铰链机

大家好，本周为大家分享一篇发表在Anal. Chem.上的文章，Alkynyl -Enrichable Carboxyl-Selective Crosslinkers to Increase the Crosslinking Coverage for Deciphering Protein Structures，该文章的通讯作者是中国科学院大连化学物理研究所的赵群和张丽华研究员。化学交联结合质谱技术 (CXMS) 的交联覆盖范围对于决定其破译蛋白质的结构的能力具有重要意义。目前，交联质谱技术中最常用的交联剂的类型为针对赖氨酸侧链的N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 酯基交联剂。然而，此种交联剂存在一定的局限性，尤其是对于含有赖氨酸数目较少的蛋白质；其他类型的氨基酸残基，如羧基等，也可以进行交联反应，以补充赖氨酸残基的局限性并提高 CXMS 的交联覆盖率，然而，羧基的低固有化学反应活性损害了羧基选择性交联剂在复杂样品中的应用。鉴于此，本文开发了三种具有不同反应基团（如酰肼、氨基和氨氧基）的富含炔基的羧基选择性交联剂，以此提高针对酸性残基的交联效率并实现复杂样品的深入交联分析。文章要点：（1）本工作系统地评估了三种交联剂的交联效率，给出了氨基功能化交联剂 BAP 的最佳反应性。此外，结合BAP交联剂于高效的交联富集策略对大肠杆菌裂解物进行交联分析。在 ≤1% 的错误发现率 (FDR) 下，共鉴定出 392 种蛋白质中涉及到的 1291 个 D/E-D/E 交联。（2） 研究结果显示，BAP 与赖氨酸靶向交联剂具有明显的结构互补性，这提高了CXMS 进行蛋白质结构解析的能力。本工作是羧基选择性交联剂首次实现全细胞裂解物的全蛋白质组交联分析。总的来说，这项工作不仅扩展了一个针对酸性残基的十分具有前途的 CXMS 工具包，同时还为提高羧基选择性交联剂的性能提供了有价值的指导。图1 三种交联剂BHP、BAP和BOP的化学性质。(A) 三功能交联剂的化学结构：两个反应性基团用红色表示，一个可修饰的手柄用橙色表示。三种交联剂的Cα原子之间的最大距离约束利用软件Chem3D 19.0计算得出。(B) 利用软件pLink 2.0分析三种交联剂与蛋白质进行交联质谱实验的MS/MS谱。(C) 三种交联剂的反应效率直方图。(D) 酰胺化反应的机理。图2 三种交联剂BHP、BAP和BOP在BSA蛋白质、六蛋白混合物和E. coli 70S ribosome结构分析中的性能。(A) 三种交联剂与BSA的反应中鉴定出的交联的维恩图。(B) 交联的Cα−Cα 距离分布的直方图，通过映射到BSA的晶体结构来验证。(C) BSA中交联残基分布的二维 (2D) 热图。颜色插入表示交联的距离分布。(D) 六蛋白混合物的环形二维交联图。黑线表示蛋白质内的交联，红线表示蛋白质间的交联。(E) 将交联映射到TXN2 (UniProtID：Q99757，PDB：1W4V)、CA2 (UniProtID：P00921，PDB：6SKS)和E. coli 70S ribosome (PDB：5KCS)的X射线晶体结构上，由BAP（红线）和BSP（黄线）鉴定。图3 基于BAP的交联平台，用于大肠杆菌裂解液的全蛋白质组分析，包括蛋白质复合物交联、点击化学、链霉亲和素富集、分馏和LC-MS/MS分析。图4 通过BAP对大肠杆菌裂解液的全蛋白质组分析。(A)富集前后鉴定的谱图数目的比较。黑色和红色分别对应于常规肽和交联肽的谱图。(B)将由BAP（红线）和BSP（黄线）鉴定的交联映射到蛋白质的X射线晶体结构上。(C)将交联映射到由BAP专门鉴定的蛋白质的X射线晶体结构上。 (D)使用Xplor-NIH软件包对hns (UniProtID：P0ACFID) 和grcA (UniProt ID：P68066) 的AF2预测结构进行细化。用BAP和BSP鉴定出的交联分别用红色和黄色标记。在本工作中，作者开发并表征了三种新的可富集的羧基选择性交联剂，它们具有不同的反应基团酰肼、氨基和氨基氧基。其中，氨基功能化交联剂 BAP 对于所有不同复杂度的蛋白质样品均表现出最佳的交联反应活性和鉴定覆盖率。此外，BAP扩展到大肠杆菌裂解液的交联分析与高效的交联富集相结合。本工作首次使用羧基选择性交联剂，以实现全细胞裂解液的全蛋白质组范围内的交联分析。因此，以上所有结果表明，本工作开发的 BAP 是一个很有前途的工具包，可以提高蛋白质结构分析的交联覆盖率。此外，本项工作还可以为提高羧基选择性交联剂的性能提供有价值的指导。参考文献：Gao H, Zhao Q, Gong Z, et al. Alkynyl-Enrichable Carboxyl-Selective Crosslinkers to Increase the Crosslinking Coverage for Deciphering Protein Structures [published online ahead of print, 2022 Aug 29]. Anal Chem.2022 10.1021/acs.analchem.2c02205. doi:10.1021/acs.analchem.2c02205

大家好，本周为大家分享一篇发表在Angew. Chem. Int. Ed.上的文章，A Membrane-Permeable and Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) - Enrichable Cross-Linking Reagent to Advance In Vivo Cross-Linking Mass Spectrometry，该文章的通讯作者是德国莱布尼茨分子药理学研究所的Fan Liu教授。交联质谱 (XL-MS) 已被用于在全蛋白质组范围内表征蛋白质的结构和蛋白间相互作用。目前，由于能够穿透完整细胞的交联试剂和富集交联肽的策略的缺乏，体内交联质谱研究的深度远远落后于细胞裂解液的现有应用。为了解决以上限制，本文开发了一种含膦酸盐的交联剂-tBu PhoX，它能够有效地渗透各种生物膜，并且可以通过常规的固定化金属离子亲和色谱 (IMAC) 进行稳定富集。 文章建立了一个基于 tBu-PhoX 的体内 XL-MS 分析流程，在完整的人类细胞中实现了较高的交联识别数目，并大大缩短了分析时间。总的来说，本文开发的交联剂和 XL-MS 分析流程为生命系统的全面交联质谱表征铺平了道路。细胞蛋白质组通过广泛的非共价相互作用网络进行组织，表征蛋白质-蛋白质相互作用 (PPIs) 对于了解细胞的调节机制至关重要。交联质谱 (XL-MS) 是系统研究细胞 PPIs 的一种强有力的方法，在 XL-MS 中，天然蛋白质接触通过交联剂共价捕获，交联剂是一种由间隔臂和两个对特定氨基酸侧链具有反应性的官能团组成的有机小分子，交联样品经过蛋白酶水解后，可以通过基于质谱的肽测序来定位氨基酸之间的交联。由于交联剂具有确定的最大长度，检测到的交联揭示了蛋白质内部或蛋白质之间的氨基酸的最大距离。以上这些信息提供了对蛋白质构象、结构和相互作用网络的见解。虽然最初仅限于纯化的蛋白质组装，但如今 XL-MS 已经可以应用于复杂的生物系统——这是通过开发先进的交联搜索引擎、样品制备策略和交联剂设计而实现的。特别是，已进行的几项全蛋白质组范围的 XL-MS 研究表明，可以通过使用可富集的交联剂来改进交联产物的鉴定，例如，通过添加生物素或叠氮化物/炔烃标记，使得消化混合物中的交联肽段能够基于亲和纯化或点击化学富集。最近，一种基于膦酸的交联剂 PhoX 被引入作为现有生物素或叠氮化物/炔烃标记试剂的高效和特异性替代品。PhoX 可通过固定化金属离子亲和色谱 (IMAC) 实现交联富集，这是一种非常快速和稳健的富集策略。 然而，尽管 PhoX 已被证明可用于从细胞裂解液中进行交联鉴定，但它无法渗透细胞膜，因此不适合体内的 XL-MS检测。基于以上讨论，本文开发了交联剂 tBu-PhoX ，其中，膦酸羟基被叔丁基保护以掩盖负电荷（图 1）。为了检测 tBu-PhoX 的膜通透性，文章交联了各种膜封闭的生物系统，包括人 HEK293T 细胞、从小鼠心脏分离的线粒体和革兰氏阳性枯草芽孢杆菌，并在 SDS-PAGE 上监测了蛋白质条带的变化（图 2）。在SDS-PAGE中，观察到在交联剂浓度为0.5和1.0mM时，蛋白质向更高分子量的浓度依赖性迁移，这表明了有效的膜渗透和交联。相比之下，将 PhoX 应用于完整的 HEK293T 细胞将产生与非交联对照相同的条带模式。图1 tBu-PhoX交联剂图2 PhoX或tBu-PhoX交联HEK293T细胞的SDS-PAGE在证明了 tBu-PhoX 可渗透各种生物膜系统后，文章接下来开发了一种基于 tBu-PhoX 的体内 XL-MS 工作流程，相比于之前的全蛋白质组 XL-MS 策略，该工作流程提高了样品处理和交联富集的速度和效率（图 3）。首先，按照标准蛋白质消化方案将交联蛋白质消化成肽；其次，使用 IMAC 珠对消化混合物进行预清除步骤以去除内源性修饰（特别是磷酸化）；第三，预清除的消化混合物（从 IMAC 流出）在稀释三氟乙酸 (TFA) 溶液中孵育以去除叔丁基并暴露膦酸基团以进行二次 IMAC 富集。第四，使用标准 IMAC 程序丰富交联产物，最后通过 LC-MS 分析以进行交联产物鉴定。图3 与tBu-PhoX进行体内交联和后续样品处理的工作流程接下来，文章优化了体内 XL-MS 工作流程的几个分析参数，以最大限度地提高交联检测的效率。首先，通过使用 IMAC 珠预清除评估了去除磷酸肽的效率；之后，使用 tBu-PhoX 交联完整的 HEK293T 细胞，经酶切成肽后，并应用预清除 IMAC 步骤去除内源性磷酸肽。在去保护步骤之后，利用 IMAC 富集交联，并通过单次 120 min LC-MS 运行测量富集的样品。通过测量 IMAC 洗脱液中磷酸肽和交联产物的数量，发现第二个 IMAC 中只有数百条磷酸肽，而预清除 IMAC 中有 4,128 条磷酸肽，这突出了通过预清除 IMAC 步骤去除磷酸肽的效率。此外，与单阶段 IMAC 结果相比，使用预清除 IMAC 的工作流程鉴定了 22% 以上的交联（1165 对 952 交联），证明了该两阶段工作流程去除干扰修饰肽的好处（图 4A）。其次，文章在肽水平上研究了膦酸盐去保护的功效。使用 tBu-PhoX 制备了体内交联的 HEK293T 样品，并分析了在不同的酸度（TFA 浓度）和孵育时间下，去保护后交联的数量如何变化。结果显示，不同浓度的 TFA 下获得了相似数量的交联。为简化处理（即在接下来的IMAC富集步骤中保持相对较低的样品体积），选择 0.5% TFA 的去保护条件，持续两个小时（图 4B，C）。第三，文章测试了 Orbitrap Tribrid 质谱仪的不同采集参数如何影响交联识别，即在高场非对称波形离子迁移率质谱法 (FAIMS) 中应用的电荷态选择和补偿电压 (CVs)。当考虑电荷状态 +3 和更高时，确定了最多数量的 tBu-PhoX 交联肽（图 4D）。图4 样品处理和LC-MS参数的优化文章将优化参数后的体内 XL-MS 工作流程应用于完整的 HEK293T 细胞。使用 180 min的 LC 梯度和优化后的分析参数，文章从体内 tBu-PhoX 交联的 HEK293T 细胞中获得了 9,547 个交联（图 5A）。基因本体分析表明，交联蛋白参与了广泛的分子功能、生物过程和细胞成分，表明 tBu-PhoX 可以揭示所有细胞区域的 PPIs（图 5A）。另外，文章还考察了完整细胞的体内 XL-MS 是否捕获了与细胞裂解液的 XL-MS 不同的 PPIs。为了验证这一点，从 HEK293T 细胞中制备 tBu-PhoX 交联裂解液，并使用与体内 XL-MS 实验相同的工作流程处理样品。 结果显示，从五个 SEC 部分中确定了 9,393 个交联。这表明 tBu-PhoX 允许以类似的效率进行裂解和体内 XL-MS。比较本文的体内和裂解数据表明，在体内 XL-MS 实验中，蛋白质间交联的数量更高，从而产生了更加相互关联的 PPI 网络（图 5B，C）。这种效应可以通过细胞环境的拥挤来解释，其中蛋白质紧密堆积并参与多种相互作用，这些相互作用被细胞裂解和稀释部分破坏。文章在 8 种选定蛋白质复合物的已知 3D 结构上可视化了 145 个体内检测到的交联（图 5C），另外，还观察到 96.6% 的交联在 35 Å 的最大距离限制内（图 5D），表明此 XL-MS 工作流程对内源性蛋白质复合物的体内结构分析的适用性。最后，文章比较了 tBu-PhoX 与 PhoX 在表征细胞裂解液的 PPI 网络方面的性能。使用与上述 tBu-PhoX 裂解液交联实验相同的交联条件从 HEK293T 细胞制备 PhoX 交联裂解液。为了去除内源性磷酸肽，在单阶段 IMAC 富集之前，用碱性磷酸酶处理消化的肽两小时。使用与 tBu-PhoX 相同的 LC-MS 方法进行 LC-MS 分析。该实验产生了 2,117 个交联，与使用 tBu-PhoX 识别的交联数量（1,942 个交联）相比略高。然而，基于 PhoX 的 XL-MS 流程需要更长的样品制备时间，因为需要进行碱性磷酸酶再处理和之后的额外脱盐步骤。行体内交联综上所述，本文开发并应用了一种新型的、可富集的、用于体内 XL-MS 的膜渗透交联剂 tBu-PhoX。在广泛使用的交联条件下（交联剂浓度为 1-5 mM），tBu-PhoX能够有效地穿透各种生物膜，为完整的细胞器和活细胞提供交联的机会。tBu-PhoX上的叔丁基基团使得高效的两阶段IMAC样品制备方案成为可能；首先，使交联剂对 IMAC 呈惰性，以促进基于 IMAC 快速而彻底地提取不需要的磷酸化肽，然后，通过去除叔丁基暴露膦酸基团，从而有效地二次 IMAC 富集交联剂修饰的肽。通过随后的 SEC 分馏，可以进一步富集交联肽段以进行 LC-MS 分析。XL-MS 在表征生命系统中的蛋白质结构和相互作用方面发挥着越来越重要的作用。为了促进这一发展，迫切需要有效的体内 XL-MS 方法。文章报告的体内 XL-MS 工作流程满足了这一需求，提供了与之前基于裂解液的 XL-MS 研究类似的交联识别能力，但需要的测量时间不到之前报告的十分之一。这一结果突出表明，本文开发并应用的 tBu-PhoX 交联剂和集成样品制备流程为推进体内相互作用组学和结构生物学提供了一种非常有前景的化学方法。

脆性材料作为结构或功能部件被广泛应用于航空航天、电子器件和组织工程等领域。由于人工脆性材料对微裂纹和不易察觉的缺陷很敏感，在长时间的循环载荷作用下，材料很容易累积损伤产生疲劳裂纹，进而存在失效的风险。随着可折叠穿戴设备的发展，对具有高疲劳抗性的可变形功能材料的需求日益凸显。通过模仿典型的生物矿物材料如珍珠母、骨骼等的结构设计可以提升脆性材料疲劳抗性，但这常依赖于疲劳裂纹扩展过程中增韧行为，然而一旦裂纹开始扩展，就会对器件的性能产生不可逆的影响，因此寻找并开发新的耐疲劳结构模型对未来可变形功能材料的设计制备具有重要的科学意义和应用价值。中国科学技术大学俞书宏院士团队和吴恒安教授团队成功揭示了双壳纲褶纹冠蚌铰链内的可变形生物矿物硬组织的耐疲劳机制，提出了一种多尺度结构设计与成分固有特性相结合的耐疲劳设计新策略，为未来耐疲劳结构材料的合理创制发展提供了新的见解。研究成果以“Deformable hard tissue with high fatigue resistance in the hinge of bivalve Cristaria plicata”为题，于6月23日发表在国际顶尖学术期刊《Science》上。审稿人评价称：“这份手稿展示了一个非常有趣的工作”、“这是一份令人兴奋的稿件。它集成了诸多表征技术来理解双壳纲铰链组织的显著疲劳抗性”、“这无疑激发了对生物复合材料的进一步研究，以设计抗疲劳性能增强的新材料”。同期《Science》观点栏目（Perspectives）以“A bendable biological ceramic”为题发表了评述（Science 2023, 380, 1216-1218），评述称“通过整合不同尺度的原理——从铰链的整体结构到单个晶体的原子结构——孟等人揭示了大自然如何主要从脆性成分中创造出抗疲劳、可弯曲、有弹性的结构。这些跨尺度原理要求在最精细的尺度上精确，而软体动物如此精确地沉积壳的细胞和分子机制是一个正在探索的领域”；“匹配生物精细控制对于对生物启发材料感兴趣的人类工程师来说是一个特别的挑战，正如开发模仿珍珠质强度和韧性的复合材料所面临的困难所证明的那样”；“尽管孟等人研究的力学性能与这种特殊生物体的需求相匹配，这些原理如何在更广泛的系统范围内得到完善，这是令人兴奋的前景。”论文共同第一作者为中国科学技术大学合肥微尺度物质科学国家研究中心博士研究生孟祥森，近代力学系周立川博士（现就职于合肥工业大学）、化学系刘蕾博士。我校俞书宏院士、吴恒安教授和茅瓅波副研究员为论文通讯作者。双壳纲动物褶纹冠蚌（Cristaria plicata）又称鸡冠蚌，是一种常见的淡水蚌类。为了满足生存需求（滤食、运动等），其外壳在一生中需要进行数十万次的开合运动，而连接两片外壳的铰链部位也会经历反复的受压和变形，表现出优异的耐疲劳性能。本工作中，研究人员揭示了铰链部位中的折扇形矿物硬组织所蕴含的跨尺度耐疲劳设计原理。从计算机断层扫描图（CT）和剖面光学照片可以看出，铰链可以分为两个不同的区域：外韧带(OL)和折扇形矿物硬组织(FFR)（图1，A和B）。研究人员首先观察了这两个区域在双壳开合过程中的运动行为（图1，D和E），并结合有限元分析(FEA)，明晰了不同区域所承担的力学角色。在闭合过程中，OL发生拉伸，承担主要的周向应力并储存大部分弹性应变能；FFR区域在周向弯曲变形，并在受限的径向变形下提供强有力的径向支撑用以固定OL（图1，F到H）。图1（A）褶纹冠蚌和截面照片；（B）铰链切片照片和CT重构图；（C）在正常开合和过载状态下的疲劳测试结果；（D）开合前后铰链各区域形状变化及其轮廓图；（E）有限元模型对应的开合前后的铰链各区域形状变化及其轮廓图；（F）铰链有限元分析模型示意图；（G）开合状态下铰链各区域周向应力分布；（H）开合状态下铰链各区域径向应力分布。研究人员对FFR在不同尺度上的观察发现，其具有跨尺度多级结构特征。在宏观尺度上，FFR的扇形外形能使其在OL和外壳之间实现有效的载荷传递。进一步的深入观察发现，FFR由弹性有机基质和嵌入其中的脆性文石纳米线组成。文石纳米线直径约为100-200纳米，线的长轴方向在形貌上和扇形的径向方向一致，在晶体学上纳米线沿002晶向取向（图2，A到H）。考虑到文石晶体在002晶向的压缩模量远大于其他晶向，这种微观形貌和晶体学取向上的一致性意味着FFR能有效地为OL的拉伸提供支撑（图2，I和J）。这一结果也通过压缩力学和FEA模拟进行了进一步的验证。此外，FEA模拟结果显示，这种微米尺度上的软硬复合微观结构在压缩、拉伸、剪切三种受力状态下能够进行协调变形，在这个过程中有机基质承担了大部分的压缩和剪切应变，极大地减少了材料内部的应力集中，从而避免了文石纳米线侧向断裂，降低了FFR发生疲劳损伤的可能性。图2（A）FFR在纵向上的自然断面扫描图；（B）FFR在横向上的自然断面扫描图；（C和D）FFR脱钙处理之后的扫描图；（E和F）文石纳米线中的孪晶结构透射电子显微图片；（G和H）文石纳米线沿长度方向上的晶体学特征；（I和J）整个FFR中纳米线在形貌上和晶体学上的取向分析示意图。从FFR的横截面观察，文石纳米线呈近似六边形，研究人员通过高分辨透射电子显微镜也在纳米线中发现了纳米孪晶结构，考虑到文石纳米线沿002方向生长，这一结构可能与文石晶体Pmcn空间群易形成（110）孪晶界密切相关。这种沿纳米线纵向方向的孪晶结构的存在，在纳米尺度上大大强化了纳米线抗弯曲断裂的能力（图2，E和F）。与典型的天然硬质生物矿物材料（如骨骼、牙釉质）以及人工材料（如金属、水凝胶）等相比，FFR所展现的特殊之处在于它能在承担较大周向变形的同时，保持长时间的结构功能的稳定。这项研究从宏观到微纳米尺度上揭示了FFR的跨尺度多级结构设计原则（图3）。图3 典型生物和人工结构材料的耐疲劳设计机制。FFR中所具备的跨尺度结构特征使其在可变形能力上明显优于典型的生物矿物如牙釉质和骨骼，与常见的人工弹性体材料相比，FFR也一定程度保持了其高硬度和刚度。这项研究揭示了含脆性基元的生物矿物材料在较大形变下的耐疲劳设计新机制，填补了国际上含脆性组元的仿生耐疲劳材料设计的空白，所提出的整合跨尺度结构特征与功能特性的设计策略，能够在不同尺度上充分发挥每种成分的固有特性，从而实现材料整体性能的优化。这种兼顾变形性和耐疲劳性的跨尺度设计原则有望为未来功能材料的仿生设计和创制提供崭新思路。该研究得到了国家重点研发计划、新基石科学基金会、国家自然科学基金重点项目和中国科学院青促会等项目的资助支持。