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在用酶联免疫法测定抗原或抗体时,不论是定量试验还是定性试验都要求使用酶标仪进行测定。一般的酶标仪在测定中均有单波长和双波长的模式,并且采用的都是垂直光路。但在日常工作中有时会不太重视单波长和双波长的选择,对使用单、双波长给测定结果带来的较大差异也不很了解,并且实际工作中也出现了使用单波长检测导致抗HCV部分弱阳性的漏检。因此,本人就酶标仪在选择单、双波长使用方面谈谈个人的体会,供同道参考。一 材料和方法1.材料 由上海科华公司提供的乙肝表面抗原测定试剂盒;eppendorf 20-20ul的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]。2.仪器 上海科华公司的ST-360酶标仪和BIO-RAD 550酶标仪。3.方法 底物液配制:底物液A、B各5ml混合,加入微量酶标记物,再加入5ml终止液,呈微黄色,混匀待用;利用上海科华公司提供的乙肝表面抗原试剂盒的酶标板,用94孔中准确加入150ul配制好的上述底物液,另2孔中加入150ul已终止的空白底物液作空白。在BIO-RAD 550酶标仪上分别进行450nm单波长和450nm及655nm(无630nm)的双波长检测,在ST-360上分别进行450nm单波长和450nm及630nm的双波长检测吸光度各两次。二 结果 1.分别对所得结果进行统计,发现单、双波长测定结果有较大的差异,双波长测定结果的CV值远小于单波长测定,结果见表1。2.对ST-360两次重复测定结果进行分析,结果基本一致,见表2。表1酶标板吸光度在两台酶标仪上的测定统计结果酶标仪 BIO-RAD550 ST-360 波长 450nm 450nm+655nm 450nm 450nm+630nm 最小值 0.125 0.126 0.130 0.131 最大值 0.154 0.139 0.153 0.141 均值 0.1356 0.1329 0.1399 0.1361 标准差 0.00671 0.00267 0.00467 0.00247 CV(%) 4.94 2.01 3.34 1.82 最大值/最小值 1.232 1.103 1.177 1.076 表2 ST-360酶标仪两次吸光度测定统计结果波长 450mnm 450nm+630nm 1 2 1 2 最小值 0.130 0.129 0.131 0.131 最大值 0.153 0.152 0.141 0.141 均值 0.1399 0.1391 0.1361 0.13711 标准差 0.00467 0.00495 0.00247 0.00229 CV(%) 3.34 3.56 1.82 1.67 三 讨论 1.酶标仪与分光光度计、自动生化分析仪等的吸光度测定有所不同,一般分光光度计是水平光路,而酶标仪则是垂直光路,但测定原理相同,都是使用朗伯-比耳定律,测定的都是样本的吸光度。垂直光的特点是标本吸光度受液体浓缩或稀释的影响小,不足之处是受被测样本液面是否水平、酶标板透光性、孔底是否平整等的影响较大。2.酶标仪在用单波长测定吸光度时,除受到测定干扰(样本的浊度、干扰色等)和电路干扰(包括噪音、漂移、电压等)等因素外,受液体表面张力的影响也很大。在检测过程中,由于液体表面张力的作用,液体的表面不是一个平面,而是形成一个凹面,从侧面看似凹透镜,这样不可避免会影响光路的正常通过。由于凹液面的影响,光线在通过液体时,除正常被液体吸收一部分外,尚有部分被折射和反射(如光线通过凹透镜那样),影响吸光度的检测。而酶标仪使用的又是通过光导纤维传播的点光源,如果每次能在同一部位检测,吸光度的重复性将得到保证,但由于机械运动等造成的误差,不可能保证每孔都在相同部位被检测,因此造成了孔与孔之间有一定的差异。结果见表1,整块板单波长检测的CV在3%以上,吸光度最高值和最低值的相对误差达17%以上。3.在双波长测定中,减少了测定干扰和电路干扰,因此测定结果明显好转,结果见表1,整块板样本的CV在2%以下。ST-360在进行稳定性观察中,如表2所示,两次检测结果基本一致,这表明ST-360的稳定性较好。同时,从表1也可以看到,科华公司生产的ST-360与BIO-RAD 550的检测结果一致,两者的检测性能基本相同。4.由于液体表面张力的不同,导致单波长测定时的误差较大。并且用不同的洗涤剂会影响到最后加入底物和终止液后的液面情况,用加入表面活性剂的洗涤液清洗后,形成的液面更凹,对单波长检测的影响更大,并且与表面活性剂的浓度成正比。而且中性蒸馏水洗涤后,单、双波长检测的结果基本一致。5.在酶联免疫法测定抗原抗体中,由于所使用的底物不论是邻苯二胺(OPD)-H2O2,还是四甲基联苯胺(TMB)-H2O2,显色终止后,在630nm和655nm处的吸光度值都只有吸收峰处(492nm/450nm)吸光度值的1%以下,因此,利用双波长检测,不会影响检测灵敏度。建立在进行酶联免疫检测时,酶标仪比色应该首选双波长。这样可以提高临界值处标本的分析正确度,减少实验误差。
我是黑龙江省药品检验所的一名药师。2004年我所买了一台雷勃酶标仪(labsystems Multiskan Ascent),所长签字购买的(他从未咨询我们使用者的意见,就直接购买了,这也是事业单位的一个缺陷:购买者与使用者没有充足的沟通与交流。如果咨询我们的意见,我们也不会买这样一台仪器。不过,还是不提这些吧)。从此,我的痛苦经历就开始了。 这种酶标仪使用滤光片,而不是全波长测定。随机只配4个固定波长滤光片,如果没有实验所需的,只能另外购买。我做的一个检品,需要的是550nm的滤光片,询问雷勃中国总代理,回答没有此波长之滤光片,最接近的只有540nm。没办法,只能对付着用吧。总不能没有合适的滤光片,一买来就报废吧。 使用时,又出现问题了。酶标仪现在由计算机来操控,我在操作时遇到些困难,反复询问雷勃公司的工程师,结果,他也没有跟我说明清楚,我于是就自己按说明书研究起来,结果,由于我的误操作,电路板烧掉了。询问厂家,他说,只能返厂维修。那就填单子维修吧,今年5月中旬(具体日期记不清了)寄到厂家,他说换上电路板就可以了,结果,到6月份上旬才修好。修好以后,说维修费加配件费共3000元。我们所财务科说可以,但你们应该先把发票寄回来,我们才能把款汇过去;维修方呢,说只有你们把款汇过来,我们才能把发票寄过去。财务科说,事业单位的财务政策就是见发票才能汇款,维修方又说,公司的政策是只有先汇款才能寄发票,又举例说沈药有一台酶标仪,维修后也是遇到这种情况,结果维修方就这么坚持,最后沈药妥协了,而那时沈药那台酶标仪已经在维修方那躺半年了。最后双方又扯了一个月的皮,终于,我们妥协了----没办法,谁让仪器在他们手里呢?先把款汇过去,结果又等了一段时间,直到八月初才回到我们手里。这时,距离我们发出仪器已经三个多月了。 仪器回来后,我试了一下仪器,运行起来一切正常,就是,操作时,总是出一个对话框,说什么背景信号太高,不进行检验操作。就这个问题,我又询问了厂家,维护工程师说,他从未遇到过这种问题,若想解决问题,只能返厂维修。我说这又不是什么大问题,你们上门应该就可以解决;再说,刚维修完,又要返厂维修,是不是你们维修不彻底造成的。他说维修后都是经过试验合格后才能出厂的,另外,雷勃公司从来没有上门维修这一项服务,若想解决问题,只能返厂维修。我又问,如果路上出现问题怎么办,他回答说,这就是你们的问题了。 [em16] 我们所买了很多仪器,有安捷伦、迪马、岛津、沃特斯、伊利特、梅特勒等国内外许多厂家的仪器,每个厂家的售后服务都是可圈可点,还有定期回访等等个性化服务。但我从来没见见过这么牛叉的厂家,从未为客户着想,售后又如此得一塌糊涂。建议大家以后不要卖他们家的仪器了。
根据酶标仪国家检定规程中,有一项是测酶标仪波长准确度的,请问酶标仪能测波长吗?