单细胞悬液制备与均质系统

实验室中的科研人就如同探索未知的勇士，他们借助着各种精密仪器，探寻着各种神奇奥秘。当我们在追求科研的精准与效率时，两款设备不容忽视—那就是高压均质机和单细胞悬液制备仪。它们如同实验室中的得力助手，以其独特的功能为实验工作提供了极大的便利性，同时也解决了部分操作时的难题。想要获取更多的研究思路和手段吗？那就让我们一起走近这两款设备，感受它们为科研带来的无限可能。一、高压均质机：高压均质机这一看似普通的设备，实则蕴含着巨大的能量。利用高压和剪切力，将物料进行均质化处理，使得原本不均匀的混合物变得细腻均匀。在食品、化工、医药等领域，高压均质机都发挥着不可替代的作用。在实验室中，科研人员可以利用高压均质机对样品进行预处理，提高实验的准确性和可靠性。 高压均质机 JXNANO-5高压均质机应用领域：制药行业中制备脂肪粒、载药型乳液均质、脂质体、纳米混悬剂和微胶囊等 生物工程产品的细胞破碎、胞内外物质的提取和均质 精细化工、碳纳米管、石墨烯、导电浆料、电阻浆料的生产和制备 个人护理品-脂质纳米的均质分散 食品和工业产品的均质和乳化,提高产品稳定性 高压均质机产品优势：①结构特点：单支陶瓷柱塞驱动，出料流量精准控制。可选配柱塞润滑装置，密封使用寿命更长。②均质压力：最大设计压力2000bar/200MPa/29000psi，选用卫生级数字隔膜压力表。③均质流量：最小样品量15ml,特别适合昂贵的药剂生产。自动吸料，无需进料设备。④部件技术：均质阀座组件可采用氧化锆、钨钢、金刚石、司太立等材质，单/双面加工，双面使用，使用寿命加倍。二级阀分散乳化，使物料分布更加均匀一致。⑤节能技术：设备变频控制，接入220V市电即可使用，进口品牌部件设备更稳定，更低的能耗，更高的能效比。二、单细胞悬液制备仪：单细胞悬液制备仪是实验室中另一款不可或缺的设备。应用于流式细胞术/单细胞测序/原代细胞培养等实验。另外单细胞悬液制备仪在肿瘤研究 心血管研究 干细胞研究 免疫研究 神经科学研究等研究领域的应用也很广泛，主要目的时为科研人员提供了更多实验便利。单细胞悬液制备仪 JX-CKSM-4WK样品范围：人类及小鼠肿瘤组织/正常组织，哺乳动物软组织，植物愈伤及根尖组织。产品应用：单细胞测序（Single-Cell RNASeq)多色流式分析（Multicolor Flow Cytometry)质谱流式细胞计数（Mass Cytometry)原代细胞分离培养（Primary Cell Isolation And Culture)细胞治疗CAR-T组织高利用率、单细胞化过程高效、单细胞高产出1、操作简易，制备流程全自动，仅需30min即可获取大量单细胞悬液2、自动控温，保护样品活力，细胞活性可达85%以上3、多种消化方案，针对不同样品选择不同程序，针对不同组织均有配套试剂盒4、针对临床穿刺样本，使组织的利用率达到100%，细胞产量可达10万个以上5、针对原代细胞培养样本，在15min内完成组织到单细胞过程，降低细胞逆境时间，提高细胞存活率6、针对组织单细胞测序，快速完成单细胞化处理，获得高产且活率在85%以上的单细胞，以小鼠组织为例：在实验室的日常工作中，高压均质机和单细胞悬液制备仪的使用频率很高。科研人员通过操作这些设备，不仅能够提高实验效率，还能够减少人为误差，保证实验结果的准确性。同时，这些设备还具有操作简便、性能稳定、便于清洁等优点，使得科研人员能够更加专注于实验本身，而不是被繁琐的清洗和操作所困扰。净信小贴士：目前任何设备都不是万能的。在使用高压均质机和单细胞悬液制备仪时，科研人员也需要注意一些细节问题。例如，要定期对设备进行维护和保养，确保设备的正常运行；在操作过程中，要严格按照操作规程进行，避免因为操作不当而导致设备损坏或实验结果失真。

时下细胞研究很火的科研技术当属单细胞测序，但此技术对细胞悬浮液的总量以及活性都有一定的要求，因此制备高质量的单细胞悬浮液成为实验成功的关键点。单细胞测序涉及的细胞类型多种多样，如肠、肺、PBMC、胚胎、神经、乳腺、干细胞等，而其中样本的处理消化亦是重中之重，样本前处理与后续的分析结果有着莫大的关联。如何在上机前得到最*的悬液呢？这里和大家分享一些制备*单细胞悬液的小tips。1、在样本采集过程中，建议采用无菌样品处理方式，包括使用不含核酸酶的试剂和耗材；2、实体组织需要先处理，传统组织处理方法有机械法，包括网搓法、研磨法。机械法一般适用样本类型为脾脏、淋巴结、胸腺；另外较温和的方法有酶解法（使用胰蛋白酶类、胶原酶、溶菌酶、弹性蛋白酶以及一些商业化包装的组合酶），适用样本类型有肝脏、肾脏、心脏、肺脏、脊髓、脑、肠道、皮肤、肿瘤等。3、如果您使用的是10x Genomics相关仪器和平台，可以从官网查看10x Genomics不同样本单细胞悬液制备官方建议或者利用关键词查询与自己样本类型相同的已发表的单细胞测序文献。对于如何获得高质量的样品，10X公司建议在单细胞悬液制备过程中，细胞重悬的缓冲液选用无Ca2+、Mg2+和EDTA的1× PBS，并用0.04% non-acetylated BSA清洗两次（300rcf，5min），选择其他缓冲液或培养基可能会对结果产生不同程度的影响。4、细胞在处理过程受到外界环境影响，其基因表达谱可能会出现一些变化；有些细胞对环境极为敏感，可能会死亡裂解，造成RNA降解从而造成检测中的背景细胞升高，进而影响所获得的数据质量。实验过程中需要尽量避免细胞死亡，不断优化细胞处理条件，加快实验流程的进度，减小对细胞的影响。5、单细胞悬液制备过程中出现的细胞团、细胞碎片或纤维等杂质会增加微流体芯片的堵塞风险。如果存在细胞碎片和大团块，请将样品通过40 µm Flowmi 细胞过滤器，细胞悬液体积损失小。 图源：10x Genomics 的Protocol《 Fresh Frozen Human Peripheral Blood Mononuclear Cells for Single Cell RNA Sequencing》图源：《10x GenomicsSingle Cell Protocols——Cell Preparation Guide》相关产品Bel-Art Flowmi 40微米 细胞过滤器，适用于1000微升移液管(50个/包)

项目编号：SDSHZB2023-058项目名称：中国海洋大学多功能酶标仪、单细胞悬液制备仪等设备采购项目预算金额：363.0000000 万元（人民币）采购需求：本项目预算总金额为363万元，共分为5个包，其中：A1包：多功能酶标仪等设备（接受进口产品），预算金额：109万元；A2包：移动式小动物麻醉机等设备（接受进口产品），预算金额：51.5万元；A3包：全自动无创血压测量系统等设备（接受进口产品），预算金额：72万元；A4包：液晶数码生物显微镜等设备（接受进口产品），预算金额：44万元；A5包：冷冻切片机等设备采购（接受进口产品），预算金额：86.5万元。合同履行期限：详见附件本项目( 不接受 )联合体投标。获取招标文件时间：2023年03月18日 至 2023年03月24日，每天上午8:00至11:30，下午13:00至16:00。（北京时间，法定节假日除外）地点：青岛市市北区敦化路138号甲西王大厦24楼23A01室或者邮件报名方式：以下方式二选一：（1）现场报名：须携带加盖单位公章的营业执照副本复印件及现金，按照上述时间、地点获取招标文件。（2）邮件报名：有意参加本次采购活动的投标人填写项目名称、项目编号、包号、公司名称、联系人、联系电话、邮箱、营业执照扫描件及标书费汇款底单发送至shzbqdb@163.com,邮件名称命名为：中国海洋大学多功能酶标仪、单细胞悬液制备仪等设备采购项目-“投标单位名称”。未按规定报名的投标人其报名无效。开户银行：兴业银行青岛市北支行，开户名：山东盛和招标代理有限公司，银行账号：522130100100053768，提交标书费须从投标人基本账户或一般账户转出，电汇时须备注2023-058-包号、资金用途注明标书费。未按规定报名的投标人其报名无效，本项目实行资格后审，获取招标文件成功不代表资格后审通过，招标文件售后不退。售价：￥300.0 元，本公告包含的招标文件售价总和对本次招标提出询问，请按以下方式联系。1.采购人信息名称：中国海洋大学地址：青岛市崂山区松岭路238号联系方式：崔老师 0532-667819792.采购代理机构信息名称：山东盛和招标代理有限公司地址：青岛市市北区敦化路138号甲西王大厦24楼23A01室联系方式：孙萌、张蕾、肖颖梦 0532-67737979　3.项目联系方式项目联系人：孙萌、张蕾、肖颖梦电话：0532-67737979

单细胞测序技术的发展日新月异，单细胞的研究已进入超高通量、超大数据研究阶段。华大智造自主研发的DNBelab C系列高通量单细胞RNA文库制备试剂盒（简称DNBelab C4）发布，助力突破单细胞研究门槛高、费用高的瓶颈，加速细胞分辨率下生命科学和医学新一轮的变革与发展，拥抱千万单细胞时代的到来。目前，应用华大智造DNBelab C4和DNBSEQ测序平台已开展百万单细胞项目十余项，发表SCI文章十余篇。2022年3月22日，国际顶级学术期刊《自然》（Nature）发表了基于华大智造单细胞利器DNBelab C4和DNBSEQ测序平台的科研应用。该研究助力科学家精确得到诱导全能干细胞（8CLC），并且通过细胞图谱分析证明了发育得到组织的多样性，证明了8CLC的全能性，最终获得了人类体外诱导的全能干细胞。这一研究的突破，正是得益于单细胞测序技术的进步与应用。在过去，研究人员可能要对成千上万个细胞进行处理和培养，才能获得全能干细胞，成功的概率只有不到百分之十五。基于华大智造自主开发的DNBelab C4，结合DNBSEQ测序平台，科学家可以以高灵敏度和高准确性的方法进行多维的单细胞分析，快速得到具有重要发育潜能的细胞，并研究这些细胞的发育去向。 利用8CLC发育的畸胎瘤组织充分证明8CLC的全能性 口袋里的单细胞实验室 每套试剂盒均带有一个小巧便携的DNBelab C4装置，无需电源，不需安装和维护，只需轻轻一拉便可实现单细胞液滴生成，堪称“可装进口袋的单细胞实验室”，简化了仪器的操作难度，并降低了单细胞研究的门槛。高效的磁珠捕获系统华大智造DNBelab C4采用自主设计的捕获磁珠，平均单个磁珠表面修饰有107条捕获序列，能够高效捕获目的分子；同时引入了自主研发的多磁珠识别技术，可有效提高细胞捕获效率以及获取细胞的完整信息。目前，DNBelab C4已经应用于人、鼠、猴、猪等十几个物种，超200种不同类型样本的单细胞转录组研究；单次实验有效捕获细胞数量1,000~12,000个，多胞率（Multiplet Rate）8%，每个细胞基因个数平均数4,000（细胞系），每个细胞UMI中位数15,000个（细胞系）。投入细胞捕获效率捕获细胞数多胞率UMI中位数/细胞（细胞系）平均基因个数/细胞（细胞系）5,000~30,00030~60%1,000~12,0008%15,000-30,0004,000单细胞研究一站式平台华大智造为单细胞测序提供一站式平台，包括自动化文库制备系统MGISP-100、MGISP-960和基因测序仪MGISEQ-2000、DNBSEQ-T7等，全面支持单细胞组学研究的快速展开。其中，自动化建库平台的搭建，有助力于节省人力、提高通量、减少操作失误。现已有部分研究机构和测序服务机构采用了该一站式平台进行了单细胞测序应用，测序结果表现优异。作为生命科技核心工具的提供者，在单细胞领域，华大智造致力于为所有生命科学实验室提供便携、经济、用户友好的单细胞组学全流程产品，助力行业开启规模化单细胞研究新时代。华大智造正在开展服务商认证，首批已认证三家服务商。

5月7日，上海多宁生物科技股份有限公司（“多宁生物”）与上海涛烜科学仪器有限公司（“涛烜科学”）签署战略合作协议，双方就高通量单细胞筛选平台HypercellⓇ等系列产品的全球化销售达成合作，基于行业前沿的目标单细胞筛选技术，为抗体发现提供经济、高效的一站式解决方案。单克隆抗体是生命科学领域的重要工具，也是肿瘤及自身免疫疾病的核心疗法之一。在传统的单抗制备流程中，选择性培养、杂交瘤阳性克隆筛选等步骤的周期较长，对单抗的快速开发造成了限制。高通量单细胞筛选平台——HypercellⓇ是一套采用先进的微流控、人工智能视觉识别技术的平台，能在2小时内完成数十万个单细胞的筛选实验。基于其高通量、易操作，可在1天内完成细胞分选的产品优势，HypercellⓇ广泛应用于抗体、ADC、细胞疗法等领域的基础研究和商业化阶段，并可显著缩短抗体的开发周期。涛烜科学是一家专注于单细胞/单菌工具开发的公司，其研发上市的首款高通量单细胞筛选平台HypercellⓇ是基于明场单B细胞分选的平台。依托于HypercellⓇ和Smartculture XⓇ（单菌筛选平台）两大核心技术，涛烜科学可为客户提供端到端的解决方案。作为一站式生物工艺解决方案提供商，多宁生物的产品及服务涵盖了细胞培养、过滤纯化、制剂灌装及流体管理一整条生物工艺链路，并将服务范围拓展至美国、印度、日本、韩国等海外市场。此次合作，双方将协力支持海内外研发人员对单细胞的精准操控和高效筛选，从而加快抗体开发的速度，简化生物疗法的研制流程。顾红峰 多宁生物副总裁“很高兴能与涛烜科学成为合作伙伴，涛烜拥有行业一流的单细胞分选技术和强势的产品开发能力，而多宁具备完整的生物工艺解决方案和国际化的销售网络。双方的优势加成，将进一步满足客户对高端科学仪器以及一站式生物工艺解决方案的需求。此次合作，我们将以提高抗体开发效率为着力点，将优质的国产仪器逐步推向全球市场。” 孙建军 涛烜科学创始人“非常荣幸与多宁生物达成战略合作，多宁生物以其一站式生物工艺解决方案，确保药物研发及生产流程的高效、稳定、可控。我们则凭借高通量、快速的单细胞分选技术，以及操作便捷、广泛适用的设备，为客户提供卓越服务。双方强强联合，将为客户提供从细胞筛选到工艺优化的全面解决方案，共同推动生物医药领域的进步，期待共同创造更多价值。”关于多宁生物上海多宁生物科技股份有限公司是一家中国领先的一站式生物工艺解决方案提供商，致力于提供生物制药产品从研发到商业化生产的综合解决方案，包括试剂及耗材、仪器设备、服务。公司主要运营生物工艺解决方案、实验室产品及服务两大业务线，通过一站式生物工艺体系帮助合作伙伴实现高效、稳定、质量及成本可控的药物研发及生产流程。关于涛烜科学上海涛烜科学作为一家专注于单细胞/单菌工具开发的公司，一直致力于推动生物医药领域的技术进步和创新。通过不断研发和推广先进的单细胞筛选技术，涛烜科学为生物医药产业的发展注入了新的活力和动力。HypercellⓇ平台的推出，更是展现了涛烜科学在技术创新和市场应用方面的领先地位和实力。在未来，涛烜科学将继续秉承“创新、专业、高效、可靠”的理念，不断推出更多先进的单细胞筛选技术和产品，为生物医药产业的发展做出更大的贡献。

摘要：2021年5月，中国科学院青岛生物能源与过程研究所荆晓艳博士等人应用星赛生物的RACS-Seq®单细胞拉曼分选-测序耦合系统，以及相应的RAGE芯片和单细胞分析试剂盒（包括环境样品中微生物单细胞提取与制备、稳定同位素饲喂细胞、单细胞核酸裂解与扩增等环节）在美国微生物学会会刊《mSystems》在线发表题为“One-Cell Metabolic Phenotyping and Sequencing of Soil Microbiome by Raman-Activated Gravity-Driven Encapsulation (RAGE)”的文章。单细胞拉曼分选耦合测序（RACS-Seq）是剖析环境菌群功能机制的重要手段，但拉曼分选后单个细菌细胞基因组的覆盖度通常低于10%，极大限制了其应用。近日，中国科学院青岛生物能源与过程研究所单细胞中心基于星赛生物的RACS-Seq®单细胞拉曼分选-测序耦合系统，以及相应的RAGE芯片和单细胞分析试剂盒（包括环境样品中微生物单细胞提取与制备、稳定同位素饲喂细胞、单细胞核酸裂解与扩增等环节），首次实现了精确到一个细菌细胞、全基因组覆盖度达93%的环境菌群scRACS-Seq，为环境微生物组原位代谢功能研究提供了一个强有力的新工具。土壤是地球上最重要的生态系统之一，土壤微生物组的代谢活动支撑着农业与畜牧业，也在地球元素循环、全球气候变化中起着关键性作用。同时，土壤菌群也是地球上最多样与最复杂的微生物组之一，而其中大部分微生物尚难以培养，因此，单个细胞精度的拉曼分析-分选-测序（Single-cell RACS-Seq，简称scRACS-Seq）策略，是剖析土壤等环境菌群之代谢机制的重要手段。然而针对环境菌群的scRACS-Seq一直以来存在两大瓶颈，一是难以无损、快速地获取具有特定拉曼表型的单个细胞；二是难以获得高覆盖度的单细胞基因组数据。这已经成为scRACS-Seq技术体系在复杂菌群中得以广泛应用的关键瓶颈。针对这一业界共性难点问题，单细胞中心荆晓艳、公衍海和徐腾等组成的联合攻关小组，基于前期发明的RAGE-Seq技术（Raman-activated Gravity-driven Encapsulation and Sequencing Xu, et al, Small, 2020，点击查看），从液相拉曼分析稳定同位素底物饲喂的土壤菌群出发，将特定拉曼表型的细菌单细胞精准分离并包裹到皮升级液滴中，进而耦合下游基因组测序。结果表明：（i）土壤菌群中细胞代谢活跃的低丰度物种（如Corynebacterium spp., Clostridium spp., Moraxella spp., Pantoea spp. 和 Pseudomonas spp.等）可经耦合重水饲喂与标记的RAGE-Seq精准地识别和分选，其单细胞基因组覆盖率可高达〜93％；（ii）同样，基于RAGE-Seq，含类胡萝卜素的土壤微生物细胞（如Pantoea spp., Legionella spp., Massilia spp., Pseudomonas spp., 和Pedobacter spp.等）能实现单个细胞分辨率、高基因组覆盖度的代谢重建，从而完整、深入地挖掘其类胡萝卜素合成途径；（iii）这些“原位”合成类胡萝卜素的土壤微生物细胞中，既有代谢活跃的，也相当部分是惰性的，表明基于纯培养的策略势必错失这些代谢惰性的功能微生物，因此“原位”、单细胞精度的功能细胞识别和分离，对于全面、客观的菌群功能剖析和资源挖掘具有重要意义。精确到一个细胞的拉曼分析-分选-测序（scRACS-Seq）此外，该工作还通过组分与状态均精确可控的人工菌群，建立了系统且严格的scRACS-Seq质量评价与控制体系。基于该体系，发现该技术能将不同拉曼表型的细菌单细胞从菌群中快速、精准分离，在保证单细胞拉曼光谱质量的同时，分选准确性达100%。此外，以来自于靶标细胞周围水相的空液滴为阴性对照，发现靶标细胞序列中被菌群中其他细胞DNA污染的概率极低。上述工作定量证明了scRACS-Seq的灵敏度、特异性和可靠性。借助星赛生物的RACS-Seq®单细胞拉曼分选-测序耦合系统，以及相应的RAGE芯片和单细胞分析试剂盒（包括环境样品中微生物单细胞提取与制备、稳定同位素饲喂细胞、单细胞核酸裂解与扩增等环节），scRACS-Seq可以在复杂菌群中以单个微生物细胞的分辨率建立新陈代谢与基因组的联系，从而精确回答“谁在做什么，为什么”。该系统广谱适用于细菌、古菌、真菌和动植物细胞，正服务于涵盖各种复杂生态系统的研究和应用。

人体组织器官由具有不同细胞类型的异质细胞群组成。传统批量测序（Bulk Sequencing）方法仅能捕获器官与组织群体细胞成分的平均水平，或者只代表其中占优势数量的细胞信息，单个细胞独有的特性常常被忽略。近年来，随着单细胞测序（Single-cell sequencing）技术的发展，实现了单个细胞水平上DNA或RNA的测序，从而能够特异和精准地探索单个细胞的基因变异水平，弥补了传统批量测序的不足[1]。图1. 单细胞测序与传统批量测序比较[1]单细胞基因组测序技术，是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项技术，广泛应用于癌症研究、胚胎发育、辅助生殖、细胞分化、免疫机制、微生物等生物医学方向的研究。本期主要对单细胞基因组测序的技术原理、技术流程、技术平台及其在生物医学领域的应用实例做简单介绍。技术原理单细胞基因组测序的原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基因组后进行高通量测序，揭示细胞间异质性的基因信息。技术流程单细胞基因组测序主要包括四个步骤，即单细胞分离→全基因组扩增→高通量测序→数据分析。目前单细胞基因组测序技术的发展依然面临两方面的技术挑战：一是易于分离和操作的单细胞分离工具（即第一步）；二是能够稳定复制单个细胞中微小核酸的方法（即第二步）[2]。2.1 单细胞分离从组织中将单个细胞分离出来是单细胞基因组测序的第一步。目前常用的单细胞分离方法主要有：有限稀释法、显微操作法、流式细胞分选术、激光捕获显微切割技术（LCM）、微流控芯片技术等，表1总结了上述提到的单细胞分离方法的原理和优缺点，在使用时可根据不同的科研需求及样品情况综合考虑选择适宜的分离方法[3,4]。表1. 单细胞分离技术分离方法原理优点缺点有限稀释法对细胞进行一系列的倍比稀释，最终使细胞处于单个状态，理论上每μL约1个细胞，然后用移液器吸取相应容积的细胞悬液进行单细胞分离。操作简便；成本低，一般不需要特殊的设备。分离效率低；需要研究人员排除大量空白孔和多细胞孔，费时费力；细胞分离过程依赖梯度计算，容易出现错误。显微操作法在高倍倒置显微镜下，利用显微镜操作器（手动或自动）实现单细胞分离。能够准确地控制单细胞的吸取与释放；可以从不同的发育阶段或多样化的群体分离单个细胞。通量低，需要大量的起始量；细胞特异性由显微镜决定，并利用微量移液管分离，可能不够准确。流式细胞分选术通过流式细胞仪，根据细胞特异性分子标志物或细胞光散射特性，分选出单个细胞或特殊细胞群，实现单细胞分离。通量高；基于细胞表面标志物的特异标记，能够确保特定细胞的分离；利用荧光标记可分离亚群。无法扩展到大规模项目；且需要流式细胞仪，设备昂贵。激光捕获显微切割技术（LCM）在显微镜下，从冰冻/石蜡包埋组织切片（或细胞固定在装配有可以激光脉冲激活的热塑膜的涂片）中分离某一类型细胞群或单个细胞，实现单细胞分离。无需解离组织，制备细胞悬液；能够直观准确、快速地获取单个细胞或单一细胞亚群；能够保留所分离细胞的完整性。需要适当的组织处理（冷冻保存或固定）；显微切割可能存在挑战；小的细胞可能难以分离；可能存在污染。微流控芯片技术通过微流控芯片隔离流动通道中的单个细胞从而达到单细胞分离的目的。通量高；上样体积小；周期短；可根据细胞表面标志物分离特定细胞。细胞大小必须均匀；消耗品昂贵。2.2 全基因组扩增（Whole-Genome Amplification , WGA）全基因组扩增是单细胞基因组测序的第二步。由于单个哺乳动物细胞中DNA的含量一般少于10pg，达不到测序仪的检测要求，因此在测序之前必须进行全基因组扩增（WGA）以获得足够的材料用于后续的文库制备。目前常用的全基因组扩增方法按原理可分为三类（见表2）[5-7]：基于聚合酶链式反应（PCR）的WGA方法{主要是简并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)}、多重链置换扩增法（Multiple Displacement Amplification , MDA）和多重退火环状循环扩增技术（Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles，MALBAC）等。表2. 全基因组扩增技术DOP-PCRMDAMALBAC原理基于PCR技术，通过加入部分简并的寡核苷酸引物与模板结合来实现扩增整个基因组的目的。基于恒温核酸扩增技术，恒温条件下，使用一条由6个随机碱基构成的随机引物与模板随机退火；紧接着在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下发生链置换反应，并最终完成扩增。结合了MDA法和PCR扩增法的特点，即由一组随机引物启动扩增（每个引物具有通用引物序列和随机碱基），随机引物与模板均匀杂交，随后在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下发生链置换反应，最终完成扩增示意图特点该方法实现了高度均匀的扩增，产物产量较高，操作较为简单；但仅产生基因组的稀疏覆盖，实验的条件需要较多优化。 MDA可以实现更好的基因组覆盖，产物片段长；但对模板质量要求高，可能产生非特异性产物。一种实现基因组广泛覆盖和均匀扩增的技术，灵敏度高，产物产量高。技术平台：目前，国内外研究机构使用的大规模单细胞测序技术平台主要有五种：Illumina® Bio-Rad® Single-Cell Sequencing Solution、BD Rhapsody™ Single-Cell Analysis System、10x Chromium Single Cell Gene Expression Solution、ICELL8 Single-Cell System和C1™ 单细胞全自动制备系统。国内也有多家企业进军单细胞测序领域，产品包括新格元自动化单细胞处理系统、万乘基因高通量单细胞测序平台、达普生物星海单细胞测序建库系统、墨卓生物高通量单细胞测序平台、德运康瑞痕量单细胞测序平台和原位测序平台等。各个平台各有特点，这里主要简单介绍一下两种应用较多的技术，即10X Genomics 公司的Chromium( 液滴法) 及 BD 公司的Rhapsody( 微孔法)。10x Genomics单细胞测序技术：10X Genomics单细胞测序起源自Drop-Seq技术，应用液滴微流体技术分选单细胞，将单个细胞与含有条形码（Barcode）和引物的凝胶珠一起包裹于油滴中；然后每个油滴中的凝胶珠溶解， 细胞裂解释放mRNA，通过反逆转录产生用于测序的带条形码的cDNA，cDNA在液体油层破坏后进行文库构建，使用测序平台对文库进行测序检测，即可一次性获得大量单细胞的基因表达数据。该平台具有“三高（high）两低（low）”的特点：即通量高，细胞捕获效率高，细胞活性要求高（大于90%），分析时长低，成本低。 图2. 10X Genomics Chromium Controller技术原理示意图3.2 BD Rhapsody单细胞测序技术：BD公司推出的这款Rhapsod™单细胞分析系统采用了Cytoseq分子标签技术，能为单细胞中每个转录本标记特异性分子标签，实现单细胞水平上基因表达谱的绝对定量。同时，将每个细胞标记上特异性细胞标签，实现了高通量平行建库。该技术在基因扩增和后续的测序部分等整体流程与10x Genomics单细胞测序技术相近，主要区别在于起始的单细胞分离和捕获技术。该技术并非基于微流控芯片技术，而是基于蜂巢板技术，基于微孔来保证单细胞的捕获，避免了10x Genomics单细胞测序技术中存在的概率碰撞对捕获效率从影响。细胞悬液经注入孔注入后，自然沉降到反应孔中，随后， 将磁珠同样由注入孔注入，即可在单个反应孔中捕获其中的细胞。微孔和纳米孔方法允许稀释的细胞悬浮液在每孔一个珠子和一个细胞的条件下与寡聚结合珠一起沉降到皮升大小的孔中，从而保证了单孔中是单细胞捕获。 图3. BD Rhapsody技术原理示意图4、应用实例：目前，单细胞基因组测序技术的应用可以归纳为两大类，即应用于人类细胞图谱研究和非细胞图谱研究。单细胞基因组学的优势就在于能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，反映细胞间的异质性。自2017年“人类细胞图谱计划”提出以来，单细胞测序技术已陆续揭示了多个组织器官的单细胞图谱，如通过对肾脏肿瘤进行单细胞测序，发现肾肿瘤细胞之间的突变频率和位置不尽相同，每个细胞的突变状态和转录情况也均不相同，表明肾肿瘤更加具有异质性，需要开发更加有效的细胞靶向疗法。2022年发表在Nature杂志上的研究，对人脑血管系统的单细胞图谱进行了分析，描绘出海马和皮质的脑血管细胞组成：内皮细胞、相邻的壁平滑肌细胞 (SMC) 和周细胞、血管周围的免疫细胞和星形胶质细胞等，这些细胞在大脑不同区域存在差异并沿动静脉轴变化，沿动静脉轴的细胞组成异质性产生了大脑健康所必需的功能分段的循环、代谢和渗透特性。揭示了人类大脑血管系统的细胞组成和分子特征，提示了阿尔茨海默病（AD）风险因素在人类中的进化转变，有助于对人类大脑健康基础的了解、疾病机制和治疗靶点的发现[8]。随着单细胞基因组覆盖范围扩大、通量提升以及多组学技术的不断进步，单细胞基因组学技术将为丰富发育谱系树、生殖细胞突变模式、癌症进化、基因组功能和微生物群落的分辨研究等提供策略[9]。参考文献：[1] Xia Y, Gawad C. Bringing precision oncology to cellular resolution with single-cell genomics[J]. Clinical and experimental metastasis, 2022(1):39.[2] Liang J, Cai W, Sun Z. Single-cell sequencing technologies: current and future. J Genet Genomics. 2014 Oct 20 41(10):513-28. doi: 10.1016/j.jgg.2014.09.005. Epub 2014 Oct 18. PMID: 25438696.[3] Wang Y, Navin N. Advances and Applications of Single-Cell Sequencing Technologies[J]. Molecular Cell, 2015, 58(4):598-609.[4] Gross A, Schoendube J, Zimmermann S, Steeb M, Zengerle R, Koltay P. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 2015 Jul 24 16(8):16897-919. [5] Gawad C, Koh W , Quake S R. Single-cell genome sequencing: current state of the science[J]. Nature Reviews Genetics, 2016.[6] Grün D, van Oudenaarden A. Design and Analysis of Single-Cell Sequencing Experiments. Cell. 2015 Nov 5 163(4):799-810.[7] 徐晓丽 吴凌娟.单细胞全基因组扩增技术与应用.[J]生物化学与生物物理进展 .2019.46(4)[8] Yang A C , Vest R T , Kern F , et al. A human brain vascular atlas reveals diverse mediators of Alzheimer's risk[J]. Nature, 2022, 603.[9] Evrony G D, Hinch A G, Luo C. Applications of Single-Cell DNA Sequencing[J]. Annual Review of Genomics and Human Genetics, 2021, 22(1).相关会议推荐：第六届基因测序网络会议来袭！六大会场，含单细胞和空间组学会场，点击下图免费报名！点击链接进入会议官网：https://www.instrument.com.cn/webinar/meetings/geneseq2023/

2016年10月25日，中国医药生物技术协会（CMBA）发布了《干细胞制剂制备质量管理自律规范》的公告，公告对为规范我国干细胞制剂制备、管理、检测安全等进行了详细规范说明，《规范》自发布之日起施行。以下为“规范”原文：关于发布《干细胞制剂制备质量管理自律规范》的公告各有关单位：　　为规范我国干细胞制剂制备，加强质量管理，促进行业自律，中国医药生物技术协会自2015年4月组织业内骨干企业及专家参照《药品生产质量管理规范》(GMP)、《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则(试行)》和《干细胞临床研究管理办法(试行)》等，经过一年多的研讨，制订了《干细胞制剂制备质量管理自律规范》。经广泛征求意见并进一步修改完善，现将《干细胞制剂制备质量管理自律规范》予以发布，并自发布之日(2016年10月25日)起施行。　　附件：《干细胞制剂制备质量管理自律规范》文件如下：　　干细胞制剂制备质量管理自律规范　　中国医药生物技术协会　　第一章 总 则　　第一条为加强干细胞制剂制备质量管理的行业自律，避免干细胞制剂制备过程中污染、交叉污染以及混淆、差错等风险，确保持续稳定地制备出符合质量标准和预定用途的干细胞制剂，参照国内外相关规定和指南，制定本规范。　　第二条干细胞制剂是指用于治疗疾病或改善健康状况的、以不同类型干细胞为主要成分、符合相应质量及安全标准，且具有明确生物学效应的细胞制剂。　　第三条本规范适用于干细胞制剂制备的所有阶段。　　第二章 一般要求　　第四条干细胞制剂的制备应遵循《药品生产质量管理规范》(GMP)的基本原则及其相关规定以及其他适用的规范性文件。　　第五条干细胞制剂制备机构(以下简称制备机构)应建立符合 GMP 要求、完整的干细胞制剂制备质量管理体系，并设立独立的质量管理部门，履行质量保证和质量控制的职责。　　第六条制备机构应根据每种干细胞制剂的特性及其制备工艺进行风险评估，并建立合理的质量管理策略。　　第七条制备机构的工作区域应合理设计及布局。各功能区域应相对独立，应有满足其功能需要的空间、设施、设备和洁净度要求。质量控制区应与制备区实施物理隔离，行政区、生活区及辅助区等应不防碍干细胞制剂的制备。　　第八条干细胞制剂制备的内、外环境应满足其质量保证和预定用途的要求，应严格控制微生物、各种微粒和热原的污染风险。　　第九条干细胞制剂制备管理负责人、质量管理负责人和质量受权人应具有与职责相关的专业知识(细胞生物学、微生物学、生物化学或医药等)，同时应具有 5 年以上的相关工作经验或接受过相应的专业培训，应能够履行干细胞制剂制备或质量管理的职责。制备管理负责人与质量管理负责人、质量受权人不得相互兼任。　　第十条从事干细胞制剂制备、质量保证、质量控制及其他相关人员(包括清洁、维修人员、物料仓储管理人员等 )均应根据其工作性质进行专业知识、安全防护、应急预案的培训和继续教育。制备机构应建立人员档案，包括卫生及健康档案。对直接进行制备和质控操作的已离职员工档案，应至少保留 30 年。　　第十一条从事干细胞制剂制备的人员、质量控制人员、包装人员应及时记录并报告任何可能导致污染的情况，包括污染的类型和程度。制备机构应采取严格的措施，避免体表有伤口、患有传染性疾病或其他可能污染干细胞制剂的人员从事制备、质量控制和包装的操作。　　第十二条应建立设备、仪器、设施的管理档案，并建立唯一的编码标识系统，确保其使用情况的可追溯性，并对相关设备按照其说明书要求建立完善的使用及维护管理制度。　　第十三条与细胞制备、质量控制直接相关的仪器、设备，如灭菌柜、超净工作台、生物安全柜、空气净化系统和工艺用水系统等，应经过验证或确认，经质量管理部门批准后方可使用，并进行计划性校验和维护。　　第十四条如采用电子信息系统进行管理，制备机构应建立电子信息系统的设计、运行、使用、升级、变更等管理程序，并对其运行的准确性和完整性进行定期验证。　　第三章 供者与采集　　第十五条制备机构应建立并执行干细胞供者评估标准，通过筛查既往病史、家族史、当前健康报告，必要时还应包括出入疫区等其他情况的报告及样本检测(包括但不仅限于HIV、HBV、HCV、HTLV、EBV、CMV、梅毒螺旋体等)进行干细胞供者的评估，以预防传染性疾病和明确的遗传性疾病通过干细胞制剂进行传播。　　第十六条有下列情况的人员不应作为异体干细胞制剂的供者：　　(一)现病史或既往病史有严重传染性疾病 　　(二)家族史有明确的遗传性疾病 　　(三)未排除可能感染严重传染病(如近期出入过严重传染病疫区等)，或其他不宜作为供者的情况。　　第十七条自体干细胞制剂的供者，应根据所制备干细胞制剂的来源、特性和预定用途，制定合理的自体供者的评估标准和制备要求，并完成上述病原体筛查。　　第十八条如使用诱导的多能性干细胞作为干细胞的来源，应能追溯到体细胞的供者，应进行供者评估所需的筛查和检测。　　第十九条如使用体外授精术产生的多余胚胎作为建立人类胚胎干细胞系的主要来源，应能追溯配子的供者，应进行供者评估所需的筛查和检测。在使用多余胚胎前，应取得胚胎所有人的知情同意和授权，并经过伦理委员会批准。　　第二十条所有人源采集物的采集必须得到供者或其法定代表人、监护人的同意，并签署知情同意书。　　第二十一条采集机构应是取得《医疗机构执业许可证》的具有供者筛查能力的医疗机构。胚胎干细胞提供机构，必须是经国家相关部门批准的专业机构。制备机构应对采集机构或提供机构的资质进行确认，并定期进行评估。　　第二十二条 采集工作应由采集机构的医护人员实施。采集人员应持有医师或护士执业证书，并经过相应的培训后方能进行采集。制备机构应向采集机构和采集人员明确采集物的质量标准、对采集信息和采集记录的要求、采集物发运前在采集场所的临时保存条件以及对采集物包装和发运的要求，必要时制备机构应对采集人员进行培训和指导。　　第二十三条采集机构应制定采集标准操作规程，并备有采集过程中的应急预案。采集过程应严格执行标准操作规程并有真实记录，采集信息应双人复核。　　第二十四条采集过程应采取措施保护供者的健康和安全，并通过无菌技术操作最大限度降低污染、感染和病原传播的风险。采集用的接触采集物的试剂和物料应无菌、符合临床安全标准，且在有效使用期内。需由制备机构提供的无菌试剂和物料，应经过制备机构质量控制部门的验证并合格。　　第二十五条采集机构应向制备机构提供采集物的获取方式、途径以及相关的临床资料，包括但不限于供者的一般信息、既往病史、家族史和当前健康报告等。既往病史和家族史要对遗传性疾病相关信息进行详细收集，必要时应收集供者的 ABO 血型、HLA-I 类和 II 类分型资料及 DNA 样本以及过去三个月内出入疫区的情况报告，以备追溯性查询。采集机构和制备机构应建立供者个人隐私保护机制，确保个人信息受控。　　第二十六条应建立采集物的唯一标识系统，以配合后续的各个标识系统满足干细胞制剂的可追溯性。　　第四章 接收与制备　　第一节 接 收　　第二十七条制备机构应制定并执行每一种采集物的质量标准和接收标准操作规程。应设置采集物的接收取样工作区，执行采集物的登记、编号、初检、核对、取样和暂存功能。接收取样工作区应与制备区隔离并有独立的洁净环境，接收时的取样操作应在A级洁净环境下进行。　　第二十八条接收人员收到采集物时应对采集物登记并进行唯一识别编码，并准确填写交接信息。　　第二十九条接收人员应对采集物进行初检，初检内容包括但不限于：　　(一)采集物信息核对，包括名称、数量、重量、供者信息、健康调查、表单等 　　(二)检查采集物内外包装及运输容器是否完整、密封状态等 　　(三)目检采集物是否有变质、损坏或污染 　　(四)取样并送检。　　第三十条采集物如有异常或特殊情况，接收人员应及时通知质量管理人员。制备机构应建立采集物异常或特殊情况处置操作规程，进行无害化处理。　　第三十一条当采集物某些检测项目周期较长时，可先进行后续工艺操作，但应对细胞进行有效的识别和隔离，待检验合格后方可对由该采集物制备的干细胞和干细胞制剂予以放行。　　第二节 制 备　　第三十二条制备机构应对每种干细胞制剂制备的全过程，建立相应的工艺规程，包括干细胞的富集、扩增、诱导、收获、冻存、分装等操作，并进行全面的工艺研究和验证。　　第三十三条干细胞制剂制备的工艺规程内容包括但不限于：　　(一)细胞的富集、分离、纯化、扩增和传代、冻存、细胞系细胞库的建立、向功能性细胞定向分化 　　(二)培养基、辅料和包材的选择标准及使用 　　(三)细胞复苏、分装和标记，以及残留物去除 　　(四)干细胞制剂成分及含量 　　(五)干细胞制剂制备标准操作规程 　　(六)过程质量控制点和中间制剂的质量标准 　　(七)终制剂质量标准 　　(八)包装标准操作规程。　　第三十四条应为干细胞制剂的制备设立专用和独立的制备区、制备设施和设备。应建立干细胞制剂制备区、质量控制区和包装区的标识制度，包括但不限于工序标识、功能间/区标识、状态标识、警示标识、应急处置标识等。　　第三十五条应按照工艺规程设计相应操作区的洁净度级别，非完全密封状态下的细胞操作(如分离、培养、灌装等)以及与细胞直接接触的无法终端灭菌的试剂和器具的操作，应在 B 级背景下的 A 级环境中进行。　　第三十六条应建立严格的清场操作规程和建立完整的洁净区环境监测操作规程，并对每项监测指标制定相应的检测方法和频次。　　第三十七条应合理安排制备工序的操作区域，不同质量标准或者工艺规程的干细胞制剂应在不同的房间操作 试剂的准备，干细胞的分离、扩增和诱导分化，干细胞制剂的配制和灌装或分装等操作，应在洁净区内分区域进行 不同批次的干细胞制剂不应同一时间在同一 A 级区域内操作。　　第三十八条干细胞制剂应严格按照经批准的重悬液的配方进行配制和灌装，应尽可能缩短从细胞消化到制剂灌装的间隔时间。　　第三十九条根据干细胞的特性及制备工艺，应在工艺的不同阶段(包括细胞库)制定相应的过程控制项目及质量标准，包括无菌、支原体、内外源病毒、细胞鉴别、细胞活力及生长特性、细胞纯度及均一性、细胞染色体核型、生物学效力、临床适应证特定指标、异常免疫学反应、内毒素及致瘤性等检测。　　第四十条应建立干细胞制剂批次和记录的管理规程。每批干细胞制剂均应编制唯一的批号，并且该批号能追溯到该批次干细胞相应的所有制备信息。　　第四十一条为保证干细胞制剂批次的稳定性、安全性和有效性，可根据干细胞的特性、制备工艺及预期用途，建立细胞库分级管理体系，如胚胎干细胞可建立细胞种子、主细胞库和工作细胞库的三级管理体系。　　第四十二条应根据干细胞制剂的质量标准及制备工艺，明确限定各级细胞库和干细胞制剂所使用的干细胞的传代水平(细胞群体倍增水平或传代次数)，不得随意变更。　　第三节 培养基与其他　　第四十三条制备机构应建立并执行物料的采购、接收、检验、贮存、发放、使用和运输的标准操作规程，并予以记录。关键物料应得到药品监督管理部门的注册批准，进口物料应同时符合国家进口管理规定。　　第四十四条干细胞制备所用物料的供应商应经过质量管理部门的供应商评估并合格。物料接收前应确认供应商提供的该批物料的说明文件完整并符合相应的质量管理要求，说明文件包括但不限于说明书、合格证、组成成分说明、质量分析证书和化学品安全数据说　　明书等。如需要，应由专业检定机构对物料进行质量检验，并出具检验报告。　　第四十五条与干细胞直接接触的物料，应选择国家批准的临床应用产品，并建立抽样检验制度，达到所规定的质量标准之后由质量管理部放行以供使用。如无国家批准的临床应用产品，应符合国家相关管理要求。　　第四十六条干细胞体外扩增培养所用的培养基应无菌、无病毒、无支原体及低内毒素，干细胞制剂中残留的培养基成分对受者应无不良影响。　　第四十七条培养基在满足干细胞正常生长的情况下，不得影响干细胞的生物学活性。　　第四十八条应尽可能避免在干细胞培养过程中使用人源或动物源性材料。如需要使用动物血清，应确保其无特定动物源性病毒污染。如需要使用猪源胰酶，应确保其无猪源细小病毒污染。严禁使用来自海绵体状脑病疫区的牛血清。　　第四十九条若培养基中含有人的血液成分，如白蛋白、转铁蛋白等生物源性成分，应尽量采用国家已批准的可临床应用的产品，并明确其来源、批号、制造商及制造商提供的质量检定合格报告。　　第五十条干细胞培养过程中，尤其是在最后的培养阶段中，除非必要，不应使用抗生素。　　第五十一条 干细胞制剂制备过程中所用的培养用液体，如盐溶液、消化液、缓冲液、水等，所有成分应满足要求的纯度级别(例如水应符合注射用水标准)，并应无菌、无病毒、无支原体及低内毒素。　　第五十二条干细胞制剂中的重悬液成分应采用国家已批准的可临床应用的产品，每种成分应满足现行《中华人民共和国药典》的质量要求。如无临床应用产品，应符合国家相关管理要求。　　第五十三条用于特定病原体(HIV、HBV、HCV、EBV、HTLV、CMV 及梅毒螺旋体等)检查的体外诊断试剂，应使用国家批准的试剂，并严格按照检测规范进行检测。　　第五章 干细胞制剂的贮存和放行　　第一节 贮 存　　第五十四条制备机构应建立干细胞中间制剂和终制剂贮存管理规程，并有足够的贮存容器。贮存方式应满足质量要求，应能防止差错、混淆、污染和交叉污染。未经检验合格批准放行的干细胞制剂，应在待检区域中隔离存放。　　第五十五条干细胞制剂的贮存区应建立标准规程管理人员进出、安全保障、应急事故处理等。干细胞制剂的入库、出库应建立台账，并进行相关记录信息的核对确认，交接双方应遵循交接标准规程操作。　　第五十六条 干细胞制剂在制备完成至检验合格批准放行阶段的贮存，应根据干细胞制剂的生物学特性确定贮存方式和管理规程。干细胞制剂的冻存、贮存、复苏等应有记录。　　(一)无需冻存的干细胞制剂，因质检、包装等原因需暂时存放的，其暂存期间的环境要求、安全保障、转移交接等应按相应的管理规程执行并记录。　　(二)因工艺规程、检测时间、预定用途等原因，需深低温冻存后再进入放行程序的干细胞制剂，无论是否需要复苏，都应按照细胞库质量管理规范执行并记录。　　第五十七条干细胞制剂深低温贮存库的设计和建造应确保良好的存放条件，冷冻保存温度不应高于 –150 ℃，应有通风和照明设施，以及必要的气体监控设施。　　第五十八条干细胞制剂深低温贮存库应根据所储存干细胞制剂的制备阶段、生物学特性、储存目的和终极应用目标采用分级管理制度。分级管理的级别包括但不限于初级细胞库，主细胞库和工作细胞库。不同的分级库应根据各自用途制定相应的质量标准、检验项目和管理规程。　　第二节 放 行　　第五十九条制备机构应在符合干细胞制剂质量标准的基础上制定干细胞制剂的放行标准。　　第六十条干细胞制剂的放行应至少符合以下要求：　　(一)在批准放行前，应对每批干细胞进行质量评价 　　(二)干细胞制剂的质量评价应有明确的合格结论 　　(三)每批干细胞制剂均应由质量受权人签名批准放行。　　第六十一条干细胞制剂放行前的质量评价包括但不限于：　　(一)干细胞来源供者筛查和采集物检测结果符合相应标准要求 　　(二)试剂、耗材等物料的检测结果符合相应标准要求 　　(三)干细胞制剂在冻存前或收获发放前各项质量控制点均符合质量标准要求，所有必须的检查、检测已完成，相关的管理人员已签字确认 　　(四)主要制备工艺和检验方法已经过验证 　　(五)留样检测已启动，制备记录真实完整 　　(六)干细胞制剂的制备全过程符合其要求的环境下进行 　　(七)变更已经经过质量管理部门批准并已按照相关规程处理完毕 　　(八)对变更或偏差已完成所有必要的取样、检查、检验和审核 　　(九)所有与该批次干细胞制剂有关的偏差均已有明确的解释或说明，或者已经过彻底调查和适当处理 如偏差还涉及其他批次制剂，也一并得到了处理 　　(十)经过质量管理部门综合评价后，由质量受权人确认准予放行。　　第六章 运输与追溯　　第一节 采集物的运输　　第六十二条采集物从采集机构到制备机构的运输应保证采集物的完好以及运输人员的健康和安全。　　第六十三条采集物的运输容器应能够将运输过程中的温度控制在规定的标准范围内并减少运输过程中温度的变化。运输容器的性能应定期进行确认和验证，以确保其能为采集物提供符合要求的贮运条件。　　第六十四条采集物运输容器表面应有明确的标识，包括但不限于：内容物名称、发运人及联系方式，接收人及联系方式、运输条件、警示标志等。　　第六十五条采集物运输应有完整运输记录。根据运输记录，应能够追溯采集医疗机构的名称、采集物的名称、采集物的采集时间、离开采集医疗机构的时间、送达干细胞制剂制备机构时间以及交接的确认。　　第六十六条运输过程中应保证采集物不被放射线照射。　　第二节 干细胞制剂的运输　　第六十七条干细胞制剂的运输条件应经过验证，应尽量缩短干细胞制剂从制备机构到应用机构的运输时间。应建立发生紧急或意外情况时的运输应急预案，确保干细胞制剂运抵使用时仍在有效期内。　　第六十八条每批次干细胞制剂均应有发运记录，并能够追踪每批次干细胞制剂的运输过程，必要时能够及时全部追回。发运记录内容应包括但不限于：干细胞制剂名称、批号、规格、数量、接收单位和地址、发运方及联系方式、承运方及联系方式、发运时间、运输方式等。　　第六十九条对于存在安全隐患决定召回的干细胞制剂，或者未使用和使用后剩余的干细胞制剂，应就地封存，由制备机构进行合法和符合伦理要求的处置并记录存档。　　第七十条制备机构如委托第三方机构运输干细胞制剂，应评估承运机构的资质。承运人应接受制备机构相应的培训确保其可按照细胞制剂运输要求完成运输过程。　　第三节 干细胞制剂的标识　　第七十一条制备机构应建立并执行完整的干细胞制剂编码标识系统，确保干细胞制剂的唯一性和可追溯性。　　第七十二条干细胞制剂编码与标识应由采集物的唯一捐献码和制剂识别码及状态标识信息等组成。干细胞制剂标识内容至少应包含以下信息：干细胞制剂唯一性字母或数字识别码、干细胞制剂名称、属性(自体使用或异体使用)、规格、细胞数量、使用方式、制备机构及联系方式、制备日期及时间、失效日期及时间、贮存温度等环境要求、生物危害　　标识以及其他特殊描述说明(如适用)等。　　第七十三条 应建立完善的标识的制版、批准、印制、发放、使用、回收销毁的管理规程，确保标识的准确性和唯一性。　　第七十四条 应明确规定不同标识的使用用途和使用节点，确保在采集物的采集和接收，干细胞制剂的制备、冻存、贮存和发运时正确使用相应的标识，使用时应确保至少双人或由经验证的机器识别系统进行审核确认。　　第四节 记录与档案管理　　第七十五条记录系统应涵盖从采集物采集至输入(或植入)到受者体内的全过程。　　第七十六条每批次干细胞制剂应有批记录，包括批接受记录、批制备记录、批包装记录、批检验记录和批干细胞制剂放行审核记录等与本批次干细胞制剂有关的记录。　　第七十七条每批干细胞制剂的质量检验记录应包括采集物、中间制剂(种子细胞、主细胞库、工作细胞库等)和干细胞制剂的检验记录，可追溯该批次干细胞制剂所有相关的质量检验结果。　　第七十八条制备记录的要素应至少包括：细胞制剂编码、关键制备参数、制备工序实施日期和时间、制备操作人员、关键试剂耗材的名称、货号、生产商/供应商、批号和有效期、数量、使用仪器设备的信息、审核人员等。　　第七十九条应确保相关记录内容的受控管理，保证纸质记录和电子版备份记录的真实性、保密性和可追溯性。　　第八十条干细胞制剂的批记录纸质记录和电子版备份记录应保存至这批干细胞制剂提取使用后的三十年，电子影像记录应至少保存三年。　　第七章 附 则　　第八十一条本规范为制备机构开展干细胞制剂制备质量管理的基本要求。机构应当根据各自的实际情况确定是否还需要遵照其他的规范。　　第八十二条本规范下列术语含义是：　　原代培养：从一个或多个器官或组织直接分离细胞开始培养，到通过亚培养获得细胞系之前的阶段。　　细胞系：从组织或原始培养物中通过亚培养或者系列传代培养产生的具备指定特性的细胞群，可用于细胞储存。　　群体倍增水平：一个细胞系自开始体外培养至一段时间后的群体倍增数。群体倍增数 = log10(N/N0)× 3.33，其中 N0 是该细胞系起始培养时的细胞数 N 是该细胞系生长一段时间后的细胞数。　　胚胎干细胞：一类来源于胚胎，处于未分化状态，可以长期自我分化和自我更新，具有在一定条件下分化形成各种组织细胞潜能的细胞。　　诱导的多能性干细胞：一类通过基因转染等细胞重编程技术人工诱导获得的，具有类似于胚胎干细胞多能性分化潜力的干细胞。　　成体干细胞：位于各种分化组织中未分化的干细胞，这类干细胞具有有限的自我更新和分化潜力。　　批：在同一生产周期中，用同一来源、同一方法制备出来的一定数量的一批制品，在规定限度内，批具有同一性质(均一性)和同一数量。　　采集：使用经批准的方法从供者获得细胞或其来源组织或器官的行为，包括但不限于，捐赠者的血浆分离置换、骨髓、 脐带血收集、器官或组织获得。　　采集物：从供者身上采集的或从相关提供机构获得的未经过操作、加工或制备的细胞、组织或器官。　　异体供者：所提供的采集物或者细胞制备的制剂有可能用于另一个体的供者。异体供者可以与接受者有遗传关系，也可以没有遗传关系。　　自体供者：所提供的采集物或者细胞制备的制剂将只限于用于自身的供者。　　洁净区：洁净区在洁净厂房设计规范 GB50073-2001 的定义为：空气悬浮粒子浓度受控的限定空间。它的建造和使用应减少空间内诱入、产生及滞留粒子。空间内其他有关参数如温度、湿度、压力等按要求进行控制。洁净区可以是开放式或封闭式。洁净度标准与现行版 GMP 一致。　　污染：从周围环境或其他细胞治疗产品引入的有害化学或生物物质。　　隔离：为了防止污染和(或)交叉感染，将细胞、采集物或物料存放在规定的物理分隔区域内，或者用其他标准程序加以鉴别的操作。　　第八十三条 本规范自发布之日实行，由中国医药生物技术协会负责解释。　中国医药生物技术协会 2016年10月25日

7月29日，在第十二届细胞产业大会的单细胞多组学与临床应用分论坛上，华大智造重磅发布其在单细胞领域的两款最新产品，单细胞液滴生成仪 DNBelab C-TaiM 4（泰山），以及单细胞表观组学产品scATAC建库试剂盒。单细胞液滴生成仪 DNBelab C-TaiM 4（左）及单细胞表观组学产品scATAC建库试剂盒（右）这是华大智造继DNBelab C系列高通量单细胞转录组建库试剂盒产品后，单细胞组学全流程产品家族补充的重要产品，更为完善的产品组合也将更好地赋能全球生命科学实验室开启规模化、标准化的单细胞多组学研究。两款新品加持单细胞测序全流程本次上新的单细胞液滴生成仪DNBelab C-TaiM 4 （以下简称TaiM4）的命名灵感来源自“泰山”，传递了华大智造不断攀登技术极限的理念。TaiM 4能为细胞或细胞核的分离和标签提供稳定的动力。该仪器配备4个独立控制的微流控通路，同时兼容单细胞ATAC文库和3’ RNA文库制备需求，支持1-4个样本的灵活上样。它延续了华大智造单细胞产品小巧轻便、即开即用的优点，适用于2500米以下的海拔实验环境。此外，该设备在单细胞ATAC文库制备过程中的细胞核分离、标记过程仅需6分钟；在单细胞3’RNA文库制备过程中的细胞核分离、标记过程仅需9分钟。华大智造单细胞液滴生成仪DNBelab C-TaiM 4另外一款上新产品是DNBelab C系列高通量单细胞ATAC文库制备试剂盒套装及配套的微流控载片。和DNBelab C-TaiM4 单细胞液滴生成仪配套使用，可以完成数万细胞核的ATAC文库制备。试剂盒套装包含液滴生成使用的百万级标签磁珠、自主开发的液滴生成油、以及适配华大智造测序仪的文库制备试剂等。该产品基于精密压力驱动微流控技术，污染率低，可完成高质量单细胞ATAC文库的制备和数据产出。可用于免疫组学、肿瘤、神经科学、发育生物学等领域的单细胞研究。两篇Nature 科研应用表现不俗值得一提的是，scATAC建库试剂盒已经在科研应用中牛刀小试，早期试用的结果已用于2篇Nature文章中，产品数据表现不俗。一站式平台 助力单细胞多组学标准化、规模化华大智造作为生命科技核心工具缔造者，能够为单细胞测序全流程提供独一无二的一站式平台。其中，针对细胞/细胞核制备环节，华大智造提供小鼠多组织解离试剂盒和50+物种组织解离方案指南；此外，已经发布的DNBelab C系列3’ RNA建库产品，已经产出了 30000+例样本数据，覆盖了40多种物种类型和300多种组织类型，重磅预告了不同物种组织的3’ RNA数据表现白名单，并展示了部分数据；在数据分析环节，提供配套的单细胞高通量、高精度多模态分析平台，不仅能够对单细胞测序数据进行简单的质控，还支持更多功能的分析和多组学数据的整合。华大智造产品市场中心总监汪婧婧博士在发布会现场表示：“华大智造在单细胞领域，除了为科研人员提供单细胞建库产品和基因测序产品MGISEQ-2000、DNBSEQ-T7、DNBSEQ-T20外，还能够提供自动化文库制备系统MGISP-100，将复杂的单细胞文库制备过程转移到自动化平台一键运行，为单细胞行业引入了全新的自动化概念，这将开启单细胞湿实验标准化时代的到来，我们也坚信单细胞多组学标准化、规模化时代终将来临。”汪婧婧博士华大智造产品市场中心总监单细胞产品家族图自动化建库流程图在单细胞产品领域，华大智造通过其率先发布的DNBelab C系列产品，已收获了众多企业及科研用户的好评。在过去的一年时间里，国内已有9个企业认证成为华大智造单细胞产品服务商，终端使用客户数量100多家。在科研产出上，基于华大智造单细胞测序平台，已累计产出高质量文章50多篇，其中包括2篇Nature，1篇Cell，其中有21篇文章IF＞10，充分证明了该单细胞平台性能的优越性。小结：单细胞技术是当前测序领域最火的技术之一，相关公司超过50家，其中不乏众多国产企业。作为国内基因测序上游龙头企业，华大智造并非在单细胞领域走的最快的，但其追赶之势十分迅猛，加上本身先天平台优势，大有后来者居上的势头。如其所言：“未来，华大智造将进一步深耕单细胞组学领域，发挥自身在基因测序设备领域、实验室自动化领域的优势，为规模化的科学研究、为单细胞组学全面进入临床及精准健康研究，提供更为优质、标准的系列产品组合，赋能单细胞多组学标准化、规模化时代”。

人类诱导多能干细胞 (hiPSC) 是一类通过基因编辑技术（如 CRISPR-Cas9）对已经高度分化的人体细胞重新逆分化得到的多能性干细胞。hiPSC的出现为科学家构建复杂的疾病模型和推进药物发现提供了有利的工具。 然而，传统的hiPSC细胞系的构建与培养过程往往操作复杂且耗时耗力。特别是从异质编辑细胞池中构建的克隆hiPSC系的培养受到了传统细胞培养方法的桎梏，很难构建一个高效的hiPSC构建与培养工作流程。此外，现有的单细胞分离和培养方法通常对细胞的处理条件苛刻，操作步骤繁琐，不能充分保证单克隆性。 为应对hiPSC细胞系构建与培养过程中的诸多挑战，IotaSicences公司采用了以GRID技术为核心的高度自动化的单细胞可视化分选培养系统isoCell来构建 hiPSC系的分选与培养平台，并在不同培养基条件下对hiPSC进行了单细胞分选与培养研究。图1 单细胞可视化分选培养系统isoCell实物图 以isoCell为核心的hiPSC细胞分选与培养平台 isoCell是一款基于GRID技术的高度自动化细胞分选与培养平台。GRID是指在细胞培养基上采用FC40液体分隔出的网格小室，体积小，光学透明度高，可以容纳细胞在内生长，且各个小室之间物质不流通。isoCell系统配备了荧光和成像系统，用于在整个克隆工作流程中记录 GRID 小室的图像（见下图）。isoCell 可自动执行所有液体处理步骤，包括构建 GRID、将单细胞注射到GRID小室中以及交换培养基和收获单克隆集落。并且，isoCell可在整个工作流程中自动检测每一个 GRID 小室，并确保每一个单克隆hiPSC细胞系来源于单个细胞。 图2 GRID实物图 材料与方法 在分别铺了Laminin-521、Vitronectin-N和iMatrix 细胞培养基质的60毫米培养皿上制备的GRID网格以待使用。制备hiPSC的单细胞悬浮液，并使用 isoCell全自动地将细胞铺在GRID上（种植）。 使用isoCell自带的显微镜鉴定每个GRID室并标记每个包含单个细胞（第 0 天）的室，将该培养皿放入培养箱培养。在第3天，将标记的含有单个细胞的GRID小室加满600 nl培养基。从第5天开始，每天观察标记单细胞的GRID小室，并对选中的GRID小室补充培养基。最后，使用isoCell观察并标记构成了hiPSC单细胞群落的GRID小室，使用isoCell全自动收获标记的GRID小室中的hiPSC细胞（通常在 6-8 天之间）。 图3 以isoCell为核心的hiPSC细胞分选与培养平台工作流程图 高效的hiPSCS细胞分选与培养平台 按照上述的工作流程，利用三种不同的培养基质（包括 VTN-N、LMN-521 和 iMatrix）构建并培养了两个独立的hiPSC细胞系，并评估所得细胞的克隆效率。如图4所示，两个不同的hiPSC测试系在不同培养基质条件下，均在GRID室中显示出非常高的克隆效率，这表明采用GRID小室低容量培养方法和细胞的自动化温和处理可产生非常适合单细胞高效生长的培养环境。 图4 GRID中的单细胞 hiPSC 克隆效率（克隆效率表示培养第5天时单细胞长成细胞群落数占第0天单细胞数的百分比） 结论 以isoCell构建的hiPSC细胞分选与培养平台可以对hiPSC细胞进行全自动化且温和地单细胞分选与培养。通过isoCell特有的GRID小室网格技术与可视化分选相结合，可以确保每一个单克隆hiPSC细胞系均来自单个细胞，且isoCell的分选与培养条件温和，hiPSC单克隆细胞系成活率高。 单细胞可视化分选系统isoCell的优势：- 全自动化流程- 操作条件温和，对单细胞无损伤- 全培养、分析流程可追踪- 单细胞分离效率高达100%- 单克隆细胞系构建成活率高- 直接转移到PCR管或96孔板- 结构紧凑，体积小 单细胞可视化分选培养系统-isoCell已在Cell、Advanced Science、Small Methods、Nature Communications等知名期刊发表多篇文章，如下摘引了近年五篇具有代表性的文献和大家分享。 Soitu C, Stovall‐Kurtz N, Deroy C, et al. Jet‐Printing Microfluidic Devices on Demand[J]. Advanced Science, 2020, 7(23): 2001854.Gangoso E, Southgate B, Bradley L, et al. Glioblastomas acquire myeloid-affiliated transcriptional programs via epigenetic immunoediting to elicit immune evasion[J]. Cell, 2021, 184(9): 2454-2470. e26.Deroy C, Nebuloni F, Cook P R, et al. Microfluidics on Standard Petri Dishes for Bioscientists[J]. Small Methods, 2021, 5(11): 2100724.Deroy C, Wheeler J H R, Rumianek A N, et al. Reconfigurable microfluidic circuits for isolating and retrieving cells of interest[J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2022, 14(22): 25209-25219.Oliveira N M, Wheeler J H R, Deroy C, et al. Suicidal chemotaxis in bacteria[J]. Nature Communications, 2022, 13(1): 7608. 样机体验 为更好地服务中国科研工作者，Quantum Design 中国也建立了样机演示实验室，将为大家提供为专业的售前、销售、售后技术支持，欢迎各位老师垂询！ 用户名单 用户评价 路易莎埃姆斯，研究科学家：The Native Antigen Company（LGC 临床诊断集团旗下公司） “使用 isoCell 进行单细胞克隆工作从一开始就简单可靠，并且已无缝地融入我们的流程中。 该程序对细胞很温和，我们看到非常好的存活率，可以筛选大量克隆。 我们收到的客户服务是优质的。”

介绍细胞系生成通常被认为是一个漫长而乏味的过程，需要大量的劳动力和材料投资。在细胞系开发中，尤其是在单克隆抗体和蛋白质治疗剂的生产中，需要具有高活性的单克隆性和稳健的克隆生长。自动细胞分配和细胞计数技术可提高通量，同时减少分配、识别和验证每孔单个细胞是否存在所需的时间和劳动力。本研究比较了使用自动Formulatrix Tempest液体分配器和Brooks Celigo成像细胞仪与电动手动移液和手动分析将CHO细胞分配和分析到384孔板的情况。 方法和材料I. 细胞培养为了制备单细胞接种和克隆生长的细胞， CHO-K1YFP细胞在T-25c㎡的烧瓶中用含有10% FBS和1%G418的F-12K培养基进行贴壁培养。细胞在37℃和98%的相对湿度下，置于5%的二氧化碳中培养。为了进行活性研究，将悬浮的CHO（CHOs）细胞培养在125mL的锥形瓶（Corning #430421）中，其中含有30mL CD CHO培养基（Gibco #10743），还添加了20mM GlutaMax（Gibco #35050-061）和1%HT（Gibco #11067）。细胞在37°C和98%相对湿度的8%CO2中置于轨道振动台（130 rpm）上培养。II. 使用Tempest或手动移液器进行单细胞接种用胰蛋白酶-EDTA (0.25%/0.5 mM) 收集表达黄色荧光蛋白 (YFP) 的 CHO-K1 细胞并重新悬浮在培养基中。细胞通过 40 µm 细胞过滤网 (BD Falcon #352340) 传代两次以获得没有聚集体的细胞悬浮液，然后使用血细胞计数器计数并稀释至200个细胞/mL。使用来自Formulatrix的 Tempest或手持式Matrix电子多通道移液器（Thermo Fisher #2231，12通道384均衡器移液器，2-125 µl）接种培养基和细胞。Formulatrix Tempest是一种非接触式的散装试剂分配器，可通过96个单独控制的喷嘴同时分配多达12种独立成分的任何体积。Tempest正在申请专利的微流控阀组利用正排量技术分配离散的液体体积，能够准确无误地分配到96孔、384孔和1536孔板。此外，使用标准移液器吸头作为源储液器可将死体积减少到100微升，是珍贵样品分配的最佳选择。在细胞接种之前，将25µL/孔的培养基分装到384孔板（Corning #3542）。随后以5微升/孔的细胞悬液（每种分配方法n=3）接种。将板离心以收集每个孔底部的细胞，然后孵化直到成像。III. 使用Brooks Celígo S进行单细胞接种成像使用Celígo成像细胞仪对孔板进行处理，以检测每孔单细胞和克隆生长。Brooks Celígo成像细胞仪是一种高速、易用、多通道亮场和荧光成像细胞仪，用于高通量、全孔细胞图像采集和多孔板处理。Celígo提供明 场成像和三通道荧光成像功能，用于可视化和量化烧瓶和6孔至1536孔微孔板中的细胞反应。该系统提供1µm/像素的全分辨率。整个Celígo是为明场和荧光成像而开发的，它结合了专有的光学器件和软件，可以在整个孔板一直到孔板边缘以一致的对比度对细胞进行成像和识别，这样能够识别细胞的位置和面积，而不需要额外的潜在细胞毒性荧光探针。在第0天使用双通道采集应用程序对孔板进行成像，使用荧光图像进行细胞检测，并使用明场图像对单细胞存在进行视觉验证。经过四天的培养期后，在双通道采集应用中再次对平板成像。明场成像用于确认克隆生长。IV. 活性和接种效率取决于Celígo在培养箱中过夜恢复后，比较了两种分配方法之间的活性测量。对于过夜恢复后的活性测定，将CHO细胞制备成细胞悬液，并使用Tempest 或电动移液器以每孔 500 个细胞的浓度移液到 384 孔板（Corning 3542）中。将板温育过夜。将浓度为 5µg/mL (8uM) 的 Hoechst 33342（Life Technologies，#H3570）和 2µg/mL(3uM)的碘化丙啶(PI)（Life Technologies，#P3566）加入孔中并孵育 30 分钟。使用Celígo对板进行成像和分析其活性。数据和结果I. 单细胞接种为了比较手持式电动移液器和Formulatrix Tempest之间细胞的正确分 配，对检测到单个细胞的孔数进行了量化。用电动移液器手动接种36%（3%CV）的单细胞孔板，Tempest接种32%（2%CV）的单细胞孔板（图1）。两种接种方法在单细胞接种中表现相同，无统计学差异（P0.01，n=3）。II. 克隆生长通过在第0天和第4天对单个细胞生长为一个菌落的孔进行视觉跟踪，可以很容易地用Celígo监测克隆生长的比较。图2显示了单个细胞生长成菌落的代表性图像。细胞和菌落都可以在Celígo的明场和荧光通道中看到。这允许对手持电动移液器和Formulatrix Tempest之间的克隆生长进行量化评估，其中91%（6%CV）和91%（4%CV）的单个细胞分别生长成一个菌落（图3）。这些结果表明，两种分配细胞的方法在克隆生长方面没有统计学差异（P0.01，n=3）。III. Celígo检测活性和接种效率对于两种接种方法，使用CHO-S细胞监测细胞活性。在一夜恢复期内，Tempest接种法的存活率测量值为97.4%（1.1%CV），电动移液器接种法的存活率测量值为98.9%（0.7%CV）（表1）。两种方法在接种后恢复得同样好。与平板上的细胞计数相比，Formulatrix Tempest的重复性更好，CV为10%，而电动手动移液器的CV为17%（表1）。IV. 手动与自动液体分配和孔板分析的对比与手动分配和孔板分析相比，自动化分配和孔板分析过程可大幅提高吞吐量。将细胞手动分配到384孔板大约需要3分钟，并且会受到更大的可变性和人为错误的影响。Tempest可以在大约40秒内将细胞有效地分配到384孔板上，节省了时间并提高了准确性。手动分析孔板以验证单个细胞的存在，这一劳动密集型过程每孔大约需要30秒，或384孔板需要192分钟，而Celigo S在大约7分钟内完成图像采集和分析过程。自动分配和分析384孔板大约需要8分钟，而手动分配和分析大约需要195分钟。因此，自动化过程将分配细胞和分析孔中是否存在单个细胞的产量提高了约25倍（图4）。总结本研究的目的是评估自动液体分配系统与基于孔板的细胞仪在单克隆细胞系开发中的使用。 要开发单克隆细胞系，必须首先分配实验孔板，然后验证每孔是否存在单个细胞。这些步骤可能既费时又费力，并且会大大增加实验费用。将 Formulatrix Tempest 液体分配器与 Brooks CeligoS 成像细胞仪相结合，创建了一个快速、高效和可靠的系统，用于分配和识别具有单细胞的孔。Formulatrix Tempest 在每块板不到 40 秒的时间内自动将细胞分配到 384 孔板，这比电动移液器分配快两分钟多。此外，使用Tempest消除了手动分配所需的材料槽和移液器吸头等材料的额外消耗成本。通过 Celígo S 自动评分对每孔细胞或菌落数量进行量化。结果分析表明，Formulatrix Tempest 将单个细胞分配到32% 的孔中，同时保持细胞活性。 与手动移液器分配和每孔单细胞分析相比，将两台机器一起使用可节省 95%以上的时间。

Xevo MRT新品应用速递 在今年ASMS美国质谱年会上，由英国萨里大学和沃特世联合发布的一篇海报，介绍了一套单细胞脂质组学工作流程，这套工作流程采用ACQUITY™ Premier液相色谱(LC)与新型多反射飞行时间质谱Xevo™ MRT系统，以脂质标准品和培养的人白血病单核细胞系建立而得。 结果表明： Xevo MRT可实现单细胞脂质组学分析，具有优异的分辨率、灵敏度、动态范围和质量精度； FACS提供了一种将细胞制备用于单细胞MS分析的精简工作流程； 展示了一套可对各种细胞类型进行单细胞分析的精简LC-MS工作流程。 参数研究和优化 使用浓度为0.5 - 1,000 ng/mL的EquiSPLASH® (Avanti Polar Lipids)稀释系列，在不同参数下进行LC和MS性能基准测试。后续实验选择以粗体突出显示的条件。 色谱柱填料：C18、C30、C8 色谱柱柱长：50 mm、100 mm、150 mm 色谱柱内径：2.1 mm和1 mm 梯度时长：3.7 min、6 min、12 min、19 min、28 min、29 min 流速：0.1 - 0.4 mL/min 图1.浓度为1,000 – 5 ng/mL的18:1 d7 LPC的平均总峰面积。 图2.(A)18:1 d7 LPC的提取离子流图(EIC)和(B)相应的质谱图。50 pg，12 min梯度，10 Hz，MSE，C18 CSH(1.7 µm 2.1×100 mm)。 左右滑动查看更多 工作流程 单细胞MS工作流程 选择THP-1、C1R和Jurkat细胞系进行研究。用含有EquiSPLASH(100 ng/mL)的IPA提取混合细胞，并稀释至10,000、1000、100、10和1个细胞/µL的浓度。 此外，通过荧光激活细胞分选术(FACS)将细胞以1、10和100个细胞/孔的数量分配到96孔板中，并用含有EquiSPLASH(10 ng/mL)的IPA进行提取。使用Xevo MRT分析脂质组，并通过Progenesis™ QI、MetaboAnalyst和Lipostar等软件包进行数据分析。 结果 1 THP-1、C1R和Jurkat的BPI显示各类脂质的性质和丰度存在明显差异(图3)。这些细胞的不同特征亦可通过PLS-DA图(未显示)予以确证。从该图可看出，除空白、媒介、内标物和QC样品之外，这些细胞类型相对于彼此的离散位置。 图3.(A)THP-1、(B)C1R和(C) Jurkat(10,000份混合细胞提取)细胞的BPI色谱图。 2 此外，在1、10和100个细胞之间，可以观察到混合细胞稀释法和通过FACS制备的细胞之间存在明显分离(图4)。 图4.(A)通过FACS制备的C1R细胞所得PLS-DA图，(B)使用混合细胞稀释法制备的C1R细胞所得PLS-DA图。使用Progenesis QI鉴定脂质，并借助MetaboAnalyst完成统计分析和图像创建。 3 Lipostar以高置信度标注了各种脂质类别，如图5中的TG 52:4所示，其置信度得分为89.76。 图5.(A)TG 52:4的匹配碎片离子(蓝色，原始MS2，绿色理论碎片离子)，置信度得分为89.76。使用Lipostar和MS/MS验证器工具标注THP-1混合细胞稀释法结果。(B)来自THP-1(10,000个细胞)的MS1数据；(C)来自THP-1(1个细胞)的MS1数据。 4 可以使用LC-MS Toolkit从原始数据中探寻标注的脂质，例如PC 36:2(图6)，此标注可以在整个稀释系列中看到。 图6.(A)从10,000个细胞到THP-1的单个细胞中所提取稀释混合细胞的PC 36:2([M+H]+，计算值m/z 786.6007)总强度。(B)为PC 36:2的代表性MS1谱图，质量精度为380 ppb。 5 THP-1(1000个细胞)的脂质特征突显出从细胞中所提取脂质的样品内动态范围，以及使用Xevo MRT检测超过5个数量级的此类脂质的能力，如图7所示。 图7.Xevo MRT检测到的THP-1细胞内脂质的动态范围。定量曲线由具有通过内部数据库鉴定所得初步鉴定结果的脂质特征组成。 后记 近年来，前沿科学工作者们越来越关注单细胞研究，这也对质谱仪提出了更高的要求，要求其有更高的灵敏度、分辨率及分析速度等，沃特世新发布的多反射高分辨质谱Xevo MRT在较高的扫描速度如100Hz下可实现十万质量分辨率，可对单细胞脂质组进行分析。 本文中使用了Lipostar新软件，可对脂质结构进行快速确认，具体功能详情介绍参见：代谢组学和脂质组学全新软件MARS和Lipostar 2，现在这两款新软件也在限时试用中，可扫描下方二维码进行申请。 △扫描申请试用啦！ 相关阅读： 沃特世推出Xevo MRT质谱仪，为高速、高分辨率的质谱分析树立全新性能标杆 沃特世Xevo MRT新产品发布会在北京圆满举行

随着单细胞测序技术的快速发展，科研工作者们可对每个独一无二的单细胞进行分析，认识到细胞间的异质性，深入了解如胚胎发育早期的分化特征、肿瘤微环境中的非均质性、罕见循环肿瘤细胞的转录组等等以往传统高通量测序方法难以攻克的领域。单细胞分析的应用已进入百花齐放的时代，涵括神经生物学、癌症、免疫学、微生物学、胚胎发育、临床诊断等多个领域。单细胞测序分析的第一步，即是单细胞样品的制备，同时确保其生物完整性不被破坏。高质量的样品制备影响着后续单细胞分析成功与否。高活性、无细胞碎片且均一的单细胞悬液可使测序结果在完整性、真实性、数据可重复性得到提升。最常见细胞分离的方法可用MACS磁珠或流式细胞仪进行目的细胞分选与富集。单细胞测序流程利用流式细胞分选法富集目的细胞群体缩小研究范围，对单细胞群体可进一步精细化解读。尤其在研究罕见细胞族群，单细胞测序前先以流式细胞分选富集稀有细胞，可大大增加实验数据真实性与可靠性。现今已有愈来愈多单细胞测序研究结合流式细胞分选，筛选目的细胞、过滤死细胞减少样本中無效细胞的比例，提高单细胞文库构建的成功率以及后续的数据质量，让单细胞测序更有深度与广度分析实验数据，推动进一步研究范畴。传统高压液滴分选仪分选单细胞传统液滴式流式细胞分选(Droplet cell sorter)，将目的细胞利用适宜的荧光标记。经荧光染色或标记的单细胞悬液，被高压压入流动室内，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出。通过相应荧光检测及充电，获得目的细胞，实现单细胞分离。然而操作过程中，分选的细胞相继受到高压、充电带有电荷、减压的刺激，常导致分选的目的细胞在分类过程中的损伤和溶解，活细胞回收率不高；即使回收的活细胞也因分选过程受刺激影响细胞基因转录图谱表现，无法维持其生物完整性。传统高压液滴分选仪进行单细胞分选Adapted from Technologies for Single-Cell IsolationInt. J. Mol. Sci. 2015, 16美天旎MACSQuant Tyto 革命性的细胞分选仪专利的微芯片技术，精准地控制阀门开合以进行细胞分选，该仪器的特性在于整个分选过程在一次性使用的全封闭样本舱(cartridge) 中进行，且无需鞘液、避免了样本污染和残留风险。上样简单、自动进行分选设置，无需操作人员进行高强度与长时间的培训就能轻松操作。由于实际分选过程都在样本舱进行，不会损失珍贵的样本材料；阳性和阴性分选组份均可在无菌洁净操作台内轻松回收。细胞不会受到高压、电荷及减压刺激，不同于传统的液滴分选仪，这种温和的分选方法可最大保持细胞活性和功能，即使经过多次分选，细胞活性也不会受影响，充分表明这种阀门介导的分选机制具有温和性质。美天旎MACSQuant Tyto细胞分选仪与样本舱功能示意图。A. 美天旎MACSQuant Tyto细胞分选仪；B. 样本舱；C.独特微芯片技术的分选示意图。单细胞测序前，使用美天旎MACSQuant Tyto细胞分选仪（MQ Tyto）进行目的细胞分选富集。分选过程不受到高压、电荷、减压与剪切力刺激，作用温和不影响细胞生物功能完整性，维持细胞基因转录图谱表现，提高细胞存活率与回收率。位于美国加州大学(University of California, Irvine- UCI)的Dr. Kai kessenbrock研究团队致力于研究机体正常组织内环境稳态和乳腺癌中的细胞通讯。他们在单细胞水平上系统性分析研究乳腺干细胞微环境(stem cell niche)中细胞通讯的机制和乳腺上皮組織内的异质性，进一步加深对早期肿瘤发生过程中系统性变化的理解；最终目的是开发用于早期检测的生物标记物以及改善乳腺癌的治疗策略。Dr. Kai kessenbrock团队在FVB小鼠取出小鼠乳腺组织，分别以美天旎MACSQuant Tyto细胞分选仪(MQ Tyto)与传统液滴式流式细胞分选(Droplet cell sorter)分离乳腺上皮细胞(CD49f+/EpCAM+)后，标记建库并进行单细胞测序；比较两种不同的流式细胞方法分选后，所获得的测序数据真实性与可靠性，也进行分选后的细胞培养，观察细胞存活与功能。小鼠乳腺上皮细胞分离与单细胞建库 (Data kindly provided by Quy Nguyen, UCI)1. MQ Tyto可有效分选出不同乳腺上皮细胞亞型（Luminal 1, Luminal 2, Basal-like subtypes），基因转录图谱完整呈现。聚类分析与差异基因热图展示2. 经由MQ Tyto分选，每个单细胞可捕获更多的mRNA数量(UMI)，获得更多可分析的基因数(Genes)；显示MQ Tyto保留了细胞的完整性。质控图3. 传统液滴式流式(Droplet cell sorter)细胞分选后细胞应激基因表现明显上调。这主要是来自于细胞分选操作过程中所受到的外力刺激，而非原始组织环境细胞的真实表现。应激基因表现量展示4. 细胞分选后，持续培养七天乳腺上皮细胞并形成乳腺球(mammosphere formation)进行计数。结果显示MQ Tyto组形成更多的乳腺球，表示其MQ Tyto分选后的上皮细胞维持其功能性与高存活率。综上，利用MQ Tyto对目的细胞进行分离与富集，作用温和不影响细胞生物功能完整性，维持细胞基因转录图谱表现，提高细胞存活率与回收率，开启单细胞测序成功的第一步。

随着科学的发展，科学家们发觉许多群体细胞，完整个体水平的研究只是研究多种类细胞，多个细胞共同作用的“平均值”，淹没了细胞个体之间的差异。因此，针对单个细胞的研究技术，单细胞基因组学研究（Single Cell Genomics Study）成为生物学研究迫切的方向，并成为再生医学，发育生物学，肿瘤研究，免疫学研究必不可少的关键研究手段。 Dolomite Bio公司基于其已有的单细胞RNA测序模块系统和μEncapsulator单细胞包裹模块系统取得良好的销售业绩及客户反馈。2017年11月，Dolomite Bio公司隆重推出Nadia高通量单细胞建库仪，可平行运行1/2/4/8个样品， 每个样品18min内可生成6000个单细胞库；专为DropSeq方案设计；使用一次性试剂盒，防止污染；自动检测试剂盒状态，触摸屏控制，全自动运行。同时，添加Innovate新方法开发平台，可以使用自己的试剂，开发新的方法，可调节液滴大小、频率、温度、搅拌和时间等参数，一旦条件摸索成功，可通过Nadia高通量单细胞建库仪在相同条件下平行运行2/4/8个样品。 2018年4月24日-27日， Dolomite Bio公司在北京、上海、深圳和澳门成功举办了Nadia高通量单细胞转录组测序技术交流会，会议现场Dolomite Bio公司CEO Mark Gilligan先生详细介绍了液滴微流控技术应用在单细胞研究的优势，高通量单细胞RNA测序实验中遇到的问题以及B细胞和T细胞、FACS分选等应用，并现场利用Nadia单细胞建库仪和Innovate新方法开发平台演示了单细胞库制备的整个实验过程。现场部分客户被邀请亲自体验了实验过程，客户对实验结果非常满意，并对Nadia通量高、操作简单、Innovate灵活开放的特点给予了极大的肯定。清华大学会场中科院学术会议中心会场华大基因会场澳门大学会场Mark给客户演示Nadia样机

原标题：清华大学王文会团队: 基于阻抗流式细胞术的单细胞样本“一步式”分选除盐质谱预处理系统——01——研究背景单细胞质谱检测技术为单细胞化学特性分析提供了一种强有力的免标记分析手段，并在癌症分析、药物刺激、免疫分析等临床应用中展现出潜在价值。然而单细胞质谱往往需要进行必要的预处理操作，如将目标细胞从混合细胞群体样本中分离出来以提高质谱检测的准确性；除盐操作去除细胞常见缓冲液中的非挥发性盐，降低基质效应提高质谱检测灵敏度。目前这些预处理往往是通过多种设备或手动操作完成，效率较低；开发有效的一步式预处理方法对于单细胞质谱分析意义重大，但目前这方面的研究较为缺乏。为此，清华大学的王文会教授团队提出一种基于阻抗流式细胞术IFC的“一步式”分选除盐质谱预处理系统，经过处理的细胞样本可直接兼容现有的免标记质谱流式、液滴微萃取等单细胞质谱分析手段。研究工作以“Microfluidic Impedance Cytometry Enabled One-Step Sample Preparation for Efficient Single Cell Mass Spectrometry”为题发表在期刊Small上，并被选为Frontispiece。本工作基于IFC原理设计微流控芯片结构，结合压电驱动实现一步式单细胞分选除盐操作，将目标细胞从细胞群中分离出来的同时实现其外基质的置换。经实验验证，系统的分选效率99%、除盐效率99%，并被证实了在癌细胞和血细胞的分离、癌变细胞与正常细胞的分离与质谱检测方面的功能。图1. 基于阻抗流式细胞术的“一步式”分选除盐质谱预处理系统示意图——02——研究内容本工作中搭建了具有四层结构的微流控芯片，如图1所示。利用IFC进行细胞的电学及尺寸特性表征实现不同细胞的识别，待其流经分选区域时由压电执行单元对目标细胞进行分选，通过合适的流速配比，执行单元将目标细胞推至作为下鞘液的质谱兼容的挥发性盐溶液中，同时实现样本的分选与除盐。芯片采用两套电极，其中第1套用于单细胞电学表征，第2套用于表征确认除盐效率。图2. 微流控芯片结构及其工作流程示意图以商用均一性较好的6 μm和10 μm直径的PS微球对系统的分选效率进行了表征。在约9000个样本的实验中，系统展现出了99.53%的分选成功率，同时样本中的10 μm微球纯度由2.48%提升至92.23%，实现了约37倍的富集效率，如图3所示。此外在模拟血液中CTCs分离的实验中，在HeLa癌细胞与人体外周血单核细胞PBMC的混合样本中分选出HeLa细胞，其纯度由15.78% 提升至87.34%，展示出巨大的临床应用潜能。图3. 微流控系统的分选性能评估从定量的角度，以270 mM NaCl溶液作为样本液、去离子水作为下鞘液为例验证了系统的除盐效率，单次分选操作引入的NaCl物质的量仅为0.77±0.16 pMol，即使在300 cells/s的分选通量下除盐效率也能够达到99.62%；同时在实际的细胞样本测试中可以看出，未经除盐的样本信号被完全淹没，而经过该系统除盐后的能够清晰分辨单细胞的典型代谢与脂质峰，证实了系统优秀的除盐性能。图4. 微流控系统的除盐性能评估该系统进一步用于正常乳腺上皮细胞MCF-10A和癌变的乳腺癌细胞MDA-MB-468的分选与检测。通过双频点的锁相检测，分别表征了两类细胞的电学特性，并据此进行了分选操作，结果表明MCF-10A细胞的纯度由 10.64% 提升至77.78%，展现出了约7.31 倍的富集效率。此外将收集到的细胞样本直接与免标记质谱流式装置级联实验，同时表征了两类细胞的代谢特征，结果表明，部分显著差异表达的代谢和脂质可能是致使细胞电学特性差异的原因，充分验证了系统在多模表征与临床分析中的应用价值。图5. 正常细胞与癌变细胞的电学与代谢特性表征分析——03——总结展望本工作提出的基于IFC的一步法单细胞样品质谱预处理方法极大地方便单细胞质谱分析，突破了复杂操作和不必要的损耗。作为一个独立的样品制备模块，本微流控系统能够兼容多种质谱分析方法，为高效的质谱样品制备提供新的范式，进而为单细胞的多模态(如电学特性、代谢特征)表征提供新的思路。论文信息Microfluidic Impedance Cytometry Enabled One-Step Sample Preparation for Efficient Single-Cell Mass Spectrometry ；Junwen Zhu, Siyuan Pan, Huichao Chai, Peng Zhao, Yongxiang Feng, Zhen Cheng, Sichun Zhang, Wenhui Wang * (王文会，清华大学)；Small, 2024, https://doi.org/10.1002/smll.202310700作者简介本工作的完成单位为清华大学精密仪器系、精密测试技术与仪器全国重点实验室。精仪系王文会教授为通讯作者，精仪系博士研究生朱焌文为第一作者。清华大学张四纯教授、程振助理研究员、清华大学博士生潘思远、柴惠超、赵鹏、丰泳翔为论文工作做出了重要贡献。本研究得到了国家自然科学基金的资助。【相关阅读】有望提高2个数量级微流控介电泳分离通量！清华大学王文会Advanced Materials封面成果速递https://www.instrument.com.cn/news/20240604/722338.shtml 3i流式KOL|清华大学王文会教授团队在阻抗流式细胞术上取得系列进展https://www.instrument.com.cn/news/20231030/689623.shtml

DispenCell专为快速、简单、温和地分离单细胞而开发，可应用于细胞株开发、CRISPR编辑的细胞筛选、稀有细胞分离、单克隆抗体筛选和单细胞基因组学等多种单细胞分离场景。基于阻抗技术的分离方式可以更加温和的处理细胞样品，小于0.1psi的分离压力让自动分离也能拥有高细胞活率。DispenSoft软件可提供即时可追溯的克隆性证明图谱，搭配CloneSelect Imager FL高通量单克隆验证系统，在第0天即可准确检测到单细胞并验证单克隆性。DispenCell主机紧凑小巧，可放置在生物安全柜等无菌环境中，软件操作界面简单直观，易于学习和使用。1. 温和高效DispenCell可实现对细胞样品更加轻柔的处理，小于0.1psi的分离压力与手动移液相当，但效率更高(~5min/96孔板)。分离过程无激光照射，保证细胞的完整性，因此，细胞活性和生长得以保持。2. 克隆性证明DispenSoft单细胞分析软件可提供即时和可追溯的克隆性证明图谱，允许用户在细胞分配后立即检查克隆性。3. 基于阻抗的分离吸头DispenCell 配有一个检测细胞通过的感应吸头，随着每个细胞的通过将触发一个独特的信号并被软件记录。无菌一次性分离吸头可确保清洁的单细胞分离，且无交叉污染，经认证不含动物源产品和细胞毒性材料。4. 小巧、简单、易用DispenCell体积小巧，可放置在生物安全柜等无菌环境中工作。仪器和软件操作简单，易于设置，无需清洁和校准，样品制备简单，易于学习和快速上手使用。简化工作流程的组合解决方案单细胞分离和单克隆验证在很多应用中都至关重要！例如细胞株开发过程，不仅需要分离和处理大量的单细胞，还需要验证单克隆性并形成证据来用于最终申报。CloneSelect Imager FL 和 DispenCell 的组合，能够提供高效的过程以及可信的证据，在第 0 天即可自信地验证单克隆性。CloneSelect Imager FL 单克隆验证系统全新的 CloneSelect Imager FL，在标准白光成像基础上，增加了高对比度多通道荧光技术，可在第 0 天准确的检测到单细胞并验证单克隆性。通过比较汇合度分析来识别和验证基因编辑。• 数字化记录单细胞证据，以便提交给监管机构• 在多个时间点对细胞进行非侵入式成像，以监测克隆形成• 使用高分辨率白光成像进行筛选• 通过动态分析提供实时结果• 可进行自动化整合

12月7日，上海涛烜科学仪器有限公司(简称：涛烜科学)宣布完成了对美国Bioelectronica Corp,Inc.的收购，后者是一家高通量单细胞筛选平台企业，2021年曾完成比邻星创投和凯风创投参与的 A 轮投资，以推动公司从新颖测定方法开发到可扩展电流体技术的数字生物化学领域的创新。　　上海涛烜科学仪器有限公司由全球多位微流控、光学以及自动化等领域的科学家联合创立，是一家专注于单细胞/单菌工具开发的公司。涛烜科学研发的全新一代高通量单细胞筛选平台，可在2小时内完成数十万个单细胞的筛选实验。同时开发了基于AI模型算法的软件，实现抗体序列功能的精准预测，大幅缩短和减少了抗体筛选和后续功能验证周期和成本。此外，涛烜科学研发的SmartcultureTM单菌筛选平台也即将推出市场。公司创始团队包含多位知名连续创业者，在半导体、制药等领域经验丰富，并有多位国内外教授、研究员、院士担当科学顾问，旨在解决关键技术和关键领域“卡脖子”问题。　　收购美国Bioelectronica Corp, Inc.　　在过去的一年时间里，涛烜科学完成了对美国Bioelectronica Corp,Inc.技术收购、中美研发团队的整合、供应链的建立以及产品商业化落地等一系列里程碑事件。涛烜科学已掌握关键技术并享有产品全球权益，可实现产品国产化及进一步迭代开发权限。目前涛烜科学推出的第一款高通量单细胞筛选平台，是全球第一家基于明场单B细胞分选，同时集成了柔性微流控芯片技术，不依赖于液滴生成设备等一系列技术于一身的创新平台。　　两大技术平台　　公司即将推出两大技术平台：高通量单细胞筛选平台HypercellⓇ，高通量微生物筛选平台SmartcultureTM。　　HypercellⓇ平台是一套采用先进的微流控、人工智能视觉识别技术的平台，能够显著缩短抗体药物的开发周期，也必将为中国创新药物研发以及打破核心技术被国际药厂所垄断的局面助力。　　SmartcultureTM平台是一套自动化平台，旨在解决微生物筛选过程中高劳动投入、培养速度慢、产出低等现状。该平台将原有筛选单个细菌的效率提高数十倍，为下游合成生物学、肠道健康、环境治理等研究提供有力支持。　　涛烜科学位于上海浦东新区外高桥复旦科技创新园，已建立近1000平方米的研发中心和办公一期建设。今后将与国内外顶尖人才共同努力，完善两大自主创新平台在全球的推广。

性价比谁与争锋？大连华微新推单细胞分选仪仅售36.8万——“HW-cyclone旋风系列2023”单细胞液滴制备与分选系统，破茧而出！大连华微生命科技，推出“HW-cyclone旋风系列”单细胞液滴制备与分选系统（2023款），单激光（基础版）售价36.8万！此消息一出，业内哗然！单细胞分选设备平均百万的售价，被大连华微靠自研专利技术，砍掉三分之二！这——还没完！单细胞液滴制备与分选相应耗材：华微生命的微流控芯片，更是达到惊人的低价：RMB200-600元/片，仅为进口单价的1/10—1/5；一次性管线耗材，低至人民币10元+/次……单细胞领域，注定又是一场腥风血雨！西方人说：技术，不能让中国人掌握！似曾相识，像中国高铁一样，只要研发起步不落后于西方，中国民族企业就能靠自己的智慧，以“铁杵磨针”的韧性不辍耕作，就能捅破高科技那层“窗户纸”，而核心技术一旦被中国企业掌握，就能创造物美价廉的高性价比产品，让全球客户都买得起、用得上！而性价比——是中国制造在高科技领域：靓丽的标签！图1 大连华微生命科技推出的“HW-cyclone旋风系列”单细胞液滴制备与分选系统这么低的售价，能和国外百万以上的产品pk么？性能如何？功能是否拉跨？和流式技术对比，细胞活性怎么样？带着这些疑问，让我们走近这个被预言为“2023年性价比新高度”的“HW-cyclone旋风系列”单细胞液滴制备与分选系统。一、结构 （1）基于用户显微镜的开放式研发体系，包括：“HW-cyclone旋风系列”单细胞液滴制备与分选系统、显微镜、进样驱动装置（注射泵或压力泵）、微流控芯片等部分组成，不仅大幅降低采购成本，更方便改造、升级甚至用户自行设计（变更）各流程环节，个性化科研，才能让灵感迅速转化为科技成果。此外，系统的1+N积木式结构，以及客户常用的注射泵、压力泵等传统进样方式，与客户科研习惯具有良好的兼容性。从源头（细胞进样悬液），至最终分选成果收集，全流程低成本管线通路（含微流控芯片），可一次性或多轮使用，“一次抛”方式杜绝了污染与交叉影响；“多次抛”常见于相同试剂重复实验或高效教学环节，并可大幅降低成本。图2 大连华微生命科技推出的“蓝晶系列”单细胞液滴包裹与分选类微流控芯片二、功能针对单个细胞、细菌、病毒、线虫、细胞团等1-100um粒径范围的生物颗粒，进行液滴包裹、检测、按阈值分选等操作。 （1）单细胞微滴包裹（微滴批量制备）（2）细胞检测： 荧光标记 无标记技术（高级版）（3）细胞分选（以下方式任选其一）： 电场力分选 磁场力分选 流体驱动柔性分选（4）特色技术（均高端机型/版） 单细胞液滴包裹时空滴删除功能 液滴切分功能 液滴再注液功能 连环分选（分选后再分选） 一分三路分选 分选后捕获（培养、扩增） 多种类单核1+1分选（5）升级扩展 升级至多激光/多通道， 扩展至影像传感、拉曼检测等检测方式； 增配单细胞自动植板系统（96/384孔板，单孔入单滴）； 升级至疾风、暴风、飓风、龙卷风等大连华微高端系列； 根据客户想法，升级为其它个性化微流控方式三、价格（直销）（1）单激光分选系统（单通道基础版）：36.8万元RMB；（2）微流控芯片（通用款或批量型）：200-800元RMB；（3）管线通路耗材：10-30元/实验；（4）生物显微镜、泵、试剂、PC电脑等均可客户自备。 （提醒用户：长期实验使用，请重点考量耗材成本）四、系统原理（1）单细胞液滴包裹原理 针对细胞、细菌等1-100um粒径的生物颗粒，基于两相不相溶液体，在“十”、“T”、“Y”等形式液路中的通道交叉口，利用剪切力，生成均一的液滴，实现微观下细胞个体之间的分离。 （2）分选原理有别于流式分选技术对细胞极大伤害性的高压鞘液，本产品采用低液压驱动，肿瘤细胞等敏感生物颗粒几乎不会收到液压方面的伤害。基于电磁场、介电力、流体驱动等方式，针对单个细胞在分叉通道处，根据实时检测参数，施力向不同的分支驱动液滴，实现分选，其中电场力、介电力驱动效率高达：1000个细胞/分钟；五、功能及参数 （1）单细胞液滴包裹：1,000—50,000 drop/min （2）电场力/磁场力/介电力分选：1,000 drop/min （3）无标记分选：100 drop/min上述分选通量，无法与流式细胞仪（每秒数万个）相提并论，原因之一：降低的速度，极弱的液压推动，就是为了——细胞活性！如果流式分选针对某种细胞分选的活率为30%，华微采用的弱压驱动分选原理，使细胞分选活率达到流式的2至3倍（60%-90%），其分选成果符合单细胞基因测序的活率要求。尤其针对肿瘤细胞等脆弱样本，细胞保活的优势明显。原因之二：匹配单细胞植板流程。从另一个角度，如果下一环节是单细胞孔板滴注，那么，针对秒级的板孔间喷嘴移动，超过5Hz的分选速度，对整个系统的单细胞植板效率影响不大。六、活性因采用柔性低压力驱动方案（1-30PSI可调，压强可低至流式1/70），以及从头至尾的液滴全流程包裹策略，且细胞无需沾染电荷，故活性远优于流式分选技术，分选后细胞活率60-99%表1 常见流式分选设备喷嘴与压力配置表七、耗材微 流控芯片（液滴制备、液滴分选、特定功能定制芯片）；管 线耗材（管路、夹具、连接件等），价格低廉，成本可忽略。大连华微生命科技，产品源于元器件级别的自主研发，客户众多，质量经过中科院、中国农科院、三甲医院、中国海洋大学、华东理工大学、江南大学等985/211高校,及其它众多客户应用及检验，性能稳定，价格低廉，拥有更亲民的性价比。公司创始研发团队包括：五位北京大学校友、两位原中科院资深工程师、多位国内985/211高校毕业生，并与中科院大连化物所、大连理工大学、大连交通大学、大连医科大学等合作单位的多位教授、博士或其它科研人员，进行长期合作。大连华微生命科技，是中国单细胞液滴分选领域的“清晨耕耘者”，（国内未发现比华微更早的商业化产品研发&制造商），用“十年磨一剑”描述毫不为过——在2013年，创始人就申请了多项发明专利，攻克多项西方对我国的“卡脖子”技术，并历经无数次改进优化，并实现了国产化。2021年，大连华微生命科技携手大连医大附属医院（三甲）、大连交通大学，以源于企业创始人专利技术的“单细胞柔性分选技术”，入选“2021年大连市重点科技计划项目”，并喜报频传，两年来不断获取新成果（预计2024年实现商业化，敬请期待）。大连华微的每一次技术革新，或能提高性能，或大幅降低成本，都承载着华微人潜心研发、敢于挑战未来科技的创业精神，我们将一如既往，不辍耕作，在单细胞细分领域不断探索，致力于全球业内的前沿科技研发，为中国民族工业添砖加瓦。企业简介：大连华微生命科技有限公司（Dalian Life Huawei Technology Co., Ltd.）（以下简称大连华微），科技型企业，是一家拥有自主知识产权，集研发、生产、销售及服务为一体的微流控系统一站式解决方案供应商，依靠自有专利技术，立足独立研发民族品牌，致力于微流体控制科技产品的研发与生产，历经十年的探索磨砺，为中国乃至世界的业内客户带来全新的选择。未来公司将一如既往地重视创新科研，与广大华微客户一起携手进步，共同推动着中国生命科学的发展，做世界细分领域有话语权的中国高科技民族企业。

NEWS近日，百奥智汇对实验步骤进行优化，完成了星海单细胞平台数据实测。高质量数据新鲜出炉，正式推出“海量单细胞测序性价比之王”——星海单细胞服务平台。平台简介百奥智汇星海单细胞服务平台依托于达普生物单细胞建库系统，以经验丰富的实验团队强势赋能搭建而成。对星海单细胞实验过程进行了全面的探索和优化，最终确定了多种样本类型的最佳实验运行条件，保证平台数据稳定产出。平台优势01 高 数据质量高质量数据稳定产出，数据可重复性高，为研究提供强大的数据支持。02 低 检测成本单个细胞检测成本低于1元，有效降低技术使用门槛。03 高 灵活性单次上样1~4个样本，灵活配置，更适合临床样本。04 高 运行效率单次实验油包水时间为7.5min，一天内可完成建库过程，为科研提速。高质量实测数据秉承科学严谨的态度，百奥智汇坚持“每推新品，必先测试”的原则，对平台的各项技术参数进行了详细的评估，现将高质量实测数据展示如下：物种类型：人物种类型：小鼠物种类型：大鼠以上实验结果表明，由星海单细胞服务平台产出的数据质量优异，在细胞检出、基因检出、细胞分群等维度均有很好的表现，足以满足数据深度挖掘的需求，且涉及了人、小鼠、大鼠等多物种的多种组织类型，可为各个研究领域的老师提供技术保障。 新品让利大促销除了在性能上的保证，百奥智汇也特别推出针对“星海单细胞服务平台”的让利促销活动，即日起，只需8000元即可实现一个样本的单细胞测序，包括组织解离、建库、测序（100G数据量）和基本分析。Tips：本次活动为限时促销，欢迎扫描以下二维码尽快锁定优惠名额，并于6个月内完成送样检测。

时间：2018年11月29日 19:30 - 20:30内容简介：在特异的组织或细胞群中，实际存在大量的细胞类型，且每种细胞类型拥有大相径庭的细胞谱系和功能。而由这些细胞有机构成的组织、器官和生物个体或微生物群落，才是发挥完整的生物学功能的基础。单细胞研究（Single-cell Analysis）作为一种系统生物学研究方法，可以弥补传统方法存在的缺陷，在单细胞水平对生物信息进行解析。流式单细胞分选技术由于其高通量、多参数、低成本等特性一直作为单细胞分离的 zui jia 方法。本讲座给大家介绍了流式单细胞分选的上下游连接以及分选中主要注意环节。主讲人简介：宋兴辉浙江大学医学院公共技术平台副主任浙江大学医学院公共技术平台副主任，主持课题多项，曾在国内外期刊上发表多篇文章

—“HW—TORNADO龙卷风”系列大连华微生命科技有限公司（Dalian Life Huawei Technology Co., Ltd.）（以下简称大连华微），是一家拥有自主知识产权，集研发、生产、销售及服务为一体的微流控系统一站式解决方案供应商。大连华微推出“HW—TORNADO龙卷风”系列单细胞液滴制备、混匀、检测、柔性操控与分选综合控制系统，引起业内客户高度关注。“HW—TORNADO龙卷风”系列产品，全球业内具有特色的“N×”阵列式并行模块单元结构，可积木式定制扩展，针对细胞、细菌、酶、病毒、蛋白、线虫等尺寸在0.1微米至2000微米范围的活性生物颗粒，实现高通量筛选：5亿×N个液滴/日（N=1,2,4,8,16…选用阵列数，理论上速度可任意增加）；对尺寸在100纳米至2毫米米范围的生物颗粒进行液滴包裹、检测、分析及筛选，可删除空液滴，实现单个液滴只包含一个细胞、菌、酶（或其它生物颗粒）；多频激光（405/488/532/561/638等）可根据用户需求配置，共聚焦实时协同作业，并可实现灵活的更换和快速升级；触摸屏软件，智能识别，实现自动化的操作处理；系统可根据客户需求定制生物芯片，实现液滴检测、混匀，以及无损操控与筛选。 大连华微成立伊始，就定位于世界前沿科技的研发与生产，其自主研发的“细胞、菌、酶液滴高通量制备、检测及柔性筛选系统”秉持民族品牌，已经发展5个系列数十种型号，成为业内知名、拥有完全自主知识产权的单细胞液滴自动化控制产品。公司本次重磅推出的：阵列式100%单细胞-巨高通量柔性筛选系统“HW—TORNADO龙卷风”系列，支持全面广泛的应用及科研需求，涵盖单细胞基因测序、基因编辑、细菌分选、药物筛选、疾病诊断、酶活筛选、基因文库构建等多个重要领域。 近一两年，国内出现很多仿制的实验室DIY型“分选系统”——依靠国外成型的功能组件、电源、信号控制部件搭接而成，智能程度低、可靠性差、误差不可控，分选过程对生物颗粒活性影响不可逆，且操作繁琐。最重要的：如果采购这种DIY型“产品”，一旦其进口电源、主控功率部件出现故障或损坏，DIY供应者无法修复，只有更换，且更换成本极高（至少需要RMB十万元以上，维修周期超过两个月，如西方限制进口则无法继续使用）。华微产品源于元器件级别的自主研发，客户众多，质量经过中科院、三甲医院、985高校等高端客户应用及检验，产品可靠性、柔性控制的性能远优于上述DIY型“产品”。华微产品除保修一年外，部件还终身享受成本价格换修（最贵的单个元件更换，不高于前述DIY供应者换修价格的三分之一），维修周期一般不超过一周，自主研发产品不存在受西方限制的核心组件，可大幅节省客户后续使用成本,这是拥有自主核心技术的底气。大连华微生命科技有限公司，依靠自有专利技术，立足独立研发民族品牌，致力于国际前沿领域的微流体控制科技产品的研发与生产，历经十年的探索磨砺，为中国乃至世界的业内客户带来全新的选择。未来公司将一如既往地重视创新科研，与广大华微客户一起携手进步，共同推动着中国生命科学的发展，做世界细分领域有话语权的中国高科技民族企业。关于华微生命科技：大连华微生命科技有限公司，坐落于素有中国“浪漫之都”之称的海滨城市大连高新区火炬路，是大连市第六批“海创工程”企业；成立伊始，就定位于世界最前沿科技的研发与生产，提供生物技术、生命科学、医疗健康、环境保护等领域的专业设备、耗材、服务，以及相关完整解决方案。

2009年，单细胞测序技术问世。2013年被Nature Methods评为年度技术。2015年以来，10X Genomics、Drop-seq、Micro-well、Split-seq等技术的出现。2018年以来，以新格元为代表的国内单细胞平台如雨后春笋般涌现。Fig 0 单细胞平台一览图详细了解厂商和各家产品之前，预告一下“第六届基因测序网络大会”，会议上德运康瑞、墨卓等企业的专家代表将有精彩的分享。马上免费报名吧！报名页面：https://www.instrument.com.cn/webinar/meetings/geneseq2023/一、低通量单细胞平台低通量的单细胞平台主要是基于smart-seq2技术原理开发而来，典型代表有Fluidigm C1™ 单细胞全自动制备系统和WaferGen ICELL8® Single-Cell System两大平台。1、Fluidigm C1™ 单细胞全自动制备系统Fig1.1 富鲁达C1单细胞系统  2012年6月13日，Fluidigm 在日本横滨举行的国际干细胞研究学会 (ISSCR ) 上发布了C1™ 单细胞全自动制备系统，是真正第一个实现商业化的平台。  C1单细胞自动制备系统微流体技术，可以同时捕获多个单细胞（IFC：~96 cells；HT-IFC：~800 cells），在同一张芯片上完成细胞捕获、裂解、逆转录及预扩增的全过程，完成smart-seq全步骤的自动化。2、WaferGen ICELL8® Single-Cell SystemFig1.2 宝生物iCell8单细胞平台  2015年2月份，Wafergen公司开发出ICELL8 Single-Cell System单细胞分选平台，后被TaKaRa公司收购。  利用WaferGen Smart Chip TE平台筛选细胞，5184个反应孔，可进行单细胞RNA测序样本的制备、扩增、表达谱建库测序、生物信息分析，可快速得到样本间的基因表达差异。  每次运行可分离500~1800个细胞； 细胞的捕获效率大约37%； 细胞适用范围为5-100um； 样本通量为8（一枚ICELL8芯片上一次最多可以分析8种细胞样品）； 没有整合试剂，使用Takara试剂，需进行试剂优化； 自动成像技术系统：可实现单细胞反应孔可视化； 单细胞挑选软件：只挑选活的单细胞进入后续的处理，从而可以节约反应试剂，缩短数据分析时间。[点评]：虽然低通量测序现在不是市场上的主流，但是由于其实验的精密度是非常高的，已依旧没有被社会淘汰。二、高通量单细胞平台（进口）  2017-2018年，两大商业化的单细胞测序平台（10X Genomics, BD Rhapsody）出现，最终让单细胞测序技术进一步达到更大商业化。1、 Mission bio：专注于高通量单细胞DNA测序的平台Fig2.1 Mission bio Tapestri Single-cell Multi-omics Solution  Tapestri平台基于微液滴的微流控装置，利用油包水体系对细胞进行捕获与封装。封装时，细胞和蛋白酶等会被一起装入微液滴中，每一个微液滴相当于一个微容器。之后，细胞在微液滴中进行裂解、加条形码（barcoding）等步骤，再结合靶向 PCR 扩增技术，对特定的DNA目标序列与蛋白产物进行单细胞水平的建库。建库完成后，即可进行高通量测序和后续的生物信息学分析。• 专注单细胞DNA测序。• 高灵敏度，可检测含量低至0.1%的罕见亚克隆，以及突变的合子型和突-变共发生情况。• 多种检测类型，可检测SNV、InDel及CNV等多种变异类型。• 高通量，每个样本可测量5,000~10,000细胞。• 灵活性强，可定制化设计疾病基因检测靶点及CRISPR靶点 。2、Illumina® Bio-Rad®：基于数字PCR的高通量单细胞平台  2017年1月17日，Illumina公司和Bio-Rad实验室公司在JP摩根健康大会上发布了Illumina® Bio-Rad® Single-Cell Sequencing Solution。Fig2.2 Illumina Bio-Rad Single-Cell Sequencing Solution该系统包含Illumina® Nextseq 500和Bio-Rad® ddSEQ™ Single-Cell Isolator；Bio-Rad最好的液滴分离技术，Droplet Digital™技术，可以对单细胞进行隔离和编制条形码，然后在Illumina的许多主要NGS仪器上进行下游测序。• 可一次性检测8个样本，每个样本可以得到500~10000个细胞。• 捕获效率低，仅为3%，但测序成本相对较低。3、10x Genomics Chromium 高通量单细胞平台(controller/connect/X series)10X面对市场不同的需求推出了三款仪器。最早的这一款就是chromium controller，这款仪器配备了是标准通量和低通用的两款试剂盒。2021年的时候，10X上又推出了chromium X series这款仪器，目前这款仪器也是市场主推的一款。它适配的试剂盒的规格也更丰富。Fig2.3 10x Genomics Chromium 高通量单细胞平台另外10X推出的chromium connect仪器最大特点就是它能够实现从单细胞分离以及到最后NGS文库构建的一个全流程的过程，因此更加适合于一些大通量的实验室。• 每次运行提供8个通道，每个通道可以收集100-10000个细胞。（注：Chip M是16个通道）• 每次细胞分装运行时间为18min左右；• 细胞捕获效率最高可达65%；• doublet比例为0.9%/1000个细胞；• 针对单细胞ATAC分析，线粒体污染率低于2%；4、BD Rhapsody™：基于微孔板法的高通量单细胞分析系统  BD Rhapsody™单细胞分析系统包括BD Rhapsody™扫描仪和BD Rhapsody™ Express单细胞分析系统。BD Rhapsody™ Express 系统配备的专有单细胞捕获技术，以微孔为基础，稳定，能够捕获数百到数千个单细胞并为其打上条形码，分析基因组和蛋白质组信息。BD Rhapsody™扫描仪旨在可视化单个细胞捕获工作流程中的所有步骤，为每个步骤提供详细的分析度量，以便用户在整个工作流程中做出关键决策。Fig 2.4 BD Rhapsody™单细胞分析系统• 单细胞捕获效率：最高可达~80%• 单细胞检测通量：100-40000• 双细胞比例： ~2-3% for 10k cells load； ~8-10% for 40k cells load[点评]：1）10x Genomics仍是主力军，在国内拥有众多代理商和服务商，占据着80%左右的国内科研市场份额。同时该平台近两年注重空间组学平台开发，2022年推出了一系列新产品；10x Chromium X系列产品有多种应用类型，支持低中高3通通量模式，在推广上又与之前的Controller进行联动（增加保修年限），是10x的主力机型。2）BD Rhapsody™平台坚持微流控微孔板的原理，配备有扫描仪，可以实时监测单细胞状态，保证细胞的分离捕获效率；同时其配套有抗体和流式平台，在单细胞实验的组合解决方案上有明显优势（混样、与流式仪器上下互动组合）。3）Mission Bio单细胞平台专注单细胞基因组测序，在血液肿瘤方向深耕多年，接触临床应用时间较早；近些年在逐步增加国内服务商的覆盖，已有多家知名服务商与之合作。4）Bio-Rad与illumina合作推出的单细胞建库平台捕获效率较低，市场占有率及市场声音较低。点击图片即可报名参会，8位嘉宾将带来单细胞测序内容！三、高通量单细胞平台（国产）截止到2022.12.31，国内的单细胞平台共有10个，分为微流控微孔平台（以新格元Matrix系统为代表）和液滴微流控平台（以华大C4系统为代表）。1、新格元Singleron Matrix® 自动化单细胞测序文库构建系统可完成将单细胞悬液分散到微流控芯片的高密度微孔阵列中，并自动完成细胞分离、细胞裂解、细胞标记至mRNA捕获步骤，无需实验人员干预。Fig3.1 Singleron Matrix自动化单细胞测序文库构建系统• 单个样本单张芯片可捕获细胞数量500-30000个 • 每份样本捕获效率最高可达75% • 检测1000个细胞中含有双细胞的比例低于0.2％；[点评]新格元生物是国内首家一站式全方位的单细胞整体解决方案提供商，在产品方面既有单细胞转录组、核转录组、免疫受体等常规产品，同时也有单细胞转录动态监测、单细胞糖基化、单细胞靶向基因检测试剂盒等特色产品，能够给科研者提供更加多样的组学研究选择。是国产单细胞的主要玩家之一。2、华大智造：DNBelab C4高通量单细胞平台DNBelab C4是华大智造推出的基于负压的微流控单细胞技术。小巧轻便（长230mm、宽42mm、高57mm），无需电源，重量不到220g，操作简单，可随时开始单细胞建库。Fig3.2 DNBelab C4 Pocket Single-Cell Lab• 有效捕获细胞数：1000~12000 cells/run；• 细胞直径范围：5µm-25µm ；• 多胞率（Multiplet Rate）：8% ；• 捕获效率：30~60% ；3、寻因生物：SeekOne双平台体系（微孔板平台+液滴油包水平台）寻因生物有单细胞标记两大主流技术：油包水法SeekOne® DD和微孔芯片法SeekOne®MM（Microwell & Magnetic Beads)。1）微孔芯片法MM  SeekOne MM（Microwell & Magnetic Beads)高通量单细胞转录组试剂盒基于微孔技术原理，通过微孔芯片SeekOne Chip实现单细胞捕获，并利用核酸修饰的Beads 对不同细胞来源的RNA 进行分子标记，最终构建兼容Illumina及华大智造测序仪的高通量单细胞转录组文库。Fig3.3.1 SeekOne MM平台（手动法）• 单次可放置1-4张芯片，单人操作可同时处理1-4个样本；• 单张芯片微孔数：17w；• 单张芯片捕获细胞数：500-10000 cells；• 捕获率：最高可达60%；• 双胞率： 0.7% / 1000 cells；• 无需其他昂贵硬件配套2）油包水法DD  液滴油包水平台（DD）是寻因生物的主力平台，并基于该平台开发了相应试剂盒，其主要有单细胞3‘转录组试剂盒和单细胞5’免疫受体试剂盒。• 芯片通量：1~8个样本，可以拆卸不会有芯片浪费；• 运行时间：3 min生成15万个油包水液滴；• 单通道细胞捕获：500-12000 Cells；• 双胞率：0.3% / 1000 cells；[点评]寻因生物尽管对外宣称具有MM和DD双平台，但整体推广上仍侧重DD平台，并依托其可拆卸的芯片实现更加灵活的实验安排。目前该公司产品相对较单一，公司在推广上发力比较多，推出了相当多的视频专题进行客户教育，算是不错的行业先行者。4、墨卓生物在过去的2022年中，墨卓生物对外发布了单细胞液滴微流控平台及其试剂盒、微生物高通量单细胞基因组测序产品。其中单细胞液滴平台MobiNova-100引入了光激发分离（Light-CUT专利技术）原理，可以在单细胞核酸捕获阶段将分子标签与微珠进行分离，因此在实验中需要专门的配套设备。Fig4.1 墨卓生物单细胞仪器• 芯片通量：1~4个样本；• 试剂盒种类：目前仅有单细胞3‘转录组试剂盒；• 运行时间：10 min；• 单通道细胞捕获：500-20000；• 双胞率：5% / 10000 cells；此外墨卓生物还推出了MobiMicrobe 微生物高通量单细胞基因组测序解决方案及其仪器产品M1，主要是在菌株水平分析宿主-噬菌体关联信息及转录转移事件。• 样本通量：每次可处理1个样本；• 捕获通量：每个样本可捕获微生物细菌数量≥6000个；• 仪器配套高速相机，能够观测微芯片中微滴发生和融合；• 仪器配有低温存储模块能，可同时放置4个0.2 mL PCR反应管和4个1.5 mL离心管；• 仪器配有扩增模块（96x0.2ml，12x8连管或96孔 PCR板）• 仪器带有自检功能：仪器在开机和运行过程中会自动检测，遇到异常会发出报警提示。5、其他除了以上4个国产单细胞平台之外，在过去的两年中还出现过一些平台公司，他们均采用液滴法来作为技术源头，并处于早期产品阶段，以单细胞转录组、免疫受体等作为主推产品，为客户提供产品或者服务。这些厂家有万乘生物（10K genomics）、百迈克生物、跃真生物（m20 genomics）、德运康瑞、纯迅生物等。总结  截至2022年12月，目前国内市场共有2个低通量进口品牌、4个高通量进口品牌和10个国产品牌，均有各自的公司定位和产品体系以及对应领域解决方案。  纵览2022年国内市场单细胞信息，主要特点有：• 单细胞新平台频出。如墨卓，M20，百迈客均是2022年推出单细胞平台。• 单细胞平台特点突出，各有产品和市场定位，有从单品到一站式解决方法成长的趋势。• 单细胞市场更为成熟。各家单细胞平台对内完善了团队建设，对外加强服务商或产业端的合作。• 空间技术应用。10X主推空间原位，德运康瑞收购先能原位，华大和百迈客主推基于测序的空间技术。• 单细胞多组学，有单细胞平台的厂家基本在或计划开发单细胞多组学（免疫，表观，蛋白，突变，全长）产品矩阵。• 单细胞技术应用方向扩展到动物，植物，微生物。如联川，诺禾推出农口单细胞激励计划，BD联合华南农大推出经济作物单核文库构建方案。（信息来源于生物医学小站）第六届基因测序网络大会进入报名页面：https://www.instrument.com.cn/webinar/meetings/geneseq2023/点击图片报名

单细胞分离采用类似喷墨打印机以及一次性分配分离槽，温和高效地接种单细胞，使用明场高分辨率成像或可选荧光分选细胞，每个单细胞分离捕获 5张图像，单克隆性，提高工作效率，保持并增强细胞活率，且防止交叉污染。　　采集单细胞分离的证据，在接种细胞时记录5张连续图像，以96或384孔板的形式提供直接的单克隆性图像证据，提高克隆形成率，与传统方法相比，在克隆形成率上可实现高达8倍的提升。　　保持细胞健康和无菌，正如克隆生长实验所见，通过温和的分离维持细胞活性，并使用无菌的一次性单向分离槽防止交叉污染，简便、快速、可选择以及无损分离单细胞，简化遗传和克隆培养、分析中分离过程。快速高效接种单个活细胞至微孔板分离系统的主要功能为高效柔和地分离或分选活的单细胞。该系统通过微流控技术柔和地形成细胞液滴，同时利用白光和荧光成像实时分析细胞数量和荧光强度，将符合要求的单细胞液滴准确接种至96孔板。　　主要特点　　1.分离效率85%，单细胞活率75%；　　2.记录分离前后的连续5张图像，用于支持细胞株的单克隆性；　　3.采用一次性分离槽，省却系统的清洗验证，减小交叉污染的风险；　　4.采用白光成像和荧光成像，可根据细胞直径、圆度以及荧光强度筛选出感兴趣的细胞；　　5.内置除静电装置，消除微孔板静电，确保细胞液滴接种至微孔正中间，尤其是PCR板。　　单细胞分离系统可代替传统的有限稀释法，高效地将单个活细胞接种至微孔板中。得益于分离系统的高效率和高活率，可以将每块微孔板中可获得的单克隆细胞团提高至多8块，从而在相同的工作量下可筛选更多的细胞克隆，从中发现更多更优质的细胞株。分离过程中记录的连续5张图像，可以与后续的孔板成像的图像证据互相补充，从而提高单克隆性的可信度。　　应用范围：连接不同管径大小的毛细玻璃针，可分离捕获各种非贴壁状态的单细胞和微粒等，如细菌、酵母、藻类细胞、植物花粉、原生动物单细胞、悬浮细胞、血液细胞、免疫细胞、卵细胞、各种悬液中单细胞及特殊标记的单细胞等。　　单细胞分离的小技巧　　1. 缩短制备单细胞悬液的时间，以保留细胞活力　　2. 考虑使用细胞筛来过滤出细胞团块或双细胞　　3. 注意缓冲液的选择，包括分选和收集溶液　　4. 如果您打算在分选后培养细胞，请使用对数生长期的细胞，并确定最佳培养条件　　5. 在分选转染后的细胞时，通常在转染后72小时进行，以提高细胞群的生存能力　　6. 如果采用荧光抗体来分离稀有细胞，请在染色前离心抗体，以便去除任何可能被误认为是靶细胞的荧光颗粒　　7. 对于单细胞基因组学应用，在分选后别忘了离心平板，以确保细胞在孔的底部　　8. 选择一种可靠的分析技术来评估分选细胞的数量和质量

学理工的人大概都有这样的感觉，很多规律和现象都可以用理论、公式或算法来描述及推导。只要知道了所有的条件，便能预测结果。反过来，也可以通过现象反推关键的成因。久而久之，我们也习惯并爱上了这样逻辑清晰、条理分明的世界。以至于我们时常因为意外的结果徒然而叹，也为寻找到那孜孜以求的&ldquo 理&rdquo 而欢欣鼓舞。抛开现实里的林林总总，理工男女的生活可以很简单&mdash &mdash 以&ldquo 理&rdquo 立身，有&ldquo 理&rdquo 走遍天下，无&ldquo 理&rdquo 无地容身。这样的准则对某些人来说甚至可以上升到人生哲学的高度&mdash &mdash 直到他们遇上了生物学。　　相比数理化，生命科学相当&ldquo 后进&rdquo 。在数理化已经发展到有相当完整的理论体系的今天，生物学，尤其是分子生物学可谓是才刚刚起步。&ldquo 不幸的&rdquo 生物工作者还处于认知的原始积累阶段。我们研究的几乎每一个对象，每一种方法，大概还没有可以宣称已经研究透彻的例子&mdash &mdash 即使对象是简单如病毒这样连生命都算不上的活性大分子。实验不能重复，现象无法解释这样的事在生物实验室里是家常便饭。许多人都遇到过PCR扩增失败，或电泳多出一条带这样的事。多数选择再做一次看看，而不是寻根究底。因为整个系统太复杂、变量太多太多了。　　 　　系统的复杂程度太高是一方面，另外一个原因是研究手段的局限(当然还有更多客观原因，非本文主旨所以省略)。微观世界的研究手段的升级依赖于其他科学门类的进步，对手段的依赖必然导致方法论的单调。在分子和细胞生物学领域，许多人习惯用宏观思维去理解微观世界，比如重视群体现象而忽视个体差异，用一群相关的细胞代替一个系统。而对一个复杂的系统用笼统的手段进行研究，得出的结论自然是粗浅的。　　虽然没人做过统计，但据估计至少95%以上的现代生物学研究成果是建立在对细胞群体的研究基础上。忽略细胞异质性(Cellular Heterogeneity)的方法固然降低了系统的复杂度，简化了流程。其带来的生物信息不可逆的丢失也是显而易见的。这种平均化的方法必然导致信息的稀释或丢失，在某些情况下甚至会让人得出矛盾的结论。另外，该方法让发现并分离细胞群体中的&ldquo 异类&rdquo 的尝试变得难上加难。如此，只有强信号才有可能被检测到。而这不仅让以往科学家们的努力有了不过是摘取了低处枝条上果实的意味，也让部分成果的准确性打上了问号。　　单细胞分析技术正是解决上述问题的方法，其中最引人注目的是单细胞测序技术(Single-Cell Sequencing)。然而，细胞异质的不确定性导致需要同时分析很多单细胞以消除小量样品可能带来的偏差，而这直接和实验可行性挂钩。幸运的是，由于技术的进步和费用的降低，单细胞测序技术近年来已得到迅速推广。通过对单个细胞的逐个测序，信息的精度、深度，以及信息量可获得几何级数的增长，随之带来的是我们对具体对象更加翔实和准确的了解。而且，通过数学方法，高度相关的细胞可以被整合起来当作亚群体处理以部分消除单个细胞的随机异质性，或者按相关性重排以构建全新的不依赖于传统时间轴的图谱。这些新手段已经给我们带来了一些前所未有的认知。那些前沿科学家们所取得的成就，同时也刺激着更多的人加入他们的行列，形成了正反馈。　　近年来，单细胞测序逐渐大众化，相关的论文发表数量在2010年后呈指数增长之势，在高品质期刊上发表的单细胞研究成果屡见不鲜。其产生的影响深远，以致Nature Methods将单细胞测序选为2013年度重大技术，并在2014年首刊专述。在后面的文章中我将会挑选几篇有代表性的文章谈谈它们的意义。有意思的是，二代测序技术已经在2007年当选Nature的年度重大技术。单细胞研究的流行无疑让它的使用拓展到了更广阔的领域。　　单细胞研究不仅在DNA和RNA测序方面取得了极大的进展，单细胞质谱分析(Mass Cytometry)也正在逐渐得到更多的关注。该技术用带有重金属原子标记的单克隆抗体对细胞表面和细胞内的关键蛋白进行标记，然后依次等离子化细胞，通过质谱分离重金属原子并分析其丰度来获取相应蛋白在各细胞内的表达情况。该技术也叫质谱流式细胞技术，相比荧光流式细胞技术，其主要特点是背景低、通道互扰小，所以可以同时分析更多的蛋白质。如今可用的重金属标记已达35种，这是基于荧光的检测手段无法企及的(最新的荧光流式技术可一次检测16-18种蛋白)。该技术可以一次分析百万量级的单细胞，而且没有理论上限，超出单细胞测序几个数量级。因此可以用来构建非常详细的细胞关联图，尤其适合分析高复杂度的系统，比如血液中的细胞。另一方面，单细胞质谱无法像测序那样对全基因组进行分析，但是由于它是直接对细胞的功能的执行者&mdash &mdash 蛋白质进行解析，跳过了对细胞内各种基因表达调控机制的考量，其意义是非常明显的。　　此外，单细胞测序技术让微流控芯片技术(Microfluidics)得到了发展。除了在制备单细胞测序文库方面具有优势以外，该技术在其他领域内的应用也得到了拓展，如在微流控环境中进行细胞培养。该方法可将少数细胞分离到纳升级(nL)的独立单元中分别培养并进行定向引导，然后可以立即利用微流控系统制备测序文库。在干细胞研究以及生物制药领域，该技术应该有着广阔的应用前景。　　在单个细胞层面的研究近年来经历了井喷式的增长。然而，其应用主要体现在基础研究中。目前临床上唯一被使用的单细胞检测法是胚胎植入前遗传学诊断(PGD, Preimplantation Genetic Diagnosis)。循环肿瘤细胞(CTCs, Circulating Tumor Cells)虽然在定义上是存在于循环系统中的极少量单个细胞，临床上仍然是先富集然后进行整体分析。对单个CTC进行分析的必要性已有探讨，但开发出相应的技术并在临床上被接受还有一段路要走。

p　　10月20日，在第二十届全国分子光谱学学术会议暨2018年光谱年会上，中国科学院青岛生物能源与过程研究所发布了自主研发的单细胞拉曼分选及测序耦合系统(RACS-SEQ)。该系统无需标记即可获知细胞种系发生、生理状态及所处的微环境变化等关键表型，并在单细胞水平精度对接表型组与基因组。/pp　　RACS-SEQ通过拉曼组(Ramanome)分析原理、拉曼光镊液滴单细胞分选(RAGE)、流式微液滴单细胞拉曼分选(RADS)等关键器件的创新，在单细胞水平实现了非标记式拉曼表型识别与功能分选，为单细胞生物学研究提供了崭新的整体解决方案。该系统以免标多维的表型组识别、精准快捷的单细胞获取，以及高效低噪的核酸扩增等为三大特色，具有单细胞拉曼成像、表型组识别、功能分选以及测序文库制备等四大功能。此外，系统还包括拉曼光镊液滴单细胞分选芯片、单细胞全基因组扩增试剂盒、单细胞拉曼耐药性快检试剂盒等附件。/pp　　RACS-SEQ搭载了自主研发的“拉曼组分析三部曲”智能信息系统。拉曼组自动化采集反馈软件(RamLIS)可快速、准确、智能化地获取单细胞拉曼光谱信息 智能化拉曼组分析统计软件(RamEX)可一站式完成在线数据处理与挖掘 高性能拉曼组数据库与搜索引擎(RamDB)通过多层次/易扩展的多维表型组数据库及拉曼组搜索引擎，实现了全景式、自动化、高通量的细胞功能识别。在此基础上，通过耦合独创的RAGE分选模块，直接对接单细胞测序。RAGE在溶液中的拉曼测量与分选，不仅充分保留了细胞活性，还大幅提高了基因组文库的质量(单个细菌细胞全基因组覆盖度可达95%以上)。/pp　　RACS-SEQ对不同尺寸与形状的细胞具良好兼容性，而且操作便捷。该系统将服务于微生态大健康、海洋资源与监测、生物安全、工业生物技术等广泛领域的研究与应用。br//pp style="text-align: center "img title="W020181023318107646929.jpg" alt="W020181023318107646929.jpg" src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/0ccfab4e-e684-4f48-b1da-a473c088dbd9.jpg"//pp style="text-align: center "　　青岛能源所发布首台单细胞拉曼分选及测序耦合系统/pp/p

2011 年，《自然方法》杂志( Nature Methods )将单细胞测序列为年度值得期待的技术之一，2013 年，《科学》杂志（Science）将单细胞测序列为年度最值得关注的六大领域榜首，表明单细胞测序已成为科研热点。应广大客户的强烈需求，2017年6月6日-8日，环球分析测试仪器有限公司携手英国Dolomite Bio公司在北京、上海和广州成功举办单细胞RNA测序和液滴微流控技术交流会，会议的主要内容包括：1、液滴微流控技术应用在单细胞研究的优势2、高通量单细胞RNA测序实验中遇到的问题3、B细胞和T细胞、FACS分选等应用介绍4、现场演示Dolomite Bio公司的产品会议现场，Dolomite Bio公司的技术专家Muriel博士演示了单细胞制备的整个实验过程，现场所有客户均被邀请亲自体验了实验过程，客户对实验结果非常满意，并对Dolomite Bio系统通量高、应用灵活、开放的特点给予了极大的肯定。 北京会议现场 客户体验实验 上海会议现场 广州会议现场

在无数实战经验中，制备高质量的单细胞悬液被公认为重中之重。实验过程中，如单细胞活性不高，细胞数过低，以及污染和杂质等问题，都会影响到有效单细胞数的产出、单细胞核酸的质量等，最终得到的单细胞数据分析及统计结果不可信。那么，组织如何解离？需要选什么酶？还需要注意什么？科技君根据相关权-威文献整理了单细胞悬液制备的方法和小贴士，让我们一起来解决单细胞研究方案中的拦路虎。实体组织解离关键——酶的合理选择 实体组织解离两大步骤，包含机械分离和酶消化处理。首先，组织需要通过物理切割或刀片切碎，然后通过酶消化来分离细胞。特定的组织消化酶及消化时间不同，相关建议可参考如下表格：人和小鼠的部分组织类型——肝脏、肺、皮肤、脾脏、消化道、胰腺、肾脏、视网膜等[1]。 表1 人鼠各类型组织酶解单细胞悬液方法总结[1]除此之外，常用酶的类型还包括：Accutase™ 、弹性蛋白酶和胶原酶，以及商业酶混合物，如 TrypLE Express 和 Liberase Blendzyme 等[1]，另外，科技君也总结已发表文献中常见实体组织解离所采用的酶，供大家参考，步骤详见参考文献：小鼠心脏肌肉组织：Collagenase IV and Dispase II[2]上皮组织：dispase(Corning) -商业化试剂[3]小鼠胚胎组织：TrypLE Express[4]乳-腺癌及其癌旁组织: Liberase TL (Sigma) -商业化试剂[5]小鼠主动脉血管：Collagenase type II (C6885, Sigma Aldrich) 和 Elastase (LS002292, Worthington Biochemistry)[6]小鼠脑垂体：Collagenase type II, trypsin， DNase I，amphotericin B 混合[7]血液处理成关键——离心稳定操作[1]样品经过密度离心(例如使用Ficoll-Paque或Histopaque-1077技术)，可以直接用于外周血单核细胞（PBMC）捕获[1]。建议不少于5mL EDTA 抗凝血，且不要使用肝素抗凝管收集血液；同时注意在合适转数离心操作后，管中内容物分为三层，上层为血浆（内含细胞碎片），中间层为分层液，底层为红细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单核细胞层（ 白膜层，薄）。此时，需使用无菌吸管小心沿离心管壁周缘吸取界面层单核细胞后，再加入HBSS /PBS重悬。更多注意事项请参见华大科技单细胞送样建议。单细胞悬液制备的8条建议[1]1. 建议采用无菌样品处理方式，包括使用不含核酸酶的试剂和耗材。2. 为降低对细胞的损伤，移液和离心应保持在最低程度。在一定的离心速度、时间和温度下，细胞浓度和大小直接影响制备的效率。3. 在进行细胞清洗和重悬过程中，使用具有合适大小的器皿，避免高浓度导致细胞集聚和结块，请注意选择。4. 应使用适当大小的细胞过滤器过滤悬浮液，孔径大于细胞直径，以去除团块和碎片。5. 细胞清洗和复苏，推荐使用含牛血清的磷酸盐缓冲盐水(不含钙和镁)，减少细胞损失和聚集的白蛋白。6. 细胞裂解升高可导致细胞团块形成，在细胞分离过程中，DNase I可减少细胞团块形成。7. 细胞团块会导致自动细胞计数器低估单个细胞的有效浓度，因此制备后应尽快处理悬浮液，最-好在30分钟内处理。8. 总之，在单细胞制备中，尽可能减少细胞聚集物、死亡细胞、非细胞核酸和逆转录(RT)抑制剂是非常重要的。为了在最大限度地提高不同细胞类型的纯度和无偏回收率的同时，最小化这些污染物，可能需要应用优化，例如，调整洗涤步骤的数量、洗涤溶液的组成、离心条件和/或过滤器类型。

2018年10月20日，中国科学院青岛生物能源与过程研究所单细胞中心在第二十届全国分子光谱学学术会议暨2018年光谱年会，发布了自主研发的单细胞拉曼分选及测序耦合(RACS-SEQ)系统。　　RACS-SEQ系统通过拉曼组(Ramanome)分析原理、拉曼光镊液滴单细胞分选(RAGE)、流式微液滴单细胞拉曼分选(RADS)等关键器件的创新，在单细胞水平实现了非标记式拉曼表型识别与功能分选，为功能单细胞研究提供拉曼表型组与基因组的整体解决方案，以免标多维的表型组识别、精准简捷的单细胞获取，以及高效低噪的核酸扩增等为系统的三大创新特色，具有单细胞拉曼成像、单细胞表型组识别、单细胞功能分选，以及单细胞测序文库制备等四大功能。　　RACS-SEQ搭载了智能信息系统，自动化采集软件(RamLIS)可快速、准确地获取单个细胞内部所有化合物的拉曼光谱信息，一站式分析软件(RamEX)可进行在线式数据处理与挖掘，通过结合多层次/易扩展的多维表型数据库及搜索引擎(RamDB)，实现了全景式、自动化、高通量地识别与分析细胞功能。同时，通过耦合独创的光镊液滴分选系统，对任何尺寸与形状的细胞均具有良好的兼容性，分选后的功能单细胞可直接对接测序环节，进行全基因组/目标基因的解析，无需任何外源标记即可获知细胞的种系发生、生理状态，以及所处的微环境变化等关键信息，已在微生态大健康、海洋资源与监测、生物安全、工业生物技术等领域进行应用示范。

瑞士Cytosurge公司的多功能单细胞显微操作系统FluidFM BOT，是将原子力系统、微流控系统、纳米位移台系统合为一体的单细胞操作系统，能够在单细胞水平上为研究者提供很大的便利，可应用于单细胞力谱、单细胞质谱、单细胞基因编辑、细胞系构建、药物研发、医疗等领域。本文将从单细胞实验方法和多功能单细胞显微操作系统FluidFM BOT结构出发，详细介绍多功能单细胞显微操作系统FluidFM BOT在单细胞力学实验中的应用。 一. 单细胞实验方法简介 在细胞生物学实验中，由于细胞的异质性，每个细胞互相之间都存在一定差异，因此在单细胞层面研究细胞性质可以获得更加准确的结果。近年来，多种单细胞研究技术不断涌现，应用于医学诊断、组织工程和药物筛选等领域。 对于细胞力学测定，原子力显微镜（AFM）能够对单个细胞或生物分子进行高分辨成像和力谱测定，但是细胞与探针的结合过程不可逆，无法实现连续、快速的检测。 对于细胞分离/分选技术，可选的有玻璃细管、光镊、流式细胞分选和磁珠分选等方法，然而有的从表面分离细胞时容易损伤细胞，有的无法从同类细胞群中分离出单个细胞。 对于细胞注射与提取，可选用纳米喷泉探针、纳米针和碳纳米管等，然而这些方法无法实现飞升以下量的含量注射，且注射时间较长。 多功能单细胞显微操作系统FluidFM BOT，针对细胞力学测量、分离/分选、注射与提取等应用，在结合以上技术的优势的同时克服了这些技术固有的问题，是一套多功能的单细胞研究系统，在单细胞研究领域发挥着巨大作用。 二. 多功能单细胞显微操作系统FluidFM BOT结构 简单来说，多功能单细胞显微操作系统FluidFM BOT是AFM与微流控的结合，主要由AFM扫描头、压力控制器与微流控探针组成（图1）。AFM扫描头装载于倒置显微镜上，整体结构大致与普通AFM相同，主要区别是探针中间有微流通道，后端连接液体池，前端探针有一小孔，用于液体的流入流出。微流通道内径小于细胞，防止细胞进入堵塞；探针则有多种不同孔径和不同的弹性，可根据不同应用以及不同样本更换所需探针。图1 FluidFM BOT系统图示。（a）微流控系统与AFM的结合应用；（b）（c）（d）探针的特殊设计。 三. 单细胞力学应用 传统AFM用于单细胞力学测量时，需要对探针进行一定处理以粘附细胞，后再与需要和细胞相互作用的表面、分子或其他细胞相结合，有时会产生多个细胞粘附，且反复测力会导致细胞被破坏，使得每次测量都必须准备新的探针，实验效率较低。 多功能单细胞显微操作系统FluidFM BOT通过将AFM与微流控相结合，使单细胞力学实验更高效，更简洁。对于已经结合在表面的固定细胞，可根据细胞尺寸安装适用的探针，从上方接触需要测量的细胞，通过微流控系统施加负压吸起细胞，获得力-距离曲线；也可以吸取悬浮细胞，与表面或其他固定细胞接触后，测量力-距离关系。这种方法能够提供远比蛋白结合牢固的多的吸附力，能够将细胞牢固的固定在探针上面，因此能够用于直接从基质上分离；另一方面，由于没有生物处理，这种方法不会改变任何细胞表面的通路，从而能够得到接近细胞原生的数据。 单个细胞测量完成后可移动探针至细胞板其他孔内，施加正压将其释放，再回到实验孔吸取下一个细胞，意味着单个探针可以进行多次测量。 细胞粘附是许多生理过程的重要步骤，细胞粘附力的测定可以为组织形态发生、胚胎发育、肿瘤、免疫反应和微生物膜等研究提供重要信息。多功能单细胞显微操作系统FluidFM BOT支持真核和原核细胞与细胞板/培养皿表面、抗菌/粘性/抗体包被的表面或其他细胞的粘附力测量（图2）。图2 不同细胞在不同环境下的粘附力-距离曲线。（a）探针接近、暂停、吸取并拉伸细胞的过程中探针偏转随时间的变化；（b）Hela细胞与纤连蛋白包被的表面的粘附力-距离曲线；（c）不同接触时间下大肠杆菌与PLL表面的粘附力-距离曲线；（d）大肠杆菌与PLL表面的分离距离与接触时间的关系；（e）酿脓链球菌与玻璃表面的粘附力-距离曲线，表示多个球菌的连续分离；（f）单个细胞与单细胞层的粘附力-距离曲线。 Sankaran等人[1]使用多功能单细胞显微操作系统FluidFM BOT来研究在共价和非共价的表面整合素受体对细胞粘附力的影响。通过测定发现两者均可有效增加细胞的粘附能力，并且效果近似（图3）。图3使用FluidFM BOT测定共价键与非共价键的整合素受体之间RGD的区别。（a）实验示意图；（b）粘附力测定前后示意图；（c）粘附力-距离曲线；（d）大粘附力。 多功能单细胞显微操作系统FluidFM BOT还可用于测量细胞的应力以研究细胞骨架的性质。Sancho等人[2]将10μm的小胶球吸附于探针上，之后使用探针去压细胞直到探针压力达到2 nN，通过压痕曲线来分析细胞骨架变化。通过对比发现过量表达MSX1的细胞硬度显著高于普通细胞（图4）。图4 使用FluidFM BOT测定HUAEC中MSX1过表达对细胞骨架的影响。（d）实验示意图；（e）吸附10μm珠子；（f）下压时空白细胞的力学谱线；（g）下压时MSX1过表达细胞的力学谱线，凹陷更深、斜率更高，表示其刚度相对更高；（h）胶体压痕法的测量结果。 四. 其他应用 多功能单细胞显微操作系统FluidFM BOT可用于细胞内注射与提取（图3），通过力学测量，可以控制探针刺入细胞质或细胞核内进行飞升别含量的液体注射或提取。此外，FluidFM BOT系统还可用于细胞分离以及细胞延展性研究。图5 FluidFM BOT系统的细胞内注射过程。（a）探针对准细胞；（b）探针刺破细胞膜，注入含荧光染料的目标液体；（c）探针与细胞分离，注射完成。 多功能单细胞显微操作系统FluidFM BOT克服了现有单细胞技术的短板，将多种单细胞应用相结合，高通量、高效率地获取单细胞层面的详细数据，研究多种细胞性质，尤其适合应用于医疗、单细胞生物学、单细胞质谱、单细胞基因编辑、药物研发等领域。 多功能单细胞显微操作系统FluidFM BOT在Quantum Design中国子公司与北大生科院共建实验室成功安装，为了更好的服务客户，Quantum Design中国子公司提供样品测试、样机体验机会，还等什么？赶快联系我们吧！ 电话：010-85120277/78 邮箱：info@qd-china.com，期待与您的合作！ 参考文献：[1]. Cell Adhesion on Dynamic Supramolecular Surfaces Probed by Fluid Force Microscopy-Based Single-Cell Force Spectroscopy, ACS Nano 2017, 11, 4, 3867–3874.[2]. A new strategy to measure intercellular adhesion forces in mature cell-cell contacts. Sci Rep 7, 46152 (2017).

2023年2月，中科院遗传发育所、中科脂典的相关研究人员在《Trends in Analytical Chemistry》(IF: 14.9)上发表了题为“Embracing Lipidomics at Single-cell Resolution: Promises and Pitfalls”的综述文章，总结了单细胞脂质组学当前的技术进展和瓶颈，讨论了在单细胞水平分析脂质的独特技术挑战(特别是准确的脂质鉴定和定量的重要性)，并例举了单细胞脂质组学在生物学和临床医学中的潜在应用。(中科院遗传发育所王泽华博士和曹明君博士为本文的第一作者，中科院遗传发育所税光厚研究员和中科脂典技术总监Sin Man Lam博士为本文的共同通讯作者。)　　1、引言　　脂质作为细胞膜和细胞内细胞器(如脂滴)的主要组成部分，发挥着一系列复杂的生物物理、能量储存和信号传导功能，这些功能是细胞机制正常运转的基础。脂质代谢失调涉及多种主要疾病，包括糖尿病、心血管疾病、代谢相关性脂肪肝(MAFLD)、癌症、神经退行性疾病、传染病等。近几十年来，随着脂质组学的蓬勃发展以及分析工具/技术的改进，脂质的结构和生物学复杂性才开始被解开。　　质谱(MS)是广泛用于脂质组学领域的主要分析技术，相对于其它方法，它具有更高的灵敏度、更大的选择性、更强的稳定性和更高的特异性。质谱仪的快速发展，伴随着软件和数据库的进步，使得来自不同生物样本的各种生物液体(血浆、血清、尿液、唾液、泪液、痰等)、组织和亚细胞器中的脂质能够以前所未有的分辨率进行表征。脂质组覆盖范围的扩大极大地促进了疾病生物标志物的识别、表型验证以及假设的产生，并在脂质数据分析中提出了可能的系统方法，包括功能脂质模块的构建和脂质通路分析。　　脂质组学的典型工作流程和应用　　经典的脂质组学给出了构成生物样本的不同细胞群的“平均”图谱，这通常需要一个器官的代表性组织样本，使得最终构建的图谱能够反映一般的生物状态。然而，取一个有代表性的组织切片，忽略了脂质的空间分布，而脂质的空间分布往往具有重要的生物学意义。例如，该研究团队先前对金线鲃属洞穴鱼和地表鱼全脑切片的定量脂质组学研究发现，洞穴鱼中的硫苷脂(髓鞘的主要脂质成分)普遍减少。基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱成像(MSI)进一步揭示了洞穴鱼硫苷脂缺失的区域与中缝5-羟色胺能神经元的位置相对应。因此，金线鲃个体大脑脂质的空间分布图谱有助于证明5-羟色胺能神经元的脱髓鞘是洞穴鱼攻击性行为丧失的基础。　　随着光学成像和细胞内电生理学的技术创新，人们得以在单细胞分辨率下深入研究组织的生物结构，细胞异质性的普遍性变得明显起来。单个细胞与邻近细胞以及它们的原生微环境动态地相互作用和交流，最终影响由不同的单细胞脂质组(和代谢组)所反映的细胞内生物化学状态。事实上，早期组学的单细胞革命揭示了细胞异质性在无数生物环境中的普遍性。例如，单细胞蛋白质组学揭示了循环系统中肿瘤细胞表面蛋白在单细胞水平的异质表达，这些蛋白预测了对药物治疗的不同细胞反应，而随着疾病的进展，患者体内这些相同蛋白的平均表达并不能确定真正的治疗效果。在这篇综述中，作者讨论了单细胞水平的脂质组学革命如何从早期的组学开始，揭示细胞内以脂质为中心的见解，以及其潜在的应用和独特的技术挑战。　　2、单细胞脂质组学的新兴技术　　与单细胞基因组学和单细胞转录组学相比，单细胞脂质组学(和代谢组学)提供了最接近实际表型的数据信息。脂质组学与代谢组学的区别主要在于其关注非极性疏水代谢物，这些代谢物需要不同的提取和分析方案(例如需要不同的溶剂系统)。与信号可以扩增数百万倍的单细胞转录组学不同，高灵敏度对于单细胞脂质组学至关重要。此外，脂质在细胞内和细胞外的不同作用使细胞脂质组具有动态性和多功能性，这需要在采样时极度谨慎和快速，以便收集的细胞能够反映其原始状态。　　2.1 单细胞的取样　　经典脂质组学侧重于批量分析，以最小化组内的异质性，而单细胞脂质组学则侧重细胞间的差异。因此，收集技术应努力保持细胞异质性，并尽量减少来自邻近细胞和细胞外基质的污染。许多现有的样品处理或细胞分离策略可以扩展到单细胞脂质组学的采样中，包括膜片钳、微量移液、流式细胞荧光分选(FACS)和微流控单细胞阵列等。这些采样技术有其独特的优势和技术瓶颈，应根据组织或细胞类型的性质以及要解决的生物学问题逐案考虑选择。例如，倾向于成团粘附和/或对操纵敏感的细胞在采样过程中可能表现出较高的细胞死亡率，这会混淆数据并导致生物学错误解读。通常，非粘附细胞，如循环中的各种类型的血细胞，更易于进行高通量单细胞处理。组织的细胞外基质(ECM)的组成以及细胞分布各不相同，因此需要获得单分散细胞的优化方案，例如机械切割、酶解或这些方法的组合。特别是，与正常组织相比，病变组织(例如纤维化组织)可能具有明显不同的解离动力学，因此，优化分离方法以确保收集单分散、完整和有活力的细胞用于单细胞脂质组分析是非常重要的。　　膜片钳通常用于研究神经元、肌肉纤维和心肌细胞等易兴奋细胞，其优势是在相对原生状态下对细胞进行采样，通常来自新鲜的组织切片。然而，在膜片钳辅助的单细胞脂质组学分析中，在不破坏细胞膜的情况下分离完整的细胞是特别具有挑战性的。例如，使用膜片钳从灌注的小鼠大脑切片中捕获单个神经元细胞体不能完全保存轴突和相关终端的完整性，这可能会影响所得到的单个神经元脂质组数据。考虑到质膜是单细胞脂质组的重要组成部分，在单细胞分离过程中对质膜的损伤对单细胞脂质组分析尤为不利。此外，细胞损伤可能触发膜修复过程，这改变了原生细胞脂质组的特征，并混淆了下游分析。　　如果谨慎操作，精密微量移液管可以获得完整的细胞，但它的低通量低且相对耗时，因此更适合于感兴趣的稀有细胞类型的取样。　　FACS可将具有不同表型的单个细胞(由特定蛋白质(抗体)的荧光强度定义)排序到用户预定义的特定血管和缓冲液中，以实现相对高通量的单细胞分离，该方法错误率较低(低于1/100)，且细胞质膜通常保持完整。FACS的一个主要缺点是需要大量的细胞(超过10,000个)，因此不适合分离数量少的稀有细胞类型。悬浮细胞的要求也意味着细胞在采集样品之前不处于其原始状态，单个细胞的空间位置丢失。如果使用非质膜荧光标记物来标记细胞，则需要验证瞬时孔形成对特定质膜脂质和细胞内代谢产物的影响。　　微流控装置包括使用阀门、油滴或纳米管对单个细胞进行微型分隔。基于液滴的策略可能不适合单细胞脂质组学，如果单个细胞的包封是在油滴中完成的，这干扰了下游的脂质分析。油包裹的水滴为下游单细胞脂质组学提供了更好的选择，但是在去除油相期间需要谨慎，以获得相对清洁的液滴内细胞提取物用于下游分析。虽然微流控芯片的处理量高，对原料数量的要求较低，但其后的样本处理通常是在现场进行，这限制了 MS 在选择脂质提取方案进行下游分析时的灵活性。此外，有效的脂质提取需要使用有机溶剂，例如氯仿和甲基叔丁基醚(MTBE) ，这些溶剂与大部分用于制造纳米芯片的塑料材料不太相容。　　基于探针的电喷雾电离(ESI)也经常用于单细胞采样，这涉及使用直径足够小的探针尖端以插入单细胞(~3-9μm)。提取溶剂连续输送以进行原位代谢物提取，随后将提取物引导到质谱仪中进行直接分析。然而，这种取样策略不能确保每个细胞的完整质膜被输送到下游分析。质膜包括全细胞中一半的磷脂和90%的总胆固醇和鞘磷脂含量，基于探针的采样可能会导致单细胞脂质组学的大量信号损失。　　与限制脂质提取程序选择的微流控芯片和基于探针的取样相比，激光捕获显微切割在为下游分析选择样品处理方案方面有更高的灵活性。微解剖的单细胞的空间信息被保留。然而，该方法事先必需用福尔马林或乙醇固定细胞，以确保在显微切割过程中划定单细胞边界时的形态清晰度，而在此过程中脂质和小分子代谢物会大量丢失。此外，即使事先固定，整个细胞的完整性也往往得不到保留，这也使得这种技术不太适合收集单细胞用于下游的脂质组学研究。　　无论采用何种细胞采集策略，采集后都应立即对分离的单个细胞进行淬灭和灭活，以停止酶活性并尽量减少细胞脂质的人为改变。　　　　单细胞脂质组学技术　　2.2 单细胞脂质的获取　　拉曼光谱具有非破坏性和非侵入性的优点，允许进行原位分析，在捕获单个细胞在其自然状态下的脂质方面具有优势，但其无法在分子水平上破译精确的脂质结构，这大大限制了其脂质覆盖范围。而MS由于在区分脂质异构体方面的卓越灵敏度和特异性，已成为单细胞脂质组学中的主要分析技术。除了结构解析，基于MS的方法还允许检查单个细胞内的空间和亚细胞脂质定位，如通过C60二次离子质谱(SIMS)分析海蜗牛Aplysia单个神经元上脂质的异质性分布。尽管与 MALDI-MS 相比，SIMS 的灵敏度较低，但其能够获得亚微米的横向分辨率，由于探针尺寸的限制，其横向分辨率限制在10μm。利用簇离子源的SIMS技术还具有更柔和的电离动力学，有助于检测完整形态的脂质，空间分辨率通常在100nm至1µm之间。　　在各种基于MS的技术中，MSI方法在取样细胞的原生微环境方面具有选择性优势，并能保留对生物推断有用的空间信息。目前已经开发了图像引导的单细胞器MALDI-MSI，用以比较来自Aplysia的致密核心囊泡和透明囊泡中脂质含量差异。尽管 MALDI-MSI 具有诸多优点，但是它存在共采样的缺点，即从相邻的细胞产生混淆信号。一些脂质对 MS 扫描过程中可能出现的环境干扰很敏感，通常需要至少一个小时或更长时间才能完成组织切片的检查。此外，MALDI-MSI 单细胞分析也容易因离子抑制而降低灵敏度。最后，精确的脂质定量仍然是 MSI 方法中的一个主要技术挑战，因为同位素内标与内源性脂质均匀混合以进行标准化在技术上是具有挑战性的。　　荧光成像在灵敏度以及空间/时间分辨率方面优于基于MS的方法，使其在单细胞成像中具有潜在的用途。然而，基于荧光的技术在单细胞脂质组学中的应用受到其脂质组覆盖范围的限制。在自然界中很少有脂质和小分子代谢物表现出自身荧光，这就需要使用荧光探针。与基于MS的方法不同，亲脂性染料通常可以标记特定的某一类脂质，但无法区分同一类脂质中具有不同酰基链组成的单个脂质种类，或不同的脂质异构体。另一方面，脂质的荧光标记极大地改变了脂质的生化性质，如有些脂质被优先分配到不同的膜微区中，而与荧光基团是在头基还是酰基链上引入无关。因此，目前的脂质荧光染料缺乏特异性，这限制了荧光光学成像在单细胞脂质组学中的更广泛应用。　　虽然单细胞取样和基于质谱的技术革新已经实现了单细胞脂质组学分析的可能性，但仍存在一些技术瓶颈，包括：脂质覆盖面相对较窄(通常只有不到一百个具有高置信度的脂质) 缺乏准确的结构鉴定 缺乏可靠的定量数据 以及对单细胞水平的分析可重复性验证不足。为了解决这些技术瓶颈并推动该领域的发展，必须采用新技术来更好地描述细胞的异质性，并以更高的精度和更大的定量准确性来阐明其生物学意义。　　3、单细胞脂质组学的技术瓶颈　　3.1 迫切需要高覆盖率、准确的识别和定量测量　　单细胞脂质组学的一个最终目标是构建单个细胞的精确脂质组图谱，以揭示细胞间的差异。即使在对大量的生物样本进行研究的经典的脂质组学中，与转录组水平的变化相比，具有生物学意义的脂质水平的定量变化通常较小。这使得准确的定量对于解读单细胞水平上微妙但有意义的脂质变化尤为重要。单细胞脂质组学的定量也具有相当大的挑战性，因为脂质的内源丰度会有很大的变化。一个细胞中内源性脂质的高动态范围意味着，在一个特定的样品浓度下，不是所有的脂质都能落入质谱检测器的线性范围。虽然这在大部分脂质组学中通常通过在另一个样品浓度下的额外进样检测来解决，但这又为单细胞脂质组学增加了另一个难度，因为来自单细胞的样品材料数量往往是有限的。内源性脂质丰度的巨大差异也需要色谱系统从其内源性丰富的对应物中有效分离微量脂质，以尽量减少离子抑制，提高次要脂质物种的敏感性，并扩大分析物的覆盖范围。重要的是，为了在单细胞脂质组学中进行准确的脂质定量，应加入稳定的同位素内标。如果没有适当的内标来归一化内源性信号，校正来自不同类别的脂质或携带不同酰基链的同一类别脂质的离子响应变化，产生的单细胞脂质组数据很容易出现错误。　　基因组几乎整个区域都可以测序和注释，而仅基于MS/MS数据却很难最大限度地确定高置信度的脂质结构。这一瓶颈部分是由于自然界中脂质结构异构体的广泛存在，其中一些异构体在缺乏专门的预处理(如化学衍生)的情况下很难分离。例如，单个TAG的甘油主链被酯化为三个脂肪酰基链，从而为每个分子式产生无数脂肪酰基链组合。此外，不同脂质类别的结构异构物可能会使脂质鉴定过程更加复杂，例如双(单酰基甘油)磷酸酯(BMP)和磷脂酰甘油(PG)，以及半乳糖神经酰胺(GalCer)和葡萄糖神经酰胺(GluCer)等。幸运的是，这些结构异构体中的一些物质在色谱上是可区分的。因此，适当的前期色谱分离的应用极大地促进了某些脂质结构异构体的准确识别和定量，从而实现了更大的脂质覆盖。　　虽然脂质组学是组学家族中一个较年轻的分支，但在过去二十年中，它的发展速度很快。基于常规高效或超高效液相色谱(流速为100-1000μL/min)并结合质谱(HPLC/UPLC-MS)的各种经典脂质组学方法已被开发用于多种生物样品。近年来，基于微流量(流速为10-100μL/min)的LC-MS方法获得了更高的灵敏度，并能够以更少的起始材料(例如≈20-1000个细胞)实现全面的脂质代谢。可以想象，通过减小柱直径和流速进一步缩小色谱分离的规模可以提高分析物浓度，从而提高检测灵敏度。因此，基于纳米流(即流速1μL/min)的超灵敏脂质组学方法有望在单个细胞内实现亚微米级的脂质检测和定量。然而，迄今为止报道的纳米流方法的脂质覆盖率仍然相对较低，通常只覆盖一到两个主要类别的脂质，如PCs、PEs和/或TAGs，或者没有适当的结构标识。仅基于一级质谱分析的分子式水平的结构鉴定会导致不准确和低灵敏度，这极大地影响了单细胞脂质组学的分析范围和质量。因此，在单细胞脂质组学能够在基础生物学和转化医学中发挥更大作用之前，通过精确的结构鉴定和精确的定量分析来扩大脂质的有效分析范围是必不可少的。离子迁移率-质谱仪在脂质鉴定中的应用将碰撞截面(CCS)引入到脂类鉴定中，增加了m/z、保留时间和MS/MS谱图上的另一个维度的信息，有望增强单细胞脂质结构鉴定的可信度。　　目前，单细胞脂质组学方法大多是低通量的，因此，与早期的单细胞组学研究相比，通常分析的细胞种类要少得多。鉴于与基因组/转录组相比，细胞脂质组的生物学动态范围要大得多，因此，在单细胞脂质组学实现更大速度和更高容量分析之前，建立健全可重复的方法、设定正确的技术基准和构建可靠的单细胞参考脂质组数据库至关重要。　　　　基于LC-MS的单细胞脂质组学的不同模式　　3.2 数据分析　　正确分析大型数据集是从各种组学技术中收集有用的生物学见解的先决条件。由于单细胞脂质组学仅处于发展的早期阶段，尚未建立系统的数据分析体系。针对海量数据定制的方法通常不直接适用于单细胞数据。这是因为大量数据分析中的分布假设经常不成立，原因是单细胞数据集拥有更高的噪声和稀疏度，存在固有的额外异质性。目前，单细胞脂质组学的出现在某种程度上加剧了在分析和解释脂质组学数据方面的瓶颈。鉴于目前在单细胞脂质组学中脂质覆盖方面的局限性，在单细胞脂组学分析中收集生物学相关的途径改变之前，需要在单细胞脂肪组学的采集和数据分析方面进行长期努力。　　4、单细胞脂质组学的生物学和转化前景　　在过去的十年里，由于分析化学的技术创新和各种组学技术的出现，生物化学从传统的系综测量转向单分子测量。传统的集合分析可能导致静态异质性，当分子集合包含在观察期内保持稳定或变化不够快的亚群体时，就会出现这种异质性，从而导致“没有明显变化”的误导性结论。生物事件的平均分析数据不会捕捉到与整体行为不同的分子。同样，在任何细胞群体中，细胞间的差异总是不同程度的存在，基于整个群体的批量测量不能完全描述单个细胞的完整表型。通过在种群和单细胞水平上同时进行表型分析，可以破译潜在的有意义的生物学偏差，从而为很多生物学问题提供新的研究方向。　　4.1 发育与细胞谱系追踪　　多细胞生物体从一个受精卵发育成一个由不同细胞类型和器官系统组成的复杂组织，整个过程被记录在细胞谱系树中，它概述了在发展成多细胞生物体的过程中，从单个母细胞到其不同分支后代的细胞转换。目前已经开发了各种工具来构建单个生物体的细胞谱系树，但大多局限于绘制有限数量的克隆种群。细胞谱系树对于科学家解开生命的错综复杂的工程，以及加深我们对生物体发育、器官生成以及疾病进展和发病的理解非常重要。通过拼凑生物体内单个细胞的发育轨迹，单细胞谱系追踪以前所未有的细节捕捉到整个发育过程中不同的细胞命运，这扩展了我们对细胞分化机制、细胞异质性以及细胞间发育潜力差异的理解。　　考虑到生物体的单个细胞携带着由DNA编码的相同的遗传物质，人们通常认为不同的细胞命运是由单个细胞中基因在空间和时间上的差异表达决定的。虽然乍一看，与单细胞转录组学相比，单细胞脂质组学与单细胞谱系追踪的相关性可能不那么直观，但许多科学证据阐明了脂质代谢在决定细胞命运中的作用。例如，脂肪酸氧化产生的乙酰COA是组蛋白乙酰化的前体，组蛋白乙酰化改变染色质结构，从而调节DNA对转录机制的可及性。在不对称细胞分裂过程中，脂筏(富含胆固醇的膜微域)的不对称遗传也被认为是胶质母细胞瘤子细胞不同治疗耐药的基础。真皮成纤维细胞中存在由不同种类的鞘磷脂组成的不同的脂类构型，这触发了不同的转录程序，进而驱动细胞间异质性的不同细胞状态的建立(例如，纤维形成或增殖)。因此，单细胞脂质组学可以增加另一个维度的有用信息，以识别不同细胞命运的分子控制。　　4.2 了解肿瘤异质性　　构成肿瘤块的细胞是异质性的，在基因表达、细胞代谢、运动性、增殖率以及转移潜能方面具有不同的形态和表型特征。这种现象被称为肿瘤内异质性，它延伸到不同的肿瘤(即肿瘤间异质性)，可由遗传和非遗传因素共同引起。肿瘤的异质性可能在一定程度上解释了为什么癌症在临床上仍然难以攻克。研究肿瘤的异质性，特别是增殖能力和转移的来源，将有助于确定新的治疗靶点，以及指导免疫治疗和药物筛选。细胞间脂质代谢的差异对各种癌症的生长和预后有重要影响，如单个胰腺导管肾上腺癌细胞的脂质组学分析观察到胰腺癌特异性脂质代谢失调，这可能是由于介导脂质合成的关键酶ATP柠檬酸裂解酶表达减少所致。单细胞脂组学在加深我们对肿瘤异质性的理解方面有很大的希望。　　4.3 剖析对疾病的免疫反应　　除癌症外，传染病和新陈代谢疾病也是对公众健康的主要威胁。哺乳动物的免疫系统保护宿主免受各种病原体的入侵。构成宿主免疫系统的免疫细胞表现出巨大的细胞多样性，可以根据各种刺激进行动态调整。例如，对不同严重程度的新冠肺炎患者的单个外周血单核细胞进行scRNA-seq检测，发现存在一种具有增殖和代谢活性的自然杀伤细胞亚群，其代谢活动与疾病的严重程度呈正相关。有趣的是，这一亚群的自然杀伤细胞显示出神经鞘脂代谢的增强，这突显了单细胞脂质组学从以脂质为中心的角度阐明单个免疫细胞对新冠肺炎感染的差异反应的潜力。除感染性疾病外，对从人胰岛分离的单个细胞的scRNA-seq分析表明，在1型糖尿病患者中存在免疫耐受的胰腺导管细胞亚群。这一导管细胞亚群的转录特征类似于耐受性树突状细胞(即缺乏CD80和CD86)，导致免疫耐受和抗原呈递时的T细胞抑制。值得注意的是，单细胞分析显示胰腺β-细胞的基因特征与抗谷氨酸脱羧酶(GAD)滴度相关。与GAD水平相关的基因通路富集丰富分析包括许多脂代谢途径，如鞘磷脂代谢和磷脂酰肌醇信号系统。虽然在这些研究中没有进行单细胞脂质组学，但上述结果强调了单细胞中的脂代谢对于破译不同疾病背景下宿主免疫反应的代谢基础的重要性。　　　　单细胞脂质组学的应用　　结束语　　单细胞脂质组学的发展仍处于起步阶段，我们相信随着该领域的发展，将会有更多的生物学和临床应用。技术突破彻底改变了我们研究生物学的方式，其标志是从整体分析过渡到专注于单分子和单细胞。随着我们以更高的分辨率检查生物结构，细微的差异被揭示出来，这可能会为新的研究方向铺平道路，从而为生物学和临床医学中长期存在的问题提供独特的见解。