质谱检测磷酸化修饰结果分析

磷酸化蛋白质及多肽相关研究的技术进展 摘要磷酸化修饰是一种重要的蛋白质化学修饰,对蛋白质功能的完成或改变起到重要作用。该领域的研究存在很多技术难点,对该领域研究形成了挑战。近年来相关技术有了很多突破,磷酸化研究也取得了很多新的成就。文章将从磷酸化蛋白的检出、磷酸化蛋白质和肽段的富集、生物质谱技术的改进以及磷酸化蛋白和多肽的定量与比较几个方面介绍该研究领域的技术进展。关键词磷酸化蛋白磷酸化肽生物质谱定量分析生命活动与蛋白质的动态变化密切 摘要 磷酸化修饰是一种重要的蛋白质化学修饰, 对蛋白质功能的完成或改变起到重要作用。该领域的研究存在很多技术难点, 对该领域研究形成了挑战。近年来相关技术有了很多突破, 磷酸化研究也取得了很多新的成就。文章将从磷酸化蛋白的检出、磷酸化蛋白质和肽段的富集、生物质谱技术的改进以及磷酸化蛋白和多肽的定量与比较几个方面介绍该研究领域的技术进展。 关键词 磷酸化蛋白 磷酸化肽 生物质谱 定量分析

生命活动与蛋白质的动态变化密切相关, 很多情况下某些蛋白质是通过各种翻译后修饰来完成或改变其功能。在数量众多的蛋白质翻译后修饰中，蛋白质磷酸化修饰无疑是最重要的一类，它是指通过蛋白激酶（Protein kinase，PK）介导的酶促反应把磷酸基团从一个化合物转移到另一个化合物上的过程（Figure 1所示），是生物体内存在的一种普遍的调节方式。现今发现的所有人类蛋白质中超过30%可被磷酸化修饰，这一修饰在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位，与生命活动的许多过程都密切相关，对此的研究已经成为蛋白质科学的热点之一。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2012/09/1346918444_small.jpg磷酸化多肽（主要指肽链中的酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基的侧链羟基被磷酸化生成酸式磷酸酯的修饰多肽）是研究蛋白质磷酸化过程的必不可少的工具，它可作为磷酸酶模型底物，或作为可产生抗磷酸化蛋白抗体的抗原，也可以在确定磷酸化蛋白的物理参数时作为参考化合物等。因此磷酸化多肽的合成在过去的几年中吸引了相当大的兴趣，目前已确定了较为成熟的合成路线，使磷酸化多肽的合成趋于常规。目前磷酸化多肽的合成主要有两个策略：后磷酸化法（Global phosphorylation）和单体法（Building block approach），如Figure 2所示。前者是在多肽序列合成结束后再在固相载体上对丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸的侧链羟基进行磷酸化，可以在同一次合成中同时得到带有和不带有磷酸化位点的多肽；而后者则将适当保护的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中，操作较前者更为简单，现已成为磷酸化多肽合成的首选策略。在采用单体法构建磷酸化多肽时，目前广泛采用的原料为侧链单苄基保护的氨基酸：Fmoc-AA(PO(OBzl)OH)-OH (AA = Ser, Thr or Tyr)。这类保护的磷酸化位点由于侧链磷酸化基团的离子化而产生较大的位阻效应，并且磷酸化位点的引入往往能促进肽链二级结构的形成，故而磷酸化位点及其后的氨基酸的引入会比较困难。这些问题在合成含有多个磷酸化位点的多肽时将会变得尤为严重，往往会使最终产物的组成非常复杂，难以进行纯化，甚至直接导致合成的失败。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2012/09/1346918477_small.jpg一般来讲，增加投料量和延长反应时间都能促使连接反应趋于完全，但增加投料量无疑会提高合成成本，对于较昂贵的带有保护的磷酸化氨基酸更是这样，而延长反应时间则可能增加其它副反应发生的风险，故而在合成磷酸化多肽时，需要对氨基酸投料量、反应方法以及反应时长等进行优化调整以期达到更理想、更经济的合成效果。我们有针对性地对磷酸化多肽合成条件进行了探索和调整，采用最终的优化条件成功合成了含有多达六个磷酸化丝氨酸残基的多肽：FAM-Ahx-X(pS)XX(pS)X(pS)X(pS)XX(pS)X(pS)-NH2（客户肽，详细序列未给出；其氨基端标记FAM以进行荧光检测），经过RP-HPLC纯化后最终纯品的纯度高达95%（见Figure 3）。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2012/09/1346918493_small.jpg参考文献：1. P. Cohen, “The Role of Protein Phosphorylation in Neural and Hormonal Control of Cellular Activity”, Nature, 1982, 296 (5858): 613-620.2. From: http://en.wikipedia.org/wiki/Protein_kinase.3. L. A. Pinna, A. Donella-Deana, “Phosphorylated Synthetic Peptides as Tools for Studying Protein Phosphatases”, Biochim. Biophys. Acta., 1994, 1222 (3): 415-431.4. W. C. Chan, P. D. White, “Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis-A Practical Approach” (2000), Oxford University Press.

[font=宋体]磷酸化抗体是一种特殊的抗体，能够识别并结合到已经被磷酸化的蛋白质。磷酸化是一种重要的蛋白质修饰方式，通过将磷酸基团结合到特定的氨基酸残基上，可以改变蛋白质的结构和功能。在许多生物学过程中，磷酸化都扮演着重要的角色，因此磷酸化抗体成为了研究生物学和生物化学的重要工具。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]蛋白质磷酸化是指蛋白在激酶作用下在特定氨基酸位点（最常见的是丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基）发生磷酸化的过程。蛋白磷酸化是极其重要的翻译后修饰，其动态调控是信号转导中不可或缺的一环，调控着细胞生长、分化、代谢、凋亡等等过程。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]磷酸化抗体主要是针对磷酸化位点制备的，可以特异性识别磷酸化氨基酸位点，对磷酸化蛋白进行定性、定量分析，检测蛋白受刺激后磷酸化水平变化情况。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州可以为客户提供一系列具有高特异性（经内源性、磷酸化特异性等多方面验证）、高灵敏度（[/font][font=Calibri]1:200000[/font][font=宋体]稀释度）特点的磷酸化抗体，满足[/font][font=Calibri]WB[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]IHC[/font][font=宋体]等应用。同时我们还可以为客户提供定制化的磷酸化抗体定制服务。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]义翘神州磷酸化抗体服务优势：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①专业高效的多肽设计软件及高效偶联方法，保证多肽免疫成功率[/font][font=Calibri]95%[/font][font=宋体]以上。[/font][/font][font=宋体]②多种纯化策略，正负筛选平台，确保得到高特异识别指定磷酸化位点的抗体。[/font][font=宋体]③竞争性的价格[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供多种生物的制备服务，包括磷酸化兔多克隆抗体制备服务、磷酸化鼠单克隆抗体制备服务、磷酸化兔单克隆抗体制备服务[/font][font=宋体]……详情可以关注[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/phospho-specific-antibody-service[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]总之，义翘神州[url=https://cn.sinobiological.com/services/phospho-specific-antibody-service][b]磷酸化抗体定制服务[/b][/url]能够满足您的个性化需求，帮助您在研究领域获得更多的突破。我们致力于为您提供高质量、高效率的抗体定制服务，助力您的科研事业更上一层楼。[/font]

合肥国肽生物科技有限公司（简称：国肽生物TM）成立于2014年，是一家专业从事多肽产品的研发、生产和销售以及多肽技术转让的高新技术企业。BP公司成立之初，便成功收购了国内几家多肽、抗体公司，是目前国内的专业多肽合成、抗体制备、蛋白表达的规模型生产企业。国肽生物专长于荧光标记肽、同位素标记肽、人工胰岛素、药物肽、化妆品肽、长肽困难肽等产品的合成与研发，致力于学术水平的科研提升，搭建学术交流平台，促进前沿、专业的学术知识推广，推动多肽在生物医学材料等领域的研究与应用。公司产品广泛应用于药物研发，抗体的制备（包括单抗与双抗），荧光分子探针的构建以及细胞透膜研究、活体成像、新型材料研发和质谱分析等研究领域国肽生物按照客户定制要求供应高品质普通多肽。我们拥有成熟的多肽合成纯化方法，利用SPPS方法和液相合成方法为客户提供高品质多肽。我们的服务特点是:1. 纯度：我们提供粗品肽和纯度纯度为70%，75%，80%,85%,90%,95%,98%,99%的纯品多肽。2.脱盐和转盐：根据客户要求，我们可以对多肽进行脱TFA盐处理，也可以转为醋酸盐。3.交货期限：30个氨基酸之内，一般2-3周，最快1-2周。4.质量控制：每条多肽都免费提供合格的HPLC，MS和COA文件。5.售后服务：1-2周内可以提出异议，我们免费复测，不合格免费退货，1-3个月内使用不合格可以免费提供复测，样品免费保存3个月。国肽生物根据客户要求，供应各种修饰型多肽。1.磷酸化的Ser、Tyr和Thr修饰的多肽：我们提供单磷酸化和多磷酸化多肽服务，目前我们已经能够提供四个磷酸化位点修饰的多肽。2.5(6)-FAM，FITC，CY5，RhodamineB，PNA，EDNAS/dabcyl等荧光标记修饰的多肽：荧光标记修饰多肽技术是我们国肽生物的代表性多肽合成技术，我们的这项技术已经相当成熟。3.生物素Biotin，Lys(Biotin)修饰的多肽：生物素是维生素B2的组成部分，Biotin，Lys(Biotin)修饰的多肽也是客户经常定制的多肽。我们提供生物素修饰的多肽已经有将近100%的成功率。4.含有一对或多对二硫键修饰的多肽：二硫键在蛋白质的结构稳定中起到重要作用，目前我们已经能够为客户提供四对二硫键修饰的多肽。5.含有同位素C13，N15修饰的多肽：同位素标记的多肽主要应用于医学和生物学领域，通常价格较高，为了满足客户需要，我们接受微克级的同位素多肽定制。6.含有特殊氨基酸修饰的多肽：例如，D型氨基酸，氨基酸衍生物，脂肪族羧酸等等，都在我们接受的定制范围内。国肽生物提供150个氨基酸以内的长肽合成服务。多肽合成过程中，肽链过长时，经常会出现缺残基，氨基酸缩合困难等情况，基于这些现象，我们开发了三种有效提高反应成功率的方案：1. 微波合成法：对于合成过程中出现的一些难以缩合的氨基酸，我们采用微波法进行合成，该方法效果显著，并且大大缩短了反应时间。2. 片段合成法：当某些多肽用常规合成方法合成困难，我们也会采用将多肽中某一段的某几个氨基酸缩合之后作为一个整体缩合到肽链上去，这种方法也能够解决许多合成中存在的问题。3.酰肼合成法：酰肼法合成多肽的方法是将固相合成的 N末端Cys 多肽和 C末端多肽酰肼之间的化学选择性反应形成酰胺键而实现多肽的连接，该方法根据肽链中Cys的位置，将整条肽链分成多条序列分别合成，最终经过液相缩合反应得到目标肽，显著地提高了最终产物纯度，广泛适用于含有Cys的长链多肽的合成。国肽生物拥有成熟的长肽合成工艺，能够根据客户定制的多肽序列，快速有效地设计合成方案并迅速开始合成，更快更好的为客户提供所需的服务是我们不变的坚持。详情请咨询合肥国肽生物www.bankpeptide.com

请问从sigma购买货号为C6780 的α-casein（α-酪蛋白）中，磷酸化的比例是多少？希望大家可以提供帮助，谢谢

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PS1利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间（MALDI-TOF）技术来表征生物分子。样品溶于固定的底物中形成晶体，用激光脉冲使其离子化，离子被加速后通过飞行管时分离，所有离子均可被检测。系统包括三个组成部件：样品点样制备工作站（SymBiot 1）、生物质谱工作站（Voyager-DE PRO）和自动化分析软件（AutoMS-Fit）。SymBiot1 是一个自动样品处理系统，支持亚微升级微量点样，具有快速省时、重现性好的特点；Voyager-DE PRO是为蛋白质组研究专门设计的自动飞行时间质谱分析系统，配有AB公司之专利—延迟检测技术，具有高分辨率、质荷比宽等特点；AutoMS软件可以批处理方式或实时动态方式检索Protein Prospector蛋白数据库或您指定的蛋白数据库，查询参数可以任意设定，检索结果以Microsoft Access格式分类编号及储存。 PS 1技术平台建立伊始便受到了许多蛋白质课题研究组的关注。中国科学院上海生物化学研究所戚正武院士课题组从猪肝中提取某一活性蛋白组分，该组分理化性质不清楚，天然含量十分低，并无相关文献报道。用HPLC分离以后对活性组分的成分不能确定。上海基康生物技术有限公司运用PS 1系统对HPLC分离后的活性组分作了质谱分析，仅在一个工作日内就精确确定该组分由分子量极为相近的几种蛋白质构成，分子量精确度达到10 ppm。后经HPLC再次细分（洗脱梯度增加了2.5倍），证实了质谱的结论。此活性组分曾滤过1kD分子筛，基康的质谱数据纠正了研究人员过去对该活性组分分子量的误判，为研究人员明确实验方向、优化实验步骤提供了强有力的依据。 PS1除了可以进行生物大分子的精确分子量测定，还可用于蛋白的肽指纹图谱分析(peptide mass fingerprint，PMF)，提供相关生物信息学服务，并且还可以利用源后衰变（Post Source Decay，PSD）技术来获得样品的MS/MS数据，以得到一级结构信息。PSD方法通常增加了激发激光的功率，使其超过产生一般肽指纹谱图所需功率的阈值，过剩的能量使前体离子在源内离子化之后发生裂解，产生一系列碎片离子，在反射器的作用下，最终可以得到一张连续的碎片离子图谱。经特定的软件分析后，即可在数据库中检索到肽段的氨基酸序列。利用PSD分析技术，还可以对磷酸化，糖基化等翻译后修饰进行定位分析，同样也可以鉴定产生翻译后修饰肽段的蛋白质。Neville et al.（1997）将这一方法成功的用于磷酸肽的序列分析。作为重要的蛋白质鉴定手段之一，PS1的精确度可以达到10 ppm，灵敏度为fmol，分子量检测范围可达到500 kDa，每天可自动分析40-100个样品，适用于大规模“蛋白质组学”研究。

供应各种修饰型多肽。1.磷酸化的Ser、Tyr和Thr修饰的多肽：我们提供单磷酸化和多磷酸化多肽服务，目前我们已经能够提供四个磷酸化位点修饰的多肽。2.5(6)-FAM，FITC，CY5，RhodamineB，PNA，EDNAS/dabcyl等荧光标记修饰的多肽：荧光标记修饰多肽技术是我们国肽生物的代表性多肽合成技术，我们的这项技术已经相当成熟。【详情请咨询国肽生物】3.生物素Biotin，Lys(Biotin)修饰的多肽：生物素是维生素B2的组成部分，Biotin，Lys(Biotin)修饰的多肽也是客户经常定制的多肽。我们提供生物素修饰的多肽已经有将近100%的成功率。4.含有一对或多对二硫键修饰的多肽：二硫键在蛋白质的结构稳定中起到重要作用，目前我们已经能够为客户提供四对二硫键修饰的多肽。5.含有同位素C13，N15修饰的多肽：同位素标记的多肽主要应用于医学和生物学领域，通常价格较高，为了满足客户需要，我们接受微克级的同位素多肽定制。6.含有特殊氨基酸修饰的多肽：例如，D型氨基酸，氨基酸衍生物，脂肪族羧酸等等，都在我们接受的定制范围内。

[color=#444444]样品是磷酸化多肽，我们的仪器是[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质联用[/color][/url]的ESI质谱，老师说拿测出来的质谱图和MALDI质谱测出来的图对照，如果找到相应的峰（去卷积后的数值和maldi的数值减去1相同），就说明测到了磷酸化多肽，我一直想不明白，有没有大神替我解释一下这是为什么？[/color]

质谱技术是抗体药物分析最重要的技术手段之一。本文简述了抗体药物的发展和质谱技术的原理。对于质谱技术在抗体药物的分析中应用进行了归类整理，主要分为在一级结构和高级结构分析中的应用。抗体类药物是指含有抗体片段的蛋白类药物，所以在恶性肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、感染和器官移植排斥等重大疾病上得到了快速的发展，是当前生物药物领域增长最快的一类药物.1.抗体药物发展新趋势在生物药物领域，抗体药物占据着越来越重要的地位，全球销售排名前10位的药物中有6个为抗体药物，抗体药物按来源分类可以分为：鼠源单克隆抗体、人鼠嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。目前，批准的单克隆抗体药物中，人源化单抗和全人源单抗数量已占据大多数。1.1 抗体药物偶联物（ADC）抗体药物偶联物（ADC）由单克隆抗体和小分子化合物两部分组成。通过抗体的靶向作用，ADC 的抗体部分和肿瘤细胞表面抗原特异性识别并结合，通过细胞内吞作用，将抗体和小分子化合物一起带进肿瘤细胞内部，释放出小分子化合物。这样既可以降低小分子药物的毒性，同时具有靶向结合的作用。已经上市的两个ADC 是Kadyla 和Adcetris。1.2 双特异性抗体（BsAb）双特异性抗体（BsAb）是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子（细胞）之间架起桥梁，由于基因工程的发展，目前双特异性抗体已经研发出多种类型，主要类型有三功能双特异性抗体、IgG-scFv、三价双特异性分子、串联单链抗体（串联scFv）、DVD-Ig 等多种形式。2.质谱技术近年来质谱仪性能的显著改进主要基于开发出的两种离子化技术：一种是介质辅助的激光解吸/离子化技术。另一种是电喷雾离子化技术。由于这两种电离技术的出现，使原本只能检测小分子的质谱技术，可以运用于检测生物大分子。在过去质谱技术主要运用于对一级结构和序列的表征，而现在质谱技术越来越多地运用于高级结构的分析，而高级结构对于抗体药物的生物活性至关重要。3.质谱技术在抗体药物一级结构分析中的应用3.1 完整抗体药物精确分子量测定当得到抗体药物时，可以直接通过高分辨率的MALDI-TOF或者ESI-MS进行分子量的检测。通过对于脱糖后分子量的检测，可以对于抗体药物进行初步定性分析，并将可以作为药物常规放行的分析方法。对于脱糖前的抗体药物进行分析，可以得到抗体药物的糖基化类型的信息及糖基化水平的分布，对于快速了解生产工艺与药物质量的关系具有十分重要的意义。3.2 药物抗体偶联比（DAR）对于赖氨酸链接的抗体偶联药物，采用C4色谱柱及联用的质谱对去糖基化样品进行分析，根据偶联不同数目药物分子的质量数增加判断偶联数目。对于质谱测定的结果，不仅可以给出确切的药物抗体偶联比值，更能够给出链接不同个小分子药物的分布情况，及反应过程副产物空链接头的分布情况。3.3 肽图谱分析蛋白被特异酶切后的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱。由于不同的抗体药物具有不同的氨基酸序列，蛋白质被酶水解后，产生的肽片段也各不相同，肽混合物的质量数具有唯一特征。可以通过LC-ESI-MS进行肽片段的一级质量数的鉴定，也可以通过LC-ESI-MS/MS对于每个肽片段进行进一步确证，提高肽图谱的准确性。3.4 翻译后修饰研究蛋白质的翻译后修饰（PTM）对于抗体药物的生物学功能十分重要。常见的翻译后修饰有：磷酸化、脱酰胺、甲硫氨酸氧化、糖基化修饰、N端焦谷氨酸环化，C端赖氨酸切除等。质谱分析仪检测蛋白和肽片段的分子量偏差，可以实现高灵敏、高通量和高精确地鉴别蛋白质的翻译后修饰的种类。3.5 N端氨基酸序列检测常规N端氨基酸检测用Edman降解法进行检测，但是抗体药物有时候会出现N 端环化的现象，在这种情况下用Edman降解法需要先对抗体进行去封闭处理，而直接使用质谱可以直接测出N端的氨基酸序列，同时可以检测出N端环化的相对比例。4.质谱技术在抗体药物高级结构分析中的应用4.1 氢/氘交换质谱（HDX-MS）常规的质谱只能获得蛋白的一级结构信息。氢/氘交换质谱（HDX-MS）可以进行蛋白质构象，溶液动力学和表位映射进行分析。在能够调查的蛋白质的高阶结构和动态结构技术中，HDX-MS已经证明适合单克隆抗体和单克隆抗体-抗原复合物的构象分析。4.2 离子淌度质谱法（IM-MS）离子淌度是根据蛋白的电荷和形状选择性分离的方法，可以区分相同分子量的蛋白和肽段，可用于检测蛋白的简单高级结构。4.3 高分辨率傅立叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS）高分辨率傅立叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS）能够检测最高质量数的质谱仪器，并且有着很高的分辨率。FTICR-MS 是目前被公认为是蛋白质组学研究的有力工具，特别是和完整的蛋白质鉴定和上/下调翻译后修饰（PTM）蛋白质的鉴定。

6 质谱仪的最新进展用质谱检测蛋白，首先考虑到用PMF与 MALDI-TOF联用，如果无法检测，下一步就用ESI-MS/MS创建序列标签。在PMF分析中，MALDI的平板中只需一小部分样本就足以检测，剩下的样本就可以用来创建序列标签。并且，在MALDI-TOF仪器上，用一种叫做“源后延迟”的方法可以对只有部分序列的肽段进行检测。然而，用这个方法产生的质谱图比较难说明，精确性也很差。最近，用MALDI联合四级杆-时间质谱分析器[30，31]以及原始的MALDI-TOF/TOF[32]方法产生了。因此同一份标本可以首先考虑用PMF检测蛋白[33]，如果有必要的话，再用MS/MS创建序列标签。MALDI联合四级杆-TOF检测高通量蛋白是有希望的[31]。7 蛋白质组研究中的转录后修饰分析蛋白组分析很重要的一点就是能对蛋白表达水平以及转录后修饰，如磷酸化和糖基化进行研究。蛋白质的磷酸化是很有趣的，因为在信号转导途径中它扮演了重要的角色。最早检测蛋白质表达水平的方法是进行2-DE之前用35S-Met对样本进行代谢性标记，再在2-DE上进行放射自显影[34-36]。在凝胶中，不同蛋白的磷酸化和糖基化位点通常在凝胶中显示一连串蛋白质点，但是还需要做更详细的分析来确定修饰类型。蛋白质磷酸化的改变既可以用32P标记细胞，也可以用特异性磷酸化抗体做western blotting进行研究。如果用32P标记的方法，仍然需要做2-DE。经过凝胶比较后，把感兴趣的点从胶上切下来，然后用质谱鉴定[36]。Soskic使用的是印迹法，两个2-DE同时进行，一个用于做特异的磷酸化抗体实验，另一个做常规染色。蛋白质磷酸化和糖基化更为详细的特性可以用质谱来检测，但是需要更多的起始材料而不仅仅是二维凝胶上的一个点。另外这些分析不能产生直接的序列信息，技术上也比用质谱检测蛋白要难的多。在蛋白上查找磷酸化位点有很多种方法。为了检测消化后的混和肽中哪一个是磷酸化的，可以用MALDI-MS在磷酸化前后对混合肽做PMF分析：经过磷酸酯酶处理后，磷酸化的肽将会失去一个磷酸基团，分子量将比处理前小80Da.糖基化研究中，多聚糖从蛋白中释放出来，对多聚糖结构的检测就是从这些游离的多聚糖中得到的。一般把MALDI仪和外源性糖苷酶[37-40]联合使用进行检测。如果需要更为详细的信息，可以用ESI-MS联合使用前体离子扫描仪[41-44]。到目前为止，能够用电泳分离后的蛋白进行糖蛋白结构检测的报道很少。其中有一项研究是N端糖蛋白酶切以后用一维SDS-PAGE分离，然后用MALDI-MS以及外源性的糖苷酶进行结构分析[45]。8 用质谱研究蛋白-蛋白之间的作用经典的蛋白组学着重于研究蛋白质在何时何处表达。因为大部分的细胞功能都是由蛋白质复合体而不是由单个蛋白来执行的，所以鉴定蛋白质的成分和相互作用是非常重要的。这个过程可以用生物化学方法纯化蛋白质后用质谱来鉴定不同的成分，如人类剪接体的成分，酵母的核孔复合体[46]以及核蛋白体等都可以用此策略检测出来。一般的蛋白复合体是用亲和层析的方法纯化和分离，如免疫沉淀反应[47，48]。 DNA结合蛋白可以用同它们有特异性亲和力的核酸来分离，然后用质谱来鉴定[49]。Rigaut等人在串联层析的基础上，建立了一种通用的蛋白质复合体纯化方法[50]。在这个方法中，一种TAP标签和靶蛋白融合在一起，然后把蛋白转移到宿主细胞或者组织中，融合蛋白在宿主细胞和组织中能持续表达。TAP标签包括一种A蛋白和一种钙调蛋白，在标签之间有一个TEV蛋白酶切位点。用串联亲和层析法能将融合蛋白及与它相互作用的蛋白成分从细胞提取物中有效的分离，纯化出来。Rappsiber等人分别用亲和层析，交叉耦合以及质谱等方法[51]对酵母的核孔复合物Nup85p的亲和性进行研究。经过层析以后，用一维SDS-PAGE方法就可以分离蛋白复合体中的各个成分，因此二维电泳的不足之处就可以避免。同样也有可能直接用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]方法分析大分子量蛋白质复合体[52]。蛋白组分析的优越之处主要是用于蛋白和蛋白之间的相互作用以及蛋白的转录后修饰的研究，同时也可以用于基因表达水平的研究。质谱对于蛋白组分析来说是一项非常重要的技术，近年来仪器以及数据库软件的发展使得质谱成为能力更强大的工具。参考文献[1] O’Farrell PH. 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一、 前言基因工程已令人难以置信的扩展了我们关于有机体DNA序列的认识。但是仍有许多新识别的基因的功能还不知道，也不知道基因产物是如何相互作用从而产生活的有机体的。功能基因组试图通过大规模实验方法来回答这些问题。但由于仅从DNA序列尚不能回答某基因的表达时间、表达量、蛋白质翻译后加工和修饰的情况、以及它们的亚细胞分布等等，因此在整体水平上研究蛋白质表达及其功能变得日益显得重要。这些在基因组中不能解决的问题可望在蛋白质组研究中找到答案。蛋白质组研究的数据与基因组数据的整合，将会在后基因组研究中发挥重要作用。目前蛋白质组研究采用的主要技术是双向凝胶电泳和质谱方法。双向凝胶电泳的基本原理是蛋白质首先根据其等电点，第一向在pH梯度胶内等电聚焦，然后转90度按他们的分子量大小进行第二向的SDS-PAGE分离。质谱在90年代得到了长足的发展，生物质谱当上了主角，蛋白质组学又为生物质谱提供了一个大舞台。他们中首选的是MALDI-TOF，其分析容量大，单电荷为主的测定分子量高达30万，干扰因素少，适合蛋白质组的大规模分析。其次ESI为主的LC-MS联机适于精细的研究。本文将简介几种常用的生物质谱技术，并着重介绍生物质谱技术在蛋白质组学各领域的应用。二、 生物质谱技术1．电喷雾质谱技术（ESI）电喷雾质谱技术( Electrospray Ionization Mass Spectrometry , ESI - MS) 是在毛细管的出口处施加一高电压,所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴,随着溶剂蒸发,液滴表面的电荷强度逐渐增大,最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子,致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子, 使质量电荷比(m/ z) 降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围,因而大大扩展了分子量的分析范围,离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。2．基质辅助激光解吸附质谱技术（MOLDI）基质辅助激光解析电离（MOLDI）是由德国科学家Karas和Hillenkamp发现的。将微量蛋白质与过量的小分子基体的混合液体点到样品靶上，经加热或风吹烘干形成共结晶，放入离子源内。当激光照射到靶点上时，基体吸收了激光的能力跃迁到激发态，导致蛋白质电离和汽化，电离的结果通常是基体的质子转移到蛋白质上。然后由高电压将电离的蛋白质从离子源转送到质量分析器内，再经离子检测器和数据处理得到质谱图。TOF质量分析器被认为是与MALDI的最佳搭配，因为二者都是脉冲工作方式，在质量分析过程中离子损失很少，可以获得很高的灵敏度。TOF质量分析器结果简单，容易换算，蛋白质离子在飞行管内的飞行速度仅与他的(m/z)-1/2成正比，因此容易通过计算蛋白质离子在飞行管内的飞行时间推算出蛋白质离子的m/z值。与传统质量分析器相比，更易得到高分辨率和高测量精度；速度快，离子飞行时间仅为几个μs和约100μs之间；质量范围宽，可以直接检测到几十万道尔顿的单电荷离子。飞行时间质量分析器被认为是21世纪最有应用前景的质量分析器。3．傅立叶变换－离子回旋共振质谱（FT-ICR MS）傅立叶变换-离子回旋共振质谱法(FT-ICR MS)是离子回旋共振波谱法与现代计算机技术相结合的产物。傅立叶变换-离子回旋共振质谱法是基于离子在均匀磁场中的回旋运动, 离子的回旋频率、半径、速度和能量是离子质量和离子电荷及磁场强度的函数, 当对离子施加与其回旋频率相同的射频场作用时, 离子将同相位加速到一较大的半径回旋, 从而产生可被接受的类似电流的信号。傅立叶变换-离子回旋共振质谱法所采用的射频范围覆盖了欲测定的质量范围,所有离子同时被激发, 所检测的信号经过傅立叶变换, 转换为质谱图。其主要优点有：容易获得高分辨；便于实现串极质谱分析；便于使用外电离源并与色谱仪器联用。此外，他还有灵敏度高，质量范围宽，速度快，性能可靠等优点。4．快原子轰击质谱技术（FABMS）快原子轰击质谱技术( Fast Atom Bomebardment Mass Spectrometry , FABMS) 是一种软电离技术,是用快速惰性原子射击存在于底物中的样品,使样品离子溅出进入分析器,这种软电离技术适于极性强、热不稳定的化合物的分析,特别适用于多肽和蛋白质等的分析研究。FABMS能提供有关离子的精确质量,从而可以确定样品的元素组成和分子式。而FABMS -MS 串联技术的应用可以提供样品较为详细的分子结构信息,从而使其在生物医学分析中迅速发展起来。三、蛋白质的分析鉴定随着质谱技术的发展，分子量的测定已从传统的有机小分子扩展到了生物大分子。MALDI-MS技术以其极高的灵敏度、精确度在蛋白质分析中得到了广泛的应用。该技术不仅可测定各种疏水性、亲水性和糖蛋白的分子量，还可直接测定蛋白质混合物的分子量。这可认为是蛋白质分析领域的一项重大突破。蛋白质组的研究是从整体水平上研究细胞或有机体内蛋白质的组成及其活动规律。质谱技术作为蛋白质组研究的三大支撑技术之一，除了用于多肽，蛋白质的分子量测定外，还广泛的应用于肽指纹图谱测定及氨基酸序列测定。肽指纹图谱(Peptide Mass Fingerprinting, PMF)测定是对蛋白酶解或降解后所得多肽混合物进行质谱分析的方法。质谱分析所得肽断与多肽蛋白数据库中蛋白质的理论肽断进行比较，判断出所测蛋白是已知还是未知。由于不同的蛋白质具有不同的氨基酸序列，不同蛋白质所得肽断具有指纹特征。采用肽指纹谱的方法已对酵母、大肠杆菌、人心肌等多种蛋白质组进行了研究。对肽序列的测定往往要应用串连质谱技术，采用不同的技术选择特定质核比的离子，并对其进行碰撞诱导解离，通过分析肽段的断裂情况推导出肽序列。四、后转录修饰的蛋白质的检测和识别在蛋白质组的研究中，蛋白质和多肽的序列分析已不局限于阐明蛋白质的一级结构，对翻译后的修饰的进一步分析也是蛋白质化学的一项重要任务。这种修饰对于蛋白质的功能非常重要，如：细胞识别中的蛋白质相互作用，信号传导和蛋白质定位。1． 蛋白质的糖基化糖蛋白在细胞内部，细胞膜和细胞外均有发现，实际上大部分蛋白质是糖蛋白。对糖蛋白的检测和分析发现，糖蛋白中糖组分的结构和功能具有多样性。糖蛋白中的糖通常是不同种类的，而且是由一些可控数量的单糖组成。糖基化的多样性与细胞周期，细胞分化和发展的状态有关。在蛋白组时代中，蛋白质的修饰会引起其理化性质的改变，因此是不容忽视的。从1D或2D凝胶得到的糖基化蛋白的识别，一般是进行MALDI-MS指纹分析， 或是对MALDI-PAD或ESI-MS/MS得到的碎片谱进行分析。对完整的糖蛋白的研究是非常困难的，所有已知的离子化技术都有其局限性。目前，人们主要研究糖肽，其好处之一就是质量减小了，这就会得到更好的分辨率，而且糖肽仍保留了糖基化位点。将分离的糖蛋白用不同的蛋白酶消化后就可进行糖肽的研究。一旦糖肽被识别出，就可以用串连质谱(ESI-MS/MS)来阐明肽序列。当蛋白的序列已知时，计算质量差就可推出其上附着的寡糖的质量。要将糖部分从糖蛋白中释放出来，可用化学切割或酶切割（流程图见图1）。目前，连有结构专一性糖苷酶的质谱在提供序列，分支和链接数据方面是最有力的技术。对于N糖基化常用的糖苷内切酶有PNGase-F, PNGase-A, EndoF和EndoH。化学切割也可以用来释放O-连接和N-连接的多糖，但经常出现的缺点是他会完全破坏所有的肽键，因而丢失了关于糖附着位点的信息。而且这些切割不能从糖肽中连续释放单糖。用肼的化学切割可以除去两种类型的糖基化。在60℃可专一性的释放O-连接的糖，而在95℃能释放N-连接的糖。释放O-原子更常用的方法是用碱进行β消除。通常，糖基中加入金属离子在MALDI和ESI中离子化。用MALDI-MS分析糖类的一个好的选择是将之与其他一些化合物混合，这样可以进一步提高灵敏度和分辨率。不同的质谱方法可以产生多糖的源后裂解(PSD)和碰撞诱导解离 (CID)谱，这可以给出有关糖的序列，分支及糖间的连接等信息。2． 蛋白质的磷酸化蛋白质中氨基酸的磷酸化在生命系统中起重要的作用。磷酸化经常作为分子开关控制不同过程蛋白质的活性，如新陈代谢，信号传导，细胞分裂等过程。因此，蛋白质中磷酰氨基酸的识别在蛋白质分析中是一项重要的工作。已知的磷酰氨基酸的类型有四种：1．O-磷酸盐，通过羟氨酸的磷酸化形成的，如丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸。2．N-磷酸盐，通过精氨酸，赖氨酸或组氨酸中的氨基的磷酸化形成的。3．乙酰磷酸盐，通过天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成的。4．S-磷酸酯，通过半胱氨酸的磷酸化形成的。

生物质谱技术在细胞生物学中的应用桑志红 王红霞 综述　概 论 蛋白分离与显色 蛋白质鉴定 数据库查寻 灵敏度 具体示例 展望未来（相关文献）摘 要 基因组计划的飞速发展使我们提早进入"后基因组时代"，而质谱技术的重要进展使得通过酶解、质量分析、序列分析及其数据库检索对蛋白质进行高通量快速鉴定的技术方法应运而生，并成为"后基因组时代"的关键核心技术。这种技术的应用范围已经从细胞,组织以及整个有机体中蛋白质的表达到蛋白质翻译后修饰等等方面。本文简要综述生物质谱技术在细胞生物学等学科中的应用。　 过去的十年经历并见证了生命科学革命性的变化. 大规模基因组测序技术的问世使人类基因组计划最终目标的实现比预期一再提前。与此同时，近几年间已有10余种模式生物的基因组序列测定告罄，3年内还将有40种左右生物的基因组全序列问世。因此大多数人同意我们现在已经提早进入"后基因组时代"（post-genome era）, 目前我们所面临的挑战是如何破解基因组计划已获得的大量序列信息并加以应用。这个问题的关键是基因的生物学功能不能只通过对核酸一级结构(序列)的检测来确定。研判一个未知基因的功能、与其他基因产物及其亚细胞结构之间的功能联系, 最终都必须通过在蛋白水平对基因产物的研究才能确定。蛋白质组这个名词是近几年才提出来的，它用来描述一个细胞的全部蛋白质,而在蛋白水平上进行大规模的研究引出了新的术语蛋白质组学。蛋白质表达图谱是依靠蛋白质显示技术和精确定量技术对细胞或组织中蛋白质表达总况进行比较（2）, 这个领域最近已有综述（11）。细胞图谱蛋白质组学是指应用生物质谱技术鉴定蛋白质及其相互作用并确定在亚细胞中的定位。本文的目的是 简要综述生物质谱技术在细胞生物学领域中越来越多的应用，并为该领域正考虑应用这种技术的研究者提供一些的有用的信息。 作为一个新的研究领域，蛋白质组学发展的关键是近年来质谱技术的革新。这种革新极大地促进了质谱技术在生命科学研究中的应用。质谱现在可以作为将各种蛋白质与序列数据库联系起来的桥梁。生物质谱根据质量数和所载电荷数不同的多肽片断在磁场中产生不同轨道而以质荷比（m/z）方式来分离它们。80年代末，随着两种崭新的尤其适合蛋白质研究的软电离方式ESI（电喷雾电离）和MALDI（基质辅助激光解吸附电离）的出现，质谱成为现代蛋白质科学中最重要和不可缺少的组成部分。 生物质谱最强大的应用功能之一是能够鉴定蛋白质复合物的组成成分（19）。细胞中一些最重要的生命过程都是通过多蛋白质复合体来执行和调节的，但由于蛋白质鉴定的困难，大多数上述蛋白复合体都是未知的。生物质谱灵敏度的不断提高显著地促进了对具有生物学功能和治疗潜力的蛋白复合体的鉴定，例如，NF-k B信号通路，CD95（FAS/APO-1）介导的细胞死亡途径，和核受体介导的转录信号传导过程中形成的蛋白复合体。在某些情况下，复合物可通过常规蛋白纯化的方法进行纯化，如剪接体复合（25），酵母纺锤体复合物（29）及VHL肿瘤抑制复合物（18）。然而，更常见的是，复合物中的组成成分通过一步免疫沉淀或免疫亲和步骤后就可纯化，这种方法甚至可以用于鉴定那些用常规蛋白纯化和鉴定技术所不及的一些过渡态或不稳定的复合物。因为生物质谱技术的介入，现在已经不再需要通过抗体进行免疫印迹实验，而是通过生物质谱技术对免疫沉淀获得的蛋白复合体组分直接进行蛋白序列分析。以酵母P24复合物鉴定为例，应用上游表位标签策略有可能不需制备抗目标蛋白的抗体就能对蛋白质复合物进行鉴定（13）。这种方法（36）对于基因组序列已完全清楚和遗传稳定的生物（如芽殖酵母,啤酒酵母）尤为简便, 例如对RENT复合物和促有丝分裂后期复合物（49）。因为这种方法的成功应用，使人们对上游表位标签策略－蛋白纯化－生物质谱分析的方法兴趣倍增。值得一提的是，将能被特殊蛋白酶切除的连接子（接头）掺入表位标签是尤为有利的（如下所述）。 上述方法是通过识别蛋白复合物中相互作用和配对的各组分而达到对蛋白鉴定的目的，另一种策略则是通过对分离纯化的细胞器蛋白组成进行鉴定而在亚细胞水平对蛋白质定位.　用这种方法确定蛋白质位置,　对评价蛋白质潜在的功能将是大有帮助的.　应用这种方法，我们称为细胞器蛋白质组学,　已经发现正常工作状态下的细胞器含有比我们以前所知道的数量多得多的蛋白种类。然而实际上，由于质谱极高的分辨率和灵敏度，纯化后的细胞器组分即使只有微量的混杂，也能被质谱分辨并误认为是细胞器的组成部分。因此，如何充分的纯化以保证至少绝大多数被鉴定的蛋白质都来自同一种细胞器，成为制约上述工作的瓶颈。 蛋白质翻译后修饰也是蛋白鉴定工作中的一个重要方面。根据DNA序列信息并不能可靠预测或推导出蛋白质翻译后的修饰。而质谱技术已经被证明对研究蛋白质翻译后的修饰（例如磷酸化和糖基化）是极为有用的，特别是对序列已知的蛋白的鉴定。例如:Betts等人（1a）用这种方法成功地鉴定了从小鼠大脑中分离的神经纤维蛋白体内磷酸化位点。同样方法, Wong等人（45）确定了钙联蛋白质（calnexin)C未端的磷酸化位点。在糖基化的例子中, Carr等人（5）采用液相色谱与质谱联用技术选择性地鉴定了糖蛋白中N- 和O-联接的寡糖. 稍后, 本文将会通过对E-选择素中糖基化位点的鉴定来进一步说明这种方法.

欢迎大家讨论一下自己做质谱的经验心得，在医疗领域和其他众多领域质谱无疑是以后发展的科研和临床应用的主流方向，其配套仪器业发展的很快，如气象色谱、液相色谱、毛细管电泳等等。因为应用领域广，讨论的范围肯定很大，大家可以各抒己见啊。我是做蛋白磷酸化修饰的，也是刚跟质谱打交道，所以很想听听各位高手的高见啊，欢迎，O(∩_∩)O谢谢。

http://img3.17img.cn/bbs/upfile/images/20100518/201005181701392921.gifAB SCIEX公司生物药研究的解决方案及其案例分析讲座时间：2014年11月13日 14:00 主讲人：郭立海、赵 健郭立海 博士 AB SCIEX公司应用专家 ；赵 健 博士 北京天广实生物技术股份有限公司http://img3.17img.cn/bbs/upfile/images/20100518/201005181701392921.gif【简介】TripleTOF 4600在生物制药领域中的应用完整蛋白分子量的测定肽指纹谱分析二级氨基酸全序列分析蛋白翻译后修饰和化学修饰分析 –翻译后修饰，如糖基化，磷酸化，去酰胺化(Deamidation) –化学修饰，如聚乙二醇(PEG)修饰，氧化(M)宿主细胞杂质蛋白及降解产物分析定量分析---蛋白药物PK 质谱在抗体类药物表征中的应用IntroductionCharacterization of therapeutic antibodies -Intact mass -Peptide mapping -Glycosylation analysis -Other PTM：Characterization of charge variants -Disulfide bonds and Cys-linked variantCharacterization of Antibody-Drug Conjugate(ADC) -Intact mass tested for DAR -Antibody Conjugation Site MappingOthersAcknowledgements-------------------------------------------------------------------------------1、报名条件：只要您是仪器网注册用户均可报名参加。2、报名并参会用户有机会获得100元手机充值卡一张哦~3、报名截止时间：2014年11月13日 13:304、报名参会：http://www.instrument.com.cn/webinar/meeting/meetingInsidePage/11825、报名及参会咨询：QQ群—231246773

有机磷农药是指含有磷原子的有机磷类化合物，在生物体内与胆碱酯酶形成磷酸化胆碱酯酶，使胆碱酯酶活性受到抑制而产生毒性作用的一类农药的总称。有机磷农药大多为磷酸酯类或硫代磷酸酯类，微溶于水，易溶于有机溶剂，对光、热、氧及酸稳定，在碱性溶液中分解、解毒。GC分析时，由于进样口等位置活性位点吸附，经常出现检测结果偏差，使得定量结果不能真实反映样品中有机磷农药残留量，给检测带来一定影响。那么在GC分析有机磷类农药残留时，应注意什么？该如何避免系统中各活性点对农药的吸附？

用于研究蛋白，核苷酸还是小分子，这里也许有理想的答案 正如其它先进的技术一样，质谱技术冲击带来了市场的膨胀，造成了多选择性的产品，专业性的术语，这也就无形中增加了研究人员选择合适于他们的系统的困难性。正如西雅图Fred Hutchinson癌症研究中心蛋白组主任Philip Gafken所说的那样，“无论大家相信与否，这种技术并没有如它们所被应用的那样被逐渐的了解，研究人员没有认识到利用这种技术的真正目的。”比如说三级四极质谱仪(Triple Quadrupole Mass Spectrom）是一种相对便宜一点，但扫描速率（scan rate）也相对比较慢的质谱仪，而目前精良的傅立叶变换离子回旋共振质谱仪（Fourier transform ion cyclotron resonance，FTICR）则在精确性和分辨率都是首屈一指的，当然价钱也会比较贵。Gafken说道，“人们总是倾向于购买一些顶级的产品，但是事实上，这些应用中很大一部分都能由一些相对便宜一点的仪器来完成”，所以我们需要购买适用于各自需要的正确仪器。1.Protein Chemist级分析对于protein chemist而言，需要得到的仅仅就是知道他在研究的是什么。通过分析一种蛋白的免疫共沉淀的成份，或者利用二维电泳识别特殊的蛋白斑点，protein chemist就可以了解这种蛋白质的生物学特性了。对于这种应用，快速而并不需要太精确的方法就可以满足需要了。[color=#DC143C]推荐系统：MALDI+TOF[/color]理由：肽指纹图谱（PePtide Mass Fingerprinting，PMF）和基质辅助激光解析电离飞行时间(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight，MALDI-TOF)质谱是可以考虑的首选方法。TOF是一种简单的质谱分析系统，灵敏度高，能进行从10原子质量单位到上百上千单位的片段分析。另一个TOF的优点就是分析的速度，伊利诺斯大学的化学副教授Neil Kelleher就表示“这就是它为什么能与MALDI配合工作的原因，你可以以一种高重复率在激光上操作，每秒获得许多光谱。” 而MALDI则是一种首先就可以考虑的方法，但是并不适合如何人，来自华盛顿大学的化学教授，Journal of the American Society for Mass Spectrometry杂志的编辑Michael Gross就说，“如果你的免疫共沉淀中有20或30个蛋白，每一个有50条特殊带，那么你就有1000条带，利用MALDI并不能在[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]中打到全部的”，为了得到更多的信息，必需要考虑一个可以提供序列详细信息的任意构造，比如MALDI-TOF-TOF，或者一个更加灵敏的仪器——离子捕获。 2. 灵敏级 难题总是出在事实本质的详细内容当中，对于蛋白而言，那就是指翻译后修饰了。比如说，假设你正在研究包含有乙酰化和三甲基化修饰的组蛋白，但是一个标准的质谱也许无法区别出这两种修饰，这时就需要高精度的仪器了，这种仪器能获得二位或者四位小数位的报告。 推荐系统：[size=4]LC+ESI+FTICR with ECD[/size]理由：准确度高的仪器可以区别对于所谓的正常（nominal-mass）仪器而言相同的分子，一般认为选择液相色谱（liquid chromatography，LC）与电喷雾电离化（electrospray ionization，ESI），以及傅立叶变换离子回旋共振质谱仪（Fourier transform ion cyclotron resonance，FTICR）相结合能达到高精度和高灵敏度的要求。也许还需要电子捕获解离技术（electron capture dissociation，ECD）来获得可重复的结果。虽然经典的碰撞诱导解离技术(collision induced dissociation，CID）介导的串联质谱方法可以进行斑点修饰（spot modifications），但是对于识别包含了修饰的蛋白残基而言，这并不是一种理想的方法，这主要是由于解离蛋白的时候常常会降解多肽的蛋白修饰，然而ECD则可以保持这种修饰的完整性。不过来自辛辛那提大学的Patrick Limbach提出一个忠告：这些仪器偏差范围小，因此可能会丢失掉一些未预期到的情况，比如天冬酰胺残基的脱酰胺，或者磷酸化。 3.边缘分析级 并不是每一人都对蛋白质感兴趣的，比如说，也许你想知道的是一种特殊的核酸是否包含了不同寻常的或是修饰了的残基（比如methyl-C），以及这些序列定位在那儿。回到这两个问题也许就需要利用到LC-ESI串联质谱（LC-ESI-tandem mass spec），对于前面那个问题需要在负电荷模式里——因为核苷酸是带负电荷的，而后者则需要正电荷模式。 推荐系统：[color=#00008B]LC+ESI+ION TRAP 或 QUAD+TOF [/color]推荐理由：Limbach博士在进行其核酸实验的时候使用的是LC-ESI线性离子阱（LC-ESI-linear ion trap），LC-ESI-QTOf（quadrupole time of flight hybrid，杂交四矩飞行时间) 质谱两种技术，他指出，“你有哪种特殊的串联质谱并不是关键问题，关键是你需要哪种串联MS功能”，比如要想完成能识别修饰，以及确定多聚核苷酸链中修饰定位在哪儿这两项任务。在这种串联质谱模式中，可以检测离子，降解（比如CID或ECD），然后获得序列以及结构的信息，但是串联质谱并不是都一样的。来自Scripps研究院的细胞生物学家John Yates表示，线性离子阱速度很快，“要比QTOf快许多，但是分辨率和质谱精度要低一些”。但这两种相对于FTICR仪器而言，都是比较便宜的选择。这些都是值得推荐的质谱方法，当然也要考虑相对慢和灵敏度低的缺点，因此需要一个超导磁（superconducting magnet）和有经验的操作人员。4.混合分析级 对小分子代谢物（比如糖类，脂质）进行详细的分析需要一套不同的仪器设备，也许你就在这个探索的过程中——寻找一种特殊疾病或者药物有效性的生物标记，那么你需要的是能明确得到化学结构的串联质谱分析能力，可供选择的就是LC-ESI-triple quad。但更重要的是，你还要借助多离子方法撒开更广的网，因此我们可以考虑两种选择：APPI（大气压光离子，atmospheric pressure photoionization），和APCI（大气压化学电离，atmospheric pressure chemical ionization）。 推荐系统：[color=#DC143C]LC+ESI+triple quad with multiple ionization sources [/color]推荐理由：APCI可以利用溶剂中的化学成份使样品电离，Limbach表示，“比如说我有一个样品在甲醇/水的溶液中，（APCI）就可以利用甲醇或者水分子发生化学反应电离样品，这样透射入光，光化学产生离子”，当然正如MALDI和电喷雾不能精确电离同样的分子，APCI和APPI也不行。 5. 计算分析级 一旦你识别了所需的生物标记，也许就需要在成百上千的生物样品中对其进行评估计算，可以考虑的定量应用分析仪器就是triple quad——与液相色谱和电喷雾离子化串联使用。Gafken就认为，“triple quads的关键用途就是真实定量，虽然有许多对蛋白和多肽进行定量，但是如果你需要的是绝对定量，那么最好的方法就是triple-quad仪器。” 推荐系统：[color=#00008B]LC+ESI+triple quad with single or multiple reaction monitoring [/color]推荐理由：Limbach认为，“Quadrupoles（四极）实际上是滤波器，就像是无线电装置一样运转：你调出一个频率，就会有一个特殊的离子传出，这样你就可以扫过这些无线电转盘（radio dial）获得离子，其它的一切都会被剔除”。这些仪器的优势就在于可以进行一个或两个离子频率的扫描（即质荷比（mass-to-charge），m/z），缺点就是对于在许多研发模式工作中需要的高m/z扫描而言太慢了。 但是怎么知道所观测到的离子就是你想要的呢？在任何生物样品中，几个离子也许有相同的m/z值，这就需要single-reaction monitoring介入，Gross认为，“这就能克服第一quad和扫描的慢速问题，因为你知道什么是你想要的”，比如说你的特异分子有m/z1000，m/z300片段离子，你就可以设置第一quad为m/z1000滤波器离子，在第二个quad中将其断裂，然后在第三个quad中对其进行计算（m/z300）。而在multiple reaction monitoring，则可以将仪器设置成“hop”——从一个m/z值到另一个，因此可以同时计算2个，或者3个分析组。

[b]什么是磷酸化蛋白质[/b]蛋白质磷酸化是指在激酶催化作用下把ATP或者GTP的磷酸基团（P04）转移到不同种类的氨基酸上（主要包括丝氨酸S、苏氨酸T、酪氨酸Y），从而使蛋白质发生翻译后修饰的过程。该修饰是蛋白质翻译后修饰（PTM）中最为重要的形式，具有显著的生物学功能，细胞增殖和凋亡，良性发育，信号转导，新陈代谢，肿瘤发生等过程都有磷酸化蛋白质的插足，研究磷酸化蛋白质对探究生物学病变机理有着非常重要的意义。[b]富集磷酸化蛋白质重要性[/b]磷酸化蛋白质具有低丰度和高动态性的特点，因此对磷酸化蛋白质组学研究首先需要对磷酸化蛋白样品进行富集，降低样品复杂程度和提高磷酸化位点鉴定数目。固相金属离子亲和色谱法（IMAC）是磷酸化蛋白质组学研究中最常用的磷酸化蛋白质富集技术之一。[b]Welchrom Ti Poss (phosphate ester)固相金属离子亲和填料[/b]Welchrom Ti Poss (phosphate ester) 是月旭科技推出的的新一代固相金属离子亲和填料，金属离子Ti??鳌合在磷酸酯 (phosphate ester) 为配基的多级孔杂化整体材料上形成的亲和填料，利用磷酸化基团与固相化的Ti??的高亲和力来富集磷酸化蛋白质。磷酸化蛋白质上的磷酸基团中的三个氧原子分别与富集材料上的三个不同Ti??螯合以形成稳定的八面体形的配位结构，这种配位方式提供了良好的结合能力。该填料具有吸附量大、选择性好、成本低、适用范围广、操作简单特点。[b]规格参数[/b][table=521][tr][td=1,1,156]基架名称[/td][td=1,1,365]多面体低聚倍硅氧烷（POSS）作为单体所制备的多级孔杂化整体材料[/td][/tr][tr][td=1,1,156]粒径范围[/td][td=1,1,365]几十微米至几百微米[/td][/tr][tr][td=1,1,156]结合载量[/td][td=1,1,365]63.6 mg/g[/td][/tr][tr][td=1,1,156]适用样品范围[/td][td=1,1,365]所有含有磷酸基团的蛋白质和肽段[/td][/tr][tr][td=1,1,156]磷酸化肽段富集特异性[/td][td=1,1,365]97%[/td][/tr][tr][td=1,1,156]pH稳定性[/td][td=1,1,365]强酸、强碱下均可使用[/td][/tr][tr][td=1,1,156]化学稳定性[/td][td=1,1,365]常见有机溶剂下均可使用[/td][/tr][tr][td=1,1,156]保存条件[/td][td=1,1,365]干燥状态下室温保存[/td][/tr][tr][td=1,1,156]通用性操作步骤[/td][td=1,1,365]采用80% ACN/6% TFA水溶液作为富集溶液，这样可以在富集过程中，很大程度上避免疏水性非磷酸化肽段的吸附。去除上清溶液后，依次用洗涤溶液A（50% ACN/6% TFA/200 mMNaCl）和溶液B（30%ACN/0.1%TFA）进行洗涤，这样可以最da程度上洗去非特异性肽段。最后采用100 μL 10%（wt%）的氨水洗脱吸附在材料上的磷酸化肽段。[/td][/tr][/table][b]应用案例[/b][align=center][img]https://img1.17img.cn/17img/images/201910/uepic/556dc556-79d8-4012-81ef-a8a16364ff16.jpg[/img][/align]（a）β-酪蛋白酶解液直接进行分析的 MALDI TOF-MS谱图和（b）Welchrom Ti Poss材料富集后分析的MADLI TOF-MS谱图[b]实验条件：[/b]0.1μg β-酪蛋白酶解液；采用80% ACN/6% TFA水溶液作为富集溶液，去除上清溶液后，依次用洗涤溶液A（50% ACN/6% TFA/200 mM NaCl）和溶液B（30%ACN/0.1%TFA）进行洗涤，最后采用100 μL 10%（wt%）的氨水洗脱吸附在材料上的磷酸化肽段。图a中，未经过富集的β-酪蛋白酶解液样品MALDI谱图中，非磷酸化肽段的质谱信号峰非常强，严重影响了对磷酸化肽段的辨别。而经过Ti??-IMAC富集，从MADLI谱图中（图b）可以清晰的看到磷酸化肽段以及其去磷酸化肽段的信号峰，而且几乎没有出现任何非磷酸化肽段的信号峰。证实了Welchrom Ti Poss富集对磷酸化肽段具有良好的富集能力。[table=562][tr][td][align=center][b]产品名称[/b][/align][/td][td][align=center][b]规格[/b][/align][/td][td][align=center][b]货号[/b][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][b]Welchrom Ti Poss (phosphate ester)[/b][/align][/td][td][align=center][b]250mg[/b][/align][/td][td][align=center][b]ATI001[/b][/align][b][/b][/td][/tr][/table]

ABSCIEX 生物质谱新技术培训4月/25日9:00-9:15am ABSCIEX 介绍9:15-10:15am 复旦杨芃原:生物质谱QTOF的仪器技术10:15-10:30am Break10:30-11:15am 实验室考察: 复杂生物样本的蛋白质鉴定11:15-12:00pm AB SCIEX 专家: 蛋白质鉴定和定量的实验设计--5600 QTOF的应用12:00-1:00pm 午餐1:00-2:30pm ABSCIEX 专家(Wenhai): SWATH 技术的实验设计2:30-3:15pm 实验室考察: 建立SWATH 技术的实验流程3:15-3:30pm Break3:30-5:00pm ABSCIEX 专家：SWATH 技术的数据处理4月/26日9:00-9:45am 复旦刘晓慧/陈晨/张磊：疾病生物标志物的鉴定和确认技术9:45-10:15am AB SCIEX 专家：MIDAS 实验设计10:15-10:30am Break10:30-12:00pm 实验室考察: MIDAS 实验流程的建立和数据处理12:00-1:00pm 午餐1:00-2:30pm ABSCIEX 专家: 应用iTRAQ 技术筛选分子标志物2:30-3:30pm 热电公司专家：待定”生命科学中的化学基础协同创新中心”生物质谱培训和讨论班4月/27日9:00-9:50am 复旦杨芃原: 生物质谱的仪器技术概况10:00-10:50am 复旦金红: 组蛋白修饰分析的质谱技术10:50-11:10am Break11:10-12:00 am 诺华/复旦廖日晶: 组蛋白修饰(甲基化)分析的质谱技术12:00-1:00pm 午餐2:00-2:50pm 复旦陆豪杰：磷酸化蛋白的质谱分析3:00-3:50pm 复旦杨芃原/曹玮倩/刘铭琪: 糖修饰蛋白的质谱分析3:50-4:10pm Break4:10-5:00pm 热电公司张伟：Orbitrap质谱的蛋白质组学方法开发与应用进展5:00-5:50pm康昱盛信息科技有限公司: 非标记定量方法的介绍和前期数据质量控制4月/28日9:00-9:50am 复旦申华莉/刘晓慧:蛋白质组测序的深度覆盖技术10:00-10:50am 北京蛋白质组研究中心应万涛：蛋白质谱分析的绝对定量技术10:50-11:10am Break11:10-12:00 am 康昱盛信息科技有限公司:蛋白质组学的IPA生物通路分析方法12:00-1:00pm 午餐2:00-2:30pm 热电公司讲座（欢迎参加）地址：上海市徐汇区东安路130号 复旦大学上海医学院 生物医学研究院 明道楼2楼

高分辨质谱　　用低分辨质谱测定时,分子的质量数都是整数表示,如CO、N2、C2H4和CH2N的质量都是28。如果用高分辨质谱测定就能得到如C2H4＝28.031299，CH2N=28.018723，因此，根据高分辨质谱所测得的精密质量就可以对结构加以剖析和区别　　小分子化合物确定结构式有多种方法，NMR，高分辨质谱(由于每个元素的原子量实际都是小数的，通过高分辨质谱可以直接获得化学式！　　其中高分辨质谱我们强烈推荐THERMO LTQ ORBITRAP　　Orbitrap具有高分辨率[最高可达45万半峰全宽（FWHM）]，高质量精度（0.1×10-6~1×10-6），质量范围宽，动态范围广的优点，可提供大范围的定性和定量分析，并且克服了其他高分辨质谱如傅里叶变换离子回旋共振（FTICR）质谱、飞行时间（TOF）质谱的尺寸大，维护与操作复杂的缺点。　　在药物分析的应用　　此段摘取贺美莲 郭常川 石峰 姜玮 所著的《Orbitrap高分辨质谱技术在药物分析领域中的应用进展》　　在药物代谢方面的应用　　Orbitrap高分辨质谱可以在很宽的质量范围内生成全扫描数据，同时提供组分的定性和定量分析[21]。此外，在各种生物基质（如血浆、血清，尿液等）中的药物代谢物分析需要复杂的前处理过程，而Orbitrap质谱对于复杂生物基质中的痕量分析物也可进行准确的分析，从而简化了样品前处理过程。基于这些优势，Orbitrap质谱已成为药物代谢研究中强有力的分析工具　　在中药组分分析方面的应用　　Orbitrap串联超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱仪[/color][/url]实现单针进样即可高通量获取中药中的成百上千化合物的定性和定量信息，能够显著提高中药复杂体系中化学成分的快速分析鉴定能力。　　中药由于成分复杂，对于其真正起治疗作用的化学成分往往不够清晰。应用二维[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]串联LTQ-Orbitrap质谱对丹参中的酚酸和双萜类成分进行定性和定量分析。根据裂解机制和高分辨MSn数据，共鉴定或初步表征了102个化合物，同时检测到丹参样品中的14个生物活性化合物，其中10个酚酸类和4个双萜类，这些成分是丹参发挥心血管疾病治疗作用的主要成分。　　从中药中探索新的化学实体是筛选候选药物的重要来源。采用Orbitrap高分辨质谱鉴定蛇麻花中具有潜在抗菌活性的化合物，对钩藤中的92个吲哚生物碱进行系统表征并发现56个新的潜在生物活性分子，进一步明确了钩藤治疗作用的物质基础。　　在药品杂质检查方面的应用　　杂质检查是药品质量安全评价的重要环节。得益于其强大的定性和定量分析性能，Orbitrap技术可为原料药中杂质和药物降解产物研究提供强有力的支持。采用超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]串联紫外检测器和高分辨质谱检测器（UPLC-UV-LTQ-Orbitrap）对左旋甲状腺素的氧化降解杂质进行鉴定，利用时间分辨的高分辨质谱数据和自动数据处理的结合能够推断出单个化合物基础上杂质形成的动力学及其形成机制；通过比较降解曲线，总共识别了4个主要类型的甲状腺素降解杂质的产生路径。　　采用超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]串联Orbitrap质谱仪对伊潘立酮降解杂质进行分离和鉴定，通过[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS分析共鉴定了7种降解杂质，并发现在水解和氧化条件下，伊潘立酮是不稳定的。　　在中成药非法添加筛查方面的应用　　[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]串联高分辨质谱技术不仅可以用来筛查已知的非法添加成分，还可以发现并鉴定复杂基质中的未知成分，先后对中成药中非法添加的磷酸二酯酶-5抑制剂、降糖药和糖皮质激素的筛查和鉴定进行了研究。在63批次中成药和34批次保健品样本的检测中，共有7批保健品检测到降糖药，涉及二甲双胍、苯乙双胍和格列本脲等在非法添加糖皮质激素的检测中，分析物响应与质量浓度（1.0~1 000 ngmL-1）呈良好的线性关系，回归系数（r2）大于0.999 0，所有分析物检测下限（LODs）为1.0 ngmL-1，在42批中成药中共有22批样品检测到醋酸泼尼松，其中1批样品同时检测到了泼尼松和醋酸氢化可的松。　　在蛋白质组学的应用　　目前广泛使用的用于蛋白质鉴定的质谱分析主要使用两种类型质谱：一种是MALDI-TOF直接对分子量进行测量；另一种是使用ESI-MS高分辨率质谱分析电喷雾得到的多电荷信号，然后对信号进行去卷积分析，获得精确分子量数值。这两种方法各有其优点及适用的领域　　采用直接MALDI-TOF进行分子量测定的主要问题是，MALDI-TOF质谱仪在不同质量区域内分辨率差别很大，分子量越大，分辨率越低。因此当样品为大分子蛋白质样品（比如抗体类药物）时，MALDI-TOF无法测得精确分子量，更不用说对蛋白质的糖基化等修饰形式进行分析。　　(1) 抗体类蛋白质药物的精确分子量测定　　抗体类蛋白质药物是生物医药界非常重要的一类样品，这些蛋白质分子的分子量非常大，一般情况下150KDa左右。因此在没有高分辨率质谱仪的情况下，要对这类蛋白质进行精确分子量测定是困难的。　　在高分辨率质谱仪，特别是orbitrap原理的质谱仪出现以后，抗体类蛋白质的去卷积分子量测定变得容易实现。　　(2) 还原后抗体类样品的不同亚基精确分子量测定　　抗体类蛋白质样品通过还原，可以将轻链和重链分开，然后通过HPLC分离，在线进行MS分析得到亚基的精确分子量。　　(3) 小分子量（25KDa）蛋白质样品的精确分子量测定　　常用蛋白质样品包括抗体类蛋白质（150 KDa），同时也包括一些相对较小的蛋白质分子。对着这些相对较小的蛋白质，进行[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]分析，并去卷积分析得到精确分子量，不需要太高的分辨率即可实现（早期的离子阱，如LTQ就可以实现对小分子量蛋白质的分子量测定）。　　高分辨率质谱可以对蛋白质样品（约10-150KDa）进行精确分子量测定，精度达到1Da左右，可以满足分析蛋白质的修饰状态（比如糖基化、磷酸化、氧化、C末端K缺失情况等），并可以对这些修饰情况进行定量分析

目前正在做一个高分子化合物与一个蛋白质链接，再将这个聚合物修饰到病毒上，请问生物质谱能检测他们之间是否连接上么。大家有没有什么好一点的方法可以推荐蛋白质电泳试过不行，因为蛋白质与病毒的大小相差太大，跑出的条带差不多。

请问各位大神，质谱检测结果为什么是【M+H】+和【M+Na】+的m/z值，而不是直接【M】+的分子量的m/z呢？离子化方式是ESI，离子模式是正离子

请问Q-TOF和MALDI-TOF的区别？这两种质谱的特点，能不能检测出蛋白的磷酸化位点，谢谢！！！

也称为选定离子的记录(SIR) 也可参阅四级杆和扫描。在四级杆上,能够调节DC和RF电压设置,仅让一个带电颗粒通过(单质荷比)到达检测器。结果噪音显著减少,当灵敏度显著增加时,出现信号(此m/z的所有颗粒始终被检测),这完全以检测不到混合物中的其它质荷比的颗粒为代价。热喷雾虽然文献报道这种类型的接口已有一段时间,但是直到1980年代早期才普及。Vestal和Blakely应值得赞赏,因为他们在LC和MS之间首次建立了实际可行,完全商业化的接口技术。大约流速1mL/min的LC溶剂在探针中,被加热(绝缘管大约1-2英尺长,75-150微米的内径),形成的蒸汽喷入质谱仪。质谱仪中的气溶胶液滴被进一步去溶剂,形成离子,进入分析器(以适合的角度喷射),会受到透镜电压的影响。