抗体药物纯化专用制备色谱

抗体药物偶联物 (ADC) 是一类新兴生物治疗药物，旨在通过将药物与单克隆抗体相连实现靶向给药。与小分子药物不同，ADC 不是单分子实体，而是一类异质性的抗体，每种抗体所携带的药物数量以及经历的翻译后修饰都各不相同。药物/抗体比率 (DAR) 是指 ADC 偶联的药物的平均数量。DAR 是 ADC 开发过程中需要优化和密切监测的关键质量属性，因为它将影响疗效和毒性。由于药物的释放，在血液循环中 ADC 的 DAR 将随时间发生变化。因此，制定一套测定药代动力学 (PK) 研究样品中 ADC DAR 的稳定解决方案非常关键。要确定 ADC DAR，首先必须纯化血清中的 ADC，然后使用 LC/MS 对其进行分析。通常该工作流程中的样品前处理和数据分析环节需耗费大量人力，因此易受变异性和人为误差影响。本应用简报介绍了一种用于测定血清样品中 ADC DAR 的解决方案，该方案采用 Agilent AssayMAP Bravo 平台对 ADC 进行自动亲和纯化；将 Agilent 1290 Infinity UHPLC 与Agilent 6550 Q-TOF 质谱仪联用，用于采集准确的完整蛋白分子量数据；并利用 Agilent MassHunter BioConfirm 和 DAR 计算器软件确定 ADC 质量和 DAR。该工作流程可节省人力、降低变异性以及减少产生与 ADC DAR 测定相关的人为误差的可能性，而且仅需很少的工作量即可扩展样品处理量。

正相色谱和反相色谱是Flash制备色谱常用的两种分离模式，被广泛应用于各类有机合成产物的分离纯化中。在正相色谱中，采用极性固定相（如带有二醇基、氨基或氰基的固定相及硅胶、三氧化二铝等）并结合使用非极性流动相（如正己烷等），根据分子的极性大小将其分开。由于正相色谱以吸附效应作为分离的基础，因此也被称为吸附色谱。而在反相色谱中，采用非极性固定相（如带有C18基团的硅胶等）配合极性流动相对样品进行分离。这两种分离模式基于不同的分离机理，因此在将两种分离模式联用时可称之为正交色谱分离模式，从而获得对复杂样品更高的分辨力和更好的分离效果。本文中以某合成药物中间体为样品，利用SepaFlash系列正相硅胶柱及反相C18柱联合使用，实现了对样品的高效分离纯化，获得了满足纯度要求的目标产物，为此类复杂样品的快速制备纯化提供了新的思路。

抗体是一种结构复杂的生物大分子，由多个氨基酸组成。即便是天然的抗体，其结构也是各不相同。抗体药物中使用到的单克隆抗体(IgG)在生产工艺(细胞培养、分离纯化)与保存过程中易发生不均一性的变化，包括抗体蛋白的二聚体、多聚体、脱酰胺化、末端氨基酸突变以及糖链部分的结构差异。这些不均一性会使药物的药效、安全性方面受到影响。 而随着生产工艺及分析手段的进步，单克隆抗体类药物的质量控制将更加严格。高效液相色谱(HPLC)作为一种分离技术，在蛋白质、抗体等生物大分子的分离分析方面已得到越来越广泛的应用。近年来，东曹生物的科学家们一直致力于在生物药分离领域开发具有革新性的色谱分离介质，基于尺寸排阻、离子交换色谱等多种HPLC分离技术实现了对抗体多聚体、各种抗体异构体的高效分离，在抗体药物的质量控制方面提供了有效地监控手段。

本研究探讨使用SepaBean machine快速液相制备色谱系统检测技术对糖类化合物进行制备纯化，结合UV检测器和ELSD检测器（蒸发光散射检测器）共同检测。选取葡萄糖、果糖、乳糖三种样品，由于样品为极性很强的糖类分子，在普通C18反相柱上保留很弱，针对样品的具体性质，应用工程师利用Sepa Flash氨基柱配合快速液相制备色谱系统SepaBean machine并与ELSD检测器联用，成功对样品进行了纯化，为极性很强的糖类化合物的制备纯化提供了一种可行的方案。

制备色谱是一种用于从混合物中分离目标化合物的技术，是很多研究领域和生产过程必不可少的分离和纯化手段。与传统的纯化方法（如蒸馏、萃取、重结晶等）比较，制备色谱是一种更有效的分离方法，因此被广泛应用在样品和产品的提取和纯化上。相较于分析型高效液相色谱关注于分离效率和分离效果等因素外，制备型高效液相色谱同时需要考虑目标产物的产率和纯度的，因此合理的目标馏分收集方式和手段也是制备型高效液相色谱重要的单元组成和重要参数。

瑞典Biotage公司的产品覆盖合成实验、分离提纯、浓缩干燥、生化药物检测等一系列科学研究领域，并成为相关领域的市场领导者。Biotage是最早推出快速制备色谱仪器的厂家，在快速制备色谱方面，市场占有率最高。

瑞典Biotage公司的产品覆盖合成实验、分离提纯、浓缩干燥、生化药物检测等一系列科学研究领域，并成为相关领域的市场领导者。Biotage是最早推出快速制备色谱仪器的厂家，在快速制备色谱方面，市场占有率最高。

在本应用案例中，样品为极性很强的某合成低聚糖类分子，在普通C18反相柱上保留很弱，此外，其紫外吸收非常弱，不适合利用UV检测器对其进行检测。针对样品的具体性质，三泰科技的应用工程师利用SepaFlash HILIC ARG柱配合快速液相制备色谱系统SepaBean machine并与外接ELSD检测器联用，成功对样品进行了纯化制备，获得了满足制备需求的目标产物，为极性很强的低聚糖类样品的纯化制备提供了一种可行的方案。

食品、饮料、个人护理用品和精油中所含芳香成分多为小分子的挥发性化合物。这些芳香成分是一些差向异构的手性化合物。正如在药品中不同的手性化合物之间具有不同的药理作用一样，芳香成分中不同手性异构体的香气不同，其存在比例也会影响香气的质量和强度。因此，对香料原料的开发而言，掌握异构体之间的特性差异非常重要，在开发过程中需要进行异构体的分离和分馏纯化。在过去，诸如芳香成分的挥发性化合物一般通过气相色谱法（GC）进行分离和制备。虽然GC具有较高的分辨率，但每次分析的样品负载量小，分析时间也较长。使用超临界流体色谱法(SFC)进行制备纯化时，与液相色谱法（LC）相比分析和负载同等量的样品能够更快速完成。此外，在SFC中用作洗脱液的液化二氧化碳会在常温常压下气化，分馏后的组分中仅含少量有机溶剂。因此，可以轻松浓缩目标组分。本文介绍了NexeraUC分析型制备系统对薰衣草精油中芳香成分芳樟醇进行制备纯化的示例。

制备出效价高，特异性强，稳定性好的抗体是免疫学实验取得成功的基础，抗体质量的好坏直接影响着研究者研究的成败，不同的免疫学实验方法（如ELISA，IHC，IP，ICC,SDS-PAGE, WB等）对抗体的效价，浓度和纯度有不同的要求。我们知道，一般免疫血清中含有特异性抗体和非特异性抗体，血清蛋白以及其他各种杂蛋白等，在制备特异性抗体过程中当抗体的效价达到实验预期之后，我们所制备的抗体的纯度关键取决于所选择的纯化方法。

本文中待纯化的样品来自某制药公司，为氨基多环糖类物质，结构类似于氨基糖苷类抗生素，其极性很大，易溶于水，其分子结构式示意图参见图1，粗品纯度约为88%（HPLC分析结果）。对于此类大极性化合物的分离纯化，根据我们之前的制备纯化经验，样品分子在普通C18分离柱上的保留很弱，因此，考虑采用C18AQ柱对其进行分离纯化。

利用循环制备对硅胶色谱柱不能分离化合物的纯化。对于有机合成，利用循环方便简洁的拿到高纯中间体以及最终产物。

分析级制备纯化 行业特点：大多数单次制备纯化量较少，可采用分析级纯化方案 半制备级纯化平台 适合大制备量核苷酸纯化，单次制备量可达200~2000 OD QC质检 HTCS核酸质谱检测系统（基于LTQ系列质谱） DEL-核酸质谱检测系统（基于LTQ质谱） 基因扩增 Realtime PCR----荧光定量PCR仪 核酸药物高端研究 Thermo LTQ-Orbitrap XL高分辨质谱系统

在分析方法考察过程中，化学家经常评估纯化过程化合物在不同色谱柱下的化学特性，例如，对于手性化合物的纯化，通常在高效液相色谱分析中筛选几种类型的色谱柱，尽管不同类型的色谱柱，有着很大的化学差异性，尽管ACCQ Prep制备色谱系统上可以安装、使用各种类型色谱柱，ACCQ Prep可以通过只需对一种类型的色谱柱单次校准计算出聚焦梯度，该校准不局限于单个色谱柱，通用校准也可以用于不同化学特性的色谱柱，只要分析型色谱柱有相同的尺寸和使用相同的梯度和流速，就允许快速和简便的色谱方法筛选。

抗体在亲和层析试剂中所占地位日趋重要，所以纯化抗体的方法也倍受关注。抗体通常是从血清、杂交瘤上清或腹水中获得的。尽管直接使用未纯化的抗体溶液可进行一些免疫学实验，但是要获得满意的结果最hao使用纯化的抗体，特别是用于亲和层析的抗体。实际上，纯化的抗体也适用于免疫检测、免疫印迹、酶联试验（ELISA）或细胞染色等。

本文介绍了使用超临界流体色谱分析仪，进行药物制备纯化和干燥的案例。使用常规HPLC制备纯化药物化合物具有如下问题：处理时间长，劳力成本高、有机溶剂消耗大等。与此相比，SFC制备纯化法具有多种优点，不仅适用于新化合物的分析，还可应用于常规化合物的纯化，提高其工作效率。

羧酸类化合物尤其是苯甲酸类化合物是许多活性药物成分（Active Pharmaceutical Ingredients, API）的关键中间体，例如解热镇痛药物阿司匹林等，具有广泛的应用价值。使用传统硅胶作为固定相的色谱柱来分离纯化这类化合物是一类难题。常州三泰科技有限公司的SepaFlash C18反相柱结合快速液相制备色谱系统SepaBean machine具有良好的分离性能。本文利用SepaFlash C18反相柱分离并纯化了两种强极性的苯甲酸类化合物(结构式如图 1所示)，结果表明混合物样品得到了很好的分离，为此类具有一定极性与亲水能力的化合物的快速分离纯化提供了一种经济实用的解决方案。

在一份先前的应用纪要中，密度调整作为一种有效的放大SFC分离方法被用于制备型SFC纯化。在本应用纪要中，我们将此策略运用于实际应用中，重点介绍两个案例研究——使用超高效合相色谱UPC2系统进行分析级的快速方法开发并放大到制备型SFC进行纯化。第一个研究侧重于活性药物成分（API）Imatinib合成过程中的反应中间体及产物的非手性分析和纯化。第二个研究则针对一种专利手性药物化合物的纯化。利用这种策略能够按照预期有效地缩放方法，有助于在较快速的分析级进行快速方法筛选，并在维持分离兼色谱完整性的同时直接将最终方法转换为制备型色谱法。最终结果显示，可显著节省时间和流动相成本（原材料和废物处理）。

抗体药物偶联物 (ADC) 是制药公司药物开发途径中快速发展的一类新型生物治疗药物。ADC的制备方法是通过化学方法将具有生物活性的小分子药物与单克隆抗体相连。ADC 通过结合高效细胞毒性药物与靶标特异性抗体将细胞毒性药物直接送达病变组织，同时限制药物在非目标组织中的毒性。药物/抗体比率 (DAR) 是抗体所连接药物数量的平均值，它是 ADC 的重要属性。由于低载药量会降低效力，而高载药量则会对药代动力学 (PK) 和毒性产生负面影响，因此 DAR 值能够对药效产生影响。目前的偶联化学方法有赖氨酸侧链酰胺化或半胱氨酸链间二硫键还原，载药量通常为 0 ~ 8 个药物分子 (D0 ~ D8)/抗体。

使用 NextGen 300+ 配备蒸发光散射检测器和 RediSep Gold 胺柱，通过 HILIC 梯度方法可以高效纯化碳水化合物。梯度生成器使得 ISCO 制造的所有色谱柱都能快速开发和放大方法。

抗体药物偶联物 (ADC) 是制药公司药物开发途径中快速发展的一类新型生物治疗药物。ADC的制备方法是通过化学方法将具有生物活性的小分子药物与单克隆抗体相连。ADC 通过结合高效细胞毒性药物与靶标特异性抗体将细胞毒性药物直接送达病变组织，同时限制药物在非目标组织中的毒性。药物/抗体比率 (DAR) 是抗体所连接药物数量的平均值，它是 ADC 的重要属性。由于低载药量会降低效力，而高载药量则会对药代动力学 (PK) 和毒性产生负面影响，因此 DAR 值能够对药效产生影响。目前的偶联化学方法有赖氨酸侧链酰胺化或半胱氨酸链间二硫键还原，载药量通常为 0 ~ 8 个药物分子 (D0 ~ D8)/抗体。LC/MS 是测定 ADC 的 DAR 和载药量分布的常用分析方法， 也是鉴定不同种类载药 ADC 的关键方法。多数情况下可直接使用 LC/MS 分析完整 ADC 从而确定 DAR 值。而在需要有关轻链和重链的具体 DAR 信息时，则可能要在 LC/MS 分析前对 ADC 进行还原。此外，还可能需要在 LC/MS 分析前对 ADC 进行去糖基化以进一步降低谱图复杂性。LC/MS 分析前的 ADC 样品前处理通常由手动完成，因此可能引入变异性并对通量产生限制。Agilent AssayMAP Bravo 是一款简单易用的自动化样品前处理系统，能够提高可重现性、通过减少手动操作时间节省人力、具有可扩展性（可同时运行 8 – 96 个样品)、简化人员间和站点间的方法转移，并能最大限度减少人为误差。AssayMAP Bravo 是一款适用于上述反应的强大自动化样品前处理平台。AssayMAP Bravo 自动化样品前处理平台与安捷伦 LC/MS 和 MassHunter/BioConfirm/ DAR 计算器软件相结合，能够针对 ADC DAR 计算提供可重现的便捷解决方案。本应用简报中采用 Agilent AssayMAP Bravo 平台对经/未经去糖基化的完整和还原态 ADC 进行了平行处理，并采用安捷伦 LC/MS 对其进行分析，随后通过安捷伦 DAR 计算器确定 DAR。

单克隆抗体是一类重要的治疗药物，拥有治疗多种疾病的巨大潜力。由于其结构具有高度复杂性和聚糖异质性，因此必须对其关键质量属性进行表征和严格控制，才能保证药物的质量和功效。与Fc区Asn-297糖基化位点相连的mAb聚糖会影响生物活性，如抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和稳定性。TSKgel FcR-IIIA系列色谱柱根据单?克隆抗体对Fcγ RIIIA配体的亲和力，将其分为3个组分：低亲和力、中亲和力和高亲和力。这主要取决于mAb的糖型及其ADCC活性。为了定量和阐明基于FcRIIIA亲和力分离的不同组分糖型聚糖谱，需要首先对馏分中的抗体聚糖进行释放并标记，再使用HILIC-MS 的分析。TSKgel FcR-IIIA-5PW是一种半制备型亲和色谱柱，其固定相是将重组Fcγ RIIIA 配基，键合到10 μ m粒径的多孔聚甲基丙烯酸酯聚合物基质上，上样量最高可达5 mg mAb。它与分析柱 (TSKgel FcRIIIA-NPR) 不同，分析柱采用的是无孔填料基质，上样量通常 ≤ 50μ g mAb。因此，使用半制备型TSKgel FcR-IIIA-5PW色谱柱，单次可收集更多的样品，对这一工作流程大有裨益。该半制备型色谱柱的附加效用是可以通过收集足量的样品，通过酶促聚糖释放和HILIC-MS方法对mAb糖型进行深度分析。

本文建立了一种使用岛津质谱引导型高效液相制备色谱用于药物中多组分的制备分离的方法。以分离制备阿托伐他汀钙片中的有关物质为例，采用反向液相色谱，分别以紫外，质谱以及紫外和质谱同时触发馏分收集，详细说明了不同触发方式的参数设置以及LH-40的制备模拟功能，使用不同的触发方式都可以对目标组分进行准确的收集。多种触发收集模式，满足不同性质的化合物制备需求。

从老鼠腹水中纯化而来的单克隆抗体往往含有一些异构体。即使在SDS-PAGE 电泳分析中只显从老鼠腹水中纯化而来的单克隆抗体往往含有一些异构体。即使在SDS-PAGE 电泳分析中只显示一条带，但当使用等电聚焦电泳时却可以观察到多条带的存在。TSKgel CM-STAT是一款适合于分析抗体异构体的高分辨率、非多孔、弱阳离子交换色谱柱。在本数据中介绍了使用TSKgel CM-STAT 色谱柱进行鼠腹水由来的单克隆抗体异构体分析的应用。同时，我们将通过TSKgel CM-STAT色谱柱分离获得的不同组分进一步使用等电聚焦电泳进行了鉴定。结果表明，TSKgel CM-STAT色谱柱确实适合于异构体的分析，并且可以适用于毫克级别的微量、高分离度的样品制备。

在本文中，三泰科技的研发人员利用快速液相制备色谱系统SepaBean machine配合SepaFlash C18反相分离柱对红豆杉植物提取物进行了分离纯化，获得了满足制备需求的目标产品，可用于后续的进一步科学研究中，为此类天然产物的快速制备纯化提供了经济高效的解决方案。

糖类化合物是由碳、氢、氧三元素组成的有机物。从化学结构上看，糖类是多羟基醛酮以及它们的多聚体，在化学式的表现上类似于“碳”与“水”的聚合，故又称碳水化合物，根据其结构不同，可分为单糖、双糖和多糖。糖类化合物具有众多的用途，涵盖了食品、医药、能源、工业等多个领域。它们不仅在食品工业中用于调味和增加口感，还在医药领域用于药物生产和治疗疾病，同时也是能源和工业生产中的重要原料。糖类化合物的广泛应用为人类的生活带来了便利，也推动了相关产业的发展。近年来糖类化合物的研究有两个方向： ①化学家致力于糖类化合物的人工合成，这主要是为社会发展作长远打算，使人类食物将有可能逐步摆脱对农业的依赖。②研究糖类化合物与生命的关系，因为在生命体内糖与蛋白质、核酸常不可分离。糖类化合物分离纯化检测由于缺乏发色基团，导致其无紫外吸收或紫外吸收很弱，常规快速液相制备色谱系统通常只配备紫外 (UV) 检测器，不能检测缺乏发色基团的目标化合物。而蒸发光散射检测器（Evaporative Light-scattering Detector）是通用型检测器，可以检测挥发性低于流动相的化合物，特别是没有紫外吸收的有机物质。本案例主要探讨使用SepaBean machine快速液相制备色谱系统搭配ELSD检测器（蒸发光散射检测器）对糖类化合物进行制备纯化，为糖类化合物的制备纯化提供了一种可行的方案。

抗体是一种结构复杂的糖蛋白。即使是天然抗体，其结构也是各不相同。抗体类药物在其生产工艺（培养、分离纯化）或存储过程中容易导致产品的不均一性，所以在药物研发以及纯化和生产过程中，对抗体药物的定量和定性的分析是非常重要的。 高效液相色谱法（HPLC）可以对抗体药物以及重组蛋白药物中的不均一性进行有效的分析。比如，尺寸排阻色谱法利用分子空间结构的不同，可对多聚体、抗体片段、PEG化蛋白等样品进行有效分离。离子交换、疏水、反相以及正相色谱法可对抗体中的带电异构体、结构异构体，或由于糖基化、托酰胺化和氧化等作用引起的杂质进行高分辨率的分析。 本目录汇总了SEC/IEC/HIC/RPC/HILIC法分析抗体药物的应用实例，同时也涵盖了最新最全的TSK色谱柱产品的选择指南。

有机发光半导体材料是一组用于制造OLED显示屏的化合物，主要由可产生荧光的多环芳烃构成。有机发光半导体材料的合成和杂质的结构表征是开发新的、高性能产品必不可少的，而多数情况下需要高纯度化合物，因此需要纯化目标组分。本文中，我们介绍了使用超临界流体色谱Nexera UC分析系统进行小容量制备以及Nexera UC Prep用于大量制备。

随着近年抗体药物市场的持续扩大，2012年全球销售额前10名的药物中有7个为抗体药物。而抗体-药物偶联物（Antibody-Drug Conjugate；ADC）是最有望成为仅次于抗体药物的下一代生物制药。ADC是将小分子化药通过化学结合到抗体（IgG）上形成的复合物。由于抗体中存在多个结合位点（Cys，Lys残基等），结合部位以及结合数量的不同会导致不均一性。这些不均一性会对ADC药物的药效、甚至是安全性产生影响。由于小分子化药的疏水性比抗体要高，结合的数量的不同也会导致ADC药物的疏水性发生变化。所以，利用这个原理通过疏水色谱模式可以对结合在抗体上的小分子化药的结合量（Drug to Antibody Ratio；DAR）进行分析.本报告中，使用了TSKgel Butyl-NPR色谱柱对ADC进行分离分析。

制备LC广泛应用于制药、食品和化工等领域，用于从混合物中纯化目标化合物、寻找天然产品中的活性成分，以及对杂质或未知化合物进行结构分析等。在应用文章“01-00650-JP”中，介绍了一种分析/制备转换LC-MS系统，其制备纯化工作流程如图1所示。该系统包括：在分析模式下的分离条件研究、规模放大、馏分纯度/回收率确认等。具体来说，使用分析方法开发软件Lab Solutions MD进行分析方法的高效的分离条件优化，确保目标化合物（氢化皮质酮）及其附近共洗脱的峰之间有充分的分离。然后，进行负载量研究，规模放大，使用UV信号作为触发信号进行制备。本文为您介绍通过使用比UV更具定性能力的MS触发收集信号，可最大限度地排除杂质的混入，提高氢化皮质酮纯度的制备案例。