用恒温设备。用途： SP型智能生化培养箱是具有制冷，加热控制的高精度恒温设备，是细菌，微生物培养试验的恒温培养装置，适用于生物工程，医学研究，卫生防疫，环境保护，药检，畜牧，水产，高校院校，科研机构等领域从事科研和生产使用的理想设备。特点：1 箱体采用优质制作而成，表面喷塑，内胆采用医用镜面不锈钢，易清洁，箱内搁板间距可调，大视角观察窗口;2微电脑智能数显控温仪，PID控制，触摸型按键，同时显示设定温度和箱内温度，控温精度可靠，具有定时功能，并具有超温保护装置，声光报警功能；3 采用品牌压缩机，环保制冷剂，效率高，能耗低，促进节能。4名牌微风机组成合理先进的温度循环系统，使箱内小试均匀。5箱内有照明灯，可观察箱内培养物；6可配RS-485接口，可连接打印机和计算机，记录温度参数的变化情况（选配）生化培养箱使用说明： 1、接通电源，合上电源开关，整机通电，开关内的电源指示灯亮。 2、控温设定请参照智能型数字温度控制器说明书。 3、如需照明打开照明开关。 4、本培养箱有断点保护功能及一分半钟左右延时功能，压缩机停机后再次启动要达一分半钟左右。 生化培养箱维护和培养： 1、培养箱外壳应可靠接地。 2、培养箱要放置在阴凉、干燥、通风良好、远离热源和日晒的地方。放置平稳，以防震动发生噪音。 3、为保证冷凝器有效地散热，冷凝器与墙壁之间距离应大于100mm。箱体侧面应有50mm间隙，箱体顶部至少应有300mm空间。 4、培养箱在搬运、维修、保养时，应避免碰撞，摇晃震动;最大倾斜度小于45度。 5、仪器突然不工作，请检查熔丝管(箱后)是否烧坏，检查供电情况。 6、本生化培养箱制冷工作时，不宜使箱内温度与环境温度之差大于25度。

一、培养基的历史体外培养（in vitro culture）包括：组织培养（tissue culture）、细胞培养（cell culture）、器官培养（organ culture）。顾名思义，就是将活体结构成分（如活体组织、活体细胞或者活体器官等）从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长发育的方法。广义组织培养与体外培养同义。体外培养已经历了约一百年的发展历史，但发展初期进程比较缓慢，没有引起很多学者的重视。直到上世纪50年代后期，体外培养技术才广泛应用于生物学研究的各个领域，使这项技术得到飞速发展。现在体外培养已成为细胞工程、基因工程、抗体工程的重要组成部分。细胞培养指从生物机体取出部分组织分散成单个细胞或直接从机体取出单个细胞，也可把体外培养细胞分散成单个细胞在体外条件下培养，细胞能继续存活与增殖。培养过程中细胞不再形成组织。发展与完善细胞培养技术围绕防止污染、改进培养方法、设计新型培养容器、设计不同的培养液等几个方面进行。1885年Roux温生理盐水培育鸡胚组织；1903年Jolly，1906年Beebe等发明了盖片悬滴培养；1907年Harrison培养蛙胚神经成功，开始创建盖片凹玻璃悬滴培养法； 　　1910、1912年Carrel采用无菌操作、更新培养基、传代，完善了悬滴培养法； 　　1924年Maximow采用双盖片悬滴培养法；　　1923年Carral设计创立了卡氏瓶培养法，用此法可根据需要随时更换培养液，既有利于组织不断生长，又可以运用不同种类的营养液培养不同的细胞，极大地推动了当时组织培养研究。Earle等加以改进，使大量细胞能直接生长于玻璃瓶壁上，培养了正常细胞与肿瘤细胞的细胞株。至此大多数研究人员都采用培养瓶培养细胞。组织培养从二十世纪40年代起迅速发展,在培养容器、培养基和培养技术等方面出现了很多革新。在培养容器方面, 由简单的用试管、旋转管培养，发展到多种培养瓶培养，近年来，塑料瓶、皿、多孔培养板的使用已日趋普遍。在培养基方面，从50年代初，Parke、Eagle等设计出合成培养基后，从纯天然培养基到合成培养基、从鸡胚浸出液发展到动物血清（促细胞生长物），直至60年代设计出无血清培养基。首先反映在设计不同种类的缓冲盐溶液，以用来培养不同的细胞和洗涤细胞。Earle在1948年设计了含有碳酸氢钠等盐类的Earle氏盐溶液，Hank’s在1949年设计了Hank’s氏盐溶液。在培养技术方法方面，革新进展更为迅猛，Earle、Dulbecco等于1943年创建单层细胞培养法，首建长期传代的L-细胞系。 　　1948年Sanford创建单细胞分离培养法，获L-细胞纯系。 　　1951年Gey首建人肿瘤细胞——Hela细胞系。 1961年Hayflick首建人二倍体细胞系25种，开辟了应用新方向。　　从50年代末开始，组织培养技术应用进入了一个繁盛的阶段，广泛应用于生物学和医学研究各个领域。 　　诱变建立遗传缺陷细胞株、杂交瘤技术制备单抗、发展细胞大量培养技术、利用重组技术构建工程细胞株，已成为生物工程的重要生产手段。 在连续灌注培养工艺方面，美国Ohashi,Ryo等人2001年报道采用2L一次性生物反应器灌注培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体，以Becton Dickenson Cell Mab+10%胎牛血清+1％聚醚F-68为培养基，最高活细胞密度超过1×107cells/ml；2001年瑞士Heine, Holger等人用带超声细胞分离器(UCS)的连续灌注搅拌罐生物反应器培养鼠杂交瘤细胞生产单克隆抗体，稳态培养时活细胞密度超过2×107cells/ml；2004年德国Thomas等人在1L搅拌罐生物反应器中培养rCHO细胞生产人MUC-1糖蛋白，采取葡萄糖浓度限制的高产率灌注工艺减少有害代谢物，代谢转向TCA循环增加，活细胞密度保持在(1～2)×107cells/ml。在流加悬浮培养工艺方面，美国麻省理工Xie Liangzhi等人2000年报道在2L生物反应器中流加培养杂交瘤细胞，通过营养控制降低氨和乳酸的比生成速率，补充培养基包括营养成分、胎牛血清和痕量金属，最大活细胞密度达到1.7×107cells/mL。

单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落（colony）。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔（lawn）。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板（culture plate）的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。　　　1. 稀释倒平板法（pour plate method）　　先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1,000、1:10,000......），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。　　　2. 涂布平板法（spread plate method）　　由于将含菌材料先加到还较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，而且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中更常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落。　　3. 平板划线法（streak plate method）　　用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。　　　4. 稀释摇管法（dilution shake culture method）　　用固体培养基分离严格厌氧菌有它特殊的地方。如果该微生物暴露于空气中不立即死亡，可以采用通常的方法制备平板，然后置放在封闭的容器中培养，容器中的氧气可采用化学、物理或生物的方法清除。对于那些对氧气更为敏感的厌氧性微生物，纯培养的分离则可采用稀释摇管培养法进行，它是稀释倒平板法的一种变通形式* 。先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右，将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开。培养后，菌落形成在琼脂柱的中间。进行单菌落的挑取和移植，需先用一只灭菌针将液体石蜡--石蜡盖取出，再用一只毛细管插入琼脂和管壁之间，吹入无菌无氧气体，将琼脂柱吸出，置放在培养皿中，用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落的移植。

从大小来讲，细胞培养瓶约可分为约600ml，250ml，50ml和25ml的，一般都经过表面改性处理，适合细胞贴壁和生长。600ml 、300ml的多用于大规模培养时用（如单克隆细胞的培养等），50ml的多用于一般性细胞实验用（一般性的传代，保存细胞，为实验提供细胞等），25ml一般是用来复苏细胞或细胞较少时的培养，还有做原代细胞时也可以做多瓶而避免交叉污染。当然还有其他如圆形的等，都可根据个人爱好和实验需要自己选择。 根据细胞培养瓶制作材料的不同，也有玻璃和塑料之分，这里谈一点自己的浅见（欢迎不同意见的战友拍砖）。不同的细胞对胰酶的敏感度不一样，所以在实验中我们常常会遇到一些细胞消化半天也没有起色，导致细胞状态不断下滑，直至最后的死亡以至于实验进展的不顺利。当然，有时候是可以通过加一些EDTA等来增强胰酶的能力，或者提高胰酶的浓度来实现，在培养一些细胞过程中，我发现，一些细胞对玻璃和塑料制品粘附能力不同，如RAW264.7，平滑肌细胞等，在转换培养瓶之后，可以发现好消化了很多，并且在回到原制品的培养瓶时不会改变它的贴壁能力。这里希望有经验的战友可以分享你们的经验。 关于培养板的购买其实我也没有什么经验，想说的就是要尽量避免购买国产的培养板，国产的一些培养瓶还可以，但是培养板我们买过很多国产的，确实效果不是很好，细胞在里面基本上长的非常非常磕碜。所以经费富余的情况下，这些东西能买进口的就买吧。大公司的基本都可以买，BD，Corning等等。这些东西原则上是一次性的，但是我们大部分实验室根本不可能做到，其实泡酸，洗干净再用也没问题，毕竟我们没有老外那么富足的经费，所以我们就累点吧，多做点体力活锻炼一下身体吧。滴管其实也没什么好说的，国产的就足够了。要说的是图中我比较喜欢用C类的滴管，原因就是塞上棉花后吹打细胞不会怕棉花湿掉而引起污染，而且用完棉花也方便取出，便于下次再用。

1 实验室设计 细胞培养是一种无菌操作技术,要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素的影响.细胞培养室和设计原则是防止微生物污染和有害因素影响,要求工作环境清洁,空气清新,干燥和无烟尘.细胞培养室的设计原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧,常规操作和封闭培养于一室,而洗刷消毒在另一室. 2 常用设施及设备 (1)超净工作台:也称净化工作台,分为侧流式,直流式和外流式三大类. (2)无菌操作间:一般由更衣间,缓冲间和操作间三部分组成.操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱,离心机,倒置显微镜等.缓冲间可放置电冰箱,冷藏器及消毒好的无菌物品等. (3)操作间:普通培养箱,离心机,水浴锅,定时钟,普通天平及日常分析处理物(4)洗刷消毒间:烤箱,消毒锅,蒸馏水处理器及酸缸等. (5)分析间:显微镜,计算机及打印机等. 3 培养器皿 常用细胞培养器皿有培养瓶,培养板,培养皿等.常准备量是使用量的三倍.器皿应选择透明度好,无毒,利于细胞粘附和生长的材料,常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品.常用的器皿有下面几种. (1)液体储存瓶:用于储存各种配制好的培养液,血清等液体,常用规格有500ml,250ml, 100ml等几种. (2)培养瓶:根据培养细胞种类要求不同培养瓶的形态各异,用于细胞传代培养的细胞要求瓶壁厚簿均匀,便于细胞贴壁生长和观察,瓶口要大小一致,口径一般不小于1cm,允许吸管伸入瓶内任何部位,规格有200ml,100ml,50ml,25ml,10ml等几种. (3)培养皿:用于开放式培养及其它用途.分直径30mm,60mm,120mm等几种. (4)吸管:常用的有长吸管和短吸管两类,长吸管也称刻度吸管.其改良后管上部有球型刻度称改良吸管,刻度吸管用于移动液体.常用1ml和10ml两种.短吸管也叫滴管,分弯头和直头两种. (5)离心管:离心管是细胞培养中使用最广泛的器皿,根据用途不同形态各样,常用于细胞培养的离心管有大腹式尖底离心管和普通尖底离心管两类.前者分别为50ml,30ml,15ml;后者则多为10ml和5ml. (6)其它:如三角烧瓶,烧杯,量筒,漏斗,注射器等.4 细胞培养温度 维持培养细胞旺盛生长,必须有恒定而适宜的温度.不同种类的细胞对培养温度要求也不同.人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃,偏离这一温度范围,细胞的正常代谢会受到影响,甚至死亡.培养细胞对低温的耐受力较对高温强,温度上升不超过39℃时,细胞代谢与温度成正比;人体细胞在39-40℃1小时,即能受到一定损伤,但仍有可能恢复;在40-41℃1小时,细胞会普遍受到损伤,仅小半数有可能恢复;41-42℃1小时,细胞受到严重损伤,大部分细胞死亡,个别细胞仍有恢复可能;当温度在43℃以上1小时,细胞全部死亡.相反,温度不低于0℃时,对细胞代谢虽有影响,但并无伤害作用;把细胞放入25-35℃时,细胞仍能生存和生长,但速度减慢;放在4℃数小时后,再回到37℃培养,细胞仍能继续生长.细胞代谢随温度降低而减慢.当温度降至冰点以下时,细胞可因胞质结冰受损而死亡.但是,如果向培养液中加入一定量的冷冻保护剂(二甲亚砜或甘油),可在深低温下如-80℃或-196℃(液氮)长期保存. 5 合适的气体环境 气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有氧气和二氧化碳.氧气参与三羧酸循环,产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分.开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中.二氧化碳既是细胞代谢产物,也是细胞生长繁殖所需成分,它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH值.大多数细胞的适宜pH为7.2-7.4,偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响.但细胞耐酸性比耐碱性大一些,在偏酸环境中更利于细胞生长.但有一些细胞也喜欢偏碱环境中生长,如成纤维细胞最适合pH是7.4-7.6.每种细胞都有其最适pH值.

1．分批培养（batchculture）将微生物置于一定容积的培养基中，经培养，最后一次收获，谓分批培养。在分批培养中，培养基一次加入，不予补充，不再更换。由于营养消耗，代谢产物积累，对数生长期不能长期维持。2．连续培养（continuous culture）在培养器中不断补充新鲜营养物质，并不断排出部分培养物（包括菌体和代谢产物），以保持长时间生长状态的一种培养方式。主要有恒浊连续培养和恒化连续培养两类。恒浊连续培养通过不断调节流速，使培养液浊度保持恒定，因而可不断提供具有一定生理状态的细胞，并可得到以最高生长速率进行生长的培养物。恒化连续培养通过控制恒定的流速使营养物浓度基本恒定，从而使微生物保持恒定的生长速率。用不同浓度的限制性营养物进行恒化培养，可得到不同生长速率的培养物。3．半连续培养（semi－continuous culture）在发酵罐中的一部分发酵液保留下来作为菌种液，放出其余部分进入提练加工工序，在剩余的培养液中加满新的未接种的培养液，继续培养，如此反复，谓之半连续培养。4．补料分批培养（fed－batch culture）补料分批培养又称半分批培养，是指在分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养液，但不取出培养物。待培养到适当时期，将其从反应器中放出，从中提取目的生成物（菌体或代谢产物）。若放出大部分培养物后，继续进行补料培养，如此反复进行，则称为重复补料分批培养（repeated fed－batch culture）。与传统分批发酵相比，补料分批发酵的优点在于使发酵系统中的基质浓度维持在低水平，这有以下优点：①可除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，以减轻供氧矛盾；②避免有毒代谢物的抑菌作用；③大为减少了无菌操作要求十分严格的接种的次数。与连续发酵相比，补料分批培养不会产生菌种老化和变异等问题。故其应用范围十分广泛。5．同步培养 能使培养的微生物处于较一致的，生长发育在同一阶段上的培养方法叫同步培养法。利用同步培养法控制细胞的生长，使它们处于同一生长阶段，所有细胞都能同时分裂，这种生长方式叫同步生长（图3—4）。用同步培养法得到的培养物叫同步培养物（synchronous culture）。这样，群体和个体行为一致，即可用研究群体的方法来研究个体水平上的问题。由于同步群体的个体差异，同步生长往往最多维持2个～3个世代，然后又逐步变为随机生长。

1. 如何选用特殊细胞系培养基？培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。2. 何时须更换培养基？视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。3. 可否使用与原先培养条件不同之培养基？不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基， 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。4. 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清， 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。5. 何谓FBS, FCS, CS, HS ?FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼， 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。6. 培养细胞时应使用5% 或10% CO2？或根本没有影响？一般培养基中大都使用HCO3-/CO3 2-/H+ 作为pH 的缓冲系统， 而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10% CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时， 则应使用5% CO2 培养细胞。7.Hank's 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hank's 平衡盐溶液(HBS)和Earle's平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2 g/L)中比在Hanks (0.35 g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。8. 细胞之接种密度为何？依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。9. 悬浮性细胞应如何继代处理？一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中， 稀释细胞浓度即可， 若培养液太多时， 可将培养角瓶口端稍微抬高， 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶， 加入新鲜培养基稀释至适当浓度， 重复前述步骤即可。10. 冷冻管应如何解冻？取出冷冻管后， 须立即放入37℃水槽中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿， 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须注意安全， 预防冷冻管之爆裂。11. 细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO？除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后， 应直接放入含有10-15 ml新鲜培养基之培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。12. 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53 mM EDTA Na4。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于-20 ℃，避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低， 并可减少污染之机会。13. 欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？欲回收动物细胞， 其离心速率一般为300xg (约1 000 rpm)，5-10 分钟， 过高之转速， 将造成细胞死亡。14. 细胞冷冻培养基之成份为何？动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5-10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90-95% 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能， 故不可将DMSO 直接加入细胞液中， 必须使用前先行配制完成。15. DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何？冷冻保存使用之DMSO 等级， 必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即为无菌状况， 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于4℃， 避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质， 并可减少污染之机会。若要过滤DMSO， 则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。16. 冷冻保存细胞之方法？冷冻保存方法一: 冷冻管置于4℃30~60 分钟→ (-20℃ 30 分钟*) → -80℃16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 ℃至-80℃以下， 再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20℃不可超过1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。17. 细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial， 融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。

作者： 陈文庆 王建超 刘华杰 高飞 张韧 （北京清大天一科技有限公司 102200 ） （《中国兽药杂志》 2010.44 （ 10 ）： 37-41 ）【摘要】 采用反应器全悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒与微载体悬浮培养Vero细胞生产狂犬病毒分别与相应的转瓶培养工艺生产案例对比分析，比较悬浮培养工艺与转瓶培养工艺的生产效益。分析显示，与转瓶培养工艺相比，反应器悬浮培养工艺获得的细胞密度、病毒效价、产品的产量和质量明显提高，生产时的能耗和劳动力需求明显降低。结果表明悬浮培养工艺的生产效益明显高于转瓶培养工艺，适宜于国内生物制品工业化生产的升级换代。【关键词 】 细胞培养；生物反应器；悬浮培养；微载体细胞悬浮培养技术是指细胞在生物反应器中自由悬浮于培养液内生长增殖的一种培养方法。根据细胞是否贴壁，又分为全悬浮细胞培养和贴壁细胞微载体培养。国际上该项技术发展较快，已趋向成熟，是疫苗、抗体等生物制品生产的普遍生产工艺模式。与转瓶培养技术相比，该工艺具有操作简单、产率高、容易放大等优点，本文结合口蹄疫病毒和狂犬病毒的生产，分别对细胞悬浮培养工艺与转瓶培养工艺的经济效益等进行了分析和分析。1. 全悬浮培养口蹄疫病毒与转瓶培养案例对比高效、安全的病毒性疫苗是防止口蹄疫情发生的最有效方法。BHK21细胞是繁殖FMDV的理想宿主，早在1962年Capstick PB等就实现FMDV的悬浮培养。1965年Telling, R.C.等实现在不锈钢发酵罐中悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫疫苗。目前国外（Intervet公司、Merial公司）普遍已经采用2000~5000L反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫苗。本文就本公司自主研发的650L生物反应器和无血清培养基进行悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫疫苗与转瓶培养工艺进行比较和分析。1.1主要材料细胞株：BHK21贴壁细胞株（中国兽医药品监察所）毒 株：FMDV-O型（某兽用疫苗企业）培养基：低血清MEM培养基(产品代号MD611)、BHK21细胞无血清培养基（北京清大天一科技有限公司）血 清：特级新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）仪 器：5 L反应器（德国贝朗），120L和650LCLAVORUS ® 生物反应器（北京清大天一科技有限公司）1.2实验方法1.2.1转瓶培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒将复苏的BHK21细胞在T75培养瓶中使用低血清培养基（含5％牛血清）培养，连续传代扩增接种15L转瓶，37 ℃培养48小时，传代比例为1:8-1:10，按常规方法接种病毒及维持液，细胞病变90%左右收获病毒液。1.2.2反应器全悬浮无血清培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒（1）贴壁细胞悬浮驯化培养：用BHK21细胞无血清培养基在恒温摇床或者方瓶中无血清驯化贴壁BHK21细胞，可采用直接驯化或者逐级降低血清驯化等方法，每代观察细胞数量和细胞活率，直至BHK21细胞在无血清培养基中的生长增殖速率正常，细胞活率达95%以上，并可连续稳定传代，说明细胞已适应无血清悬浮培养。（2）反应器用种子细胞扩增：采用反应器罐倒罐逐级放大技术，细胞从摇瓶→5 L反应器→120 L反应器→650 L反应器进行逐级放大培养。细胞培养方式为批培养，控制反应器各参数在正常范围：温度37.0 ℃、pH7.2~7.4、溶氧（DO）20~70%、搅拌转速50~150 r/min。（3）反应器培养口蹄疫病毒：待650 L反应器中细胞达到一定密度，提高培养pH至7.5左右，按一定比例直接接种口蹄疫病毒进行病毒维持培养，控制温度、pH、DO、搅拌转速等参数在合适范围，在线无菌间隔取样判断细胞病变情况并检测病毒毒价（LD50,TCID50），确定收获的最佳时间。1.3 细胞培养结果对比分别对低血清培养基15 L转瓶培养的贴壁BHK21细胞进行观察和细胞计数，反应器全悬浮培养的BHK21细胞取样进行数量和活率检测。培养条件和结果对比见表1。表1 转瓶培养和反应器全悬浮培养BHK21细胞对比http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/10/A1380442105_small.jpg http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/10/A1380442106_small.jpg http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/10/A1380442107_small.jpg 图1 转瓶BHK21细胞低血清培养48 hr，100X 图2 反应器全悬浮无血清培养48 hr，100X 结果显示，转瓶培养的BHK21细胞，培养48小时显微镜观察成致密单层，见图1，96小时细胞开始出现脱落死亡；反应器无血清全悬浮培养BHK21细胞48小时的细胞显微镜观察状态如图2，生长至96小时细胞密度可达5.4x106 cells/ml，活率维持在94%左右。从细胞数量比较，650L反应器培养一批的细胞数量相当于500～700个15 L转瓶培养的细胞总量。1.4 病毒培养效果对比两种不同培养工艺，细胞在满足活力要求的基础上，以同等条件分别接种FMDV病毒，取样测定病毒毒价，结果见表2。 表2 转瓶和反应器全悬浮培养BHK21细胞病毒毒价对比http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/10/A1380442112_small.jpg结果表明，无血清悬浮培养的口蹄疫病毒毒价（TCID50和LD50）检测不低于转瓶培养工艺。根据反应器低血清悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫完整病毒粒子（146S）检测较转瓶高10倍左右的情况，应用无血清悬浮培养工艺，杂蛋白含量更少，口蹄疫完整病毒粒子和口蹄疫疫苗质量均提高。1.5 反应器和转瓶经济效益估算对比依据培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒工艺过程要求，从细胞密度、病毒毒价、产品效力、资源环境、劳动力等方面进行简单对比，借以一窥二者的经济效益差别（见表3）。 表3 反应器无血清悬浮培养与转瓶培养BHK21细胞经济效益对比http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/10/A1380442114_small.jpg*按照反应器无血清悬浮培养一条生产线（5L-120L-650L）、转瓶体积15 L进行对比按照目前培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒质量要求，对悬浮无血清培养工艺的产能进行预估，一条5L-120L-650L的反应器生产线年生产病毒量约为2.1亿毫升，生产疫苗量约为4.2亿毫升。2. 人狂犬病毒微载体培养与转瓶培养的对比我国是受狂犬病危害最为严重的国家之一，近年报告狂犬病死亡人数均在2400人/年以上，一直位居我国各类传染病报告死亡数的前三位，根据有关国家成功控制狂犬病的经验，世界卫生组织提出倡议，到2020年消除人狂犬病。我国距此倡议目标还有大量工作要做，国内也对人用和兽用狂犬病疫苗的生产做了大量研究工作。下面就120L反应器微载体培养Vero细胞生产狂犬病毒效果与转瓶培养工艺和培养效果比较分析。2.1主要材料细胞株：Vero细胞株毒 株：aG株（细胞株和毒株均来自某人用疫苗企业）培养基：低血清199培养基（产品代号MD504）、 Vero细胞反应器培养用培养基（产品代号MD505）, 均来自北京清大天一科技有限公司仪 器：5 L反应器（德国贝朗）、120LCLAVORUS ® 生物反应器（北京清大天一科技有限公司）血 清：特级新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）微载体：Cytodex 1 （美国GE

灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物，灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。本实验主要介绍物理方法的一种，即加热灭菌。 加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。通过加热使菌体内 蛋白质凝固变性，从而达到杀菌目的。蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关，含水量越高，其凝固所需要的温度越低。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强，可增加灭菌效力。 2.1 湿热灭菌 煮沸消毒法 ：注射器和解剖器械等均可采用此法。先将注射器等用纱布包好，然后放进煮沸消毒器内加水煮沸。对于细菌的营养体煮沸约15～30min，对于芽孢则需煮沸约1～2h。 高压蒸汽灭菌法：高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是微生物学实验中最常用的灭菌方法。这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时，水蒸气的温度升高到121℃，经15～30min，可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌。 2.2 操作方法和注意事项 加水：打开灭菌锅盖，向锅内加水到水位线。立式消毒锅最好用已煮开过的水，以便减少水垢在锅内的积存。注意水要加够，防止灭菌过程中干锅。 装料、加盖：灭菌材料放好后，关闭灭菌器盖，采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺旋，使蒸汽锅密闭，勿使漏气。 排气：打开排气口(也叫放气阀)。用电炉加热，待水煮沸后，水蒸气和空气一起从排气孔排出，当有大量蒸汽排出时，维持5min，使锅内冷空气完全排净。 升压、保压和降压：当锅内冷空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。当压力上升至所需压力时，控制电压以维持恒温，并开始计算灭菌时间，待时间达到要求（一般培养基和器皿灭菌控制在121℃，20min）后，停止加热，待压力降至接近“0”时，打开放气阀。注意不能过早过急地排气，否则会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外。 灭菌后的培养基空白培养：灭菌后的培养基放于37℃培养箱中培养，经24h培养无菌生长，可保存备用；斜面培养基取出后，立即摆成斜面后空白培养；半固体的培养基垂直放置凝成半固体深层琼脂后，空白培养。 2.2 干热灭菌法 通过使用干热空气杀灭微生物的方法叫干热灭菌。一般是把待灭菌的物品包装就绪后，放入电烘箱中烘烤，即加热至160～170℃维持1～2h。 干热灭菌法常用于空玻璃器皿、金属器具的灭菌。凡带有胶皮的物品，液体及固体培养基等都不能用此法灭菌。 2.2.1 灭菌前的准备 玻璃器皿等在灭菌前必须经正确包裹和加塞，以保证玻璃器皿于灭菌后不被外界杂菌所污染。常用玻璃器皿的包扎和加塞方法如下：平皿用纸包扎或装在金属平皿筒内；三角瓶在棉塞与瓶口外再包以厚纸，用棉绳以活结扎紧，以防灭菌后瓶口被外部杂菌所污染；吸管以拉直的曲别针一端放在棉花的中心，轻轻捅入管口，松紧必须适中，管口外露的棉花纤维统一通过火焰烧去，灭菌时将吸管装入金属管筒内进行灭菌，也可用纸条斜着从吸管尖端包起，逐步向上卷，头端的纸卷捏扁并拧几下，再将包好的吸管集中灭菌。 2.2.2 干燥箱灭菌 将包扎好的物品放入干燥烘箱内，注意不要摆放太密，以免妨碍空气流通；不得使器皿与烘箱的内层底板直接接触。将烘箱的温度升至160～170℃并恒温1～2h，注意勿使温度过高，超过170℃，器皿外包裹的纸张、棉花会被烤焦燃烧。如果是为了烤干玻璃器皿，温度为120℃持续30分钟即可。温度降至60～70℃时方可打开箱门，取出物品，否则玻璃器皿会因骤冷而爆裂。 用此法灭菌时，绝不能用油、蜡纸包扎物品。 2.2.3 火焰灭菌 直接用火焰灼烧灭菌，迅速彻底。对于接种环，接种针或其它金属用具，可直接在酒精灯火焰上烧至红热进行灭菌。此外，在接种过程中，试管或三角瓶口，也采用通过火焰而达到灭菌的目的。

1、L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？ L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。 2、哪种培养基中可以省去加酚红？ 酚红在培养基中用作PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，(特别是雌激素)。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。 3、二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？ 二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。4、培养基中丙酮酸钠的作用是什么？ 丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。 5、室温下配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用时PH值是多少？ 缓冲液PH值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃时，不同PH值。 50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃时，不同PH值 4°C 25°C 37°C 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8 8.9 9.0 9.1 9.2 9.3 9.4 8.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8.0 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 7.8 7.9 8.0 8.1 8.2 8.3 8.4 8.5