丙酮酸检测

近日，重庆大学附属肿瘤医院李咏生教授团队在《Signal Transduction and Targeted Therapy》杂志（影响因子：38.104）发表了题为《线粒体丙酮酸载体：调控T细胞分化的代谢-表观遗传学检查点》的研究亮点，阐述线粒体丙酮酸载体作为代谢-表观遗传检查点调控T细胞分化的分子机制，及影响肿瘤免疫的临床意义。细胞毒性CD8+ T细胞是抗癌免疫反应中最强大的效应细胞。在抗原刺激下，CD8+ T细胞可增殖并分化为效应T细胞（Teff），其中大部分是终末分化的短寿命效应细胞 (SLEC)，具有强大的细胞毒性潜力；而其余的部分则是记忆前体效应细胞 (MPEC)，可进一步分化为长寿的、可自我更新的记忆CD8+ T细胞（Tmem）。代谢重编程对CD8+ T细胞的分化和功能具有重要调控作用，其中糖酵解，包括乳酸发酵和丙酮酸氧化，均可促进CD8+ T细胞向Teff的分化。然而，线粒体丙酮酸载体（MPC）控制的线粒体丙酮酸摄取和代谢如何影响T细胞功能和命运仍不清楚。今年五月，来自瑞士洛桑大学的Mathias Wenes团队在Cell Metabolism上发表了题为 The mitochondrial pyruvate carrier regulates memory T cell differentiation and antitumor function的论著，他们发现，MPC缺陷的CD8+ T细胞具有向记忆型分化的倾向，机制研究表明，MPC受抑制的CD8+ T细胞可利用环境中的谷胱甘肽和脂肪酸氧化产生乙酰辅酶A，进而促进组蛋白H3K27位点乙酰化，并导致转录因子RUNX1下游的Tmem分化相关细胞因子（如IL-2，CD40）的表达上调。 此外，该团队还发现，在营养缺乏的肿瘤微环境（TME）中，乳酸来源的丙酮酸是维持CD8+ T细胞抗肿瘤活性的重要能源物质。由于谷胱甘肽和脂肪酸含量较少，在肿瘤微环境（TME）浸润CD8+ T细胞中敲除MPC并不会导致其向Tmem分化，但CD8+ T细胞内mTOR信号受到了显著抑制，进而引起H3K27位点甲基化水平上调，最终导致其抗肿瘤免疫活性降低。近年来，过继细胞转移（ACT）疗法成为了临床上最主要的抗肿瘤免疫治疗策略之一，其通过生成大量的带有基因修饰受体（嵌合抗原受体CAR）的肿瘤特异性CD8+ T细胞（也就是CAR-T 细胞）来增强抗肿瘤效应。然而，由于CAR- T细胞在患者体内的存活率、增殖能力和活力持续性较低，对部分患者的抗癌效果不佳。研究表明，低分化的CD8+ Tmem细胞在ACT疗法中具有更好的抗肿瘤治疗效果。同样，在ACT疗法中，使用MPC抑制剂预处理的CAR-T细胞具有更强的抗肿瘤效应。李咏生教授团队指出，在临床转化应用中，对MPC调控CD8+ T细胞分化和肿瘤免疫抑制的研究表明了靶向MPC可成为激活肿瘤浸润T细胞乳酸利用和抗肿瘤疗效的新途径。并且抑制MPC增强了CAR-T细胞的抗肿瘤作用、记忆表型和持久性，可能是未来临床试验中改善CAR-T细胞免疫治疗的潜在策略。据悉，重庆大学附属肿瘤医院肿瘤内科助理研究员陈瑜和陆军军医大学新桥医院消化内科博士生王景纯为共同第一作者，重庆大学附属肿瘤医院肿瘤内科李咏生教授为通讯作者。原文链接：https://www.nature.com/articles/s41392-022-01101-z陈瑜重庆大学附属肿瘤医院肿瘤内科助理研究员。长期从事肿瘤微环境中MDSC免疫抑制功能及其脂质代谢的基础研究工作，主要研究方向为肿瘤免疫与脂质代谢。近年来共参与发表SCI文章9篇，其中以第一/共同第一作者在Signal Transduction and Targeted Therapy和Theranostics杂志共发表SCI论文3篇；参编Elsevier出版社的英文著作1部；主持重庆市科技局课题1项，参与重庆市科技局课题2项。王景纯陆军军医大学新桥医院消化内科博士生，从事肿瘤治疗耐药及肿瘤干细胞领域研究。近年来共参与发表SCI文章11篇，其中以第一/共一作者在Signal Transduction and Targeted Therapy和Theranostics杂志共发表SCI论文3篇；参与重庆市科技局课题1项；2019年获得“世界医学生论坛”冠军；获评陆军军医大学“优秀共产党员”及“优秀毕业生”。李咏生重庆大学附属肿瘤医院肿瘤内科主任、教研室主任、I期病房主任，博士、教授、主任医师、博士生导师、结直肠癌和恶性肿瘤临床试验首席专家，美国哈佛医学院博士后，国家高层次引进人才，国家自然科学基金重点国际合作项目首席科学家，国家自然科学基金重点、国合、优青、海外优青项目评审委员，重庆英才•创新领军人才，重庆市杰出青年科学基金获得者，重庆市学术技术带头人，重庆市高校创新研究群体负责人，重庆市青年专家工作室领衔专家，中国抗癌协会肿瘤代谢专委会免疫代谢学组组长，肿瘤与微生态专委会常务委员，重庆市免疫学会代谢免疫专委会主任委员，重庆市医药生物技术协会肿瘤罕见病疑难病专委会主任委员，重庆市医学会肿瘤学分会化疗学组组长，重庆市医学会精准医疗与分子诊断专委会副主任委员，重庆市免疫学会、重庆抗癌协会、重庆市医药生物技术学会常务理事。兼任《中国医院用药评价与分析》副主编，STTT等杂志编委，Cell Metabolism、Advanced Science、Cancer Research等杂志审稿人。专注于“肿瘤免疫代谢”研究，主持国家高层次引进人才计划、国家自然科学基金重点国际合作研究项目、国家临床重点专科等项目20余项，发表SCI论文70余篇，总影响因子大于500，被引用大于4000次，以第一/通讯作者在Immunity、STTT、Ann Rheum Dis、Sci Adv、Nat Commun、Cancer Res等杂志发表SCI论文40余篇，单篇影响因子大于30的论文4篇，大于10的论文12篇，截止2022年7月的H指数36。获得国际发明专利1项，国家发明专利2项，国家实用新型专利2项。主编和参编Springer Nature、Elsevier等出版社英文专著4部。以PI身份参研临床试验共计48项，其中I期36项，II期5项，III期7项，以组长单位牵头全国多中心临床研究7项，其中注册类6项。当选中国临床肿瘤协会首批35岁以下最具潜力青年肿瘤医生，获树兰医学青年奖提名，获中国抗癌协会青年科学家奖，入围中国细胞生物学学会青年科学家奖。

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什么是能量代谢?代谢，是生命最基本的特征之一，机体从外界摄取营养物质，包括碳水化合物、脂肪、蛋白质、微量元素、水及维生素等，同时经过体内分解吸收将其中蕴藏的化学能释放出来转化为组织和细胞可以利用的能量，再通过利用这些能量来维持正常的生命活动。我们把这种代谢过程中所伴随的能量的释放、储存和利用称为能量代谢。细胞，作为构成生命体最基本的结构和功能单位，对其功能的研究，比如细胞的增殖，分化等，可以为多个研究领域提供有价值的信息，包括癌症、免疫功能障碍、心血管疾病、神经退行性疾病等。在过去的若干年中，涌现出大量文章及数据，说明能量代谢如何支持细胞生物学的各个方面，以及代谢的变化如何影响重要的细胞功能。安捷伦 Seahorse XF 技术，作为目前细胞能量代谢检测的金标准，可以在不侵入，不破坏样本的前提下，实现实时、高通量、多样本来源的活细胞能量代谢检测，从而为评估细胞功能及研究代谢机制，提供了强有力的技术手段。除了细胞样本，安捷伦 Seahorse XF 技术可以支持多种类型的样本检测，包括新鲜的组织切片，微生物，模式动物等等。当下新冠状病毒肆虐，我国针对病毒的疫苗及特效药的研发也在争分夺秒的进行中，安捷伦 Seahorse 技术同时可以为抗病毒药物和疫苗的研发奠定理论基础。我们已经在之前两篇系列文章（具体请参见文末推荐阅读）中介绍了安捷伦 Seahorse 助力抗病毒研究的相关内容。为什么要研究细胞底物氧化水平?细胞能量代谢与多种疾病息息相关，因此，许多领域的研究人员都对研究能量代谢产生了浓厚的兴趣，其中了解并知道在代谢过程中满足细胞能量需求所依赖的燃料成为了一个重要的研究方向。众所周知，生物体所需的三大营养物质为脂肪、糖类和蛋白质，对于细胞来说，长链脂肪酸（LCFA），葡萄糖（glucose）/丙酮酸（pyruvate）和谷氨酰胺（glutamine）是提供能量的三种最主要的底物。许多领域（例如癌症、免疫学、干细胞生物学）的研究人员已经证明这些底物的氧化水平会对细胞命运、功能以及适应性产生深远影响。癌症研究人员对研究癌细胞对于底物的依赖性很感兴趣，最常见的是癌细胞对于谷氨酰胺的依赖[1,2]，这种依赖性可以揭示癌细胞的弱点，从而为找到药物靶点提供依据；免疫学研究人员则对研究诱导免疫细胞分化和激活的底物感兴趣，最常见的是脂肪酸氧化[3]。很多研究发现不仅提供了新的生物学见解，而且还揭示了干预和开发成功疗法的新方法。免疫代谢研究领域领军人物 Dr.Erika L. Pierce 的团队发表在 Trends in Immunology 上的综述性文章[4] 就是这样一个例子。在本文中，他们着重讨论了通过调控 T 细胞代谢（包括脂肪酸氧化）从而治疗癌症和免疫疾病的各种方法，为现在热门的免疫治疗提供了重要依据。文章提到代谢重编程对于 T 细胞激活和功能是必须的，比如抑制氨基酸的转运，可以限制效应 T（effector T）细胞的扩增；抑制脂肪酸的合成，可以削弱 Th17 细胞的分化并且促进调节性 T 细胞（Treg）的发展；增强脂肪酸氧化可以促进调节性 T 细胞或者记忆 T 细胞（T memory）的发展。因此，调控 T 细胞的代谢是提高靶向 T 细胞功能的一种方法。再来看一篇来自癌症研究领域，2019 年发表在 Nature Metabolism 上的文章。美国贝勒医学院的科学家揭示了前列腺癌，这种常见于中老年男性泌尿生殖系统癌症类型的发生机制，其中有部分前列腺癌与雄性激素分泌紊乱有关[5]。文章中指出雄激素受体驱动的前列腺癌细胞所需的能量来源依赖于线粒体丙酮酸氧化，其中 Seahorse 数据证实了抑制负责将丙酮酸转运到线粒体内的转运子（MPC），可以有效抑制细胞的氧化磷酸化水平，揭示了这种癌细胞的底物利用机制，从而提示 MPC 可能是这种前列腺癌的潜在治疗靶点。如何检测细胞底物氧化水平前面我们已经介绍了研究细胞对于底物氧化依赖的重要性，安捷伦 Seahorse 为此提供了一套完整的检测方法，可通过评估活细胞的耗氧速率（OCR）变化来测定细胞底物的氧化水平。这些快速而对样本无侵入损伤的检测方法使研究人员能够研究细胞如何氧化三种主要的底物：长链脂肪酸，葡萄糖/丙酮酸和谷氨酰胺。利用特定底物氧化通路的抑制剂，结合 Seahorse XF 线粒体压力测试，可以对线粒体功能进行全面评估，在底物需求较少（即基础呼吸）和底物需求较多（即最大呼吸）的条件下研究细胞功能，其中在底物需求较多时细胞更多地依赖特定底物（图 1）。该测定方法基于已被广泛熟知并认可的 Seahorse XF 线粒体压力测试，可提供直观的功能性参数，非常适合研究细胞在基础条件下以及在压力状态下能否升高对底物的需求，从而对细胞底物的偏好性以及依赖性进行全方面评估。使用这些试剂盒能够更方便快速的研究活细胞中特定底物的氧化过程，从而有助于研究细胞如何转换对于特定底物的依赖，以执行关键的细胞功能。图 1. 安捷伦 Seahorse XF 底物氧化压力测试曲线。在添加或不添加抑制剂时，连续添加化合物，测定基础呼吸参数、对抑制剂（Etomoxir、UK5099 或 BPTES）的急性响应以及最大呼吸参数。值得注意的是，虽然在基础条件下可以检测到较小的变化，即急性响应，但在高底物需求条件下（如 FCCP 的加入），往往会出现更大的响应，从而显示出细胞氧化所研究底物的能力的差异。产品信息：每个试剂盒均包含三个一次性试剂袋。每个试剂袋包含各一瓶以下试剂：底物通路抑制剂（Etomoxir 或 UK5099 或 BPTES），寡霉素（oligomycin），FCCP 和鱼藤酮/抗霉素 A（rotenone/antimycin A）混合物。每个试剂袋包含足够的试剂，可用于一块完整的 XF96 或 XF24 测试板。为了获得最佳实验结果，建议使用 pH 7.4 的 Seahorse XF DMEM 或 RPMI 检测液和 Seahorse XF 底物（葡萄糖，丙酮酸和谷氨酰胺）。Seahorse XF 底物氧化压力测试与 XF/XFe96 和 XF/XFe24 分析仪兼容。推荐阅读：1. 战胜新冠病毒可用之利器 | 安捷伦 Seahorse 助力抗病毒研究 https://www.instrument.com.cn/netshow/SH100320/news_522313.htm2. 抗击新型冠状病毒，安捷伦核酸/蛋白质质量控制产品从这些方面入手！ https://www.instrument.com.cn/netshow/SH100320/news_521879.htm3. 聚焦代谢，安捷伦 Seahorse 在病毒免疫研究中的应用 https://www.instrument.com.cn/netshow/SH100320/news_523220.htm关注“安捷伦视界”公众号，获取更多资讯。