细胞颗粒计

何为细胞外泌体？　　外泌体最早发现于体外培养的绵羊红细胞上清液中，是细胞主动分泌的大小较为均一，直径为40~100纳米，密度1.10~1.18 g/ml的囊泡样小体。细胞外泌体携带多种蛋白质、mRNA、miRNA，参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程并且有可能成为药物的天然载体，应用于临床治疗。　　然而，测量技术手段的局限限制了外泌体在这些领域的研究进展。所以，在这篇文章中，作者总结了外泌体的纯化方法（离心法、过滤离心法、密度梯度离心法、免疫磁珠法以及色谱法），比较了现存各种外泌体测量技术（电子显微镜、动态光散射技术及纳米微粒追踪分析术）在外泌体尺寸和表征研究中的应用。原文点击——综述：细胞外泌体颗粒表征测量技术新进展

许多关于细胞利用的一些生物学应用，如微生物学、细胞培养、血液检查等要求我们在实验中确定细胞的浓度。细胞计数非常简单，需要有一个计数板，称为血细胞计数板，或血细胞计数器。19世纪法国解剖学家Louis-Charles Malassez发明了这种血细胞计数板。血细胞计数板是由一片较厚的特制玻片构成，中间有一个垂直线网格。网格的尺寸是给定的，因此每条线覆盖的区域是已知的，这样就可以对一定体积内的溶液中的细胞数量进行计数，为后期的血细胞检测奠定基础。最为常见的血细胞计数板类型的中部有一个“H”形结构，上面有两个像镜子一样抛光的网格表面，并可在上面加上外罩。加载血细胞计数板开始进行计数之前，用擦镜纸拭去灰尘颗粒，确保血细胞计数板及其盖玻片处于洁净状态。安装在血细胞计数板上的盖玻片是特制的，明显厚于传统的显微镜盖玻片，这是因为它必须能够克服液滴的表面张力。确保在加载细胞悬液之前，先将盖玻片放置在计数表面，然后将吸液头和样本放进其中的一个V型孔中，并小心地挤出样本。利用毛细管作用充填盖玻片下部的区域。必须放入足够的液体以便覆盖整个镜片的表面，通常需要大约10ul，但不要溢出表面。您可以在一台血细胞计数板中加载两个样本，每个样本进入两个网格。将加载完的血细胞计数板放置在显微镜台上，然后将计数格在低倍镜焦距中显示。将样本静置几分钟，不要移动盖玻片，以免产生气泡导致计数困难。在血细胞计数板上进行血细胞计数一个血细胞计数板的整个网格包括9个方格，每个方格的面积为1mm2。血细胞计数板的中心区域有25个较大的方格，每个大的方格中又包含16个小方格。当进行计数时，仅对那些位于大方格两侧的各行中的细胞进行计数，以避免重复计数。悬液必须稀释到足够的程度，这样，细胞或其它颗粒才能均匀分布，不会再网格中相互重叠。为了判断细胞的活性，通常采用一种特殊的染色剂（如用台盼蓝稀释样本）。这种染色方法，又称为染色

4.1 流式细胞仪基本原理1. 生物学颗粒分析原理① 流式细胞技术是在单细胞水平上，对于处在快速直线流动状态中的大量细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术，现已成为现代医学研究最先进的分析技术之一。应用流式细胞仪对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行快速的、多参数的定量分析和分选的技术称为流式细胞术。② 生物学颗粒包括大的免疫复合物、DNA、RNA、蛋白质、病毒颗粒、脂质体、细胞器、细菌、霉菌、染色体、真核细胞、杂交细胞、聚集细胞等，所检测的生物颗粒的理化性质包括细胞大小、细胞形态、胞浆颗粒化程度、DNA含量、总蛋白质含量、细胞膜完整性和酶活性等。③ 流式细胞仪是以激光为光源，集流体力学技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。 ④ 流式细胞仪是在荧光显微镜技术、血细胞计数仪和喷墨技术的基础上发展起来的。⑤ 鞘液和样品流在喷嘴附近组成一个圆柱流束，与水平方向的激光束垂直相交，染色的细胞受激光照射后发出荧光，这些信号分别被光电倍增管荧光检测器和光电二极管散射光检测器接收，经过计算机储存、计算、分析这些数字化信息，就可得到细胞的大小、活性、核酸含量、酶和抗原的性质等物理和生化指标。2. 流式细胞仪细胞分选原理在压电晶体上加上频率为30kHz的信号，使液柱断裂成一连串均匀的液滴。当某类细胞的特性与要分选的细胞相同时，流式细胞仪就会在这类细胞形成液滴时给含有这类细胞的液滴充以特定的电荷，带有电荷的液滴向下落入偏转板间的静电场时，依所带电荷的符号分别向左偏转或向右偏转，落入指定的收集器内，从而达到细胞分类收集的目的。4.2 流式细胞仪的分类和基本结构1. 流式细胞仪的分类流式细胞仪根据功能不同可分为临床型(亦称台式机)和科研型（亦称大型机）。流式细胞仪根据其结构不同又可分为一般流式细胞仪和狭缝扫描流式细胞仪。http://www.care100.com/yqxjpkc/images/112.gif

[align=center][font='times new roman'][size=16px]超速离心法[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]富集[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]细胞分泌的外[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]泌[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]体[/size][/font][/align][align=left][font='times new roman'][size=16px]引言[/size][/font][/align]本章利用超速离心法富集细胞分泌的外泌体。采用透射电子显微镜，Western Blot实验，纳米颗粒示踪分析等表征了外泌体的形态结构及分布特征。最后，用增殖实验和划痕实验测试了富集得到的外泌体的生物完整性[font='宋体']。[/font][align=left][font='times new roman'][size=16px]细胞分泌的[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]外[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]泌[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]体表征[/size][/font][/align][img]" style="max-width: 100% max-height: 100% [/img]利用透射电子显微镜对超速离心法得到的外泌体进行了表征。如图（a）所示，洗脱后的外泌体具有典型的杯状结构。纳米颗粒示踪分析技术显示富集的外泌体粒径分布较窄，平均粒径为115.3 nm（图 b）。Western blot方法验证了富集方法的有效性。如图（c）所示，经超速离心法富集后，典型的低丰度外泌体标记物HSC70、TSG101、CD63和CD9可得到有效检测。以上结果证明，基于超速离心法对外泌体的富集可行性。[align=center][font='黑体'][size=14px]图[/size][/font][font='黑体'][size=14px] （a）重悬液中外[/size][/font][font='黑体'][size=14px]泌[/size][/font][font='黑体'][size=14px]体的透射电子显微镜表征，（b）[/size][/font][font='黑体'][size=14px]纳米颗粒示踪分析技术[/size][/font][font='黑体'][size=14px]表征外[/size][/font][font='黑体'][size=14px]泌[/size][/font][font='黑体'][size=14px]体的尺寸分布，（c）[/size][/font][font='黑体'][size=14px]Western blot方法[/size][/font][font='黑体'][size=14px]表征[/size][/font][font='黑体'][size=14px]外[/size][/font][font='黑体'][size=14px]泌[/size][/font][font='黑体'][size=14px]体标记物HSC70、TSG101、CD63和CD9[/size][/font][font='黑体'][size=14px]蛋白条带[/size][/font][/align][align=left][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px]完整性验证[/size][/font][/align][img]" style="max-width: 100% max-height: 100% [/img]首先用细胞增殖用于评估超速离心法分离的外泌体的生物完整性。不同浓度（10[font='times new roman'][sup][size=16px]6[/size][/sup][/font]、10[font='times new roman'][sup][size=16px]8[/size][/sup][/font]、10[font='times new roman'][sup][size=16px]10[/size][/sup][/font]颗粒/孔）的H1299细胞外泌体分别与H1299细胞共培养24、48和72小时。如图（a）所示，H1299细胞来源的外泌体以剂量依赖性方式显著促进细胞增殖。此外，伤口愈合实验显示，H1299细胞来源的外泌体加速了伤口愈合速度，并以剂量和时间依赖的方式提高了伤口愈合质量（图 b）。上述结果表明，通过超速离心法富集的外泌体具有完整性，可以促进细胞增殖、分化和迁移。[align=center][font='黑体'][size=14px]图[/size][/font][font='黑体'][size=14px]（a）H[/size][/font][font='黑体'][size=14px]1299[/size][/font][font='黑体'][size=14px]细胞来源的外[/size][/font][font='黑体'][size=14px]泌[/size][/font][font='黑体'][size=14px]体对细胞增殖的影响结果，（b）[/size][/font][font='黑体'][size=14px]H1299细胞来源的外[/size][/font][font='黑体'][size=14px]泌[/size][/font][font='黑体'][size=14px]体对细胞[/size][/font][font='黑体'][size=14px]划后伤口愈合[/size][/font][font='黑体'][size=14px]的影响结果[/size][/font][/align][align=left][font='times new roman'][size=16px]小结[/size][/font][/align]本章利用超速离心法富集了细胞来源的外泌体，并对富集得到的外泌体进行了一系列表征表征。通过透射电子显微镜和纳米颗粒示踪分析技术分析表明得到的外泌体具有典型的杯状结构和小的粒径分布，证明了富集方法的可行性。Western Blot结果表明，富集后得到的外泌体溶液经裂解后，特征蛋白HSC70、CD63、TSG101和CD81，其含量比富集前显著提高。利用细胞增殖实验和划痕实验证明超速离心法富集得到的外泌体具有良好的生物学活性，可应用于下游的实验研究。

脂质体包覆的COX-2抑制剂纳米颗粒的靶向化疗脂质体确 (liposome) 是一种磷脂和胆固醇组成的双层膜球形囊泡. 脂质体可以用天然的磷脂和磷脂乙醇胺 (phosphatidylethanolamine, 源于鸡蛋) 或纯表面活性剂, 如 DOPE (dioleolylphosphatidylethanolamine) . 脂质体通常含有一个核心的水溶液 (但这并非脂质体定义). 不含有水溶性物质的脂质双膜体被称为胶束(miscell).脂质体 (Liposome) 是由两个希腊词'脂'和 '体' 的意思构成. 脂质体本身并不表明任何大小之特点, 因此不同于纳米体 (nanosome). 1961年英国剑桥大学巴巴拉汉姆学院血液学家Bangham先生首次描述脂质体. Bangham先生与其同事Horne为了测试研究所新到的电子显微镜, 加负染色剂(三氯醋酸,TCA)于干磷脂中, 随后他们观察到一种类脂双层结构, 酷似质膜, 这就是首次显微镜照片展示的细胞膜实质性证据. 由于其独特的性能脂质体可用于药物载体, 这是由于亲水溶解溶质不能轻易通过脂质双膜, 而疏水性化学物质,可以溶解到脂质体膜内, 所以脂质体既可携带疏水性分子, 也可亲水性分子. 脂质体双层可以与其他细胞膜双层融合, 从而传递携带内含物. 用脂质体来投递DNA (lipofection) 比 单独用DNA感染细胞要有效的多. 低(或高) pH脂质体中的水溶解药物都带有电荷 (即pH值是药物的等电点范围以外) . 随着pH值自然抵销 (质子能通过膜), 因药物能自由穿过细胞膜, 中和后的脂质体药物也会自由扩散, . 这一投递是借脂质体双层膜与细胞接触来扩散脂质体药物, 而不是直接的融合. 所以这种脂质体药物的生产与使用受到时间上的限制.另一种脂质体药物投递的方式是借巨吞噬细胞作用. 一定大小范围内的脂质体可被人体中巨噬细胞吞噬. 脂质体药物在脂质体被巨噬细胞的胞溶体溶解后释放出来.加上陪体 的脂质体更易激活这种内吞噬作用.另一脂质体的好处是它的癌细胞靶向能力, 所有健康人的血管内皮都是由内皮细胞所包裹, 严密阻止任何大颗粒从血液中漏出. 但肿瘤血管则不具有相同水平的密封效果,通常小于400nm的脂质体可可迅速从患者的血液进入肿瘤. 抗癌药物如阿霉素(Doxorubicin, Doxil) 和柔红霉素 (Daunorubicin, Daunoxome ) 就是利用脂质体给药系统. 脂质体可用磷脂水经超声波而制成. 低剪切率超声波制成像洋葱多层状脂质体, 如持续用高剪切超声波则倾向于形成较小的单层脂质体 (unilamellar). 超声波法被普遍认为是"毛, 粗"的制备方法, 较新的方法, 如挤出法(extrusion)制成的脂质体药物可供人类使用.当前研究已经能够使脂质体能躲避人体的免疫系统, 成为"隐形脂质体", 即脂质体外挂上惰性聚乙二醇( PEG ), PEG脂质体延长循环中的药物运送. 但是 目前的困难是PEG涂的厚度. 太厚则阻止脂质体与细胞的接合. 为了特异性接合脂质体可挂上单克隆抗体, 或特异性抗原. 这样脂质体药物只送到病变组织.

流式细胞术是一项基于激光和免疫荧光的单细胞检测技术。当带有荧光标记的细胞或其它颗粒流动通过检测点时，激光与荧光素分子相互作用，产生的光信号可以定性或定量的表征细胞中被标记的成分。由于细胞的特异性主要由

研究人员报告说，以能检测到皮肤中的外来入侵物而最为出名的一组免疫细胞也能通过代谢环境中的化学物质而促进肿瘤的生长。包括皮肤及那些覆盖许多身体表面的上皮组织形成了一种抵御微生物及可以引起癌症的化学毒素的关键性的屏障。（在人类中，90%的癌症起源于上皮组织。）这些组织常常充满了树突状细胞，其中包括一个叫做朗格汉斯细胞的亚组细胞，这些细胞可识别抗原并将它们“穿戴”在其表面以警示T细胞进行防御反应。这些抗原可以是微生物，或它们也可来自肿瘤。然而，令人感到惊讶的是，缺乏朗格汉斯细胞的小鼠则可不受化学性致癌作用的侵害，而Badri Modi及其同事希望能找出其原因。他们如今用一种鳞状细胞癌的小鼠模型揭示了朗格汉斯细胞可驱使健康的皮肤细胞转变成为癌性细胞。朗格汉斯细胞在对致癌物7,12二甲基苯丙蒽（DMBA）进行回应时会增加其对某种叫做CYP1B1酶的表达，这种酶会将DMBA代谢成为一种可诱导细胞内突变的化合物。文章的作者指出，DMBA是一种聚芳烃，或PAH，而这些烃类化合物一般在工业污染中非常普遍。他们说，含有PAH的颗粒物质可能是人类皮肤癌中的一种未得到正确评价的环境因素。 —————————————————————————————————————————— 令人震惊的比例（人类90%），不过PAHs尤其是苯并芘（BAP）是强致癌物倒是听说过！

第 一 部 分 流式细胞术的一般介绍概念流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。流式细胞仪（Flow Cytometer)集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。流式细胞仪特点[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2008/11/200811302229_121122_1769204_3.gif[/img]

目前血细胞分析仪检测原理包括电学和光学两种，电学包括电阻抗法和射频电导法，光法包括激光散射法和分光光度法。电阻抗法根据Coulter原理及血细胞非传导的性质，以电解质溶液中悬浮的血细胞在通过计数小孔时引起的电阻变化进行检测为基础，进行血细胞计数和体积测定。当有细胞通过小孔时，由于电阻增加，于瞬间引起电压变化及通过脉冲。细胞体积越大，脉冲振幅越高，细胞数量越多，脉冲数量也越多。脉冲信号经过：放大、阈值调节、甄别、整形、计数而得出细胞技术结果。电阻抗法可准确量出细胞（或类似颗粒）的大小，是三分类血液分析仪的主要应用原理，并与光学检测原理组合应用于五分类血液分析仪中。激光散射法应用了流式细胞术检测原理及细胞通过激光束被照射时，产生与细胞特征相应的各种角度的散射光。对经信号检测器接受的散射光信息进行综合分析，即可准确区分正常类型的细胞。激光散射法在区别体积相同而类型不同的细胞特征时，比电阻抗法分群更加准确。故激光散射法已成为现代五分类血液分析仪的主要检测原理之一。射频电导法是用高频电磁探针渗入细胞膜脂质可测定细胞的导电性，提供细胞内部化学成分、细胞核和细胞质、颗粒成分等特征信息。射频电流是每秒变化大于10000次的高频交流电磁波，能够通过细胞壁。分光光度法是所有类型的血细胞分析仪检测血红蛋白的原理，它利用血红蛋白与溶血剂在特定波长下比色，吸光度的变化与液体中血红蛋白含量成比例。

多维流式细胞仪可同时进行多参数测量，在特定空间内对细胞群进行分析。若要实现该多维空间的合理使用，每个特定参数需提供额外信息来识别细胞群，并确保其动态范围能够最大限度地加以利用。本研究就白细胞的光信号散射情况进行了详细说明，从而促进了多维流式细胞分析的开展。细胞制备技术的提升对获得高分辨率光散射信号至关重要，可以实现粒细胞、单核细胞、颗粒状和非颗粒状淋巴球的完全分离。对搜集前向散射光的角度进行了改进，以提升白细胞的区分度。尽管正交光散射信号能够区分颗粒状和非颗粒状淋巴细胞，但仍无法利用线性或对数函数的形式将分辨率和动态范围显示出来。而在正交光散射信号中应用多项式函数，则可将白细胞全部以高分辨率显示出来。关联前向和正交光散射信号可实现高分辨率光散射与非线性显示的结合，使细胞群呈现等距分布状态。使用这种方式，可将外周血中性粒细胞、嗜酸细胞、嗜碱粒细胞、单核细胞、颗粒状和非颗粒状淋巴细胞等都显示出来，占据与正交和前向光散射相关的不同位置。出人意料的是，嗜碱粒细胞是处在了颗粒状淋巴和单核细胞附近而非中性和嗜酸性粒细胞。流式细胞术中的人体白细胞光散射特性主要应用于区分淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。前向光散射信号与细胞的大小和折光率有关，而正交光散射信号则与细胞的粒度有关。一项对正交光散射信号更进一步的分析显示出了淋巴细胞成分的差异，即非颗粒状淋巴细胞的信号比颗粒状的要低。此外，该方法还显示了白血球的正交光散射信号在不同疾病状态下的变化情况。高分辨率光散射要在最佳角度收集散射参数，并对散射光的收集光路进行优化。改进细胞制备方法对最大限度地实现对细胞群的分离至关重要。改变制备流程可能导致细胞群分辨率的提高或降低。通过光散射，可从测量中排除受损细胞和无核细胞的干扰，从而提高细胞群的分辨率。正交光散射信号的动态范围不允许在相同线性尺度上同时观察淋巴细胞群和中性粒细胞。本研究提供了一种新方法，通过对正交光散射信号进行数字信号处理转换，实现了白细胞群在光散射显示中更加均衡的分布。这种转换提升了淋巴细胞分辨率，实现了细胞的可视化，而动态范围的确定对中性粒细胞的观察也十分重要。因此，重新对细胞群在多维空间进行定位可使细胞群在制备过程中实现完美分离。

水溶性颗粒剂的制备方法一、水溶性颗粒剂的制备方法提取方法因中药含有效成分的不同及对颗粒剂溶解性的要求不同，应采用不同的溶剂和方法进行提取。多数药物用煎煮法提取，也有用渗漉法、浸渍法及回流法提取。含挥发油的药材还可用“双提法”。1．煎煮法系将药材加水煎煮取汁的方法。一般操作过程如下：取药材，适当地切碎或粉碎，置适宜煎煮容器中，加适量水使浸没药材，浸泡适宜时间后，加热至沸，浸出一定时间，分离煎出液，药渣依法煎出2－3次，收集各煎出液，离心分离或沉降滤过后，低温浓缩至规定浓度．稠膏的比重一般热测(80－90℃)为1．30－1．35。为了减少颗粒剂的服用量和引湿性．常采用水煮醇沉淀法，即将水煎煮液蒸发至一定浓度(一般比重为1：1左右)，冷后加入1－2倍置的乙醇，充分混匀．放置过夜，使其沉淀，次日取其上清液(必要时滤过)，沉淀物用少量50％－60％乙醇洗净，洗液与滤液合并，减压回收乙醇后，待浓缩至一定浓度时移置放冷处(或加一定量水．混匀)静置一定时间，使沉淀完全，率过，滤液低温蒸发至稠膏状。煎煮法适用于有效成分能溶于水，且对湿、热均较稳定的药材。煎煮法为目前颗粒剂生产中最常用方法，除醇溶性药物外，所有颗粒剂药物的提取和制稠膏均用此法。2．浸渍法系将药材用适当的溶剂在常温或温热条件下浸泡，使有效成分浸出的一种方法。其操作方法如下：将药材粉碎成粗末或切成饮片，置于有盖容器中，加入规定量的溶剂后密封，搅拌或振荡，浸渍3－5天或规定时间，使有效成分充分浸出，倾取上清液，滤过，压榨残液渲，合并滤液和压榨液，静止24小时，滤过即得。浸渍法适宜于带粘性、无组织结构、新鲜及易于膨胀的药材的浸取，尤其适用于有效成分遇热易挥发或易破坏的药材。但是具有操作用期长，浸出溶剂用量较大，且往往浸出效率差，不易完全程出等缺点。3．渗漉法系将经过适宜加工后的药材粉末装于渗漉器内，浸出溶剂从渗漉器上部添加，溶剂渗过药材层往下流动过程中浸出的方法。其一般操作方法如下：进行渗漉前，先将药材粉末放在有盖容器内，再加入药材量60％－70％的浸出溶剂均匀润湿后，密闭，放置15分钟至数小时，使药材充分膨胀以免在渗漉筒内膨胀。取适量脱脂棉，用浸出液湿润后，轻轻垫铺在渗漉筒的底部，然后将已润湿膨胀的药粉分次装人渗漉筒中，每次投入后均匀压平。松紧程度根据药材及浸出溶剂而定。装完后．用滤纸或纱布将上面覆盖，并加一些玻璃珠或石块之类的重物，以防加溶剂时药粉浮起；操作时．先打开渗漉筒浸出液出口之活塞，从上部缓缓加入溶剂至高出药粉数厘米，加盖放置浸渍24－48小时，使溶剂充分渗透扩散。渗漉时，溶剂渗入药材的细胞中溶解大量的可溶性物质之后，浓度增高，比重增大而向下移动，上层的浸出溶剂或较稀浸出溶煤置换其位置，造成良好的细胞壁内外浓度差。渗漉法浸出效果及提取程度均优于浸渍法。渗漉法对药材粒度及工艺条件的要求较高，一般渗漉液流出速度以1kg药材计算，慢速浸出以1—3ml/min为宜；快速浸出以3—5ml/min为宜。渗漉过程中，随时补充溶剂，使药材中有效成分充分浸出。浸出溶剂的用量一般为1：4—8(药材粉末：浸出溶剂)。4．其它(1)动态温浸工艺：将原药材破碎到规定粒度．使药材与溶媒有效接触面积扩大．在适当的温度范围内保持恒温；用机械搅拌促进流动，实现药材界面内外浓度差，有利于有效成分快速浸提，而低温温浸，药液不沸腾，避免了淀粉的过分裂解糊化．既方便了固液分离和离心除杂，又避免了水蒸气共沸蒸馏成分的损失。因此，动态温浸工艺与传统的静态沸腾提取工艺相比，具有提取效率高，保存有效成分多，缩短工时，降低耗能等优点。(2)超速离心除杂与超滤除杂技术：与传统的醇醉沉除杂工艺相比，超速离心与超滤(采用微孔滤膜，经加压滤过)除杂技术，避免了具有免疫调节作用的多糖和肽类成分的损失，天然成分保留较完全，既使中药汤剂的特色得到发挥，同时又缩小了剂量，制得的颗粒质量高．稳定性好”。(二)浓缩、干燥技术药材中指标成分提提取后，制成原颗粒之前应得到流动性粉末为宜，因此提取液必须浓缩与干燥，需要一定温度除去水，伴随有效成分的损失与破坏。如长瓣金莲花的水煎液常压浓缩1小时、16小时及26小时，总黄酮含量分别降低6．25％、20％及39％，时间越长有效成分破坏越多。又如采用常压浓缩或减压浓缩制备三黄泻心汤干浸膏，结果成品中番泻苷、黄芩苷的含量降低了23％－94％，改用逆渗透液缩和喷雾干燥技术，含量仍降低1％—6％，当归芍药汤的汤液作成软膏后．其仓术醇和β－桉醇含量分别只有原药材的0.04％和0．14％。通常浓缩最简易是采用真空度1．33kPa(即10mmHg)，温度约40℃即可，若采用薄膜浓缩、离心薄膜浓缩则效率可提高，且可降低对有效成分的影响。浓缩液一般浓缩到20％—50％，进行干燥，喷雾干燥操作简便、速度快，产品细度均匀，干燥过程液滴干燥的实际温度仅35－50℃，在几秒或十几秒钟完成，被干燥物料不致发生过热现象，不耐热或对热不稳定的成分不致破坏，如大黄浓缩液以进风温度20℃、出风温度105℃进行干燥，其番泻苷A几乎不分解，但高于上述温度会分解。大多数中药成分浓缩液的进风温度在110－130℃，出风温度65－80℃，都能喷出流动性好的粉末。近年来，有人认为最佳干燥条件应从控制液温和浸膏粒度大小着手。液滴大小可用激光测定，其原理是激光的折射角能定量地随粒度大小而变化．该平均粒径随着雾化器转速的增加而减小，干浸膏粉末的粒度大小由光学显微镜或库氏测定仪改为精确度高的激光测定，干浸膏粉末粒度和汤液雾滴大小是相互关联的，如庶黄附子细辛汤的干浸膏粉末的粒度比其雾滴直径要小得多。浸膏剂的浓缩与干燥方法很多，最近常用于中药浸膏的浓缩或干燥的新技术有：薄膜浓缩、反渗透法和喷雾干燥、离心喷雾干燥、微波干燥及远红外干燥技术等。现举例说明喷雾干燥与冷冻干燥技术的在中药颗粒剂制备中的应用。1．喷雾干燥与干法制粒工艺该法是将药材浸出液经喷雾干燥制成于浸膏粉，加入辅料．先预压成粗片，然后粉碎成颗粒的一种新工艺。它实现了瞬间干燥，防止了有效成分损失，同时保证了颗粒和性状的均一性，使颗粒具有较稳定的崩解性和溶散性，从而克服了湿法造粒工艺的溶媒残留、变色、储存不稳定等缺点。上海中药制药一厂利用动态水提取和干法制粒工艺，成功地研制出粒度集中、不易粘连的六昧地黄丸(颗粒型)冲剂。2．冷冻浓缩与冷冻干燥技术冷冻浓缩技术是使药液于—5～—20℃低温冷冻，通过不断搅拌使结出冰块成为微粒，然后以离心机除去冰屑而得到浓缩的浸膏。此种超低温浓缩可达到有效成分的高保留率。如桂枝芍药汤中的有效成分桂皮醛，采用冷冻浓缩法可保留该成分为一般真空加热浓缩法的50倍之多。但反潮性强，成本高，未能用于大量生产。小太郎株式会社为了保证成品质量，在生药煎液高真空浓缩后采用冷冻干燥，先降温至—50℃．在高真空下干燥。冷冻浓缩和冷冻干燥技术，可以保证中药挥发性有效成分在生产中不被破坏或损失。

美国北卡罗莱纳大学教堂山分校文理学院的首席化学教授约瑟夫—德西蒙博士领导的研究小组发现，人体中的一种正常的良性蛋白质，如果和纳米粒子相结合，就能瞄准并杀死癌细胞，而无须负载那些携带化疗药物的粒子。此前，研究人员曾认为，纳米粒子只有携带了有毒的化学载体才能达到这样的效果。转铁蛋白是人体血液中数量第四多的蛋白质，近20年来一直被作为肿瘤靶向载体用以递送治癌药物。纳米粒子通常也是无毒的，需要通过负载标准化疗药物来治疗癌症。然而，结合转铁蛋白的“打印”纳米粒子，不仅能识别它们，还能诱导癌细胞死亡。而不与任何纳米粒子结合的自由转铁蛋白，能从拉莫斯癌细胞中获得养料生长，即使在很高浓度下也不会杀死任何拉莫斯癌细胞。然而令人吃惊的是，转铁蛋白附着在纳米粒子表面后，其能有效地筛选标靶，攻击并杀死B细胞淋巴瘤。在许多迅速生长的癌细胞表面，蛋白质受体被过度表达，于是和转铁蛋白配体结合的治疗就能找到并瞄准它们，而结合转铁蛋白的纳米粒子被认为是安全且无毒的。德西蒙实验室发明了一种“打印”技术，能人为造出尺寸精确且形状符合预期的纳米颗粒。他们采用这种技术制作出一种可与人类转铁蛋白相结合的生物相容性纳米粒子，其能安全且精确地识别广谱癌症，除了B细胞淋巴瘤外，还能有效地指向非小型细胞，如肺、卵巢、肝脏和前列腺的癌细胞。研究人员目前正在进一步研究，携带转铁蛋白的纳米粒子如何及为何对于拉莫斯癌细胞是有毒的，而对其他细胞却无毒。化学治疗和放射治疗曾被认为是癌症的最有效疗法，但这些疗法通常会损害健康组织和器官。这一发现将可能发展出一种全新的策略来治疗某种类型的淋巴瘤，而副作用更小。不过，德西蒙承认，该研究也会引起一些人对不可预期后果的担忧，即一个设计好的针对某类癌症的靶向化疗载体是否会偏离目标。

[align=center][size=24px]流式细胞仪监测适配体与靶细胞的结合[/size][/align][align=center]肖书棋 18122884967[/align][align=center][/align]本次说明是基于核酸适配体能与靶标进行特异性结合的原理，利用流式细胞仪监测适配体与靶细胞的结合状况，还能比较不同适配体与靶细胞之间的结合强度的比较；本次所使用的流式分析仪是BD FACSAria III。[font='times new roman'][size=16px]1.原理介绍：[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1.1核酸适配体：[/size][/font]核酸适配体(Aptamer，Apt）：是一段寡核苷酸序列（ssDNA或RNA），是利用指数富集的系统进化技术（the Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX）在多样寡核苷酸序列的文库中，进行体外筛选得到。[align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/11/202111301026239049_1528_5413603_3.jpeg[/img][/align][align=center][size=13px]Aptamer结合靶标原理[/size][size=13px]图[/size][/align]如图所示，在合适的缓冲液环境下，单链寡核苷酸序列具有弯曲以及折叠成特定的三级空间结构的能力，该结构可以与靶分子特异性结合，SELEX技术就是应用该原理来进行选择的。将信息量巨大且随机的的寡核苷酸文库与靶标孵育，经过多轮的优胜劣汰和PCR扩增，最后得到能与靶标高亲和力性结合的寡核苷酸序列，即核酸适配体(Aptamer)。由于核酸适配体具有靶向特异性的特点，因此应用广泛；那么如何监测适配体靶向细胞亲和力的方法，就需要用到流式细胞术进行表征。[font='times new roman'][size=16px]1.2流式细胞仪原理：[/size][/font]流式细胞术能够快速检测细胞或者生物颗粒的特征，其检测灵敏，能够定性或者定量分析颗粒的参数，还具有细胞分选的功能，功能强大，分析参数多，实用性较强。流式细胞仪（flow cytometer，FCM）的设计应用了光学、细胞化学、电子学等技术，拥有较强大的细胞及微粒分析功能，在临床医学、免疫学、微生物学等等研究领域发挥着巨大的作用。流式分析可以检测细胞表面颗粒复杂程度、核酸以及蛋白质的含量、细胞表面积或者细胞表面的抗体、细胞受体等等，在多种研究领域起到重要作用。在本研究中应用流式分析细胞荧光强度的基本步骤原理是：（1）制备成单细胞悬液：将待测细胞预处理进行荧光标记后制成单细胞悬液，通过气压将流式管中的细胞悬液通过管道压进流动室，同时喷出的鞘液将细胞包裹，形成圆形的鞘流，细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过流动室检测区域。（2）形成光散射：激发光源侧向垂直射向单个细胞，含有荧光的细胞形成两种光：①前向散射光（forward scatter， FSC）：激光束照射细胞时，光束偏移量较小（10°以内），散射至前方，可用于检测细胞等粒子的表面信息，颗粒体积越大，信号越强。②侧向散射光（side scatter，SSC）激光束照射颗粒，产生偏移角度为直角的散射光，可反应细胞内含物的信息。（3）光信号转化成电信号：光信号导入到计算机中，依次形成电信号，再转化为数字信息。应用FlowJo软件处理数据，可以获得相应的散点图、直方图等形式，便于直观分析。[align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/11/202111301026241158_6946_5413603_3.jpeg[/img][/align][align=center][font='times new roman'][size=13px]流式分析基本原理图[/size][/font][/align][font='times new roman'][size=16px]2.分析步骤：[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2.1细胞预处理：[/size][/font]通过流式分析预处理，可以使细胞在特定的环境，与带有FAM荧光的适配体进行特异性结合，通过平行实验使细胞与不同的适配体文库进行标记，最终表征其荧光强度，进行亲和力的分析与比较。如表所示，流式分析条件为：[align=center][size=13px]流式细胞分析条件探寻[/size][/align][table][tr][td][align=center][size=13px][color=#000000]孵育时条件[/color][/size][/align][/td][td][size=13px][color=#000000]孵育时体积[/color][/size][/td][td=2,1][align=center][size=13px][color=#000000]孵育时浓度[/color][/size][/align][align=center][size=13px][color=#000000]细胞浓[/color][/size][size=13px][color=#000000]度 [/color][/size][size=13px][color=#000000]单链DNA浓度[/color][/size][/align][/td][td][align=center][size=13px][color=#000000]第二次洗涤用液[/color][/size][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][size=13px][color=#000000]4 ℃，30 min,BB,摇晃[/color][/size][/align][/td][td][align=center][size=13px][color=#000000]500 μL[/color][/size][/align][/td][td][size=13px][color=#000000]2.5×10^6个/mL[/color][/size][/td][td][align=center][size=13px][color=#000000]125 nM[/color][/size][/align][/td][td][align=center][size=13px][color=#000000]PBS x 2[/color][/size][/align][/td][/tr][/table]流式分析的大致步骤为：消化细胞、细胞与文库孵育、润洗重悬、上样分析。最终确定，初始的细胞悬液浓度为5×10[font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font] 个/mL，初始文库的浓度为250 nM；孵育时体系的总体积为250 L，细胞浓度为2.5×10[font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font]个/mL，适配体浓度为125 nM，环境为4 ℃、30 min，震荡。最后上样的细胞悬液体积为500 L，细胞浓度为2.5×10[font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font]个/mL。[align=left][font='times new roman'][size=16px]2.1.1材料准备：[/size][/font][/align][align=center][size=13px] 流式分析主要仪器与试剂[/size][/align][table][tr][td][align=center]名称[/align][/td][td][align=center]规格/型号[/align][/td][td][align=center]作用[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]流式细胞仪[/align][/td][td][align=center]FACSAria III[/align][/td][td][align=center]对细胞进行流式分析[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]可调式混匀仪[/align][/td][td][align=center]MX-S[/align][/td][td][align=center]混悬适配体悬液[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]震荡仪[/align][/td][td][align=center]MX-M[/align][/td][td][align=center]震荡孵育体系，防止细胞贴壁[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]制冷恒温金属浴[/align][/td][td][align=center]HX-20L[/align][/td][td][align=center]热击适配体，使核酸变性恢复到自由的无规则卷曲状态[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]显微镜[/align][/td][td][align=center]DMI1[/align][/td][td][align=center]观察细胞[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]水浴氮吹仪[/align][/td][td][align=center]FY-DCY12S[/align][/td][td][align=center]加热试剂[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]电子天平[/align][/td][td][align=center]JA2003[/align][/td][td][align=center]称量药品[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]离心管[/align][/td][td][align=center]15 mL×10、50mL×10[/align][/td][td][align=center]分装试剂，装载需离心的细胞[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]低吸附离心管[/align][/td][td][align=center]2 mL×20[/align][/td][td][align=center]装适配体悬液，减少适配体与细胞在管壁上的吸附[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]一次性使用吸管[/align][/td][td][align=center]3 mL×20[/align][/td][td][align=center]方便地吸取PBS[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]细胞刮刀[/align][/td][td][align=center]3010×1[/align][/td][td][align=center]刮下贴壁生长的细胞[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]PBS[/align][/td][td][align=center]50 mL×2[/align][/td][td][align=center]ScienCell[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]Cell Dissociation Solution[/align][/td][td][align=center]100 mL[/align][/td][td][align=center]消化细胞[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]0.25%Trypsin-EDTA[/align][/td][td][align=center]100 mL[/align][/td][td][align=center]Gibco[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]1×PBS缓冲液[/align][/td][td][align=center]500 mL[/align][/td][td][align=center]润洗细胞，重悬细胞[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]Cell Dissociation Solution[/align][/td][td][align=center]100 mL[/align][/td][td][align=center]消化细胞[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]0.25%Trypsin-EDTA[/align][/td][td][align=center]100 mL[/align][/td][td][align=center]Gibco[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]1×PBS缓冲液[/align][/td][td][align=center]500 mL[/align][/td][td][align=center]润洗细胞，重悬细胞[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]无酶无菌水[/align][/td][td][align=center]500 mL[/align][/td][td][align=center]溶解适配体文库[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]DMEM高糖培养基[/align][/td][td][align=center]50 mL[/align][/td][td][align=center]停止消化[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]细胞[/align][/td][td][align=center]＞5×10[font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font]个[/align][/td][td][align=center]作为目的细胞进行流式表征[/align][/td][/tr][/table]①配置Binding buffer（结合缓冲液BB）：配置10 g/L BSA：称量0.1g BSA，溶于10 mL Washing Buffer，过膜；取上述溶液5 mL，加入到445 mL Washing Buffer中；再加入500 L鲑精DNA，混匀。②将U盘格式化，提前打开制冰机和金属浴（95℃）；③37℃水浴：将无酶消化液、ECM、PBS（1）放入37℃水浴。④4℃冰敷：向泡沫盒中加碎冰，离心管架、温度计，准备4℃孵育环境，放入PBS和BB预冷。⑤打开显微镜（酒精擦拭载物台）。⑥打开离心机：120 g，1 min，25℃。[align=left][font='times new roman'][size=16px]2.1.2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]计数和文库预处理[/size][/font][/align]（1）细胞计数（20倍或者40倍显微镜）：①采用直接计数法，在显微镜中随机选择五个点进行计数取平均值，根据视野的面积以及T75培养瓶面积计算细胞总数，推出公式：Y为总细胞数；X为视野中细胞平均数；Y=27886.12X（20倍镜下）/Y=111111.11X（40倍镜下)。为了保证流式有足够的细胞，需要保证细胞总数＞5×10[font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font]个/mL。②计算BB体积：V=Y/（2×10[font='times new roman'][size=16px]7[/size][/font]）mL，用V体积的BB重悬细胞沉淀，可获得细胞浓度为5×10[font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font]个/mL的初始细胞悬液。（2）文库预处理：①将粉末状适配体文库进行离心：4000 r，5 min，4℃；使适配体粉末聚集在离心管底部，防止打开离心管时干粉状适配体飞出。②按照说明用一定体积的无酶无菌水溶解适配体，使适配体母液浓度在5 M。③取100 L母液，并加入900 LBB，使适配体浓度在500 nM。④再去上述液体500 L，并用BB稀释至浓度为250 nM，最终得到250 nM的适配体文库悬液。⑤95℃热击3 min，热击后放在泡沫盒中冰敷。[align=left][font='times new roman'][size=16px]2.1.3[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]细胞处理[/size][/font][/align]（1）消化：①PBS（37℃）润洗3次。②无酶消化液3 mL，消化9 min（等待期间准备好孵育用离心管；确认离心机参数为：120 rcf，1 min，25 ℃），吹打细胞使其从培养瓶表面脱落。直接转移至15mL离心管中，吹打混匀约20次（吹散细胞团，分离成单个细胞）。③显微镜观察确认细胞均从培养瓶上脱落，加入2-3 mL ECM至培养瓶中润洗，然后转移至上述离心管中，吹打终止消化。④离心：120 rcf，1 min，25℃。（等待期间各加入250 L待测文库至低吸附离心管中,注意要快速，吸取之前需要先混悬文库）。⑤离心之后小心倒出，用枪吸出剩下的ECM，加入2V L BB，重悬吸打混匀，获得5×10[font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font]个/mL的细胞悬液。[align=left][font='times new roman'][size=16px]2.1.4[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]细胞与文库结合[/size][/font][/align]①孵育：分别加入250 μL上述细胞悬液至250 μL ssDNA文库中，进行孵育：4℃，30 min，打开摇床第二格。②等待期间离心机调至4℃；用密封袋装好洁净的1000 L枪头准备流式上样用；2.2.2.5 润洗重悬细胞①取出孵育好的体系，进行离心：4℃，120 g，1 min（等待期间准备好4℃ PBS)。②倒掉上清液，用枪头小心吸出管口残留的上清液，每管加500 L PBS（4℃）用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液枪[/color][/url][/color][/url]吸打重悬约20次。③再次离心4℃，120 g，1 min。④第二次重悬：重复①-③步骤。⑤每管加入500 L PBS重悬，忽略实验损失，最后得到理论细胞浓度为2.5×10[font='times new roman'][size=16px]6[/size][/font]个/mL的细胞悬液。[font='times new roman'][size=16px]2.2[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]送样分析[/size][/font]FAM荧光染色较弱，在预处理之后应尽快进行流式分析，流式分析上样程序复杂，需要正确进行开机，测样，关机的步骤，才能够得到准确的数据。[align=left]（1）准备工作：[/align][align=left]准备1000 mL[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液枪[/color][/url][/color][/url]，1000 mL 洁净枪头，流式管，质控微球。[/align][align=left]①开启液流系统：由上至下打开流式细胞仪开关；再开启计算机，打开FACSDiva软件，在“Cytometer仪器框”中确认流式细胞仪已与电脑连接，启动液流之前，确认液流系统水平，进行补充鞘液、去离子水、乙醇以及漂水，并清空废液。[/align][align=left]在“Cytometer”菜单中，点击“Fluidics Startup（启动液流系统）”，按照提示进行操作：确定气路和液路是从乙醇桶连接到了鞘液桶上：将蓝色液路管接到过滤器下方，透明气路管接到鞘液桶上；确定闭合的喷嘴是在流动检测池上。[/align][align=left]②将70 m的喷嘴放入装有超纯水的烧杯中，超声30 s，用无尘纸蘸干；抽出闭合的喷嘴；插入70 m的喷嘴（红圈朝上）。[/align][align=left]③点击“×steam”，开启液流，出现水滴状，调整使上端横线位于第二个或者第三个水滴的尾部，下端横线位于第三个或者第四个液滴的中部，调整好后关闭液流。[/align][align=left]（2）做质控：[/align][align=left]①用CS&T微球，用之前一定将微球甩匀（保证取出的微球呈均匀体系）用涡旋震荡；取一支洁净的流式管加入333 L的鞘液，再加一滴微球（用之前用混悬仪混匀，正常的微球为浑浊状）。[/align][align=left]②打开液流系统，在“Cytometer”菜单下点击“CST”；展开Setup Control窗口：在Characterize菜单中中选择“Check Performence”；在Configuration流式设置中：喷嘴的大小：选择70m，点击左下角“set configuration”，再点击“OK”。[/align][align=left]③选择微球的Lot ID：与微球瓶身上编号对应：10549。[/align][align=left]④敲弹准备好的微球悬液使其混匀，进行上样，打开液流；确认激发光源没问题即可关掉页面并关掉液流。[/align][align=left]（3）上样：[/align][align=left]①新建样品，并勾选FITC、SSC、FSC的H、A、W、log数据项。[/align][align=left]②作图：建立散点图，横坐标为FSC-H，纵坐标为SSC-H；再建立一个图：横坐标：FITC-H，纵坐标为：Count。[/align][align=left]③打开液流至3，选择对应样品；吹打混匀并放置样品，点击“LOAD”上样。调整FSC和SSC的电压，使散点图的中的点都集中在所圈的门中。（若散点偏右，则FSC电压过大，调整FSC电压使其变小，若散点偏上，则调整SSC使其变小。）当调整合适时点击“RECORD”记录数据。[/align][align=left]④计数完毕，调低流速，点击“unload”，选择第二个样品并重复第③步。[/align][align=left]⑤上样完毕之后，保存数据。[/align][align=left]（4）关机步骤：[/align][align=left]①上一管clean液，高速冲2 min；再上一管去离子水，高速冲5 min；关闭液流，检查液路系统。[/align][align=left]②在“Cytometer”菜单中，选择“shutdown”，根据指示操作：取下70 m的喷嘴，超声清洗，安装闭合喷嘴（红色点朝上）。[/align][align=left]③把液路和气路连接到乙醇桶上，用乙醇冲洗（先拔气路再拔液路）。[/align][align=left]④装一管clean液，清洗上样针和流动池。[/align][align=left]完成上述步骤之后即可关闭界面。[/align][align=left][/align][font='times new roman'][size=16px]2.3数据处理：[/size][/font]将原始数据用Flowjo软件进行处理，得到散点图以及荧光强度直方图，接下来通过举例来说明数据如何分析：（1） 散点图分析：[align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/11/202111301026242555_5228_5413603_3.jpeg[/img][size=13px]数据处理分析散点图[/size][/align]该图为散点图，可以看出大体分为两个集团，散点图有两个集团说明体系中有两种细胞粒子，并且在该图片的左下角粒子较少，说明细胞碎片较少，在预处理时较好地保护了细胞的完整性。散点图中可以区分出整个上样的体系中主要含有两种大小的细胞颗粒，在预处理的过程中，无酶消化液的消化能力较弱，并且细胞团密度较大，细胞间黏连较多，在最后孵育结束用PBS进行重悬的时候仍然能够肉眼可见有白色细微絮状物。FSC值越大，代表颗粒的体积越大；SSC值越大，代表颗粒内部的复杂程度越高。故可初步判断，G1门中的颗粒为未消化完全的细胞团，而G2门中的颗粒为分散的单个细胞。（2） 直方图分析：[align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/11/202111301026243736_5071_5413603_3.jpeg[/img][size=13px]数据处理分析直方图[/size][/align]图中为G2门选中的样品的荧光强度，该图中有两个峰，横坐标10[font='times new roman'][size=16px]2[/size][/font]附近所产生的荧光峰可以判定是残留的细胞碎片，可视为背景值，横坐标10[font='times new roman'][size=16px]4[/size][/font]~10[font='times new roman'][size=16px]5[/size][/font]附近的峰代表四个适配体分别与细胞结合所产生的荧光强度，SYL3C-Aptamer结合偏移量最大，荧光较强，且高荧光事件次数较多，说明SYL3C-Aptamer与单个细胞的结合能力最强，并且G2门中的颗粒大多数为消化完全的单个细胞，呈现出较好的特异性。总之，该组结果对比体现出，单个细胞靶点较多，适配体与单个细胞结合能力较高，通过荧光强度波峰的偏移所反映的适配体与细胞特异性结合能力的大小依次为SYL3C-Aptamer＞EP166-Aptamer＞CA2-Aptamer＞ARC1172-Aptamer。同时，由图中可以看出：10th-ssDNA pool与SYL3C-Aptamer在10[font='times new roman'][size=16px]4[/size][/font]～10[font='times new roman'][size=16px]5[/size][/font]荧光强度波峰较高，说明二者与单个细胞的结合能力较好，结合位点较多，呈现良好的特异性和亲和性。SYL3-Aptamer荧光波峰明显右移，与单个细胞的结合位点较多。[font='times new roman'][size=16px]三、总结[/size][/font]本次说明旨在利用带荧光的适配体靶向特异性结合目的细胞的原理，利用流式细胞仪监测适配体结合靶细胞能力的强弱，同时还可以应用于不同适配体靶向同一种细胞的结合能力强弱的比较。进一步利用流式细胞仪，还可以测定适配体的Kd值；还可以根据预处理的条件不同，与对照组比较，来测定适配体靶向细胞的受体是位于细胞膜表面还是细胞内，从而进一步测定适配体的生物学稳定性。同时，流式细胞仪还有很多方面的应用，例如鉴定细菌、检测细胞凋亡等，一些抗体-细胞复合物的结合情况也能够由流式细胞仪来进行监测。 在进行流式上样的过程中，预处理、上样以及数据处理阶段都有需要注意的细节，例如：本次所使用的细胞为贴壁生长的内皮细胞，故在细胞预处理时需要先消化细胞；在进行上样前，需要将样品进行吸打混匀，以免细胞沉积在流式管底部，导致未吸取到样品；在应用流式细胞仪的过程中，使用前的维护、质控流程十分重要，该流程会直接影响所得数据的稳定性；不同的流式细胞仪的维护程序稍有不同，本次说明中的使用方法只适用于BD FACSAria III，流式细胞仪具有强大的分析功能，其在细胞研究中具有重要的作用。[align=left][/align][align=left][/align][align=left][/align][align=left][/align]

给大家推荐一款美国进口的液体中颗粒物测定仪，希望对大家有帮助PC-2200激光颗粒计数器用于测定水及各种液体中颗粒物的数量及粒径大小,粒径范围0.5-100µm.既可测定流动液体也可测定容器内的静止液体.特点:* 易于用户自行校准* SuperCount软件* 结构紧凑,便于携带* 快速测定颗粒数量及粒径* 对流动液体无交叉污染* 无需样品冲洗http://www.morechina.com.cn/Spectrex/images/pc-2200_1.jpg工作原理:采用"近前向光散射"原理,旋转激光束通过流通池的玻璃器壁,当光束通过中心"感测区"时,PC-2200同时测出悬浮颗粒的的数量和粒径大小.光脉冲产生的模拟信号输入计算机并进行数字化.http://www.morechina.com.cn/Spectrex/images/pc-2200_2.jpghttp://www.morechina.com.cn/Spectrex/images/pc-2200_3.jpg校准:每套仪器提供3个密封的校准标准.每个校准标准含有精确数量和已知粒径的聚苯乙烯球体颗粒,可进行NIST溯源,采用惰性氩气密封.该标准的稳定性经证实超过10年,10分钟内即可提供有效的校准.应用:* 水处理厂* 大学实验室* 制药厂* 炼油厂和钻井现场* 装瓶和饮料操作* 海洋学研究* 液压机液体和石油质量控制* 液相色谱法溶剂质量控制* 冷却塔和废水过滤器效率* 颗粒凝聚研究* 泥沙和沉淀物粒径筛分* 颗粒沉淀特性研究* 腐蚀性化学品和溶剂粒径筛分* 小瓶和安瓿针剂检查* 去离子水和酸性试验* 细胞计数SuperCount 软件显示以下测定数据:* 颗粒数量* 平均直径* 质量分布* 百分比分布* 标准偏差* 总悬浮固体技术参数:* 仪器尺寸:120×355×114mm* 测量瓶尺寸:15-60mm内径* 测量瓶材料:透明,无划痕玻璃瓶* 重量:2.7Kg* 电源:230VAC/50Hz* 可测粒径范围:0.5-100µm选配附件:http://www.morechina.com.cn/Spectrex/images/pc-2200_4.jpghttp://www.morechina.com.cn/Spectrex/images/pc-2200_5.jpghttp://www.morechina.com.cn/Spectrex/images/pc-2200_6.jpg不透明度指示计5ml小瓶附件流通池

我国现行环境标准规定，凡粒径在100微米以下的颗粒物统称为总悬浮颗粒物简称TSP.粒径大于100微米的叫做降尘。另一种粒径小于10微米的颗粒物叫飘尘简称PM10.飘尘中很大一部分比细菌还小，人眼观察不到，它可以几小时、几天或者几年飘浮在大气中。飘浮的范围从几公里到几十公里，甚至上千公里。因此在大气中会不断蓄积使污染程度加重。飘尘也称可吸入尘，它能越过呼吸道的屏障，粘附于支气管壁或肺泡壁上。粒径不同的飘尘随空气进入肺部，以碰撞、扩散、沉积等方式，滞留在呼吸道的不同部位。各种粒径不同的微小颗粒，在人的呼吸系统沉积的部位不同，粒径大于10微米的，吸入后绝大部分阻留在鼻腔和鼻咽喉部，只有很少部分进入气管和肺内。粒径大的颗粒，在通过鼻腔和上呼吸道时，则被鼻腔中鼻毛和气管壁粘液滞留和粘着。据研究，鼻腔滤尘机能可滤掉约为吸气中颗粒物总量的30～50％。由于颗粒对上呼吸道粘膜的刺激，使鼻腔粘膜机能亢进，腔内毛细血管扩张，引起大量分泌液，以直接阻留更多的颗粒物，这是机体的一种保护性反应。若长期吸入含有颗粒状物质的空气，鼻腔粘膜持续亢进，致使粘膜肿胀，发生肥大性鼻炎。此后由于粘膜细胞营养供应不足，使粘膜萎缩，逐渐形成萎缩性鼻炎。在这种情况下鼻腔滤尘机能显著下降，进而引起咽炎、喉炎、气管炎和支气管炎等。 长期生活在飘尘浓度高的环境中，呼吸系统发病率增高。特别是慢性阻塞性呼吸道疾病如气管炎、支气管炎、支气管哮喘、肺气肿、肺心病等发病率显著增高，且又可促进这些病人病情恶化，提前死亡。 在颗粒物表面还能浓缩和富集某些化学物质如多环芳烃类化合物等，这些物质常常浓缩在颗粒物表面，成为该类物质的载体，随呼吸进入人体成为肺癌的致病因子。许多重金属如铁、铍、铝、锰、铅、镉等的化合物附着在颗粒表面上，也可对人体造成危害。在作业环境中长期吸入含有二氧化硅的粉尘，可以使人得矽肺病。这类疾病往往发生于翻砂、水泥、煤矿开凿等工作中。另外石棉矿开采及其加工中石棉尘被人吸入也可成为致癌因子。总之，颗粒物特别是10微米以下的飘尘是影响人体健康的主要污染物之一。

概念：细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。基本步骤：1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率 =（克隆数/接种细胞数）×100%平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

全自动血细胞分析仪——能依靠它们去计数吗？库尔特原理库尔特原理指出：悬浮在电解液中的颗粒随电解液通过小孔管时，在恒电流设计的电路中导致小孔管内外两电极间电阻发生瞬时变化，产生电位脉冲。脉冲信号的大小和次数与颗粒的大小和数目成正比。这主要是根据血细胞与稀释剂相比，血细胞是不良导体的特性而提出的。起初，原始的库尔特计数器只能计算和测量红细胞。后来，随着技术的不断发展和设备的不断改进，临床医生还可以利用它来计算和测量白细胞。到20世纪70年代，技术的进一步发展使技术人员能够分离血小板。全自动细胞计数器的演进传统意义上的血细胞计数器是通过研究外周血涂片，使用血细胞仪和白细胞分类计数而手动完成的（也称为100个细胞涂片分类，手动白细胞分类计数或手动计数器）。根据库尔特原理导致了库尔特计数器的发明，随后又开发出了技术先进的全自动血液细胞分析仪。自此，仪器的技术水平得到不断提高。由于技术的进步，一台仪器可以分析越来越多的参数，从而大大提高了血液检测的效率，减少在多台仪器上分析一个样品的情况。现代的细胞分析仪能够测量白细胞（WBC）、白细胞分类（五分类）、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）、血小板（PLT）、平均红细胞体积（MCV）、平均血小板体积，并且可以自动计算血细胞比容（HCT）、平均红细胞血红蛋白（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）、红细胞分布宽度，血小板比积和血小板分布宽度。自动分析仪的其他重要因素包括它们运行的速度和每批次可以处理的样本数量（大处理容量可以减少周转时间）。即时检验（POCT）即时检验（[/

日前，一台流式细胞仪BD公司的 C6报修操作者说：“散点图右下角有杂质、跑水颗粒数高“送到维修站说是蓝激光器坏了或者老化，需要更换，报价8W RMB。想问问：这种现象是否确是激光器的问题？从资料介绍上看，激光照射在样本（细胞）上激发出来的信号要经过透镜、滤光片，被光电倍增管接收，通过电子线路放大到显示器上。我以为这些光路和电路都可能导致信号失真或噪声，是否仅从上述现象就断定激光器挂了？坛里可有朋友解答？谢谢！

我的粉末样品中的颗粒基本上都是单晶颗粒，我想知道这些单晶颗粒形成后暴露在外的是哪些晶面，用什么方法能分析呢，希望高手不吝赐教！

神经细胞能够被量子点控制，图片来自CNRI/Science Photo Library。在量子物理学和神经科学的史无前例的结合中，称作量子点(quantum dot)的微小颗粒首次被用来控制脑细胞。对大脑的这种控制可能有朝一日提供一种治疗诸如阿尔茨海默病、抑郁症和癫痫症之类的疾病的非侵入式方法。在近期，量子点可能通过重新激活视网膜细胞而被用来治疗眼睛失明。美国华盛顿大学西雅图分校Lih Lin说，“很多脑部疾病是由于不平衡的神经活性而导致的。操纵特异性神经元可能允许它们恢复到正常的活性水平。”人工刺激大脑的一些方法已经存在，不过每种方法都有它的缺点。尽管在帕金森疾病中人们采用深度大脑刺激方法来触发脑细胞活性并阻止导致虚弱性震颤的异常信号传导，但是该方法所需的电极是高度侵入性的。颅磁刺激(transcranial magnetic stimulation)方法能够刺激来自头部外面的脑细胞，但是它不是高度靶向的，因而同时影响大脑大部分区域。光遗传学研究人员能够利用光控制基因修饰的脑细胞，但是由于这些修饰，这种技术迄今为止在人类中被视为是不安全的。如今，Lin领导的研究小组利用量子点---光敏感性的直径只有几个纳米的半导体颗粒---设计出另一种方法。首先，他们在用量子点覆盖的薄膜上培养前列腺癌细胞。这些癌细胞的细胞膜紧挨着量子点放置。研究小组然后将光照射在纳米颗粒上。来自光线的能量激活量子点内的电子，从而导致周围的区域带负电荷。这就导致癌细胞中一些电压控离子通道打开从而允许离子进入或逃离癌细胞。在神经细胞中，打开离子通道是产生动作电位的关键性一步，而这种动作电位是大脑中细胞进行沟通的信号。如果电压变化足够大的话，动作电位就产生。当Lin领导的研究小组在神经细胞中重复他们的实验时，他们发现刺激量子点导致它的离子通道打开，这样神经细胞就被激活。对人而言，量子点将需要被传送到大脑组织。Lin声称这应当不是一种问题。她说，“一种重要的优势在于量子点表面能够被不同分子修饰。”这些分子能够附着到量子点上以便靶向特异性脑细胞，也能够以静脉注射方式进行传送。一种关键性障碍是将光源传送到大脑。为此，Lin认为这种技术将在重新激活视网膜受损细胞中首次使用，因为视网膜自然地吸收光线。共同作者Fred Reike是视网膜疾病的专家。他说，量子点在这种领域有着较大的潜力，因为它们能够直接影响在视力的信号传导途径中发挥着关键性作用的离子通道。英国利兹大学Kevin Critchley对此也同意，“量子点在生物医学应用中有着光明的未来”，但是可能也存在一些限制，如潜在性毒性问题。Lin说，“基于我们的研究结果，我们对这种技术在帮助我们解答生物学问题以及最终诊断和治疗人类疾病上的潜力保持乐观。”

六. 流式细胞仪主要构造和工作原理 信号检测系统 当测定标本在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区时产生散射光和荧光信号,散射光分为前向角散射（Forward Scatter, FS）和侧向角散射或900散射（Side Scatter, SS）,散射光是细胞的物理参数与细胞样本的制备（如染色）无关;荧光信号也有两种,一种是细胞自发荧光它一般很微弱,一种是细胞样本经标有特异荧光素的单克隆抗体染色后经激光激发发出的荧光，它是我们要测定的荧光,荧光信号较强,这两种荧光信号的同时存在是我们测定时需要设定阴性对照的理由,以便从测出的荧光信号中减去细胞自发荧光和抗体非特异结合产生的荧光。前向角散射（FS）反映被测细胞的大小,它由正对着流动室的光电二极管装置接收并转变为电信号；侧向角散射或900散射（SS）反映被测细胞的细胞膜、细胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状, 它由一个光电倍增管(PMT) 接收并转变为电信号,这些电信号存储在流式细胞仪的计算机硬盘或软盘内。流式细胞仪测定常用的荧光染料有多种,他们分子结构不同,激发光谱和发射光谱也各异,选择荧光染料时必须依据流式细胞仪所配备的激光光源的发射光波长(如氩离子气体激光管,它的发射光波488ηm,氦氖离子气体激光管发射光波长633ηm）。488ηm激光光源常用的荧光染料有FITC（异硫氰酸荧光素）、PE（藻红蛋白）、PI（碘化丙啶）、CY5（化青素）、preCP(叶绿素蛋白)、ECD(藻红蛋白-得克萨斯红)等。他们的激发光和发射光波长分别是： [/col

发酵过程中，细胞浓度是一个非常重要的生理参数，不但可以计算比生长速率，底物消耗速率、生物量产率和维持系数等参数，还可以及时判断是否有染菌等异常情况发生。目前测量细胞浓度的方法主要有化学法（DNA/RNA分析）和物理法（干重、光密度、呼吸商等）两大类。一般来说，与物理法相比，化学法能较准确的测量有代谢活性的生物量，缺点是花费时间长，而利用物理法测量，无法区分区分处于悬浮状态的颗粒和微生物，也无法分别活死细胞。 实现在线活细胞浓度一直是发酵领域的热门话题，仅些年来出现了不少的测量方法，依据的工作原理也是五花八门，其中最具代表性的有声学，激光散色、荧光、核磁、量热或电容。 其中法国fogale公司的测量仪器，以电容法为工作原理，直接将传感器安装与发酵罐上，可承受121℃高温灭菌，理论技术也比较成熟，是目前最为理想的适合工业级别的在线活细胞传感器。工作原理：电容传感器采用活细胞的介电特性，实时连续测量活细胞的生物体积，可应用于实验室桌面型的反应器或者是工业规模的大型反应器两对对电极位于传感器的顶部，一对用于在培养基中产生交变的电场，在电场范围内，带有完整细胞膜的细胞会在培养基中发生极化现象，发生极化的细胞可以认为是极小的电容，死细胞或者其他粒子没有完整的细胞膜，所以不能形成电容型号。另一对电极用于检测培养基中的介电信号，培养基中的介电信号和细胞的浓度是精确关联的。细胞的极化率和电场的频率纯在函数关系，当频率增加时，培养基中细胞的介电常数由低频峰（最大极化）降低到高频峰（最小极化）。这种随频率增加极化率降低的现象称为β-散射。传感器采用双频测量模式：培养基的基线在10MHz左右得到，细胞的信号在临界频率区域获得，在曲线的拐点，（动物细胞和细菌在1MHz，酵母在2MHz）我们获得了最佳的信号线性。应用：这项技术可广泛应用于各种细胞培养，生物发酵过程。已被文献证实可应用的细胞如下：动物细胞：CHO, BHK, MDCK, PERC6, NSO, HEK, Hela,Hybridoma, Vero细 菌：E.Coli, Bacillus Thuringensis, Salmonella,Streptomyces, Lactic Bacteria酵 母：Pichia Pastoris, Saccharomyces Cervisiae, PolymorphaHasenula昆虫细胞：sf9, Hi-5真 菌：Absidia

十八. 流式细胞术在血液学中的应用NK和LAK细胞活性测定 NK细胞存在于外周血大颗粒淋巴细胞中,它对靶细胞的细胞毒活性不依赖于抗体,无MHC限制性,它们的数量及细胞毒活性是机体免疫系统的重要指标。人NK细胞一般表达CD56、CD16、CD57部分表达CD2、CD8、CD11而不表达CD3。 LAK(Lymphokine Activated Killer cells)细胞主要存在于LGL的高密度群体中,LAK前体细胞表达NK细胞标志CD16而不表达T细胞标志如CD3、CD4、CD5等;它们不需要抗原刺激就能杀伤NK细胞不能杀伤的肿瘤细胞,并且无MHC限制性;从表型上看大多数LAK细胞来自NK细胞,但严格讲LAK细胞对K562细胞的杀伤活性不能称作LAK活性,测定LAK活性的靶细胞应为NK抵抗的实体瘤细胞,如HL-60细胞、HeLa细胞等。 [