活体单细胞基因电穿孔系统

成果名称 低压直流细胞电穿孔微流芯片系统 单位名称 北京大学 联系人 马靖 联系邮箱 mj@labpku.com 成果成熟度 □研发阶段 &radic 原理样机 □通过小试 □通过中试 □可以量产 成果简介： 电穿孔（电转染）是一种利用外加电场击穿细胞膜，使平时不能穿透细胞膜的大分子(核酸、蛋白质、药物等)进入细胞的技术。电穿孔技术已在细胞实验、基因治疗等领域广泛应用。但目前的技术均需要金属电极，金属电极产生的金属离子渗出、气泡等对细胞有不利影响，降低了转染效率。此外，高压脉冲电源的使用使得目前此类仪器操作复杂、价格居高不下。这些都大大限制了电穿孔技术的广泛应用。针对上述问题，北京大学工学院熊春阳课题组采用微流芯片技术，实现一种不需要微电极，仅利用简单低压直流电源即可实现的细胞电穿孔技术。这一技术将大大降低仪器制造成本，简化操作流程，并可以进一步发展为高通量、高效率的细胞电转染系统。 2009年，熊春阳副教授申请的&ldquo 低压直流细胞电穿孔微流芯片系统&rdquo 项目得到了第二期&ldquo 仪器创制与关键技术研发&rdquo 基金的支持。课题组利用微流体中因尺度效应而产生的层流，用高电导率的液体来代替电极，将细胞悬浮液通过流动聚焦技术夹在高电导率溶液之间，形成三个平行流动的稳定流层。通过将电极与两侧的高电导率溶液相连，再与直流电源相连，电压会大部分施加在中间电阻较大的细胞流层。由于微流尺度较小，即使很低的电压都可产生较大的场强，从而可以实现细胞电穿孔。 这项工作在基金的支持下得以顺利的推进，通过相关设备的购置和实验测试，课题组完成了微流控芯片的设计和加工、液体导电层的引入、不同类型细胞电转染参数的优化等工作。该项目目前已经顺利结题，相关成果已经申请中国专利，正在申请国际专利。 应用前景：该项目实现一种不需要微电极，仅利用简单低压直流电源即可实现的细胞电穿孔技术。这一技术将大大降低仪器制造成本，简化操作流程，并可以进一步发展为高通量、高效率的细胞电转染系统。由于课题组具有完全的自主知识产权，这一工作可以打破目前国外同类仪器建立的技术壁垒，具备较强的市场推广前景。

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哈佛仪器网络讲堂第二期- 高效基因导入-电穿孔在生命科学研究中的应用，将于2014年7月8日14：00开课。报名网址：http://www.instrument.com.cn/webinar/meeting/meetingInsidePage/1086 ， 欢迎参与研讨!本期简介：现代分子生物学发展的突飞猛进，随着人类基因组计划的完成，21世纪生物学研究已经进入了基因和DNA的微观量级。在这样的大背景下，电穿孔技术经过不断 发展正展示出愈发重要的价值和地位。电穿孔技术是利用电场作用使细胞膜的脂双层膜结构进行重新排列，形成许多微小的孔径，从而是外源分子可以通过细胞膜进 入细胞的一种重要分子生物学技术。如今被广泛应用于生物医药领域，实现基因和药物导入特定的细胞、siRNA基因沉默和基因疗法、细胞融合和单克隆抗体制 备以及核转移和动物克隆。与其他化学和生物导入方式相比，电穿孔有着得天独厚的优势，对导入的外源分子大小没有限制、无细胞毒性、具有很高的实验可重复性 并且操作简单快捷。配合专业设计的多样性电极，电穿孔技术的应用对象也拓展至体外悬浮细胞、活体动物、离体组织、子宫内胚胎、卵内胚胎和贴壁细胞，并且可 以进行大规模96孔高通量应用，从而使得电穿孔技术的应用领域得到了无限扩展，新的应用技术不断涌现......

据美国物理学家组织网10月16日报道，美国俄亥俄州立大学科学家开发出一种名为“纳米隧道电穿孔”的新技术，或称为NEP。利用其给细胞注射基因治疗药剂时，不用针头，而是用电脉冲通过微小的纳米隧道，几毫秒内就能把精确剂量的治疗用生物分子“注射”到单个活细胞内。该研究发表在最近的《自然纳米技术》杂志网站上。 　　长期以来，在进行基因治疗时，人们对插入细胞的药剂数量无法控制，因为人体绝大部分细胞都太小，最小的针头也无能为力。而“NEP让我们能研究药剂和其他生物分子是怎样影响了细胞的生物和基因路径的，现有其他技术都无法达到这么细微的水平。”该校化学与生物分子工程教授詹姆斯李说。他们用这种方法，将定量的抗癌基因成功插入到白血病细胞中并杀死了它们。 　　研究人员用聚合物压制成一种电子设备样机，用DNA(脱氧核糖核酸)单链作为模板来构建纳米隧道。詹姆斯李发明了一种使DNA链解旋的技术，并使其按照需要形成精确结构。他们给DNA链涂上一层金涂层并加以拉伸，使之连接两个容器，然后将DNA蚀去，在设备内部留下一条连通两个容器的尺寸精确的纳米隧道。 　　隧道中的电极将整个设备变成一个微电路，几百伏特的电脉冲从一个装药剂的容器经纳米隧道到达另一个装细胞的容器，在隧道出口处形成了强大的电场，与细胞自身的电荷相互作用，迫使细胞膜打开一个小孔，足够投放药物而不会杀死细胞。调整脉冲时间和隧道宽度，就能控制药物剂量。 　　为了测试NEP能否递送活性药剂，他们把一些治疗用RNA(核糖核酸)插入了白血病细胞，发现5毫秒的电脉冲能递送足够剂量的RNA杀死这些细胞 而更长的脉冲，如10毫秒，能杀死几乎所有的白血病细胞。作为对照，他们还插入了一些无害的RNA到白血病细胞中，这些细胞都没死。 　　詹姆斯李指出，由于这种方法一次只能给一个或几个细胞注射，更适合用在实验室。目前他们正在开发一种机械式细胞装载系统，一次能给10万个细胞注射，有望用于临床诊断和治疗。 　　“我们希望NEP能最终用于早期癌症检测与治疗，比如在干细胞或免疫细胞中插入精确剂量的基因或蛋白质，引导它们分化改变，不必担心过量注射带来的安全问题，然后把这些细胞放回体内作为一种细胞基础疗法。”詹姆斯李说，这种方法还可能用于白血病、肺癌及其他肿瘤。

近日，东胜创新主办的“电穿孔、电融合技术的应用”巡回讲座分为三场依次在广州、上海、北京举行。在广州的专场已于10月21日圆满结束，来自美国BTX公司的技术专家Robin E. Butler介绍了“Electroporation and Electrofusion——A methodology for efficient gene transfer in In vivo, In Utero,96 Well and Fusion applications”。 接下来的两场分别将于 10月22日下午14:30—17:00在上海中国科学院营养所35号楼2楼多功能厅； 10月24日上午 9:00—11:30在北京中国农业大学新综合楼马协三层举行。 上海的专场还将增加由中国科学院神经科学研究所的丁玉强研究员介绍“在体子宫内胚胎电转技术——在神经科学研究中的应用”；北京的专场还将增加由中国农业大学生命科学学院的卫恒习介绍“电融合技术在转基因动物克隆中的应用”。 背景介绍： 一、电穿孔、电融合技术的应用范围： 哺乳动物细胞或组织的转染、细菌和酵母的转化、动物细胞融合、活体/离体基因或药物导入、卵内基因或药物导入、核转移、植物组织和原生质体的转化、杂交瘤生成、胚胎操作、植物原生质体融合、蛋白质电整合/电插入。 二、美国BTX公司——电穿孔、电融合专家 自1983年成立以来，以电穿孔仪、电融合仪为主要产品，开发了电穿孔、电融合、转染、转化等方面的众多最新技术和产品，成为电穿孔、电融合领域全球领先的专业厂家。 三、东胜创新BTX产品链接 http://www.eastwin.com.cn/product_btx.asp

基于全身循环的静脉注射给药模式是癌症化疗最常见的方式。在临床上，化疗药物作用剂量与全身毒性之间存在矛盾关系。局部给药策略可以提高药物在靶部位的积累，但在促进药物在肿瘤内高效递送和在细胞内高效转运的效果方面较为欠缺；而仅依靠被动扩散的药物递送常导致肿瘤细胞内化疗药物含量低，肿瘤杀伤效果欠佳。针对这一问题，北京航空航天大学常凌乾等人在《Advanced Functional Materials》 （IF: 18.8）期刊上发表了题为 “Multimicrochannel Microneedle Microporation Platform for Enhanced Intracellular Drug Delivery” 的研究论文。该工作设计了一种3D 高精度打印的（nanoArch S130，摩方精密）、具有中空微通道的微针阵列（图1）。 图1.多微通道微针微穿孔平台靶向给药原理及制备示意图（平台直径8mm，平台分布间隔500μm的21个微针，微针底部直径300μm，高度500μm，每个微针均含8个贯穿孔道，孔道直径40μm）该生物芯片利用微通道装载药物，并在低电压直流电场的作用下，实现药物分子的快速递送；通过微通道聚焦电场的作用，在微针周围的肿瘤细胞膜发生电穿孔，进一步提高药物递送进细胞的能力。在活体实验中，该技术与周身送药、实心微针和局部板电极电穿孔系统进行了在体对比，在药物递送能力、肿瘤抑制、其他器官毒副作用等方面其优势显著（图2）。图2.试验设计的4M Platform介导化疗药（DOX）体内递送及对肿瘤的抑制作用。 该研究第一单位为北京市生物医学工程高精尖创新中心和北航生物与医学工程学院；常凌乾教授为主要通讯作者；南方科技大学郭传飞教授和北京化工大学庄俭副教授为共同通讯作者；研究生林龙、博士后王玉琼和研究生蔡旻堃为论文的第一作者。 文章链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/adfm.202109187

将小分子、核酸、蛋白质和药物导入细胞是监测和了解细胞行为以及生物功能的重要途径。然而，质膜是阻止外源分子进入细胞的生物屏障。因此，如何在保持细胞活力的同时高效地将外源分子递送到细胞中是细胞生物学领域的一个重要课题。为了克服现有大规模细胞内递送方法的弱点，例如细胞活性和递送效率不一致，主要基于膜破坏介导机制的微技术已成为一种有前景的解决方案。利用化学质膜穿孔进行单细胞递送的尚未得到广泛研究。2024年4月26日，清华大学化学系林金明教授团队在《ACS Applied Materials & Interfaces》杂志在线发表了题为“Chemical Plasma Membrane Perforation Generated by a Microfluidic Probe for Single-Cell Intracellular Protein Delivery”的工作。该研究使用微流控探针将含有毛地黄皂苷和货物的溶液精确地作用到单细胞上。毛地黄皂苷与质膜中的胆固醇结合诱导质膜穿孔，货物通过孔进入细胞。碘化丙啶 (0.67 kDa) 和 FITC-葡聚糖 (10、40 和 150 kDa) 可以在3分钟内成功引入单细胞，同时保持细胞活力。两种蛋白质（细胞色素C和亲环素A）被递送进入细胞，并观察到它们在细胞中得生理功能。图1. 微流控探针诱导单细胞化学质膜穿孔首先，利用Comsol Multiphysics软件对微流控探针形成的微区域进行数值模拟。使用荧光素（扩散系数=500 μm2 /s）来指示溶质扩散。结果表明，注入的溶液可以被完全吸出，并且溶质被限制在液滴状微区域内而不会扩散。微区内溶质浓度分布均匀。计算了基质上的剪切应力，低剪切应力不会对细胞造成额外的机械损伤。实验在与模拟相同的条件下进行，使用荧光素显示微流控探针产生的微区域，与浓度分布模拟结果一致。溶液的连续流动使微区中毛地黄皂苷和货物的浓度几乎恒定，有利于维持递送过程的连续性和稳定性。图2. 流体的数值模拟通过微流控探针进行碘化丙啶（PI）的细胞内递送来验证该方法的可行性以及优化递送条件。尝试使用 20-100 μg/mL 毛地黄皂苷将 PI 递送至U87细胞。随着毛地黄皂苷浓度的增加，ts（PI开始进入时间）和tm（PI进入速度最大时间）逐渐减少，表明细胞穿孔加速。当毛地黄皂苷浓度为60 μg/mL时，ts约为20 s，1 min内即可观察到清晰的荧光。此外，还尝试了不同的PI浓度进行细胞内递送，较高的PI浓度也使得PI能够更快地进入细胞。还测试了流速对递送结果的影响。注入流量保持2 μL/min，抽出流量在6~14 μL/min之间调整。当抽吸流速大于8 μL/min时，进入细胞的PI量随着流速的增长而显着增加。图3. 毛地黄皂苷浓度、PI浓度和流速对细胞内递送的影响为了证明该方法的效率和通用性，使用该方法将PI递送至U87、HUVEC和A549细胞。当递送时间为20秒时，三种类型的细胞几乎不发出荧光。随着递送时间逐渐增加，细胞的相对荧光强度显着增加，递送处理50 s后观察到强烈的红色荧光。由于洋地黄皂苷的作用，质膜逐渐透化，PI通过质膜上形成的孔继续进入细胞。还检查了该方法递送大分子的能力，使用不同分子量（10、40和150 kDa）的 FITC-葡聚糖作为货物。FITC-葡聚糖可以在3min内进入细胞，并且FITC-葡聚糖进入的量随着递送时间的增加而增加。图4. PI和FITC-葡聚糖递送的结果在验证了这种方法用于单细胞胞内递送的可行性后，作者尝试了细胞内蛋白质递送。Cyt C ( Mw = 13 kDa) 是线粒体中的一种蛋白质，可将电子转移到呼吸链以维持ATP的产生。当cyt C释放到细胞质中时，它会引发细胞凋亡。由于外源cyt C在正常情况下不能进入细胞，利用微流控探针将cyt C递送至A549中作为抗肿瘤药物以诱导细胞凋亡。对照组和仅用毛地黄皂苷或cyt C处理的细胞之间未观察到caspase-3水平和Hoechst 33342染色结果的显着差异。毛地黄皂苷诱导的质膜穿孔不会引起细胞凋亡。仅用cyt C处理的细胞中caspase-3的水平也没有增加，表明正常情况下cyt C不能穿过质膜进入细胞激活凋亡途径。然而，在进行毛地黄皂苷介导的cyt C递送的细胞中，caspase-3水平显著增加，蓝色荧光显著增强。细胞形态发生明显变化，细胞体积缩小，并形成凋亡小体。这些结果表明，递送的cyt C成功诱导细胞凋亡，并且外源蛋白可以通过微流控探针有效地引入细胞内并发挥作用。图5. Cyt C被递送至A549以诱导细胞凋亡为了进一步探索这种方法在细胞研究中的潜力，作者利用它来研究肿瘤耐药性。CypA (M w = 18 kDa) 是一种广泛存在的细胞内蛋白质，可充当抗氧化剂。最近有报道称CypA通过重塑细胞氧化状态介导结直肠癌耐药。BCNU是一种常用的抗肿瘤药物，其诱导细胞毒性的机制之一是谷胱甘肽还原酶的抑制导致ROS的积累。利用微流控探针将CypA递送到U87中，研究CypA对胶质瘤耐药性的影响。与对照组相比，未经CypA递送的细胞经BCNU处理1小时后ROS水平显着升高，并且细胞形态发生改变。对于递送CypA的细胞，ROS含量显着低于未递送细胞，并且细胞保持正常形态。结果表明，递送的CypA在细胞中具有抗氧化作用，这可能增强U87对BCNU的耐药性。抑制CypA表达可能是治疗神经胶质瘤的潜在方法。图6. CypA对胶质瘤耐药性的影响总结作者开发了一种基于开放式微流控探针的方法，以方便高效地实现单细胞递送。该方法通过使用化学试剂对单个细胞进行质膜穿孔，将最大分子量为150 kDa 的外源货物递送到细胞中。与载体介导或场辅助递送方法相比，该方法不需要对货物进行额外处理，无需物理场辅助的温和递送条件也避免了对货物和细胞的额外损伤。作者展示了使用微流控探针进行cyt C和CypA的细胞内递送，证明了该方法能够研究外源蛋白质对细胞生命活动的影响。未来，各种货物（肽、蛋白质、mRNA、DNA、质粒、细胞器等）可以通过这种方法导入细胞内，调节细胞的生理功能和命运。而且该方法不需要昂贵的设备，操作简单，有望成为单细胞递送的一种理想方法。清华大学化学系林金明教授为该论文的通讯作者，清华大学化学系2022级博士生宋扬为本论文的第一作者。该研究受到国家重点研发计划（No.2022YFC3400700）和国家自然科学基金（No.22034005）的支持。关于林金明教授工学博士，分析化学专业。1984年福州大学毕业，1992年在日本昭和大学国际交流基金的资助下前往该大学药学部从事访问研究。1994年获得日本政府奖学金转入东京都立大学攻读博士学位，1997年3月获得工学博士学位，同年留校任教，2000年入选中国科学院“百人计划”，受聘中科院生态环境研究中心研究员、博士生导师；2001年获得国家杰出青年科学基金，2002年3月底回国工作，2004年入选清华大学“百名人才引进计划”，受聘清华大学化学系教授、博士生导师。2008年受聘教育部长江学者特聘教授,2014年入选英国皇家化学会会士。目前主要从事微流控芯片质谱联用细胞分析、化学发光/荧光免疫分析、复杂样品前处理分析、空气负离子检测与健康评估等研究。已培养博士研究生43名（含联合培养，其中留学生2名）、硕士研究生28名、博士后11名（其中留学生3名）、访问学者10名（其中外国访问学者1名）。

近日，中科院青岛生物能源与过程研究所功能基因组团队与北京惟馨雨生物科技公司联合承担的科技部创新方法工作专项&mdash &mdash &ldquo 拉曼光钳筛选新方法在活体单细胞高通量分离中的应用&rdquo 通过了评审验收，这标志着全球首台活体单细胞拉曼分选仪在中国研制成功。 　　该研究是在青岛能源所研究员徐健和兼职研究员、英国谢菲尔德大学黄巍主持下，通过所企联合攻关完成的。项目组此次研发的是目前已公开文献报道的首台基于细胞拉曼指纹图谱的细胞手动和自动分选仪器。该分选仪可实现单细胞拉曼图谱快速采集，并首次将单细胞的拉曼信号采集时间缩短到1~100毫秒 还可完成基于拉曼图谱的细胞种类及生长状态快速鉴别等多项任务。 　　该仪器的核心优势在于，对细胞生化信息及其变化敏感，无须预知生物标识物，无须标记细胞，可进行原位和非侵害性的活体检测等。此项技术将对单细胞生物技术和单细胞基因组的研究产生积极的贡献。 　　项目组利用该仪器，已经在光合产油微藻生理状态识别、多环芳烃降解微生物分离等研究中取得初步成果，并建立起应用示范技术参照方法和数据分析流程。 　　据了解，目前该仪器已服务于国内外多个科研团队，在海洋资源挖掘、生物燃料和生物材料、生物能源种质筛选、食品微生物检测、药物研究、肿瘤监测与分选、环境微生物监控、农业生态研究等领域发挥重要作用。 青岛能源所首台&ldquo 活体单细胞拉曼分选仪&rdquo 样机通过验收 　　背景新闻： 　　日前，受科技部条财司委托，中国21世纪议程管理中心在北京组织专家对中国科学院青岛生物能源与过程研究所功能基因组团队与北京惟馨雨生物科技公司联合承担的科技部创新方法工作专项&ldquo 拉曼光钳筛选新方法在活体单细胞高通量分离中的应用&rdquo 项目进行验收，标志着研究所基于自主技术开发的首台&ldquo 活体单细胞拉曼分选仪&rdquo 通过科技部验收。 　　验收专家听取了项目组的工作总结汇报、审查了验收材料，认为项目组基于自主开发的&ldquo 活体单细胞拉曼分选仪&rdquo 开展的各项工作完全符合任务书下达的全部考核指标，一致同意项目通过验收。 　　在项目实施过程中，项目组成功研制开发了&ldquo 活体单细胞拉曼分选仪&rdquo (&ldquo Raman-Activated Cell Sorter&rdquo ，简称RACS)，并在中科院青岛能源所成功搭建了首台样机。该样机(编号RACS-1)由激光器、拉曼光谱仪、落射荧光显微镜、细胞分选系统以及自动控制系统组成，是目前已公开文献报道的首台基于细胞拉曼指纹图谱的细胞手动和自动分选仪器。目前，RACS-1已可实现的功能包括：单细胞拉曼图谱快速采集，并首次将单细胞的拉曼信号采集时间缩短到1-100ms 基于拉曼图谱的细胞种类及生长状态快速鉴别 拉曼-落射荧光不可培养功能微生物鉴定 拉曼光钳单细胞操纵 基于拉曼信号的单细胞计数 单细胞拉曼数据库系统 拉曼激活单细胞分选等。 　　与现有的基于细胞荧光信号的荧光流式细胞分选仪(&ldquo Fluorescence-Activated Cell Sorter&rdquo ，简称 FACS)原理和方法均不同，RACS是基于对单个细胞的拉曼化学指纹图谱(细胞生化信息)的获取并与参照细胞拉曼数据库比对，从而原位、不依赖于培养、高通量地分选具有特定(或指定)生化状态的单细胞。与FACS相比，RACS的核心优势在于：对细胞生化信息及其变化敏感、不需预知生物标识物、不需标记细胞、原位和非侵害性的活体检测等。因此，RACS可有效克服&ldquo 细胞功能异质性&rdquo 、&ldquo 尚不可培养微生物&rdquo 、&ldquo 探测未知的细胞表型&rdquo 等三个共性科学与技术瓶颈。 　　此外，项目组利用RACS-1在光合产油微藻生理状态识别、多环芳烃降解微生物分离等方面研究取得了初步示范成果，并建立起应用示范技术参照方法和数据分析流程，为未来对细胞表型鉴定及功能微生物筛选奠定了基础。

近日，清华大学欧阳证教授课题组在analytical chemistry上发表了single-cell mass spectrometry analysis of metabolites facilitated by cell electro-migration and electroporation，且以acs editors' choice形式亮点报道。 文章介绍了基于细胞电迁移-电穿孔的单细胞质谱分析方法，该方法无需细胞高精度操控平台，仅通过对单细胞施加一定序列的电压，即可实现对单个酵母等具有细胞壁的细胞内代谢物的可控释放与质谱分析。 acs美国化学会报道： acs 编辑良择 | 基于细胞电迁移-电穿孔的单细胞质谱分析方法通讯作者：欧阳证，清华大学作者：zishuai li (李自帅)，zhengmao wang (王正茂)，junmin pan (潘俊敏)，xiaoxiao ma (马潇潇)，wenpeng zhang (张文鹏)，zheng ouyang (欧阳证) 单细胞分析对研究细胞在转录组学、蛋白组学以及代谢组学等方面的异质性有着重要的意义。目前，科学家们开发了大量的单细胞分析方法和技术，例如荧光分析法、微流控芯片、流式细胞仪、单细胞测序等。质谱分析，因其低样品消耗量、高灵敏度、高定量准确性等优势，已经被广泛应用于单细胞蛋白组学、脂质组学和代谢组学分析中。然而，目前大部分的单细胞质谱分析方法，都需要依托于高精度操作平台，这给单细胞分析技术的应用带来了一定的挑战。 清华大学欧阳证教授课题组报道了一种基于细胞电迁移-电穿孔的单细胞质谱分析方法。该方法无需细胞高精度操控平台，仅通过对单细胞施加一定序列的电压，即可实现对单个酵母等具有细胞壁的细胞内代谢物的可控释放与质谱分析。如图1所示，在硼玻璃纳喷管中加入适当体积(约0.5 μl)的细胞悬浮液(约104细胞/ml)，该溶液内平均只含有单个细胞。由于细胞表面通常带负电，通过非接触式电极对溶液施加直流负电压，使细胞迁移到纳喷管尖端，并在针尖处封闭一段超小体积(约1.5 pl)的液体。之后施加高压脉冲电压，在细胞膜表面形成电穿孔，细胞内代谢物即释放到前端的超小体积液体中，从而避免了细胞内代谢物的过度稀释。最后，采用非接触式电极加压，由纳升电喷雾离子化将该部分溶液离子化并进行质谱分析。图1. 基于细胞电迁移-电穿孔的单细胞质谱分析方法 该研究中，首先用酵母细胞进行了方法验证。如图2所示，从离子流热图中可以看出，施加脉冲电压后，在质荷比m/z 50到800的范围内出现了大量的代谢物离子信号。图2b-c中比较了施加脉冲电压前后的单细胞分析质谱图。通过精确质量对比、串级质谱分析等方法，该课题组在单个酵母细胞内检测到了71种代谢物。图3a-f展示了几种典型代谢物的串级质谱谱图。 图2. (a)质谱离子流热图。在5 s时刻施加了高压脉冲电压。(b)负离子模式。(c)正离子模式。 图3. 负离子模式下单酵母菌代谢产物典型的串级质谱谱图 (a) glu, (b) gsh, (c) amp, (d) adp, (e)atp, (f) udp-hex. 除了酵母细胞，该方法还可用于其他种类的具有细胞壁结构的单细胞菌类的高灵敏度质谱分析。图4展示了莱茵衣藻(chlamydomonas reinhardtti)、杜氏盐藻(dunaliella salina)、斜生栅藻(scenedesmus obliquus)、绿眼虫(euglena viridis)的单细胞分析质谱图。图4. 不同种类细胞的单细胞质谱谱图。从内向外依次为：莱茵衣藻，杜氏盐藻，斜生栅藻，绿眼虫。 此外，该课题组还研究了不同培养环境下，单个细胞内代谢物相对含量的变化情况。将两组莱茵衣藻细胞，分别在有/无光照条件下培养24小时，之后采用本方法进行单细胞内代谢物的质谱分析。单细胞质谱分析表明，在黑暗条件下，衣藻细胞内的卡尔文循环内的碳固定被终止，细胞内有氧呼吸强度下降，糖酵解代谢增强。此时，细胞的光合作用停止，细胞通过糖酵解分解糖类以提供基本的代谢需求，同时降低有氧呼吸强度以维持生存。图5. 黑暗条件下的莱茵衣藻单细胞内部分代谢物强度比值变化。 本研究的相关结果已发表在analytical chemistry，并以acs editors' choice形式亮点报道。该论文得到了国家自然科学基金项目的支持。 文章链接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.analchem.0c02147

科技日报讯 美国西北大学开发出一种新型电穿孔微流控装置，能对分化中的干细胞进行电穿孔操作，在细胞生命的最重要阶段能够进行分子输送。这提供了研究神经元等原代细胞所必要的条件，为探索神经疾病致病机制打开了一扇门，可能会引发新一代的基因疗法。 　　电穿孔技术是分子生物学中强有力的技术手段。利用电脉冲在细胞膜上创建一个临时的纳米孔洞，研究人员就能将化学品、药物和DNA(脱氧核糖核酸)直接输送到单个细胞中。 　　但是，现有的电穿孔技术要用很高的电场强度来保持细胞悬浮在溶液中，打断了细胞通路，使敏感的原代细胞处在恶劣的环境中。因此，研究人员要在细胞持续分化和扩大过程中研究细胞的自然属性几乎没有可能。 　　据物理学家组织网近日报道，这个新型装置的英文缩写为LEPD，适用于在人工衬底而非自由浮动的培养基中生长的贴壁细胞，这类细胞的生长必需有可以贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的活培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长和繁殖。 　　研究人员说：&ldquo 不破坏分化却能推送分子进入贴壁细胞的能力，是生物技术学研究者进一步了解相关基础知识的必要条件，尤其有利于进行最先进的干细胞研究。在生物学和医学研究领域，对细胞进行正确环境下的无损操作是非常关键的技术。&rdquo 　　相关成果发表在《英国皇家化学学会》杂志上。

近日，星赛生物宣布EasySort单细胞微液滴分选系列产品升级，在芯片、硬件及软件三方面全维度创新和性能提升。其中，业内首创光镊辅助静态池成像分选技术在芯片上的应用可支持精确索引细胞分选，而新增的独创EasySort AUTO自动化模块及相关软件升级，使得显微镜可以智能化发现目标单细胞，并自动化分离获取，实现30秒内“精准擒拿”目标活体单细胞，单细胞得率达93%。升级产品可以更智能化、自动化的方式解决研究人员在单细胞分选环节一直以来的难题——“看得到，拿不出”，实现精细到不同细胞形态阶段的“所见即所得”，为微生物资源的探测和挖掘提供了有力手段。图1：EasySort AUTO提升活体单细胞分选的自动化与智能化程度此前，星赛生物EasySort系列于今年年初发布，是一款可实现原位状态下活性单细胞精准分选的装备，目前包括Lego（可将显微镜升级为单细胞分选仪）和Compact（高度集成化的单细胞智能分选仪）两个型号。通过耦联光镊和微液滴技术，EasySort为单细胞的观测监测、捕获操纵、分离提取提供系统化解决方案。而此次产品升级进一步应用了多个业内独创专利技术，使活体单细胞分析分选更精准、更智能、更高效，为后续单细胞多组学研究提供了更多科研创新思路。实验数据显示，升级的EasySort系统搭载的AI辅助图像识别算法对目标细胞识别的准确率达80%；系统嵌入的光镊技术可以捕捉并精准操控目标细胞；基于界面接触的微量液体分离专利技术，目标细胞能够以单管单细胞（One-Cell-One-Tube）的形式自动收集于PCR管中，通量为~120细胞/小时，单细胞率高于93%。该系统分选的目标单细胞可以直接开展单细胞测序、培养等工作，单细胞测序成功率高于84.2%，酵母细胞和大肠杆菌单细胞培养的成功率分别为~85%和~80%。相关科研成果近期发表于权威期刊《微生物》mLife。芯片升级：打造全新一代静态池芯片，实现高通量的精确索引细胞分选为了进一步简化技术操作流程，提升分选通量，并进一步支持大批量单细胞分析分选，星赛生物采用了基于OPSI的新一代的单细胞分选耦合培养/测序策略，业内首创光镊辅助静态池成像分选技术，可以精确索引的方式对细胞进行分类，能“所见即所得”、保持细胞原位活性、高通量地分选明场、荧光、拉曼成像下的目标单细胞，并支撑高质量的单细胞基因组/转录组测序。该技术对于细菌、古菌、真菌、动植物、人体等各种大小的细胞均广谱适用。相关工作得到了国家重点研发计划、山东省自然科学基金委和国家自然科学基金委的资助，相关研究成果发表于微流控领域国际权威期刊《芯片实验室》Lab on a Chip。图2：OPSI技术服务单细胞多组学研究软硬件升级：全流程自动化+独家AI算法，目标细胞识别更精准高效开发团队在原有版本产品基础上新增了自动化收集装置——EasySort AUTO系统模块，可实现自动化、智能化的从细胞群中精确分类不同形态的细胞。该系统由星赛生物联合中国科学院青岛生物能源与过程研究所单细胞中心开发，支持EasySort产品在一次上样之后，检索、分选、收集等环节实现全流程自动化。新增装置通过将光镊模块和自动采集模块耦合到正置显微镜来构建，安装简便并适配奥林巴斯、尼康、徕卡和蔡司等多个显微镜型号。产品同时升级了支持EasySort AUTO自动化收集装置的软件，可对细胞进行AI智能分析并精准检索目标细胞，其智能分选路径设计，在光镊锁定细胞启动分选时还可以使其自动避障。多个权威期刊论文实验结果验证EasySort对单细胞多组学的创新研究价值升级后的EasySort系列产品为研究人员提供了新一代的单细胞分选耦合培养/测序策略，提供了原位活体微生物单细胞分选的自动化、基于精确索引和保持细胞活力的解决方案，并已成功支持多个相关实验研究。例如，成功的利用AI辅助检测模型，实现单个细胞的形态图像快速获取并呈现预测结果。实验使用在亮度、形状和质地上都不同的两种酵母来验证识别的准确性。其中一种酵母对比度小、形状圆润、内部纹理无明显变化，而AI辅助检测模型精准的识别了相关特征。实验结果显示绝大多数酵母种类可以被正确分类。该研究成果发表于《微生物》mLife。近期在《芯片实验室》Lab on a Chip发表的论文也展现了OPSI的通用性、方便性、灵活性和低成本等优势，研究人员使用OPSI系统分选人体MCF-7单细胞进行RNA-seq，获得了高质量和高可重复性的单细胞转录组谱。目前，升级版本EasySort产品已实现样机下线及支持批量生产，升级后的装置及系统可与拉曼光谱仪耦合用于单细胞分析分选，将大大拓宽应用范围，其能将表型与基因型联系起来的能力也为单细胞多组学提供了更多研究空间。

高等植物和微藻能够利用光能将水和二氧化碳转化成淀粉等高能化合物，从而生产粮食和生物燃料。因此，高产淀粉细胞工厂的选育具有重要意义。目前，定量测定细胞中淀粉含量的方法通常包括破坏性的细胞处理过程、酶(或酸)介导的水解、水解产物的定量等多个环节，不仅需要大量细胞，且操作步骤繁琐、耗时耗力、成本较高，极大地限制了淀粉含量的高通量筛选。此外，传统方法通常无法检测自然界中大量存在的难培养微生物中的淀粉含量。 　　近日，中国科学院青岛生物能源与过程研究所单细胞研究中心助理研究员籍月彤、硕士研究生何曰辉等利用该中心研制的活体单细胞拉曼分选仪原型机(Raman-activated Cell Sorter，RACS)，通过单细胞拉曼光谱的快速采集和分析，发明了一种快速、非侵入性、不须标记、以单个活体细胞为单位的淀粉定量检测方法，为富含淀粉的种质资源选育提供了一种崭新手段。该工作发表在新一期的Biotechnology Journal上。 利用单细胞拉曼光谱技术在单个细胞精度定量监测微藻产淀粉过程 　　研究人员以478 cm-1拉曼峰强度作为细胞淀粉含量的定量标记对莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)以及工业常用藻株小球藻(Chlorella pyrenoidosa)进行了淀粉含量检测，证明该方法与传统试剂盒法测定结果相关系数(R2)达0.99。该方法无需破壁等繁琐预处理，信号测量时间仅需两秒，基本无耗材消耗，仅需个别细胞或纳升级样品。同时，该方法不需经过细胞纯化与培养环节，能将微藻种质淀粉含量筛选时间从几天缩短至几分钟。此外，该方法还能对难培养微生物资源进行检测并基于淀粉含量进行单细胞分选，从而极大地拓展了应用空间。 　　上述研究得到了科技部合成生物学&ldquo 863&rdquo 项目和中科院&ldquo 能源微藻生物炼制&rdquo 创新团队国际合作伙伴计划等支持，由徐健研究员和黄巍研究员共同主持完成，华东理工大学李元广教授团队也参与了该研究。

细胞与基因治疗是生物制药市场中增长最快的细分领域之一，也是除抗体药物领域外，另一个备受资本市场追捧的赛道，虽然一度受2016年的魏则西事件所影响，但仍阻挡不住各方对这一领域的看好和投入，近些年，国内不断涌现出专注于细胞与基因治疗产品的企业，到2024年，预计全球细胞与基因治疗市场规模将达437亿美元。有人说，细胞与基因治疗正在开创一个新的医疗时代。近几年，细胞与基因治疗研发投入在急剧增加，而这一过程必然离不开相关的技术和实验室工具，用于基因操作、细胞生长和维持，目前，许多现有实验室工具和新的技术正被应用于细胞与基因治疗产品研发、质量控制和生产制造过程中。2021年最新调研数据显示，细胞与基因治疗的实验室工具市场规模超过20亿美元，其中许多技术和产品呈双位数增长，随着这一领域的快速发展，相关的实验室产品市场也将水涨船高，目前，已有众多规模不一的仪器供应商加快了该领域的布局。细胞与基因治疗研发生产所用的仪器和耗材可简单分为六个部分：通用技术、基因治疗工具、转导与转染、细胞富集、细胞培养与扩增和冷冻保存。每一部分都包括一套广泛用于细胞与基因治疗开发制造的技术，包括仪器和消耗品。其中有成熟的实验室技术和产品，如PCR和流式细胞仪，还有较新的技术，如CRISPR和自动细胞处理系统。微流控、实时监测和生物信息学相关分析技术主要用于细胞与基因治疗确保产品产品的安全性和法规依从性，以及解决生产效率的问题，这些问题正是细胞与基因治疗走向市场所面临的挑战。细胞与基因治疗 实验室工具清单类别产品通用技术PCR细胞分析细胞计数基因治疗工具CRISPR质粒提取纯化转导与转染病毒载体转座子电穿孔细胞富集细胞分离细胞分选仪自动化细胞处理系统细胞培养与扩增乳细胞培养若血清补充剂GMP细胞培养基GMP血清及补充剂常规生物反应器一次性悬浮生物反应器一次性附着生物反应器冷冻保存冷冻介质和保护剂冷冻袋和冷冻瓶据悉，细胞培养和扩增产品在细胞与基因治疗工具市场中占比最高，最常用的消耗品是细胞培养基和血清，在细胞扩增领域的仪器方面，一次性生物反应器的需求正在快速增长。与传统反应器相比，一次性生物反应器具有更加灵活和节省时间的优越性。这一市场的规模也一定程度上反映了细胞疗法的高成本。上面所说的细胞培养和扩增细分市场占比最高，不包括按市场规模划分的两个最大的单个技术细分市场，主要是归类到通用技术和基因治疗工具市场中，这两类市场也是细胞与基因治疗领域非常具有代表性的市场，同样由耗材产品驱动，其中通用技术贯穿与整个实验室工作流。在细胞与基因治疗领域，赛默飞、默克生命科学是两大领先的实验室产品供应商，他们可提供的产品范围十分广泛，并且在细胞培养和扩增市场占有重要地位，此外，Cytiva、赛多利斯、BD和康宁公司也是这一领域主要的实验室产品供应商。除以上主要的工艺产品供应商外，还有一些特定技术的供应商，包括艾本德、贝克曼库尔特、Miltenyi Biotec和STEMCELL Technologies等。随着全球越来越多的细胞与基因治疗产品获得监管部门的批准，逐步形成标准化的研发流程和生产流程，细胞与基因治疗实验室工具将伴随着这一领域的发展而前景广阔。

活体光学成像(Optical in vivo Imaging)主要采用生物发光（bioluminescence）技术与荧光（fluorescence）技术。生物发光是用荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或DNA，今天，生物发光标记物可以标记到任何一种基因上，使对基因功能的全面细致研究成为现实。而荧光技术则采用荧光报告基团（GFP、RFP, Cyt及dyes等）进行标记，利用荧光蛋白在外源光源或是内源发光照射下被激发产生的荧光作为检测信号。研究人员能够利用一套非常灵敏的光学检测仪器直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。 该技术可被广泛应用于标记细胞或基因的示踪及检测；基因治疗在活体动物体内直接的观察和检测；基因组、蛋白组学、药学及生物技术在活体动物内的研究；药物及化学合成药物的药物代谢及毒理学监测；食品菌落生长成像；皮肤医学中皮肤疾病的体内成像；法医鉴定；微孔板成像，例如：免疫分析、报告基因、基因探针和嗜菌作用分析等；荧光团的体内成像，例如：Alzheimer疾病研究中结合嗪的β-淀粉沉淀物分析；转基因植物中通过报告基因对生理周期节奏的研究；凝胶成像分析等等。 但在研究过程中，研究者们必须事先用基因技术进行荧光素酶基因标记，或者某种荧光报告基团标记。目前活体光学成像系统的知名制造商，如Berthold、GE、Xenogen、Photometrics、Carestream Health等，不仅为客户提供先进的仪器，也提供具体实验所需的整套解决方案，包括试剂、实验手册、特殊用途的质粒、细胞株、转基因动物、细胞处理和动物处理设施等配套技术支持。出色的多任务处理能力，人性化的整体设计，便捷精确的操作系统，使实验室影像分析领域进入了一个全新的时代。 下面以研究干细胞活体移植后的存活率为例，简介一两种内源性荧光色素标记的实验方法，供专业人士参考。 用荧光色素DiD标记 间充质干细胞 1. 先用胰蛋白酶消化待标记材料，使之成为一定密度的悬浮液； 2. 从细胞培养箱中取出间充质干细胞，吸取含原有培养基的细胞悬浮液进行标记； 3. 用10 ml Mg/Ca-free PBS （不含钙镁离子的磷酸缓冲液）清洗细胞，吸去PBS， 钙镁离子会影响胰蛋白酶的活性，必须小心； 4. 加入预热的0.05% 胰蛋白酶液，加液量以T75型瓶为例，每瓶加5ml， 确保瓶的表面被完全覆盖； 5. 在细胞培养箱中37° C 孵育约 5 分钟； 6. 然后在显微镜下确认细胞已经完全分散，如果有细胞贴壁情况，轻拍若干次或延长孵育时间直至酶解消化完全成功； 7. 加入等量含 10% FCS的培养基中和胰蛋白酶； 8. 用移液器反复吸取几次确保细胞均匀分散； 9. 然后移取细胞悬浮液至15ml 已灭菌的有盖聚丙烯离心管中； 10. 400 RCF离心5 分钟； 11. 小心移去上清液，不要扰动细胞； 12. 将细胞重新悬浮于DMEM 并进行计数； 13. 需要待标记细胞在无血清DMEM溶液中的密度应为1x106 /ml ； 14. 每ml细胞悬浮液加入5 ?L DiD 染色液； 15. 用移液器将染色液与细胞悬浮液混合均匀； 16. 在6孔低附着性细胞板上37 °C 孵育20分钟； 17. 孵育完全后移取细胞悬浮液至15ml 已灭菌的有盖聚丙烯离心管中； 18. 400 RCF离心5 分钟； 19. 小心移去染色液，不要扰动细胞； 20. 用PBS清洗细胞，用移液器反复吸取几次确保细胞均匀分散； 21. 重复洗三次； 22. 细胞重新计数并用台盼蓝染色法检测细胞活性； 23. 可以进行活细胞成像了！ 用荧光色素ICG标记 人胚胎干细胞 1. 必须先准备好吲哚菁绿溶液（血容量、心输出量、肝功能测定剂）作为对照品 ，然后使之与转染试剂鱼精蛋白（抗凝血作用）混合； 2. 测出1ml吲哚菁绿溶液的活力，然后在100 ?L DMSO中溶解ICG； 3. 向混合物中加入 400 ?L Dulbecco的改良Eagles 培养基 (DMEM + 10% 胎牛血清)， 震荡均匀，吲哚菁绿溶液终浓度为2mg/ml； 4. 加入转染试剂鱼精蛋白，鱼精蛋白作为对照品的载体，使之能够有效进入细胞； 5. 在300 ?L ICG 和 300 ?L 无血清Dulbecco改良 Eagles 培养基中混入 5 ?L 硫酸鱼精蛋白溶液, 使之终浓度为 10mg/ml,； 6. 震荡5分钟使之形成复合物，标记溶液制备完毕； 7. 从 hESC 10mm Petri 培养皿中移去原有培养基； 8. 加入5ml预热的 DMEM； 9. 加入制备好的鱼精蛋白/ICG 溶液， 37 °C下孵育1h； 10. 孵育完全后移去染色液； 11. 用5 ml PBS漂洗培养皿以清除染色液； 12. 移去 PBS 再加入 5ml 0.25 % 胰蛋白酶液，37 °C下孵育5分钟使之酶解，适当震摇培养皿效果会更好； 13. 用移液器反复吸取几次确保细胞均匀分散； 14. 加入等量含 10% KSR的培养基中和胰蛋白酶； 15. 然后移取细胞悬浮液至15ml 已灭菌的有盖聚丙烯离心管中，400 RCF离心5 分钟； 16. 在全培养基中悬浮细胞； 17. 如果还有细胞团块，可以移去原有培养基用10ml预热的全ESC培养基重新悬浮细胞，重复酶解再离心； 18. 在这一点上，鼠源饲喂细胞需从hESCs中分离； 19. 然后将细胞悬浮液移至涂布琼脂的10 cm 培养皿中； 20. 37 °C 孵育 45 分钟，注意不要晃动培养皿，如此鼠源饲喂细胞会贴壁而干细胞保持悬浮； 21. 从Petri 培养皿中移出已标记的单细胞人胚胎干细胞悬浮液； 22. 细胞重新计数并用台盼蓝染色法检测细胞活性； 23. 可进行活细胞成像了！

图片来源：昵图网 　　随着第二代测序技术的普及，单细胞测序迎来了迅猛发展。 　　近日，南方科技大学生物学系副教授贺建奎在美国冷泉港参加了单细胞分析会议后，在科学网博客里写道：&ldquo 这是一个非常令人激动的前沿学术会议，我深深地体会到了单细胞基因组学时代的来临。&rdquo 　　他对《中国科学报》表示：&ldquo 单细胞基因测序技术的突破，只是开了一个很小的&lsquo 口&rsquo ，&lsquo 口&rsquo 的另外一边，就是一个非常漂亮的世界。&rdquo 他说，单细胞基因组学研究的强劲势头，昭示着人类正逐步迈进个体化医疗时代。 　　更重要的是，测序技术的发展使基因测序民用成为大势所趋，个人DNA测序咨询服务即是一例。美国路易斯维尔大学研究员徐鑫认为，基于个人基因组DNA信息的健康评估有潜在市场，有可能发展成为一个新兴的庞大产业。 　　高通量测序的推力 　　&ldquo 单细胞测序，就好像从太平洋里钓一条小鱼。这在以前是不可想象的，而现在我们技术上已经实现了单细胞测序，可以做很多以前不敢想象的事情。&rdquo 贺建奎表示。 　　耶鲁大学一篇发表在《遗传》杂志上的文章指出，单细胞基因组学研究，致力于从最小量的样品(终极目标是单细胞)获得全基因组的最大信息，即在全基因组范围内鉴定在不同水平上影响生命活动的基因群的功能和相互作用。在只有或只能用单细胞或极少量细胞的情况下，单细胞测序技术将一展身手。 　　贺建奎介绍说：&ldquo 高通量测序技术的发展，使单个基因组测序价格降到5000美元。&rdquo 　　单细胞测序在技术上实现突破，应归功于高通量测序技术。&ldquo 新一代基因分析平台Ion Torrent巴掌大小的芯片上就有上千万个测序微孔&rdquo ，据深圳华因康基因科技有限公司研发部负责人金虹介绍，类似于半导体集成芯片，高通量测序芯片的密度非常高，这样就能实现一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，效率非常高。 　　微流控技术帮了单细胞测序一个大忙&mdash &mdash 减少甚至避免基因污染。贺建奎说，微流控平台提供了一个适于单细胞基因扩增、与反应物充分接触、基因测序的&ldquo 微试管&rdquo ，可以降低单细胞测序的噪声。 　　他打了个很有意思的比方：&ldquo 就好像我们把小鱼从太平洋赶到小池塘，只需要很少的鱼钩(反应物)就能把它抓到，而且大大减少了&lsquo 误捕&rsquo 的机会。&rdquo 　　徐鑫认为，基因测序日益便捷，成本不断下降，研究人员都在努力向1000美元即可实现测序单个人基因组的目标迈进，因此基因组DNA测序有可能逐步发展为民用。 　　目前我国在高通量测序技术上不甘落后。金虹表示，开展研发具有自主知识产权的高通量测序技术，对于我国在这一新兴领域的发展具有重要意义，尽管这个过程可能漫长而艰辛。 　　基因病变的曙光 　　测序技术目前已在癌症的诊疗中崭露头角。金虹指出，目前基因测序技术已经在癌症的诊疗中发挥作用，尤其是在靶向药物作用靶点的基因表达水平的检测，能给癌症患者实质性的帮助。 　　&ldquo 然而，基因测序作为一种工具，目前在民用方面的受惠面还很窄，远远没有发挥它的作用，现阶段主要的用途还是在科研方面。&rdquo 金虹话锋一转，说：&ldquo 不过我们有理由相信，基因测序将会越来越多地向临床应用方向发展。&rdquo 　　据了解，癌症基因组的最新研究进展表明，癌症本身是一种多基因相互作用和影响的疾病，这正是癌症难以治愈的原因。而了解癌细胞如何在肿瘤内变化以及每个细胞内&ldquo 定居&rdquo 着多少版本的基因，这将有助于癌症诊断。 　　&ldquo 肿瘤的演化过程是复杂的。&rdquo 贺建奎认为，单细胞基因组学的研究，使人们能够认识癌细胞进化过程的更多细节，&ldquo 比如我们有望通过研究从血液中分离出来的单个游离癌细胞，实现癌症的超早期诊断和治疗的实时监测。&rdquo 他说，借此了解癌症的形成、扩散，可以为癌症的治疗提供更多的借鉴。 　　例如，近日深圳华大基因的研究人员揭示了癌症并非由常见的突变基因导致，在病人群体中所鉴定的频发突变可能与肿瘤个体无关。因此，在癌症分析和诊断过程中进行个性化治疗十分重要。 　　不仅对癌症，许多基因病变也可为鉴。贺建奎说，单细胞基因组学的一个功能就是揭示基因病变的根本原因，解开基因治疗的密码，对不同患者对症下药。 　　2012年，美国科学院院士谢晓亮课题组与北京大学生物动态光学成像中心研究员李瑞强课题组等合作，首次实现了高覆盖度的单个精子的全基因组测序。谢晓亮表示，这项工作构建了迄今为止重组定位精度最高的个人遗传图谱，这一技术方法在男性不育症研究和肿瘤早期诊断及个体化治疗等生物医学领域有着广泛的应用前景。 　　重新审视生命 　　&ldquo 尽管单细胞基因组学前景广阔，但并不意味着我们要改造生命。&rdquo 贺建奎说，&ldquo 帮助人们更深刻地观察、重新审视生命的奥秘，是单细胞基因组学研究的要义。&rdquo 　　一直以来，人体干细胞都被认为是单向地从不成熟细胞发展为专门的成熟细胞，生长过程不可逆转。 　　而2012年诺贝尔生理学或医学奖获得者，日本科学家山中伸弥和英国发育生物学家约翰· 戈登关于细胞核重编程的研究，彻底改变了人们对细胞和器官生长的理解：他们发现，成熟的、专门的细胞可以重新编程，成为未成熟的细胞，并进而发育成人体的所有组织。 　　贺建奎认为，通过单细胞测序技术对每个细胞的测序，对比细胞间的差异，就有可能有新的发现，诸如&ldquo 为什么有的干细胞发育成了心脏，有的发育成了手足?&rdquo 此类命题，单细胞基因组学可能会给出不同的答案。 　　&ldquo 我们通过对人体不同部位的单细胞的测序和基因比对，就有可能解开发育之谜。&rdquo 贺建奎说，单细胞基因测序将取代基因组测序的平均法则，&ldquo 对于每一种疾病，也可以从单个细胞的水平重新认识，从而揭示病变的根本原因。&rdquo 　　《自然》杂志网站这样评价单细胞基因组学：测序技术的飞速发展和成本大大降低，使得基因组测序成为常规技术。然而，大多数的人类基因组、癌症等研究仍然通过多个细胞抽提DNA进行测序，其中所忽略的细胞间的差异对于控制基因表达、细胞行为和药物反应的问题却有可能是至关重要的。单细胞测序有望成为个体化医疗的重点领域。

利用单细胞拉曼光谱技术在单个细胞精度定量监测微藻产淀粉过程 　　高等植物和微藻能够利用光能将水和二氧化碳转化成淀粉等高能化合物，从而生产粮食和生物燃料。因此，高产淀粉细胞工厂的选育具有重要意义。目前，定量测定细胞中淀粉含量的方法通常包括破坏性的细胞处理过程、酶(或酸)介导的水解、水解产物的定量等多个环节，不仅需要大量细胞，且操作步骤繁琐、耗时耗力、成本较高，极大地限制了淀粉含量的高通量筛选。此外，传统方法通常无法检测自然界中大量存在的难培养微生物中的淀粉含量。 　　近日，中国科学院青岛生物能源与过程研究所单细胞研究中心助理研究员籍月彤、硕士研究生何曰辉等利用该中心研制的活体单细胞拉曼分选仪原型机(Raman-activated Cell Sorter，RACS)，通过单细胞拉曼光谱的快速采集和分析，发明了一种快速、非侵入性、不须标记、以单个活体细胞为单位的淀粉定量检测方法，为富含淀粉的种质资源选育提供了一种崭新手段。该工作发表在新一期的Biotechnology Journal上。 　　研究人员以478 cm-1拉曼峰强度作为细胞淀粉含量的定量标记对莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)以及工业常用藻株小球藻(Chlorella pyrenoidosa)进行了淀粉含量检测，证明该方法与传统试剂盒法测定结果相关系数(R2)达0.99。该方法无需破壁等繁琐预处理，信号测量时间仅需两秒，基本无耗材消耗，仅需个别细胞或纳升级样品。同时，该方法不需经过细胞纯化与培养环节，能将微藻种质淀粉含量筛选时间从几天缩短至几分钟。此外，该方法还能对难培养微生物资源进行检测并基于淀粉含量进行单细胞分选，从而极大地拓展了应用空间。 　　上述研究得到了科技部合成生物学&ldquo 863&rdquo 项目和中科院&ldquo 能源微藻生物炼制&rdquo 创新团队国际合作伙伴计划等支持，由徐健研究员和黄巍研究员共同主持完成，华东理工大学李元广教授团队也参与了该研究。

近年来，肿瘤免疫疗法已广泛应用于癌症的临床治疗中，各种类型的免疫细胞特别是那些可以通过细胞间接触溶解靶细胞的免疫细胞受到了研究人员的重点关注。其中，由于自然杀伤细胞（NK）具有非特异性直接杀伤肿瘤细胞的特性，被认为是人体抵抗癌细胞和病毒感染的第一道防线。许多研究表明，免疫突触（IS）的形成是NK细胞清除靶细胞的关键，它们可以识别和消除病毒感染和转化的癌细胞。尽管对IS的特征及其形成过程有了深入了解，但通过细胞骨架调节其稳定性的机制尚不清楚。近期，韩国生物科学与生物技术研究院免疫治疗研究中心的研究团队在著名期刊《Nature immunology》发表了题为“NgR1 is an NK cell inhibitory receptor that destabilizes the immunological synapse”的文章，他们报道了一种新型的NK细胞抑制性受体Nogo受体1（NgR1），它通过干扰接触稳定性和调节IS形成来影响NK细胞对表达NogoA靶细胞的杀伤能力，并确定NgR1为IS形成过程中的免疫检查点，提出了一个可用于改善肿瘤免疫治疗的潜在靶点。为了验证NgR1干扰NK细胞的抗肿瘤功能，该团队首先研究了NgR1在细胞表面的表达，结果显示NgR1在多种免疫细胞中均有表达，如小鼠原代NK细胞、CD8 T细胞和EL4细胞系（图1a），而NgR1的配体NogoA在各种癌细胞系中表达。随后，对NgR1是否参与免疫细胞的细胞溶解过程进行了研究，发现在NEP1-40（NgR1的拮抗肽）处理后，NgR1敲除小鼠（KO）的脾细胞比WT小鼠的脾细胞具有更高的细胞溶解能力（图2c），并验证了NEP1-40的特异性（图1d）。接下来，通过建立WT和KO小鼠肺转移小鼠同基因模型（图1e），进一步证明了NK细胞中的NgR1对肿瘤生长具有负调控作用。此外，为了研究NgR1缺陷导致的抗肿瘤效果的改善是否源于免疫成分的内在变化，对WT和KO小鼠的免疫细胞群进行了分析（图1h）。结果表明，NgR1缺陷并不影响免疫细胞的组成，提示NgR1主要参与NK细胞的效应功能。图1 NgR1缺陷增强了NK细胞杀伤能力在小鼠中，NgR1参与了NK细胞的肿瘤控制，因而在人类NK细胞中也可能具有重要的作用。作者发现，NgR1及其辅助受体在人体UCB-NK、PB-NK、MNK、NK92和Jurkat细胞系中都有表达（图2a）。为研究NgR1的信号转导机制，使用Nogo-P4（NgR1激动肽）在NK细胞中激活了NgR1，发现在NK92细胞和UCB-NK细胞中，RhoA和LIMK都被激活，而Cofilin失活（图2b）。RhoA的激活通过肌动球蛋白的收缩和粘连蛋白的失活来促进应力纤维的形成，导致肌动蛋白细胞骨架重组。且F-肌动蛋白的积聚会引起细胞膜突起的形成，从而影响细胞的迁移和黏附。通过在表达Lifeact-GFP的NK92细胞中直接显示F-肌动蛋白，并使用视频显微镜观察Nogo-P4处理对F-肌动蛋白动态变化的影响。结果表明，经过Nogo-p4处理的NK92细胞中F-肌动蛋白强度和膜突出频率都显著增强（图2c、d、e）。这些数据表明，NK细胞中的NgR1通过RhoA信号调节肌动蛋白细胞骨架。图2 NgR1促进NK细胞F-肌动蛋白聚合随后，为了评估NgR1在NK细胞杀伤中的特异性，作者通过调节NK细胞或靶细胞中NgR1的表达来探究NK细胞介导的细胞杀伤作用。在几乎不表达NogoA的肿瘤细胞中，使用或不使用NEP1-40阻断NgR1对NK的杀伤效果没有差异（图3a）。而在过表达NogoA的K562肿瘤细胞中，NK介导的杀伤效果显著降低，并可以被NEP1-40所挽救（图3b、c）。在用NEP1-40处理后，NK细胞对U87MG细胞的细胞毒性增强（U87MG细胞是一种已知高表达NogoA35的脑瘤细胞系）（图3d）。并且当抑制U87MG细胞中NogoA的表达或NK92细胞中NgR1的表达时，同样会增强NK细胞毒性（图3e、f）。因此，上述结果表明，在NogoA存在的情况下，NgR1对NK细胞的细胞溶解功能具有抑制作用。值得一提的是，为了在K562细胞中过表达NogoA和在NK92细胞中抑制NgR1的表达，研究人员使用了NEPA GENE公司的NEPA21高效基因转染系统分别对上述细胞进行电穿孔，并成功将pCMV-NogoA质粒和NgR1 siRNA导入至相应细胞中，实现基因过表达和敲降的目的。图3 NK细胞介导的杀伤作用以NogoA-NgR1依赖性方式被抑制接下来，作者通过活细胞成像系统观察了NK细胞与靶细胞之间的相互作用，以探究NgR1如何抑制NK细胞介导的细胞杀伤。结果表明，大多数对照NK92细胞与U87MG细胞只有瞬时相互作用，而NEP1-40处理的NK92细胞与U87MG细胞稳定接触，且部分NK92细胞最终杀死U87MG细胞（图4a）。通常情况下，NK细胞与靶细胞先产生瞬时相互作用，然后形成稳定突触，再引导裂解细胞颗粒的极化分泌进行靶细胞裂解（图4b）。研究发现，NEP1-40处理显著减少了瞬时相互作用，增加了接触时间，从而增强了细胞毒性（图4c-e）。这表明，NgR1信号通过干扰稳定的突触形成来降低NK细胞的杀伤作用。在后续实验中，该团队还通过一系列实验深入探究了NgR1信号调节NK细胞与靶细胞接触的分子机制，证明了NK细胞与靶细胞的接触是由NgR1信号通路介导的F-肌动蛋白动态变化实现的，NgR1能促进F-肌动蛋白从细胞间接触向外聚合，导致NK92细胞在细胞颗粒向IS极化之前脱离。最后，他们使用异种移植小鼠模型对NgR1阻断剂的治疗效果进行了初步研究，证明了NgR1在免疫细胞中的表达可以作为免疫检查点抑制IS的形成，并认为NgR1可能是肿瘤控制中一个新的治疗靶点。总之，作者通过严谨的实验设计和巨大的工作量证明了NgR1是一种新型的NK细胞抑制性受体，它通过LIMK-cofilin介导的肌动蛋白动态变化来抑制稳定IS的形成，进而调控NK细胞对肿瘤细胞的杀伤力，揭示了NgR1改善NK细胞功能的一种潜在机制。在本研究的转染实验中，该团队多次借助NEPA21电转染仪将质粒和siRNA成功导入至肿瘤细胞或NK细胞中，这显现出NEPA21在难转染细胞中具有良好的转染效果，可以为科研人员在NK细胞的研究中提供强大助力。NEPA21高效基因转染系统采用全新设计的电转程序，配合专利的电压衰减设计，在获得高转染效率的同时，提高细胞存活率。操作简单，电转参数可见可调，适用性强。特别适用于难转染的原代免疫细胞、干细胞、神经细胞、活体动物、受精卵及宫内胚胎等的转染，已应用于众多著名期刊文献中，是进行悬浮/贴壁细胞、活体和离体组织转染的电转系统主流品牌之一。 文献信息（1）论文链接：https://www.nature.com/articles/s41590-022-01394-w（2）参考文献：Oh, SC., Kim, SE., Jang, IH. et al. NgR1 is an NK cell inhibitory receptor that destabilizes the immunological synapse. Nat Immunol 24, 463–473 (2023).https://doi.org/10.1038/s41590-022-01394-w

p 　　12月24日，The Scientist评选出了“Top Technical Advances 2015”，成像、光遗传学、单细胞分析以及基因编辑技术CRISIPR入选。那么，我们就一起看看这四大技术在过去的一年中都取得了哪些进展吧。 /p p 　　 strong 成像 /strong /p p 　　今年， a title=" " style=" color: rgb(255, 0, 0) text-decoration: underline " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S01-T000-1-1-1.html" target=" _self" span style=" color: rgb(255, 0, 0) " 生命科学 /span /a 的成像领域打破了过去的壁垒，科学家们通过显微镜学方法越来越深入的观察到了生命组织。 /p p 　　Spectrometer-free vibrational imaging by retrieving stimulated Raman signal from highly scattered photons. Science Advances. /p p style=" text-align: center " img width=" 500" height=" 281" title=" 1.jpg" style=" width: 500px height: 281px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201512/noimg/550d29a2-5d13-4f9b-80da-ed1514392728.jpg" border=" 0" vspace=" 0" hspace=" 0" / & nbsp /p p 　　在过去的十年里，一种称作为体内振动光谱成像(vibrational spectroscopicimaging)的技术一直被用来捕捉一些活体组织中蛋白质、脂类、核酸和其他分子的活动。尽管这一技术可在无需荧光标记的条件下显影组织，但它仍然太慢而无法适用于大多数的研究和 a title=" " style=" color: rgb(255, 0, 0) text-decoration: underline " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S01-T000-1-1-1.html" target=" _self" span style=" color: rgb(255, 0, 0) " 临床应用 /span /a 。 /p p 　　10月30日，Purdue大学的科学家们报告称，他们利用体内振动光谱成像技术大大提高了收集图片的速度(从分到秒)。新技术最关键的改进是不再需要收集分子振动信号的光谱仪。取而代之的是，这一改进的技术在光子进入组织前会对其进行颜色编码。 /p p 　　该研究的通讯作者 Ji-Xin Cheng 说：“我们的想法是在将光子发送到组织前，用不同的兆赫频率进行颜色编码。通过这样的方式，我们能够在几十微妙内收集漫射光子，并通过编码频率和光颜色之间的一一对应检索光谱。” /p p 　　Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nature Methods. /p p style=" text-align: center " img width=" 500" height=" 281" title=" 2.jpg" style=" width: 500px height: 281px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201512/noimg/b0bb94ab-9898-4818-9de9-d2b62801551e.jpg" border=" 0" vspace=" 0" hspace=" 0" / /p p 　　同一个月，发表在《Nature Methods》上的一项研究中，霍华德休斯医学研究所Philipp Keller领导的研究小组发明的一款新型显微镜让科学家们能够更加清晰、全面的观察活体动物的生物过程。 /p p 　　这款显微镜能够产生完整的、不透明生物体的图像，包括斑马鱼或果蝇的胚胎，在三个维度都有足够的分辨率，每个细胞都能展现出明显的结构。更重要的是，它能够观察到胚胎发育过程中细胞的移动，还能够监测大脑活动。研究人员用它记录了果蝇神经系统发育的过程，最终共有10,000个细胞。 /p p 　　 strong 光遗传学 /strong /p p 　　All-Optical Interrogation of Neural Circuits. Journal of Neuroscience . /p p style=" text-align: center " img width=" 500" height=" 281" title=" 3.jpg" style=" width: 500px height: 281px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201512/noimg/f53a88eb-91d0-4b20-b9af-9dabdc4fbcc1.jpg" border=" 0" vspace=" 0" hspace=" 0" / /p p 　　今年11月，MIT的Edward Boyden和斯坦福大学的Karl Deisseroth因他们在光遗传学领域的工作获得了表彰。光遗传学技术是指通过光线来操控神经元，科学家们一直在不断的改进这一技术。 /p p 　　本月前，在芝加哥举行的神经科学学会会议上，Deisseroth等人提出了全光电生理学(all-optical electrophysiology)的升级版。哈佛大学Adam Cohen和他的团队开发出了一种reporter，当引入到细胞中去时，在电压发生改变的情况下会发出红外线。Cohen与Boyden一起，将电压指示器与一种响应蓝光的膜通道一起导入到了细胞中，这使得研究人员能够用蓝光开启细胞，用红外线记录它们的活动。 /p p 　　Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics. Science. /p p 　　今年6月，发表在《科学》杂志上的一项研究中，研究人员在海藻中发现了一种紫红质通道蛋白(channelrhodopsin)，与先前开发的工程通道相比，它能够更快地抑制神经元活动。科学家们还开发出了一种对在光遗传学控制下神经元作出即时反馈的方法，维持它们的活性在一个理想的状态。这一“神经恒温器”(neuro thermostat)可在24小时内控制细胞的firing rate常数。 /p p 　　 strong 单细胞分析 /strong /p p 　　Droplet Barcoding for Single-Cell Transcriptomics Applied to Embryonic Stem Cells. Cell /p p 　　Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell /p p style=" text-align: center " img width=" 400" height=" 400" title=" 4.jpg" style=" width: 400px height: 400px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201512/noimg/21d86143-27bf-4226-8414-b90e7a49c325.jpg" border=" 0" vspace=" 0" hspace=" 0" / /p p 　　近年来，单细胞分析蓬勃发展，研究成果不断涌出，技术也越来越精准。今年，通过单细胞分析，科学家们鉴定出了一个新的细菌们，检测了小鼠肠道内最珍贵的细胞类型。5月，发表在《细胞》杂志上的两项研究使单细胞转录组学有了一个相当大的飞跃，并行检测的细胞数量从约100增加到了几千。 /p p 　　哈佛大学的Marc Kirschner和Steve McCarrol实验室开发出了一些高通量技术，能够在样本进入到搅拌器中去之前，快速、轻松、廉价地赋予每个细胞独特的遗传条形码。研究小组希望他们的技术将能够帮助生物学家们更深入地发现和分类机体中的细胞类型，绘制出大脑一类复杂组织中的细胞多样性图谱，更好地了解干细胞分化，以及获得更多有关疾病遗传学的认识。 /p p 　　两个研究小组各自开发了一些方法利用微珠将大量不同的DNA条形码同时传送到几十万纳米大小的液滴中。两种方法都利用了微流体装置来将细胞和微珠一起装入这些液滴中。这些液滴是在一个小型装配线上生成，沿着一根头发宽的槽道流动。微珠条形码附着到每个细胞的一些基因上，因此科学家们可以一批次测序所有的基因，追踪每个基因的来源细胞。 /p p 　　 strong CRISPR /strong /p p 　　我们熟知的基因编辑工具CRISPR不断带来新的研究成果，在许多研究人员利用CRISPR的同时，其他一些人则专注于改进这一技术。 /p p 　　Photoactivatable CRISPR-Cas9 for optogenetic genome editing. Nature Biotechnology. /p p style=" text-align: center " img title=" 5.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201512/noimg/153730c1-5f84-484b-a957-9d99a4d6fd77.jpg" / /p p 　　6月15日，发表在《Nature Biotechnology》上的一项研究中，科学家们结合CRISPR与光遗传学构建出了一种系统：一种光激活的新型Cas9核酸酶使得研究人员能够在空间和时间上更好地控制RNA引导的核酸酶的活性。 /p p 　　研究人员通过首先将Cas9蛋白分成两个失活的片段构建出了paCas9。随后他们让每个片段连接一个光控开关蛋白Magnet。当受到蓝光照射时，两个Magnet蛋白结合到一起，分开的Cas9片段随之结合重建出了RNA引导的Cas9核酸酶活性。重要的是，这一过程是可逆的：当切断光线时，paCas9核酸酶会再度分裂，核酸酶活性终止。 /p p 　　Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. /p p 　　Cas9酶是基因编辑系统中一个非常关键的组成部分，而脱靶效应一直是CRISPR技术需要克服的重大技术问题。11月30日，发表在《科学》杂志上的一项研究中，麻省理工学院-哈佛医学院Broad研究所CRISPR大神张锋的研究小组又取得了一项突破性的成果。研究人员通过创建了3个新版本的Cas9酶大大降低了CRISPR/Cas9系统的脱靶效应 有效改善了这一技术的最大局限性之一。 /p p 　　In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9.Nature. /p p style=" text-align: center " img width=" 450" height=" 281" title=" 6.jpg" style=" width: 450px height: 281px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201512/noimg/48e6fc4c-b79f-4a44-bdb7-88bcca74d8dc.jpg" border=" 0" vspace=" 0" hspace=" 0" / /p p 　　4月1日，发表在《自然》杂志上的一项研究中，张锋研究小组还鉴别出了一种更小的Cas9核酸酶版本。最常使用的Cas9酶源自化脓性链球菌(SpCas9)，因太大而无法装入到腺病毒载体中。这项研究中介绍了一种来自金黄色葡萄球菌的Cas9核酸酶(saCas9)，它比SpCas9小25%，从而为腺病毒的包装问题提供了一个解决方案。并未参与这项研究的杜克大学的 Charles Gersbach 说：“真正让人兴奋的是saCas9在体内真的能发挥作用。” /p p 　　Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers. Nature Biotechnology. /p p 　　同月6日，Gersbach和同事们也在《Nature Biotechnology》发表了他们的研究成果。研究人员结合一种组蛋白乙酰转移酶与Cas9构建出了一种表观遗传编辑器。他们破坏了Cas9切割DNA的能力，转而利用它作为一种自动引导装置到达基因组中的正确位点，并通过组蛋白乙酰化来启动基因。 /p p 　　 span style=" font-size: 14px " 备注：本文部分内容参考自生物通网站。 /span /p

单细胞光导系统是利用计算机系统融合光电半导体技术与微流控技术，打造一个单细胞分选、培养、分析以及回收功能的多功能单细胞平台，能够高效、快速、精准地进行各种基于单细胞分辨率下的细胞生物学研究和操作。目前，该技术平台已广泛应用于抗体发现、细胞株构建及合成生物学等领域，极大精简和缩短了新型生物药物相关研发工作的流程。目前，全球主流供应商仅有Berkeley Lights 一家。据悉，彩科生物完成了LyTARS™单细胞光导系统研发及商品化工作，实现了该领域国产零的突破。为了一探究竟，近日，仪器信息网实地走访了位于苏州的彩科生物，并与CEO程鹏博士进行了对话交流。走访彩科（苏州）生物科技有限公司（仪器信息网生命科学主编李博(左)；彩科生物CEO程鹏（右））芯片上的抗体发现实验室——LyTARS™单细胞光导系统程鹏表示，“寻找药物新靶点，一直是全球创新药物研发激烈竞争的焦点和难点。随着时间推移和易筛靶点被大量挖掘，新药研发面临着“低垂的果子被摘完”，潜在靶点难以筛选的窘境。工欲善其事必先利其器，发明新的药物发现工具迫在眉睫。然而，国外上游工具开发企业对中国药物研发的实时需求响应速度缓慢，尤其新应用开发领域，重视程度远不及欧美市场。作为一家专注于为生命科学提供先进研究工具的本土企业，彩科生物敏锐地捕捉到了机遇，基于整个研发团队的多学科交叉技术背景和坚定的工程师精神，通过数年时间成功自主研制出LyTARS™单细胞光导系统。”程鹏补充说，“随着流式细胞技术、微流控技术和光流体技术等相关生物技术发展和成熟，单B细胞技术不断革新和完善，成功地从实验室走向了商业化应用。相比于杂交瘤等传统平台，利用单B细胞技术搭建的单B细胞平台能够直接对单个B细胞或其分泌的抗体进行分析，绕开了传统的细胞融合和大量铺板的繁重低效的工作，使科学家摆脱了融合的限制和负面影响，同时，平台可以实现对单B细胞不同程度的高通量筛选，有效简化实验流程，从而大大缩短研发周期。基于新一代单B细胞克隆技术，彩科生物自主研发的LyTARS™单细胞光导系统，能够在芯片上直接完成单细胞抗体筛选、抗原结合及功能测试，将抗体药物早期发现周期从4-6个月缩短至1-2个月，大大加快了抗体药物开发进程。”彩科的研究员们使用LyTARS™单细胞光导系统进行相关实验坚持底层创新与多学科交叉融合程鹏认为，“底层创新和多学科交叉融合是促进国产高端科学仪器发展进步的两大关键因素。底层创新包括基础理论研究、新技术开发和创新以及新材料发现等，这些研究在短期内可能无法产生明显的商业效益，但它们是科技发展的基石，为未来的技术创新提供了坚实的基础；当代知识生产和学科发展已经步入多学科交叉融合的时代，单一学科的研究范式与思考角度难以实现科技创新和解决复杂的系统问题。多学科交叉融合旨在结合不同学科之间地研究思路，利用不同学科的优势最高效地产生实用性的研究成果。”程鹏表示：“从零做起，研发过程涉及多学科交叉融合，其难度不亚于基因测序仪”。据程鹏介绍，开发单细胞光导系统初期面临着研发难度大、国内供应链尚未成体系、诸多工艺设计也无前车之鉴等诸多挑战与困难。彩科生物拥有经验丰富的多学科交叉背景研发团队，始终坚持底层创新理念，综合运用半导体、微电子、生物工程、机器学习、材料化学以及自动化等多学科技术，实现了光电技术和微流控技术等关键核心技术突破。其中，多个核心零部件生产涉及的技术非常复杂，影响因素众多，不仅要研究材料本身性质，也要对材料开发工艺进行全新设计。最终，凭借坚持不懈的努力和多方协作，彩科生物完成了LyTARS™单细胞光导系统从研发到发售各个环节的工作。细胞生物学进入“单细胞”时代，LyTARS™系统应用前景广阔细胞是构成生命体的结构和功能的基本单位，早期基于群体细胞分析所获得的平均性数据，往往忽略了细胞个体间差异。随着生物技术发展和多学科交叉融合，细胞生物学作为生物学的重要分支，也已经开始进入一个全新的时代。单细胞多组学、空间转录组等新兴技术的出现帮助科研人员能够深入研究单个细胞的DNA、RNA、蛋白质，以单细胞分辨率组合多层信息，揭示单细胞基因组、转录组、甲基化、蛋白质组学等多种数据。程鹏介绍说，“彩科生物是一家旨在开发高效的产品以挖掘高分辨率的海量生命科学信息企业，以核心技术平台μ-MPF(Micro-scaled Multi Physics coupled Force)为基础，搭建了多个应用平台，其中包括LyTARS™单细胞光导系统和多重单分子检测平台。其中LyTARS™单细胞光导系统在细胞生物学研究具有广阔应用前景，它能更好地保留B细胞的多样性，在早期阶段即可得到高质量的阳性hits，避免“优秀克隆”的丢失。通过将独特的光电定位技术与微流控设计结合，不仅能够在一张芯片上精准地对单细胞进行挑选，还可以直接进行培养、实时而不间断地利用多个不同的荧光通道，监测细胞状态，对单细胞或单克隆进行多种实验，并根据实验时读取的特定结果导出需要的目标细胞和目标克隆。另外，LyTARS™单细胞光导系统还可以实现在线on-chip检测。除此以外，该系统还具有更丰富的功能性筛选，包括阻断实验、交叉活性等检测，不仅检测类型多样，检测的灵敏度也极高。”程鹏非常看好LyTARS™单细胞光导系统未来在细胞生物学领域的应用前景，也非常期待与更多国内优秀企业开展广泛合作，让彩科生物的生命科学研究工具尽快服务于中国生物医药产业。LyTARS™单细胞光导系统打包环节后记：近年来，中国高端科学仪器的制造和研发水平不断提升，尤其是生命科学仪器在国产化上已取得积极进展，市场也涌现出诸多优秀国产仪器，比如流式细胞仪、基因测序仪等，国产高端科学仪器正在开启宏大时代。LyTARS™单细胞光导系统成功研制不仅仅攻克了又一项国产高端生命科学仪器卡脖子”难题，也侧面证实多学科交叉融合是实现科技创新和解决复杂的重大问题有效途径。程鹏博士毕业于美国理海大学，从事基于半导体芯片的单分子基因组测序仪器的研究。创办彩科之前在精密科学仪器企业Asylum Research工作，负责APAC的技术团队。苏州彩科成立于2018年，是一家为生命科学提供先进研究工具的公司，一直专注于开发高效的技术平台以挖掘高分辨率的海量生命科学数据。目前，公司以核心技术平台μ-MPF (Micro-scaled Multi Physics coupled Force) 搭建了多个应用平台，其中包括单细胞光导平台、单分子灵敏度生物分子检测平台及多重磁性荧光编码微球平台。

p 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 什么叫做单细胞基因测序(Single-Cell Sequencing)? /span /p p 　　一句话说，就是单个细胞水平上对基因组进行测序。2013年，自然杂志把年度技术授予了单细胞 a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S01-T000-3-1-1.html" target=" _self" span style=" color: rgb(255, 0, 0) " 基因测序 /span /a (Single Cell Sequencing)，认为该技术将改变 a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S01-T000-3-1-1.html" target=" _self" span style=" color: rgb(255, 0, 0) " 生物界和医学界 /span /a 的许多领域。 /p p 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 我们为什么要进行单细胞基因测序? /span /p p 　　传统的测序方法，无论是基因芯片或者二代基因测序技术(Next Generation Sequencing，NGS)都需要从超过10万个细胞中提取一大堆(bulk)DNA或者RNA，而提供的信息是一大堆细胞的平均值。但是传统的方法，对于理解人体细胞的多样性有着明显的局限性。 /p p 　　在人体的每一个组织中，比如说，肾脏组织，拥有着大量不同的细胞类型，每一种细胞类型有着独特的起源和功能。每一个细胞的谱系和发展的状态又决定了每个细胞如何和周围的细胞和环境如何反应，把基因测序应用到单个细胞层面，对于我们理解细胞的起源，功能，变异等有着至关重要的作用。 /p p 　　关于二代基因测序已经详细在我们的前期两篇深度报告中进行了介绍，在本篇报告中，我们将详细解读单细胞基因测序，以及该技术对癌症，辅助生殖以及免疫学等领域带来的新的突破。 /p p 　　 strong 一、单细胞基因测序行业：刚启程，面临引爆点 /strong /p p 　　BCC Research的一项分析报告指出，2014年全球单细胞分析(Single-cell Analysis)的市场达5.4亿美金，预测将从2015年的6.3亿美金增长到2020年的16亿美金，复合增长率达21%。根据GENReports的报告，关于单细胞分析的文章发表在过去的几年也有着爆发性的增长。 /p p style=" text-align: center " 　　图2：单细胞分析的文章发表数量 /p p style=" text-align: center " img title=" 1.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/006c9fd7-a2cd-46b2-a028-18b51b5ea3cd.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　资料来源：GEN，民生证券研究院 /p p 　　其中，传统的单细胞基因组学主要是由基因芯片和PCR主导的，随着二代基因测序的成本以超摩尔定律下降，目前单细胞基因组学逐渐由二代基因测序技术接棒。 /p p 　　和qPCR在90年代的发展一样，目前所有的刺激因素(高度的科研兴趣，生物医药巨头公司的关注等)正在解锁这个市场，单细胞基因测序行业正面临引爆点。 /p p 　 strong 　二、单细胞基因测序的基本流程：单细胞分离--基因组扩增--测序和分析 /strong /p p 　　单细胞测序，简单地说，主要经过如下的步骤：单细胞的分离--DNA/RNA的提取和扩增(全基因组扩增和全转录组扩增)---测序以及后续的分析和应用。 /p p style=" text-align: center " 　　图3：单细胞测序的步骤 /p p style=" text-align: center " img title=" 2.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/782ee757-3c06-4a1b-9103-4c7336ac2929.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　资料来源：Recent advances and current issues in single-cell /p p style=" text-align: center " sequencing of tumors，民生证券研究院 /p p 　　2.1 单细胞的捕捉和分离 /p p 　　单细胞测序的第一步是单细胞的分离和提取，目前的方法主要有如下几种方法：流式细胞术，激光捕获显微切割技术以及微流控技术。 /p p style=" text-align: center " 　　图4：单细胞分离的三种方式：流式细胞术，激光捕获显微切割以及微流控技术 /p p style=" text-align: center " img title=" 3.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/ea66e087-c9b2-4930-a4d3-50025543fe8b.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　资料来源：Technologies for Single-Cell Isolation，民生证券研究院 /p p 　　1)流式细胞术 (Flow Cytometry) /p p 　　是指通过对于悬浮于流体中的细胞或者其他颗粒进行定量分析和分选的技术。在各种流式细胞仪中，大家主要讨论的是荧光活化细胞分类计FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting)系统分离单细胞。定量原理：待测细胞经特异性荧光染料染色后，加入样品管中，经过测量区，由染色后的细胞在激光照射下的荧光产生的电信号来进行定量分析 分选原理：通过流束形成含有细胞的带电液滴来实现的。 /p p 　　2)激光捕获显微切割技术Laser Capture Microdissection(LCM) /p p 　　LCM技术可以在显微镜直视下快速、准确获取所需的单一细胞亚群，甚至单个细胞，从而成功解决了组织中细胞异质性问题。其基本原理是通过一低能红外激光脉冲激活热塑模-乙烯乙酸乙烯酯(EVA)膜，在直视下选择性地将目标细胞或组织碎片粘到该膜上。 /p p 　　3)微流控技术(Microfluidics) /p p 　　微流控技术是一种用于精确控制微量液体的技术。微流控芯片是实施该技术的平台，通常通过细微的管道对液体实施操控，微流控对液体的操控尺度, 刚好适合于单细胞样品的处理操作。 /p p 　　2.2 全基因组扩增 (Whole Genome Amplification. WGA)/ 全转录组扩增 (Whole Transcriptome Amplification，WTA)：单细胞测序的难点 /p p 　　2.2.1 主要的三种全基因组扩增技术，各有优势 /p p 　　由于在单细胞中的DNA和RNA的数量非常小(几个pg)，用传统的测序仪无法检测，所以科学家们必须首先对这些分子进行扩增，同时尽量的减少错误。目前的全基因组扩增技术主要有三种：简并寡核苷酸引物PCR扩增(DOP-PCR)，多重置换扩增(MDA) 和基于多次退火和成环的扩增循环(MALBAC)。 /p p 　　1)基于PCR技术的全基因组扩增技术，例如DOP-PCR(简并寡核苷酸引物PCR扩增) /p p 　　DOP-PCR是一种部分随机引物法, 其引物构成为3& amp #8242 -ATGTGG-NNNNNN-CCGACTCGAG-5& amp #8242 ；主要 利用3& amp #8242 端ATGTGG这6个在人体中分布频率极高的碱基作为引导, 以6个碱基的随机序列来决定特异的扩增起始位点，从而达到扩增整个基因组的目的。 /p p 　　2)多重置换扩增(MDA) /p p 　　MDA是一种等温的链置换扩增反应, 其使用随机的6碱基引物在多位点和模板链结合, 接着利用 phi29DNA 聚合酶很强的模板结合和置换能力实现对全基因组的扩增。 /p p style=" text-align: center " 　　图5：DOP-PCR和MDA全基因组扩增技术简介 /p p style=" text-align: center " img title=" 4.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/d9b0aef0-e3b1-4c63-8313-c20796064bb3.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　资料来源：Single-cell genome sequencing: current state /p p style=" text-align: center " of the science，民生证券研究院 /p p 　　3)MALBAC(Multiple annealing and looping-based amplification cycles)基于多次退火和成环的扩增循环 /p p 　　通过采用特殊引物，使得扩增子的结尾互补而成环，从而达到近乎线性的扩增,该技术是哈佛大学谢晓亮教授团队发明的。 /p p style=" text-align: center " 　　图6：MALBAC全基因组扩增的示意图 /p p style=" text-align: center " img title=" 5.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/83e2f828-d990-4b9c-afd6-bd692fc52888.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　资料来源：Single-cell sequencing by Doug Brutlag，民生证券研究院 /p p 　　表1：三种类型的全基因组扩增方式比较 /p p style=" text-align: center " img width=" 600" height=" 302" title=" QQ截图20160302115018.jpg" style=" width: 600px height: 302px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/297e4e6e-a134-4101-a297-456cd703c3af.jpg" border=" 0" vspace=" 0" hspace=" 0" / /p p style=" text-align: center " 　　资料来源：Single-Cell Sequencing Technologies: Current and Future， /p p style=" text-align: center " 民生证券研究院 /p p 　　Navin 在研究报告中指出(来源：Cancer genomics: one cell at a time)，对于检测CNV(Copy Number Variation)的时候，DOP-PCR以及MALBAC较有优势，另一方面， MDA方法一般用来检测点突变。Gawad et al., (2015)更是指出，三种全基因组扩增技术并没有明显的胜者，具体方法的使用取决于研究的目的。 /p p 　　2.2.2 全转录组扩增 /p p 　　一个哺乳动物的单细胞大约含有10pg的RNA，其中mRNA大约在0.1-0.5pg，并不能满足目前测序平台的要求，所以需要进行全转录组扩增技术。 /p p 　　单细胞中提取的RNA首先经过逆转录出cDNA，然后对逆转录生成的cDNA进行扩增。目前主要的转录组扩增技术主要包括如下几种：传统的PCR，改进的PCR，T7-in vitro 体外转录组扩增以及Phi29聚合酶扩增。 /p p 　　三. 单细胞测序的主要应用：癌症，辅助生殖以及免疫学领域 /p p 　　当单细胞被分离，细胞内的DNA/RNA被提取和扩增后，二代基因测序(Next Generation Sequencing)可以用来进行后续的测序。当把基因测序应用于单个细胞层面，在下游应用领域有着先天独到的优势。 /p p 　　3.1单细胞基因测序技术有助研究癌症起因和治疗 /p p 　　首先谈一下癌症的异质性：中晚期的肿瘤或由一系列的肿瘤克隆组成，每一种克隆有着独立的变异，形态和药物反应。对于肿瘤克隆精准的诊断非常重要，因为一个占据原发性肿瘤5.1%的亚克隆种群在复发的时候可能成为主要的致病因素。 /p p style=" text-align: center " 　　图7：肿瘤的异质性 /p p style=" text-align: center " img title=" 6.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/88b49609-3a47-4577-ad2a-7e9b36b6a4dc.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　资料来源：Illumina，民生证券研究院 /p p 　　实体瘤由一系列不同的细胞组成，包括癌症纤维细胞，内皮细胞，淋巴细胞，巨噬细胞等。同时，实体瘤由多个肿瘤克隆亚种群构成，使得临床样本的分析更加复杂。当多个肿瘤克隆同时存在时，标准方法检测的要么是平均信号要么是主要的克隆群体(并不一定是最致病的)的信号。 /p p 　　而同时，肿瘤的异质性和癌症产生抗药性以及转移密切相关，所以，单细胞测序开始用来检测肿瘤内基因异质性，对于癌症起因以及后续治疗的研究非常关键和重要。 /p p 　　例如，Navin et al.(2011), 利用单细胞基因测序的方法(流式细胞术提取细胞-全基因组扩增-NGS)，在某个乳腺癌肿瘤组织中检测了100个乳腺癌细胞的CNVs，覆盖度大约6%，发现了三种完全不一样的克隆亚种群。 /p p 　　除了肿瘤细胞，单细胞基因测序同样可以应用于循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells)和外周血播散肿瘤细胞DTC(disseminated tumor cells)，该部分内容将在后续的研究报告中深入讨论。 /p p 　　3.2 单细胞基因测序助力辅助生殖 /p p 　　PGS(Pre-implantation Genetic Screening)是胚胎注入前遗传学筛查，主要是通过检测胚胎的23对染色体结构、数目，来分析胚胎是否有遗传物质异常 PGD(Pre-implantation Genetic Diagnosis)，主要用于检测胚胎是否携带遗传缺陷的基因，关于PGS/PGD的介绍，请参考我们之前的行业深度《基因+大数据的颠覆：从癌症基因测序到辅助生殖》。 /p p 　　PGD过程中，目前主要有三种方式获得活检材料：1)卵子的第一极体和第二极体 2)培养至第3天胚胎卵裂期的卵裂球细胞(一般取1-2个细胞) 3)培养第5天左右的囊胚细胞。 /p p 　　例如，牛津大学的Dr.Dagan Wells团队，通过对囊胚细胞进行单细胞基因测序，选择健康的胚胎植入。另外，谢晓亮教授团队通过对女方卵细胞极体细胞进行测序，结合胚胎选择，选择正常的胚胎移植。 /p p style=" text-align: center " 　　图8：卵母细胞减数分裂产生极体的过程 /p p style=" text-align: center " img title=" 7.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/a1c2724b-0f2c-4b27-9eca-d304dccd613c.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　资料来源：Genome Analyses of Single Human Oocytes，民生证券研究院 /p p style=" text-align: center " 　　(注：其中PB1和PB2是第一极体和第二极体) /p p 　　3.3 单细胞基因测序打开免疫报多样性研究之门 /p p 　　用单细胞基因测序分析免疫细胞的原因是现存的多样的病原体导致了免疫细胞的高度异质性，传统的检测方法，取样来自一大堆细胞，低估了单个免疫细胞的多样性，所以我们需要更加精确检测单个免疫细胞的遗传物质，从而理解机体复杂的免疫机制。正如开篇提到的Juno收购的单细胞基因测序公司AbVitro致力于T细胞和B细胞的基因测序。 /p p 　　图9展示了对单个T细胞受体基因测序(TCR Sequencing)的流程。TCR & amp #945 和& amp #946 mRNA经过逆转录，扩增，重叠延伸，目的基因被选择性地进行PCR扩增以及后续的分析。 /p p style=" text-align: center " 　　图9：TCR Sequencing过程 /p p style=" text-align: center " img title=" 8.png" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/04e7c357-80bd-4709-89dc-92ee07a28fa9.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　资料来源：Pairing of T-cell receptor chains via emulsion PCR， /p p style=" text-align: center " Illumina，民生证券研究院 /p p 　　四. 单细胞基因测序未来的发展之路 /p p 　　在目前来看，单细胞基因测序还处在非常初级的阶段，也面临很多技术的挑战，包括：如何高效的分离细胞，全基因组无偏差的扩增，以及下游的数据分析等。但各大生物医药巨头都已经目光锁定了这个方向，除了今年初Juno收购AbVitro(单个T细胞和B细胞进行基因测序)，去年八月BD公司收购了单细胞测序公司Cellular Research。Illumina也通过和Clontech合作，推出了单细胞RNA测序服务。 /p p 　　我们认为，未来的基因测序一定朝着更精准，更微观的方向前进，如今，单细胞测序正面临着一场革命，在单个细胞层面让我们在前所未有的水平理解基因组学，表观基因组学和转录组学的多样性。 /p p 　　背景案例： /p p 　　2016年1月，肿瘤免疫疗法的领头羊公司Juno宣布以1.25亿美金的股票和现金收购波士顿的一家单细胞测序公司：AbVitro Inc.。 AbVitro公司的技术起源于哈佛大学George Church的实验室，AbVitro的技术包括对单个T细胞和B细胞进行基因测序，帮助科学家们理解T细胞受体(T cell receptor & amp #945 和& amp #946 链的基因的复杂性。 /p p 　　图：Juno收购AbVitro之后的布局 /p p style=" text-align: center " img title=" 9.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/6ef1eca1-dc46-4600-9c6d-d95f77a85f9e.jpg" / /p

近日，中科院精密测量院/深圳先进院研究员徐富强研究团队基于新型基因编码生物磁共振成像技术，首次建立了一种在体无创全脑检测星形胶质细胞的新技术。相关研究进展在学术期刊Molecular Psychiatry上发表。星形胶质细胞是哺乳动物中枢神经系统（Central nervous system, CNS）中含量最丰富、分布最广、胞体最大的一种神经胶质细胞。星形胶质细胞具有多种至关重要的生物学功能，其功能异常参与多种疾病的致病过程。然而，星形胶质细胞形态不均且高度复杂，在同一脑区或不同脑区之间均有不同，且在生理和病理状态下也是动态变化的。因此，全脑维度无损检测并跟踪星形胶质细胞的动态变化相关技术的研发迫在眉睫。研究团队通过整合重组腺相关病毒载体（rAAV）和磁共振成像活体检测的优势，逐步在细胞水平，脑区水平及全脑水平实现星形胶质细胞的活体无损检测。自2016年起，研究团队在精密测量院研究员徐富强和王杰的带领下，联合磁共振成像与病毒基因改造技术率先提出一种新型基因编码生物磁共振成像技术，逐步实现神经元网络和星形胶质细胞在体水平的无创检测。其中，rAAV是近年来发展极为迅速的一类工具病毒，是研究神经科学相关问题和基因治疗的重要载体。团队首先对rAAV工具病毒的衣壳蛋白进行突变改造，并利用人类胶质纤维蛋白的启动子GFAP构建rAAV载体，提升了病毒工具在星形胶质细胞的转导效率。另外，水通道蛋白是一组高度保守的跨膜转运蛋白，对水具有高度选择通透性。过表达AQP1蛋白可产生弥散加权成像信号的改变，因而水通道蛋白基因可作为磁共振成像报告基因。团队继续对病毒载体rAAV2/5和rAAV2/PHP.eB进行优化改造，使其同时携带水通道蛋白报告基因和荧光元件，构建新型工具病毒，逐步实现脑区和全脑水平的星形胶质细胞的无创活体成像。在全脑成像研究中，团队构建可高效通过血脑屏障的新型rAAV2/PHP.eB-AQP1-EGFP工具病毒，利用尾静脉注射技术将该病毒注入小鼠体内，在病毒表达两周和三周后分别进行MRI活体成像，最终利用荧光成像对活体成像效果进行评估。结果显示，该新型基因编码生物磁共振成像技术不仅可实现星形胶质细胞的活体全脑成像，而且其成像时间适用于常用的光遗传学/药理遗传学相关研究。全脑维度星形胶质细胞的新型检测技术的开发将有助于加强对星形胶质细胞功能的理解，提升对其在调控整个中枢神经网络中的认识，为研究神经系统疾病的致病机制和治疗靶点提供了新思路。另外，该技术可应用到疾病模型小鼠相关的星形胶质细胞异常的相关机制研究，为此类疾病的早期预防起到了重要作用。中科院深圳先进技术研究院博士后李梅和精密测量院博士柳壮为该文章的共同第一作者，王杰和徐富强为通讯作者。该项目获得国家自然科学基金等项目的支持。该项目所涉及的病毒工具均可从布林凯斯（深圳）生物技术有限公司直接获得。

北京倍辉科技诚邀辽宁、吉林，黑龙江三省独家合作代理商倍辉科技有限公司是国内创新科技的引领代理商，位于科技密集的北京中关村。我们致力于将先进的产品及技术更好的服务于中国快速发展的生命科学及药物研究领域，涵盖活体动物成像，基因表达研究，非标记细胞成像研究，蛋白功能研究，转基因领域及纳米技术。有意向的代理商，请发邮件至：info@bio-sun.com.cn 或联系13701242384 蔡经理，也诚挚邀请其他省份的代理商联系合作。一． 两大重量级常规仪器（独家代理）1. 美国Denovix公司DS-11/DS-11+超微量分光光度计，采用安卓智能app触摸屏操作，高端悬臂式检测模式（远优于微量比色杯式），自动感应变换光程，最新的斜率检测技术，终生无需校准，堪称目前性能最好的超微量分光光度计2. 日本BEX公司CUY21EDIT II超级多模式细胞/活体基因电转化仪， BEX专利多模式脉冲技术，不用任何专用试剂即可高效转染原代细胞，血液细胞，免疫细胞等难转细胞，以及最佳的动物活体基因电转功能，既1998年BEX研发出全球第一款专业活体基因电转化仪之后又一款具有里程碑意义的电转化仪。CUY21Vitro-ex电穿孔仪，常规细胞电穿孔明星产品。LF301细胞融合仪，具备最佳的融合性能。二． 两大高端细胞研究利器（独家代理）1. 瑞典Phiab公司激光全息细胞成像及分析系统。激光全息技术是目前最佳的非标记细胞分析技术，可以提供完整的细胞形态学参数及图像分析，尤其适合于细胞增殖分化，细胞计数，细胞迁移，细胞凋亡，细胞3D成像分析等的研究。产品分为M3高端型和M4 mini型2. 瑞典Ridgeview公司Green蛋白-细胞相互作用分析系统。瑞典Ridgeview公司的创建者也是SPR技术的发明人。SPR技术是小分子互做研究的经典，但不适合于细胞样品的分析。Green是目前唯一一款细胞基础上的互做研究产品，应用广泛，包括病毒-细胞，细菌-细胞，蛋白-细胞，药物-细胞，细胞-细胞等的互做研究三． 其他著名品牌1. 日本ATTO公司，著名的基因表达发光检测仪，电泳，凝胶成像制造商。最新款RGB多色凝胶成像分析系统，超高性价比（独家代理）。2. 美国MDI公司，著名的拉针仪，煅磨针中心，细胞超微注射泵制造商（独家代理）3. 丹麦Labogene公司，著名的冻干机，真空浓缩仪，冷却循环水浴制造商（一级代理）北京倍辉科技有限公司www.bio-sun.com.cn发布者：倍辉科技有限公司联系电话：010-51581369/E-mail：info@bio-sun.com.cn

项目编号：NMCX22T-0095-ND2022-06项目名称：内蒙古大学科研仪器设备采购预算金额：985.7000000 万元（人民币）最高限价（如有）：985.7000000 万元（人民币）采购需求：第一包：多功能细胞电穿孔电融合系统等，包括多功能细胞电穿孔电融合系统、细胞成像微孔板检测仪、多功能微孔板读板机，具体要求详见招标文件；预算金额为243万元。第二包：高通量单细胞分离系统等，包括高通量单细胞分离系统、荧光定量PCR仪，具体要求详见招标文件；预算金额为232万元。第三包：免疫组化染色系统等，包括免疫组化染色系统、植物光合荧光测定系统，具体要求详见招标文件；预算金额为228万元。第四包：全波长酶标仪等，包括全波长酶标仪、体式荧光显微镜、植物叶绿素荧光成像系统、基因枪系统，具体要求详见招标文件；预算金额为164.7万元。第五包：全自动体视显微镜等，包括全自动体视显微镜、便携式高通量单分子基因测序仪，具体要求详见招标文件；预算金额为118万元。合同履行期限：详见招标文件本项目( 不接受 )联合体投标。

最近几年，关于单细胞测序的报道日益增多。事实上，单细胞测序是一个新兴的领域。据了解，单细胞测序萌芽于2010年，13年左右才真正发展起来。2014年，单细胞测序的应用被列为《自然—方法学》(Nature Methods)年度最重要的方法学进展。2015基因组学前沿研讨会将单细胞组学单独列为一个单元，可见单细胞测序在当前基因组学前沿研究中的热度。　　本次研讨会上，报告主题涉及单细胞组学领域的报告人，包括美国哈佛大学终身教授谢晓亮博士,美国德克萨斯大学达拉斯分校张奇伟博士，厦门大学杨朝勇博士，中国科学院重庆绿色智能技术研究院王德强博士，北京大学汤富酬博士，美国贝勒免疫研究所林巍博士，华中科技大学宁康博士，南方科技大学贺建奎博士，华中农业大学李响同学等。　　事实上，即使是来源相同的单个细胞，由于随机生物过程和环境扰动的原因，彼此在许多方面也存在差异，即细胞的异质性。常见的基因组测序技术避免不了这一现象带来的影响，基于这一原因，研究人员开启了单细胞测序技术的探索之路。此次研讨会的单细胞组学单元中也有多个报告涉及了单细胞/单分子测序技术的最新进展。　　其中，谢晓亮教授，于2012年在Science发表的论文中推出了一项新技术，多重退火和成环循环扩增技术(Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles, MALBAC)。这项技术能从一个细胞的基因组中，分离出DNA。据了解，这种技术能降低PCR扩增偏倚，使得单细胞中93%的基因组能够被测序。从而使得检测单细胞中较小的DNA序列变异变得更容易，也能够发现个别细胞之间的遗传差异。这样的差异可以帮助解释癌症恶化的机制，生殖细胞形成机制，甚至是个别神经元的差异机制。目前，这项技术已经应用到体外受精以及肿瘤的个性化治疗中。谢晓亮　　来自厦门大学的杨朝勇教授，运用液滴微流控技术进行高通量的单细胞检测，包括分离，处理和分析DNA、RNA和蛋白质，这种技术是在微流控芯片上发展起来的一种操纵微小体积液体的全新技术。在传统的液滴微流控技术基础上,将“油包水”改成“油包琼脂糖”,同时杨教授提出了一种琼脂糖液滴微流控技术。这项技术已经成功应用到蛋白结晶、酶分析、化学合成、单分子/单细胞研究等分子与细胞生物学及分析化学研究领域中。杨朝勇　　据了解，上世纪90年代已有关于利用纳米孔进行核酸序列识别的报道，该方法存在DNA易位速率过快的问题。中国科学院重庆绿色智能技术研究院王德强博士，正在研发新一代单分子测序技术，在直径小于双螺旋的固态纳米孔中，通过拉伸双链DNA，减慢单个分子的双链DNA的易位速度。王德强　　目前，单细胞的RNA或DNA测序方法不允许同时分析转录组和基因组序列。来自深圳南方科技大学的贺建奎博士介绍到，他们利用基于新一代测序技术的策略解决了这一问题。以小鼠卵母细胞为例，这种将单个卵母细胞DNA和RNA测序合并的方法可以达到基因组的高覆盖率和低偏好性转录组的可重复性。这项技术将有助于实现生物学和医学的核目标，即将生理或病理条件下单个细胞的基因型和表型完美地联系起来。贺建奎　　从此次研讨会上单细胞组学的热烈讨论中，我们可以感受到，现在是单细胞测序的蓬勃发展阶段，相信在不久的将来，科学工作者们能解释更多的诸如遗传性疾病的成因、癌症恶化机制等问题，为精准医学和个性化医疗等临床应用提供更坚实的理论基础。 编辑：史秀明

水牛是一种分布于热带和亚热带气候条件下的一种家畜，可为人类提供奶、役力和牛肉。全世界水牛总数约为15.8亿头，亚洲存养的水牛数占世界的97%。 由于其经济效益和应用价值，繁殖动物学家需要对牛、羊等大型动物进行研究。近年来，转基因经济动物，如转基因牛、乳腺发生器等研究非常热门。但牛不是一种常规实验室的模式生物，所以在细胞转染和基因改造时，可参考的经验不多。 文献表明，脂质体转染法对水牛细胞的转染效率不高，常规的电穿孔仪常带来较高的细胞死亡率、且转染率也不理想。一些新型的电转染仪，虽然能为许多难转染的细胞带来福音，但其转染试剂盒多针对人、鼠等动物开发，没有专用于牛的试剂盒。 NEPA21不需要转染试剂盒，利用优化的程序即可达到高的转染效率，为水牛甚至其它经济动物的转基因研究带来了便利。 2012年4月，华粤行仪器有限公司在广西大学展开水牛胎儿成纤维细胞的转染试用活动，获得了较高的转染效率和细胞存活率。实验者对NEPA21的转染效果给予了较高的评价。 GFP标准质粒转染水牛胎儿成纤维细胞效果图

随着三代测序技术（TGS，也即单分子测序技术）的发展，基于大量细胞的三代基因组测序数据被广泛应用于各种复杂大型基因组的组装，由于其读长相比于二代测序（NGS）技术有数百倍的增加，因此基因组中重复序列区域以及染色体重排等复杂结构变异区域都能被更好地组装出来。对于人类基因组的组装研究，端粒到端粒（T2T）联盟在2022年3月，使用纯合二倍体细胞系CHM13率先发布了首个完整的端粒到端粒的人类基因组参考序列CHM13v1.1。2022年3月，人类泛基因组联盟（HPRC）在预印本平台bioRxiv上发布了首个高质量人类杂合二倍体细胞系HG002的单倍型组装结果。目前，高质量的基因组组装通常依赖于大量细胞混合样本的三代测序数据，需要大量的基因组DNA（通常需要从数百万个细胞中提取几十微克基因组DNA），然而在基因组组装的实际应用中常常要面对两个困难：1、细胞群体中存在遗传异质性。基于大量细胞三代测序数据的基因组组装需要确保测序的样本中每个细胞的遗传背景高度一致，否则组装结果将很难区分同一个细胞内的不同单倍型基因组之间的差异和不同细胞亚群之间的基因组差异。只有降低或者消除细胞间的遗传异质性才能确保单倍型组装的准确性。但是，在人体正常组织样本中也常常广泛存在体细胞拷贝数变异（CNA）。与此同时，正常的人类细胞也会不断积累突变，同一块人体组织常常是由很多包含不同突变的细胞克隆组成。在癌症研究中，同一个肿瘤样本中不同癌细胞亚克隆之间的基因组异质性就更为明显。2、细胞数量稀少。在很多情况下，很难获取上百万个细胞以提取大量（几微克）基因组DNA。例如，在早期胚胎发育研究、司法检验、特别是在癌症基因组研究中（如循环肿瘤细胞、肿瘤活检样本、脑脊液中的肿瘤细胞、以及腹水中的肿瘤细胞等），能够获取的细胞数量常常很稀少，而且这些细胞很难在体外培养和扩增；即使偶尔可以培养扩增，也不能保证在体外培养扩增过程中其基因组不会进一步产生新的遗传变异。基于二代测序（NGS）平台的单细胞基因测序技术被广泛应用于微生物等简单小型基因组的组装。许多种类的细菌无法在实验室中培养，单细胞基因组测序可以与宏基因组学方法结合起来完成微生物的基因组组装。由于人类基因组结构、大小、以及复杂程度远超细菌等微生物，单纯使用基于二代测序平台的大量细胞基因组测序数据也无法组装出高质量的人类基因组参考序列（NG50很难达到Mb（百万碱基对）级别），那么使用少量DNA甚至单细胞基因组测序数据组装人类基因组则更具挑战性，它不仅需要基于三代测序平台的单细胞基因组长读长测序技术的支持，还需要合适的组装软件以及良好的生物信息学分析策略。2022年7月12日，北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）汤富酬课题组在Nucleic Acids Research发表了题为De novo assembly of human genome at single-cell levels的研究论文。该研究使用优化的SMOOTH-seq单细胞基因组三代测序技术，基于Pacific Biosciences（PacBio）HiFi和Oxford Nanopore Technologies（ONT）两种三代测序平台首次在单细胞水平上完成了Mb级连续性的人类基因组组装，并使用多种评价指标，充分探索了不同测序策略和组装工具对基因组组装结果的影响。1、全面优化了SMOOTH-seq单细胞基因组三代测序技术，使其同时适用于PacBio和ONT两种主流单分子测序平台。此前的SMOOTH-seq技术只适用于PacBio单分子测序平台，使用场景有较大的局限性。优化后的SMOOTH-seq技术既可以用于PacBio单分子测序平台，也可以用于ONT单分子测序平台，使用场景更加灵活，可以兼顾测序数据准确性和测序成本。2、使用hifiasm，Hicanu，wtdbg2等主流组装工具和95个单细胞的三代基因组测序数据（Pacbio HiFi平台），对人类慢性粒细胞性白血病（CML）细胞系K562进行了高质量基因组组装。组装出的主要叠连群（primary contig）的NG50（可覆盖50%的已知基因组区域的最短叠连群的长度）可达2.11Mb，也就是说在这个组装出的参考序列中，人类基因组中一半（15亿碱基对）以上的区域都被至少2.11Mb以上的叠连群覆盖了。最长叠连群可达14.12Mb，完整的通用单拷贝同源基因基准（Complete BUSCOs）比例接近95%，且大部分组织相容性复合体（MHC）位点（基因组上的一个有代表性的复杂区域，全长约6Mb）被成功组装出来（如图1所示）。图1. 95个K562细胞的基因组组装结果（Pacbio HiFi）3、使用hifiasm，Hicanu，wtdbg2等主流组装工具和人类正常二倍体细胞系HG002的157个单细胞的基因组三代测序数据（Pacbio HiFi平台）对人类基因组进行了高质量组装。组装出的主要叠连群（primary contig）的NG50可达0.65Mb，最长的叠连群可达6.82Mb，完整的通用单拷贝同源基因基准（Complete BUSCOs）比例接近91%。在使用此数据进行HG002的单倍型组装的过程中该研究发现经过指数扩增的基因组数据的k-mer分布会发生偏移，因此使用有双亲二代测序数据作为辅助的Trio-binning模式进行基因组单倍型组装结果更为准确。因此该研究分别使用Trio hifiasm和Trio Hicanu两种组织工具进行单倍型组装，得到的亲本叠连群的NG50可达0.3Mb左右，完整的通用单拷贝同源基因基准（Complete BUSCOs）比例均超过84%。通过比较HG002亲本六种经典人类白细胞抗原（HLA）位点的组装分型结果，Trio Hicanu能够正确组装出HLA区域的两个亲本的大部分基因位点（如图2所示）。图2. 157个HG002细胞的基因组组装结果（Pacbio HiFi）4、使用Flye，Necat，wtdbg2等主流组装工具和人类正常二倍体细胞系HG002的192个单细胞的三代基因组测序数据（ONT平台，低测序深度）对人类基因组进行高质量组装。研究发现，不同的组装工具对最终组装结果有很大影响，Flye展现出更为适合单细胞ONT三代测序数据的特性，组装出的叠连群的NG50可达1.38Mb，最长叠连群可达11.42Mb，完整的通用单拷贝同源基因基准（Complete BUSCOs）比例超过93%，多项指标都远超另外两个组装工具。同时组装结果能够补齐39个hg38版本的人类参考基因组中未组装出的缺口（gap）区域，其中14个区域在hg38中注释的长度超过50Kb（如图3所示）。图3. 192个HG002细胞以及30个HG002细胞的基因组组装结果（ONT）5、使用Flye，wtdbg2等组装工具和人类正常二倍体细胞系HG002的30个单细胞的三代基因组测序数据（ONT平台，高测序深度）对人类基因组进行高质量组装。为了探究仅使用极少量单细胞的基因组测序数据进行人类基因组组装的极限情况，该研究分别使用1个、10个、20个和30个单细胞尝试进行人类基因组组装，发现仅需要高测序深度的30个单细胞的基因组测序数据（平均基因组覆盖度~41.7%）就能完成叠连群 NG50高达1.34Mb连续性的组装。同时组装结果能够补齐38个hg38版本的人类参考基因组未组装出的gap区域，其中15个区域在hg38注释的长度超过50Kb（如图4所示）。图4. 30个基因组高覆盖度HG002细胞的基因组组装结果（ONT）6、通过对K562细胞系基因组的从头组装，该研究相比于使用原始单细胞基因组三代测序数据能更精准地鉴定出更多的基因组插入事件和复杂结构变异事件。对于K562这样的白血病细胞系，基因组从头组装之后是否能更好地鉴定出基因组结构变异（SV）事件是癌症研究中的重要问题。该研究分别使用hifiasm和Hicanu组装出的主要（primary）叠连群和替代（alternate） 叠连群来进行结构变异鉴定。发现组装后的叠连群比起原始单细胞数据直接比对能更准确地鉴定出基因组插入事件，召回率达到70%以上，精确度达到90%以上。同时，K562中的三对经典融合基因：CDC25A-GRID1、BCR-ABL1和NUP214-XKR3都能被精准地鉴定出来，而CDC25A-GRID1融合在原始单细胞基因组数据直接比对到参考基因组时是无法被发现的 (如图5所示) 。为了进一步验证基因组从头组装后找到的结构变异事件的准确性，该研究挑选了20个（14个插入事件，6个缺失事件）在组装后的叠连群中被鉴定到、但是在单细胞基因组原始测序数据直接比对到参考基因组时没有被鉴定出来的结构变异事件进行了PCR验证，准确率高达80%，证明了组装后的叠连群对结构变异事件的鉴定是精准可靠的（如图6所示）。图5. 组装后叠连群（contig）中结构变异事件检测的准确性 图6. PCR验证基因组结构变异事件的结果综上，为了解决基因组从头组装在实际应用中遇到的细胞遗传异质性和细胞稀缺性的问题，该研究使用优化的SMOOTH-seq技术在两种不同的主流三代测序平台上，采用不同的测序策略（高通量、低深度测序策略（multi-cells with low sequencing depth）和低通量、高深度测序策略（few-cells with high sequencing depth）），使用多种不同组装软件（hifiasm，Hicanu，wtdbg2, Flye，Necat等）、多个评价指标、以及不同组装策略，探讨了利用单细胞测序数据从头组装人类基因组的可行性，并确定了影响组装结果的主要因素，将基因组组装的分辨率提高到单细胞水平（少至30个单细胞）。未来随着单细胞测序技术和基因组组装策略的进一步发展，最终必将实现只用一个单细胞的测序数据就能组装出Mb级连续性的人类参考基因组的梦想。北京大学生命科学学院博士生谢昊伶以及北京大学前沿交叉学科研究院博士生李文为该论文的并列第一作者。北京大学生物医学前沿创新中心汤富酬教授为该论文的通讯作者。该研究项目得到了北大-清华生命科学联合中心、国家自然科学基金委、北京市科技委和北京未来基因诊断高精尖创新中心的支持。论文链接：https://doi.org/10.1093/nar/gkac586汤富酬研究员简介：汤富酬，博士，北京大学BIOPIC/ICG研究员，国家“优青”(2013)、“杰青”(2016）。1998年本科毕业于北京大学，2003年在北大获得细胞生物学博士学位，2004-2010年间在英国剑桥大学Gurdon研究所从事博士后研究， 2010年回到北京大学组建实验室，主要从事人类早期胚胎发育的单细胞功能基因组学研究。在国际上率先系统发展了单细胞功能基因组学研究体系，并利用一系列技术体系对人类早期胚胎发育进行了深入、系统的研究，揭示了人类早期胚胎DNA去甲基化过程的异质性以及其他表观遗传学关键特征，发现了人类早期胚胎中基因表达网络的重要表观遗传学调控机理，为人们提供了一个全面分析人类早期胚胎表观遗传调控网络的研究框架，加深了对人类原始生殖细胞的发育以及表观遗传重编程过程的认识。

马波*，籍月彤，刘阳，徐健*　　摘要：　　单个细胞是地球上生命活动的基本单元，单细胞精度的科学研究能够揭示生命科学的本质问题，已经成为国际研究热点。拉曼激活细胞分选(Raman-activated Cell Sorting，RACS)能够利用“单细胞拉曼图谱”这一细胞内在、免外源标记的“生化指纹”进行功能分选，突破“细胞功能异质性原理”、“大多微生物尚难培养”等共性科学问题与重大技术屏障。本文介绍了拉曼光谱在单细胞功能识别方面的研究进展，详述了基于拉曼光谱的单细胞分选技术和核心器件研制的产业化过程。同时，介绍了近期推出的第一代商品化的RACS仪器，并且讨论了这些国产仪器装备为医药、海洋、土壤/环境、工业生物技术领域提供的原创解决方案。这些拥有自主知识产权的国产高端仪器装备将广泛服务于工业过程在线实时监控、细胞工厂筛选、工业/土壤/海洋种质资源挖掘、临床精准用药及新能源开发等。　　关键词：拉曼组，单细胞表型组，拉曼激活细胞分选，国产仪器装备，单细胞分选技术与核心器件　　单个细胞是地球上生命活动的基本单元，因此单个细胞精度的生命系统研究能够揭示“细胞功能异质性机制”这一生命科学的本质问题1。传统的、基于细胞群体水平性状测量的信息并不能真实反映细胞内部的生物过程及机制2,3，这是因为，在细胞种群中，即使是基因组信息完全一致的不同单个细胞之间，其表型也具有极为显著的差异，而这些差异往往具有重要的生物学意义4,5。因此，单个细胞的研究能够带来生物技术在能源、环境、健康、农业、海洋等广泛应用领域的突破。2018年，利用单细胞测序技术完成的胚胎发育初期单细胞命运追踪被Science杂志评为2018年最重要的十大科学进展之首。近两年来，世界顶级学术期刊《科学》《自然》分别有43篇和38篇文章聚焦于单细胞分析。　　(一)拉曼组技术是单细胞功能识别的创新工具和有力武器。　　自上个世纪以来，研究人员主要通过荧光标记与流式细胞术的结合实现单细胞功能分选，即荧光激活细胞分选(Fluorescence-activated Cell Sorting，FACS)6。然而，FACS一般需要针对特定的生物标识物对细胞外加荧光标记，因此在单细胞分选方面存在如下瓶颈：(1)细胞适用性有限。不论在干细胞发育的机理研究、肿瘤细胞的诊断，还是微生物群落中功能组分的识别中，关键的细胞表型经常仅有粗放认识或完全未知(即“未知”的细胞表型)，也没有其生物标记。因此，FACS通常难以分选那些生物标识物通常未知或难以外加活体荧光标记的细胞体系(如微生物群落等)。(2)难以开展“原位”研究。进入细胞的荧光标记经常会改变细胞的原位状态，有时甚至影响细胞活性，因此该方法通常仅限于能够进行外加荧光标记的细胞，而且难以进行真正意义上的“原位”研究。(3)难以获取全方位的代谢表型。FACS在单位时间只能获得与区分很有限的细胞信息数据，如形态、折光率、反射率或荧光强度等有限指标，难以表征单细胞全方位的“代谢表型组”，因此通常不易获得尚难培养微生物与其生态功能之间的原位联系。　　拉曼光谱是一种非标记的散射光谱，每个单细胞拉曼光谱由分别对应于一类化学键的超过1500个拉曼谱峰组成，反映了特定细胞内化学物质的成分及含量的多维信息。因此，特定时空状态下一个细胞群体的单细胞拉曼光谱的集合称为“拉曼组”7。由于细胞内化合物的组成对于细胞生理状态和微环境的变化等因素敏感，因此单细胞拉曼图谱或拉曼组不仅潜在能区分不同物种的细胞，还可以静态或动态地表征该细胞的生理状态及所处微环境8。　　业界研究表明，利用拉曼组可实现较为广泛的细胞类型及功能的表征8。例如，Forrester和Deng等分别利用拉曼光谱成功地对多株芽孢杆菌属细菌的生化特性进行了鉴定，发现根据拉曼光谱信息可实现菌株水平的鉴定，并分析了各菌株之间可能的遗传进化关系9,10。在细胞功能识别方面，Samek和Singh等分别通过检测拉曼图谱分析了不同微藻的油脂产量，并建立了通过分析特定峰位比值来估测脂类不饱和度的方法11,12。Heraud等通过检测细胞拉曼图谱，对微藻细胞所处的营养状态(缺氮与否)进行判别和预测13。在临床方面，2011年Dochow等通过微流控芯片结合拉曼光镊技术，成功对人体白细胞、红细胞、急性髓性白血病细胞以及两种乳腺癌细胞进行了鉴别14。利用癌细胞的生化表型与正常细胞的区别，Barman15, Surmacki16和Haka17分别独立地证实了单细胞拉曼可用于乳腺癌早期诊断。此外，中国科学院青岛生物能源与过程研究所单细胞中心等也证明，单细胞拉曼光谱可以区分或定量表征细菌细胞的种系发生18、药物应激反应与耐药性19,20、分解代谢(综合细胞代谢活性21、分解特定底物的活性22)、合成代谢(甘油三酯含量及油脂饱和度23,24、淀粉含量25)、不同物种之间的代谢互作26等。　　(二)基于拉曼光谱的单细胞分选技术和核心器件是单细胞组学研究获得突破性进展的关键。　　拉曼激活细胞分选(Raman-activated Cell Sorting，RACS)能够利用“单细胞拉曼图谱”这一细胞内在、免外源标记的“生化指纹”进行功能分选，建立单细胞功能表征和单细胞组学分析之间的桥梁，突破“细胞功能异质性原理”、“大多微生物尚难培养”等共性科学问题与重大技术瓶颈27,28。随着微流控技术的进步，一系列基于拉曼光谱的单细胞分选技术和核心器件先后面世，其中包括在静止或者相对静止系统中进行的拉曼光镊分选21,29,30、单细胞拉曼弹射分选(RACE)18,31和拉曼激活光镊重力驱动微液滴分选技术(RAGE)32，以及在液相流动态细胞中进行的拉曼激活微流分选(RAMS)33、拉曼激活单细胞微液滴流式分选(RADS)34、介电迟滞拉曼激活单细胞微液滴流式分选(pDEP-RADS)。　　RACE适用于静置或贴壁细胞的单细胞分选。该技术在风干的芯片上对细胞逐一测量拉曼信号后，用脉冲激光弹射出具有目标拉曼信号的细胞18。通过改进弹射基片材料，RACE可以在背向直接采集拉曼信号，降低了操作的繁琐性并大幅提升了全流程的速度和通量35 同时，“All-In-One”RACE芯片的面世，让测量、弹射、细胞裂解与核酸扩增都在同一与空气隔绝的封闭体系内进行，从而降低了环境DNA对目标单细胞核酸扩增的污染35。近期油相震荡乳化单细胞MDA方法的开发，使RACE分离的纯培养E. coli（每个MDA体系含5个细胞）基因组覆盖度由通常的青岛星赛生物科技有限公司依托于中国科学院青岛生物能源与过程研究所单细胞中心的原创技术与知识产权，自主研发了一系列基于拉曼组原理的原创单细胞拉曼分选仪器装备。　　单细胞拉曼分选-测序耦合系统(Raman-Activated single-Cell Sorting RACS-Seq)克服了单个细胞拉曼分离可靠性低、核酸扩增容易污染、全基因组测序覆盖度不均等关键技术难点，具备样品预处理、显微拉曼成像、RAGE/RADS拉曼分选、单细胞微液滴细胞裂解和核酸扩增、拉曼组分析软件等功能，实现了单细胞功能检测、分选、测序与培养之完整流程的仪器化。RACS-Seq带有配套的RAGE、RADS、pDEP-RADS等芯片和相应试剂盒(环境样品中微生物单细胞提取与制备、稳定同位素饲喂细胞、单细胞核酸裂解与扩增等)，能够满足不同实验目的所需的单细胞识别、分选和测序文库构建，并且适用于任何大于0.5 μm的细菌、古菌和真菌细胞(也适用于微藻、植物、动物及人体细胞)。　　临床单细胞拉曼药敏快检仪(Clinical Antimicrobial Susceptibility Test Ramanometry CAST-R)是临床样品之病原鉴定、药敏性表型测量及耐药基因解析的一体化装备。它基于重水饲喂单细胞拉曼光谱技术，不需分离培养而直接鉴定病原种类，并测量基于代谢活性抑制的药敏性表型(及其在细胞之间的异质性)，全流程可在3小时内完成，将目前检测时长缩短至1/10 20。进而通过单细胞微液滴光镊拉曼分选与核酸扩增技术，完成低偏好性、高覆盖度、与耐药表型关联的单细胞基因组测序。最新论文证明，该系统能从临床菌群中直接、精准地获取一个细菌细胞的药敏表型及其完整基因组(以往未有先例) 32。CAST-R在单个细菌细胞精度同时追踪“药敏表型-完整基因组”的独特能力，预期将为临床感染诊断和用药、耐药性传播监控、微生态监控等提供新一代解决方案。　　单细胞拉曼表型监测系统(Raman-Activated Phenotyping System RAPS)是基于拉曼复合表型对细胞工厂进行单细胞水平高通量、低成本、非入侵式的快速表型监测装备。现有发酵过程的监控方案存在三大问题：1)时间精度，目前只能通过离线方式对各表型分别进行测定，由于样品处理和测量时间带来的滞后性，使得微生物发酵过程的控制比一般的工业生产难度更大 2)表型精度，由于缺乏综合表型表征手段，只能通过胞外产物尽量刻画细胞状态 3)测量精度，现有表型的测量均基于群体水平大量细胞的平均性状，在高压、高浓、高密度、且营养物质不均一的发酵过程中，细胞之间的差异被累积并级联放大，而群体水平的平均性状掩盖了这种差异的发生/发展和变化规律，无法反映细胞的真实状态。RAPS克服了现有方法的滞后性、可检测表型有限，以及无法反映细胞异质性等局限，为细胞工厂研究提供了一个高效、全景式的表型鉴定和过程监测方案。　　模块式单细胞微液滴分离系统(EasySort)是一款拥有自主知识产权的小型台式仪器。它小巧灵活，操作简便，能够自由地与各种型号的显微镜搭配组装，轻松将明场/荧光/拉曼显微镜升级为“所见即所分”、保持原位状态与活性的细菌单细胞精准功能分选装置。在显微镜的视野下，具特定表型的直径大于0.5 μm的单细胞均能够被迅速包裹成单液滴，并通过独有的重力驱动专利技术迅速移动到孔板或者EP管中，对接下游实验。因其兼具超高的性价比、便携的外形、灵活的适配度、简易的用户界面以及优秀的细胞活性保持等众多优势，EasySort将广泛应用于各类单细胞的分离、分选、培养及测序实验。　　高通量流式拉曼分选仪(High-throughput RACS：FlowRACS)搭载了具自主知识产权的pDEP-RADS技术，通过在高速液流中基于介电迟滞来精确捕获和采集单细胞拉曼信号，克服了单细胞拉曼分选的通量限制，以及微液滴对于拉曼表型鉴定的影响，巧妙地集成了单细胞拉曼信号采集与单细胞微液滴发生。同时它利用全光谱实时判别算法，实现了活体单细胞超高通量拉曼分选的高度自动化。　　(四)原创国产单细胞拉曼分选装备将服务于医药、土壤/环境、海洋和工业生物技术等广阔领域。　　上述介绍的这些拥有自主知识产权的原创仪器装备已经支撑着临床精准用药、生物资源挖掘、环境微生态机制、细胞工厂筛选、工业过程监控等广阔领域。　　在医药领域，细菌耐药性蔓延是临床感染面临的严重危机。当前基于培养原理的病原鉴定和药敏仪器检测一般需要花费2-3天。而CAST-R不再需要培养，而是基于重水标记单细胞拉曼光谱，在3小时之内即可完成针对代谢活性抑制的药敏性实测，而且将具有耐药表型的目标耐药菌单细胞分离出来，直接耦合细菌单细胞基因组测序，实现了在单个细菌/真菌细胞的精度，挖掘耐药基因及突变、追踪病原传播和考察耐药微进化机制。利用CAST-R针对临床尿液样品的初步分析显示，基于单细胞拉曼的菌株鉴定准确率达到93%，药敏测试与培养法的一致性达到90%。同时，从临床尿液样本中直接识别和分选出耐受特定抗生素的临床E. coli，并进行了精确到一个细菌细胞的全基因组测序，覆盖度可达99.5%32，保证了基因组上所有耐药基因突变均得以全面、精确地揭示。　　在海洋和土壤/环境领域，“99%的微生物难培养”、“异质性普遍存在”、“原位功能难以测量”等因素均对环境功能基因研究、种质资源挖掘、生态环境监测等提出了严峻的挑战。借助RACE技术，研究人员以中国黄海近海真光层的新鲜海水为模式，用13C-NaHCO3饲喂其微生物组，然后通过测量海水拉曼组中各个单细胞拉曼图谱上13C峰的动态特征，分辨出在海水中活跃固定与代谢无机碳的单细胞群。同时，分选这些原位固碳单细胞群(30个细胞混合)并测定其DNA序列，可重构出基因组草图35。后续研究表明，利用搭载RAGE-Seq芯片的RACS-Seq系统，可以分选获取海水中单个原位固定CO2的目标细菌细胞，并且对1个细胞的基因组即可获得超过95%的基因组覆盖度。对于土壤样品，则可以基于重水孵育、针对代谢活性进行菌群中功能细胞的识别、分选和测序，单个细胞的基因组覆盖度可达90%。　　在工业生物技术领域，新兴的合成生物学需要对细胞工厂进行人工设计并构建具新功能的生物系统，从而建立药物、材料或能源替代品等的生物制造途径36。其中细胞表型的测试筛选工作是合成生物技术发展的“限速步骤”之一。代谢物是细胞中基因表达的最终产物，因此对细胞代谢物组或代谢状态的检测是细胞功能检测最直接有效的手段之一。利用RACS-Seq，可以快速、非侵入性、不须标记地以单个活体细胞中淀粉含量这一特定表型对莱茵衣藻和小球藻进行快速表型鉴定，为富含淀粉的种质资源选育提供了一种崭新手段25。在莱茵衣藻和微拟球藻中，利用RACS-Seq可针对单个细胞中淀粉、蛋白质、甘油三酯含量和脂质不饱和度等表型对目标细胞进行快速筛选24。利用RACS-Seq，还能够针对CO2利用速率这一特定表型对海水中难培养微生物进行分选和测序，从而完成功能基因及种质资源挖掘35。　　此外，在酶活筛选方面，将未知功能的酶基因库转化入酵母底盘中，利用FlowRACS基于拉曼光谱、不需酵母培养和纯化而直接识别和定量其单细胞精度的目标代谢物，进而高通量流式拉曼分选目标单细胞，并利用下游测序快速识别其中表达的目标化合物合成酶。因此，FlowRACS大大节约了时间、耗材和人力的成本，可将酶的筛选效率提高100到1000倍。　　总之，拉曼组和单细胞拉曼分选基于细胞本征性的生化指纹图谱来识别与分选特定“代谢表型组”的目标细胞，具有不需预知生物标识物、不需标记、非侵入性、可全景式识别细胞代谢表型等核心优势8。因此，包括RACS-Seq，CAST-R，RAPS，EasySort以及FlowRACS等在内的单细胞分析仪器系列(青岛星赛生物科技有限公司)，将在精准医疗、大健康、生物资源挖掘、生态监测、生物安全、工业生物技术等领域得以广泛应用，同时为单细胞研究提供全新的科学思路、技术路线和仪器装备。　　参考文献：　　1 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In vivo lipidomics using single-cell Raman spectroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 3809-3814, doi:10.1073/pnas.1009043108 (2011).单细胞中心合影　　中国科学院青岛生物能源与过程研究所单细胞中心(徐健、马波、籍月彤、刘阳 所在单位)简介：中国科学院青岛生物能源与过程研究所是由中国科学院、山东省人民政府、青岛市人民政府于2006年7月启动筹建，2009年11月30日通过共建三方验收并纳入中国科学院“知识创新工程”管理序列的国立科研机构。单细胞中心的核心使命是以基因组工程、工具酶开发、先进成像、微流控器件、大数据等为主要方法学支撑，围绕细胞工厂构建、微生物组快检及机制等领域的关键科学和技术瓶颈，开发单细胞分析、分选、测序与培养技术，研制与产业化单细胞分析仪器系列，从国产装备的角度支撑单细胞大数据网络和微生物组天网等原创大数据系统，服务于工业生物技术、大健康、海洋资源挖掘、环境保护与修复、生物安全等应用领域。　　青岛星赛生物科技有限公司(籍月彤所在单位)：青岛星赛生物科技是一家专注于单细胞分析科研设备及临床诊断仪器研发与产业化的创新型高新科技企业。竭诚为科学研究人员、工业生物技术人员、以及临床工作者提供高效、可靠、一体化全方位的单细胞水平解决方案，着力打造国产高端生命科学仪器品牌。产品应用于工业过程监控、工业及海洋种质资源挖掘、临床精准用药、微生物组研究、生物安全及新能源开发等领域。

人体组织器官由具有不同细胞类型的异质细胞群组成。传统批量测序（Bulk Sequencing）方法仅能捕获器官与组织群体细胞成分的平均水平，或者只代表其中占优势数量的细胞信息，单个细胞独有的特性常常被忽略。近年来，随着单细胞测序（Single-cell sequencing）技术的发展，实现了单个细胞水平上DNA或RNA的测序，从而能够特异和精准地探索单个细胞的基因变异水平，弥补了传统批量测序的不足[1]。图1. 单细胞测序与传统批量测序比较[1]单细胞基因组测序技术，是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项技术，广泛应用于癌症研究、胚胎发育、辅助生殖、细胞分化、免疫机制、微生物等生物医学方向的研究。本期主要对单细胞基因组测序的技术原理、技术流程、技术平台及其在生物医学领域的应用实例做简单介绍。技术原理单细胞基因组测序的原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基因组后进行高通量测序，揭示细胞间异质性的基因信息。技术流程单细胞基因组测序主要包括四个步骤，即单细胞分离→全基因组扩增→高通量测序→数据分析。目前单细胞基因组测序技术的发展依然面临两方面的技术挑战：一是易于分离和操作的单细胞分离工具（即第一步）；二是能够稳定复制单个细胞中微小核酸的方法（即第二步）[2]。2.1 单细胞分离从组织中将单个细胞分离出来是单细胞基因组测序的第一步。目前常用的单细胞分离方法主要有：有限稀释法、显微操作法、流式细胞分选术、激光捕获显微切割技术（LCM）、微流控芯片技术等，表1总结了上述提到的单细胞分离方法的原理和优缺点，在使用时可根据不同的科研需求及样品情况综合考虑选择适宜的分离方法[3,4]。表1. 单细胞分离技术分离方法原理优点缺点有限稀释法对细胞进行一系列的倍比稀释，最终使细胞处于单个状态，理论上每μL约1个细胞，然后用移液器吸取相应容积的细胞悬液进行单细胞分离。操作简便；成本低，一般不需要特殊的设备。分离效率低；需要研究人员排除大量空白孔和多细胞孔，费时费力；细胞分离过程依赖梯度计算，容易出现错误。显微操作法在高倍倒置显微镜下，利用显微镜操作器（手动或自动）实现单细胞分离。能够准确地控制单细胞的吸取与释放；可以从不同的发育阶段或多样化的群体分离单个细胞。通量低，需要大量的起始量；细胞特异性由显微镜决定，并利用微量移液管分离，可能不够准确。流式细胞分选术通过流式细胞仪，根据细胞特异性分子标志物或细胞光散射特性，分选出单个细胞或特殊细胞群，实现单细胞分离。通量高；基于细胞表面标志物的特异标记，能够确保特定细胞的分离；利用荧光标记可分离亚群。无法扩展到大规模项目；且需要流式细胞仪，设备昂贵。激光捕获显微切割技术（LCM）在显微镜下，从冰冻/石蜡包埋组织切片（或细胞固定在装配有可以激光脉冲激活的热塑膜的涂片）中分离某一类型细胞群或单个细胞，实现单细胞分离。无需解离组织，制备细胞悬液；能够直观准确、快速地获取单个细胞或单一细胞亚群；能够保留所分离细胞的完整性。需要适当的组织处理（冷冻保存或固定）；显微切割可能存在挑战；小的细胞可能难以分离；可能存在污染。微流控芯片技术通过微流控芯片隔离流动通道中的单个细胞从而达到单细胞分离的目的。通量高；上样体积小；周期短；可根据细胞表面标志物分离特定细胞。细胞大小必须均匀；消耗品昂贵。2.2 全基因组扩增（Whole-Genome Amplification , WGA）全基因组扩增是单细胞基因组测序的第二步。由于单个哺乳动物细胞中DNA的含量一般少于10pg，达不到测序仪的检测要求，因此在测序之前必须进行全基因组扩增（WGA）以获得足够的材料用于后续的文库制备。目前常用的全基因组扩增方法按原理可分为三类（见表2）[5-7]：基于聚合酶链式反应（PCR）的WGA方法{主要是简并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)}、多重链置换扩增法（Multiple Displacement Amplification , MDA）和多重退火环状循环扩增技术（Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles，MALBAC）等。表2. 全基因组扩增技术DOP-PCRMDAMALBAC原理基于PCR技术，通过加入部分简并的寡核苷酸引物与模板结合来实现扩增整个基因组的目的。基于恒温核酸扩增技术，恒温条件下，使用一条由6个随机碱基构成的随机引物与模板随机退火；紧接着在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下发生链置换反应，并最终完成扩增。结合了MDA法和PCR扩增法的特点，即由一组随机引物启动扩增（每个引物具有通用引物序列和随机碱基），随机引物与模板均匀杂交，随后在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下发生链置换反应，最终完成扩增示意图特点该方法实现了高度均匀的扩增，产物产量较高，操作较为简单；但仅产生基因组的稀疏覆盖，实验的条件需要较多优化。 MDA可以实现更好的基因组覆盖，产物片段长；但对模板质量要求高，可能产生非特异性产物。一种实现基因组广泛覆盖和均匀扩增的技术，灵敏度高，产物产量高。技术平台：目前，国内外研究机构使用的大规模单细胞测序技术平台主要有五种：Illumina® Bio-Rad® Single-Cell Sequencing Solution、BD Rhapsody™ Single-Cell Analysis System、10x Chromium Single Cell Gene Expression Solution、ICELL8 Single-Cell System和C1™ 单细胞全自动制备系统。国内也有多家企业进军单细胞测序领域，产品包括新格元自动化单细胞处理系统、万乘基因高通量单细胞测序平台、达普生物星海单细胞测序建库系统、墨卓生物高通量单细胞测序平台、德运康瑞痕量单细胞测序平台和原位测序平台等。各个平台各有特点，这里主要简单介绍一下两种应用较多的技术，即10X Genomics 公司的Chromium( 液滴法) 及 BD 公司的Rhapsody( 微孔法)。10x Genomics单细胞测序技术：10X Genomics单细胞测序起源自Drop-Seq技术，应用液滴微流体技术分选单细胞，将单个细胞与含有条形码（Barcode）和引物的凝胶珠一起包裹于油滴中；然后每个油滴中的凝胶珠溶解， 细胞裂解释放mRNA，通过反逆转录产生用于测序的带条形码的cDNA，cDNA在液体油层破坏后进行文库构建，使用测序平台对文库进行测序检测，即可一次性获得大量单细胞的基因表达数据。该平台具有“三高（high）两低（low）”的特点：即通量高，细胞捕获效率高，细胞活性要求高（大于90%），分析时长低，成本低。 图2. 10X Genomics Chromium Controller技术原理示意图3.2 BD Rhapsody单细胞测序技术：BD公司推出的这款Rhapsod™单细胞分析系统采用了Cytoseq分子标签技术，能为单细胞中每个转录本标记特异性分子标签，实现单细胞水平上基因表达谱的绝对定量。同时，将每个细胞标记上特异性细胞标签，实现了高通量平行建库。该技术在基因扩增和后续的测序部分等整体流程与10x Genomics单细胞测序技术相近，主要区别在于起始的单细胞分离和捕获技术。该技术并非基于微流控芯片技术，而是基于蜂巢板技术，基于微孔来保证单细胞的捕获，避免了10x Genomics单细胞测序技术中存在的概率碰撞对捕获效率从影响。细胞悬液经注入孔注入后，自然沉降到反应孔中，随后， 将磁珠同样由注入孔注入，即可在单个反应孔中捕获其中的细胞。微孔和纳米孔方法允许稀释的细胞悬浮液在每孔一个珠子和一个细胞的条件下与寡聚结合珠一起沉降到皮升大小的孔中，从而保证了单孔中是单细胞捕获。 图3. BD Rhapsody技术原理示意图4、应用实例：目前，单细胞基因组测序技术的应用可以归纳为两大类，即应用于人类细胞图谱研究和非细胞图谱研究。单细胞基因组学的优势就在于能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，反映细胞间的异质性。自2017年“人类细胞图谱计划”提出以来，单细胞测序技术已陆续揭示了多个组织器官的单细胞图谱，如通过对肾脏肿瘤进行单细胞测序，发现肾肿瘤细胞之间的突变频率和位置不尽相同，每个细胞的突变状态和转录情况也均不相同，表明肾肿瘤更加具有异质性，需要开发更加有效的细胞靶向疗法。2022年发表在Nature杂志上的研究，对人脑血管系统的单细胞图谱进行了分析，描绘出海马和皮质的脑血管细胞组成：内皮细胞、相邻的壁平滑肌细胞 (SMC) 和周细胞、血管周围的免疫细胞和星形胶质细胞等，这些细胞在大脑不同区域存在差异并沿动静脉轴变化，沿动静脉轴的细胞组成异质性产生了大脑健康所必需的功能分段的循环、代谢和渗透特性。揭示了人类大脑血管系统的细胞组成和分子特征，提示了阿尔茨海默病（AD）风险因素在人类中的进化转变，有助于对人类大脑健康基础的了解、疾病机制和治疗靶点的发现[8]。随着单细胞基因组覆盖范围扩大、通量提升以及多组学技术的不断进步，单细胞基因组学技术将为丰富发育谱系树、生殖细胞突变模式、癌症进化、基因组功能和微生物群落的分辨研究等提供策略[9]。参考文献：[1] Xia Y, Gawad C. Bringing precision oncology to cellular resolution with single-cell genomics[J]. Clinical and experimental metastasis, 2022(1):39.[2] Liang J, Cai W, Sun Z. Single-cell sequencing technologies: current and future. J Genet Genomics. 2014 Oct 20 41(10):513-28. doi: 10.1016/j.jgg.2014.09.005. Epub 2014 Oct 18. PMID: 25438696.[3] Wang Y, Navin N. Advances and Applications of Single-Cell Sequencing Technologies[J]. Molecular Cell, 2015, 58(4):598-609.[4] Gross A, Schoendube J, Zimmermann S, Steeb M, Zengerle R, Koltay P. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 2015 Jul 24 16(8):16897-919. [5] Gawad C, Koh W , Quake S R. Single-cell genome sequencing: current state of the science[J]. Nature Reviews Genetics, 2016.[6] Grün D, van Oudenaarden A. Design and Analysis of Single-Cell Sequencing Experiments. Cell. 2015 Nov 5 163(4):799-810.[7] 徐晓丽 吴凌娟.单细胞全基因组扩增技术与应用.[J]生物化学与生物物理进展 .2019.46(4)[8] Yang A C , Vest R T , Kern F , et al. A human brain vascular atlas reveals diverse mediators of Alzheimer's risk[J]. Nature, 2022, 603.[9] Evrony G D, Hinch A G, Luo C. Applications of Single-Cell DNA Sequencing[J]. AnnualReview of Genomics and Human Genetics, 2021, 22(1).相关会议推荐：第六届基因测序网络会议来袭！六大会场，含单细胞和空间组学会场，点击下图免费报名！点击链接进入会议官网：https://www.instrument.com.cn/webinar/meetings/geneseq2023/

p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 细胞是生物体和生命活动的基本单位,细胞分析对于细胞结构和功能的研究、生命活动规律和本质的探索、疾病的诊断与治疗、药物的筛选与设计等都具有十分重要的意义。作为细胞研究的“标配”，创新细胞分析技术在生命科学基础研究、生物制药、新型治疗方法中的应用与进展不可不知！ /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 仪器信息网举办的“细胞分析技术与应用”专题网络研讨会在6月5日成功召开，本次会议报告干货十足，诚意满满，对广大细胞分析领域用户的研究工作具有一定指导意义。错过了直播的小伙伴不要遗憾，部分专家的精彩报告视频回放即刻奉上! /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(192, 0, 0) " strong 报告题目：《单细胞试剂盒分析》 /strong /span /p p span style=" color: rgb(192, 0, 0) " strong /strong /span /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 200px height: 212px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/c6e217a3-3a1c-404e-ab9a-af4cc9876f3b.jpg" title=" 001.jpg" alt=" 001.jpg" width=" 200" height=" 212" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " 江德臣，南京大学化学化工学院及生命分析化学国家重点实验室教授，博士生导师，单细胞分析课题组组长，教育部青年长江学者,江苏省化学化工学会质谱专业委员会秘书长。研究兴趣为高内涵单细胞分析方法和装置的建立，及其在细胞信号传导机制研究中的应用。以第一/通讯作者在PNAS、JACS、Anal Chem 等期刊发表学术论文50余篇。 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 单细胞分析可以揭示细胞个体特征，以助于理解细胞自身的复杂性及彼此之间存在巨大差异，具有重要的生物学价值。在过去的六年中，江德臣教授所在实验室发展了基于微/纳试剂盒的单细胞分析策略，将宏观维度生物测量理论与方法引入单细胞分析中，建立了通用性强、通量高且可测量单细胞及单细胞器内生物分子活性的新型分析方法和装置。 span style=" color: rgb(192, 0, 0) " strong a href=" https://www.instrument.com.cn/webinar/video_105263.html" target=" _blank" （ span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 点击查看视频回放 /span ） /a /strong /span /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(192, 0, 0) " strong 报告题目：《微流控芯片单细胞分泌分析》 /strong /span /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 200px height: 239px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/c6f4bf34-0adc-48e7-aa50-6026304a3bef.jpg" title=" 陆瑶.jpg" alt=" 陆瑶.jpg" width=" 200" height=" 239" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-indent: 2em " span style=" text-align: justify font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " 陆瑶，博士, 副研究员，中国科学院大连化学物理研究所单细胞分析研究组组长。研究相关工作发表于PNAS，Science Signaling等国际期刊，主要科研成果在美国两家公司获得应用，作为主要发明人参与开发的单细胞蛋白分析技术获国际发明专利授权，目前已应用于CAR-T肿瘤免疫治疗药品开发及临床测试，被美国著名科普杂志科学家（The Scientist）评选为2017年度十大医疗技术发明首位。现主要从事基于微流控芯片的单细胞分析技术开发及其在人类健康/疾病相关问题中的应用等研究。 /span br/ /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 细胞是生命存在的基础，探索生命健康与疾病常需要以细胞研究为基础。由于细胞与细胞之间存在差异，群体细胞的研究结果只能得到一群细胞的平均值，这往往会掩盖个体差异信息。为更全面的了解细胞以服务人类健康、疾病研究，单细胞分析就变得尤为必要。在过去的几年中，陆瑶老师团队开发了一系列的基于抗体条形码微流控芯片的高通量、高内涵单细胞细胞分泌分析工具，大大加深了人们对细胞分泌异质性的认识，并尝试将其服务临床实现个体化、精准医疗。 span style=" color: rgb(0, 112, 192) font-size: 14px " strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " (含未公开发表内容，暂不提供回放视频) /span /strong /span /p p style=" text-align: center " strong span style=" color: rgb(192, 0, 0) " 报告题目：《拉曼单细胞流式分选技术及应用》 /span /strong /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 200px height: 240px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/e7fe07cf-f676-4425-985b-a6b1b99d2bc7.jpg" title=" 马波.jpg" alt=" 马波.jpg" width=" 200" height=" 240" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-indent: 2em " span style=" font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai text-indent: 2em text-align: justify " 马波，研究员，博士生导师，中科院青岛生物能源与过程研究所微流控系统团队负责人。自2003 年起致力于微流控芯片技术在分析化学和生命科学中的基础和应用研究。目前研究方向聚焦在：基于微流控技术的高通量单细胞分析技术和仪器研究，研制了首套拉曼单细胞流式细胞分选仪；用于临床、环境和食品安全的便携式微生物检测系统；工业酶、菌株和微藻的高通量筛选、选育和定向进化研究等。 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " “单细胞拉曼图谱” 是特定细胞的“化学指纹”，蕴含着该特定细胞在特定生理状态下的丰富的生化信息，通过体现细胞化学组成及其变化，能够静态和动态地表征和监测该细胞的遗传背景、生理状态及所处微环境。与现有荧光细胞分选技术FACS相比，拉曼激活单细胞分选RACS 具有无损非标记的特点。因此，马波教授团队先后研发了单细胞拉曼光镊液滴分选、高通量流式拉曼单细胞分析与分选及单细胞测序等系列关键技术，并于新近推出了单细胞拉曼分选耦合测序的RACS-SEQ系统，同时提供适用于拉曼抗生素耐药性快检、单细胞测序的芯片和试剂盒。该仪器及试剂盒将为耐药性快速检测、合成生物学细胞工厂表型筛选、工业菌株和高通量酶定向进化和筛选等提供创新的系统解决方案。 strong span style=" font-size: 14px color: rgb(0, 112, 192) " (含未公开发表内容，暂不提供回放视频) /span /strong /p p style=" text-align: center " strong span style=" color: rgb(192, 0, 0) " 报告题目：《肿瘤靶向的拉曼SERS探针和拉曼微球的构建和应用》 /span /strong /p p strong span style=" color: rgb(192, 0, 0) " /span /strong /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 200px height: 242px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/7c59cb63-76ee-4bdd-ba86-db17ae600e1e.jpg" title=" 汤新景.jpg" alt=" 汤新景.jpg" width=" 200" height=" 242" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " 汤新景，博士，北京大学药学院教授，长江学者奖励计划青年学者，国家优秀青年科学基金获得者，教育部跨世纪(新世纪)人才。近年来，在反义核酸药物及非编码RNA等功能核酸的定点修饰及其功能的精确光调控、新型荧光核酸探针和新型肿瘤靶向的光学纳米探针等方面开展了一系列的研究工作。 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 拉曼纳米探针基于其高的光谱分辨率和深的组织穿透性而被广泛应用于生物体系。目前大多数的拉曼纳米探针是利用增敏金属表面负载的染料分子，且拉曼信号位于1400-1700 cm-1 范围内。鉴于此，汤新景教授设计并构建了一系列基于生物体系拉曼信号静默区（1900-2500 cm-1）的拉曼报告基团的金纳米拉曼探针以及无需金属增敏的拉曼纳米微球。通过进一步的拉曼纳米探针表面的靶向修饰和功能化，实现对肿瘤细胞、组织以及活体小鼠的特异性拉曼光谱检测或拉曼成像。 a href=" https://www.instrument.com.cn/webinar/video_105271.html" target=" _blank" style=" text-decoration: underline color: rgb(0, 112, 192) " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong （点击查看视频回放） /strong strong /strong /span /a /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(192, 0, 0) " strong 报告题目：《肝细胞移植治疗肝衰竭的问题和策略》 /strong /span /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 200px height: 239px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/bd1cd376-e0ab-4ac6-8ad6-43c62228704c.jpg" title=" 何志颖.jpg" alt=" 何志颖.jpg" width=" 200" height=" 239" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-indent: 2em " span style=" font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai text-align: justify text-indent: 2em " 何志颖，研究员，博士生导师。同济大学附属东方医院再生医学研究所执行所长、课题组长，同济大学东方临床医学院生物技术教研室主任。入选上海市浦江人才计划等。现任中华医学会医学细胞生物学分会委员、中国整形美容协会干细胞研究与应用分会副秘书长等。科研上以干细胞与肝脏再生为研究方向，开展肝细胞移植基础和应用研究，致力肝脏疾病的细胞治疗。在Nature，Cell Stem Cell，Gastroenterology等期刊发表SCI论文37篇。 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 肝衰竭是多数肝脏疾病重症化的共同结局，肝细胞移植治疗肝衰竭成为新的希望。如何获得非供体来源的肝细胞、提高移植肝细胞在宿主肝脏中的植入和增殖效率及开展活体示踪评价细胞移植的安全性等，成为肝细胞移植应用于临床迫切需要解决的主要问题。何志颖老师在报告中分享了应用多能干细胞肝向诱导分化、肝向谱系重编程等方案，获得充足的非供体来源的肝系细胞；通过局部磁场干预促进移植肝细胞在受体肝脏的植入效率；通过基因修饰或在受体肝脏释放生长因子促进移植肝细胞的增殖能力，寻找特异标志物分选具有肝脏再殖能力的肝系细胞，实现了移植肝细胞在受体肝脏的有效再殖；最后，应用活体生物体内发光成像系统，何志颖教授对肝细胞移植后在体内的分布进行了动态观察，开展了肝细胞移植后在肝脏中归巢与再殖规律的研究。 a href=" https://www.instrument.com.cn/webinar/video_105264.html" target=" _blank" style=" color: rgb(0, 112, 192) text-decoration: underline " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong （点击查看视频回放） /strong strong /strong /span /a /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(192, 0, 0) " strong 报告题目《质谱对大脑代谢通路的解析——从单细胞分析到组织成像》 /strong /span /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 200px height: 239px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/bf5f8e7b-bab1-45d3-9b30-42440313e939.jpg" title=" 黄光明.jpg" alt=" 黄光明.jpg" width=" 200" height=" 239" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " 黄光明，中国科学技术大学化学系教授，博士生导师。2001及2004年先后在北京师范大学获分析化学学士和硕士学位，2007年在清华大学获得博士学位。2012－今在中国科学技术大学化学系任教。于2013年入选中组部第四批“青年千人计划。美国质谱协会会员，中国质谱分析专业委员会委员。长期从事质谱分析及其化学、生命科学等领域的应用研究。目前主要承担国家自然科学基金青年及面上项目，中组部千人计划以及科技部重大研发计划子课题等课题。在Cell，PNAS，Angew. Chem. Int. Ed.，Anal. Chem.，Chem. Sci., Chem. Comm. 等国际期刊上发表论文50余篇，引用1200余次。于2018年获得中国质谱学会首届“质谱青年奖”。 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 针对单细胞分析中的一系列技术难题，黄光明教授通过兼容膜片钳技术实现了活体细胞原位取样，并结合毫秒级超快电泳分离技术，搭建了单细胞质谱分析平台。利用该平台实现了对脑切片组织样品上的单个神经元细胞研究，在脑内发现了一条新的谷氨酸合成通路，阐释了其促进学习记忆功能的分子机制，为在单细胞内开展代谢通道研究提供了新的研究平台。 a href=" https://www.instrument.com.cn/webinar/video_105270.html" target=" _blank" style=" color: rgb(0, 112, 192) text-decoration: underline " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong （点击查看视频回放） /strong /span /a /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " 虽然会议已经结束，但是精彩仍在继续，仪器信息网已经将部分报告老师的现场讲座视频上传到仪器信息网网络讲堂，想要重复学习或者错过参与会议直播的网友，可以点击报告视频精彩回放进行学习与分享。 /span span style=" font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai color: rgb(0, 0, 0) " 更多专家报告请点击查看： /span a href=" https://www.instrument.com.cn/news/20190612/486910.shtml" target=" _blank" style=" text-decoration: underline border: 1px solid rgb(0, 0, 0) " span style=" border: 1px solid rgb(0, 0, 0) " i strong span style=" border: 1px solid rgb(0, 0, 0) color: rgb(192, 0, 0) font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " 【视频回看】单细胞原位、定量分析、无损分选，还有？“最夯”重器都在这儿！ /span /strong /i i strong span style=" border: 1px solid rgb(0, 0, 0) color: rgb(192, 0, 0) font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " /span /strong /i /span /a /p p style=" text-align: center " span style=" text-decoration: underline " & nbsp & nbsp & nbsp & nbsp & nbsp & nbsp & nbsp & nbsp & nbsp & nbsp & nbsp & nbsp & nbsp /span br/ /p p style=" text-align: center " strong 关注 span style=" color: rgb(192, 0, 0) " 【3i生仪社】 /span 解锁生命科学新鲜资讯！ /strong /p p strong /strong /p p style=" text-align: center " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/bb3dca69-d424-4faa-b6d3-f9b9d6eee2d8.jpg" title=" 小icon.jpg" alt=" 小icon.jpg" / /p

p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 神经细胞.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/noimg/5ea1ac41-e831-42dc-ab38-5e418c9181f5.jpg" / 　 /p p 　世界上没有两片完全相同的叶子，细胞也是。然而，科学家们在进行现代生物学研究时，大多时候都考察的是细胞群体，而忽略了细胞异质性。 /p p 　　就拿神经细胞来说，大脑中有亿万个神经细胞，这些神经细胞在细胞形态，突触连结，细胞结构，电生理以及生理功能上具有高度的多样性。不同种类的神经细胞中，其基因组、蛋白组、化学分子组成、含量、代谢也都有着很大的差别。在直径不到1毫米的一个很小的脑区，可能就存在几十种甚至上百种完全不同的神经元以及胶质细胞类型。甚至很多情况下，即使物理距离上相邻的两个神经元也可能是两个不同的神经元类型。因此，对脑内单个神经元的基因组、蛋白质组以及代谢组进行分析，具有重要的生物学价值。 /p p 　　单细胞技术在近年发展非常迅速，比如单细胞测序，已经广泛应用于各种生命学科的研究。2014年1月Nature Methods上发表的年度特别报道，将“单细胞测序”(Singled out for sequencing)的应用列为2013年度最重要的方法学进展。 /p p 　　单细胞技术不仅在测序方面取得了极大进展，单细胞质谱分析也正在逐渐得到更多的关注。与用于分析单个细胞基因组的单细胞测序不同，单细胞质谱主要是研究单个细胞内的代谢物情况，例如化学小分子的组成、含量和代谢等等。单细胞质谱的优势在于可以高通量检测目前其它单细胞技术无法检测的小分子化合物，以及它们的代谢过程。同时，由于质谱本身的优势，不需要采取测序或者特异性抗体等外部手段，就可以精确分析检测到的化学物质信息，可以说是“物美价廉”。 不过，由于质谱技术本身的局限性，目前还无法做到类似单细胞测序那样的大规模测量。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　　　多学科交叉合作，开发单神经细胞质谱 /p p 　　2013年，熊伟教授结束了在美国国立卫生研究院的博士后研究工作，回国后加入了中国科学技术大学生命科学学院。在申请中组部“青年千人计划”时，熊伟教授认识了另一位中科大化学学院的“青千”黄光明教授，当时，黄光明教授课题组正在发展一种小样品(pL级别)质谱测量技术。经过多次讨论，他们决定将两个实验室的优势技术进行结合，开发单神经细胞质谱这一新技术。 /p p 　　目前质谱技术在神经科学中的应用，主要还是采用对大量组织细胞匀浆后的样品进行分析。在单细胞检测中，质谱分析因为具有高灵敏度，大的线性范围以及高通量分析化学分子的特点，逐渐被用于单细胞的细胞代谢分析。但目前的方法需要使用大量有机试剂对细胞进行处理，无法保持采样时细胞的活性 冗长的处理和分离过程也导致较慢的分析速度，无法短时间内完成大量单细胞分析 并缺乏来自同一细胞的电生理信号 最终导致单细胞代谢物的质谱分析无法大规模用于神经细胞的分析。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　新技术让质谱分析活体单个神经元成为现实 /p p 　　2017年1月26日，熊伟教授与黄光明教授等人在PNAS上发表了一项题为“Single-neuron identification of chemical constituents, physiological changes, and metabolism using mass spectrometry”的研究。在这项新研究中，研究团队依托电生理膜片钳以及电喷雾离子源技术建立了一种稳定的单神经元胞内组分取样和质谱组分分析技术。 /p p 　　 img title=" 神经细胞2.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/noimg/6e5915a4-ec84-4cb3-b4c3-d7724a1fc4d3.jpg" / /p p & nbsp /p p style=" TEXT-ALIGN: center" & nbsp 　 span style=" FONT-SIZE: 14px" 膜片钳与单细胞质谱分析联用技术分析单个神经细胞示意图 /span /p p 　　电生理膜片钳能将玻璃微电极接触并吸附在细胞膜上，高阻抗封接后将膜打穿成孔，记录膜片以外部位的全细胞膜的离子电流。而电喷雾技术主要是利用一个高压交流电使分析物被离子化然后被质谱检测，该离子源具有较强的抗干扰能力。与传统的质谱方法相比，这一新方法最大的优势是可以原位对活细胞进行取样，并且同时采集细胞位置、电生理活动以及细胞内化学成分等多方面的信息。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　质谱分析让神经化学研究进入单细胞水平 /p p 　　研究人员利用这一方法对小鼠海马、前额叶、杏仁核、纹状体等脑区单个神经元内的数千种化学小分子进行了快速质谱检测，并同步采集了电生理信号。 /p p 　　海马、前额叶、杏仁核、纹状体这四个核团无论是在人类还是低等动物中都非常重要，与学习、记忆和情绪等行为以及相关疾病如阿尔茨海默病、帕金森病等有着密切的联系。这些核团内的神经元种类繁多，目前国内外有多个课题组正在从单细胞测序的角度解析这些核团的神经元分类及对其功能进行鉴定。熊伟教授表示，他们对这四个核团神经元进行质谱研究，也正是想从单细胞水平全面分析这些核团神经元的代谢组学情况，以及这些代谢通路和代谢组在学习、记忆和情绪等行为及其相关疾病中的作用机制。 /p p 　　在这项研究中，研究人员主要对不同年龄段的小鼠海马、杏仁核、纹状体等脑区单个神经元中的谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)以及GABA等化学小分子进行定性、定量分析并对其进行神经元分类。 /p p 　　Glu和GABA是中枢神经系统两大类神经递质(兴奋性或抑制性)的代表性分子。早期人们认为一个神经元内只存在一种递质，其全部末梢只能释放同一种递质，这被称之为戴尔原则(Dale& #39 s principle)。然而随着科学技术的发展，人们逐渐认识到两种或两种以上递质(包括调质)可存在于同一神经元内，在适当的刺激下可经突触前膜共同释放。这种新的观点得到了众多电生理及免疫组化等实验的证明。然而这些证据大部分都是间接的证据，尚无直接证据表明二者的共存。这项研究首次在单细胞水平，通过质谱分析给出了二者共存于同一神经元内的直接证据。同时，研究人员还发现了一些尚未在神经系统中被发现的小分子，他们正在努力研究其作用和分子机制。 /p p 　　此外，研究还鉴定了单个神经元内谷氨酰胺的代谢路径。Gln-Glu-GABA通路是谷氨酸和GABA代谢的经典通路，尤其是谷氨酸，它不仅仅作为兴奋性神经递质存在于神经元内，还大量参与到蛋白质的合成代谢以及细胞能量供应体系中。而GABA是中枢神经系统的抑制性递质，可以防止神经细胞过度兴奋。二者与各种脑疾病都有着密切的关系，如自闭症、阿尔茨海默病、帕金森病等。该通路在大脑的发育和衰老中扮演着非常重要的角色。对单个神经元内谷氨酰胺的代谢路径的鉴定对于深入理解这条代谢通路以及与之相关的疾病机制具有重要意义。 /p p 　　这项研究首次利用化学质谱方法直接无稀释地检测单个神经元中多种神经递质、代谢物、脂质等化学小分子，对单个神经元化学成分及代谢物进行了即时分析，并将目前神经细胞成分分析的研究推向了一个活细胞及单细胞水平。这一技术在将来或许能够帮助科学家们在单细胞层次上去研究神经生物学、代谢组学、毒理学等生命科学的重大问题。 /p p 　　谈到临床应用前景时，熊伟教授的态度也十分肯定。他表示，该技术允许研究人员对血液、脑脊液等样品中的单个细胞进行质谱检测，结合相应的生物标记物，完全有可能对阿尔茨海默病、帕金森病、抑郁症等神经精神疾病的早期诊断提供帮助。 /p p 　　　熊伟教授从事神经科学研究，他认为现代神经科学研究需要技术的快速研发以及多领域多学科的交叉合作，必须发展包括显微成像、分子示踪、质谱分析、光遗传学以及转基因操作等最新的生物、物理、化学与工程材料等多学科交叉技术。熊伟教授表示，对他而言，科研不仅仅是工作，也是兴趣，尤其是对新技术的热切追求，驱动着他不断前行。熊伟教授及其研究团队也正在和中国科大的其它实验室展开合作，和不同的领域的科学家交流和分享科研心得是一种享受。 /p p 　　该项工作由中科大生命学院博士后朱洪影、生命学院博士研究生邹桂昌、王宁在熊伟教授和黄光明教授的共同指导下完成。该研究工作得到了国家自然科学基金委重大研究计划、科技部、中科院战略性先导科技专项(B类)以及国家青年千人计划等的资助。该工作还得到中国科学技术大学同步辐射实验室光电离质谱线站的仪器与技术支持。　 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" & nbsp img title=" 熊伟.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/noimg/2a3b00c2-8807-4156-a379-59653af1915d.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　熊伟 教授 /p p 　　熊伟教授是国家中组部“青年千人计划”获得者，2001年毕业于北京大学生命科学学院，获理学学士学位。2006年毕业于北京大学生命科学学院，获理学博士学位。2006至2013年，在美国国立卫生研究院(NIH)酒精滥用与酒精中毒研究所(NIAAA)做博士后研究工作。2013年3月加入中国科学技术大学生命科学学院。中科院脑科学与智能技术卓越创新中心骨干成员。中科大神经退行性疾病研究中心暨脑资源库核心成员。长期从事与神经化学、药理学、小分子药物研发相关的神经科学研究，运用多种先进的实验技术从分子、细胞水平、到动物行为进行了深入系统的研究，并取得了系列重要成果。研究工作发表在Nature Neuroscience, Nature Chemical Biology, Journal of Experimental Medicine, PNAS, Journal of Neuroscience, Molecular Pharmacology等国际学术期刊上。获得过多项国家级基金资助。 /p