凝血器

[align=center][/align][align=left][b] 摘要：目的 [/b]确立不同稀释液对凝血因子效价检测的影响，研究因子效价检测的稀释方法，从而完善因子类血液制品效价检测的方法。 [b]方法 [/b]对同一批和连续生产的10批人凝血因子Ⅷ、人凝血酶原复合物样品进行全自动血凝仪法的效价检测，分别选用全自动血凝仪稀释液和含1%人血白蛋白稀释液进行检测，统计10次以上的检测结果以确定不同稀释液之间的差别。 [b]结果 [/b]本实验确定了在人凝血因子Ⅷ的效价检测中，采用不同的稀释液对每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅷ的样品进行稀释，无论是对同一批质控品的测定还是对连续批次样品的测定，检测结果之间存在较大的差别。而在人凝血酶原复合物人凝血因子Ⅸ的效价检测中，采用不同的稀释液对每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅸ的样品进行稀释，同一批质控品和连续批次样品检测结果之间差别较小。[b]结论 [/b]因子类血液制品效价检测时，同一样品采用不同的稀释液进行稀释检测结果可能存在较大差别，应对血凝仪是否可用于因子类血液制品进行评估，并应建立起正确的检测操作规程。[/align][b] 关键词: [/b]凝血因子； 稀释液； 效价测定 目前国内血液制品的生产是以健康人血浆为原料，经过分离纯化和病毒灭活制成，主要分为三大类，人血白蛋白、人免疫球蛋白类产品、人凝血因子类产品。国内已上市或在研的人凝血因子类产品主要有人凝血因子Ⅷ、人凝血酶原复合物、人纤维蛋白原、人纤维蛋白粘合剂、人凝血因子Ⅸ、人抗凝血酶Ⅲ等。人凝血因子Ⅷ主要用于防治甲型血友病和获得性凝血因子Ⅷ缺乏而致的出血症状病人的手术治疗。人凝血酶原复合物主要有效成分为人凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ，主要用于治疗主要用于乙型血友病、 维生素K依赖的凝血因子缺乏症等病症的治疗。 人凝血因子Ⅸ主要用于防治乙型血友病和获得性凝血因子Ⅸ缺乏而致的出血症状病人的手术治疗。因子类血液制品是血液中凝血因子的高纯度浓缩物，在进行效价测定时需要对样品进行稀释，而稀释液中蛋白含量的不同对其检测结果有着影响。因子效价测定方法有一期法、二期法和发色底物法。一期法是目前应用最广泛的检测方法，系用人凝血因子缺乏血浆为基质，在APTT试剂和氯化钙的参与下，根据凝血因子国家标准品和供试品的凝集时间来计算供试品中的人凝血因子效价，实际检测过程中将基于一期法原理的人凝血因子效价测定法分为三种方法，即手工法、半自动血凝仪法、全自动血凝仪法。全自动血凝仪只是对一期法中各反应试剂的加入顺序进行了修订以便实现仪器的自动操作。相对于手工法检测，消除了很多主观因素。在日常工作中，当使用不同种类的稀释剂而采用相同的检测原理和方法进行效价测定应不会对测定结果产生影响，但实际工作中发现使用不同种类的稀释剂对效价测定结果有一定的影响。在人凝血因子Ⅷ效价检测过程中，采用手工法、半自动血凝仪法、全自动血凝仪法进行人凝血因子Ⅷ效价的比对试验，发现手工法、半自动血凝仪法检测结果一致，这两种方法比全自动血凝仪法的检测结果高20%以上。血液制品的原料来源于人血浆，受原料限制，一直较为稀缺，尤其是当前人凝血因子Ⅷ的生产量远远无法满足血友病患者的需求[sup][[/sup][sup]1-5[/sup][sup]][/sup]，不同检测方法间20%以上的检测差别可能影响20%的产品收率，所以建立起因子类产品效价准确的检测至关重要。[b][b]1 实验仪器与试剂1.1 仪器[/b][/b]Stago-compact全自动血凝仪（法国Diagnostica Stago公司），漩涡振荡器（美国Thermo Scientific公司）。[b][b]1.2 试剂[/b][/b]人凝血因子Ⅷ缺乏血浆（法国Diagnostica Stago公司），人凝血因子Ⅸ缺乏血浆（法国Diagnostica Stago公司），APTT试剂（法国Diagnostica Stago公司），Owren-Koller（稀释液）（法国Diagnostica Stago公司），0.025 mol/L氯化钙溶液（法国Diagnostica Stago公司），Desorb U（清洗液）（法国Diagnostica Stago公司），人凝血因子Ⅷ国家标准品（批号20100101），人凝血酶原复合物国家标准品（批号20130306），生理氯化钠溶液（石家庄四药有限公司），咪唑（天津市巴斯夫化工有限公司），氯化钠（天津市巴斯夫化工有限公司），枸橼酸钠（台山新宁制药有限公司），人血白蛋白（公司自产）。[b][b]2 方法2.1 人凝血因子Ⅷ不同稀释液稀释效价测定2.1.1 人凝血因子Ⅷ供试品Owren-Koller（稀释液）稀释效价测定方法[/b][/b] 人凝血因子Ⅷ国家标准品的定标：取1支人凝血因子Ⅷ国家标准品，加入1.0 ml纯化水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml含1.00 IU人凝血因子Ⅷ，将Desorb U（清洗液）、复溶后的人凝血因子Ⅷ缺乏血浆、0.025 mol/L氯化钙溶液、APTT以及每1ml含1.00 IU的人凝血因子Ⅷ标准品溶液分别装入全自动血凝仪的试剂抽屉，将Owren-Koller（稀释液）装入全自动血凝仪的样本抽屉，按照《Stago-compact全自动血凝仪标准操作规程》选择人凝血因子Ⅷ效价测定定标程序进行定标，仪器自动将装入的人凝血因子Ⅷ标准品溶液再进行2倍、4倍、8倍稀释，建立人凝血因子Ⅷ标准品溶液效价（分别为1.00 IU/ml、0.50 IU/ml、0.25 IU/ml、0.13 IU/ml）的对数对其相应凝固时间对数的直线回归方程。人凝血因子Ⅷ供试品效价测定：取人凝血因子Ⅷ供试品，按其标示装量加入灭菌注射用水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅷ，再用Owren-Koller（稀释液）做2倍、4倍稀释，将稀释后的供试品溶液装入全自动血凝仪的样本抽屉，选择人凝血因子Ⅷ效价测定选项进行测定。[b][b]2.1.2 人凝血因子Ⅷ供试品药典稀释液稀释效价测定方法[/b][/b] 人凝血因子Ⅷ国家标准品的定标同2.1.1人凝血因子Ⅷ供试品效价测定：取人凝血因子Ⅷ供试品，按其标示装量加入灭菌注射用水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅷ，再用药典稀释液（取1体积的3.8%枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合，加适量20%人血白蛋白至终浓度为1%配制而成）做2倍、4倍稀释，将稀释后的供试品溶液装入全自动血凝仪的样本抽屉，选择人凝血因子Ⅷ效价测定选项进行测定。[b][b]2.2 人凝血酶原复合物人凝血因子Ⅸ不同稀释液稀释效价测定2.2.1 人凝血酶原复合物供试品Owren-Koller（稀释液）稀释效价测定方法[/b][/b] 人凝血因子Ⅸ国家标准品的定标：取1支人凝血酶原复合物国家标准品，加入1.0 ml纯化水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml含1.00 IU人凝血因子Ⅸ，将Desorb U（清洗液）、复溶后的人凝血因子Ⅸ缺乏血浆、0.025 mol/L氯化钙溶液、APTT以及每1ml含1.00 IU的人凝血因子Ⅸ标准品溶液分别装入全自动血凝仪的试剂抽屉，将Owren-Koller（稀释液）装入全自动血凝仪的样本抽屉，按照《STAGO Compact全自动血凝仪标准操作规程》选择人凝血因子Ⅸ效价测定定标程序进行定标，仪器自动将装入的人凝血因子Ⅸ标准品溶液再进行2倍、4倍、8倍稀释，建立人凝血因子Ⅸ标准品溶液效价（分别为1.00 IU/ml、0.50 IU/ml、0.25 IU/ml、0.13 IU/ml）的对数对其相应凝固时间对数的直线回归方程。 人凝血酶原复合物供试品效价测定：取人凝血酶原复合物供试品，按其标示装量加入灭菌注射用水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅸ，再用Owren-Koller（稀释液）做2倍、4倍稀释，将稀释后的供试品溶液装入全自动血凝仪的样本抽屉，选择人凝血因子Ⅸ效价测定选项进行测定。[b][b]2.2.2 人凝血酶原复合物供试品药典稀释液稀释效价测定方法[/b][/b] 人凝血因子Ⅸ国家标准品的定标同2.1.1。人凝血酶原复合物供试品效价测定：取人凝血酶原复合物供试品，按其标示装量加入灭菌注射用水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅸ，再用药典稀释液（取1体积的3.8%枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合，加适量20%人血白蛋白至终浓度为1%配制而成）做2倍、4倍稀释，将稀释后的供试品溶液装入全自动血凝仪的样本抽屉，选择人凝血因子Ⅸ效价测定选项进行测定。[b][b]3 结果3.1 人凝血因子Ⅷ不同稀释液稀释效价测定结果[/b][/b] 2015ZK0801批人凝血因子Ⅷ为泰邦公司人凝血因子Ⅷ产品的质控品，取自正常生产的产品，用国家标准品标定后用作工作质控品。在进行人凝血因子Ⅷ效价测定时，分别用Owren-Koller（稀释液）和药典稀释液（取1体积的3.8%枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合，加适量20%人血白蛋白至终浓度为1%配制而成）对每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅷ进行再稀释。检验结果见表1，效价检测结果为效价标示量的百分比。[align=center]表1 FⅧ质控品两种稀释液检测结果对比[/align][align=center][img=,586,268]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141920_02_1626619_3.png[/img][/align]用柱形图表示，如图1：[align=center][img=,488,300]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141921_02_1626619_3.png[/img][/align][align=center]图1 FⅧ质控品两种稀释液检测结果对比[/align] 选取泰邦公司生产的连续10个批次的人凝血因子Ⅷ产品，进行人凝血因子Ⅷ效价测定，分别用Owren-Koller（稀释液）和药典稀释液（取1体积的3.8%枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合，加适量20%人血白蛋白至终浓度为1%配制而成）对每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅷ进行再稀释。检验结果见表2，效价检测结果为效价标示量的百分比。[align=center]表2 连续10批FⅧ两种稀释液检测结果对比[/align][align=center][img=,580,273]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141921_03_1626619_3.png[/img][/align]用柱形图表示，如图2：[align=center][img=,499,310]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141922_01_1626619_3.png[/img][/align][align=center]图 2 连续10批FⅧ两种稀释液检测结果对比[/align][b][b]3.2 人凝血酶原复合物不同稀释液稀释效价测定结果[/b][/b] 2015ZK0901批人凝血酶原复合物为泰邦公司人凝血酶原复合物产品的质控品，取自正常生产的产品，用国家标准品标定后用作工作质控品。在进行人凝血酶原复合物人凝血因子Ⅸ效价测定时，分别用Owren-Koller（稀释液）和药典稀释液（取1体积的3.8%枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合，加适量20%人血白蛋白至终浓度为1%配制而成）对每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅸ进行再稀释。检验结果见表3，效价检测结果为效价标示量的百分比。[align=center]表3 PCC质控品两种稀释液检测结果对比[/align][align=center][img=,580,269]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141923_01_1626619_3.png[/img][/align]用柱形图表示，如图3：[align=center][img=,548,288]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141923_02_1626619_3.png[/img][/align][align=center]图3 PCC质控品两种稀释液检测结果对比[/align] 选取泰邦公司生产的连续10个批次的人凝血酶原复合物产品，进行人凝血酶原复合物人凝血因子Ⅸ效价测定，分别用Owren-Koller（稀释液）和药典稀释液（取1体积的3.8%枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合，加适量20%人血白蛋白至终浓度为1%配制而成）对每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅸ进行再稀释。检验结果见表4，效价检测结果为效价标示量的百分比。[align=center]表4 连续10批PCC两种稀释液检测结果对比[/align][align=center][img=,573,259]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141947_01_1626619_3.png[/img][/align]用柱形图表示，如图4：[align=center][img=,548,327]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141947_03_1626619_3.png[/img][/align][align=center]图4 连续10批PCC两种稀释液检测结果对比[/align][b][b]4 讨论[/b][/b] 本实验确定了在人凝血因子Ⅷ的效价检测中，采用不同的稀释液对每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅷ的样品进行稀释，无论是对同一批质控品的测定还是对连续批次样品的测定，检测结果之间存在较大的差别，另外对FⅧ质控品两种稀释液检测结果运用软件SPSS17.0进行均值单因素ANOVA比较，计算P值，P＜0.05表明两种方法的结果有显著性差异，含有蛋白的稀释液的检测结果明显高于不含蛋白的稀释液。而在人凝血酶原复合物人凝血因子Ⅸ的效价检测中，采用不同的稀释液对每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅸ的样品进行稀释，同一批质控品和连续批次样品检测结果之间差别较小，另外对PCC质控品两种稀释液检测结果运用软件SPSS17.0进行均值单因素ANOVA比较，计算P值，P＞0.05表明两种方法的结果无显著性差异。在使用全自动血凝仪进行人凝血因子Ⅷ和人凝血酶原复合物等因子类血液制品效价检测时，一般按照仪器的使用说明书和配套试剂进行稀释检测，但是忽视了血凝仪的开发目的是用于临床血浆样品的检测，而血浆与高纯度的血液制品浓缩物是不同的，用检测血浆样品的方法进行因子类血液制品的效价检测可能影响检测结果。因子类血液制品效价检测时，同一样品采用不同的稀释液进行稀释检测结果可能存在较大差别，应对血凝仪是否可用于因子类血液制品进行评估，并应建立起正确的检测操作规程。因子类血液制品采用不同的稀释液进行稀释检测结果可能存在较大差别可能跟产品本身的性质有关，因子类血液制品经过分离、纯化，去除了众多的杂质蛋白，为高纯度的浓缩物，活性较高，但蛋白质含量较低，人凝血因子Ⅷ的蛋白质含量约为0.1%，人凝血酶原复合物的蛋白质含量约为2.3%，而临床血浆样本的蛋白质含量约为5%，, 人凝血因子Ⅷ加入含1%人血白蛋白的稀释液后对FⅧ效价测定影响较大，PCC中加入含1%人血白蛋白的稀释液后对FⅨ效价测定影响较小，可能是人凝血因子Ⅷ的蛋白质含量远小于血凝仪设计用于检测的血浆样本的蛋白含量，故建立不同蛋白质浓度梯度的稀释液对因子效价进行测定，从而确认蛋白质浓度对因效价测定的影响。[b]参考文献：[/b]Cheng E, Jinzenji D, Lorthiois AP, et al. Purification of coagulation factorⅧ using chromatographic methods. Direct chromatography of plasma in anion exchange resins . Biotechnol Lett, 2010, 32(9):1207-1214.李策生, 周志军, 胡勇, 等. 人凝血因子Ⅷ中试纯化工艺的质量控制 .中国生物制品学杂志, 2013, 26(10):1508-1512.冉曙光, 刘文芳, 赵辉. 凝血因子Ⅷ浓缩物的制备及安全性和有效性 .中国输血杂志, 2008, 21(2):156-159.倪道明, 朱威. 血液制品 . 北京: 人民卫生出版社, 2013:21.王卓, 赵雄, 吕茂民, 等. 血液制品的现状与展望 . 生物工程学报, 2011, 27(5):730-746.[b] [/b]

人凝血因子VIII中氨基酸含量测定摘要 目的: 建立用高效液相色谱法测定人凝血因子VIII中氨基酸含量。方法: 采用6 － 氨基喹啉－ N － 羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯( AQC) 为衍生剂，与氨基酸柱前衍生后，用Agilent 1200 高效液相色谱仪，AccQ·Tag C18柱( waters 150 mm ×3. 9 mm，4 μm) ，以水Eluent( 醋酸盐－ 磷酸盐缓冲液) 稀释液和乙腈进行梯度洗脱，检测波长为248 nm，柱温37 ℃，进样量10μL。结果: 各氨基酸在32 min 内测定完毕，回收率为98.7% ～ 101.5%。RSD 均小于1. 5%。结论: 本法分离度好，快速、简便，可作为产品的质量控制方法。关键词: 6 － 氨基喹啉－ N － 羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯; 人凝血因子VIII; 甘氨酸; 衍生物; 梯度洗脱; 高效液相色谱法;氨基酸; 含量测定人凝血因子VIII，本品对缺乏人凝血因子礓所致的凝血机能障碍具有纠正作用，主要用于防治甲型血友病和获得性凝血因子Ⅷ缺乏而致的出血症状及这类病人的手术出血治疗。该药物制备过程中使用了氨基酸( 精氨酸、丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、盐酸赖氨酸、脯氨酸 等) 做稳定剂，为了保证药品质量和用药安全，应对其中氨基酸的含量进行控制。该法依据过量的6 － 氨基喹啉基－ N － 羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯( AQC) 在一定条件和氨基酸形成稳定的衍生产物( 柱前衍生) ，用高效液相色谱法测定衍生产物，根据衍生产物的含量计算人凝血因子中各氨基酸的含量。1 仪器和试药1200 高效液相色谱系统( 美国Agilent 公司) ，配置低压四元梯度泵、1314B 紫外吸收检测器、自动进样器、柱温箱、Chemistations 化学工作站; Sartorius CP225D 电子微量天平( 德国Sartorius 公司) ; SartoriusPB － 21 型pH 计( 德国Sartorius 公司) ; LDZ5 －2 低速自动平衡离心机( 上海医用离心机厂) 等。各标准品均来自于中国食品药品检定研究院2 色谱条件及系统适用性试验色谱柱: Waters AccQ·Tag C18色谱柱( 3. 9 mm ×150 mm) ; 流动相: 水为溶剂D，Eluent( 醋酸盐－ 磷酸盐缓冲液) 稀释液( A) － 乙腈( B) － 水( D) ，柱温:37 ℃; 检测波长: 248 nm。精密量取对照品溶液与供试品溶液10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图32 min。梯度洗脱条件表见表1。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/08/201508311802_563771_1637386_3.png

建立了使用石墨炉原子吸收分光光度法检测人凝血因子VIII中铝含量的分析方法，探讨了以非离子表面活性剂Triton X-100,基体改进剂，干燥温度和气体流量对实验结果的影响.在最佳工作条件下，铝的检测限为0.8μg/l；样品测得的相对标准偏差（n=6）为5.6%，加标回收率94.5%～103.5 %。方法适合人凝血因子VIII中铝离子残留量的分析测定。关键词：铝；石墨炉原子吸收分光光度法；人凝血因子VIII，残留量 铝是一种人体非必需的微量元素, 如果摄入过多, 将会严重影响人体的神经系统, 不仅使老年人易患痴呆病,还会引发慢性肾功能损害等病症, 故世界卫生组织及欧洲药典等均将铝含量的测定作为成品检定项目之一。 人凝血因子VIII辅料中加入Al2O3作为吸附剂，因此其在制剂中需对其残留量进行检测。由于其制剂成分复杂、有机物干扰严重、某些样品中的铝含量极低, 有些分析方法检出限达不到要求。石墨炉原子吸收光谱法是铝残留量分析中常用的方法之一。 本文采用非离子表面活性剂Triton X-100,基体改进剂硝酸镁 ，建立了石墨炉原子吸收分光光度法检测人凝血因子VIII中铝离子残留量的分析方法。1 　实验部分1 .1 　仪器与试剂ICE 3400GF 型原子吸收光谱仪(美国Thermo公司):ID100 自动稀释器,Chill I冷却水系统，GFS35Z石墨炉，自参比单光束塞曼系统, GFS 石墨炉自动进样器, 涂层石墨管（Extended Lifetime Cuvettes）；铝空心阴极灯；ELGA Q15 纯水机。HNO3为MOS级；100μg/mL铝元素标准溶液（GSB 04-1713-2004) , 标准工作溶液均由以上溶液经超纯水逐级稀释而成的；稀释液：1%（v/v）硝酸+0.01%（v/v）Triton X-100(化学纯试剂)；2.5g/L Mg(NO3)2 基体改进剂:称取0.25g分析纯Mg(NO3)2到PPE塑料烧杯中, 用超纯水溶解定容至100mL PPE塑料容量瓶中。实验所用水为电阻率为18.2 MΩ·cm 的超纯水。1 .2 　样品预处理1.2.1 供试品溶液 精密量取供试品溶液0.2ml，加稀释液2.3ml。1.2.2 混合溶液 精密量取供试品溶液0.2ml，加入100μg/L标准铝溶液0.50ml，再加稀释液1.8ml。1 .3 　实验方法准确移取稀释液、供试品溶液、混合溶液倒入自动进样器的样品杯中, 再通过自动进样器进样后由石墨炉原子吸收光谱仪进行铝含量的测定。1 .4 　仪器工作条件石墨炉原子吸收光谱仪测定铝时的工作参数设置和石墨炉升温程序见表1 和表2 。表1 石墨炉原子吸收光谱仪的操作参数Tab.1 Operating parameters for GFAAS电流 I/mA测定波长 λ/nm缝隙宽度 l/nm测定模式进样量 V/µL基体改进剂8309.30.5峰高102.5g/L Mg(NO3)2 表2 石墨炉升温程序Tab.2 Graphite furnace heating program步骤程序温度 ℃时间 s斜坡 ℃/s气体类型气体流量 l/min1干燥8010.00氩气0.22干燥1105.03氩气0.13干燥2205.01氩气0.24灰化150010.00氩气0.15原子化26005.00氩气06清除26505.00氩气0.3 1 .5 　工作曲线的制作将0

http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/05/201105281415_296633_1609805_3.jpg献血毕竟也是“出血”。我们知道，一般急性失血500ml，就会出现头昏、心慌、乏力，失血1000ml就会出现休克。正常成人的血液总量大约有4000～5000ml，倘若一次失血超过20%（也就是800～1000ml）就可能有生命危险。因此，献血者有些顾虑是正常的，但是献血对身体的具体影响会大到什么地步呢？血液中的主要成分包括红细胞、血小板、白细胞和血浆。红细胞的主要作用是运送氧气和二氧化碳——这可谓是血液最重要的功能。人体的组织器官，缺氧超过几分钟就会发生不可逆的损伤。而细胞所需要的氧几乎都是由红细胞运送的。大量失血之所以会要人命，主要就是因为红细胞会不够用。血小板和血浆中的十几种凝血因子共同参与凝血的工作。如果血小板减少的话，人就可能出血不止，甚至出现自发出血，也就是你什么都不做，血自己就渗出来了。白细胞主要参与免疫反应，说白了就是抵抗外来入侵者、以及清除内部叛乱者——肿瘤细胞。但是这个免疫反应绝对不是白细胞一个人在战斗，还需血浆中的各种免疫成分协作。

[b]中文摘要：目的[/b] 确立因子类血液制品中蛋白质含量对效价检测结果的影响，从而完善因子类血液制品效价检测的方法。[b]方法 [/b]选取不同蛋白质浓度梯度的稀释液对同一供试品进行稀释来确定蛋白质影响的规律。 [b]结果 [/b]建立起人凝血因子Ⅷ、人凝血酶原复合物的全自动血凝仪因子效价检测方法，根据效价检测反应体系中蛋白浓度对检测结果的影响,建立因子类血液制品效价全自动血凝仪检测的方法。[b]结论 [/b]建立的两种稀释方法均消除了样品中蛋白质含量的不同对检测结果的影响，提高了检测的准确性，不但可以适用于现在产品的效价检测，而且适用于随着生产工艺的提升生产的更高纯度、低蛋白含量的FⅧ和PCC，同时也是对中国药典标准的补充。[b]关键词[/b]：人凝血因子Ⅷ；人凝血酶原复合物；效价；蛋白含量 人凝血因子Ⅷ、人凝血酶原复合物、人凝血因子Ⅸ等因子类血液制品，是以健康人血浆为原料，经分离纯化和病毒灭活制成，在临床上主要用于各种凝血因子缺乏的治疗，这些因子类血液制品的凝血因子效价是药品有效性的指标，凝血因子效价的测定也是药品质量检测中的关键检测项目。血液制品生产企业及各级检测机构一般采用全自动血凝仪并按照仪器使用说明来进行因子效价的检测，然而在不同检测方法结果比对中，发现全自动血凝仪检测结果与中国药典中一期法的检测结果在部分因子效价检测中存在检测差异，差异可能是样品稀释中使用的稀释液的蛋白含量不同引起的，故本课题主要研究因子类血液制品中蛋白质含量对效价检测结果影响。通过蛋白含量对因子效价检测影响的研究建立起的全自动血凝仪因子效价检测方法，消除了产品本身性质的影响，可以准确进行因子效价的测定，方法的建立不但可以准确控制因子类血液制品的质量，保证生产企业持续稳定生产出质量均一的药品，而且可以减少因子类产品在临床使用中的风险。[b]1 实验仪器与试剂[b]1.1 仪器[/b][/b]Stago-compact全自动血凝仪（法国Diagnostica Stago公司），漩涡振荡器（美国Thermo Scientific公司）。[b][b]1.2 试剂[/b][/b]人凝血因子Ⅷ缺乏血浆（法国Diagnostica Stago公司），人凝血因子Ⅸ缺乏血浆（法国Diagnostica Stago公司），APTT试剂（法国Diagnostica Stago公司），Owren-Koller（稀释液）（法国Diagnostica Stago公司），0.025 mol/L氯化钙溶液（法国Diagnostica Stago公司），Desorb U（清洗液）（法国Diagnostica Stago公司），人凝血因子Ⅷ国家标准品（批号20100101），人凝血酶原复合物国家标准品（批号20130306），生理氯化钠溶液（石家庄四药有限公司），咪唑（天津市巴斯夫化工有限公司），氯化钠（天津市巴斯夫化工有限公司），枸橼酸钠（台山新宁制药有限公司），人血白蛋白（公司自产）。[b][b]2 方法2.1 人凝血因子Ⅷ不同蛋白质浓度梯度稀释效价测定[/b][/b] 人凝血因子Ⅷ国家标准品的定标：取1支人凝血因子Ⅷ国家标准品，加入1.0 ml纯化水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml含1.00 IU人凝血因子Ⅷ，将Desorb U（清洗液）、复溶后的人凝血因子Ⅷ缺乏血浆、0.025 mol/L氯化钙溶液、APTT以及每1 ml含1.00 IU的人凝血因子Ⅷ标准品溶液分别装入全自动血凝仪的试剂抽屉，将Owren-Koller（稀释液）装入全自动血凝仪的样本抽屉，按照《Stago-compact全自动血凝仪标准操作规程》选择人凝血因子Ⅷ效价测定定标程序进行定标，仪器自动将装入的人凝血因子Ⅷ标准品溶液再进行2倍、4倍、8倍稀释，建立人凝血因子Ⅷ标准品溶液效价（分别为1.00 IU/ml、0.50 IU/ml、0.25 IU/ml、0.13 IU/ml）的对数对其相应凝固时间对数的直线回归方程。 不同蛋白质浓度梯度稀释液制备：选取全自动血凝仪的稀释液Owren-Koller、生理氯化钠溶液、取1体积的3.8%枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合液分别定义为稀释液1、稀释液2、稀释液3。向3种稀释液中分别加入人血白蛋白，使其中人血白蛋白的浓度分别为0、0.5%、1%、3%、5%。 人凝血因子Ⅷ供试品效价测定：取人凝血因子Ⅷ供试品，按其标示装量加入灭菌注射用水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅷ，再用含不同蛋白浓度的稀释液做2倍、4倍稀释，将稀释后的供试品溶液装入全自动血凝仪的样本抽屉，选择人凝血因子Ⅷ效价测定选项进行测定。[b][b]2.2 人凝血因子Ⅷ人凝血因子缺乏血浆稀释效价测定[/b] [/b]人凝血因子Ⅷ国家标准品的定标：取1支人凝血因子Ⅷ国家标准品，加入1.0 ml纯化水复溶，轻轻混匀，用人凝血因子Ⅷ缺乏血浆将其稀释成每1ml含1.00 IU人凝血因子Ⅷ，将Desorb U（清洗液）、复溶后的人凝血因子Ⅷ缺乏血浆、0.025 mol/L氯化钙溶液、APTT以及每1 ml含1.00 IU的人凝血因子Ⅷ标准品溶液分别装入全自动血凝仪的试剂抽屉，将Owren-Koller（稀释液）装入全自动血凝仪的样本抽屉，按照《Stago-compact全自动血凝仪标准操作规程》选择人凝血因子Ⅷ效价测定定标程序进行定标，仪器自动将装入的人凝血因子Ⅷ标准品溶液再进行2倍、4倍、8倍稀释，建立人凝血因子Ⅷ标准品溶液效价（分别为1.00 IU/ml、0.50 IU/ml、0.25 IU/ml、0.13 IU/ml）的对数对其相应凝固时间对数的直线回归方程。 人凝血因子Ⅷ供试品效价测定：取人凝血因子Ⅷ供试品，按其标示装量加入灭菌注射用水复溶，轻轻混匀，用人凝血因子Ⅷ缺乏血浆将其稀释成每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅷ，再用Owren-Koller（稀释液）做2倍、4倍稀释，将稀释后的供试品溶液装入全自动血凝仪的样本抽屉，选择人凝血因子Ⅷ效价测定选项进行测定。[b][b]2.3 人凝血酶原复合物人凝血因子Ⅸ不同蛋白质浓度梯度稀释效价测定[/b][/b] 人凝血因子Ⅸ国家标准品的定标：取1支人凝血酶原复合物国家标准品，加入1.0 ml纯化水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml含1.00 IU人凝血因子Ⅸ，将Desorb U（清洗液）、复溶后的人凝血因子Ⅸ缺乏血浆、0.025 mol/L氯化钙溶液、APTT以及每1 ml含1.00 IU的人凝血因子Ⅸ标准品溶液分别装入全自动血凝仪的试剂抽屉，将Owren-Koller（稀释液）装入全自动血凝仪的样本抽屉，按照《Stago-compact全自动血凝仪标准操作规程》选择人凝血因子Ⅸ效价测定定标程序进行定标，仪器自动将装入的人凝血因子Ⅸ标准品溶液再进行2倍、4倍、8倍稀释，建立人凝血因子Ⅸ标准品溶液效价（分别为1.00 IU/ml、0.50 IU/ml、0.25 IU/ml、0.13 IU/ml）的对数对其相应凝固时间对数的直线回归方程。 不同蛋白质浓度梯度稀释液制备同2.1。 人凝血酶原复合物供试品效价测定：取人凝血酶原复合物供试品，按其标示装量加入灭菌注射用水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅸ，再用含不同蛋白浓度的稀释液做2倍、4倍稀释，将稀释后的供试品溶液装入全自动血凝仪的样本抽屉，选择人凝血因子Ⅸ效价测定选项进行测定。[b][b]2.4 人凝血酶原复合物人凝血因子Ⅸ人凝血因子缺乏血浆稀释效价测定[/b][/b] 人凝血因子Ⅸ国家标准品的定标：取1支人凝血酶原复合物国家标准品，加入1.0 ml纯化水复溶，轻轻混匀，用人凝血因子Ⅸ缺乏血浆将其稀释成每1 ml含1.00 IU人凝血因子Ⅸ，将Desorb U（清洗液）、复溶后的人凝血因子Ⅸ缺乏血浆、0.025 mol/L氯化钙溶液、APTT以及每1 ml含1.00 IU的人凝血因子Ⅸ标准品溶液分别装入全自动血凝仪的试剂抽屉，将Owren-Koller（稀释液）装入全自动血凝仪的样本抽屉，按照《Stago-compact全自动血凝仪标准操作规程》选择人凝血因子Ⅸ效价测定定标程序进行定标，仪器自动将装入的人凝血因子Ⅸ标准品溶液再进行2倍、4倍、8倍稀释，建立人凝血因子Ⅸ标准品溶液效价（分别为1.00 IU/ml、0.50 IU/ml、0.25 IU/ml、0.13 IU/ml）的对数对其相应凝固时间对数的直线回归方程。 人凝血酶原复合物供试品效价测定：取人凝血酶原复合物供试品，按其标示装量加入灭菌注射用水复溶，轻轻混匀，用人凝血因子Ⅸ缺乏血浆将其稀释成每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅸ，再用Owren-Koller（稀释液）做2倍、4倍稀释，将稀释后的供试品溶液装入全自动血凝仪的样本抽屉，选择人凝血因子Ⅸ效价测定选项进行测定。[b][b]3 结果3.1 人凝血因子Ⅷ不同蛋白质浓度梯度稀释效价测定结果[/b][/b] 选取2015ZK0801批人凝血因子Ⅷ进行了不同蛋白质浓度梯度稀释效价测定，不同浓度稀释液分别测定10次。人血白蛋白的浓度分别为0、0.5%、1%、3%、5%的稀释液1、稀释液2、稀释液3的效价检测结果分别见表1、2、3，效价检测结果为效价标示量的百分比。[align=center]表1 FⅧ质控品不同蛋白浓度梯度稀释液1检测结果[/align][align=center][img=,590,266]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142017_01_1626619_3.png[/img][/align][align=center]表2 FⅧ质控品不同蛋白浓度梯度稀释液2检测结果 [/align][align=center][img=,586,260]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142019_01_1626619_3.png[/img][/align][align=center]表3 FⅧ质控品不同蛋白浓度梯度稀释液3检测结果 [/align][align=center][img=,585,261]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142019_02_1626619_3.png[/img][/align]人凝血因子Ⅷ质控品2015ZK0801批用不同蛋白质浓度梯度的稀释液1、稀释液2、稀释液3稀释效价检测结果平均值用折线图表示，如图1：[align=center]图1 FⅧ质控品不同蛋白质浓度检测结果对比[/align][align=center][img=,548,295]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142019_03_1626619_3.png[/img][/align] 选取2批国外产人凝血因子Ⅷ和VWF混合制剂进行了不同蛋白质浓度梯度稀释效价测定，人血白蛋白的浓度分别为0、0.5%、1%、3%、5%的稀释液1、稀释液2、稀释液3的效价检测结果见表4、5，效价检测结果为效价标示量的百分比。[align=center]表4 658668A批制剂FⅧ检测结果[/align][align=center][img=,585,99]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142020_01_1626619_3.png[/img][/align][align=center]表5 A3B1814批制剂FⅧ检测结果[/align][align=center][img=,577,97]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142021_01_1626619_3.png[/img][/align]FⅧ效价检测结果用折线图表示，如图2、3：[align=center][img=,563,299]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142029_01_1626619_3.png[/img][/align][align=center]图2 658668A批不同蛋白质浓度检测结果对比[/align][align=center][img=,567,287]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142030_01_1626619_3.png[/img][/align][align=center]图3 A3B1814批不同蛋白质浓度检测结果对比[/align][b][b]3.2 人凝血酶原复合物不同蛋白质浓度梯度稀释效价测定结果[/b][/b] 选取2015ZK0901批人凝血酶原复合物进行了不同蛋白质浓度梯度稀释人凝血因子Ⅸ效价测定，不同浓度稀释液分别测定10次。人血白蛋白的浓度分别为0、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%的稀释液1、稀释液2、稀释液3的效价检测结果分别见表6、7、8，效价检测结果为效价标示量的百分比。[align=center]表6 PCC质控品不同蛋白浓度梯度稀释液1检测结果[/align][align=center][img=,583,269]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142031_01_1626619_3.png[/img][/align][align=center]表7 PCC质控品不同蛋白浓度梯度稀释液2检测结果[/align][align=center][img=,586,260]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142031_02_1626619_3.png[/img][/align][align=center]表8 PCC质控品不同蛋白浓度梯度稀释液3检测结果[/align][align=center][img=,593,263]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142043_01_1626619_3.png[/img][/align]人凝血酶原复合物质控品2015ZK0901批用不同蛋白质浓度梯度的稀释液1、稀释液2、稀释液3稀释FⅨ效价检测结果平均值用折线图表示，如图4：[align=center][img=,556,300]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142032_01_1626619_3.png[/img][/align][align=center]图4 PCC质控品不同蛋白质浓度FⅨ检测结果对比[/align][b][b]3.3 人凝血因子Ⅷ人凝血因子缺乏血浆稀释效价测定结果[/b][/b]选取2015ZK0801批人凝血因子Ⅷ进行了人凝血因子缺乏血浆稀释效价测定，共测定10次。效价检测结果见表9，效价检测结果为效价标示量的百分比。[align=center]表9 FⅧ质控品人凝血因子缺乏血浆稀释检测结果[/align][align=center][img=,579,74]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142032_02_1626619_3.png[/img][/align]选取2批国外产人凝血因子Ⅷ和VWF混合制剂进行了人凝血因子缺乏血浆稀释效价测定。效价检测结果见表10，效价检测结果为效价标示量的百分比。[align=center]表10 国外产品人凝血因子缺乏血浆稀释检测结果[/align][align=center][img=,578,77]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142036_01_1626619_3.png[/img][/align][b][b]3.4 人凝血酶原复合物人凝血因子Ⅸ人凝血因子缺乏血浆稀释效价测定结果[/b][/b]选取2015ZK0901批人凝血酶原复合物进行了人凝血因子缺乏血浆稀释人凝血因子Ⅸ效价测定，共测定10次。效价检测结果见表11，效价检测结果为效价标示量的百分比。[align=center]表11 PCC质控品人凝血因子缺乏血浆稀释检测结果[/align][align=center][img=,582,89]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142047_01_1626619_3.png[/img][/align][b][b]4 讨论[/b][/b] 本实验中对人凝血因子Ⅷ和人凝血酶原复合物分别用不同蛋白浓度梯度的稀释液进行了效价测定，另外用人凝血因子缺乏血浆稀释后进行了效价测定。因子效价测定中，稀释液1、稀释液2、稀释液3中加入相同浓度的人血白蛋白后，得到的因子效价检测结果没有差异，说明全自动血凝仪的稀释液Owren-Koller、生理氯化钠溶液、取1体积的3.8%枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合液作为稀释液时没有区别。 人凝血因子Ⅷ、人凝血酶原复合物不同蛋白浓度梯度效价测定时，随着稀释液中蛋白质含量的增高，效价检测结果也不断升高，但在人凝血因子Ⅷ效价测定中，采用蛋白质含量为1%、3%的稀释液时，效价检测结果间均无显著差别，在人凝血酶原复合物人凝血因子Ⅸ效价测定中，采用蛋白质含量为0、0.5%、1%的稀释液时，效价检测结果间均无显著差别。另外，人凝血因子Ⅷ进行人凝血因子缺乏血浆稀释效价测定效价检测结果与采用蛋白质含量为1%、3%的稀释液得到的检测结果也无显著差异，人凝血酶原复合物人凝血因子缺乏血浆稀释人凝血因子Ⅸ效价检测结果与采用蛋白质含量为0、0.5%、1%的稀释液得到的检测结果也无显著差异。另外，国外生产的人凝血因子Ⅷ和VWF的混合制剂FⅧ效价的检测结果及血浆、稀释液的影响同泰邦公司产品一致。[b]参考文献[/b][align=left] 邬杨斌, 余蓉. 凝血因子Ⅸ复合物的研制 . 华西药学杂志, 2000, 15(3):177-179. Pabinger I, Brenner B, Kalina U, et al. Prothrombin complex concentrate（Beriplexw P/N）for emergency anticoagulation reversal: A prospective multinational clinical trial . J Thromb Haemost, 2008, 6(4):622-631. Kiman E, Elela AA, Ｒamsis N, et al. Evaluation of the coagulation factors activity of Cryosupernatant . Suez Canal Univ Med J, 2003, 6(2):247-258.Tullis JL, Melin M, Jurigian P. Clinical use of human Prothrombin complexes . N Engl J Med, 1965, 73(13):667-674.马莉, 孙盼, 李长清, 等. 去冷沉淀血浆的质量分析 . 中国生物制品学杂志, 2013, 26(1):81-83.魏舒, 时凯, 刘国荣, 等. 冻干人凝血酶原复合物的生产工艺研究 . 中国输血杂志, 2008, 21(10):282-284.Samama CM. Prothrombin complex concentrates: a brief review . Eur J Anaesthesiol, 2008, 25(10):784-789.焦丽华, 代旭兰, 刘文芳. 凝血酶原复合物的制备及其临床应用进展 .中国输血杂志, 2008, 21(9):737-741.[/align][b] [/b]

[align=center][b]因子类血液制品效价的检测方法验证[/b][/align][align=left][b]中文摘要[/b]：[b]目的 [/b]验证全自动凝血仪应用于因子类血液制品效价测定时方法的准确性 [b]方法[/b]根据生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则及《中国药典》2015年版通则9012生物样品定量分析方法验证指导原则，通过线性关系，准确度，精密度（重复性、日间精密度），专属性对本方法进行方法学验证。[b]结果[/b]两种稀释方法的因子效价检测所进行的线性关系，准确度，精密度、日间精密度、专属性验证均符合方法学验证的标准。[b]结论[/b]两种稀释方法适用于因子效价的检测。效从价检测方法的建立可应用于因子类血液制品生产的中间过程控制，通过准确的效价检测可以对中间各个生产环节的中间产品进行指导，可以精确分析各生产环节的效价损耗量，而制定解决方案，提高整个生产过程的产品收率，在半成品的配制环节，可对产品的总效价进行精确控制，从而提高产品质量的均一性，整体提高产品的质量水平。[/align][b]关键词: 因子类血液制品；效价检测； 方法学验证[/b]通过蛋白质含量对凝血因子效价检测影响的研究，发现在供试品稀释中使用含不同蛋白质浓度的稀释液导致因子效价测定的差异。而在制药企业和检测机构中，为追求检测方法的简单化、仪器化和数据可追溯性，大部分采用了全自动血凝仪，并按照血凝仪的使用说明书进行了因子类血液制品的效价检测。选用蛋白浓度为1%的药典稀释液和用人凝血因子缺乏血浆进行预稀释两种方法对人凝血因子进行效价检测全自动血凝仪法通过线性关系，准确度，精密度（重复性、日间精密度），专属性对本方法进行方法学验证。效价检测方法的建立可应用于因子类血液制品生产的中间过程控制，通过准确的效价检测可以对中间各个生产环节的中间产品进行指导，可以精确分析各生产环节的效价损耗量，从而制定解决方案，提高整个生产过程的产品收率，在半成品的配制环节，可对产品的总效价进行精确控制，从而提高产品质量的均一性，整体提高产品的质量水平。[b] 1 实验仪器与试剂1.1 仪器[/b]Stago-compact全自动血凝仪（法国DiagnosticaStago公司），漩涡振荡器（美国ThermoScientific公司）。[b]1.2 试剂人凝血因子Ⅷ国家标准品（批号20100101），人凝血酶原复合物国家标准品（批号20130306），药典稀释液（取1体积的3.8%枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合，加适量20%人血白蛋白至终浓度为1%），Owren-Koller（稀释液）。2 方法2.1 蛋白含量1%的药典稀释液稀释人凝血因子Ⅷ效价检测方法验证2.1.1线性关系[/b]取复溶后的人凝血因子Ⅷ国家标准品，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml含1.00 IU人凝血因子Ⅷ，按照Stago全自动血凝仪操作规程选择人凝血因子Ⅷ效价测定定标程序操作，仪器自动将装入的人凝血因子标准品溶液稀释至1.00 IU/ml、0.50IU/ml、0.25IU/ml、0.13IU/ml，连续定标3次。定标完成后，仪器建立人凝血因子Ⅷ标准品溶液效价（IU/ml）的对数对其相应的凝固时间（秒）对数的直线回归方程，记录相关系数R值，应不低于0.99。[b]2.1.2 准确度[/b]将生理氯化钠溶液稀释至1 IU/ml的人凝血因子Ⅷ溶液放入STAGO全自动血凝仪中定标，另取用药典稀释液再稀释1.5倍，3倍，6倍，8倍的标准品溶液（标准曲线范围内高、中、低三个稀释度和定量下限）作为待测样品，按照操作规程进行测定，测定3次，并计算回收率，高、中、低浓度标准品回收率应在85%~115%范围内，定量下限标准品回收率应在80%~120%范围内。[b]2.1.3 精密度[/b]取2015ZK0801批人凝血因子Ⅷ质控品，用灭菌注射用水复溶后，用生理氯化钠溶液将其进行27倍稀释，再用药典稀释液稀释1倍，1.5倍，3倍，6倍，8倍，分别作为标准曲线范围内定量上限，高、中、低三个稀释度和定量下限。每一个稀释度重复测定5次。计算每一浓度测定结果的均值、SD和RSD值，高、中、低浓度标准品回收率应在85%~115%范围内，定量上、下限标准品回收率应在80%~120%范围内。[b]2.1.4 日间精密度[/b]在不同的三天分别按照2.1.3进行精密度的测定。[b]2.1.5 专属性[/b]为确保当制品中含有其它组分，如杂质、降解物、添加物（如缓冲液、赋形剂、稳定剂）等存在时，能够准确可靠测定供试品的能力而进行分析方法的专属性验证。取人凝血因子Ⅷ生产过程中的配制平衡液（含与人凝血因子Ⅷ中相同含量的氯化钠、枸橼酸钠、甘氨酸、甘露醇等），以此作为不含人凝血因子Ⅷ的基质溶液，进行人凝血因子Ⅷ效价的检测，其检测结果应低于方法定量下限，并对用基质溶液稀释的高浓度和低浓度的标准品进行检测，要求至少80%以上的标准品的准确度在±20%范围内。[b]2.2 人凝血因子缺乏血浆进行预稀释人凝血因子Ⅷ效价检测方法验证2.2.1 线性关系[/b]取复溶后的人凝血因子Ⅷ国家标准品，用人凝血因子Ⅷ缺乏血浆将其稀释成每1 ml含1.00 IU人凝血因子Ⅷ，按照Stago全自动血凝仪操作规程选择人凝血因子Ⅷ效价测定定标程序操作，仪器自动将装入的人凝血因子标准品溶液稀释至1.00 IU/ml、0.50IU/ml、0.25IU/ml、0.13IU/ml，连续定标3次。定标完成后，仪器建立人凝血因子Ⅷ标准品溶液效价（IU/ml）的对数对其相应的凝固时间（秒）对数的直线回归方程，记录相关系数R值，应不低于0.99。[b]2.2.2 准确度[/b]将人凝血因子Ⅷ缺乏血浆稀释至1 IU/ml的人凝血因子Ⅷ溶液放入STAGO全自动血凝仪中定标，另取用Owren-Koller（稀释液）再稀释1.5倍，3倍，6倍，8倍的标准品溶液（标准曲线范围内高、中、低三个稀释度和定量下限）作为待测样品，按照操作规程进行测定，测定3次，并计算回收率，高、中、低浓度标准品回收率应在85%~115%范围内，定量下限标准品回收率应在80%~120%范围内。[b]2.2.3 精密度[/b]取2015ZK0801批人凝血因子Ⅷ质控品，用灭菌注射用水复溶后，用人凝血因子Ⅷ缺乏血浆将其进行27倍稀释，再用Owren-Koller（稀释液）稀释1倍，1.5倍，3倍，6倍，8倍，分别作为标准曲线范围内定量上限，高、中、低三个稀释度和定量下限。每一个稀释度重复测定5次。计算每一浓度测定结果的均值、SD和RSD值，高、中、低浓度标准品回收率应在85%~115%范围内，定量上、下限标准品回收率应在80%~120%范围内。[b]2.2.4 日间精密度[/b]在不同的三天分别按照2.2.3进行精密度的测定。[b]2.2.5 专属性[/b]为确保当制品中含有其它组分，如杂质、降解物、添加物（如缓冲液、赋形剂、稳定剂）等存在时，能够准确可靠测定供试品的能力而进行分析方法的专属性验证。取人凝血因子Ⅷ生产过程中的配制平衡液（含与人凝血因子Ⅷ中相同含量的氯化钠、枸橼酸钠、甘氨酸、甘露醇等），以此作为不含人凝血因子Ⅷ的基质溶液，进行人凝血因子Ⅷ效价的检测，其检测结果应低于方法定量下限，并对用基质溶液稀释的高浓度和低浓度的标准品进行检测，要求至少80%以上的标准品的准确度在±20%范围内[b]2.3 蛋白含量1%的药典稀释液稀释人凝血酶原复合物效价检测方法验证2.3.1 线性关系[/b]取复溶后的人凝血酶原复合物国家标准品，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml含1.00 IU人凝血因子Ⅸ，按照Stago全自动血凝仪操作规程选择人凝血因子Ⅸ效价测定定标程序操作，仪器自动将装入的人凝血因子Ⅸ标准品溶液稀释至1.00 IU/ml、0.50IU/ml、0.25IU/ml、0.13IU/ml，连续定标3次。定标完成后，仪器建立人凝血因子Ⅸ标准品溶液效价（IU/ml）的对数对其相应的凝固时间（秒）对数的直线回归方程，记录相关系数R值，应不低于0.99。[b]2.3.2 准确度[/b]将生理氯化钠溶液稀释至1 IU/ml的人凝血因子Ⅸ溶液放入STAGO全自动血凝仪中定标，另取用药典稀释液再稀释1.5倍，3倍，6倍，8倍的标准品溶液（标准曲线范围内高、中、低三个稀释度和定量下限）作为待测样品，按照操作规程进行测定，测定3次，并计算回收率，高、中、低浓度标准品回收率应在85%~115%范围内，定量下限标准品回收率应在80%~120%范围内。[b]2.3.3 精密度[/b]取2015ZK0901批人凝血酶原复合物质控品，用灭菌注射用水复溶后，用生理氯化钠溶液将其进行15倍稀释，再用药典稀释液稀释1倍，1.5倍，3倍，6倍，8倍，分别作为标准曲线范围内定量上限，高、中、低三个稀释度和定量下限。每一个稀释度重复测定5次。计算每一浓度测定结果的均值、SD和RSD值，高、中、低浓度标准品回收率应在85%~115%范围内，定量上、下限标准品回收率应在80%~120%范围内。[b]2.3.4 日间精密度[/b]在不同的三天分别按照2.3.3进行精密度的测定。[b]2.3.5 专属性[/b]为确保当制品中含有其它组分，如杂质、降解物、添加物（如缓冲液、赋形剂、稳定剂）等存在时，能够准确可靠测定供试品的能力而进行分析方法的专属性验证。取人凝血酶原复合物生产过程中的配制平衡液（含与人凝血酶原复合物中相同含量的氯化钠、枸橼酸钠、甘氨酸等），以此作为不含人凝血酶原复合物的基质溶液，进行人凝血因子Ⅸ效价的检测，其检测结果应低于方法定量下限，并对用基质溶液稀释的高浓度和低浓度的标准品进行检测，要求至少80%以上的标准品的准确度在±20%范围内。[b]2.4 人凝血因子缺乏血浆进行预稀释人凝血酶原复合物效价检测方法验证2.4.1 线性关系[/b]取复溶后的人凝血酶原复合物国家标准品，用人凝血因子Ⅸ缺乏血浆将其稀释成每1 ml含1.00 IU人凝血因子Ⅸ，按照Stago全自动血凝仪操作规程选择人凝血因子Ⅸ效价测定定标程序操作，仪器自动将装入的人凝血因子Ⅸ标准品溶液稀释至1.00 IU/ml、0.50 IU/ml、0.25 IU/ml、0.13 IU/ml，连续定标3次。定标完成后，仪器建立人凝血因子Ⅸ标准品溶液效价（IU/ml）的对数对其相应的凝固时间（秒）对数的直线回归方程，记录相关系数R值，应不低于0.99。[b]2.4.2 准确度[/b]将人凝血因子Ⅸ缺乏血浆稀释至1 IU/ml的人凝血因子Ⅸ溶液放入STAGO全自动血凝仪中定标，另取用Owren-Koller（稀释液）再稀释1.5倍，3倍，6倍，8倍的标准品溶液（标准曲线范围内高、中、低三个稀释度和定量下限）作为待测样品，按照操作规程进行测定，测定3次，并计算回收率，高、中、低浓度标准品回收率应在85%~115%范围内，定量下限标准品回收率应在80%~120%范围内。[b]2.4.3 精密度[/b]取2015ZK0901批人凝血酶原复合物质控品，用灭菌注射用水复溶后，用人凝血因子Ⅸ缺乏血浆将其进行15倍稀释，再用Owren-Koller（稀释液）稀释1倍，1.5倍，3倍，6倍，8倍，分别作为标准曲线范围内定量上限，高、中、低三个稀释度和定量下限。每一个稀释度重复测定5次。计算每一浓度测定结果的均值、SD和RSD值，高、中、低浓度标准品回收率应在85%~115%范围内，定量上、下限标准品回收率应在80%~120%范围内。2.4.4 日间精密度在不同的三天分别按照2.4.3进行精密度的测定。[b]2.4.5 专属性[/b]为确保当制品中含有其它组分，如杂质、降解物、添加物（如缓冲液、赋形剂、稳定剂）等存在时，能够准确可靠测定供试品的能力而进行分析方法的专属性验证。取人凝血酶原复合物生产过程中的配制平衡液（含与人凝血酶原复合物中相同含量的氯化钠、枸橼酸钠、甘氨酸等），以此作为不含人凝血酶原复合物的基质溶液，进行人凝血因子Ⅸ效价的检测，其检测结果应低于方法定量下限，并对用基质溶液稀释的高浓度和低浓度的标准品进行检测，要求至少80%以上的标准品的准确度在±20%范围内。[b]3 结果3.1 蛋白含量1%的药典稀释液稀释人凝血因子Ⅷ效价检测方法验证3.1.1 线性关系结果[/b]用生理氯化钠溶液稀释的每1 ml含1.00 IU人凝血因子Ⅷ标准品进行Ⅷ效价测定定标，三次直线回归方程相关系数R值结果见表1。[align=center]表1 生理氯化钠稀释FⅧ定标R值检测结果[/align][align=center][img=,573,138]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141653_01_1626619_3.png[/img][/align][align=left][b]3.1.2 准确度结果[/b][/align][align=left]用生理氯化钠溶液稀释的每1 ml含1.00 IU人凝血因子Ⅷ后再用药典稀释液再稀释1.5倍，3倍，6倍，8倍的标准品溶液的检测结果见表2。[/align][align=center]表2 准确度检测结果[/align][align=center][img=,570,335]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141654_01_1626619_3.png[/img][/align][b]3.1.3 精密度结果[/b]2015ZK0801批人凝血因子Ⅷ质控品用生理氯化钠溶液稀释27倍后再用药典稀释液再稀释1倍，1.5倍，3倍，6倍，8倍的检测结果见表3。[align=center]表3 精密度检测结果[/align][align=center][img=,571,422]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141656_01_1626619_3.png[/img][/align][align=center][img=,566,290]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141657_01_1626619_3.png[/img][/align][b]3.1.4 日间精密度结果[/b]在不同的三天2015ZK0801批人凝血因子Ⅷ质控品用生理氯化钠溶液稀释27倍后再用药典稀释液再稀释1倍，1.5倍，3倍，6倍，8倍的检测结果见表4。[align=center]表4 日间精密度检测结果[/align][align=center][img=,571,470]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141703_01_1626619_3.png[/img][/align][align=center][img=,589,1214]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141713_01_1626619_3.jpg[/img][/align][b]3.1.5 专属性结果[/b]将生理氯化钠溶液稀释至1 IU/ml的人凝血因子Ⅷ溶液定标后，取不含人凝血因子Ⅷ的基质溶液，进行人凝血因子Ⅷ效价的检测，并对用基质溶液稀释的高浓度和低浓度的标准品进行检测，检测结果见表5。[align=center]表5 专属性检测结果[/align][align=center][img=,565,239]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141714_01_1626619_3.png[/img][/align][b]3.2 人凝血因子缺乏血浆进行预稀释人凝血因子Ⅷ效价检测方法验证3.2.1 线性关系结果[/b]用人凝血因子Ⅷ缺乏血浆稀释的每1 ml含1.00 IU人凝血因子Ⅷ标准品进行Ⅷ效价测定定标，三次直线回归方程相关系数R值结果见表6。[align=center]表6 人凝血因子缺乏血浆稀释FⅧ定标R值检测结果[/align][align=center][img=,567,135]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141716_01_1626619_3.png[/img][/align][b]3.2.2 准确度结果[/b]用人凝血因子Ⅷ缺乏血浆稀释的每1 ml含1.00 IU人凝血因子Ⅷ后用Owren-Koller（稀释液）再稀释1.5倍，3倍，6倍，8倍的标准品溶液的检测结果见表7。[align=center]表7 准确度检测结果[/align][align=center][img=,569,300]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141717_01_1626619_3.png[/img][/align][b]3.2.3 精密度结果[/b]2015ZK0801批人凝血因子Ⅷ质控品用人凝血因子Ⅷ缺乏血浆稀释27倍后再用Owren-Koller（稀释液）再稀释1倍，1.5倍，3倍，6倍，8倍的检测结果见表4-8。[align=center]表8 精密度检测结果[/align][align=center][img=,566,570]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141720_01_1626619_3.png[/img][/align][b]3.2.4 日间精密度结果[/b]在不同的三天2015ZK0801批人凝血因子Ⅷ质控品用人凝血因子Ⅷ缺乏血浆稀释27倍后再用Owren-Koller（稀释液）再稀释1倍，1.5倍，3倍，6倍，8倍的检测结果见表9。[align=center]表9 日间精密度检测结果[/align][align=center][img=,588,1701]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141726_02_1626619_3.jpg[/img][/align][b]3.2.5 专属性结果[/b]将人凝血因子Ⅷ缺乏血浆稀释至1 IU/ml的人凝血因子Ⅷ溶液定标后，取不含人凝血因子Ⅷ的基质溶液，进行人凝血因子Ⅷ效价的检测，并对用基质溶液稀释的高浓度和低浓度的标准品进行检测，检测结果见表10。[align=center]表10 专属性检测结果[/align][align=center][img=,569,238]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141728_01_1626619_3.png[/img][/align][b]3.3 蛋白含量1%的药典稀释液稀释人凝血酶原复合物效价检测方法验证3.3.1 线性关系结果[/b]用生理氯化钠溶液稀释的每1 ml含1.00 IU人凝血因子Ⅸ标准品进行Ⅸ效价测定定标，三次直线回归方程相关系数R值结果见表11。[align=center]表11 生理氯化钠稀释FⅨ定标R值检测结果[/align][align=center][img=,571,139]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141729_01_1626619_3.png[/img][/align][b]3.3.2 准确度结果[/b]用生理氯化钠溶液稀释的每1 ml含1.00 IU人凝血因子Ⅸ后再用药典稀释液再稀释1.5倍，3倍，6倍，8倍的标准品溶液的检测结果见表12。[align=center]表12 准确度检测结果[/align][align=center][img=,571,274]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141730_01_1626619_3.png[/img][/align][b]3.3.3 精密度结果[/b]2015ZK0901批人凝血酶原复合物用生理氯化钠溶液稀释15倍后再用药典稀释液再稀释1倍，1.5倍，3倍，6倍，8倍的检测结果见表13。[align=center]表13 精密度检测结果[/align][align=center][img=,572,506]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141731_01_1626619_3.png[/img][/align][b]3.3.4 日间精密度结果[/b]在不同的三天2015ZK0901批人凝血酶原复合物质控品用生理氯化钠溶液稀释15倍后再用药典稀释液再稀释1倍，1.5倍，3倍，6倍，8倍的检测结果见表14。[align=center]表14 日间精密度检测结果[/align][align=center][img=,590,1702]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141737_01_1626619_3.jpg[/img][/align][align=left][b]3.3.5 专属性结果[/b][/align]将生理氯化钠溶液稀释至1 IU/ml的人凝血因子Ⅸ溶液定标后，取不含人凝血酶原复合物的基质溶液，进行人凝血因子Ⅸ效价的检测，并对用基质溶液稀释的高浓度和低浓度的标准品进行检测，检测结果见表15。[align=center]表15 专属性检测结果[/align][align=center][img=,566,236]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141739_01_1626619_3.png[/img][/align][b]3.4 人凝血因子缺乏血浆进行预稀释人凝血酶原复合物效价检测方法验证3.4.1 线性关系结果[/b]用人凝血因子Ⅸ缺乏血浆稀释的每1 ml含1.00 IU人凝血因子Ⅸ标准品进行Ⅸ效价测定定标，三次直线回归方程相关系数R值结果见表16。[align=center]表16 人凝血因子缺乏血浆稀释FⅨ定标R值检测结果[/align][align=center][img=,567,133]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141740_01_1626619_3.png[/img][/align][b]3.4.2 准确度结果[/b]用人凝血因子Ⅸ缺乏血浆稀释的每1 ml含1.00 IU人凝血因子Ⅸ后用Owren-Koller（稀释液）再稀释1.5倍，3倍，6倍，8倍的标准品溶液的检测结果见表17。[align=center]表17 准确度检测结果[/align][align=center][img=,568,274]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141741_01_1626619_3.png[/img][/align][b]3.4.3 精密度结果[/b]2015ZK0901批人凝血酶原复合物质控品用人凝血因子Ⅸ缺乏血浆稀释15倍后再用Owren-Koller（稀释液）再稀释1倍，1.5倍，3倍，6倍，8倍的检测结果见表18。[align=center]表18 精密度检测结果[/align][align=center][img=,571,576]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141742_01_1626619_3.png[/img][/align][b]3.4.4 日间精密度结果[/b]在不同的三天2015ZK0901批人凝血酶原复合物质控品用人凝血因子Ⅸ缺乏血浆稀释15倍后再用Owren-Koller（稀释液）再稀释1倍，1.5倍，3倍，6倍，8倍的检测结果见表19。[align=center]表19 日间精密度检测结果[/align][align=center][img=,588,1756]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141747_01_1626619_3.jpg[/img][/align][b]3.4.5 专属性结果[/b]将人凝血因子Ⅸ缺乏血浆稀释至1 IU/ml的人凝血因子Ⅸ溶液定标后，取不含人凝血酶原复合物的基质溶液，进行人凝血因子Ⅸ效价的检测，并对用基质溶液稀释的高浓度和低浓度的标准品进行检测，检测结果见表20。[align=center]表20 专属性检测结果[/align][align=center][img=,568,240]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141748_01_1626619_3.png[/img][/align][b]4讨论[/b]本章对人凝血因子Ⅷ、人凝血酶原复合物中的FⅨ效价测定方法进行了方法学验证，供试品因子效价的测定可采用两种不同的稀释方法进行，先用生理氯化钠溶液稀释至（约）1 IU/ml再用药典稀释液进行稀释或者先用凝血因子缺乏血浆稀释至（约）1 IU/ml再用Owren-Koller（稀释液）稀释。两种稀释方法的因子效价检测所进行的线性关系，准确度，精密度、日间精密度、专属性验证均符合方法学验证的标准，适用于因子效价的检测。其中先用生理氯化钠溶液稀释至（约）1 IU/ml再用药典稀释液进行稀释检测方法适用于开放型（可使用不同厂家试剂）的血凝仪，且所用稀释剂价格低廉，降低了检测成本；而先用凝血因子缺乏血浆稀释至（约）1 IU/ml再用Owren-Koller（稀释液）稀释适用于Stago全自动血凝仪这种封闭式（只能使用本厂配套试剂）的血凝仪，且由于使用凝血因子缺乏血浆这种价格昂贵的试剂提高了检测成本。[b]参考文献[/b] 王卓, 赵雄, 吕茂民, 等. 血液制品的现状与展望 . 生物工程学报, 2011, 27(5):730-746. Newman J, et al. Methods for the productionof clinically effective intermediate and high-factor-Ⅷconcentrates . Brit J Haemat, 1971, 21：1. 王箐舟, 赵卉, 王威, 等. 第四批人凝血因子Ⅷ国家标准品制备和标定 .中国药品标准, 2013,14(3):188-190. 刘大英, 沈琦, 云志宏. 血浆和中纯FⅧ国家标准品FⅧ: C检测结果及分析. 中国输血杂志, 1995,8(2):87-88.

[font=黑体][color=#fe2419]本文为[font=Arial]hchemh[/font][font=宋体]原创作品，本作者是该作品唯一合法使用者，该作品暂不对外授权转载。[/font][/color][font=Arial][/font][size=3][font=宋体]其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现的，均属侵权违法行为。[/font][b][font=Arial][/font][/b]摘 要：[/size][/font][size=3] [font=楷体_GB2312]本实验分别[/font][/size][size=3][font=楷体_GB2312]采用多种方法对人体血液的部分化学成分进行了分析测定。经实验分析鉴定，可知人体血液中凝血酶和血红素的含量。这为以后对于血液成分的进一步研究奠定基础。这个实验是我在学校的时候做的，说到为什么要做这个实验，纯属有现成的样品，却没有可做的实验，于是听毛主席的话：浪费可耻！于是就想着做了这个实验，现在拿出来现眼也是因为抵制不了原创大赛的层层诱惑，可以奖品许愿现在又开始了大乐透，让我就豁出去，分享下自己的实验过程和方法吧！大家板砖轻拍哈！！先说说这次提取的血液中有效成分是什么，由于实验条件的限制，这次我们主要提取两种有效成分，那就是[/font][/size][font=黑体][size=3]凝血酶和血红素！！[/size][/font][align=center][b]=================写在前面，背景知识介绍=======================[/b][/align][font=新宋体][b][size=4]凝血酶[/size][/b]是机体凝血系统的天然组分，是由[/font][font=新宋体]前体凝血酶原激活剂激活而转化成具有活性的凝血酶。[/font][color=black][font=宋体]正常血浆中存在无活性的凝血酶原，[/font][/color][color=black][font=宋体]通过对血液提取可以得到凝血酶原，经激活后上清液于沉淀分离即可得到凝血酶。[/font][/color][color=black][font=宋体]凝血酶[/font][/color][font=宋体]是一种糖蛋白，凝血酶[/font][font=宋体]（[/font][font=Times New Roman,serif]thrombi,E.C,3.4.21.5[/font][font=宋体]）[/font][font=宋体][/font][font=宋体]是由两条肽链之间以二硫键相连接，为蛋白水解酶。形状呈无定形粉末，易溶于水，难溶于乙醇、丙酮、乙醚等有机溶剂，但储存于[/font][font=Times New Roman,serif]2~8[/font][font=宋体]℃很稳定，水溶液室温[/font][font=Times New Roman,serif]8[/font][font=宋体]小时失活。遇热稀酸、碱、金属等活力降低。[/font][font=新宋体] 凝血酶可直接作用于血浆纤维蛋白，加速不溶性纤维蛋白凝块的生成，促进血液凝固。常以干粉或溶液局部应用于伤口或手术处，以控制毛细血管渗血。较多用于骨出血、扁桃体摘除和拔牙等。也可口服，用于胃和十二指肠出血。目前凝血酶的应用范围正日渐扩大，由单纯的局部外敷到外科手术、鼻、喉、口腔、妇产、泌尿急消化道等部位出血的止血，也可以作为多种外用止血药物的重要原料，其止血效果优于“对氨基苯甲酸”、“止血坏酸”、“止血敏”等通过注射后须经血管收缩而起止血作用的药物，故深受广大用户欢迎。据悉，国际新型高效局部止血药物—凝血酶将广泛应用于临床，是目前十分紧俏的凝血酶身价倍增,更趋紧缺。目前我国进口的凝血酶是从牛血中提取的。[/font][font=新宋体]凝血酶是机体凝血系统中的天然成分，国外主要在低温条件下从人或牛血液中提取凝血酶原，在经激活物激活而成凝血酶。其工艺流程为：[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/08/201008251635_238813_1947624_3.jpg[/img][/font][b][size=4][color=black][font=宋体]血红素[/font][/color][/size][/b][color=#333333][font=新宋体][/font][/color][color=black][font=宋体]是含铁卟啉衍生物，是由原卟啉和一个铁离子构成。如下图[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/08/201008251644_238816_1947624_3.jpg[/img][/font][/color][font=新宋体]在食品行业中，血红素可代替熟肉中得发色剂亚硝酸盐及人工合成色素。它可使肉制品产生一种诱人的鲜艳红色，增加其外观美感。更重要的是使用血红素可减少亚硝酸盐的致癌作用。在制药行业中，血红素可作为半合成胆红素原料，而且是制备抗癌的特效药。另外，血红素在临床上作为补铁剂，可治疗因缺铁引起的贫血症（在儿童、妇女中常见）。目前临床上用的非血红素补铁剂，主要从植物性食物中提取，以氢氧化铁络合物形式存在。这种铁络合物在人体中吸收率很低，并含有对人体有害的成分，而血红素补铁剂（即亚铁血红素）可直接被人体吸收，吸收率高达10%~20%。我国民间早有吃血治疗贫血的经验，但原血有异味，易腐败变质，难以作为补铁剂用于临床。从雪中提取血红素，可解决这一问题。血红素补铁剂将取代目前常用的补铁剂，成为深受欢迎的一代产品。[/font][color=black][font=宋体][/font][/color][font=新宋体]血液中的血红蛋白是由4分子亚铁血红素和分子珠蛋白结合而成的。再Ph3时，亚铁血红素与珠蛋白结合最疏松。更据此性质，提取实现从血液中分离出血球液，然后加水将血球液溶解（即溶血），调节Ph至3.0左右，加入适量丙酮，可是蛋白质凝固，亚铁血红素则溶于丙酮液中。此时若加入乙酸钠和鞣酸，即可使血红素沉淀析出。如加入羧甲纤维素（CM-C）阳离子交换剂，血红素可被CM-C吸附，然后过滤，就可以分离出血红素。[/font][b][color=black][font=新宋体][/font][/color][/b][img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/08/201008251646_238819_1947624_3.jpg[/img][color=#333333][font=新宋体]用碱处理氯高铁血红素，使之变成羟高铁血红素，将此化合物还原就可得到血红素。它的吸收光谱的主要吸收带在581（α带），545（β带），415（γ带）毫微米．中心的铁原子显有进一步和二个碱基形成配位键的八面体的强烈倾向[/font][/color][b][size=4][font=新宋体][/font][/size][/b][color=#333333][font=新宋体] [/font][/color][color=#333333][font=新宋体]特别是和吡啶、喹啉、烟碱、4-甲基咪唑等三级氨基的二个构成比较稳定的血色原（例如吡啶血色原）．这时基于铁原子的3d电子能级结构的永久磁性消失．它的主吸收带为尖峰，在557、525、430毫微米附近．如果把氰酸作为碱基，就生成一个氰酸和二个结合体．还常和蛋白质结合，吸收带多在560、530、430毫微米附近，一般说血红素和血色原自动氧化性强．能和氧发生反应，容易被氧化成三价铁的羟高铁血红素．但一如血红蛋白那样，可与蛋白质（珠蛋白）中的组氨酸结合，被包围在疏水环境里时是比较稳定的，很难发生自动氧化。[/font][/color][font=新宋体][/font][align=center][b]=====================华丽丽的分割，下面介绍我的试验方法=========================[/b][/align][font=楷体_GB2312]1.2[/font][font=楷体_GB2312]实验方法[/font][font=新宋体]1.2.1[/font][font=新宋体]凝血酶的制备 [/font][color=black][font=宋体]取血球研磨后称[/font][/color][color=black]10g[/color][color=black][font=宋体]，加入蒸馏水，搅拌[/font][/color][color=black]30min[/color][color=black][font=宋体]，使血球溶血，，再加入[/font][/color][color=black]5[/color][color=black][font=宋体]倍体积的氯仿，滤去纤维收集滤液。将上述除去纤维的血球一移入量筒加[/font][/color][color=black]4[/color][color=black][font=宋体]－[/font][/color][color=black]5[/color][color=black][font=宋体]倍体积的丙酮溶液。用[/font][/color][color=black]1mol/L[/color][color=black][font=宋体]盐酸校正[/font][/color][color=black]PH[/color][color=black][font=宋体]至[/font][/color][color=black]2[/color][color=black][font=宋体]－[/font][/color][color=black]3[/color][color=black][font=宋体]，搅拌抽提[/font][/color][color=black]10min[/color][color=black][font=宋体]，然后过滤收集沉淀。将上述溶液装入蒸馏瓶中，水溶蒸馏回收丙酮（[/font][/color][color=black]t [/color][color=black][font=宋体]控在[/font][/color][color=black]60[/color][color=black][font=宋体]℃左右）待滤液浓缩至干时，既有沉淀析出。收集沉淀并称重。此即为血红素粗品。将血红素[/font][/color][color=black]4[/color][color=black][font=宋体]倍量的吡啶、[/font][/color][color=black]7[/color][color=black][font=宋体]倍量的氯仿倒入瓶中，然后加入粗品血红素，充分振荡[/font][/color][color=black]30min[/color][color=black][font=宋体]，过滤后收集滤液。滤渣用氯仿洗涤，合并两次滤液。先把适量的冰醋酸加热至沸腾后，加入各占[/font][/color][color=black]1/7[/color][color=black][font=宋体]体积（相对于冰醋酸而言）的饱和氯化钠溶液和盐酸，随后加入滤液，搅匀后过滤，滤渣用氯仿洗涤，合并两次滤液，用旋转蒸馏器蒸馏。收集蒸馏剩物记得到产品。[/font][/color][color=black][font=新宋体][/font][/color][font=新宋体] [/font][font=新宋体]分离血浆、提取凝血酶原：取人血液，按1Kg人血液加3.8g柠檬酸三钠投料，脚板均匀，装入离心管中，以3000r/min的速度离心15min，分出血球（可供制备血红素），收集血浆。（已完成）吸取上清血浆40mL，加蒸馏水到400Ml（360mL），用2%的乙酸调Ph5.3，静置数分钟，出现絮状物后，在离心机上以3000r/min的速度离心15min，弃去上清液，取沉淀物沉重，此即为凝血酶原。[/font][font=新宋体] [/font][font=新宋体]凝血酶原的激活：在30℃条件下，将凝血酶原溶于1~2倍的0.9%氯化钠溶液中，脚板均匀，加入占凝血酶原质量1.5%的氯化钙，搅拌15min。在4℃下静置1.5小时，保证凝血酶原转化为凝血酶。[/font][font=新宋体] [/font][font=新宋体]沉淀分离凝血酶原：将激活的凝血酶溶液用离心机以3000r/min的速度离心15min，弃去沉淀。上清夜于量筒内，加入等量的预冷至4℃的丙酮，搅拌均匀,在冰箱中放置分层。然后用力离心机分离，收集沉淀，上清液可供回收丙酮。沉淀分别用95%乙醇和污水乙醇洗涤，放置在干燥器中干燥，即得凝血酶粗品。[/font][font=新宋体]计算：[/font][i][font=新宋体]凝血酶得率=凝血酶干重g/血清Ml * 100%[/font][/i][font=新宋体]1.2.2[/font][font=新宋体]血红素的制备[/font][font=新宋体]1.2.2.1[/font][font=新宋体]血红素的粗制[/font][font=新宋体] [/font][font=新宋体]分离后溶血：称取50g血球，边研磨边加蒸馏水至100Ml，搅拌30min，使血球溶血，在加入2倍体积的氯仿，滤去纤维，收集滤液。[/font][font=新宋体] [/font][font=新宋体]抽提：用离心机以3000r/min的速度离心10min，弃去沉淀，取上清液，即为红色溶血液，加5倍体积的丙酮溶液，（其中含丙酮体积3%的盐酸）。用1mol/L的演算校正Ph至2~3，搅拌均匀，然后过滤，收集滤液。[/font][font=新宋体] [/font][font=新宋体]蒸馏：将上述溶液于水浴上蒸馏回收丙酮（温度控制在60℃左右），待滤液浓缩至干时，既有沉淀析出。[/font][font=新宋体] [/font][font=新宋体]干燥：把产品干燥后，可得无定性黑绿色粉末状物，装入瓶中保存。 [/font][font=新宋体]1.2.2.2[/font][font=新宋体]血红素的精制[/font][font=新宋体] [/font][font=新宋体]提取：先将血红素4倍量的吡啶、7倍量的氯仿倒入瓶中，然后加入粗品血红素，充分振荡30min，过滤后收集滤液。滤渣用氯仿洗涤，合并两次滤液。[/font][font=新宋体] [/font][font=新宋体]沉淀、静置过夜、洗涤干燥：先把适量冰醋酸加热至沸腾后，加入各1/7体积（相对于冰醋酸来而言）的饱和氯化钠和盐酸，随后加入滤液，搅匀后过滤，滤渣用氯仿洗涤，合并两次滤液，静置过夜，过滤收集滤饼，干燥，即得产品。[/font][font=新宋体][/font][font=新宋体]计算：[/font][font=新宋体] [/font][i][font=新宋体]血红素得率=黑绿色血红素g/血球重g *100%[/font][/i][align=center][font=新宋体][b]=======================结果计算及分析====================[/b][/font][/align][i][font=新宋体]2.[/font][/i][font=新宋体]结果与分析[/font][font=新宋体]2.1[/font][font=新宋体]凝血酶制备：[/font][img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/08/201008251651_238820_1947624_3.jpg[/img][font=新宋体]凝血酶原(Ⅱ，prothrombin)是含582氨基酸残基的酶原，被因子Xa在Arg－Thr及Arg－Ile处切开，切除N