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液相色谱中峰向拖得方法

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液相色谱中峰向拖得方法相关的论坛

  • 液相色谱峰拖尾严重

    液相色谱测全氟辛酸拖尾好严重，峰形丑，测的时候样品浓度比较高，样品浓度低了几乎没响应，并且浓度越大保留时间越前，要怎么改善峰形?求助(已经在流动相中加了三乙胺)[img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/08/202108091954043841_3618_5229531_3.png[/img]

  • 【原创大赛】高效液相色谱法测定食品中的脱氢乙酸方法的优化

    脱氢乙酸具有较强抑制细菌、霉菌及酵母菌发酵的作用，尤其对霉菌的抑制作用最强，是一种高效的防霉、防腐剂。其还具有脂溶性强、热稳定性高的特点，在摄氏120℃的杀菌温度下仍保持杀菌能力不变。国外曾广泛使用于食品、药品中，我国自上世纪70年代中其开始用于食品防腐，曾用于果汁、酱菜、腐乳、干酪、人造奶油、乳酸菌饮料、月饼、果酱等食品。而脱氢乙酸的缺点是毒性较强，目前我国允许在腐乳、酱菜、果蔬汁、肉类制品、糕点、月饼、焙烤馅料中作为防腐剂使用，最大使用量0.5克/公斤。 脱氢乙酸的国标检测方法为[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url]法，样品经过有机溶剂的萃取、净化、浓缩等步骤的复杂处理，并且脱氢乙酸在[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url]条件下，色谱峰出现拖尾现象，使定性、定量影响较大。据报道利用高效液相色谱法食品中的脱氢乙酸，采用纯水、乙醇-水、碱性水对样品进行超声萃取处理，萃取液经过滤后上机检测。作者在试验中发现，利用脱氢乙酸难溶于水而易溶于甲醇、乙醇、乙腈等有机溶剂的特性，样品均浆后酸化处理，用乙腈提取，经微孔过滤后再用高效液相色谱进行定性、定量测定，方法的灵敏度、准确度和回收率高，精密度良好，重现性好，前处理简便快捷，更能满足样品分析要求。 实验样品材料采用一般市售的果汁、酱菜、腐乳、糕点等食品。果汁样品精确称取5.00 g于50 ml的离心管中；酱菜、腐乳、糕点等食品样品事先均匀，准确称取2.0～3.0 g于50ml的离心管中，加入5mL饱和氯化钠溶液和1ml盐酸溶液（1：1），用旋涡混合器混合1分钟，准确加入10mL乙腈，用旋涡混合器混合3分钟，3000转离心15分钟，取上清液经0.45μm过滤器过滤后供液相色谱测定。　　按相应的色谱条件对样液进行分析，采用外标法，以保留时间定性，以峰面积定量，测定样液中脱氢乙酸的浓度（mg/ml）。　 得到结果以下结果：一、根据扫描的结果，脱氢乙酸的最大吸收波长在230 nm和297 nm处，230 nm处吸收较强，但基体干扰较多，在波长297NM处基体干扰较少，故选取检测波长297NM。 二、动相为乙腈+水时，脱氢乙酸峰形拖尾，使用0.02 mol / L的乙酸铵代替水作流动相，峰形得到较大的改善。乙腈的比例影响出峰的时间和响应，乙腈的比例低，保留时间长，响应也会低，乙腈比例高时，出峰时间短，响应也较高。试验表明，当0.02 mol / L的乙酸铵―乙腈比例为85：15时效果较好。 三、脱氢乙酸难溶于水，易溶于苯、氯仿、乙醚。脱氢乙酸钠则易溶于水，选用水或氢氧化钠溶液、碳酸钠溶液提取，提取液须净化后方可使用。本方法选用乙腈作提取液，主要考虑到脱氢乙酸能溶液于乙腈，乙腈的水溶性有利于乙腈从酸性的样液中把脱氢乙酸完全溶解，同时乙腈可沉淀蛋白质，与脂肪不溶，离心分离得到干净的提取液。 四、在相应的色谱条件下测定，脱氢乙酸的保留时间为5.775min，峰形及组分分离效果好。 五、以70%乙腈水溶液为溶剂配制浓度0.01～0.1范围内的脱氢乙酸标准使用液。以峰面积对脱氢乙酸浓度进行回归分析得回归方程式Y=2.39X×108� 1.33×105，R=0.9997，线性良好。在对同一浓度标样连续进样5次，得到脱氢乙酸的峰面积和保留时间的RSD值分别为0.35%和0.24，方法的定性和定量准确度较高。　　本文采用乙腈提取食品中脱氢乙酸，注入高效液相色谱进行测定，以保留时间定性，采用外标法定量。本方法的线性方程有良好的相关性，R=0.9997。方法加标回收率为96.2%～99.6%，变异系数RSD值为1.09%。该方法操作简便、准确，回收率高，精密度良好，重现性好，可用于优化食品中脱氢乙酸的测定。

  • 羧酸酯液相色谱峰拖尾

    [table=100%][tr][td]我做的一种羧酸酯液相色谱峰拖尾，流动相是乙腈的反相梯度洗脱，柱子是C8柱，怎么从改变流动相入手消除拖尾呢？[/td][/tr][/table]

  • 液相色谱峰前拖尾

    液相色谱峰一直峰前拖尾，目前流动相比例为乙腈:水=60:40，色谱柱为安捷伦C18色谱柱，各位老师遇到过这种情况吗？[img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/01/202201221432111823_1075_4080951_3.png[/img]

  • 【求助】岛津-20A液相色谱峰拖尾

    我的岛津-20A液相色谱连了紫外检测器和电化学检测器，现在紫外有峰拖尾现象，电化学检测器峰拖尾更严重！对于电化学检测器，设置电位越低，风拖尾越严重！当然电位再高，也还有拖尾现象......当然，我的色谱柱是没问题的，我测过柱效了......我测得是黄酮类化合物，以前在其他仪器上测得峰都没有拖尾现象......请高手指点迷津......

  • 液相色谱纯物质峰鼓包拖尾

    液相色谱纯物质峰鼓包拖尾

    [color=#444444]液相色谱纯物质峰鼓包拖尾，用质谱确定峰鼓包处不是其他物质，求解决方法~（走基线是很小很小的规则的波浪型，基本等同于直线）[/color][color=#444444]自己手画，因为原图不放大看不太明显，放大后就是左边的样子。。。。[/color][color=#444444][img=,690,428]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908130944573375_9115_1739275_3.jpg!w690x428.jpg[/img][/color]

  • 高效液相色谱方法及应用__（第二版）

    跟大家分享一本书《高效液相色谱方法及应用》第二版，感兴趣的版友可以下载附件查阅，也欢迎补充。全书的目录如下：作 者： 于世林出 版 社： 化学工业出版社 本社特价书所属丛书： 色谱技术丛书 册 数： 条 形 码： 9787502569068 ; 978-7-5025-6906-8I S B N ： 7502569065 出版时间： 2005-6-1开 本： 小16开 页 数： 333定 价： 39 元第一章 绪论第一节 高效液相色谱法的特点一、与经典液相(柱)色谱法比较二、与气相色谱法比较三、高效液相色谱法的优点四、高效液相色谱方法发展简介第二节 高效液相色谱法的分类一、按溶质在两相分离过程的物理化学原理分类二、按溶质在色谱柱洗脱的动力学过程分类第三节 高效液相色谱法的应用范围和局限性一、应用范围二、方法的局限性参考文献第二章 高效液相色谱仪简介第一节 流动相及储液罐一、储液罐二、流动相脱气第二节 高压输液泵及梯度洗脱装置一、高压输液泵二、输液系统的辅助设备三、梯度洗脱装置第三节 进样装置一、停流进样装置二、六通阀进样装置三、自动进样器第四节 色谱柱一、柱材料及规格二、柱填料三、保护柱四、柱连接方式五、柱温控制第五节 检测器一、检测器的分类和响应特性二、紫外吸收检测器三、折光指数检测器四、电导检测器五、荧光检测器六、蒸发光散射检测器第六节 色谱数据处理装置一、微处理机二、色谱工作站参考文献第三章 液固色谱法和液液色谱法第一节 分离原理一、吸附系数二、分配系数第二节 固定相一、液固色谱固定相二、液液色谱固定相第三节 流动相一、表征溶剂特性的重要参数二、液固和液液色谱的流动相第四节 二元溶剂体系中液固和液液色谱的保留规律一、溶质保留值的基本方程式二、液固色谱的保留值方程式三、液液色谱的保留值方程式参考文献第四章 键合相色谱法第一节 分离原理一、正相键合相色谱法的分离原理二、反相键合相色谱法的分离原理第二节 固定相一、键合固定相的制备及分类二、键合固定相的性质三、使用键合固定相应注意的问题第三节 流动相一、溶剂的选择性分组二、在键合相色谱中选择流动相的一般原则三、改善色谱分离选择性的方法四、多元混合溶剂的多重选择性五、溶质保留值随溶剂极性变化的一般保留规律六、用线性溶剂化自由能关系（LSER）来表征反相液相色谱中溶质的保留值方程式第四节 新型高效液相色谱的固定相和流动相一、新型高效化学键合固定相二、化学键合固定相分类方法简介三、整体色谱柱四、超热水流动相第五节 离子对色谱法一、分离原理二、固定相、流动相和对（反）离子三、影响离子对色谱分离选择性的因素参考文献第五章 梯度洗脱第一节 基本原理一、等度洗脱二、梯度洗脱第二节 影响梯度洗脱的各种因素一、梯度洗脱时间(tG)对分离的影响二、强洗脱溶剂组分B浓度变化范围的影响三、梯度陡度对保留值的影响四、柱温变化对保留值的影响五、梯度洗脱程序曲线形状的影响六、影响梯度洗脱的其他变量第三节 优化梯度洗脱的方法一、建立梯度洗脱方法的一般步骤二、梯度洗脱中的实验条件第四节 梯度洗脱的图示方法一、二元溶剂梯度洗脱二、三元溶剂梯度洗脱三、四元溶剂梯度洗脱四、用极坐标和球面坐标描述梯度洗脱参考文献第六章 体积排阻色谱法第一节 分离原理一、分布系数二、体积排阻色谱法的特点第二节 固定相一、固定相的分类二、凝胶固定相的特性参数三、凝胶色谱柱的制备及谱图特点第三节 流动相一、凝胶渗透色谱的流动相二、凝胶过滤色谱的流动相第四节 凝胶渗透色谱法测定聚合物分子量分布一、聚合物分子量、分子量分布及测定的意义二、凝胶渗透色谱图的解析及数据处理参考文献第七章 高效液相色谱法的基本理论第一节 表征液相色谱柱填充性能的重要参数一、总孔率二、柱压力降三、柱渗透率第二节 高效液相色谱的速率理论一、影响色谱峰形扩展的各种因素二、范第姆特方程式的表达及图示第三节 诺克斯方程式一、描述色谱柱性能的折合参数二、诺克斯方程式第四节 色谱柱操作参数的优化一、三个柱操作参数的表达式二、HPLC中实用柱操作参数的优化三、柱操作参数优化的图示表达方法第五节 “无限直径”效应和柱外效应一、“无限直径”效应二、柱外效应第六节 超高效液相色谱一、超高效液相色谱的理论基础二、实现超高效液相色谱的必要条件三、超高效液相色谱的应用参考文献第八章 高效液相色谱分离条件的优化第一节 高效液相色谱中色谱参数的相关性一、色谱参数的分类二、色谱参数的相关性第二节 色谱分离条件优化标准的选择一、难分离物质对的峰对分离优化标准二、整体色谱图的优化标准第三节 色谱响应函数和色谱优化函数一、Morgan和Deming提出的色谱响应函数二、Watson和Carr提出的色谱响应函数三、Glajch和Kirkland提出的色谱优化函数四、Berridge提出的色谱响应函数第四节 色谱分离条件的优化方法一、单纯形法二、窗图法三、混合液设计实验法四、重叠分离度图法五、等强度洗脱和梯度洗脱的优化图示法第五节 优化HPLC分离的计算机辅助方法一、实验设计系统二、人工智能系统第六节 高效液相色谱专家系统简介一、专家系统的组成二、专家系统的使用方法参考文献第九章 微柱液相色谱法第一节 方法简介一、微型柱的分类二、微柱液相色谱法的优点和缺点第二节 基本理论一、柱外效应二、管壁效应三、稀释效应四、分离阻抗第三节 仪器装置一、输液泵系统二、进样系统三、柱系统四、检测器系统五、连接管和接头第四节 微柱的制备一、评价微柱性能的重要参数二、影响微柱分离效率的相关参数三、微柱的制备方法第五节 微柱液相色谱的新技术一、纳米液相色谱技术二、超高压液相色谱技术参考文献第十章 二维高效液相色谱法第一节 描述分离体系效能的参数一、峰容量二、信息量第二节 二维高效液相色谱的技术功能一、切割功能二、反冲洗脱功能三、痕量组分的富集功能第三节 二维高效液相色谱的流路系统一、多通路切换阀二、二维高效液相色谱的流路系统第四节 二维高效液相色谱在蛋白质组学研究中的应用参考文献第十一章 建立高效液相色谱分析方法的一般步骤和实验技术第一节 样品的性质及柱分离模式的选择一、样品的溶解度二、样品的分子量范围三、样品的分子结构和分析特性第二节 分离操作条件的选择一、容量因子和死时间的测量二、色谱柱操作参数的选择三、样品组分保留值和容量因子的选择四、相邻组分的选择性系数和分离度的选择第三节 高效液相色谱法的实验技术一、溶剂的纯化技术二、色谱柱的装填技术三、色谱柱的平衡、保护与清洗、再生技术四、梯度洗脱技术五、色谱柱前和柱后的衍生化技术六、样品的预处理技术参考文献符号表

  • 液相色谱峰裂分可能的原因及应对方法

    [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]峰裂分的原因有很多，如：1. 色谱柱过载；应对方法：可以通过降低进样量观察峰形是否改善来确定是否是过载导致的峰裂分。2. 色谱柱柱头污染或筛板部分堵塞；应对方法：可以通过更换同款色谱柱来排查或者反接色谱柱（如果确定色谱柱可以反接）观察峰形是否改善。3. 样品稀释剂洗脱能力较强而导致的溶剂效应；应对方法： 在不影响分析物溶解的前提下，尽量用（初始）流动相溶解样品或者用弱洗脱强度溶剂稀释样品以降低溶剂效应；在不影响灵敏度的前提下降低进样体积。4. 化合物自身的原因。比如化合物中存在多种互变形式；或者存在多个离子化位点，可能导致色谱峰裂分成双重甚至多重峰。应对方法：考察不同极性溶剂、流动相pH、温度等对峰形的改善情况，也可以针对性地选择特殊的色谱柱固定相，比如键合了带电基团的色谱柱来分析化合物等。

  • 【求助】液相色谱峰突然拖尾严重，高手快来呀

    [B][size=3][size=2]我们公司刚买的岛津lc020A的液相，我们专门打一个产品。用的流动相是 乙腈：0.1%磷酸水溶液=15：85色谱柱为 shim vp ods C-18柱仪器和色谱柱都是新买的，用了不到20次（大约买了才45天）前几次做样，出峰是正常的。昨天下午我分析产品也是正常的，用的是纯甲醇冲洗柱子，并保留的。等我今天下午在做样品是就发现出峰不正常了。本来响应有500的峰高，现在只有50，而且原来不拖尾的，现在尾巴拖的能从3分钟一直到8分钟。我把昨天做过的样品再拿出来分析，也是拖的很严重，根本不成峰了。像是土丘一样。因为跟昨天比，是同样的样品，同样的流动相，（泵的压力也和昨天差不多）同样的波长，不知道为什么会出现拖尾那么严重的，该不会是柱子塌陷了吧，但是我柱子才用20来次，一共也才打了40针。怎么会呢？请遇到或者能解决的大虾帮帮我。[/B]

  • 【原创大赛】液相色谱峰形拖峰与预柱的判断及处理

    【原创大赛】液相色谱峰形拖峰与预柱的判断及处理

    液相色谱峰形拖峰与预柱的判断及处理一、案例介绍：l 测定油悬浮剂中的有效成份：双草醚；l 采用国产仪器伍丰LC-100分别搭配250×4.6mmODS柱和250×4.6mm BRISA LC2 C18柱，对应流动相比例分别为甲：乙：水=20：35：45和甲：乙：水=20：40：40，检测波长为246nm；l 发生该异常（严重的峰形拖尾）状况时，仪器可见部分均正常运行，系统反馈压力较正常的上升2.0~3.2Mpa，其它操作均符合实验操作之要求；l 按标准操作所得液相图谱峰形异常，主要是拖尾因子1.00变化至1.77；二、案例图谱标准图谱：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/01/201701191700_668316_2239775_3.png双草醚-液相分析标准图谱 1拖尾因子1.00注：实验条件250×4.6mm BRISA LC2 C18柱，流动相甲：乙：水=20：40：40，检测波长为246nm，目标峰保留时间为16.232min异常图谱：（不可接受）http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/10/2016071409341955_01_2239775_3.png双草醚-液相异常分析图谱1 拖尾因子1.77 注：实验条件250×4.6mm BRISA LC2 C18柱，流动相甲：乙：水=20：40：40，检测波长为246nm，目标峰保留时间为16.232minhttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/10/2016071409345934_01_2239775_3.png双草醚-液相异常分析图谱2 拖尾因子1.79 注：实验条件250×4.6mm BRISA LC2 C18柱，流动相甲：乙：水=20：35：45，检测波长为246nm，目标峰保留时间为19.240minhttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/10/2016071409353819_01_2239775_3.png双草醚-液相异常分析图谱3-1 拖尾因子1.28注：实验条件250×4.6mm ODS柱，流动相甲：乙：水=20：35：45，检测波长为246nm，目标峰保留时间为16.407minhttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/10/2016071409361418_01_2239775_3.png双草醚-液相异常分析图谱3-2 拖尾因子1.28(上图目标峰起始部分和结束部分放大图)三、异常问题与分析1. 异常问题简述： 在进行正确的操作后，通过观察双草醚液相分析的图谱发现在同条件下所得目标峰的保留时间无明显变化，但出现明显或不可接受的峰形拖尾现象。按经验调整流动相中有机相（降低5%）与水相（增加5%）的比例再次进样分析，所得图谱发现目标峰的保留时间有明显变化但峰形的拖尾因子仍未得到改善。即正常情况下和微调后无法对分析条件进行优化。2. 原因分析：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/10/2016071409371743_01_2239775_3.png 鉴于液相分析条件的确定性（科学合理）、人为操作的正确性（准确无误）、色谱柱的使用寿命（才启用8个月）以系统运行压力的异常结果（正常压力为16.3~16.6Mpa上升到18.3Mpa及以上），故判断为流动相传输系统异常故障。四、异常状况处理http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/07/201607140938_600425_2984502_3.pnghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/07/201607140938_600426_2984502_3.png更换新的预柱1注：更换预柱柱芯后之所以更换整个预柱主要是为止先前的柱套内仍有异物，如此可避免产生污染，从而达到更换预柱柱芯的目的；旧的预柱可超声清洗后留待备用……装上新预柱后，顺道把色谱柱反冲洗了一下……然后……然后就好……五、异常状况处理之结果 经处理后液相分析所得图谱恢复正常（0.95≤拖尾因子≤1.05），确定是预柱内有异物造成流动相传输系统故障导致系统压力升高和目标峰峰形严重拖尾。不可以打脸……

  • 【第三届原创参赛】解决液相色谱峰拖尾小实例

    【第三届原创参赛】解决液相色谱峰拖尾小实例

    维权声明：本文为liuliuhui原创作品，本作者与仪器信息网是该作品合法使用者，该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为，我们将追究法律责任。概述： 灯盏细辛，习称灯盏花，为菊科植物短葶飞蓬Erigeron breviscapus(Vant.)Hand-Mazz]的干燥全草，主要分布在云南、广西等地。行温、味辛、微苦，具有散寒解表、祛风除湿、温络止痛之功效。小儿脓耳，捣汁滴入耳内；左瘫右痪，风湿疼痛，水煎点水酒服。临床上主要用于缺血性心脑血管病的治疗，对冠心病、高粘滞血症也有一定疗效。临床所使用的制剂有口服和静脉滴注两类，收载于《中华人民共和国药典》（1977年版一部）。近年来对其化学成分、药理学研究及临床应用都进行了深入研究。[font=宋体] 由于本人需检测灯盏花素中灯盏乙素的含量，因此对样品进行了初步的液相分析。[/font][/font][color=#d40a00]结构： 灯盏花素（[i]breviscapine）是从灯盏细辛中提取的黄酮类有效成分，主要含有灯盏乙素和少量的灯盏甲素。结构如下：[/font][img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/10/201010301545_256026_2164743_3.jpg[/img]由以上结构可以看出，灯盏乙素和甲素中都含有一个葡萄糖醛酸的结构基团。下面主要是灯盏乙素的液相色谱图普通液相色谱条件如下:色谱柱：YMC C18（250×4.6mm，5μm） 检测波长：335nm柱 温： 30℃ 流 速：0.8mL/min流动相：甲醇/水=45% 进 样 量：15μL[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/10/201010301554_256029_2164743_3.jpg[/img]如图可见，色谱峰存在严重拖尾现象，这就是由于灯盏乙素中含有一个羧基，硅胶对酸性化合物的吸附，在洗脱过程中使酸性物质不能同时到达检测器，造成峰展宽。在普通的液相条件下峰型很难看，因此将色谱条件改为:色谱柱：YMC C18（250×4.6mm，5μm） 检测波长：335nm柱 温：30℃ 流 速：0.8mL/min流动相：甲醇/水=45% ([color=red]AcOH:5[color=red]‰) 进 样 量：10μL[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/10/201010301655_256045_2164743_3.jpg[/img]加入乙酸后，峰型明显得到改善。（注：加入磷酸的效果也很好，但出于对柱子的维护方面考虑加入乙酸） 讨论：1． 色谱峰拖尾原因：A：硅胶对酸性化合物的吸附引起的拖尾；B：进样量太大造成超载现象容易引起拖尾；C：样品溶剂较流动相的极性大容易造成拖尾现象。2． 解决方案：A：硅胶对酸性化合物的吸附引起的拖尾 硅胶对酸性化合物的吸附，在洗脱过程中使酸性物质不能同时到达检测器，造成峰展宽。灯盏乙素，为酸性化合物，普通液相条件下严重拖尾，加入酸后，首先与硅胶表面的酸性硅醇基反应，抑制了灯盏乙素与硅醇基的反应，达到调节峰型的目的。B：进样量太大造成超载现象引起的拖尾 当进样量过大时导致拖尾可减少进样量。C：样品溶剂的极性较流动相的极性大 如果是此原因引起的拖尾现象可将样品用流动相溶解。[/font]

  • 【原创大赛】液相色谱流动相脱气的那些事

    【原创大赛】液相色谱流动相脱气的那些事

    液相色谱流动相脱气的那些事流动相脱气的必要性 困扰液相色谱的一个很大问题是液路中常会溶入或进入气泡,均匀的、少量的还勉强可以接受,大气泡或是不均匀的气泡我们是绝对接受不了的。气泡的出现会使我们的分析不准确,甚至无法进行分析,给液相色谱分析的的朋友们带来不可估量的烦恼和麻烦。所以流动相的脱气在液相色谱使用过程中是必须的、必不可少的。脱气知识或技术也是大家应该了解或是掌握的。气泡在分析过程中出现很多不正常的现象,大致为: 1.气泡的存在会使压力变化大,流速不稳定或无液流； 2.气泡会延迟出峰时间和出峰效果； 3.气泡会使基线波动大,出现尖锐的噪声峰或漂移严重,从而影响仪器的灵敏度； 4.气泡进入系统排出需要时间,尤其是进入色谱柱.而且系统的平衡会被破坏,还得花费较长的时间重新平衡； 5.气泡严重时可能导致色谱柱的损坏等等 6.气泡可能还会使某些部件生锈及腐蚀; 7.某些色谱柱对流量、压力和温度要求非常严格,由于气泡带来的影响,色谱柱可能被损坏； 8.气泡还可能引起某些不稳定的样品被氧化或使溶液pH值发生变化； 9.气泡还可能引起一些我们无法预测的问题或是意外现象.出现气泡的原因一般有四种： 1.流动相溶液中往往因溶解有氧气或空气而形成气泡； 2.液路阻力比较大,吸液时出现了真空气泡； 3.系统开始工作时未能将流路中的空气排除干净； 4.在注入样品时混入了空气。 对分析造成较大影响的主要是泵前形成的气泡, 为了消除气泡对液相色谱分析结果的影响，对流动相或泵前液路排气是非常必要的。液相色谱流动相脱气方式 液相色谱使用较多的脱气方法主要有五种：氦气或氮气脱气、真空脱气、超声波脱气、加热回流脱气、在线脱气机脱气。 1.氦气或氮气脱气：氦气脱气是很有效的脱气方法,效果很好。由于氦气在流动相中的溶解度极低，所以用氦气脱气保护的流动相可以认为是一个无气体溶解体系。氦气缓缓的从储液器的底部通入流动相,赶去溶入的空气，如果使用得当，在10min内可除去80%～90%的溶入气体。如果存放流动相的储液器是密封的,并且通入有一定压力(5个psi左右)的氦气,脱气效果更佳。

  • 液相色谱峰拖尾分析

    w 液相色谱峰拖尾分析从色谱柱分离机理角度 造成拖尾的原因多数是因为要分离的化合物是碱性的。 硅胶表面的硅羟基 pKa 值是2-3， 也就是当流动相的 pH 值大于这个值，硅羟基就会解离，这时这个氧带的外层电子对碱的吸 附是特别强的，很多人知道硅羟基对碱性物质吸附，解决办法：应选择封尾的柱子，但是即 使封尾，不管工艺怎么好，都不会是100%能封住。那么就争取从 pH 值角度考虑，减小流 动相 pH，或者说加三乙胺，三乙胺容易被这个解离的硅羟基吸附，其实作用相当于对色谱 柱封尾。 从流动相的角度 用甲醇做碱性物质要相对比乙腈好，因为甲醇含有-OH，多少能抑制硅羟基解离，加缓冲盐 的目的也是抑制硅羟基解离。 所以说种种方法都是抑制硅羟基解离或竞争吸附， 尽量减少解 离的硅羟基对碱性物质的吸附。 前沿峰图 非常有可能是色谱柱的硅胶溶解造成的。 前沿峰还有可能是由溶解性效应引起， 就是溶解样 品的溶液对样品的溶解性远大于流动相。 现在市场上有种色谱柱经过表面处理之后残留的硅 羟基 pKa 值能达到5.5-6我不说哪家生产的，用这种柱子做你的流动相 pH 控制在5.5以下拖 尾的效果非常好， 另外建议做碱性化合物时选择色谱柱尽量选择比表面积小， 含碳量低些的 色谱柱，效果会好。 A、 峰拖尾 、 1、筛板阻塞(a、反冲色谱柱 b、更换进口筛板 c、更换色谱柱) 2、色谱柱塌陷(填充色谱柱) 3、干扰峰(a、使用更长的色谱柱 b、改变流动相或更换色谱柱) 4、流动相 PH 选择错误 (调整 PH 值。对于碱性化合物，低 PH 值更有利于得到对称峰) 5、样品与填料表面的溶化点发生反应(a、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂 b、换柱子) B、 峰前延 、 1、柱温低(升高柱温) 2、样品溶剂选择不恰当 (使用流动相作为样品溶剂) 3、样品过载 (降低样品含量) 4、色谱柱损坏 (见 A1、A2) C、 峰分叉 、 1、保护柱或分析柱污染图 (取下保护柱再进行分析。如果必要更换保护柱。如果分析柱阻 塞， 拆下来清洗。 如果问题仍然存在， 可能是柱子被强保留物质污染， 运用适当的再生措施。 如果问题仍然存在，入口可能被阻塞，更换筛板或更换色谱柱。) 2、样品溶剂不溶于流动相 (改变样品溶剂。如果可能采取流动相作为样品溶剂。) D、 峰变形 、 1、样品过载 (减少样品载量) E、 早出的峰变形 、 1、样品溶剂选择不恰当 (a、减少进样体积 b、运用低极性样品溶剂) F、 早出的峰拖尾程度大于晚出的峰 、 1、柱外效应(a、调整系统连接(使用更短、内径更小的管路) b、使用小体积的流通池) G、 K’增加时，脱尾更严重 增加时， 、 增加时 1、二级保留效应，反相模式(a、加入三乙胺(或碱性样品)b、加入乙酸(或酸性样品)c、加入 盐或缓冲剂(或离子化样品)d、更换一支柱子) 2、二级保留效应，正相模式(a、加入三乙胺(或碱性样品)b、加入乙酸(或酸性样品)c、加入 水(或多官能团化合物)d、试用另一种方法) 3、二级保留效应，离子对 (加入三乙胺(或碱性样品)) H、 酸性或碱性化合物的峰拖尾 、 1、缓冲不合适 (a、使用浓度50-100mM 的缓冲液 b、使用 Pka 等于流动相 PH 值的缓冲液) I、 额外的峰 、 1、样品中有其他组份 (正常) 2、前一次进样的洗脱峰 (a、增加运行时间或梯度斜率 b、提高流速) 3、空位或鬼峰 (a、检查流动相是否纯净 b、使用流动相作为样品溶剂 c、减少进样体积) J、 保留时间波动 、 1、温控不当 (调好柱温) 2、流动相组分变化 (防止变化(蒸发、反应等)) 3、色谱柱没有平衡 (在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱) K、 保留时间不断变化 、 1、流速变化 (重新设定流速) 2、泵中有气泡 (从泵中除去气泡) 3、流动相选择不恰当 (a、更换合适的流动相 b、选择合适的混合流动相) L、 基线漂移 、 1、柱温波动,即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测 器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。 (控制好柱子和流动相的温度，在检测 器之前使用热交换器图) 2、 流动相不均匀,流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。 (使用 HPLC 级的溶 剂，高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气，使用中使用氦气。) 3、流通池被污染或有气体 (用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要，可以用1M 的 硝酸。(不要用盐酸)) 4、检测器出口阻塞,高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线 (取出阻塞物或更换管子。参 考检测器手册更换流通池窗) 5、流动相配比不当或流速变化 (更改配比或流速,定期检查流动相组成及流速) 6、柱平衡慢，特别是流动相发生变化时 (用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在 分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗) 7、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成 (检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及 HPLC 级的溶剂) 8、 样品中有强保留的物质(高 K’值)以馒头峰样被洗脱出， 从而表现出一个逐步升高的基线。 (使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子) 9、使用循环溶剂，但检测器未调整(重新设定基线。当检测器动力学范围发生变化时，使用 新的流动相) 10、检测器没有设定在最大吸收波长处。(将波长调整至最大吸收波长处)柱头有空隙。解决 办法：使用填料或玻璃珠填充柱顶部 柱上样品超载。解决办法：使用更高负载量的固定相。增加色谱柱内径、减少样品量、 单峰- 存在干扰性组分。解决办法：净化样品；预分离 存在未扫的死体积。解决办法：减少接头的数量、确保进样器密封垫紧密、确保接头正 确固定 碱性化合物- 硅醇相互作用。解决办法：换成聚合物固定相 碱性基质- 硅醇相互作用。 解决办法： 使用更强的流动相或添加竞争碱 （例如， 三甲胺） 硅胶基- 柱降解。解决办法：使用特种色谱柱；聚合物柱或空间位阻 硅胶基- 柱降解。解决办法：使用特种色谱柱；聚合物柱或空间位阻+

  • 液相色谱峰拖尾，排除柱子原因

    我们有一台岛津10A的液相色谱，平时使用的都很正常，最近总是出现峰型拖尾的现象，排除柱子与样品的问题，检测器的流通池也洗过了，还有检测器的能量有800，基线正常，不知道是什么原因

  • 纯干货！关于液相色谱峰的拖尾问题

    纯干货！关于液相色谱峰的拖尾问题

    同学们如果仔细查看色谱图，就会发现几乎每一个色谱峰都有一定程度的拖尾现象。[img=,690,388]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/04/201804111348068132_888_2428063_3.jpg!w690x388.jpg[/img]这本不是问题，但是当拖尾严重到一定程度，就会影响我们的分析结果，所以今天就让我们来谈一谈关于液相色谱峰的拖尾问题吧！什么是拖尾峰前沿陡峭，后沿较前沿平缓的不对称峰，称为拖尾峰。下图就是一个拖尾峰，[img=,690,324]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/04/201804111348271812_3608_2428063_3.jpg!w690x324.jpg[/img]我们会发现这个峰的右半边峰宽是大于左半边峰宽的，尤其在基线处更加明显。那如何评价色谱峰的拖尾呢？绝大多数情况下制药行业的从业人员会选择用美国药典（USP）中拖尾因子(Tf)来评价[img=,690,318]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/04/201804111349308492_1619_2428063_3.jpg!w690x318.jpg[/img]而其余的分析行业内人员则会选择用对称因子（As）来评价，关于这两个因子的计算我们之前就有相关的视频介绍大家可以回顾一下：拖尾因子和对称因子到底什么关系？其中，拖尾因子Tf=(a+b)/2a其中a和b分别是5%峰高处的左右半峰宽对称因子As=c/d其中c和d分别是10%峰高处的左右半峰宽如果a=b，c=d那么拖尾因子和对称因子的数值都等于1，也就是该峰不拖尾。实际工作中，当拖尾因子和对称因子小于2时，这两个值是非常接近的，如下图所示。[img=,690,319]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/04/201804111350579682_8480_2428063_3.jpg!w690x319.jpg[/img]拖尾峰会对工作造成什么影响？1. 影响峰高的计算先来看看第一个峰（Tf=1.0）和最后一个峰(Tf=3.5)，它们的峰面积虽然是相同的，但是由于最后一个峰拖尾很严重，所以它们的峰高相差三倍。当我们使用峰高来计算最低检出限时拖尾峰的负面影响就会比较明显。2. 影响峰面积的计算当我们对色谱峰进行积分来计算峰面积时，峰的起点和终点通常情况下通过色谱峰的斜率来确定。色谱峰越拖尾，它的尾部基线越平缓终点就越难确认。这一点在基线波动较大时体现的更加突出，那么它就会影响我们积分得到的峰面积。3. 影响对某些痕量组分的确认在药典计算有关物质的相关要求中会提到峰面积达到主峰面积0.1%的组分都要参与计算。[img=,690,312]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/04/201804111351483718_1035_2428063_3.jpg!w690x312.jpg[/img]那么当一些小峰和前面的峰分离度不是很好时就会容易被隐藏在前面峰的拖尾处从而无法参与计算。综上所述，拖尾峰会对色谱分析的定性定量结果都会产生影响。产生拖尾峰的原因是什么？01拖尾峰的形成是因为在色谱分离时出现了一种以上的保留机制，并且其中一种保留机制是超负荷的。在日常分析中大多数情况下会使用反相色谱。以常用的C18柱为例，C18是被键合在载体硅胶表面的，而硅胶是由硅和氧聚合而成的，所以它的表面会出现各种形态的硅羟基[img=,690,170]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/04/201804111352103052_1682_2428063_3.jpg!w690x170.jpg[/img]虽然理想的状态是流动相中的样品只和固定相C18发生作用。而实际上一半以上的硅胶表面并没有被键合上C18，所以硅胶表面会裸露出大量的硅羟基（Si-OH）。[img=,690,292]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/04/201804111352281909_361_2428063_3.jpg!w690x292.jpg[/img]而单独的自由硅羟基会和流动相中的样品发生作用，形成拖尾。于是在最近的十几年中，色谱柱供应商致力于生产出高纯度的硅胶载体由于新型硅胶在无金属离子环境下制造所以表面不会残留金属离子也会减少拖尾另外，硅胶表面尽可能减少自由的硅羟基，未与固定相键合的硅羟基尽可能形成螯合或聚合状态，用来减少拖尾峰的产生。02当色谱柱经历过高温、强酸，或者一些极端使用方法导致固定相流失较多后，色谱柱中的自由硅羟基也会变得越来越多从而更加容易造成拖尾峰03拖尾峰的形成也有可能是因为柱外的死体积较多，导致样品在死体积处发生了滞留和扩散。[img=,690,539]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/04/201804111353128162_7615_2428063_3.jpg!w690x539.jpg[/img]04当样品中出现了碱性化合物，碱性基团更容易与色谱柱中的硅羟基发生作用形成拖尾峰。如何改善拖尾峰01对于过去的自由硅羟基较多的色谱柱，建议在流动相中加入三乙胺来抑制拖尾。实验表明三乙胺有非常好的拖尾抑制效果。另外，由于三乙胺呈碱性需要大家在使用时考虑色谱柱的ph值耐受范围，某些情况可能需要加入酸性调节剂。对于新型的表面以耦合和聚合硅胶为主的硅胶载体，我们就很少使用三乙胺来抑制拖尾，而是通过调整流动相的ph3来抑制硅胶的离子化。02当色谱柱柱效降低导致拖尾峰时建议更换色谱柱。03建议在液相色谱中正确安装并且使用与您的仪器匹配的管线接头，以减少死体积的产生。摘自微信公众号《色谱学堂》

  • 用高效液相色谱测乳清蛋白中各蛋白含量，拖尾峰严重是怎么回事

    我现在是一名研二学生，课题是从乳清蛋白中分离α-乳白蛋白，目前要用高效液相色谱做出α-乳白蛋白的标准曲线，实验室用的是型号POLARIS-211的液相色谱仪，目前出峰的拖尾峰明显，停留时间也不稳定，有用过这个仪器的朋友吗，希望得到大家的帮助http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09511.gif

  • 【原创大赛】液相色谱系统中系统峰的干扰

    【原创大赛】液相色谱系统中系统峰的干扰

    李军芳/在采用液相色谱法进行油品烃族组成测定试验中，发现由于受系统倒峰的影响，单一饱和烃标准物质（标样）进样极易产生异形峰，异形峰的出现会影响积分面积，导致计算结果偏差。下面对异形峰产生的原因进行分析描述，并对如何规避异形峰进行简要介绍。 仪器配置及色谱条件：Waters高效液相色谱仪，包括Waters1525高压输液泵，Waters 2414示差折光检测器。配备具有2707自动进样器，在线脱气包，柱温箱和Breeze色谱数据处理工作站。色谱柱：Waters Spherisorb 5.0μm NH2 流动相：正庚烷。 实验得到，采用正辛烷（C8）、正壬烷（C9）、正十二烷（C12）作为饱和烃标样，色谱图中在饱和烃出峰位置（4'20＂~4'50＂）出现拖尾小峰（图1-图3）。采用环己烷作为饱和烃标样，色谱图中在饱和烃出峰位置，峰型完好（图4）。采用正十六烷（C16）、甲基环己烷作为饱和烃标样，色谱图中在饱和烃出峰位置出现前伸的小峰（图5、图6）。而采用单纯的流动相正庚烷作为样品进样，在色谱图中饱和烃出峰位置会出现倒峰（峰面积相对很小）（图7）。 根据试验分析，异形峰产生的原因是由于系统倒峰的存在，保留时间稍有差异的饱和烃试样正峰与系统倒峰相互抵消产生的结果。此系统峰是由于进样过程中系统压力波动造成的，一般出现在死体积附近，往往会形成一个正的或者倒的色谱峰，这些色谱峰独立于样品而存在。本次试验，通道大量调试发现系统倒峰无法规避，方法中固定相采用氨基柱，流动相需为非极性的，而待分析的饱和烃物质也是非极性的。这样待分析的组分基本在色谱柱中没有保留直接流出，造成系统倒峰和试样中饱和烃组分正峰无法分离开。鉴于不同饱和烃的标样响应值差异较大。考虑采用混合标样，进行后续标定。这样既可以将系统倒峰完全规避抵消掉（标样、样品积分面积都有内部抵扣），又可以使测试结果更趋于真值。[img=,554,115]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708281154_01_3232859_3.png[/img]图1 C8作为饱和烃标样色谱图[img=,554,117]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708281155_01_3232859_3.png[/img]图2 C9作为饱和烃标样色谱图[img=,555,134]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708281155_02_3232859_3.png[/img]图3 C12作为饱和烃标准物质色谱图[img=,526,113]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708281156_01_3232859_3.png[/img]图4 环己烷作为饱和烃标样色谱图[img=,554,102]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708281156_02_3232859_3.png[/img]图5 C16作为饱和烃标样色谱图[img=,534,101]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708281156_03_3232859_3.png[/img] 图6 甲基环己烷作为饱和烃标样色谱图[img=,555,136]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708281157_01_3232859_3.png[/img] 图7 流动相正庚烷作为样品直接进样色谱图

  • 液相色谱的问题解决：方法开发，峰形不正，干扰峰

    [color=#3e3e3e] 问题：我们开发了一种方法来检测食物样品中的苯二甲酸，此法是先对样品进行皂化处理，然后用反相离子对色谱法来分析。经皂化后，基体的酸性非常强。在所有分析方法中，是液相色谱（LC）法最好，还是离子交换色谱法更加适合呢？[/color][color=#3e3e3e][/color][color=#3e3e3e]　　解答：对于如苯二甲酸的酸性样品，离子对色谱法是可取的，离子交换色谱法也是可行的，但我选择了从一种较为传统的技术开始。通常我喜欢使方法简洁一些。方法越是简单，引出的问题也就越少。因此，我从反相色谱法开始研究，它使用低pH值的流动相。（如果你决定用离子对或离子交换色谱法，在本节的末尾部分我就这两种方法如何进行添加了一些论述。）[/color][color=#3e3e3e]　　从15或25cm×4.6mm，5um的C-8或C-18色谱柱开始。我比较喜欢用新型的碱灭活硅烷作为柱填料，而不喜欢旧型的色谱柱，因为碱灭活硅烷对拖尾较不敏感，并且在较宽的pH范围内稳定。为了在离子抑制的环境下操作，流动相的pH值应低于酸的pKa1-1.5个pH单位。苯二甲酸的第一个pKa为2.9，则需要在pH=1.4-1.9的环境下操作。一般情况下，除非你知道色谱柱在什么环境下是稳定的，否则我们应该尽量避免在pH〈2的环境下操作。我从pH=2.0开始，用25mM的磷酸盐缓冲液作为流动相的水溶液部分，同时用乙腈或甲醇作为有机溶剂。在这些条件下，苯二甲酸未能充分离子化而得不到好的峰形，并且表现得像中性化合物。因为芳香烃的特性，所以用UV检测在255nm应该有可能。[/color][color=#3e3e3e]　　我较喜欢用搜索梯度来准确本身的流动相强度，正如以前的“液相色谱的确问题解决”和参考文献2所述。用有选择地逐步处理作为方法开发，开始时用90%有机溶剂作为起点，然后有机溶剂含量逐渐下降10%，直到得到合理的保留时间为止。在样品注射前可调节其pH值，使之与流动相的pH值接近。[/color][color=#3e3e3e]　　低pH值流动相中的离子抑制比在高pH值流动相中的有更多优点。低pH值时，苯二甲酸的离子化受到抑制，所以会表现得像中性分子而其保留时间可预测且得到可接受的峰形。低pH值也抑制固定相中硅醇基团的离子化，这有助于减少峰拖尾。所有的反相色谱柱在3〈pH〈7的范围内是稳定的，而较新型的色谱柱可在2〈pH〈8甚至更宽的范围内操作。[/color][color=#3e3e3e]　　如果你想在高pH值下操作，你应该知道pH值大于8时柱填料中的碱性硅会溶解。有些色谱柱比其它色谱柱稳定一些，较高的pH值下，封尾的色谱柱比没有封尾的色谱柱更加稳定。在碱性条件下，当用有机缓冲液（如柠檬酸）替代无机缓冲液（如磷酸盐）时色谱柱的稳定性得到改善。一种选择是使用聚合物反相色谱柱。这些聚合物色谱柱对pH值不敏感，但它们趋向于产生比硅胶色谱柱较低的理论塔板数和较宽的峰。[/color][color=#3e3e3e]　　你提议的离子交换色谱法是在高pH值分离的另一个可能。离子交换相附着在聚合物小球上，具有你寻找的pH值稳定性，但与相应的反相色谱柱比较，其理论塔板数较低。[/color][color=#3e3e3e]　　[b]峰变形[/b][/color][color=#3e3e3e][/color][color=#3e3e3e]　　[/color][color=#3e3e3e]问题：上一部分就苯二甲酸开发分析方法时，我们发现了如果制备苯二甲酸标准溶液时用水代替甲醇则其峰形得到改善。是什么原因导致这样的结果呢？我们使用的流动相是20：80（V/V）的甲醇-5mM磷酸盐缓冲液，并加入10mM四戊铵溴化物作为离子对。[/color][color=#3e3e3e]　　解答：这样的结果是由注射入太大量的过强的溶剂引致的。图1解析了这个问题。图1a所示是变形峰，是将30ul样品注射入流动相的结果，样品用乙腈溶解，而流动相是含乙腈18%的水溶液。图1b所示的是正常峰，是用流动相作为注射溶剂溶解相同的样品。如果样品用不同于流动相的溶剂溶解，当被注射入时，样品溶液与流动相混合，并被稀释。如果注射的溶液比流动相强度大，则样品像在较强溶剂中一样会立即移动，并且较快地通过色谱柱，正如图1a所示，其保留时间比较短。当注射入的溶液与流动相混合时，有些分子与流动相的混合比其它分子更快，则它们穿过色谱柱的速率将发生改变，则谱带发生变形。如图1a所示，峰变形现象对较早洗脱的峰影响较大。解决将注射溶液量减至最少的问题的关键是使稀释在瞬间发生或者用强度不大于流动相的溶剂来溶解样品。较弱的溶剂在色谱柱中将样品浓缩，因此得到的峰往往是比注射入较强溶剂时更窄。[/color][color=#3e3e3e]　　因此作为一般规律，如果样品溶于比流动相强的溶剂，则注射体积应少于25ul。注射容积取决于注射溶剂与流动相之间到底存在多大的差异，此差异很容易凭经验判断――只是等体积地增加注射的量直到峰开始变形，然后返回两个单位就可以了。在读者的问题中，样品溶于甲醇，但甲醇比流动相强得多，所以他得到变形的较宽的峰。当他用水代替甲醇时，则样品溶液弱于流动相，峰形就得到了改善。在离子对色谱法中，总是用流动相作为样品溶剂以减少基线后移现象。[/color][color=#3e3e3e][/color][color=#3e3e3e]　　[b]干扰峰[/b][/color][color=#3e3e3e]　　问题：在反相LC分离法中，怎样避免溶剂前置峰对分析峰产生的干扰呢？[/color][color=#3e3e3e][/color][color=#3e3e3e]　　解答：有些化合物不具保留性，在开始分离时就被洗脱下来，避免这些物质的干扰的最好的方法是增加待分析化合物的保留时间。通常如果保留因子（k）大于1，则其色谱法和分离效果都会比较好。利用溶剂前沿作为规则可估计出k的值。色谱图的第一个峰通常是溶剂前沿峰或杂质峰，此峰的洗脱时间为色谱柱的死时间（t0），此时间表示一个在色谱柱中不保留的化合物通过色谱柱的时间。紧跟着死时间出来的是与色谱柱作用很小，并且很难从溶剂前沿和其它化合物的杂质峰中分离开来的物质。为了获得k值大于1，被检测的化合物的保留时间必须是死时间的两倍以上。例如，图1b中9.03min处的峰，其k值大约为1。[/color][color=#3e3e3e]　　你可以通过使用较弱的溶剂来增加保留时间。对于反相LC，弱溶剂一般是水或缓冲溶液。每改变溶液中的有机溶剂含量的10%，则保留时间大约变化3倍。为了获得期望的保留时间，你可以利用这个“3倍规则”来估计需要改变多少有机溶剂。[/color][color=#3e3e3e]　　如何开始？[/color][color=#3e3e3e][/color][color=#3e3e3e]　　问题：就反相LC分离而言，我看了很多关于选择初始条件的文献，但总体来说觉得很混乱，C-8好还是C-18好呢？我需要一根长为15cm的色谱柱还是25cm的色谱柱呢？我应该用乙腈还是甲醇那一种作为有机溶剂呢？就初始条件的选择你能给我一些指引吗？[/color][color=#3e3e3e]　　解答：让我们单独地分析每一个参数吧。首先，C-8好还是C-18好，又或者是其它固定相更好呢？就大多数的应用而言，你选择任何一种固定相都只有很少的差异。对于某些物质，C-18比C-8更具保留性，所以极性较小的样品选用C-8柱比较适合，同时，极性越强的物质在C-18柱中的保留性就越强。对大部分物质而言，这样选择色谱柱是正确的。填料物质的特性是一个更重要的选择。新型的、洁净的、碱性去活硅（B型）有利于新方法的开发。在我的经验中，这些固定相比旧型的固定相总是产生更好的峰形和更少的拖尾。我坚信，你为色谱柱付出多少就有多少收获--$200一根的色谱柱不可能给你$400一根的色谱柱的运行水平。当然例外是存在的，但对大部分情况而言，当你在方法的开发上花费了数千美元并在分析上花费了数万美元时，色谱柱的分离能力有可能很差吗？[/color][color=#3e3e3e]　　色谱柱长度是另一个反复选择的内容。大部分微粒的分离需要8000-10000的塔板数，填充5um微粒的15cm长的色谱柱或含有3um微粒的7.5-10cm长的色谱柱对实际样品会产生这个塔板数。所以仅从塔板数来看，长为15或25cm的色谱柱都是合适的。我比较喜欢用15cm×4.6um，3.5-um的色谱柱，因为它们能在流速为2ml/min，同时柱压为2500psi的条件下操作。较长的25-cm的色谱柱对于相同的柱压要求较低的流速。较长的色谱柱产生大约3倍的通过时间，这是因为柱长和流速大约影响整个分析结果的30%。使用一根新型的7.5cm×4.6um，3.5-um的色谱柱是另一个选择。这些色谱柱在大约一半的时间内产生与15cm的色谱柱相近的塔板数。你必须使用较短的、小微粒色谱柱避免产生柱外带加宽现象。你也可以使用窄孔柱（1-2mmi.d.），但他们也对由柱外因子引起的带加宽非常敏感。[/color][color=#3e3e3e]　　最后，有机溶剂也是经常选择的内容。溶剂应该与水完全混溶，与分析物及色谱柱均不起反应，粘度低，适用于所使用的检测器。最常用的三种溶剂是乙腈、甲醇和四氢呋喃。四氢呋喃是平时最坏的选择―操作时令人感觉不适，化学不稳定（放置一段时间后会形成过氧化物），平衡速度慢。甲醇是基本无毒的，并且对于检测波长高于220nm的物质是一个好的选择。然而，我的第一选择是乙腈，因为我的实验开发的许多方法都是需要在低波长检测的。[/color][color=#3e3e3e]　　总而言之，我喜欢的初始条件是15cm×4.6mm，5um的C-8或C-18色谱柱，流速为2ml/min，乙腈-水或乙腈-缓冲溶液作为流动相。我也成功使用过7.5cm×4.6mm，3.5-um的色谱柱。这些色谱柱中的任何一根都会提供一个好的出发点，因为它们对于大部分的分离而言都提供了足够多的塔板数，能在较低波长下检测，并且移动速率快。说到这，我认为使用长为15或25cm的C-8或C-18色谱柱，选择乙腈或甲醇作为流动相，这里的任何一个组合都是非常可行的―这就是你的选择。[/color][color=#3e3e3e][/color][color=#3e3e3e]　　[b]结论[/b][/color][color=#3e3e3e]　　为一个新方法选择初始条件，包括选择色谱柱、流动相和注射溶剂。虽然这些因素的许多组合都是可行的，但使用低pH值的流动相、反相色谱柱以及与流动相相似的注射溶剂，会给你开始的成功带来最大的可能。[/color]

  • 高效液相色谱法中干扰峰来源

    高效液相色谱法中干扰峰来源

    [size=15px][/size][size=15px]高效液相色谱法中的干扰峰是广大色谱工作者甚为头疼的事情，本文通过对干扰峰的来源进行分类，对其产生原因进行分析探究，供参考，便于后期快速解决同类问题。对于液相色谱法中的干扰峰，简单归纳为3类：试剂/溶剂、器材以及液相系统。下面对每一类干扰峰来源做简单的分析。[/size][b][size=15px]一、试剂/溶剂[/size][/b][size=15px][/size][size=15px]高效液相色谱法中，常用的试剂主要是有机溶剂、各种盐类及水。有机溶剂一般多为购买的色谱级，所以出现问题的几率较小。但是分装出的有机溶剂，由于多次使用，被污染的概率较大，因此引入干扰峰的几率较高。其次是水，水中的杂质是干扰峰的主要来源之一，这是大家极易忽视的问题。采集波长较低的检测方法，建议使用高品质水，这样可以避免很多因为水质带来的问题。再次是各种盐类，这也是色谱干扰峰的主要来源之一。如图2所示，与图1相比，如图2加入磷酸二氢钾后，16.5min处出现干扰峰。对于无机盐引入的干扰峰，在方法开发初期一般就会给眼关注，寻找解决方案。方法确定后，盐的品种及级别也同时确定，因此盐对方法的影响基本可控。[/size][size=15px]水和无机盐引起的干扰峰，比较快捷的解决方案是安装鬼峰补集柱，这样可以有效的避免此类干扰。如果使用离子对试剂，则需选择不影响离子对试剂的鬼峰补集柱。[/size][img=,603,617]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/08/202108081055083308_9090_3005249_3.png!w603x617.jpg[/img][b][size=15px]二、器材[/size][/b][size=15px][/size][size=15px]干扰峰来源的第二个方面是流动相配制及样品前处理过程中接触的各种器材。[/size][size=15px]首先是流动相配制过程中接触的器材，包括烧杯、玻璃棒、pH计、滤杯、滤膜、流动相瓶等。烧杯、玻璃棒是配制流动相首先接触的器材，因此建议配制流动相的烧杯、玻璃棒专用。滤杯实验人员只要清洗干净一般不会带来污染。需要注意的是，如果过滤含有离子对的流动相，建议增加清洗次数，避免清洗不干净污染后续流动相。因此，对滤杯的清洗应该建立基本的洗涤规程，保证实验人员对使用的器材清洗到位。滤膜也是干扰峰引入源头之一。如图3所示，乙腈经过有机系滤膜过滤后，在梯度洗脱中会引入较大干扰峰。鉴于色谱级试剂厂家已经过膜，且多数仪器都有脱气机，所以建议无需再对甲醇、乙腈等纯有机相过滤。流动相瓶引入干扰峰的现象主要出现在夏季，这是由于夏季温度高，纯水相容易滋生细菌。后续的流动相瓶使用人员清洗不到位，所以导致引入干扰峰。因此流动相瓶的清洗要建立严格的洗涤规程。[/size][size=15px]再次样品前处理过程中接触的器材。前处理过程中接触的器材主要包括容量瓶、滤头、注射器及进样瓶。容量瓶的清洗同流动相瓶、过滤装置一样，要建立良好的清洗规程。[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]材以及滤头、注射器，多为塑料制品，其化学惰性较玻璃制品差，因此容易引入干扰峰。如下图4、图5、图6所示案例，此方法检测波长为210纳米，溶剂为正己烷-异丙醇（90:10），溶剂分别接触[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液枪[/color][/url][/color][/url]枪头、一次性吸管、一次性注射器后，均引入不同的干扰峰。[/size][size=15px][img=,612,815]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/08/202108081056561551_79_3005249_3.png!w612x815.jpg[/img][/size][size=15px]进样小瓶若为一次性使用，一般不会引入干扰峰。如果进样瓶反复清洗，多次使用，则应建立清洗规程并对其清洗干净程度进行确认。[/size][b]三、液相系统[/b][size=15px][/size][size=15px]与前两类干扰峰相比，液相系统干扰峰的解决更加困难。液相系统是一个动态过程，所以此类问题解决过程耗费时间长，而且要求实验人员有很高的色谱素养。对此类问题来源主要归结为三类：强保留物质、离子对污染和管路滋生细菌。[/size][size=15px]首先是强保留物质的干扰，其主要特征是宽峰。此类问题多数发生在等度洗脱中，梯度洗脱主要出现在高比例有机相处。这是由于强保留物质在当次进样中未洗脱出，在后续进样洗脱出来所致。如图7中9分钟处的色谱峰。[/size][size=15px][img=,604,682]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/08/202108081058092812_7861_3005249_3.png!w604x682.jpg[/img][/size][size=15px][size=15px]对于此类干扰峰，可通过延长采集时间或增加洗脱强度来消除对后续样品的干扰。至于如何延长采集时间，可通过下面的公式计算得到。[/size][/size][size=15px][size=15px]N＝5.54*(tR/Wb/2)^2（1）[/size][/size][size=15px][size=15px]由公式（1）推导可知[/size][/size][size=15px][size=15px]tR＝Wb/2 *(N/5.54)^(1/2)（2）[/size][/size][size=15px][size=15px]N-塔板数，在等度洗脱中N对所有峰相同[/size][/size][size=15px][size=15px]tR-保留时间[/size][/size][size=15px][size=15px]Wb/2-色谱峰半峰宽[/size][/size][size=15px][size=15px]由公式（2）推知， tR2= tR1* W2b/2/W1b/2。积分结果显示，图7中，7min处的色谱峰W1b/2=0.12min，9min处的宽峰W1b/2=0.32min，由此可推知，图7中9min处的宽峰保留时间tR2= 7* 0.32/ 0.12=18.6min。图8为延长采集时间的图谱，20min处即为图7中9min处的色谱峰，与公式推导结果基本接近。延长采集时间后，后续图谱干扰峰消失。尽管按照此公式计算会有一定误差，但这足以让色谱工作者对其进行预判，设置合理的采集时间。[/size][/size][size=15px][size=15px][font=-apple-system, BlinkMacSystemFont, &]系统干扰峰第二个方面是离子对、螯合剂这种难以洗脱的试剂对液相系统的污染。此类污染物多半是由于使用完毕含有离子对、螯合剂之类的流动相后，对系统的冲洗不彻底所致。此类污染物主要对一些采集波长较低的方法产生干扰，普遍表现是基线噪音大或者干扰峰，但随着方法的运行会逐渐趋于正常。[/font][/size][/size][font=-apple-system, BlinkMacSystemFont, &][size=15px][color=#333333]系统干扰峰第三个方面是系统滋生细菌。对于系统滋生细菌，多数可能觉得不可思议，因为液相系统使用完毕都会用有机相冲洗保存。目前很多方法流动相A都是水相，虽然水相每日都会新配制，但如果由滤头到比例阀这一段管路长时间在水相中就会滋生细菌。随着时间的运行，梯度洗脱中会逐渐的产生干扰峰。此类问题虽然比较隐蔽，但比较容易解决，只要每日对放置纯水相的通道用有机相冲洗即可避免此类问题。[/color][/size][/font][font=-apple-system, BlinkMacSystemFont, &][size=15px][color=#333333]以上是对干扰峰来源的简单分析。然而对于干扰峰的产生，要具体问题具体分析，因为其还与具体色谱条件有关。同一种试剂，在方法A中产生干扰，但在方法B中可能完全没有干扰。因为采集波长，有机相初始比例及最终比例等因素，都可能会对干扰峰的出现产生影响。实际工作中，色谱工作者遇到的最大困难是如何识别判断干扰峰属于哪一类。由于找不清问题根源，所以也就难以有针对性的解决问题。[/color][/size][/font][font=-apple-system, BlinkMacSystemFont, &][size=15px][color=#333333]简单分享一下解决干扰峰的经验：[/color][/size][/font][font=-apple-system, BlinkMacSystemFont, &][size=15px][color=#333333]首先，判断干扰峰是来自系统还是供试品。此时需要运行两次采集：只运行梯度与正常进样。如果只运行梯度，未进样品，依然有干扰峰，这种情况下多半是系统所致，此时解决方向应针对液相体系，而不是针对供试品。鉴于有些型号的仪器，如果不进样，不会执行进样动作。因此，对于此类仪器，建议执行正常进样与减少进样量两次采集，根据干扰峰的大小来判断是系统原因还是供试品原因。[/color][/size][/font][font=-apple-system, BlinkMacSystemFont, &][size=15px][color=#333333]其次，调查仪器使用记录，与实验人员交流。查看仪器使用记录，了解近期运行哪些方法以及这些方法的流动相组成。查看完相关记录后，再跟实验人员交流，了解其操作过程。比如，对于A通道滋生细菌问题，通过仪器使用记录发现，出现干扰峰的仪器近一周都是在运行同一个方法。实验记录显示，此方法的流动相为0.1%的磷酸水溶液，因此可能是系统滋生细菌所致。但实验人员告知，每天晚上都会用有机相冲洗色谱柱，不可能滋生细菌。再次询问得知，实验人员每晚的冲洗是切换成C通道执行，而A通道却一直在0.1%的磷酸水溶液中。因此，切换通道冲洗系统这种不规范操应尽量避免。[/color][/size][/font][font=-apple-system, BlinkMacSystemFont, &][size=15px][color=#333333]第三，采取单因素试验解决问题。每次只改变一个因素，逐步找到干扰峰的来源。此类做法看似比较费时费力，但却让色谱工作者对各类色谱问题产生原因有理性认知，增强了色谱工作者解决问题能力，有助于后期问题的解决排查。[/color][/size][/font][font=-apple-system, BlinkMacSystemFont, &][size=15px][color=#333333]最后，对单因素排查出的解决方案进行验证，将问题重现。如果根据单因素变量找到的解决方案无法将问题重现，很有可能排查出的影响因素并不是问题真正的根源，需继续排查。能够重现问题，问题才算解决，方可将其关闭，不再研究。[/color][/size][/font][size=15px][/size][size=15px][/size]

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