红外法鉴别喹诺酮类抗菌药实验

喹诺酮类(Quinolones)是一类含有4-喹诺酮母核的化学合成抗菌药，它的抗菌谱广、抗菌活性强，广泛应用于畜牧、水产等养殖业中。然而，喹诺酮类药物有潜在的致癌性和遗传毒性，同时还容易使病菌产生耐药性。因此，喹诺酮类药物残留问题越来越引起人们的关注。美国FDA已于2005年宣布禁止用于治疗家禽细菌感染的抗菌药物恩诺沙星的销售和使用。联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂专家联席委员会、欧盟都已制定了多种喹诺酮类药物在动物组织中的最高残留限量。 高效液相色谱-串联质谱联用技术是近些年来发展很快的分析技术，具有很高的选择性和灵敏度，对复杂基质中的抗生素类残留具有很强的定性能力，准确度高，是目前超痕量残留分析的首选方法。 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8040联用测定牛奶中14种喹诺酮类抗生素的方法。该方法在7.0 min之内完成14 种目标物的分离分析，且精密度高，线性范围宽，校准曲线的相关系数均在0.999以上。对不同浓度的标准溶液进行精密度实验，连续6次进样保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.437%和4.937%以下，系统精密度良好。该方法具有超快速、高灵敏的特点，适合动物食品、水产品中喹诺酮类抗生素残留量的快速检测。 岛津三重四极杆质谱仪LCMS-8040 了解详情，敬请点击《超高效液相色谱三重四极杆质谱联用法测定牛奶中的喹诺酮类抗生素残留》 关于岛津 岛津企业管理（中国）有限公司是（株）岛津制作所于1999年100%出资，在中国设立的现地法人公司，在中国全境拥有13个分公司，事业规模不断扩大。其下设有北京、上海、广州、沈阳、成都分析中心，并拥有覆盖全国30个省的销售代理商网络以及60多个技术服务站，已构筑起为广大用户提供良好服务的完整体系。本公司以“为了人类和地球的健康”为经营理念，始终致力于为用户提供更加先进的产品和更加满意的服务，为中国社会的进步贡献力量。 更多信息请关注岛津公司网站www.shimadzu.com.cn/an/ 。 岛津官方微博地址http://weibo.com/chinashimadzu。岛津微信平台

喹诺酮类(Quinolones)是一类含有4-喹诺酮母核的化学合成抗菌药，它的抗菌谱广、抗菌活性强，广泛应用于畜牧、水产等养殖业中。然而，喹诺酮类药物有潜在的致癌性和遗传毒性，同时还容易使病菌产生耐药性。因此，喹诺酮类药物残留问题越来越引起人们的关注。美国FDA已于2005年宣布禁止用于治疗家禽细菌感染的抗菌药物恩诺沙星的销售和使用。联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂专家联席委员会、欧盟都已制定了多种喹诺酮类药物在动物组织中的最高残留限量。 高效液相色谱-串联质谱联用技术是近些年来发展很快的分析技术，具有很高的选择性和灵敏度，对复杂基质中的抗生素类残留具有很强的定性能力，准确度高，是目前超痕量残留分析的首选方法。 岛津公司建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪和三重四极杆质谱仪联用测定动物源性食品中14种喹诺酮类抗生素的方法。样品经处理后，用超高效液相色谱LC-30A在7 min内实现快速分离，三重四极杆质谱仪LCMS-8040进行定量分析。使用外标法内绘制14种喹诺酮类抗生素的校准曲线，线性良好，相关系数为0.999以上；对不同浓度的标准溶液进行精密度实验，连续6次进样保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.437 %和4.937%以下，表明仪器精密度良好。 了解详情，请点击&ldquo 超高效液相色谱三重四极杆质谱联用法测定牛奶中的喹诺酮类抗生素残留&rdquo 。 关于岛津 岛津企业管理（中国）有限公司是（株）岛津制作所为扩大中国事业的规模，于1999年100%出资，在中国设立的现地法人公司。 目前，岛津企业管理（中国）有限公司在中国全境拥有13个分公司，事业规模正在不断扩大。其下设有北京、上海、广州、沈阳及成都5个分析中心；覆盖全国30个省的销售代理商网络；60多个技术服务站，构筑起为广大用户提供良好服务的完整体系。 岛津作为全球化的生产基地，已构筑起了不仅面向中国客户，同时也面向全世界的产品生产、供应体系，并力图构建起一个符合中国市场要求的产品生产体制。 以&ldquo 为了人类和地球的健康&rdquo 为目标，岛津人将始终致力于为用户提供更加先进的产品和更加满意的服务。 更多信息请关注岛津公司网站www.shimadzu.com.cn。

抗生素的不当使用一方面贻误病情、导致复发感染，甚至造成人体菌群紊乱，诱导其它疾病的发生，另一方面则加速耐药菌乃至“超级细菌”的出现。因此，如何实现“快、准、狠”的抗生素精准用药既是精准医学的重要前沿，也是遏制耐药性蔓延的核心挑战之一。而准确全面的抗菌效果评价技术是抗生素精准用药的前提与基础。近日，中国科学院青岛生物能源与过程研究所单细胞中心与中山大学光华口腔医学院合作发表了基于重水标记单细胞拉曼成像的药物抗菌效果评价技术，在单个细菌细胞精度快速测量药物对细胞代谢活性的抑制性。以此为基础提出的“基于代谢活性的最低抑菌浓度”(“MIC-MA”指数)，与目前临床用药普遍依据的“最低抑菌浓度”(“MIC”指数)相比具有重要的特色与优势，因此有望成为指导临床精准用药的新标准之一。该工作近期发表于《分析化学》(Analytical Chemistry)。　　据专家估算，目前在必须使用抗生素治疗的临床案例中，高达30~50%存在着治疗方案制定、抗生素选择或抗生素疗程等方面的错误 在重症监护中，约30~60%的抗生素处方均存在非必要抗生素的滥用、非对症抗生素或者非最佳抗生素组合方案等问题。与此同时，目前每年约有70万人死于耐药菌感染 到2050年，这一数目将激增至每年1000万人，大约为每年死于各种癌症的病人总数。因此，2016年9月22日联合国大会193个成员国共同签署了历史性宣言，承诺通力合作扫除“超级耐药病菌”。2016年8月26日中国国家卫计委等14部门联合印发的《遏制细菌耐药国家行动计划(2016-2020)》中明确提出，要“加强抗菌药物应用和耐药控制体系建设”和“完善抗菌药物应用和细菌耐药监测体系”。准确全面的抗菌效果评价技术是抗生素精准用药的前提与基础，但是，临床需求与技术现状的矛盾如此紧迫和突出，以至于2016年9月8日美国NIH悬赏二千万美元，专门激励细菌耐药性临床快检技术的研发。　　迄今为止，MIC指数，即体外培养细菌24小时后能抑制培养基内病原菌生长的最低药物浓度，一直是微生物药敏试验、抗菌药效评价和临床抗菌方案制定的主流标准与主要依据之一。然而其测量不仅耗时耗力，且对难以实验室培养或生长缓慢的病菌无能为力。尤其关键的是，MIC只能从抑制细胞数目扩增这一角度反映与测量药效，却无法检测处于“NGMA”(Non-Growing but Metabolically Active)状态的病菌，即在药物作用下已经不再增殖但仍然具备代谢活性的存活细胞。这种状态的病菌在临床上十分常见，如果在抗菌治疗中成为漏网之鱼，将贻误病情，引起复发性感染，进而诱导耐药菌乃至“超级细菌”的频繁出现。因此根据MIC制定抗菌治疗方案有可能出现“不够快、不够准、不够狠”的情况。　　针对上述瓶颈问题，研究人员开发了基于拉曼组(Ramanome)的细菌药物应激效应成像技术(如图)，有效地克服了上述缺陷。该研究以导致龋病的变形链球菌(Streptococcus mutans)与多种临床常见抗菌药物为模式，证明单细胞拉曼成像能够精确测量细胞利用胞外重水(D2O)分子的速率，而后者与该细胞的代谢活跃程度呈高度的正相关。因此与重水标记耦合的单细胞拉曼成像能够从对微生物代谢活性抑制的角度定量测量药效，让处于“NGMA”状态的细胞无所遁形，从而使抗菌治疗方案“够准”。同时，由于该方法具备单个细菌细胞的精度，因此对于绝大部分细菌、古菌和真菌，该方法能够测量同一样品内不同细胞之间在抗菌效应上的差异程度，评价病菌细胞群体或群落在药物作用下是否已被“赶尽杀绝”，从而使抗菌治疗方案“够狠”。实验还证明，该方法能够在半小时内快速区分氟耐受型和氟易感型的变形链球菌，这一高度灵敏性对于评价抗菌效果是否“够快”具有重要意义。　　基于上述重水标记单细胞拉曼成像技术，研究人员提出了名为“基于代谢活性的最低抑菌浓度”(“MIC-MA”指数)的抗菌药效指标，即药物作用8个小时后所有细胞其代谢活性彻底、且全都被抑制的最低药物剂量。对于特定病菌和特定抗菌药物，MIC-MA指数与MIC指数显著不同。在该研究测试的三种抗菌药物的MIC剂量下，尽管变形链球菌细胞群体已经不再生长与扩增，但大部分的细胞都仍然保持着一定的代谢活性。事实上，在高达60倍MIC的氨苄西林剂量时，仍然存在高比例的“NGMA”状态的变形链球菌细胞，这导致在抗生素压力消失时病菌“星火燎原”，发生复发性感染。这说明MIC-MA在评价抗菌药效是否“快、准、狠”等方面，与目前临床上普遍参照的MIC相比，具有重要的特色与优势。　　此外，传统MIC检测将受试微生物作为同质化的群体来看待，忽视了针对细胞之间药效异质性的考察与评价。而MIC-MA在单个细胞精度的药敏性与药效检测，对于研究考察耐药性形成与微进化机制等方面具有重要意义。　　单细胞中心前期已经证明拉曼组能够快速区分细胞药物应激机制(Teng L, et al, Sci Rep, 2016)。因此，拉曼组技术预期将成为指导“个体化”临床精准用药与耐药性快检的新手段与新标准之一，同时，也为新型抗菌药物筛选与研发提供了崭新的共性技术平台。　　青岛能源所单细胞中心研究员徐健和中山大学光华口腔医学院教授凌均棨为论文的共同通讯作者，联合培养博士生陶一帆是论文的第一作者。该工作获得了国家自然科学基金委、中科院生物高通量检测分析技术服务网络(STS)等的支持。　　论文信息：　　Yifan Tao, Yun Wang, Shi Huang, Pengfei Zhu, Wei E. Huang, Junqi Ling*, Jian Xu*. Metabolic-activity based assessment of antimicrobial effects by D2O-labeled Single-Cell Raman Microspectroscopy. Anal. Chem., 2017, DOI:10.1021/acs.analchem.6b05051.　　Lin Teng, Yun Wang, Xiaojun Wang, Honglei Gou, Ren Lihui, Tingting Wang, Yun Wang, Yuetong Ji, Wei E. Huang, Jian Xu, Label-free, rapid and quantitative phenotyping of stress response in E. coli via ramanome. Sci Rep, 2016. 6:34359. DOI:10.1038/srep34359.基于重水标记单细胞拉曼成像的药物抗菌效果评价技术示意图