液相色谱黄曲霉毒素方法

高效液相色谱方法检测食品中黄曲霉毒素研究进展由于黄曲霉具有极强的毒性和致癌性，大多数国家和地区都规定了食品中的限量要求，这就要求对黄曲霉毒素进行有效的监督，一方面可以保护公众的食品安全和健康，另一方面可以减少食品对外贸易带来的经济损失。高效液相色谱法是一种检测痕量物质常用的方法，检测黄曲霉毒素的一般步骤是用适合的溶剂提取目标物，净化浓缩，C18柱分离后检测器检测，根据检测器的不同，可分为荧光检测法和质谱检测法两类。1提取和净化样品提取溶剂的选择取决于黄曲霉毒素自身的物化性质，一般用到的提取溶剂有甲醇、乙腈的水溶液，尽管早期的方法中经常用到氯仿，但考虑到氯仿对环境的影响，现已基本上被替代；一些新的提取技术，如超临界流体萃取、加压流体萃取（加速流体萃取）被用于黄曲霉毒素的提取，但是超临界流体的提取物常有大量的杂质，而加压流体萃取设备价格昂贵，限制了其广泛使用。样品的提取溶液中常含有共提取物，给黄曲霉毒素的检测带来干扰和基质效应。为了排除基质对分离和检测的干扰，常用的净化手段有液液萃取、固相萃取柱、免疫亲和柱和多功能净化柱。对于含油量大的样品，常需要在提取溶液中加入正己烷用液液萃取法去油；传统固相萃取柱在黄曲霉毒素净化方面的应用较早，填料主要有C18、硅胶、弗洛里硅土、氧化铝等，但由于选择性差，且往往既耗时又浪费溶剂，因此不及免疫亲和柱和多功能净化柱应用广，而微型固相萃取柱的应用便于建立简单快速、成本低廉的前处理方法。Mahoney等采用硅胶柱（30 mg/3 mL）建立了简单可靠的方法来分析检测来自不同植物源的油中黄曲霉毒素，结果表明硅胶柱可以选择性保留植物油中的黄曲霉毒素；Sobolev使用自制氧化铝柱（200 mg/1.5 mL）用于来净化检测主要农产品（玉米粉、棉籽、花生、杏仁、英国胡桃、巴西坚果、阿月浑果）中的黄曲霉毒素，该方法简单快速，成本低廉。由于弗罗里硅土对黄曲霉的吸附能力强，因此用弗罗里硅土柱净化洗脱需要用到大量的丙酮-水溶液；Sobolev对于弗罗里硅土柱（130 mg/1.5 mL）净化的的洗脱条件进行了研究，结果显示丙酮/水/甲酸(96:3.7:0.3, v/v)为洗脱溶剂时的洗脱能力最强，2 mL的洗脱体积即可得到大于98%的回收率；该净化方法用于花生、巴西坚果、玉米、棉籽等样品基质，其中花生基质中B1定量限达到0.05 μg/kg；使用商品化的弗罗里硅土柱可以保证样品检测的重复性，同时可进行实验室间结果比对。免疫亲和柱具有高效和特异性吸附的优点，可同时实现样品的净化和富集，达到比普通固相萃取柱更好的净化效果和更高的信燥比，而且有机试剂使用量少，因此免疫亲和柱越来越多用于黄曲霉毒素等真菌毒素的样品净化。AOAC对免疫亲和柱净化的黄曲霉毒素检测方法进行了协同研究；我国将免疫亲和柱用于黄曲霉毒素检测的国标方法（GB/T 18979-2003）。多种真菌毒素免疫亲和柱的商品化使同时净化分析多种真菌毒素成为可能，如人参和姜中黄曲霉毒素和赭曲霉毒素A的同时净化，谷物中黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮三种真菌毒素的同时净化富集；最新推出的商品化免疫亲和柱可实现黄曲霉毒素、赭曲霉毒素[font=T

针对近期奶中出现的黄曲霉毒素M1超标问题提出以下液相色谱法精准检测方案。1. 仪器1.1 高效液相色谱仪配荧光检测器1.2震荡器（或高速搅拌器）1.3 高速离心机1.4 泵流操作架（带气泵）2. 试剂与试液2.1 色谱甲醇2.2 蒸馏水2.3 乙腈+水（25+75）2.4 石油醚2.5 10%乙腈2.6 氢氧化钠溶液（0.5mol/L）玻璃纤维滤纸（PriboFast免疫亲和柱免费赠送）3. 测定法本法系用高效液相色谱法（GB/T 18980-2003）测定牛奶，奶粉等产品中的黄曲霉毒素M1，除另有规定外，按下列方法测定。3.1 色谱条件色谱柱：C18柱，150×4.6mm，5um检测器：荧光检测器；激发波长365nm，发射波长435nm；流动相：乙腈-水（25：75）流速：1.0ml/min进样量：20ul柱温：室温3.2 标准品溶液的配制取黄曲霉毒素M1标准品，用乙腈稀释成0.5ug/ml的标准储备液。根据使用需要，准确吸取10μl、20μl、50μl、1

高效液相色谱方法检测食品中黄曲霉毒素研究进展由于黄曲霉具有极强的毒性和致癌性，大多数国家和地区都规定了食品中的限量要求，这就要求对黄曲霉毒素进行有效的监督，一方面可以保护公众的食品安全和健康，另一方面可以减少食品对外贸易带来的经济损失。高效液相色谱法是一种检测痕量物质常用的方法，检测黄曲霉毒素的一般步骤是用适合的溶剂提取目标物，净化浓缩，C18柱分离后检测器检测，根据检测器的不同，可分为荧光检测法和质谱检测法两类。1提取和净化样品提取溶剂的选择取决于黄曲霉毒素自身的物化性质，一般用到的提取溶剂有甲醇、乙腈的水溶液，尽管早期的方法中经常用到氯仿，但考虑到氯仿对环境的影响，现已基本上被替代；一些新的提取技术，如超临界流体萃取、加压流体萃取（加速流体萃取）被用于黄曲霉毒素的提取，但是超临界流体的提取物常有大量的杂质，而加压流体萃取设备价格昂贵，限制了其广泛使用。样品的提取溶液中常含有共提取物，给黄曲霉毒素的检测带来干扰和基质效应。为了排除基质对分离和检测的干扰，常用的净化手段有液液萃取、固相萃取柱、免疫亲和柱和多功能净化柱。对于含油量大的样品，常需要在提取溶液中加入正己烷用液液萃取法去油；传统固相萃取柱在黄曲霉毒素净化方面的应用较早，填料主要有C18、硅胶、弗洛里硅土、氧化铝等，但由于选择性差，且往往既耗时又浪费溶剂，因此不及免疫亲和柱和多功能净化柱应用广，而微型固相萃取柱的应用便于建立简单快速、成本低廉的前处理方法。Mahoney等采用硅胶柱（30 mg/3 mL）建立了简单可靠的方法来分析检测来自不同植物源的油中黄曲霉毒素，结果表明硅胶柱可以选择性保留植物油中的黄曲霉毒素；Sobolev使用自制氧化铝柱（200 mg/1.5 mL）用于来净化检测主要农产品（玉米粉、棉籽、花生、杏仁、英国胡桃、巴西坚果、阿月浑果）中的黄曲霉毒素，该方法简单快速，成本低廉。由于弗罗里硅土对黄曲霉的吸附能力强，因此用弗罗里硅土柱净化洗脱需要用到大量的丙酮-水溶液；Sobolev对于弗罗里硅土柱（130 mg/1.5 mL）净化的的洗脱条件进行了研究，结果显示丙酮/水/甲酸(96:3.7:0.3, v/v)为洗脱溶剂时的洗脱能力最强，2 mL的洗脱体积即可得到大于98%的回收率；该净化方法用于花生、巴西坚果、玉米、棉籽等样品基质，其中花生基质中B1定量限达到0.05 µg/kg；使用商品化的弗罗里硅土柱可以保证样品检测的重复性，同时可进行实验室间结果比对。免疫亲和柱具有高效和特异性吸附的优点，可同时实现样品的净化和富集，达到比普通固相萃取柱更好的净化效果和更高的信燥比，而且有机试剂使用量少，因此免疫亲和柱越来越多用于黄曲霉毒素等真菌毒素的样品净化。AOAC对免疫亲和柱净化的黄曲霉毒素检测方法进行了协同研究；我国将免疫亲和柱用于黄曲霉毒素检测的国标方法（GB/T 18979-2003）。多种真菌毒素免疫亲和柱的商品化使同时净化分析多种真菌毒素成为可能，如人参和姜中黄曲霉毒素和赭曲霉毒素A的同时净化，谷物中黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮三种真菌毒素的同时净化富集；最新推出的商品化免疫亲和柱可实现黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、伏

95液相色谱法测定玉米中的黄曲霉毒素.pdf

[align=center][b]高效液相色谱法检测花生中的黄曲霉毒素[/b][/align][align=center][b] [/b][/align]一、[b]黄曲霉毒素[/b]1、[b]黄曲霉毒素及来源[/b]黄曲霉毒素:是一组真菌(霉菌)毒素。黄曲霉毒素是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。主要有黄曲霉寄生曲霉产生的次生代谢物。来源：存在于土壤、动物、植物、各种坚果里。特别是花生、大豆、荞麦、酱豆很容易被污染。2、[b]理化性质及毒性 [/b]它是目前自然界中已经发现的理化性质最稳定的一类真菌毒素,具有很强的毒性、致癌性、致突变性和致畸毒性。其中以黄曲霉毒素B1的毒性最大，相当氰化钾的10倍, 砒霜的68倍，且其致癌性是二甲基亚硝胺的70倍。在水中很难溶解，可以溶解在油、甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，但不溶于石油醚、己烷和乙醚中。一般在中性溶液中比较稳定，在强酸性溶液中稍有分解，可以在PH9-10的强碱溶液中分解迅速，其纯品为无色结晶，耐高温。二、[b]检测方法选择 [/b]我国很早之前就已经对黄曲霉毒素展开研究，制定了一系列相应检测标准。目前国标方法已有12种之多，其中包括薄层分析法，液相色谱法，酶联免疫法，毛细管电泳法，荧光光度法，金标试纸法和生物传感器法。液相色谱法中高效液相色谱法是目前国内外比较权威的定量检测黄曲霉的分析方法，也是我国黄曲霉毒素检测的国家标准方法。所以在检测时选用了高效液相色谱-柱后光化学衍生法。三、[b]高效液相色谱仪[/b]1、[b]原理 [/b][color=#333333]样品溶液经进样器进入流动相，[/color][color=#333333]随着流动相进入色谱柱[/color][color=#333333]，由于样本溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的“吸附-解吸”的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样本浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式输出检测结果。[/color]2、[b]组成[/b][color=#333333]高压输液系统、[/color][color=#333333]进样系统[/color][color=#333333]、[/color][color=#333333]分离[/color][color=#333333]系统（色谱柱）[/color][color=#333333]、[/color][color=#333333]检测系统[/color][color=#333333]、[/color][color=#333333]数据处理和记录系统[/color][color=#333333]。[/color]3、[b]特点[/b][color=#333333]高效液相色谱[/color][color=#333333]与经典液相色谱相比有以下优点：[/color][color=#333333]分析[/color][color=#333333]速度快[/color][color=#333333]、[/color][color=#333333]分辨率高[/color][color=#333333]、[/color][color=#333333]检测[/color][color=#333333]灵敏度高[/color][color=#333333]、[/color][color=#333333]色谱柱可反复使用[/color][color=#333333]、[/color][color=#333333]样品量少，容易回收[/color][color=#333333]。[/color]四、[b]实验过程[/b]1、[b]样品前处理 [/b]样液准备：将均质杯放在天平上，在其内分别称取25g花生四份。再称取5gNaCl加入均质杯中。最后用200mL量筒量取125mL甲醇-水溶液（700+300）加入均质杯内。在其中两份两份花生中分别加入50μL（1μg/mL）标准品溶液作为回收。将盛有样品的均质杯依次放在均质器上进行打磨混匀。将定性滤纸两张叠放在玻璃漏斗上，下端接入锥形瓶内，先在滤纸上倒入少量样品过滤润洗锥形瓶，润洗后正式开始过滤。过滤完成后取滤液15mL分别倒入100mL量筒中再加入30mL超纯水震荡混匀。 样液的净化：在过滤的同时激活免疫亲和柱，将免疫亲和柱安装好加入10mL超纯水进行激活，速度控制在大约1s滴1滴。激活完成后将混合好的样液经过两张玻璃滤纸过滤15mL到已经激活的免疫亲和柱中，混合样液完全从亲和柱中过滤后，再在免疫亲和柱中加入10mL超纯水。 样液洗脱：在亲和柱中加入1mL甲醇，用洗耳球吹洗，速度控制在1滴/秒，甲醇全部通过亲和柱后再加入1mL超纯水，吹洗速度与甲醇的保持一致。 样液装瓶：把洗脱下来的液体放在涡旋混合器上，震荡混匀后取1000μL装入进样瓶，在进样瓶上注明名称以及日期。配制1ng/mL的标准品1000μL放入进样瓶混匀，再配制一个空白（1000μL甲醇-水溶液）。 备注：实验所用药品氯化钠([u]NaCl[/u]）为优级纯、甲醇（CH[sub]3[/sub]OH）为色谱纯，水为超纯水。混合标准品为国标GB5009. 22 — 2016中规定标样。2、[b]实验参数[/b] 以C18柱为分离色谱柱，甲醇-水（45：55，体积：体积）溶液为流动相梯度洗脱，流速1mL／min，在室温下，激发波长360nm，发射波长435nm条件下，进样量20μL，经过光化学衍生后用荧光检测器检测。3、[b]进样检测[/b]①先换流动相（A：甲醇-45% B：水-55%）②再打开电脑和仪器③打开联机软件④进样针变绿后再打开泵和温控箱，将流动相容量修改为相应的体积，再将流速改为3mL/min，打开空气阀排净气泡，再把空气阀关闭流速改为1mL/min，冲柱一段时间。⑤将进样瓶放入指定位置（依次为空白、标准品、样品、回收）⑥建立序列，修改子目录（将日期设为子目录），修改完毕点击样品位置修改名称、坐标，查看进样次数，确定进样量（20μL）。⑦打开FLD，同时打开荧光检测器，和光化学衍生器，待准备就绪后点击开始。⑧检测完毕后，打开结果查看峰，有杂峰影响时点击删除杂峰，然后点击校正，删除校正。4、[b]实验数据 [/b]黄曲霉毒素G[sub]2[/sub]在8.1分钟左右出现峰，黄曲霉毒素G[sub]1[/sub]在9.6分钟左右出现峰，黄曲霉毒素B[sub]2[/sub]在11.7分钟左右出现峰，黄曲霉毒素B[sub]1[/sub]在14.3分钟左右出现峰,若在其他时间段出现峰则不属于黄曲霉毒素的峰。四种黄曲霉毒素峰宽在0.3～0.4min，而峰高和峰面积中则是B[sub]2[/sub]较大，G[sub]1[/sub]较小，B[sub]1[/sub]和G[sub]2[/sub]属于居中。回收率=样品峰高/标准品的峰高70％≤回收率≤120％视为未检出黄曲霉毒素。①标准品[table][tr][td][align=center]峰[/align][/td][td][align=center]保留时间/min[/align][/td][td][align=center]峰宽/min[/align][/td][td][align=center]峰面积/LU[/align][/td][td][align=center]峰高/LU[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]1[/align][/td][td][align=center]8.142[/align][/td][td][align=center]0.3682[/align][/td][td][align=center]2.20190[/align][/td][td][align=center]9.18729e[sup]-2[/sup][/align][/td][/tr][tr][td][align=center]2[/align][/td][td][align=center]9.686[/align][/td][td][align=center]0.3735[/align][/td][td][align=center]1.18640[/align][/td][td][align=center]4.57970e[sup]-2[/sup][/align][/td][/tr][tr][td][align=center]3[/align][/td][td][align=center]11.710[/align][/td][td][align=center]0.4021[/align][/td][td][align=center]5.54293[/align][/td][td][align=center]2.15125e[sup]-1[/sup][/align][/td][/tr][tr][td][align=center]4[/align][/td][td][align=center]14.376[/align][/td][td][align=center]0.4373[/align][/td][td][align=center]2.67834[/align][/td][td][align=center]9.30720e[sup]-2[/sup][/align][/td][/tr][/table]②花生回收1[table][tr][td][align=center]峰[/align][/td][td][align=center]保留时间/min[/align][/td][td][align=center]峰宽/min[/align][/td][td][align=center]峰面积/LU[/align][/td][td][align=center]峰高/LU[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]1[/align][/td][td][align=center]8.169[/align][/td][td][align=center]0.3323[/align][/td][td][align=center]2.01464[/align][/td][td][align=center]9.31226e[sup]-2[/sup][/align][/td][/tr][tr][td][align=center]2[/align][/td][td][align=center]9.720[/align][/td][td][align=center]0.3330[/align][/td][td][align=center]1.02491[/align][/td][td][align=center]4.53172e[sup]-2[/sup][/align][/td][/tr][tr][td][align=center]3[/align][/td][td][align=center]11.756[/align][/td][td][align=center]0.3750[/align][/td][td][align=center]4.88574[/align][/td][td][align=center]2.03627e[sup]-1[/sup][/align][/td][/tr][tr][td][align=center]4[/align][/td][td][align=center]14.442[/align][/td][td][align=center]0.4124[/align][/td][td][align=center]2.18995[/align][/td][td][align=center]7.94352e[sup]-2[/sup][/align][/td][/tr][/table]③花生回收2[table][tr][td][align=center]峰[/align][/td][td][align=center]保留时间/min[/align][/td][td][align=center]峰宽/min[/align][/td][td][align=center]峰面积/LU[/align][/td][td][align=center]峰高/LU[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]1[/align][/td][td][align=center]8.178[/align][/td][td][align=center]0.3238[/align][/td][td][align=center]1.76791[/align][/td][td][align=center]8.68845e[sup]-2[/sup][/align][/td][/tr][tr][td][align=center]2[/align][/td][td][align=center]9.727[/align][/td][td][align=center]0.3353[/align][/td][td][align=center]1.05383[/align][/td][td][align=center]4.89711e[sup]-2[/sup][/align][/td][/tr][tr][td][align=center]3[/align][/td][td][align=center]11.764[/align][/td][td][align=center]0.3602[/align][/td][td][align=center]5.12116[/align][/td][td][align=center]2.18196e[sup]-1[/sup][/align][/td][/tr][tr][td][align=center]4[/align][/td][td][align=center]14.452[/align][/td][td][align=center]0.4125[/align][/td][td][align=center]2.44144[/align][/td][td][align=center]8.91182e[sup]-2[/sup][/align][/td][/tr][/table]④结果计算[table][tr][td]样品 [sub] [/sub][sub] [/sub] 峰名称[/td][td][align=center]B1[/align][/td][td][align=center]B2[/align][/td][td][align=center]G1[/align][/td][td][align=center]G2[/align][/td][td][align=center]是否检出[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]花生回收1[/align][/td][td][align=center]85.34%[/align][/td][td][align=center]94.65%[/align][/td][td][align=center]98.95%[/align][/td][td][align=center]101.3%[/align][/td][td][align=center]否[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]花生回收2[/align][/td][td][align=center]95.75%[/align][/td][td][align=center]101.43%[/align][/td][td][align=center]106.93%[/align][/td][td][align=center]94.57%[/align][/td][td][align=center]否[/align][/td][/tr][/table][b]5、结果与讨论[/b] 在此实验中使用高效液相色谱检测黄曲霉毒素一般分为：提取、净化、衍生和测定，但因文中采用了无衍生器法，所以此实验无衍生那一步骤。提取采用了甲醇水溶液和氯化钠固体，净化采用了免疫亲和柱（IAC），测定时流动相为甲醇水45:55，用荧光检测器检测在激发波长为365nm，发射波长为450nm下检测20μL样品。结果表明：在此方法中黄曲霉毒素回收率在70％～120％之间，选用样品中均无黄曲霉毒素。 黄曲霉毒素存在范围极广难以防范，国家对黄曲霉检测制定了相应的标准。但我们在日常生活中不可能将所有所需所用都进行检测，但我们可以通过一些方法在日常生活中进行辨别：如不建议摄入发霉食物，也可以通过在低温、干燥、避免阳光直射的地方存放食物；关注食品的保质期等方式减少食物被黄曲霉毒素污染的风险。

针对近期奶中出现的黄曲霉毒素M1超标问题快速解决方案。1. 仪器1.1 高效液相色谱仪配荧光检测器1.2 震荡器（或高速搅拌器）1.3 高速离心机2. 试剂与试液2.1 色谱甲醇2.2 蒸馏水2.3 乙腈+水（25+75）2.4 石油醚2.5 10%乙腈2.6 氢氧化钠溶液（0.5mol/L）玻璃纤维滤纸（PriboFast免疫亲和柱免费赠送）3. 测定法本法系用高效液相色谱法（GB/T18980-2003）测定牛奶，奶粉等产品中的黄曲霉毒素M1，除另有规定外，按下列方法测定。3.1色谱条件色谱柱：C18柱，150×4.6mm，5um检测器：荧光检测器；激发波长365nm，发射波长435nm；流动相：乙腈-水（25：75）流 速：1.0ml/min 进样量：20ul柱 温：室温3.2 标准品溶液的配制取黄曲霉毒素M1标准品，用乙腈稀释成0.5ug/ml的标准储备液。根据使用需要，准确吸取10μl、20μl、50μl、100μl、200μl的黄曲霉毒素标准储备液，置5ml的容量瓶中，用流动相稀释至刻度，配成相当于1ng/ml、2g/ml、5ng/ml、10g/ml、20ng/ml的标准工作液，即得。3.3 样品前处理3.3.1牛奶将100mL牛奶水浴加热至40℃；4000r/min离心15min，收集50mL清澈液待用；3.3.2乳粉和粉状婴幼儿配方食品称取10g奶粉样品，将100mL50℃水多次少量加入，搅拌，使奶粉充分溶解；6000r/min离心15min，收集50mL清澈液待用；3.3.3发酵乳(包括固体状、半固体状和带果肉型)称取60 g混匀的试样，用0.5mol/L 的氢氧化钠溶液在酸度计指示下调pH至7.4；用高速均质器在 9500 转/分钟，高速匀浆5 min水浴加热至40℃；4000r/min离心15min，收集50mL清澈液待用3.3.4干酪称取经切细、过10目圆孔筛混匀的试样5g置于50 mL离心管中，加2 mL水和30mL甲醇；用高速均质器在 9500r/分钟，高速匀浆5 min；超声提取30 min；在6000r/分钟下离心15 min，收集上清液并移入250 mL分液漏斗中。在分液漏斗中加入30 mL石油醚，振摇2 min；待分层后，将下层移于50 mL烧杯中，弃去石油醚层。重复用石油醚提取2次；。将下层溶液移到100 mL圆底烧瓶中，减压浓缩至约2 mL；浓缩液倒入离心管中，烧瓶用乙腈-水溶液(1+4) 5 mL分2次洗涤，洗涤液一并倒入50 mL离心管中；加水稀释至约50 mL，在6000 转/分钟下离心 5 min，上清液供净化处理。3.3.5奶油称取5g试样，置于50 mL烧杯中；用20 mL石油醚将其溶解并移于250mL具塞锥形瓶中。加20 mL水和30 mL甲醇，振荡30 min后，将全部液体移于分液漏斗中；待分层后，将下层溶液全部移到100 mL圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪中减压浓缩至约5 mL，加水稀释至约50mL，供净化处理。3.4 供试品溶液的制备3.4.1 PriboFast® 黄曲霉毒素M1免疫亲和柱的操作将免疫亲和柱连接于50.0mL玻璃注射器下。准确移取50.0mL净化溶液注入玻璃注射器；将空气压力泵与注射器连接，调节压力使溶液以约2-3mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2～3mL空气通过柱体；更换10ml注射器与亲和柱连接，在注射器中加入10ml水，调节压力使水以约6mL/min流速清洗亲和柱。准确加入4mL色谱级乙腈洗脱，流速为1 mL/min～2mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。（建议将乙腈的量分2-4次加入。每次加入后，要让甲醇充分浸泡柱子里的凝胶2分钟。洗脱后的乙腈溶液，最好是水浴30℃加热吹近干。用10%乙腈定容后上液相）3.5 测定精密量取1ng/ml、2g/ml、5ng/ml、10g/ml、20ng/ml的标准工作液各20ul，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。另精密量取供试品溶液20ul，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素M1的量，计算，即得。1.本实验应有相应的安全、防护措施，并不得污染环境。2.残留有黄曲霉毒素M1的废液或废渣的玻璃器皿，应置于专用贮存容器（装有10%氯酸钠溶液）内，浸泡24小时以上，再用清水将玻璃器皿冲洗干净。

作为国内专业从事霉菌毒素检测技术与产品服务的主要供应商之一， 近年来泰乐祺检测应用实验室重点关注食品安全事件尤其是涉及霉菌毒素安全等检测技术问题，以期望快速提出解决方案。针对近期奶中出现的黄曲霉毒素M1超标问题，泰乐祺科技提出以下快速解决方案。1. 仪器1.1 高效液相色谱仪配荧光检测器1.2 震荡器（或高速搅拌器）1.3 高速离心机2. 试剂与试液2.1 色谱甲醇2.2 蒸馏水2.3 乙腈+水（25+75）2.4 石油醚2.5 10%乙腈2.6 氢氧化钠溶液（0.5mol/L）玻璃纤维滤纸（PriboFast免疫亲和柱免费赠送）3. 测定法本法系用高效液相色谱法（GB/T 18980-2003）测定牛奶，奶粉等产品中的黄曲霉毒素M1，除另有规定外，按下列方法测定。3.1色谱条件色谱柱：C18柱，150×4.6mm，5um检测器：荧光检测器；激发波长365nm，发射波长435nm；流动相：乙腈-水（25：75）流 速：1.0ml/min 进样量：20ul柱 温：室温3.2 标准品溶液的配制取黄曲霉毒素M1标准品，用乙腈稀释成0.5ug/ml的标准储备液。根据使用需要，准确吸取10μl、20μl、50μl、100μl、200μl的黄曲霉毒素标准储备液，置5ml的容量瓶中，用流动相稀释至刻度，配成相当于1ng/ml、2g/ml、5ng/ml、10g/ml、20ng/ml的标准工作液，即得。3.3 样品前处理3.3.1牛奶将100mL牛奶水浴加热至40℃；4000r/min离心15min，收集50mL清澈液待用；3.3.2乳粉和粉状婴幼儿配方食品称取10g奶粉样品，将100mL50℃水多次少量加入，搅拌，使奶粉充分溶解；6000r/min离心15min，收集50mL清澈液待用；3.3.3发酵乳(包括固体状、半固体状和带果肉型)称取60 g混匀的试样，用0.5 mol/L 的氢氧化钠溶液在酸度计指示下调pH至7.4；用高速均质器在 9500 转/分钟，高速匀浆5 min水浴加热至40℃；4000r/min离心15min，收集50mL清澈液待用3.3.4干酪称取经切细、过10目圆孔筛混匀的试样5g置于50 mL离心管中，加2 mL水和30 mL甲醇；用高速均质器在 9500r/分钟，高速匀浆5 min；超声提取30 min；在6000r/分钟下离心15 min，收集上清液并移入250 mL分液漏斗中。在分液漏斗中加入30 mL石油醚，振摇2 min；待分层后，将下层移于50 mL烧杯中，弃去石油醚层。重复用石油醚提取2次；。将下层溶液移到100 mL圆底烧瓶中，减压浓缩至约2 mL；浓缩液倒入离心管中，烧瓶用乙腈-水溶液(1+4) 5 mL分2次洗涤，洗涤液一并倒入50 mL离心管中；加水稀释至约50 mL，在6000 转/分钟下离心 5 min，上清液供净化处理。3.3.5奶油称取5g试样，置于50 mL烧杯中；用20 mL石油醚将其溶解并移于250mL具塞锥形瓶中。加20 mL水和30 mL甲醇，振荡30 min后，将全部液体移于分液漏斗中；待分层后，将下层溶液全部移到100 mL圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪中减压浓缩至约5 mL，加水稀释至约50mL，供净化处理。3.4 供试品溶液的制备3.4.1 PriboFast® 黄曲霉毒素M1免疫亲和柱的操作将免疫亲和柱连接于50.0mL玻璃注射器下。准确移取50.0mL净化溶液注入玻璃注射器；将空气压力泵与注射器连接，调节压力使溶液以约2-3mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2～3mL空气通过柱体；更换10ml注射器与亲和柱连接，在注射器中加入10ml水，调节压力使水以约6mL/min流速清洗亲和柱。准确加入4mL色谱级乙腈洗脱，流速为1 mL/min～2mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。（建议将乙腈的量分2-4次加入。每次加入后，要让甲醇充分浸泡柱子里的凝胶2分钟。洗脱后的乙腈溶液，最好是水浴30℃加热吹近干。用10%乙腈定容后上液相）3.5 测定精密量取1ng/ml、2g/ml、5ng/ml、10g/ml、20ng/ml的标准工作液各20ul，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。另精密量取供试品溶液20ul，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素M1的量，计算，即得。1.本实验应有相应的安全、防护措施，并不得污染环境。2.残留有黄曲霉毒素M1的废液或废渣的玻璃器皿，应置于专用贮存容器（装有10%氯酸钠溶液）内，浸泡24小时以上，再用清水将玻璃器皿冲洗干净。

大家在用免疫亲和柱-高效液相色谱法测定黄曲霉毒素和呕吐毒素等真菌毒素时，有没有一些技术要点可以一起分析下，比如前处理过程、净化过程等。新人刚接触这块，希望大家能多指导，十分感谢！

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关于黄曲霉毒素的检测，迪马科技应用实验室做了一系列的应用，分享给大家～方法优势：目前检测黄曲霉毒素主要主要是免疫亲和柱-高效液相色谱法串联质谱法等，免疫亲和柱-液相色谱法和液相色谱法-串联质谱能够准确定量，但是由于免疫亲和柱与质谱检测成本高，应用范围受到限制。而迪马科技使用SPE的前处理净化方法，不但能保持与免疫亲和小柱差不多的回收率和重现性，而且过柱方法简单易操作，对操作人员要求不高，检测成本相对较低，这对于企业来说还是非常经济实惠的～实验应用 《黄曲霉毒素M1、B1、B2、G1、G2 》 - 方法：HPLC - 应用编号：103148 2014-05-05 《DHA冬化油和植物油中黄曲霉毒素B1的测定》 - 方法：HPLC - 应用编号：103121 2014-01-15 《DHA冬化油和植物油中黄曲霉毒素B1的测定》 - 方法：SPE - 应用编号：103120 2014-01-15 《乳制品中黄曲霉毒素M1检测》 - 方法：SPE - 应用编号：103002 2013-01-31 《粮谷中黄曲霉毒素检测》 - 方法：SPE - 应用编号：102977 2013-01-30 《粮谷中黄曲霉毒素检测》 - 方法：HPLC - 应用编号：102976 2013-01-30 《新型、快速、低成本SPE法检测黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2、M1》 - 方法：SPE - 应用编号：101897 2012-07-03 《新型、快速、低成本SPE法检测黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2、M1》 - 方法：HPLC - 应用编号：101895 2012-07-02 《乳制品中黄曲霉毒素M1检测》 - 方法：HPLC - 应用编号：101713 2012-01-12 《谷物、坚果及其制品中黄曲霉毒素的测定》 - 方法：HPLC - 应用编号：101314 2010-07-02 《谷物、坚果及其制品中黄曲霉毒素的测定》 - 方法：SPE - 应用编号：101200 2010-07-01

在当今社会，食品安全越来越受到人们的关注和重视，尤其是在发生三聚氰胺和地沟油等一系列事件之后，人们更加重视食品安全问题。黄曲霉毒素这类真菌在世界不同地区都发现大量存在于食品中，它主要是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的一类有毒次生代谢物。目前，已知的黄曲霉毒素及其衍生物有20余种 , 即B1，B2，B2a，G1，G2，G2a，M1，M2等，黄曲霉毒素B1是其中毒性最大的一种，实验结果显示，其毒性是人们熟知的剧毒药氰化钾的10倍，是砒霜的68倍。黄曲霉毒素B1可诱发癌症和皮下肉瘤，并且可使动物的肝、肾、大脑和神经系统等产生病变。自20世纪60年代以来，有关黄曲霉毒素的危害被大量报道，以致黄曲霉毒素已成为最受人们关注的一种真菌毒素。因此，寻求准确、快速、简便、价廉的检测方法，对黄曲霉毒素进行高效的定性定量分析，是黄曲霉毒素研究的一个重要方面。以下对黄曲霉毒素的检测方法研究进展进行评述。【薄层色谱法】1.薄层层析（TLC）法TLC 法是测定黄曲霉毒素的经典方法，在薄层板展开后，在365 nm紫外灯下，黄曲霉毒素B1，B2，G1和G2分别显示紫色、蓝紫色、绿色和绿色荧光。TLC 法的特异性较差，灵敏度相对较差，且测定黄曲霉毒素专一性不够，经常引起测量误差。但由于此法设备简单，易于普及，所以国内外仍在使用。2.高效薄层（HPTLC）法HPTLC 法测定黄曲霉毒素采用目前国际上流行的样品处理方法——固相萃取法（SPE）中针对真菌和病毒的多功能净化（MFC）柱。采用MFC柱净化后，仅用单相展开即可达到分离测定的目的，不仅节省了工作时间，提高了工作效率，而且进一步减少了有毒有害溶剂的用量。Stroka等将免疫亲合柱净化应用于 TLC法测定，进行单相展开并用荧光密度计定量，此方法能检测含量明显低于当前欧盟标准的黄曲霉毒素。Kamimura 等用HPTLC方法测定玉米、花生、荞麦等样品，并与通过公职分析化学家协会（AOAC）认证的分析花生及花生制品中黄曲霉素的官方方法CB（Contamination Branch）法和 BF（Best Foods）法进行比较，4种主要黄曲霉毒素的检测限均不高于0.2μg／kg，回收率与CB法一样均高于BF法。3.高压薄层色谱（OPTLC）法高压薄层色谱于1979年由Tyihak提出，它结合了经典薄层色谱法、高效薄层色谱法与高效液相色谱法的优点，是一种能够提高薄层分离效率的平面液相色谱技术。随着实验技术的不断成熟，OPTLC 法在饲料和食物中黄曲霉毒素的检测方面的应用越来越多。Eszter Papp等发展了一系列适合检测玉米和小麦中黄曲霉毒素的OPTLC方法。【高效液相色谱（HPLC）法】由于具有稳定、准确、灵敏等优点，HPLC法已成为当前进行黄曲霉毒素定量研究的首选方法。分析黄曲霉毒素的液相色谱方法包括正相液相色谱方法（NPLC）和反相液相色谱方法（RPLC）。反相高效液相色谱(RP-HPLC)系统易操作，流动相具有低毒性，可同时分离、分析样品中黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2且不受样品沸点、热稳定性、和分子量限制，所以目前使用荧光检测器的反相HPLC法已经成为检测黄曲霉毒素的主要测定方法。Chiavaro等根据不同环式糊精增强黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1荧光释放的不同效果，发展了将环式糊精加入到流动相中的高效液相色谱法，黄曲霉毒素 B1，B2，G1，G2 的检测限均在0.3μg／kg以下，M1的检测限在0.0005μg／kg以下，几种黄曲霉毒素都呈线性反应关系。这种方法也被用于测定自然污染及人工添加样品。【免疫学方法】黄曲霉毒素的免疫学检测方法是将生物大分子的免疫学特性与化学特性结合起来的检测方法。该方法具有快速、灵敏、对样品纯度要求不高的特点，特别适合于大批量样本的检测。用于检测黄曲霉毒素的免疫学方法有酶联免疫吸附测定法、放射免疫测定法、亲和层析法、荧光偏振免疫测定法及免疫层析法。1.酶联免疫吸附测定(ELISA)法ELISA法是在免疫学和细胞工程学基础上发展出来的一种微量检测技术，分为直接法、间接法、双抗体夹心法和竞争法，其优点是对黄曲霉毒素B1的检测定性定量准确而且检测速度快（比薄层法提高了近 200倍），特异性强，荧光物质、色素、结构类似物对结果无干扰，回收率高，提取方法简单，成本较低，特别适合于对黄曲霉毒素Bl污染监测控制中大量样品的筛查。缺点是ELISA法中酶的活性易受反应条件影响，测定结果重复性较差，测定结果易出现假阳性问题；此外ELISA试剂寿命短，需要低温保存，葡萄酒类、含盐量高的酱油、含脂量高的花生油在提取时要进行调节pH 值、脱盐、脱脂等特殊处理。2.亲和层析法亲和层析法利用免疫化学反应原理，采用大剂量的单克隆抗体，选择性吸附提取液中的抗原物质黄曲霉毒素。由于抗原-抗体反应具有高灵敏、高选择、高特异性等特点，从而大大提高了试样的净化效果及检测灵敏度，同时可显著减少有毒有害试剂的使用，有利于操作人员的身体健康和环境保护。3.放射免疫(RIA)法RIA法与ELISA法基本相似，不同的是它们所使用的标记物不同，ELISA 法的标记物为酶，RIA法所用的标记物一般为放射性元素氚(3H)。该方法是将毒素 -3H标记物与样品加抗体进行竞争性结合，除去未结合的部分，测定其放射性，放射性强则说明样品中毒素含量低，反之毒素含量高。实验证明 ELISA比RIA灵敏度更高且更简便，并且RIA需要特殊设备，有放射性元素污染问题，人员需要安全防护，现在已经很少使用。4.荧光偏振免疫测定法荧光偏振免疫测定法的主要原理是荧光标记的毒素在样品缓冲液中与未荧光标记的毒素对特异性抗体的竞争性结合。分子质量越大，分子旋转速度越慢，荧光偏振值越大。Nasir等报道了用基于荧光偏振的装置检测不同谷物中的黄曲霉毒素。5.免疫层析（IC）法IC法是20世纪80年代初发展起来的一种快速免疫分析技术，其操作简单，快速，人员不用培训，且不需特殊的仪器设备，非常适用于现场测试和进行大量样品的初筛。免疫学与仪器结合方法近年来，随着黄曲霉毒素在食品中的检出标准越来越严格，很多人采取了免疫学与仪器结合的方法来检测黄曲霉毒素，发展了黄曲霉毒素的检测方法。1.免疫亲和柱净化荧光光度法张艺兵等提出了一种以免疫亲和柱净化结合荧光光度法检测黄曲霉毒素的新方法，此法利用抗原抗体——对应的特异吸附特性，以黄曲霉毒素单克隆抗体为填充柱，特异性、选择性地吸附黄曲霉毒素，再以甲醇为流动相将结合的黄曲霉毒素洗脱下来然后通过溴溶液衍生，所得衍生物可发射荧光，再通过荧光光度计分析即可以测定毒素含量。此方法克服了TLC法和HPLC法在操作过程中使用剧毒的真菌毒素作为标定标准物和在样品预处理过程中使用多种有毒、有异味的有机溶剂对操作人员造成身体伤害和污染环境的缺点，所需仪器设备轻便易携带，自动化程度高，操作简单，灵敏度可达1μg／kg，回收率在85％以上。一个样品只需10～15 min便能直接读出测试结果，比传统方法快几个小时甚至几天时间。缺点是此法只能测定黄曲霉毒素的总量且对试剂要求比较高，检测中药材黄曲霉毒素的含量时结果会出现一些假阳性。2.免疫亲和柱高效液相色谱法免疫亲和柱（IAC）是将特异性的黄曲霉毒素单克隆抗体与载体蛋白偶联并填柱而成。由于抗原抗体有一一对应的特异性吸附关系，所以IAC能特效性地、高选择性地吸附黄曲霉毒素，而让其它杂质通过柱子，使样品得以纯化，吸附的黄曲霉毒素可以被极性有机溶剂洗脱，再用HPLC法进行定量检测，其优点是具有高度特异性，可除去绝大多数干扰物质，检测限达1ng／g，还具有快速、溶剂使用少、可以自动化和再生利用的特点。缺点是柱成本高，商品化 IAC 仅适合几种毒素，有时需要加预柱净化。3.多功能净化柱高效液相色谱法Wilson和Romer开发了独特的真菌毒素多功能净化(MFC)柱，MFC柱提供一种快速的一步萃取纯化方法，工作原理和操作过程与其它净化柱相反，它含有亲脂性(非极性)和电荷活性成分(极性)，当样品提取液通过柱时，MFC柱保留样品液中的干扰物质如脂肪、蛋白质类化合物和碳水化合物等，而待测组分黄曲霉毒素不被吸附而直接通过，从而一步完成净化过程，除去90％的杂质，减少了传统净化方式淋洗杂质和洗脱待测样品的步骤，从而达到净化目的，这一点是IAC 和普通SPE净化柱所不具备的，并且与IAC相比净化效果同样理想，回收率高，灵敏度高，检测限低。【超光谱（HS）法】一直以来，黄曲霉毒素的检测都用化学方法，并且有些化学方法的检测结果非常准确，但是化学方法都要耗费大量的检测时间，检测费用较高且损坏检测样品，所以研究一种快速、准确、无损样品的检测方法对粮食产业是至关重要的，超光谱法检测黄曲霉毒就是这样一种方法。它的原理是首先通过光源激发待测样品，再通过设备捕捉成像，然后对成像进行特征抽取和特征排列，最后实现区别受黄曲霉毒素污染和未受黄曲霉毒素污染的样品。Haibo Yao等利用超光谱法分析了长波紫外线激发下的玉米粒的光谱BGYF 响应，首先用中心激发波长为365nm的紫外线光照射检测样品，被检测到黄绿色荧光的玉米粒，手动挑选出来，结果显示，在500～515 nm波长范围具有较强的黄绿色荧光发射光谱峰，选取500～515 nm有较强黄绿色荧光的玉米粒作为阳性组，用高效液相色谱法测定，与正常组对比，呈黄绿色荧光成像的黄曲霉毒素浓度的平均水平浓度是5.114μg／g。这个实验证明了玉米只有在感染黄曲霉毒素多的时候才会发出黄绿色荧光

苹果中的黄曲霉毒素B1的检测最近因为蒙牛、长富牛奶有检出了黄曲霉毒素M1的事件，造成此事件的主要原由是由于奶牛吃的黄曲霉毒素B1超标的饲料，黄曲霉毒素B1经动物体代谢后便转化为了黄曲霉毒素M1（植源性的食物是B1、动源性的食物是M1哦）。所以我们也再加班做黄曲霉毒素B1，悲催啊。我也顺便将品相较差的苹果拿来检测下其所含有的黄曲霉毒素B1。试剂与仪器Agilient LC-1200、Agilient G1321A荧光检测器、Mycosep 226 净化柱，柱后衍生仪：PICKERING PCX5200、色谱柱：SB-C18（250*4.6mm， 5μm），涡旋混合器、高速离心机、AF B1、B2、G1、G2标准品、乙腈、碘（均为色谱纯）、样品提取液：84% 乙腈水溶液；衍生液：0.1g碘溶于100mL20%乙腈水溶液。品相较差的苹果样品的处理：取20g粉碎后的样品至250mL的三角瓶中，加入80mL84% 乙腈水溶液，涡旋10min，离心分离。取8mL提取液至Mycosep 226 净化柱的试管中净化（控制流速0.5mL/min），取2mL净化液待测。色谱条件：流动相流速：1mL/min；荧光检测器：激发波长：360nm；发射波长：440nm；进样量：10微升，柱温：30度。（梯度洗脱）http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/12/201112300907_342653_1601435_3.gif衍生温度：将20ng/mL的B1、G1及5ng/mL的B2、G2为测定液，衍生液流速为0。2ml/min，各温度下的衍生结果见图2。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/12/201112300909_342654_1601435_3.gifhttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/12/201112300909_342655_1601435_3.gif

GB5009.24-2010 食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素M1和B1的测定GB5413.37-2010 食品安全国家标准 乳和乳制品中黄曲霉毒素M1 的测定GB/T5009.22-2003 食品中黄曲霉毒素B1的测定GB/T5009.23-2006 食品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定GB/T8381-2008 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 半定量薄层色谱法GB/T17480-2008 饲料中黄曲霉毒素B1的测定酶联免疫吸附法GB/T18979-2003 食品中黄曲霉毒素的测定 免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法GB/T23212-2008 牛奶和奶粉中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2的测定 液相色谱-荧光检测法LS/T6108-2014 粮油检验 谷物中黄曲霉毒素B1的快速测定 免疫层析法NYT1286-2007 花生黄曲霉毒B1的测定 高效液相色谱法NY/T1664-2008 牛乳中黄曲霉毒素M1的快速检测　双流向酶联免疫法NY/T2071-2011 饲料中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和T-2毒素的测定液相色谱-串联质谱法NY/T2548-2014 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 时间分辨荧光免疫层析法NY/T2549-2014 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 免疫亲和荧光光度法NY/T2550-2014 饲料中黄曲霉毒素B1的测定 胶体金法SN/T1664-2005 牛奶和奶粉中黄曲霉毒素M1、B1、B2、G1、G2含量的测定SN/T1736-2006 进出口蜂蜜中黄曲霉毒素的检验方法 高效液相色谱法SN/T3136-2012 出口花生、谷类及其制品中黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏马毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素、HT-2毒素的测定SN/T3263-2012 出口食品中黄曲霉毒素残留量的测定

黄曲霉毒素是天然存在的霉菌产生的一种毒素，已经被证明对人体容易产生癌症，是一类致癌物质。美国联邦政府有关法律规定人类消费食品和奶牛饲料中的黄曲霉毒素含量不能超过20ppb，人类消费的牛奶中的含量不能超过0.5ppb。而其它动物饲料中的含量不能超过300ppb。黄曲霉毒素是一类真菌（如黄曲霉和寄生曲霉）的有毒的代谢产物，它们具有很强的致癌性，主要存在于谷物、坚果、棉籽以及一些与人类血液，动物饲料相关的产品中。黄曲霉毒素M1是黄曲霉毒素B1的羟基化代谢产物，也是一种强致癌物质。牛乳及其制品是易受到黄曲霉毒素M1污染的食品之一。黄曲霉毒素 M1的检测方法有高效液相色谱法(HPLC)，薄层层析法(TLC)，酶联免疫法（ELISA）等。而使用黄曲霉毒素M1 免疫亲和柱则能够快速而准确的提纯纯化并浓缩样品中黄曲霉毒素M1组分，使得后面的分析更加轻松简单。PriboFast黄曲霉毒素总量亲和层析柱可选择性吸附样品液中的黄曲霉毒素（B1,B2,G1,G2），从而对黄曲霉毒素总量（B1,B2,G1,G2）样品起到非常针对性的纯化作用，过柱净化后的样品液可直接用于液相进行黄曲霉毒素总量（B1,B2,G1,G2）含量的检测。亲和层析柱与HPLC配合使用可达到快速测定的目的，以改善信噪比，可提高检测方法的准确度。PriboFast黄曲霉毒素总量亲和柱用于定性、定量检测谷物、副食品、酒类等食品和饲料等样本中的黄曲霉毒素总量（B1,B2,G1,G2）时的样品前处理。柱容量：≥200ng 回收率：80-90%可用于快递纯化检测牛奶，奶粉等样本中的黄曲霉毒素M1。

高效液相色谱法检测牛奶，奶粉等产品中黄曲霉毒素M11. 仪器高效液相色谱仪配荧光检测器，震荡器（或高速搅拌器），高速离心机2. 试剂与试液色谱甲醇，蒸馏水，乙腈+水（25+75），石油醚，2.5 10%乙腈， 氢氧化钠溶液（0.5mol/L），玻璃纤维滤纸（PriboFast免疫亲和柱免费赠送）3. 测定法本法系用高效液相色谱法（GB/T 18980-2003）测定牛奶，奶粉等产品中的黄曲霉毒素M1，除另有规定外，按下列方法测定。3.1 色谱条件色谱柱：C18柱，150×4.6mm，5um检测器：荧光检测器；激发波长365nm，发射波长435nm；流动相：乙腈-水（25：75）流 速：1.0ml/min 进样量：20ul柱 温：室温3.2 标准品溶液的配制取黄曲霉毒素M1标准品，用乙腈稀释成0.5ug/ml的标准储备液。根据使用需要，准确吸取10μl、20μl、50μl、100μl、200μl的黄曲霉毒素标准储备液，置5ml的容量瓶中，用流动相稀释至刻度，配成相当于1ng/ml、2g/ml、5ng/ml、10g/ml、20ng/ml的标准工作液，即得。3.3 样品前处理3.3.1牛奶将100mL牛奶水浴加热至40℃；4000r/min离心15min，收集50mL清澈液待用；3.3.2乳粉和粉状婴幼儿配方食品称取10g奶粉样品，将100mL50℃水多次少量加入，搅拌，使奶粉充分溶解；6000r/min离心15min，收集50mL清澈液待用；3.3.3发酵乳(包括固体状、半固体状和带果肉型)称取60 g混匀的试样，用0.5 mol/L 的氢氧化钠溶液在酸度计指示下调pH至7.4；用高速均质器在 9500 转/分钟，高速匀浆5 min水浴加热至40℃；4000r/min离心15min，收集50mL清澈液待用3.3.4干酪称取经切细、过10目圆孔筛混匀的试样5g置于50 mL离心管中，加2 mL水和30 mL甲醇；用高速均质器在 9500r/分钟，高速匀浆5 min；超声提取30 min；在6000r/分钟下离心15 min，收集上清液并移入250 mL分液漏斗中。在分液漏斗中加入30 mL石油醚，振摇2 min；待分层后，将下层移于50 mL烧杯中，弃去石油醚层。重复用石油醚提取2次；。将下层溶液移到100 mL圆底烧瓶中，减压浓缩至约2 mL；浓缩液倒入离心管中，烧瓶用乙腈-水溶液(1+4) 5 mL分2次洗涤，洗涤液一并倒入50 mL离心管中；加水稀释至约50 mL，在6000 转/分钟下离心 5 min，上清液供净化处理。3.3.5奶油称取5g试样，置于50 mL烧杯中；用20 mL石油醚将其溶解并移于250mL具塞锥形瓶中。加20 mL水和30 mL甲醇，振荡30 min后，将全部液体移于分液漏斗中；待分层后，将下层溶液全部移到100 mL圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪中减压浓缩至约5 mL，加水稀释至约50mL，供净化处理。3.4 供试品溶液的制备3.4.1 PriboFast® 黄曲霉毒素M1免疫亲和柱的操作将免疫亲和柱连接于50.0mL玻璃注射器下。准确移取50.0mL净化溶液注入玻璃注射器；将空气压力泵与注射器连接，调节压力使溶液以约2-3mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2～3mL空气通过柱体；更换10ml注射器与亲和柱连接，在注射器中加入10ml水，调节压力使水以约6mL/min流速清洗亲和柱。准确加入4mL色谱级乙腈洗脱，流速为1 mL/min～2mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。（建议将乙腈的量分2-4次加入。每次加入后，要让甲醇充分浸泡柱子里的凝胶2分钟。洗脱后的乙腈溶液，最好是水浴30℃加热吹近干。用10%乙腈定容后上液相）3.5 测定精密量取1ng/ml、2g/ml、5ng/ml、10g/ml、20ng/ml的标准工作液各20ul，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。另精密量取供试品溶液20ul，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素M1的量，计算，即得。1.本实验应有相应的安全、防护措施，并不得污染环境。2.残留有黄曲霉毒素M1的废液或废渣的玻璃器皿，应置于专用贮存容器（装有10%氯酸钠溶液）内，浸泡24小时以上，再用清水将玻璃器皿冲洗干净。

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液相色谱 荧光检测器做黄曲霉毒素B1为什么衍生时候要用正己烷标准上说：加200μL正已烷和50μL三氟乙酸于上述离心管中，盖紧磨口塞，超声振荡1min，静置10min，打开磨口塞，缓缓通入氮气至干。用乙腈-水溶液（1+1）定容至1.0mL，超声1min，用0.5μm滤膜过滤，滤液供液相色谱。不知道为什么这个步骤要加入正己烷 作用是什么 能不能用其他代替？

[b]摘要：[/b]黄曲霉毒素主要是由黄曲霉菌和寄生曲霉产生的次生代谢产物，它们存在于土壤、动植物、各种坚果中，特别是容易污染的花生、玉米、稻米、大豆、小麦等粮油产品，是霉菌毒素中毒性最大、对人类健康危害极为突出的一类霉菌毒素，是我国食品安全风险监测的主要监测对象。本文采用多功能净化柱-液相色谱法对玉米粉质控物样品中的黄曲霉毒素进行检测，实验结果表明：该方法回收率稳定、灵敏度高，RSD均小于5%。[b]关键字：[/b]黄曲霉毒素 多功能净化柱-液相色谱 检测方法 随着世界经济发展、生活水平提高，人们对于食品对生命安全和身体健康的影响越来越关注。在众多的食品污染因素中，生物毒素是最重要的污染物之一，而黄曲霉毒素因其对人及动物肝脏的剧烈损害名列毒性之首，一直受到人们和食品安全监督机构的广泛关注。 黄曲霉毒素是由黄曲霉菌和寄生曲菌产生的一种结构类似的二呋喃香豆素衍生物，主要有B1、B2、G1和G2四种形态。其除具有致癌性、致突变性和致畸性外，还会引起肝细胞变性和坏死，是至今发现的毒性最大的真菌毒素。 黄曲霉毒素的检测方法最初以薄层层析法为主，但是薄层层析法存在操作步骤多、样品前处理繁琐、提取和净化效果不够理想、提取液中杂质较多、灵敏度低、重现性差、不能准确定量等缺点。后发展荧光分光光度法，其存在检测费用较高、需配备专门设备、不能对单一毒素进行检测的缺点，此外张雪辉等比较了用荧光光度法和溴衍生-高效液相色谱法检测中药中黄曲霉毒素的结果，发现存在假阳性。免疫分析法是利用抗原抗体特异性反应等来测定黄曲霉毒素含量的方法，该方法的缺点是：重复性差，试剂寿命短，存在假阳性。目前黄曲霉的检测一般采用高效液相色谱法，兼具定性、定量的特点。 本文采用一种多功能净化柱-液相色谱法对玉米粉质控物样品中的黄曲霉毒素进行检测，先将样品提取液过自制多功能净化柱进行过滤，将过滤液进入液相色谱仪进行分析检测。该方法与其他黄曲霉毒素检测方法相比，具有耗时短、灵敏度高、操作简单、价格低廉、易于保存等优点。1.样品的提取与净化1.1 实验试剂与仪器 多功能净化柱，青岛贞正分析仪器有限公司；阴性玉米粉质控物；光化学柱后衍生设备；离心机；超声波清洗机；高效液相色谱仪，Waters2695；甲醇、乙腈，色谱纯；超纯水；黄曲霉毒素标准品（B1、B2、G1、G2）。1.2 样品的提取 称取5g阴性玉米粉质控物样品进行研磨，加入25mL 84/16乙腈/水，将样品进行超声，时间为60min，中间每隔10min摇晃一次，然后将样品离心处理，6000r/min离心10min，取上清提取液。1.3 样品的净化 将上述上清提取液至于试管中，过自制多功能净化柱进行过滤，注意过柱速度要小于2mL/min，提取过滤后液体于样品瓶中，做好标记。2. 黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2工作曲线的测定 分别配置梯度浓度的黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2溶液，用液相色谱仪进行检测，得到黄曲霉毒素B1工作曲线，如图1所示。液相色谱条件：流动相：A相，水；B相，乙腈+甲醇（50%+50%）；等梯度洗脱条件：A，68%；B，32%；色谱柱：C18柱（柱长150mm或250mm，柱内径4.6mm，填料粒径5μm）；流速：1.0mL/min；柱温：40℃；进样量：50μL；光化学柱后衍生器：激发波长：360nm；发射波长：440nm。[align=center][img=,536,755]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707311253_01_3254848_3.png[/img][/align][align=center]图1 黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2工作曲线[/align]3.基质空白值测定结果 依据《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》 GB 5009.22-2016 方法，对阴性玉米粉质控物样品进行提取、净化、检测。[align=center]表2 空白值测定结果 [/align][align=center][table=558][tr][td=1,1,177] 空白测定次数（n）[/td][td=1,1,185] 峰面积[/td][td=1,1,195] 浓度（mg/L）[/td][/tr][tr][td=1,1,177] 1[/td][td=1,1,185] 0[/td][td=1,1,195] 0[/td][/tr][tr][td=1,1,177] 2[/td][td=1,1,185] 0[/td][td=1,1,195] 0[/td][/tr][tr][td=1,1,177] 3[/td][td=1,1,185] 0[/td][td=1,1,195] 0[/td][/tr][tr][td=1,1,177] 平均值 [/td][td=2,1,380] 0[/td][/tr][/table][/align]4.方法评价结果 依据《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》 GB 5009.22-2016，对试剂空白加标，加标水平为2ppb，对阴性玉米粉加标，加标水平分别为0.5ppb、2ppb、5ppb。[align=center][b]表3 试样测定结果[/b] [/align][align=center][table=651][tr][td=1,2,94] [align=center] [/align][/td][td=1,2,22] [align=center] [/align][/td][td=2,1,138] [align=center]B1[/align][/td][td=2,1,132] [align=center]B2[/align][/td][td=2,1,132] [align=center]G1[/align][/td][td=2,1,132] [align=center]G2[/align][/td][/tr][tr][td=1,1,80] [align=center]回收率[/align][/td][td=1,1,58] [align=center]RSD[/align][/td][td=1,1,74] [align=center]回收率[/align][/td][td=1,1,58] [align=center]RSD[/align][/td][td=1,1,74] [align=center]回收率[/align][/td][td=1,1,58] [align=center]RSD[/align][/td][td=1,1,74] [align=center]回收率[/align][/td][td=1,1,58] [align=center]RSD[/align][/td][/tr][tr][td=1,6,94] [align=center]试剂加标（2ppb）[/align][/td][td=1,1,22] [align=center]1[/align][/td][td=1,1,80] [align=center][color=black]93.13[/color][/align][/td][td=1,6,58] [align=center][color=black]3.36[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]95.60[/color][/align][/td][td=1,6,58] [align=center][color=black]2.46[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]92.73[/color][/align][/td][td=1,6,58] [align=center][color=black]3.91[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]98.07[/color][/align][/td][td=1,6,58] [align=center][color=black]2.38[/color][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,22] [align=center]2[/align][/td][td=1,1,80] [align=center][color=black]100.28[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]100.16[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]100.44[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]98.44[/color][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,22] [align=center]3[/align][/td][td=1,1,80] [align=center][color=black]98.76[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]97.86[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]99.46[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]99.12[/color][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,22] [align=center]4[/align][/td][td=1,1,80] [align=center][color=black]98.02[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]99.93[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]93.09[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]92.81[/color][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,22] [align=center]5[/align][/td][td=1,1,80] [align=center][color=black]97.82[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]98.74[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]99.09[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]96.61[/color][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,22] [align=center]6[/align][/td][td=1,1,80] [align=center][color=black]92.24[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]94.17[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]92.71[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]95.82[/color][/align][/td][/tr][tr][td=1,6,94] [align=center]基质加标（0.5ppb）[/align][/td][td=1,1,22] [align=center]1[/align][/td][td=1,1,80] [align=center][color=black]64.40[/color][/align][/td][td=1,6,58] [align=center][color=black]3.97[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]70.46[/color][/align][/td][td=1,6,58] [align=center][color=black]3.87[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]78.92[/color][/align][/td][td=1,6,58] [align=center][color=black]4.31[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]73.43[/color][/align][/td][td=1,6,58] [align=center][color=black]4.89[/color][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,22] [align=center]2[/align][/td][td=1,1,80] [align=center][color=black]60.80[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]67.21[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]77.63[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]79.60[/color][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,22] [align=center]3[/align][/td][td=1,1,80] [align=center][color=black]57.53[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]65.32[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]75.80[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]75.14[/color][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,22] [align=center]4[/align][/td][td=1,1,80] [align=center][color=black]62.46[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]72.38[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]82.59[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]80.17[/color][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,22] [align=center]5[/align][/td][td=1,1,80] [align=center][color=black]59.36[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]71.56[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]75.16[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]76.85[/color][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,22] [align=center]6[/align][/td][td=1,1,80] [align=center][color=black]60.03[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]69.67[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]83.25[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]83.96[/color][/align][/td][/tr][tr][td=1,6,94] [align=center]基质加标（2ppb）[/align][/td][td=1,1,22] [align=center]1[/align][/td][td=1,1,80] [align=center][color=black]75.59[/color][/align][/td][td=1,6,58] [align=center][color=black]3.25[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]81.29[/color][/align][/td][td=1,6,58] [align=center][color=black]3.54[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]82.07[/color][/align][/td][td=1,6,58] [align=center][color=black]4.62[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]82.05[/color][/align][/td][td=1,6,58] [align=center][color=black]4.31[/color][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,22] [align=center]2[/align][/td][td=1,1,80] [align=center][color=black]73.30[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]79.14[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]75.16[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]79.44[/color][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,22] [align=center]3[/align][/td][td=1,1,80] [align=center][color=black]71.36[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]80.80[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]80.06[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]81.56[/color][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,22] [align=center]4[/align][/td][td=1,1,80] [align=center][color=black]75.81[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]83.16[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]81.36[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]81.28[/color][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,22] [align=center]5[/align][/td][td=1,1,80] [align=center][color=black]70.91[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]81.44[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]81.53[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]76.06[/color][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,22] [align=center]6[/align][/td][td=1,1,80] [align=center][color=black]70.48[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]74.98[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]73.60[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]73.70[/color][/align][/td][/tr][tr][td=1,6,94] [align=center]基质加标（5ppb）[/align][/td][td=1,1,22] [align=center]1[/align][/td][td=1,1,80] [align=center][color=black]85.29[/color][/align][/td][td=1,6,58] [align=center][color=black]3.27[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]89.74[/color][/align][/td][td=1,6,58] [align=center][color=black]2.90[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]100.80[/color][/align][/td][td=1,6,58] [align=center][color=black]4.80[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]92.30[/color][/align][/td][td=1,6,58] [align=center][color=black]3.02[/color][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,22] [align=center]2[/align][/td][td=1,1,80] [align=center][color=black]90.27[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]95.90[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]109.18[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]92.65[/color][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,22] [align=center]3[/align][/td][td=1,1,80] [align=center][color=black]87.58[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]93.70[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]108.12[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]93.29[/color][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,22] [align=center]4[/align][/td][td=1,1,80] [align=center][color=black]90.80[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]95.68[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]97.19[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]85.75[/color][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,22] [align=center]5[/align][/td][td=1,1,80] [align=center][color=black]93.57[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]94.54[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]107.71[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]90.93[/color][/align][/td][/tr][tr][td=1,1,22] [align=center]6[/align][/td][td=1,1,80] [align=center][color=black]91.40[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]90.16[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]100.78[/color][/align][/td][td=1,1,74] [align=center][color=black]90.19[/color][/align][/td][/tr][/table][/align]5.结论 该多功能净化柱适用于玉米粉物质的检测，通过对检测方法精确度、准确度的评价，回收率57%-110%之间，RSD＜5%，满足玉米粉基质中黄曲霉毒素的检测。参考文献[align=left]1.田随安，张焱，翟志雷.食品中的黄曲霉毒素（B1、B2、G1、G2）HPLC法测定探讨.医药论坛杂志，2008，29：28-29.2.谢光洪，于光，肖成蕊，等.黄曲霉毒素B1免疫检测方法的新进展.中国畜牧兽医，2007，4（7）：145-146.3.夏义平.食品中黄曲霉毒素检测技术研究进展.第二届环渤海色谱学术报告会论文汇编，2012：941-946.4.张雪辉，陈建民.高效液相色谱法与荧光光度法检测中药材中黄曲霉毒素的比较.药学学报，2004，39（12）：997-1000.5.张英，蔡志斌，郑志伟.超高液相色谱法同时测定油炸食品中4种黄曲霉毒素.实用预防医学，2011，32（3）：379-383.[/align]

那位有（1）、GB/T 18979-2003 《食品中黄曲霉毒素的测定??免疫亲和层净化高效液相色谱法和荧光光度法》（2）、GB/T 18980-2003 《乳和乳粉中黄曲霉毒素M1的测定??免疫亲和层净化高效液相色谱法和荧光光度法》麻烦给共享一下。谢谢啦

用液相检测黄曲霉毒素B1要注意什么问题？？手动上样的针接触标液后怎样处理？？用次氯酸钠浸泡清洗吗？？

2015版药典中药中黄曲霉毒素的检测有两种方法，不知大家是采用的哪种方法呢？液质？还是液相色谱-光化学衍生+荧光呢？

今天做黄曲霉毒素B1柱后衍生谱图很难看，标准品图谱都很难看， 这种图谱正常吗？[img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/08/202108191230128890_872_5026084_3.png[/img][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/08/202108191230128361_7242_5026084_3.png[/img]

[color=#444444]我们用碘衍生方法，按照药典中样品前处理的方法配制样品溶液，加样做回收率，其中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1的回收率均在70%以上，而黄曲霉毒素G2的回收率总是在40%左右，换了另一个品牌新色谱柱结果一样，想问一下这个跟四种毒素的结构有关系吗，或者跟免疫亲和柱有关吗？[/color][img=,absmiddle]http://muchongimg.xmcimg.com/data/emuch_bbs_images/smilies/rolleyes.gif[/img]

[em0808] 有哪位大虾指点一下？？？求助除了用试剂盒法外，用液相色谱法检测食品中黄曲霉毒素B1的方法！！不胜感激~~~~！

新买了一台液相色谱仪，发现销售人员提供的相关配件里，用到的是免疫亲和柱，而国家标准里需要的是含有反相离子吸附剂的净化柱，为啥不一样呢？测黄曲霉毒素用的不是最新的国家标准GBT5009.23-2006吗？同行业的是怎么检测的啊？