全自动蛋白质印迹定量分析系统

在发明蛋白质印迹法（Western Blot）出现了30多年之后，这项技术仍然是获取特定蛋白可靠鉴定的关键。许多近期涌现的产品利用各种方法来提高蛋白质印迹实验的可重复性、敏感性、定量性以及速度。有三个人都被认为发展了蛋白质的免疫印迹方法，但其中只有一人才算得上是“Western Blotting（蛋白质印迹法）”的命名者，他就是当时在西雅图哈钦森癌症研究中心Bob Nowinski实验室工作的W. Neal Burnette。“Western Blotting”的命名中暗含了Southern Blotting（Edwin Southern在1975年发明的一项技术，使用胶、尼龙膜和吸水纸去鉴定一个复杂个体中特定的DNA序列）、Northern Blotting（随后发明出的相似策略，用于鉴定RNA）以及位于西海岸（West Coast）的Nowinski实验室三者之意。http://www.ibioo.com/data/attachment/portal/201309/22/095234xzm2pso06fsmtbof.jpgBurnette的技术成果直到1981年才得以发表。他回想起来，当时审稿人“特别”反对使用“Western blotting”这一名称。但尽管如此，这个名称还是沿袭了下来，而且蛋白质印迹技术也成为了最广泛使用的免疫化学技术之一。工作原理蛋白质印迹法的第一步涉及到用凝胶电泳（Gelelectrophoresis）按照大小分离蛋白质，然后通过将膜置于胶上，将蛋白质转移到膜上（通常是硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜），并在膜上加上若干片吸水纸，然后将这套堆层放在缓冲溶液中，这样就能通过毛细管作用将蛋白质向上拉拽到膜上。这也就是所谓的湿法或槽式转印法。另外两项技术是干法和半干转印法，这两种方法比传统的湿转印法更快也更规整，但是对于高分子量蛋白质而言，效率更低。对于半干转印方法来说，膜和胶放置在被缓冲液浸泡过的滤纸层之间，将这些都夹在阴极和阳极之间，电流就能驱动蛋白质转移到膜上。三种方法中，干法转印最快，但转印效率也最低。转印结束后，膜被放在稀释过的蛋白质溶液中用来封闭非特异性的蛋白质结合。然后将膜与一抗进行孵育、洗脱，再与标记了信号检测探针的二抗进行孵育。最后一步是检测，通常采用化学发光或者荧光方法。在化学发光检测中，与酶交联的二抗能够与检测抗原产生光发生反应，可以被胶片或成像装置捕获。而在荧光检测中，抗体探针被荧光集团所标记。荧光检测方法的主要优势在于，它可以同时检测多个蛋白质，并且其信号更加一致。因此与化学发光检测相比，也更有利于量化研究。不少制造蛋白质印迹相关设备、软件和消耗品的公司正在努力推动其中一些或所有步骤的自动化，期望能够将这一实验变得更加简单有效。同时在实验中加入了一些验证点，让研究人员能够随时监测实验进展，甚至重新打造整个过程。科学家们寻求的是高效性、稳健性和策略化，从而能够帮助他们避免浪费宝贵的造价高昂的抗体。加速免疫检测过程转印、抗体孵育、上样和洗脱步骤占据了蛋白质印迹法实验80%的时间，EMD Millipore公司“蛋白质印迹法解决方案”产品经理Michele Hatler这样介绍。这家总部位于加州泰梅库拉的公司推出的SNAP i.d. 2.0蛋白质检测系统加速了整个过程，使用真空装置通过膜推入试剂，而不仅仅依赖于扩散作用。这样就能将免疫检测的时间从4小时缩短到30分钟，Hatler表示。她解释说：“我们真正致力于提高蛋白质印迹工作流程的效率。我们仍然是按照传统的步骤走，只是加了一个真空装置。”Hatler指出，2.0版本是于2012年9月推出的，相比之前的版本有几个方面的优势。它可以使用中等大小的凝胶（8.5×13.5厘米）和迷你凝胶（7.5×8.4厘米），之前则只能用迷你凝胶。“这一设备很便宜，操作也很简便，但切实提高了实验效率，节省了实验时间。” Hatler说。伯乐公司（Bio-Rad）的Trans-Blot Turbo蛋白质转移系统是实验台面大小的仪器，能够提供快速而高效的转印。得益于新的转印缓冲液配方，特殊的过滤材料和增强的电流强度（由一个集成电源调节），这一系统能够在短至3分钟的时间内完成转印，并且印迹结果能与槽式转移相媲美。传统的半干转移系统需要15到60分钟时间，而且通常无法提供高分子量蛋白质转移的有力结果。增加验证点以缓解忧虑蛋白质印迹法的高失败率常常令人感到非常沮丧，尤其是你需要若干天来换取一个结果。“这是一项非常不稳定的技术，”伯乐公司“蛋白质印迹组”市场经理Ryan Short说，“我们对用户调查时发现，一半的用户报告他们用此技术的失败率至少是25%。”Short还说：“几乎没有什么机会可以检查实验过程是否满足期望。由此就产生了焦虑。我们正在引入可视验证点的概念来增加信心和确定性。”这家公司的标准和Mini-PROTEAN免染色预制胶，利用其ChemiDoc MP胶成像系统，使得研究者可以快速观测到他们的蛋白是否正确地载入到凝胶上，进而确证高质量的蛋白质转移，便于决定是否应该转向下一个步流程或是重新开始。ChemiDoc MP系统是为化学发光和多元荧光斑点成像技术所设计，能够在个人电脑上用ImageLab软件来操作。这些验证点“真的很有用”，在实验室使用该系统的加州大学戴维斯分校助理教授Aldrin Gomes表示：“我们可以成像这些免染的凝胶，不用加入额外的染料，而且能够快速判断跑在胶上的样品是否出现问题。我们还能在蛋白质转膜之后再去对凝胶成像，如果其中任何一个步骤出现问题，我们都可以在这一点上停止实验进程。”成像和软件提高定量性当许多科学家仍在使用胶片分析蛋白质印迹时，世面上开始出现越来越多的宽范围免胶片凝胶记录成像系统，这些系统可以用来成像并分析化学发光的印迹、荧光的印迹斑点或者同时检测这两种印迹。许多公司开始纷纷努力，争相制造尽可能便捷的成像仪及其分析软件。很多公司提供了按键式成像捕捉系统，其大小可在实验台上操作。Syngene公司于2012年4月推出了非常简洁的一键操作系统PXi，分析化学发光和荧光印迹。该系统是基于该公司的G:BOX成像系统，并配有GeneSys成像软件。2012年10月，赛默飞世尔公司（Thermo Fisher Scientific）推出了myECL成像仪，使用紫外和可见光透射法，专业的滤镜和电荷耦合器件（CCD）摄影技术去捕获和分析蛋白质印迹以及蛋白和核酸凝胶。

蛋白质结构定量分析具体步骤？谢谢

[font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/category/wb-faq][b][font=Calibri]WB([/font][font=宋体]蛋白质印迹[/font][font=Calibri])[/font][/b][/url][font=宋体]是一种用于检测样本（如细胞提取物或组织匀浆）中特异性蛋白的技术，也用于分析体外合成的重组蛋白。蛋白免疫印迹法还可以根据某种抗原与其相对抗体之间的特殊亲和力来鉴定靶蛋白。蛋白免疫印迹法一般包含三个主要步骤分别为[/font][font=Calibri]SDS-PAGE[/font][font=宋体]、样品印迹和免疫学检测。通过蛋白免疫印迹法可以获得关于靶蛋白的定性和半定量数据。在蛋白质领域，蛋白免疫印迹法被广泛用于蛋白表达水平的检测。下面针对[/font][b][font=Calibri]WB[/font][font=宋体]在实验过程中遇到的问题进行罗列及解答：[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、为什么抗磷酸化酪氨酸抗体会出现高背景或信号减弱？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]请您检查所使用的封闭液并注意封闭以及洗膜的时间。有两种常用的封闭液：脱脂奶粉或[/font][font=Calibri]BSA[/font][font=宋体]。脱脂奶粉成本低但不能用于磷酸化蛋白的封闭，因为脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白，会结合在膜上并与磷酸化特异性抗体结合导致高背景。并且稀释抗磷酸化酪氨酸抗体与脱脂奶粉中的酪蛋白结合后，用于检测的抗体较少导致信号减弱。此外，避免封闭时间过长，否则会掩盖抗原表位，阻止抗体结合。洗膜时间不宜过长或过短，过长会导致信号减弱（抗体被洗脱），过短则会导致高背景。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]我们建议使用含[/font][font=Calibri]1% BSA[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]TBS[/font][font=宋体]，含吐温[/font][font=Calibri]20[/font][font=宋体]作为封闭液，请勿使用脱脂奶粉。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、为什么随着时间的推移，蛋白免疫印迹法中的抗体活性会降低？[/font][/font][font=宋体]如果您使用我们的一种抗体进行蛋白免疫印迹分析，并且反应性似乎随着时间的推移而降低，可能的原因及解决方案如下：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①可能的原因一：使用了不同的样本。[/font][font=宋体]解决方案：培养的细胞会随着时间的推移而变性，因此我们建议解冻新鲜细胞。[/font][font=宋体]②可能的原因二：样品在储存期间或反复冻融后降解。[/font][font=宋体]解决方案：制备新鲜样品，避免反复冻融。[/font][font=宋体]③可能的原因三：抗体被污染。解决方案： 旋转小瓶，检查是否有沉淀。[/font][font=宋体]④可能的原因四：二抗失效。解决方案：更换新的二抗。[/font][font=宋体]⑤可能的原因五：蛋白质转膜效率低。解决方案：配置新的转膜液；根据蛋白分子量大小调整转膜时间。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、如何避免转膜不充分或结果不理想的问题？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]确定蛋白质的大小。如果蛋白质大于[/font][font=Calibri]180 kDa[/font][font=宋体]，则需要通过以下方式优化转膜条件：[/font][/font][font=宋体][font=宋体]? 使用[/font][font=Calibri]20% MeOH[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]? 加入[/font][font=Calibri]0.05% SDS[/font][font=宋体]转膜缓冲液。[/font][/font][font=宋体]? 增加裂解物的上样量。[/font][font=宋体][font=宋体]? [/font][font=Calibri]110 V[/font][font=宋体]恒压转[/font][font=Calibri]150 min[/font][font=宋体]，湿法转膜。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、如何避免“斑点状”或不均匀的蛋白免疫印迹？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]为避免进行蛋白免疫印迹法时出现[/font][font=宋体]“斑点状”或不均匀的印迹，有以下几种方法[/font][font=Calibri]: [/font][/font][font=宋体]? 延长封闭时间，以优化封闭效果。[/font][font=宋体]? 延长洗涤次数 （这对组织匀浆样品尤为重要）。[/font][font=宋体]? 在配置封闭液时，确保奶粉完全溶于溶液。[/font][font=宋体]? 在取出抗体溶液使用之前，旋转装有抗体溶液的试管，防止出现蛋白沉淀。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]、如何避免印迹上出现“点状”、不均匀的斑点？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]为避免印迹上出现[/font][font=宋体]“点状”或不均匀斑点，请尝试以下几种方法：[/font][/font][font=宋体]? 检查所有缓冲液是否被细菌污染。[/font][font=宋体]? 确保在抗体和清洗孵育过程中膜完全浸入。[/font][font=宋体]? 在转膜时，排除薄膜和凝胶之间的所有气泡。[/font][font=宋体]? 将膜放在摇床上，确保均匀地接触。[/font][font=宋体]? 清洗蛋白免疫印迹所需的设备。[/font][font=宋体][font=宋体]? 过滤[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]结合物，除去任何可能的聚集物。[/font][/font][font=宋体]?减少底物暴露时间。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]6[/font][font=宋体]、选择什么作为[/font][font=Calibri]WB[/font][font=宋体]抗体的阳性对照？[/font][/font][font=宋体]为了使您的蛋白免疫印迹抗体中获得最佳性能，请使用技术数据表中推荐的阳性对照。阳性对照将帮助您按照制定的方案，在实验中获得准确的结果。[/font][font=宋体][font=宋体]我们建议将这些裂解物放置在[/font][font=Calibri]-20[/font][font=宋体]℃下长期储存。裂解物非常稳定，它们是细胞制剂，所有酶均变性和灭活。我们做了大量的研究，证实了不同条件下的稳定性。例如，大多数裂解物的完整性和质量不受反复冻融的影响，可在[/font][font=Calibri]25[/font][font=宋体]℃下储存长达[/font][font=Calibri]12[/font][font=宋体]周。但裂解物在[/font][font=Calibri]37[/font][font=宋体]°[/font][font=Calibri]C[/font][font=宋体]下[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]周时开始降解。然而，根据裂解物的来源，稳定性可能存在一些轻微差异，因此我们建议将其储存在[/font][font=Calibri]-20[/font][font=宋体]℃下。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]7[/font][font=宋体]、应该分析多少蛋白质？[/font][/font][font=宋体]我们建议：[/font][font=宋体]样本类型[/font][font=宋体]每条泳道[/font][font=宋体]全细胞裂解液[/font][font=宋体][font=Calibri]50 [/font][font=宋体]μ[/font][font=Calibri]g[/font][/font][font=宋体]细胞核提取物[/font][font=宋体][font=Calibri]25 [/font][font=宋体]μ[/font][font=Calibri]g[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]8[/font][font=宋体]、应该使用多少浓度的丙烯酰胺凝胶来分离蛋白？[/font][/font][font=宋体]为了更好地分离感兴趣蛋白，丙烯酰胺凝胶的百分比应基于蛋白分子量。我们建议：[/font][font=宋体][font=宋体]蛋白大小（[/font][font=Calibri]kDa[/font][font=宋体]）[/font][/font][font=宋体][font=宋体]丙烯酰胺凝胶百分比（[/font][font=Calibri]%[/font][font=宋体]）[/font][/font][font=宋体][font=Calibri] 80[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]7.5[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]9[/font][font=宋体]、蛋白免疫印迹法应使用哪种印迹膜？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]我们建议使用硝酸纤维素（[/font][font=Calibri]NC[/font][font=宋体]）膜。虽然聚偏二氟乙烯（[/font][font=Calibri]PVDF[/font][font=宋体]）膜、尼龙膜和[/font][font=Calibri]DEAE[/font][font=宋体]纤维素膜也可以使用，但有时会产生升高的背景，特别是实验过程中使用山羊多克隆抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]10[/font][font=宋体]、应该使用什么封闭缓冲液？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]封闭液的选择与目标蛋白有关，我们建议一般使用[/font][font=Calibri]1X TBS[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]5%[/font][font=宋体]脱脂奶粉、[/font][font=Calibri]0.05%[/font][font=宋体]吐温[/font][font=Calibri]-20[/font][font=宋体]作为封闭液，在室温下封闭[/font][font=Calibri]30-60[/font][font=宋体]分钟或在[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]℃下封闭过夜。请注意，如果封闭过夜，缓冲液中应不加吐温[/font][font=Calibri]-20[/font][font=宋体]。如果目标蛋白较特殊（如磷酸化），建议使用[/font][font=Calibri]1X TBS[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]1% BSA[/font][font=宋体]并含有吐温[/font][font=Calibri]-20[/font][font=宋体]的封闭液，可得到较清晰条带。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]11[/font][font=宋体]、一抗的稀释倍数一般是多少？[/font][/font][font=宋体]请查看各个抗体的数据表，因为这通常记录起始稀释度。如果数据表上没有具体稀释信息，我们建议您对相关的阳性和阴性对照进行连续滴定。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]12[/font][font=宋体]、为什么实际的蛋白免疫印迹条带大小与预期的不同？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]蛋白免疫印迹法是根据蛋白质大小分离蛋白的技术。一般来说，蛋白越小，其在[/font][font=Calibri]SDS-PAGE[/font][font=宋体]凝胶中移动的速度就越快。然而，移动速率也受到其他因素的影响，因此实际条带大小可能与预测不一致。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]可能的原因[/font][font=宋体]备注[/font][font=宋体]①翻译后修饰[/font][font=宋体]例如磷酸化、糖基化等，可增加蛋白质的大小。[/font][font=宋体]②翻译后切割[/font][font=宋体]大多数蛋白质首先合成为前体蛋白形式，再经切割产生活性形式，例如前体半胱天冬酶。[/font][font=宋体]③剪接变体[/font][font=宋体][font=宋体]可变剪切会产生从同一基因产生不同大小的蛋白质。剪接变体的表达具有高度变异性，取决于使用的特定组织和实验条件[/font] [font=宋体]。[/font][/font][font=宋体]④亚型[/font][font=宋体]许多蛋白质表达多种不同大小的亚型。相同靶蛋白不同亚型的表达具有高度变异性，取决于使用的特定组织和实验条件。参照不同的网站，确定特定靶标的亚型。[/font][font=宋体]⑤相对电荷[/font][font=宋体][font=宋体]氨基酸组成（带电[/font][font=Calibri]vs.[/font][font=宋体]不带电）。[/font][/font][font=宋体]⑥多聚体[/font][font=宋体]例如蛋白质二聚化。尽管相互作用可能导致出现较高条带，但在还原条件下需防止该情况。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]13[/font][font=宋体]、为什么蛋白免疫印迹结果信号微弱或完全没有信号？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]可能的原因[/font][font=宋体]备注[/font][font=宋体]①抗体滴定 [/font][font=宋体][font=宋体]应使用多种抗体浓度进行抗体滴定实验，以确定最佳信噪比的合适抗体浓度。一般而言，滴定浓度应在[/font][font=Calibri]0.2-5.0 [/font][font=宋体]μ[/font][font=Calibri]g/mL[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]②组织[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]细胞特异性 [/font][/font][font=宋体]靶蛋白表达取决于待测的细胞或组织。应进行文献检索，确保您正在使用的细胞等条件适用于检测靶蛋白。[/font][font=宋体]③复溶 [/font][font=宋体]在重新溶解冻干抗体时应注意，确保抗体全部溶解。尽管冻干抗体沉淀通常位于试管底部，但有时粉末可能位于管壁上。因此，溶解时应覆盖试管的整个表面，以确保抗体完全溶解。然后进行短暂离心，确保将所有粉末收集在试管底部。[/font][font=宋体]④阳性对照 [/font][font=宋体]在您的蛋白免疫印迹中添加阳性对照泳道是评价抗体是否正常工作和实验条件是否适当的最佳方法。另外，基于文献或实验结果的阳性对照也可以用来评估抗体是否正常发挥作用。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多[/font][font=Calibri]WB[/font][font=宋体]蛋白免疫印迹法常见问题详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/category/wb-faq[/font][/font][font=宋体][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/services/western-blot-wb-service][b]Western Blot[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/western-blot-wb-service][b]检测服[/b][/url]务：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/western-blot-wb-service[/font][/font]

蛋白质的质谱定量是一个新兴的发展方向，附件中的资料对蛋白质定量的策略进行了详细描述，供大家参考

蛋白质为复杂的含氮有机化合物，是各种氨基酸以肽键连接而成，各类食品的蛋白质含量很不均匀，蛋白质含量是评价食物营养价值的重要指标之一。在食品中蛋白质含量测定方法中最常用最基本的方法是凯氏定氮法，在GB/T5009.5-2003中也将其定为法定检测方法，凯氏定氮法有常量凯氏氮法和微量凯氏定氮法。采用经典的凯氏定氮法比较费时费力，采用模块式消化、全自动凯氏定氮仪测定食品中的蛋白质，该方法比经典法快速，且数据准确可靠。1 材料与方法1．1 仪器与试剂1．1．1主要仪器：KjeltecTM2300型全自动凯氏定氮仪，DS-20消化炉及排废装置(均为瑞典FOSSTECATOR公司生产)，样品磨，电子天平(准确至0.0001克)。1．1．2主要试剂：浓硫酸；硫酸钾；硫酸铜；盐酸标准溶液0.1027mol/L；氢氧化钠溶液400g/L；1％溴甲酚绿和0.7％甲基红混合指示剂；1％硼酸吸收溶液；硫酸铵；蔗糖。所用试剂均为优质品。1．2 测定方法称取适量样品放入消化管中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及约12mL浓硫酸慢慢摇动将样品浸湿。把消化管放入已预热至42℃的加热模块中，将抽气泵打开到最大。5min后，关小抽气泵至酸雾刚好充满排废罩，在试管中形成冷凝环。约60min样品消化至透明蓝绿色液体，取出冷却至室温。将消化管放入2300型自动凯氏定氮仪，关上安全门，待仪器自动蒸馏、滴定、计算并打印结果。2 结果与讨论2．1 精密度取3种蛋白质含量不同的样品，每种样品平行测定6次，从测定结果可见，该仪器的精密度良好（见表1）。表1 仪器精密度测定样品名称 蛋 白 质 含 量(g/100g) 平均值(g/100g) 相对标准差(RSD%)纯牛奶 3.18 3.17 3.20 3.19 3.18 3.18 3.18 0.34大豆 31.25 31.46 31.38 31.53 31.62 31.39 31.44 0.41螺旋藻粉 67.54 67.78 67.58 67.64 67.69 67.82 67.68 0.16

蛋白质化学与蛋白质组学夏其昌 曾嵘 等编著2004年4月出版ISBN 7-03-012401-4/Q.133116开，平装，580页定价: 75.00元 本书系统论述了蛋白质化学基础理论和实验技巧，也反映了蛋白质组学研究的最新成果。内容包括：蛋白质的表征，蛋白质的组成分析和序列测定，与此相关的实验方法，包括各种色谱、电泳、质谱技术等，以及应用在蛋白质表征研究和基因工程产品的质检方面的实际范例。在蛋白质组学领域介绍了基本概念、样品制备、双向凝胶电泳的图像分析和定量分析、质谱等常规方法，并介绍了国际上最新的多维技术在研究中的应用；同时充分体现了生物信息学在蛋白质组研究中的重要性。 本书可作为生物学、医学、化学专业大学生，研究生和教学人员的参考书，也是从事生物化学、分子生物学、医学等领域中分离分析工作人员的参考书。

[font=-apple-system, BlinkMacSystemFont, &][color=#05073b][size=16px]　　蛋白质检测仪测量指标有哪些，蛋白质检测仪的测量指标可以因不同型号、品牌和用途的仪器而有所差异。然而，一般来说，蛋白质检测仪的测量指标可以归纳为以下几个方面：　　一、基本测量参数　　检出下限：这是仪器能够检测到的最低蛋白质含量，通常以百分比或具体浓度值表示。例如，某些蛋白质快速检测仪器的检出下限为0.5%。　　检测范围：仪器能够测量的蛋白质含量的范围，这通常是一个区间值。例如，某些仪器的检测范围为(0～50)%。　　吸光度值范围：在光度法中，吸光度是衡量物质对光吸收程度的物理量，蛋白质检测仪通常会给出其吸光度值的测量范围，如0.000-4.000A。　　重复性：这是衡量仪器测量结果稳定性的一个重要指标，通常以百分比或具体数值表示。例如，某仪器的重复性为±0.1%(A)。　　重复性误差：与重复性相关，但更具体地描述了多次测量同一样品时结果之间的差异，如吸光度(A)≤0.003。　　稳定性：指仪器在长时间运行或不同时间点测量时，结果的一致性。例如，光电漂移(A)±0.002(3分钟)可以反映仪器的稳定性。　　二、特定功能指标　　多通道检测：一些先进的蛋白质检测仪支持多通道检测，可以同时处理多个样品，提高检测效率。　　样品类型：仪器能够检测的样品类型，如食物、饮品、血清、血浆、尿液等。　　分子量范围：对于能够检测蛋白质分子量的仪器，其分子量范围是一个重要的指标，如2-440kDa。　　样品处理量：一次运行能够处理的样品数量，如某些全自动蛋白质定量检测仪一次可以处理25个样本/每轮。　　检测速度：完成一次检测所需的时间，这也是衡量仪器效率的一个重要指标。　　三、高级功能指标　　智能化程度：包括仪器的自我保护功能、数据储存方式(如支持U盘储存)、以及是否具备自动校准、自动清洗等高级功能。　　检测精度和误差：除了上述的重复性和重复性误差外，还包括仪器的整体检测精度和误差控制水平。　　软件支持：是否配备有用户友好的软件界面，用于数据分析和报告生成。　　兼容性：仪器是否兼容不同类型的试剂盒和样品处理方法。　　需要注意的是，以上指标并非所有蛋白质检测仪都具备，具体指标会根据仪器的设计、用途和性能而有所不同。在选择蛋白质检测仪时，应根据实际需求和使用场景综合考虑各项指标。[img=,690,690]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/07/202407030956049224_5772_6098850_3.png!w690x690.jpg[/img][/size][/color][/font]

磷酸化蛋白质及多肽相关研究的技术进展 摘要磷酸化修饰是一种重要的蛋白质化学修饰,对蛋白质功能的完成或改变起到重要作用。该领域的研究存在很多技术难点,对该领域研究形成了挑战。近年来相关技术有了很多突破,磷酸化研究也取得了很多新的成就。文章将从磷酸化蛋白的检出、磷酸化蛋白质和肽段的富集、生物质谱技术的改进以及磷酸化蛋白和多肽的定量与比较几个方面介绍该研究领域的技术进展。关键词磷酸化蛋白磷酸化肽生物质谱定量分析生命活动与蛋白质的动态变化密切 摘要 磷酸化修饰是一种重要的蛋白质化学修饰, 对蛋白质功能的完成或改变起到重要作用。该领域的研究存在很多技术难点, 对该领域研究形成了挑战。近年来相关技术有了很多突破, 磷酸化研究也取得了很多新的成就。文章将从磷酸化蛋白的检出、磷酸化蛋白质和肽段的富集、生物质谱技术的改进以及磷酸化蛋白和多肽的定量与比较几个方面介绍该研究领域的技术进展。 关键词 磷酸化蛋白 磷酸化肽 生物质谱 定量分析

如何通过傅立叶红外光谱定量分析蛋白质的二级结构含量？

褚福亮,王福生, 中国人民解放军第302医院全军艾滋病与病毒性肝炎重点实验室 北京市 100039项目负责人 王福生, 100039 ,北京市丰台路26号, 中国人民解放军第302医院全军艾滋病与病毒性肝炎重点实验室. fswang@public.bta.net.cn电话:010-66933332 传真:010-63831870收稿日期 2002-08-15 接受日期 2002-09-03摘要新近广泛应用蛋白质芯片（ProteinChipâ Array）系统成功鉴定出了一些重要疾病（如肿瘤和危害性较大的传染病）新的、特异性的生物标记（biomarkers）,后者不仅在生物医学的基础方面具有重要的科学价值,而且在临床疾病的诊断、治疗和预防发挥重要的指导作用,显示了良好的发展前景.本文就表面增强的激光解析电离-飞行时间-质谱（SELDI-TOF-MS）相关的原理、特点、在临床和基础研究中的应用新进展和未来的发展趋势做一综述.此外,我们就蛋白质谱分析技术在病毒性肝炎、肝硬化和肝癌等一系列肝病方面的应用策略和前景进行了分析.褚福亮,王福生. 蛋白质谱分析方法特点及其在蛋白组学研究领域中的应用.世界华人消化杂志 2002 10(12):1431-14350 引言人类基因组计划已经进入后基因组时代-即功能基因组时代[1]，作为基因功能的直接体现者-蛋白质，及其之间的相互作用越来越引起基础和临床科学家们的关注[2-6] .因为要彻底了解生命的本质，只把基因测出来还是不够的，还必须要了解其在生物生长、发育、衰老和整个生命过程中的功能、不同蛋白质之间的相互作用以及他们与疾病发生、发展和转化的规律[7-14] .正因为如此，有关上述问题的蛋白质组学研究成了今天生命科学最重要的焦点之一[15] .为了阐明蛋白质在上述生命现象中的作用和相关机制，人们设计了许多新的方法技术，如：二维电泳、质谱分析、微距阵列、酵母双杂交和噬菌体展示等，这些方法在一些特定的情况下，虽然显示出了他们各自不同的优点，但是同样也存在着较大的局限性，难以开展大规模、超微量、高通量、全自动筛选蛋白质等方面的分析，因而设计更全面、同时研究多种蛋白质相互作用的技术，在功能基因组和蛋白组学的研究中建立一个更有效的技术平台，成为本领域中优先关注的问题[16] .近来，美国Ciphergen（赛弗吉）公司研制的ProteinChipâ Array的仪器，并建立了一种新的蛋白质飞行质谱-表面增强的激光解析离子化-飞行时间-质谱（surface-enhanced laser desorption/inionation-time of flight-mass spectra， SELDI-TOF-MS），已取得可喜的进展，筛选出了许多与疾病相关的新型生物标志，不仅为临床疾病的诊断和治疗等提供了新的选择，而且在基础科学、新药研制和疾病预防等方面具有广泛的应用前景[16-18] .本文就SELDI-TOF-MS相关的原理、特点、在临床和基础研究中的应用新进展和未来的发展趋势做一综述.1 ProteinChipâ Array系统和SELDI-TOF-MS的特点1.1 蛋白质芯片系统的组成和原理 蛋白质芯片系统由三部分组成：蛋白质芯片、芯片阅读器和芯片软件.供研究用芯片上有6-10芯池，不同的芯片表面上的化学物质不同，芯片表面分为两大类：一类为化学类表面，包括经典的色谱分析表面，如：结合普通蛋白质的正相表面，用于反相捕获的疏水表面，阴阳离子交换表面和捕获金属结合蛋白的静态金属亲合捕获表面；另一类称为生物类，特定的蛋白质共价结合于预先活化的表面阵列，可以用来研究传统的抗体一抗原反应，DNA和蛋白质作用，受体、配体作用和其他的一些分子之间的相互作用[19] . 根据检测目的不同，可以选用不同的芯片，或者自己设计芯片.将样本和对照点到芯池上以后，经过一段时间的结合反应，用缓冲液或水洗去一些不结合的非特异分子，再加上能量吸收分子（energy absorbing molelule，EAM）溶液，使样本固定在芯片表面.当溶液干燥后，一个含有分析物和大量能量吸收分子“晶体”就形成了.能量吸收分子对于电离来说非常重要.经过以上步骤，就可经把芯片放到芯片阅读器中进行质谱分析. 在阅读器的固定激光束下，芯片上、下移动，使样本上每一个特定点都被“读”到.激光束的每一次闪光释放的能量都聚集在该区一个非常小的点上（focused laser beam，聚焦激光束）.这样，每个区都含有丰富的，可寻址（addressable）的位置.蛋白质芯片处理软件精确控制激光寻读过程.当样本受到激发，就开始电离和解除吸附.不同质量的带电离子在电场中飞行的时间长短不同，计算检测到的不同时间，就可以得出质量电荷比,把他输入电脑,形成图像[19].Ball et al [20]采用一种称为人工神经网络（artifical neural network,ANN）的算法处理出现的成千上万的峰，鉴定出三个分子量为13 454、13 457和14 278的生物标记分子，使疾病预测率达到97.1 %.1.2 ProteinChipâ Array芯片和SELDI-TOF-MS的特点 新型蛋白芯片与以往的蛋白芯片不同之处：SELDI-TOF-MS，他是在MALDI（matrix-assisted laser desorption/inionation）［21,22］基础上，改进后实行表面增强的飞行质谱.SELDI-TOF-MS优于MALDI-TOF表现为他不会破坏蛋白质，或使样本与可溶的基质共结晶来产生质谱信号.对SELDI-TOF来说，可以直接将血清、尿液、组织抽取物等不需处理直接点样检测[40] 由于一部分非特异结合的分析物被洗去，因而出现的质峰非常一致，有利于后期分析[23,24] . 与二维电泳相比：二维电泳分析蛋白质的分子量在30 KDa以上时电泳图谱较清楚，对在组织抽提物中占很大比例的低丰度的蛋白质不能被检出；其次，二维电泳胶上的蛋白质斑点很大一部分包含一种以上的蛋白质；而且，二维电泳耗时长，工作量大，对象染色转移等技术要求高，不能完全实现自动化.而SELDI-TOF在200 Da-500 KDa区间都可以给出很好的质谱，对一个样本的分析在几十分钟内就可以完成[19]，处理的信息量远远大于二维电泳；对于低丰度物质，即使浓度仅attomole(10-18)的分子，只要与表面探针结合，就可以检测到，这也是二维电泳所不具备的[24,25] . 对于微距阵蛋白芯片来说，需要一种不破坏折叠的蛋白质构象的固定技术，再与另外的蛋白质反应，经检测莹光来观察蛋白质之间的作用[26] .而基于SELDI-TOF-MS的ProteinChip分析蛋白质不需溶解、不需染色、廉价、针对性强. 因而蛋白质芯片仪具有以下优势：(1)可直接使用粗样本，如：血清、尿液、细胞抽提物等[27] .(2)使大规模、超微量、高通量、全自动筛选蛋白质成为可能；(3)他不仅可发现一种蛋白质或生物标记分子，而且还可以发现不同的多种方式的组合蛋白质谱，可能与某种疾病有关[28] (4)推动基因组学发展，验证基因组学方面的变化，基于蛋白质特点发现新的基因.可以推测疾病状态下，基因启动何以与正常状态下不同，受到那些因素的影响，从而跟踪基因的变化[2,14,15] . 其存在的问题：对于不同的样本，根据检测的目标采取或者设计几种芯片，理论上可以把所有的相同性质蛋白质捕获，但是实际上仍有少量的分子没与表面探针结合.使用SELDI-TOF-MS，仅能给出蛋白质的分子量，不能给出C端、N端的序列，也没法知道蛋白质的构型，因此需要将蛋白质充分纯化后，用蛋白酶消化芯片上的蛋白质，分析肽段，再用生物信息学方法鉴定蛋白质序列[18,24] .另外，在国内，该芯片费用较高，分析质谱需要大量后续工作支持.

如果目前分离蛋白质组的最好技术是2-DE，那么随之而来的挑战是数百数千个蛋白如何被鉴定。在这里，我们不考虑传统的蛋白鉴定方法，如免疫印迹法、内肽的化学测序、已知或未知蛋白的comigration分析，或者在一个有机体中有意义的基因的过表达。并不是因为这些方法无效，而是因为它们通常耗时、耗力，不适合高流通量的筛选。目前，所选用的技术包括对于蛋白鉴定的图象分析、微量测序；进一步对肽片段进行鉴定的氨基酸组分分析和与质谱相关的技术。(1) 图象分析技术(Image analysis)。“满天星”式的2-DE图谱分析不能依靠本能的直觉，每一个图象上斑点的上调、下调及出现、消失，都可能在生理和病理状态下产生，必须依靠计算机为基础的数据处理，进行定量分析。在一系列高质量的2-DE凝胶产生(低背景染色，高度的重复性)的前提下，图象分析包括斑点检测、背景消减、斑点配比和数据库构建。首先，采集图象通常所用的系统是电荷耦合CCD(charge coupled device)照相机；激光密度仪(laser densitometers)和Phospho或Fluoro?imagers，对图象进行数字化。并成为以象素(pixels)为基础的空间和网格。其次，在图象灰度水平上过滤和变形，进行图象加工，以进行斑点检测。利用Laplacian，Gaussian，DOG(difference of Gaussians) opreator使有意义的区域与背景分离，精确限定斑点的强度、面积、周长和方向。图象分析检测的斑点须与肉眼观测的斑点一致。在这一原则下，多数系统以控制斑点的重心或最高峰来分析，边缘检测的软件可精确描述斑点外观，并进行边缘检测和邻近分析，以增加精确度。通过阈值分析、边缘检测、销蚀和扩大斑点检测的基本工具还可恢复共迁移的斑点边界。以PC机为基础的软件Phoretix-2D正挑战古老的Unix为基础的2-D分析软件包。第三，一旦2-DE图象上的斑点被检测，许多图象需要分析比较、增加、消减或均值化。由于在2-DE中出现100%的重复性是很困难的，由此凝胶间的蛋白质的配比对于图象分析系统是一个挑战。IPG技术的出现已使斑点配比变得容易。因此，较大程度的相似性可通过斑点配比向量算法在长度和平行度观测。用来配比的著名软件系统包括Quest，Lips，Hermes，Gemini等，计算机方法如相似性、聚类分析、等级分类和主要因素分析已被采用，而神经网络、子波变换和实用分析在未来可被采用。配比通常由一个人操作，其手工设定大约50个突出的斑点作为“路标”，进行交叉配比。之后，扩展至整个胶。例如：精确的PI和MW(分子量)的估计通过参考图上20个或更多的已知蛋白所组成的标准曲线来计算未知蛋白的PI和MW。在凝胶图象分析系统依据已知蛋白质的pI值产生PI网络，使得凝胶上其它蛋白的PI按此分配。所估计的精确度大大依赖于所建网格的结构及标本的类型。已知的未被修饰的大蛋白应该作为标志，变性的修饰的蛋白的PI估计约在±0.25个单位。同理，已知蛋白的理论分子量可以从数据库中计算，利用产生的表观分子量的网格来估计蛋白的分子量。未被修饰的小蛋白的错误率大约30%，而翻译后蛋白的出入更大。故需联合其他的技术完成鉴定?(2) 微量测序(microsequencing)。蛋白质的微量测序已成为蛋白质分析和鉴定的基石，可以提供足够的信息。尽管氨基酸组分分析和肽质指纹谱(PMF)可鉴定由2-DE分离的蛋白，但最普通的N-末端Edman降解仍然是进行鉴定的主要技术。目前已实现蛋白质微量测序的自动化。首先使经凝胶分离的蛋白质直接印迹在PVDF膜或玻璃纤维膜上，染色、切割，然后直接置于测序仪中，可用于subpicomole水平的蛋白质的鉴定。但有几点需注意：Edman降解很缓慢，序列以每40 min 1个氨基酸的速率产生；与质谱相比，Edman降解消耗大；试剂昂贵，每个氨基酸花费3～4$。这都说明泛化的Edman降解蛋白质不适合分析成百上千的蛋白质。然而，如果在一个凝胶上仅有几个有意义的蛋白质，或者如果其他技术无法测定而克隆其基因是必需的，则需要进行泛化的Edman降解测序。近来，应用自动化的Edman降解可产生短的N-末端序列标签，这是将质谱的序列标签概念用于Edman降解，业已成为一种强有力的蛋白质鉴定。当对Edman的硬件进行简单改进，以迅速产生N-末端序列标签达10～20个/d，序列检签将适于在较小的蛋白质组中进行鉴定.若联合其他的蛋白质属性，如氨基酸组分分析、肽质质量、表现蛋白质分子量、等电点，可以更加可信地鉴定蛋白质。选择BLAST程序，可与数据库相配比。目前，采用一种Tagldent的检索程序，还可以进行种间比较鉴定，又提高了其在蛋白质组研究中的作用。(3) 与质谱(mass spectrometry)相关的技术。质谱已成为连接蛋白质与基因的重要技术，开启了大规模自动化的蛋白质鉴定之门。用来分析蛋白质或多肽的质谱有两个主要的部分，1)样品入机的离子源，2)测量被介入离子的分子量的装置。首先是基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)为一脉冲式的离子化技术。它从固相标本中产生离子，并在飞行管中测其分子量。其次是电喷雾质谱(ESI-MS)，是一连续离子化的方法，从液相中产生离子,联合四极质谱或在飞行时间检测器中测其分子量。近年来，质谱的装置和技术有了长足的进展。在MALDI-TOF中，最重要的进步是离子反射器(ion reflectron)和延迟提取(delayed ion extraction)，可达相当精确的分子量。在ESI-MS中，纳米级电雾源(nano-electrospray source)的出现使得微升级的样品在30～40 min内分析成为可能。将反相液相色谱和串联质谱(tandem MS)联用，可在数十个picomole的水平检测；若利用毛细管色谱与串联质谱联用，则可在低picomole到高femtomole水平检测；当利用毛细管电泳与串联质谱连用时，可在小于femtomole的水平检测。甚至可在attomole水平进行。目前多为酶解、液相色谱分离、串联质谱及计算机算法的联合应用鉴定蛋白质。下面以肽质指纹术和肽片段的测序来说明怎样通过质谱来鉴定蛋白质。1)肽质指纹术(peptide mass fingerprint, PMF)是由Henzel等人于1993年提出。用酶(最常用的是胰酶)对由2-DE分离的蛋白在胶上或在膜上于精氨酸或赖氨酸的C-末端处进行断裂，断裂所产生的精确的分子量通过质谱来测量(MALDI-TOF-MS，或为ESI-MS)，这一技术能够完成的肽质量可精确到0.1个分子量单位。所有的肽质量最后与数据库中理论肽质量相配比(理论肽是由实验所用的酶来“断裂”蛋白所产生的)。配比的结果是按照数据库中肽片段与未知蛋白共有的肽片段数目作一排行榜，“冠军”肽片段可能代表一个未知蛋白.若冠亚军之间的肽片段存在较大差异，且这个蛋白可与实验所示的肽片段覆盖良好，则说明正确鉴定的可能性较大。2)肽片段(peptide fragment)的部分测序。肽质指纹术对其自身而言，不能揭示所衍生的肽片段或蛋白质。为进一步鉴定蛋白质，出现了一系列的质谱方法用来描述肽片段。用酶或化学方法从N-或C-末端按顺序除去氨基酸，形成梯形肽片段(ladder peptide)。首先以一种可控制的化学模式从N-末端降解，可产生大小不同的一系列的梯形肽片段，所得一定数目的肽质量由MALDI-TOF-MS测量。另一种方法涉及羧基肽酶的应用，从C-末端除去不同数目的氨基酸形成肽片段。化学法和酶法可产生相对较长的序列，其分子量精确至以区别赖氨酸(128.09)和谷氨酰胺(128.06)。或者，在质谱仪内应用源后衰变(post-source decay, PSD)和碰撞诱导解离(collision-induced dissociation, CID)，目的是产生包含有仅异于一个氨基酸残基质量的一系列肽峰的质谱。因此，允许推断肽片段序列。肽片段PSD的分析在MALDI反应器上能产生部分序列信息。首先进行肽质指纹鉴定。之后，一个有意义的肽片段在质谱仪被选作“母离子”，在飞行至离子反应器的过程中降解为“子离子”。在反应器中，用逐渐降低的电压可测量至检测器的不同大小的片段。但经常产生不完全的片段。现在用肽片段来测序的方法始于70年代末的CID，可以一个三联四极质谱ESI-MS或MALDI-TOF-MS联合碰撞器内来完成。在ESI-MS中，由电雾源产生的肽离子在质谱仪的第一个四极质谱中测量，有意义的肽片段被送至第二个四极质谱中，惰性气体轰击使其成为碎片，所得产物在第三个四极质谱中测量。与MALDI-PSD相比，CID稳定、强健、普遍，肽离子片段基本沿着酰胺键的主架被轰击产生梯形序列。连续的片段间差异决定此序列在那一点的氨基酸的质量。由此，序列可被推测。由CID图谱还可获得的几个序列的残基，叫做“肽序列标签”。这样，联合肽片段母离子的分子量和肽片段距N-、C?端的距离将足以鉴定一个蛋白质。(4) 氨基酸组分分析。1977年首次作为鉴定蛋白质的一种工具，是一种独特的“脚印”技术。利用蛋白质异质性的氨基酸组分特征，成为一种独立于序列的属性，不同于肽质量或序列标签。Latter首次表明氨基酸组分的数据能用于从2-DE凝胶上鉴定蛋白质。通过放射标记的氨基酸来测定蛋白质的组分，或者将蛋白质印迹到PVDF膜上，在155℃进行酸性水解1 h，通过这

质谱与蛋白质组学蛋白质组学对一个细胞或组织所表达的蛋白质进行的系统分析，而质谱是它的关键性分析工具。在过去的两年中，标准蛋白质组技术中的进展增进了更高水平自动化和敏感性的蛋白质识别技术。另外，新的技术促成了鉴定蛋白质功能相关特性的里程碑性的进展，包括它们的定量和在蛋白质复合物中复杂情况。缩写2DE two-dimensional gel electrophoresis双向凝胶电泳CID collision-induced dissociation碰撞诱导的解离ESI electrospray ionization电喷雾离子化FT-ICR Fourier-transform ion cyclotron resonance傅里叶-变换离子回旋加速器共振ICAT isotope-coded affinity tagsIEF isoelectric focusing等电聚焦MALDI matrix-assisted laser desorption ionization基质辅助的激光解析离子化Q-TOF quadrupole-TOFRP reversed phase反向TOF time-of-flight飞行时间简介蛋白质组学的核心组成是系统识别一个细胞或组织中表达的每一个蛋白质，以及确定每个蛋白质的突出特征(比如，丰度、修饰状态以及在多蛋白质复合体中的复杂状态)。这些分析的技术包括分离蛋白质和肽的分离科学、识别和定量分析物的分析科学和数据管理和分析的生物信息学。它的初步工具包括使用IEF(等电点聚焦)/SDS-PAGE凝胶的高分辨率的双向凝胶电泳(2DE)，结合质谱和数据库搜索来分离、识别和定量在一个复合样本中存在的个体蛋白质，最终识别被分离的蛋白质。一个常用的方法用在Fig1中用图解说明。此技术以及由此而来的变化(综述见[1])已经被用来识别和分类在复杂样本中存在的大量蛋白质，并在蛋白质组数据库中呈现它们，该过程我们这里称之为"描述蛋白质组学"比如，Shevchenko等[2]从2D凝胶上系统地鉴定了150个蛋白质。数目庞大的这样的数据库现在可以找到。同样的技术现在已经被作为普遍的发现工具来动态检测一个细胞或组织对外来或内部干扰反应而在蛋白质组中的改变。因为检测动态改变需要精确定量每个被检测成分，我们使用"定量蛋白质组学"来定义。在此报告中，我们总结了自1999年1月至2000年4月来报道的与蛋白质组学和质谱相关的最重要的进展。在核心质谱技术中的进展已经导致2DE为基础的蛋白质组学技术的进一步改进。它们同时又促进了传统凝胶为基础的方法的替代方法，诸如引入以同位素稀释理论为基础的精确蛋白质定量技术和蛋白质复合物的系统分析。蛋白质组分析的MS技术进展在此部分，我们总结了在MS设备、它们的控制和操作中的进展，以及比较质谱数据和序列数据库识别蛋白质所用的搜索工具的进展。随着新型质谱仪的引入，蛋白质组学研究现存类型的质谱仪性能已经显著改进了。在此综述期间最普遍使用的仪器是可以分为两类：单一阶段的质谱仪和串联质谱为基础的系统。单一阶段的质谱仪，最显著的是基质辅助的激光解吸电离(MALDI)飞行时间(TOF)仪器，被用于无数通过肽质谱图谱技术大规模蛋白质识别的项目中。此方法在鉴别表达自小一些的和完全测序的基因组的蛋白质特别成功[3,4]。串联质谱仪器诸如triple quadrpole、离子捕获(ion-trap)和近来引进的混合quadrupole飞行时间(Q-TOF)被常规应用于[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS或用电喷雾电离(ESI)来生成肽片段离子谱，以便通过搜寻序列数据库进行蛋白质鉴定。使用仪器控制程序来自动选择肽离子进行碰撞诱导的解离(CID)(数据依赖CID)的不断增多是这些MS/MS仪器的一个明显的趋势。一些新的构造的具有高潜能的质谱仪被引入到蛋白质组学研究中产生深刻影响。两个研究组近来一个MALDI离子源和一个混合Q-TOF耦联了起来[5,6]。Q-TOF提供的质量准确性和敏感性提升了数据库搜寻结果并同时使它成为MS/MS从头测序的当然仪器选择。MALDI Q-TOF构造提供了激动人心的机会进行自动化和高通量应用以及在一个样品盘上存档样品进行日后研究的可能。Medzihradszky等[7]描述了一个不同的混合仪器称之为MALDI TOF TOF。此设备享有许多MALDI Q-TOF的优点，另外能够进行高能量CID和非常快速的扫描速率。傅里叶-变换离子回旋加速器共振(FT-ICR)质谱对于蛋白质组学来说相对陌生。这些设备具有非常高的敏感性和分辨率，质量精确性可以达到1ppm。这些特征被用来在一次分析中测量和定量几百种蛋白质的完整的分子质量[8]。Goodlett等[9]表明FT-MS测量的一个肽的准确质量以及可以容易获得的限制因素能够通过序列数据库搜索被用来识别蛋白质。蛋白质组学如果没有软件工具来进行质谱数据和序列数据库的关联将变得几无可能。现存的数据库搜索程序已经变得越来越成熟和可以(从网络)可获得。另外，引入了新的算法。主要相关程序是Sequest[10]，MASCOT[11]，PeptedeSearch[12]，PROWL[13]和Protein Prospector[14]。在它们中间，Sequest使用CID谱设置了蛋白质识别的实验室标准(benchmark)，因为它与边界MS/MS数据工作得最好，并高度可信，可以从整个[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS实验中自动分析数据，并不需要任何使用者的破译工作。在所提的程序中，然而，只有Sequest不能在网络上搜索。MASCOT是一个新的、快速、网络可进入和多功能的程序，具有进行肽指纹分析、用部分破译或未破译的CID谱进行数据库搜索的功能。

基因组(genome)包含的遗传信息经转录产生mRNA，一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的mRNA称为转录子组(transcriptome)。很显然，不同细胞在不同生理或病理状态下转录子组包含的mRNA的种类不尽相同。mRNA经翻译产生蛋白质，一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质称为蛋白质组(proteome)。同理，不同细胞在不同生理或病理状态下所表达的蛋白质的种类也不尽相同。蛋白质是基因功能的实施者，因此对蛋白质结构，定位和蛋白质-蛋白质相互作用的研究将为阐明生命现象的本质提供直接的基础。生命科学是实验科学，因此生命科学的发展极大地依赖于实验技术的发展。以DNA序列分析技术为核心的基因组研究技术推动了基因组研究的日新月异，而以基因芯片技术为代表的基因表达研究技术为科学家了解基因表达规律立下汗马功劳。在蛋白质组研究中，二维电泳和质谱技术的黄金组合又为科学家掌握蛋白质表达规律再铸辉煌。蛋白质组学(proteomics)就是指研究蛋白质组的技术及这些研究得到的结果。蛋白质组学的研究试图比较细胞在不同生理或病理条件下蛋白质表达的异同，对相关蛋白质进行分类和鉴定。更重要的是蛋白质组学的研究要分析蛋白质间相互作用和蛋白质的功能。蛋白质组学的研究内容包括：1.蛋白质鉴定：可以利用一维电泳和二维电泳并结合Western等技术，利用蛋白质芯片和抗体芯片及免疫共沉淀等技术对蛋白质进行鉴定研究。2.翻译后修饰：很多mRNA表达产生的蛋白质要经历翻译后修饰如磷酸化，糖基化，酶原激活等。翻译后修饰是蛋白质调节功能的重要方式，因此对蛋白质翻译后修饰的研究对阐明蛋白质的功能具有重要作用。3.蛋白质功能确定：如分析酶活性和确定酶底物，细胞因子的生物分析/配基-受体结合分析。可以利用基因敲除和反义技术分析基因表达产物-蛋白质的功能。另外对蛋白质表达出来后在细胞内的定位研究也在一定程度上有助于蛋白质功能的了解。Clontech的荧光蛋白表达系统就是研究蛋白质在细胞内定位的一个很好的工具。4.对人类而言，蛋白质组学的研究最终要服务于人类的健康，主要指促进分子医学的发展。如寻找药物的靶分子。很多药物本身就是蛋白质，而很多药物的靶分子也是蛋白质。药物也可以干预蛋白质-蛋白质相互作用。在基础医学和疾病机理研究中，了解人不同发育、生长期和不同生理、病理条件下及不同细胞类型的基因表达的特点具有特别重要的意义。这些研究可能找到直接与特定生理或病理状态相关的分子，进一步为设计作用于特定靶分子的药物奠定基础。不同发育、生长期和不同生理、病理条件下不同的细胞类型的基因表达是不一致的，因此对蛋白质表达的研究应该精确到细胞甚至亚细胞水平。可以利用免疫组织化学技术达到这个目的，但该技术的致命缺点是通量低。LCM技术可以精确地从组织切片中取出研究者感兴趣的细胞类型，因此LCM技术实际上是一种原位技术。取出的细胞用于蛋白质样品的制备，结合抗体芯片或二维电泳-质谱的技术路线，可以对蛋白质的表达进行原位的高通量的研究。很多研究采用匀浆组织制备蛋白质样品的技术路线，其研究结论值得怀疑，因为组织匀浆后不同细胞类型的蛋白质混杂在一起，最后得到的研究数据根本无法解释蛋白质在每类细胞中的表达情况。虽然培养细胞可以得到单一类型细胞，但体外培养的细胞很难模拟体内细胞的环境，因此这样研究得出的结论也很难用于解释在体实际情况。因此在研究中首先应该将不同细胞类型分离，分离出来的不同类型细胞可以用于基因表达研究，包括mRNA和蛋白质的表达。LCM技术获得的细胞可以用于蛋白质样品的制备。可以根据需要制备总蛋白，或膜蛋白，或核蛋白等，也可以富集糖蛋白，或通过去除白蛋白来减少蛋白质类型的复杂程度。相关试剂盒均有厂商提供。蛋白质样品中的不同类型的蛋白质可以通过二维电泳进行分离。二维电泳可以将不同种类的蛋白质按照等电点和分子量差异进行高分辨率的分离。成功的二维电泳可以将2000到3000种蛋白质进行分离。电泳后对胶进行高灵敏度的染色如银染和荧光染色。如果是比较两种样品之间蛋白质表达的异同，可以在同样条件下分别制备二者的蛋白质样品，然后在同样条件下进行二维电泳，染色后比较两块胶。也可以将二者的蛋白质样品分别用不同的荧光染料标记，然后两种蛋白质样品在一块胶上进行二维电泳的分离，最后通过荧光扫描技术分析结果。胶染色后可以利用凝胶图象分析系统成像，然后通过分析软件对蛋白质点进行定量分析，并且对感兴趣的蛋白质点进行定位。通过专门的蛋白质点切割系统，可以将蛋白质点所在的胶区域进行精确切割。接着对胶中蛋白质进行酶切消化，酶切后的消化物经脱盐/浓缩处理后就可以通过点样系统将蛋白质点样到特定的材料的表面（MALDI-TOF）。最后这些蛋白质就可以在质谱系统中进行分析，从而得到蛋白质的定性数据;这些数据可以用于构建数据库或和已有的数据库进行比较分析。实际上像人类的血浆，尿液，脑脊液，乳腺，心脏，膀胱癌和磷状细胞癌及多种病原微生物的蛋白质样品的二维电泳数据库已经建立起来，研究者可以登录www.expasy.ch/www/tools.html等网站进行查询，并和自己的同类研究进行对比分析。Genomic Solution可以为研究者提供除质谱外的所有蛋白质组学研究工具，包括二维电泳系统，成像系统及分析软件，胶切割系统，蛋白质消化浓缩工作站，点样工作站等；同时还可以提供相关试剂和消耗品。LCM-二维电泳-质谱的技术路线是典型的一条蛋白质组学研究的技术路线，除此以外，LCM-抗体芯片也是一条重要的蛋白质组学研究的技术路线。即通过LCM技术获得感兴趣的细胞类型，制备细胞蛋白质样品，蛋白质经荧光染料标记后和抗体芯片杂交，从而可以比较两种样品蛋白质表达的异同。Clontech最近开发了一张抗体芯片，可以对378种膜蛋白和胞浆蛋白进行分析。该芯片同时配合了抗体芯片的全部操作过程的重要试剂，包括蛋白质制备试剂，蛋白质的荧光染料标记试剂，标记体系的纯化试剂，杂交试剂等。对于蛋白质相互作用的研究，酵母双杂交和噬菌体展示技术无疑是很好的研究方法。Clontech开发的酵母双杂交系统和NEB公司开发的噬菌体展示技术可供研究者选用。关于蛋白质组的研究，也可以将蛋白质组的部分或全部种类的蛋白质制作成蛋白质芯片，这样的蛋白质芯片可以用于蛋白质相互作用研究，蛋白表达研究和小分子蛋白结合研究。Science，Vol.293，Issue 5537，2101-2105，September 14，2001发表了一篇关于酵母蛋白质组芯片的论文。该文主要研究内容为：将酵母的5800个ORF表达成蛋白质并进行纯化点样制作芯片，然后用该芯片筛选钙调素和磷脂分子的相互作用分子。最后有必要指出的是，传统的蛋白质研究注重研究单一蛋白质，而蛋白质组学注重研究参与特定生理或病理状态的所有的蛋白质种类及其与周围环境(分子)的关系。因此蛋白质组学的研究通常是高通量的。适应这个要求，蛋白质组学相关研究工具通常都是高度自动化的系统，通量高而速度快，配合相应分析软件和数据库，研究者可以在最短的时间内处理最多的数据。

云唐蛋白质检测仪是一种用于测定食品、生物样品等中蛋白质含量的仪器设备。它在食品科学、生物学、医学和生化等领域具有重要作用，以下是其主要作用：　　食品质量控制： 在食品工业中，蛋白质是食品的主要组分之一，其含量影响着食品的口感、质地、营养价值等。蛋白质检测仪可以用于监测食品样品中的蛋白质含量，确保产品的质量稳定性和一致性。　　生物学研究： 在生物学研究中，蛋白质是细胞功能和结构的重要组成部分。蛋白质检测仪可以帮助研究人员测定生物样品(如细胞提取物、血清等)中蛋白质含量，从而深入了解细胞的生物学特性和疾病机制。　　医学诊断： 在临床医学中，某些疾病的发展可能会导致血清蛋白质含量的改变。蛋白质检测仪可以用于测定血液和尿液中的蛋白质含量，帮助医生进行疾病诊断和监测。　　药物研发： 药物研发过程中，蛋白质的定量分析是评估药物效果的重要环节。蛋白质检测仪可以用于分析药物与蛋白质的相互作用，评估药物对蛋白质的影响。　　生化实验： 在生化实验室中，蛋白质检测仪常用于定量测定蛋白质样品，用于分析实验数据和评估实验结果的可靠性。　　环境监测： 在环境科学领域，蛋白质检测仪可以用于监测水体、土壤等环境中蛋白质的含量，从而评估环境质量。

最近使用新买的便携式近红外设备，对酶力肽进行了蛋白质的湿化学方法检测，然后对样品光谱进行采集，通过定量分析模型的建立、优化，尝试对样品进行回归测定。蛋白质采用凯氏定氮法，按同一标准，粉碎蛋白有一定差异的样品（同一粉碎机、粉碎时间），测定出样品蛋白质含量的真值：70-90%（主要是含水量不同造成的差异）。光谱采集分粉碎样品和原始样品两种类型，分别建模。结果：总体不错。但有几个问题需要大家注意。1. 粒度对模型和检测结果影响非常大，一定要粉碎一致。不同粒度下建立的模型检测结果误差很大，尤其是未粉碎的，误差更大。粉碎的样品结果一致性很好2.由于采用漫发射光谱，光源直接贴近样品照射，同一位点进行定量检测时如果不移动，每次的检测结果都会变化，但按绝对值增大约1%的幅度增加。我感觉可能与长期一直照射的情况下，样品内部温度发生变化导致水分发生移动，或漫反射的能量加强导致检测结果不稳定。但哪个是主要原因呢？？？

PS1利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间（MALDI-TOF）技术来表征生物分子。样品溶于固定的底物中形成晶体，用激光脉冲使其离子化，离子被加速后通过飞行管时分离，所有离子均可被检测。系统包括三个组成部件：样品点样制备工作站（SymBiot 1）、生物质谱工作站（Voyager-DE PRO）和自动化分析软件（AutoMS-Fit）。SymBiot1 是一个自动样品处理系统，支持亚微升级微量点样，具有快速省时、重现性好的特点；Voyager-DE PRO是为蛋白质组研究专门设计的自动飞行时间质谱分析系统，配有AB公司之专利—延迟检测技术，具有高分辨率、质荷比宽等特点；AutoMS软件可以批处理方式或实时动态方式检索Protein Prospector蛋白数据库或您指定的蛋白数据库，查询参数可以任意设定，检索结果以Microsoft Access格式分类编号及储存。 PS 1技术平台建立伊始便受到了许多蛋白质课题研究组的关注。中国科学院上海生物化学研究所戚正武院士课题组从猪肝中提取某一活性蛋白组分，该组分理化性质不清楚，天然含量十分低，并无相关文献报道。用HPLC分离以后对活性组分的成分不能确定。上海基康生物技术有限公司运用PS 1系统对HPLC分离后的活性组分作了质谱分析，仅在一个工作日内就精确确定该组分由分子量极为相近的几种蛋白质构成，分子量精确度达到10 ppm。后经HPLC再次细分（洗脱梯度增加了2.5倍），证实了质谱的结论。此活性组分曾滤过1kD分子筛，基康的质谱数据纠正了研究人员过去对该活性组分分子量的误判，为研究人员明确实验方向、优化实验步骤提供了强有力的依据。 PS1除了可以进行生物大分子的精确分子量测定，还可用于蛋白的肽指纹图谱分析(peptide mass fingerprint，PMF)，提供相关生物信息学服务，并且还可以利用源后衰变（Post Source Decay，PSD）技术来获得样品的MS/MS数据，以得到一级结构信息。PSD方法通常增加了激发激光的功率，使其超过产生一般肽指纹谱图所需功率的阈值，过剩的能量使前体离子在源内离子化之后发生裂解，产生一系列碎片离子，在反射器的作用下，最终可以得到一张连续的碎片离子图谱。经特定的软件分析后，即可在数据库中检索到肽段的氨基酸序列。利用PSD分析技术，还可以对磷酸化，糖基化等翻译后修饰进行定位分析，同样也可以鉴定产生翻译后修饰肽段的蛋白质。Neville et al.（1997）将这一方法成功的用于磷酸肽的序列分析。作为重要的蛋白质鉴定手段之一，PS1的精确度可以达到10 ppm，灵敏度为fmol，分子量检测范围可达到500 kDa，每天可自动分析40-100个样品，适用于大规模“蛋白质组学”研究。

20世纪基因组学研究取得的巨大成就为蛋白质组学的发展奠定了基础。蛋白质组学是从整体水平上分析生命体、组织或细胞的蛋白质组成及其活动规律的科学，以基因表达产物为研究对象，延伸了基因组学研究深度，更深层次地揭示了生命活动规律。蛋白质组学的研究内容主要包括蛋白质表达存在方式(修饰形式)的鉴定、结构与功能分析、蛋白质定位、蛋白质差异表达以及蛋白质间相互作用分析等[1]。目前蛋白质组学研究技术主要包括：二维电泳技术、蛋白质芯片技术、质谱技术等[2]。其中，二维电泳技术是早期蛋白质组学的重要技术之一，但是由于实验步骤多，耗时长，重复性差等特点，已经逐步被新型技术所取代。蛋白质芯片技术是将多种蛋白质纯品点于芯片表面，形成蛋白质矩阵进行免疫等标记反应，主要受限于很多蛋白质无法获得纯品而不能用于芯片制备。质谱技术由于灵敏度高、特异性强、分析范围宽等优点逐渐成为蛋白质组学的主要研究手段，可以对特定生命过程中的功能性蛋白质分子进行定性和定量检测，因此在基础科研和临床研究中得到了广泛的应用[3,4]。一、基于质谱的蛋白质组学技术1．基于质谱的蛋白质组学定性技术：蛋白质定性鉴定的基本原理在于：蛋白质组的基本序列已经通过基因组学信息获得，可以用来鉴定多肽的氨基酸序列，并且获得多肽与蛋白质的对应关系[1]，即质谱提供的多肽碎片数据可以与蛋白质数据库自动匹配来确定多肽序列与蛋白质归属。基本技术策略分为：(1)自上而下(Top–down)策略[5]，即完整蛋白质在质谱中进行分析，可以提供完整蛋白质的质量数，但是由于质谱仪受到质量分析范围的限制，此方法在常规实验室不易实现。(2)自下而上(Bottom–up)策略[6]，即蛋白质被蛋白酶水解成多肽，然后对多肽进行质谱分析和碎裂。基于这条策略的大致步骤为：蛋白质样品首先经过酶解降解为多肽，然后对多肽进行色谱–质谱分离与鉴定，最后通过搜索引擎(MASCOT：http：//www.matrixscience.com/server.html, SEQUEST：http：//fields.scripps.edu/sequest等)在公共蛋白质组学数据库(SWISS–PORT: http：//web.expasy.org/groups/swissprot, NCBI：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed等)中自动完成质谱数据的解析，确定多肽序列与蛋白质种类。该技术灵敏度高，特异性好，仪器自动化程度高，可以鉴定出生物样品中成千上万种蛋白质，被认为是大规模、高通量蛋白质定性检测的首选方法。2．基于质谱的蛋白质组学相对定量技术：对于大多数生命科学和医学研究来说，仅完成样品中蛋白质组的定性研究是远远不够的，还需要对蛋白质组进行定量分析。由于组学的研究对象是多个蛋白质，单次检测很难实现所有蛋白质的绝对定量，因此蛋白质组学定量多为相对定量检测。蛋白质组学定量的质谱技术包括谱图计数、质谱峰强度定量、同位素定量技术等。其中使用同位素作为内标定量的方法是目前质谱定量的最佳手段，即对整体蛋白质组进行同位素标记，并使用每一种天然蛋白质与同位素蛋白质的比值进行相对定量分析。主要分为细胞层面标记和蛋白质层面标记两种技术路线：(1)细胞层面标记的细胞培养氨基酸稳定同位素标记(stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)方法[7]：即在两种细胞样品中分别加入轻重同位素标记的培养基，经过传代培养后，两种细胞样品中的全部蛋白质中分别嵌合了轻重同位素，可以在质谱上根据同位素的不同质荷比直接判断样品来源并进行定量比对。(2)蛋白质层面标记：使用含有同位素的小分子与样品全部蛋白质直接标记，如同位素标记相对和绝对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)[8]、同位素编码亲和标记(isotope–coded affinity tag，iCAT) [9]、18O标记[10]等方法，此类方法使用带有稳定同位素的小分子与特定氨基酸侧链反应，使得多个样品可以分别连接含有不同同位素个数(多至8个)的小分子，从而产生一级数据相同但是二级数据不同的质谱谱图，通过二级谱图强度比对进行多个样品的定量分析。3．基于质谱的目标蛋白质绝对定量技术：质谱技术对目标蛋白质的绝对定量检测主要通过质谱多反应监控技术与同位素多肽内标技术联用来实现[11]。该方法首先选定目标蛋白质的一个或多个多肽，合成序列相同但含有稳定同位素的多肽作为内标，定量加入样品中，通过监测特定多肽及其同位素多肽的质谱峰强度进行比对和计算获得目标蛋白质的定量值。质谱多反应监控技术通过进行母离子筛选与子离子筛选等二次选择过程，筛选出目标蛋白质，而非目标蛋白质由于无法通过筛选达到检测器，极大降低了噪音干扰。因此，此方法针对性强，本底噪音低，是目前质谱技术中定量能力最好的一种，可以控制变异系数小于15%，检测限低至纳克每毫升，适合血液、组织等临床样品的定量检测[11]。二、质谱技术发现肿瘤蛋白质标志物质谱技术作为一项强有力的研究工具在科学研究中发挥着巨大的作用，特别在肿瘤相关研究中，目前已经获得美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准的肿瘤标志物包括多种蛋白质前列腺特异性抗原(prostate–specific antigen, PSA), 癌胚抗原(carcinoembryonic antigen CEA), 人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，Her–2), 人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, HCG), 糖类抗原CA125等，均揭示了蛋白质与肿瘤发生发展密切相关。这些已有成果极大促进了质谱技术在肿瘤蛋白质标志物研究中的应用，并取得了标志性进展。例如：美国约翰霍普金斯大学的Chan课题组发现了新型卵巢癌蛋白质标志物，他们使用表面增强激光解析电离质谱技术(surface enhanced laser desorption and ionization time–of–flight mass spectrometry, SELDI–TOF MS)技术对503个妇女的血清进行了蛋白质组学的分析[12]，在随后的大量临床验证中最终确定CA125、β2微球蛋白，转铁蛋白，甲状腺运载蛋白和载脂蛋白A1的联合检测可以作为卵巢癌的新型临床诊断指标。2009年9月该试剂盒OVA1(商品名称：http：//ova–1.com)获得了美国FDA的认证，进入临床使用，被认为是国际肿瘤蛋白质标志物研究的重要标志性成果。同时，肿瘤仍然是国际上致死率最高的疾病之一，缺乏早期检测技术和有效治疗方案，临床中还存在着大量问题需要解决，新型标志物的研发迫在眉睫。由于肿瘤蛋白质标志物研究的难度大，风险高，因此近十年来仅有几例试剂盒获得了美国FDA批准，进入临床使用。大量标志物研究还停留在论文研究水平，其中临床问题、研究思路和技术方案的选择直接关系到研究的成功与否。1．临床问题选择：在肿瘤蛋白质标志物研究中，临床问题的选择是研究核心。在肿瘤研究中，需要解决的临床问题往往包括肿瘤早期检测、肿瘤分期检测、治疗方案与药物选择、疗效评估等多个方面。研究者需要根据不同肿瘤的临床情况，具体分析并凝练不同肿瘤的主要临床问题。例如，对于病程发展快、五年存活率低、没有有效手术或化疗手段的肿瘤，早期诊断是研究重点，如胰腺癌、卵巢癌、肺癌等；对于病程发展慢、手术效果明显的肿瘤，肿瘤的愈后与复发是需要关注的问题，如前列腺癌、肠癌等；还有一些肿瘤有特殊的检测需求，如乳腺癌虽然有临床有效的雌激素受体(estrogen receptor，ER)，孕激素受体(progesterone receptor，PR)，HER2等基因标志物，可以进行药物靶点治疗，但是三阴性乳腺癌的检测还缺乏有效的标志物与治疗方案。因此，在肿瘤蛋白质标志物研究实验开展之前，明确临床问题，并以此确定临床样品入组标准，是研究成功的核心基础。2．研究思路设计：不同于基础科学实验，临床实验需要在大量样本中进行实验结果的验证，因此肿瘤蛋白质标志物研究往往包括新型标志物发现和验证两部分。标志物发现实验是在疾病组和对照组之间进行蛋白质组学分析，鉴定样本中的未知蛋白质组并进行相对定量比较，分析数据选择出在两组样本中差异最大的一个或几个蛋白质作为新型标志物的候选物。随后，标志物验证实验在大量未知样本中进行蛋白质候选物的定量检测，使用发现实验中建立的区分标准进行判读，计算检测灵敏性(sensitivity)和特异性(specificity)。有效的蛋白质标志物研究往往需要发现与验证的两步设计思路来相互保证。3．技术方案选择：根据蛋白质标志物研究的两步设计思路，发现实验中使用基于质谱的蛋白质组学定性技术与相对定量技术对样本中的大量未知蛋白质进行分析，获得标志物候选物名单。验证实验中根据已有名单，进行目标蛋白质(非蛋白质组学)的精确定量检测。这几种质谱技术的配合使用，可以满足不同实验情况和目的，最终实现新型蛋白质标志物的成功研发。三、展望质谱技术是现阶段蛋白质组学研究的核心技术，具有灵敏度高、特异性强、分析通量大等优势，特别是其与同位素内标的联合使用，大大提高了质谱定量能力，因此在多种肿瘤标志物研究中取得了突破性进展并被广泛应用。目前，大量肿瘤蛋白质标志物候选物已经通过使用质谱技术被从血液、组织、体液中筛选出来，预计在完成大规模临床验证后可以作为新型标志物在临床使用，促进肿瘤检测水平的发展。同时值得注意的是，质谱技术还不具备进行蛋白质组的绝对定量能力。相对于免疫等传统蛋白质检测技术，仪器昂贵，操作复杂，自动化程度低，这些因素决定了质谱目前适用于蛋白质的临床研究，但不适用于蛋白质的临床检验，这是质谱技术面临的重要挑战之一。参考文献[1]何华勤. 简明蛋白质组学[M]. 北京:中国林业出版社, 2011:1,76,85-95,119,125-138.[2]RuediA, MatthiasM. 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国家蛋白质科学上海设施/国家蛋白质科学中心（上海）（筹）公开招聘自动化控制系统工程师国家蛋白质科学研究上海设施是国家重大科技基础设施，是国家级蛋白质科学研究平台；在设施建设基础上，依托中国科学院上海生命科学研究院，委托生物化学与细胞生物学研究所(简称SIBCB)负责筹建成立并管理国家蛋白质科学中心（上海）(筹)， 负责设施的运行管理。中心在筹建期间，办公地点设于生化与细胞所（上海市岳阳路320号）；中心在建成运行期间，办公地点设于浦东新区张江高科技园区中区西部（上海市海科路333号）。中心定位于：支撑国家蛋白质上海设施建设的建设，衔接该设施的运行；聚集培养生命科学与生物技术特别 是蛋白质研究的人才，提升国家蛋白质研究能力；进而促进我国蛋白质基础研究的飞跃发展。中心将立足于国家生命科学与生物技术及相关研究领域雄厚的研究基础和创新实力，成为兼具蛋白质科学研究、技术及成果的转化、集成和应用平台的国家级的重要科学研究单元。国家蛋白质科学中心（上海）（筹）现因工作扩展的需要，公开招聘自动化控制系统工程师一名。一、岗位职责：参与国家蛋白质科学中心（上海）（筹）在上海同步辐射光源5线6站的建设、运行和管理，充分理解同步辐射光束线站的工作内容和线站用户的实际需求，完成线站自动化控制程序的设计、开发和维护。二、任职条件：1、本科以上学历，有丰富的 Unix/Linux 平台下的工作经验，熟悉 Unix/Linux 工作环境，习惯于在 Unix/Linux 平台下工作。有大量的源代码的阅读经验。2、有丰富的 C/C++ 开发经验。熟悉 Socket 编程和多线程编程。3、良好的英文表达能力。能独立完成项目调研，设计和开发工作。4、有以下背景或经验者优先考虑：有大型系统开发经验者和硬件开发经验者；有软件界面开发经验者；有网络程序开发经验者；熟悉 Tcl/Tk 语言者；有 Unix/Linux 系统管理经验者。5、具有良好的人际关系和团队协作精神，工作努力，作风踏实，责任心强。6、身体健康，能长期稳定工作。 三、招聘方式及程序 1、应聘材料：（[back=whi

近日，[b]科创中心生物与分子智造研究院分子智造研究所所长方群教授团队[/b]再出新成果！团队[b]开发了“点取式”单细胞蛋白质组分析（PiSPA）工作流程和基于纳升级微流控液滴操控机器人，实现了单细胞的精准捕获、前处理以及自动进样，并首次在单个哺乳动物细胞中实现了高达3000种蛋白质的超高定量深度[/b]。目前，相关研究成果以“ Pick-up single-cell proteomic analysis for quantifying up to 3000 proteins in a Mammalian cell ”为题在国际权威期刊《自然通讯》上发表。[b]这项成果也再次向我们证明了单细胞蛋白质组学在诊疗和预防、药物开发、癌症基因组学等精准医学研究中的应用潜力。[/b][align=center][img=,700,444]https://img1.17img.cn/17img/images/202402/uepic/a2bc5a12-447c-42f5-901c-d7cd2ada8821.jpg[/img][/align][align=center]团队自研的探针式微流控液滴操纵机器人系统[/align][color=#0070c0][b]更强大的单细胞蛋白质组分析工具：PiSPA工作流程[/b][/color]单细胞蛋白质组学技术是近年来生命科学领域研究的热点。因单个细胞中的蛋白质含量极微（仅约0.2 ng）且无法扩增，单细胞蛋白质组分析极具挑战性。目前传统蛋白质组分析技术仅能在每个细胞中鉴定1000种左右的蛋白质，而这在单细胞分析领域显得有些“力不从心”。此外，传统的样本前处理操作大多在微升级反应器中进行，在样品处理和转移的过程中会出现明显的样品损失，这会限制单细胞蛋白质组学的鉴定深度，难以满足生命科学研究的迫切需求。“想要突破单细胞蛋白质组学鉴定深度的障碍，有两种策略。一是在足够小的微反应器中进行样品前处理，利用微尺度效应提高反应效率；二是将所有操作整合在一起，降低样品损失，但这两种策略对技术与设备的要求都很高”，本项成果第一完成人王宇博士解释道，“我们利用微流控技术将商品化的内插管改造为阵列化的纳升级微反应器，解决了纳升级样品反应与自动进样的问题。PiSPA平台可自动完成细胞捕获、样品前处理、色谱分离、质谱检测、数据处理等操作，进一步降低了样品损失。”[align=center][img=,700,303]https://img1.17img.cn/17img/images/202402/uepic/63b80008-6467-4583-b1b7-147e9680c481.jpg[/img][/align][align=center]“点取式”单细胞蛋白质组分析流程示意图[/align][b]PiSPA工作流程使得高精度的液体操控、单细胞的精确处理以及先进的LC-TIMS-QTOF MS技术融为一体，重新定义了单细胞蛋白质组学分析。[/b]“在研究中，我们将该平台应用于三种哺乳动物细胞（HeLa、A549和U2OS细胞）的单细胞蛋白质组分析，以及HeLa细胞迁移过程中的细胞异质性研究中，均实现了超高深度定量分析”，王宇博士说。同时，迁移细胞的单细胞蛋白质组分析也证实了PiSPA平台具有识别细胞迁移关键分子以及有价值靶点的应用潜力。[align=center][img=,700,394]https://img1.17img.cn/17img/images/202402/uepic/b4d136ba-e078-4fc6-b59d-911f8f0abfcc.jpg[/img][/align][align=center]哺乳动物细胞的单细胞蛋白质组分析结果[/align][color=#0070c0][b]单细胞的定量深度：从3000+走向全蛋白质组测序[/b][/color]PiSPA平台集成了基于序控液滴（SODA）技术的自动化液滴操纵机器人，能够在“点取式”操作模式下实现纳升级的细胞分选、多步样品前处理和自动进样操作。相比于其他单细胞分析方法，[b]PiSPA平台的优势主要体现在与成像技术结合，能够灵活地选择任意单个细胞进行分析，目标细胞的捕获指向性强，具有很高的捕获准确性和成功率，并可保留目标细胞的表观和空间信息，显著增加了单细胞分析的信息维度[/b]。其次，PiSPA平台采用针对单细胞样品的“定制化”分析条件，实现了蛋白质鉴定深度的大幅提升，能够为生物医学研究提供更多有效的基础数据。这些优势对推动单细胞蛋白质组分析的实际推广应用具有重要意义。“目前的单细胞定量深度只是一个起点”，方群教授分享道，在该项研究中，可从单个哺乳动物细胞中可定量多达3000种蛋白质，约占人类基因编码蛋白质总数（约20,000种）的15%，其鉴定深度已经达到10年前单细胞转录组测序技术的相近水平。类比单细胞转录组测序技术的发展历史，可以预见当前已处于单细胞蛋白质组分析技术的爆发阶段，随着技术的快速革新，单细胞的定量鉴定深度还将得到史无前例的提升。“这意味着单细胞蛋白质组学技术已进入在广泛的生物医学研究领域中实际应用的阶段。”[align=center][img=,700,315]https://img1.17img.cn/17img/images/202402/uepic/0ff9f496-19a8-4d58-a0de-a5d54a37ad74.jpg[/img][/align][b]团队表示，未来，他们将进一步提高单细胞蛋白质组分析的鉴定深度和通量，以持续推进该技术实用化和应用拓展的水平[/b]。此外，在上述成果基础上，目前团队还在利用iChemFoundry平台的自动化机器人技术和机器视觉技术构建能够完成单细胞蛋白质组分析全部流程操作自动化的分析平台，很快会有新的成果发布，这些都将为人们了解生命活动中细胞异质性的变化带来更有力工具。[来源：浙大杭州科创中心][align=right][/align]

[font=宋体][font=宋体]泛素化是一种细胞内的蛋白质标记系统，蛋白质泛素化是指将小的蛋白质泛素共价地连接到其他蛋白质分子上的过程。泛素（[/font][font=Calibri]ubiquitin[/font][font=宋体]）是一种高度保守的蛋白质，其结构由[/font][font=Calibri]76[/font][font=宋体]个氨基酸残基组成。泛素连接到目标蛋白质上的过程，经历了泛素激活、泛素转移和靶蛋白接受三个主要步骤。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]蛋白质泛素化具有多种特点，例如它是高度选择性的，不同蛋白质泛素化的位置和数量可以影响其功能；它是可逆的，通过去泛素化反应可以调控蛋白质的泛素化状态；它还是动态调控的，受到多种因素的调控，如细胞信号通路和环境刺激。[/font][b][font=宋体]泛素化蛋白大小：[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]蛋白泛素化是指将小蛋白颗粒泛素（[/font][font=Calibri]Ubiquitin[/font][font=宋体]）与其他蛋白质共价结合的修饰过程。 泛素化修饰通常会导致泛素共价连接在蛋白质的赖氨酸残基上形成多重泛素链。 这种蛋白质泛素化增加了蛋白质的分子量，因为每个泛素分子的质量大约为[/font][b][font=Calibri]8.5[/font][font=宋体]千达尔顿（[/font][font=Calibri]kDa[/font][/b][font=宋体][b]）[/b]。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]泛素化蛋白质组学在许多领域有重要的应用，主要包括：[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]①疾病机制研究：泛素化是一种广泛存在于细胞中的蛋白质修饰方式，参与了细胞的生长、分化、修复和调控等多个生命活动。泛素化蛋白质组学的研究可以帮助我们了解泛素化修饰的生物学功能和调控机制，为疾病发生机制和治疗策略的研究提供重要线索。例如，在癌症、代谢综合征、神经退行性疾病等疾病中，则会出现异常泛素化。[/font][font=宋体]②药物研发：通过分析药物对泛素化蛋白质的影响，可以评估药物的效力和选择性，为药物研发提供指导。[/font][font=宋体]③临床诊断：泛素化蛋白质组学鉴定与定量分析技术可以揭示细胞调控的机制，通过分析泛素化蛋白质的组学数据，可以确定泛素化修饰在细胞信号转导、蛋白质降解和细胞周期调控等过程中的重要作用。此外，通过比较病态和正常样品中泛素化蛋白质的差异，可以鉴定与疾病发生发展相关的泛素化修饰靶点，并进一步理解疾病的分子机制。因此，这些技术也可用于临床诊断。[/font][font=宋体]④蛋白质降解调控：在癌症、神经退行性疾病和免疫相关疾病等病症中，蛋白质降解调控出现异常。而泛素化蛋白组在调控蛋白质降解中发挥重要作用。通过与泛素连接，目标蛋白质被送入蛋白酶体或蛋白酶体样体中进行降解。这个过程是细胞清除异常、老化或受损蛋白质的重要途径。[/font][font=宋体]⑤高通量技术应用：高通量泛素化蛋白质组学鉴定与定量分析技术的发展包括质谱鉴定和抗体鉴定两种方法。质谱鉴定技术利用质谱仪的高灵敏度和分辨率，能够鉴定泛素化修饰的蛋白质及其泛素化位点。抗体鉴定技术则通过特异性抗体的使用，可以富集和鉴定泛素化修饰的蛋白质。这些技术为全面了解泛素化在细胞中的作用机制和调控网络提供了可能。[/font][font=宋体]总的来说，泛素化蛋白质组学在多个领域都有重要的应用价值，推动了我们对生命过程的深入理解以及疾病治疗的创新发展。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]更多详情关于[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review][b]蛋白资源[/b][/url]详情可以参看：[/font][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review][u][font=宋体][color=#0000ff][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review[/font][/color][/font][/u][/url][b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

[b][color=#f10b00][size=4]新书《蛋白质组学实验指南与疑难解析》[/size][/color][/b]前言从1994年Williams提出“蛋白质组”至今，蛋白质组经历了“三级跳”式高速发展，铸造了生命科学领域全新的研究热点和学科方向。从人类蛋白质组组织（HUPO）启动的十二项人类蛋白质组计划，到最近我国启动的“蛋白质科学基础设施建设（凤凰工程）”，蛋白质组学参与人数之众、设立项目之多、投入经费之大、涉及行业之广，都是其它新型学科难以媲美的，蛋白质组学给生命科学注入了巨大的源泉与活力，可以说促成了“蛋白质科学的春天”的到来。然而，如此高速发展的蛋白质组学，也让许许多多人深深的感叹：入门难，提高水平更难。虽然国内外都出版了一些蛋白质组学和生物质谱的专著，但众多人还是觉得自己很多的谜团不能被解惑。到底要怎么去设计一个相对完整的蛋白质组研究？样品制备和电泳那么多试剂都有必要吗？为什么会出现那么多“坏胶”？TOF/TOF还能为蛋白质组作出多大贡献？DDA的液相色谱原理是什么？在线多维[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质联用[/color][/url]不是可以很轻松的解决成千上万个蛋白质的全自动鉴定吗？十分热门的离子淌度质谱在蛋白质组学中究竟有多大作为？如何确认和评判蛋白鉴定的效果？如何构建本地检索系统？如何自定义修饰？如何进行非标记蛋白质组学分析？本书正是从这样的角度出发，尝试将蛋白质组和质谱研究中的约200个疑难问题进行适当的解析，结合详细的操作步骤，希望帮助读者“既会做也能明白”蛋白质组研究。[color=#fe2419] [b] 如果关注本书的各位版友您可以回帖表示下是否期待用积分换购到本书？？[/b][/color][b][color=#013add][size=3]更多详情，请大家关注：魏开华研究员专栏[url]http://www.instrument.com.cn/ilog/wkh/[/url][/size][/color][/b]

如题，怎样对蛋白质拉曼光谱所获得的二级结构含量进行分析