高精度纳米级三维形貌仪

用于纳米级表面形貌测量的光学显微测头李强，任冬梅，兰一兵，李华丰，万宇（航空工业北京长城计量测试技术研究所 计量与校准技术重点实验室，北京 100095）　　摘 要：为了满足纳米级表面形貌样板的高精度非接触测量需求，研制了一种高分辨力光学显微测头。以激光全息单元为光源和信号拾取器件，利用差动光斑尺寸变化探测原理，建立了微位移测量系统，结合光学显微成像系统，形成了高分辨力光学显微测头。将该测头应用于纳米三维测量机，对台阶高度样板和一维线间隔样板进行了测量实验。结果表明：该光学显微测头结合纳米三维测量机可实现纳米级表面形貌样板的可溯源测量，具有扫描速度快、测量分辨力高、结构紧凑和非接触测量等优点，对解决纳米级表面形貌测量难题具有重要实用价值。　　关键词：纳米测量；激光全息单元；位移；光学显微测头；纳米级表面形貌0　引言　　随着超精密加工技术的发展和各种微纳结构的广泛应用，纳米三坐标测量机等精密测量仪器受到了重点关注。国内外一些研究机构研究开发了纳米测量机，并开展微纳结构测量［1-4］。作为一个高精度开放型测量平台，纳米测量机可以兼容各种不同原理的接触式测头和非接触式测头［5-6］。测头作为纳米测量机的核心部件之一，在实现微纳结构几何参数的高精度测量中发挥着重要作用。原子力显微镜等高分辨力测头的出现，使得纳米测量机能够实现复杂微纳结构的高精度测量［7-8］，但由于其测量速度较慢，对测量环境要求很高，不适用于大范围快速测量。而光学测头从原理上可以提高扫描测量速度，同时作为一种非接触式测头，还可以避免损伤样品表面，因此，在微纳米表面形貌测量中有其独特优势。在光学测头研制中，激光聚焦法受到国内外研究者的青睐，德国SIOS公司生产的纳米测量机就包含一种基于光学像散原理的激光聚焦式光学测头，国内也有一些大学和研究机构开展了此方面的研究［9-11］。这些测头主要基于像散和差动光斑尺寸变化检测原理进行离焦检测［12-13］。在CD和DVD播放器系统中常用的激光全息单元已应用于微位移测量［14-15］，其在纳米测量机光学测头的研制中也具有较好的实用价值。针对纳米级表面形貌的测量需求，本文研制了一种基于激光全息单元的高分辨力光学显微测头，应用于自主研制的纳米三维测量机，可实现被测样品的快速瞄准和测量。1　激光全息单元的工作原理　　激光全息单元是由半导体激光器（LD）、全息光学元件（HOE）、光电探测器（PD）和信号处理电路集成的一个元件，最早应用于CD和DVD播放器系统中，用来读取光盘信息并实时检测光盘的焦点误差，其工作原理如图1所示。LD发出激光束，在出射光窗口处有一个透明塑料部件，其内表面为直线条纹光栅，外表面为曲线条纹全息光栅，两组光栅相互交叉，外表面光栅用于产生焦点误差信号。LD发出的激光束在光盘表面反射回来后，经全息光栅产生的±1级衍射光，分别回到两组光电探测器P1~P5和P2~P10上。当光盘上下移动时，左右两组光电探测器上光斑面积变化相反，根据这种现象产生焦点误差信号。这种测量方式称为差动光斑尺寸变化探测，焦点误差信号可以表示为　　根据焦点误差信号，即可判断光盘离焦量。图1　激光全息单元　　根据上述原理，本文设计了高分辨力光学显微测头的激光全息测量系统。2　光学显微测头设计与实现　　光学显微测头由激光全息测量系统和光学显微成像系统两部分组成，前者用于实现被测样品微小位移的测量，后者用于对测量过程进行监测，以实现被测样品表面结构的非接触瞄准与测量。　　2.1　激光全息测量系统设计　　光学显微测头的光学系统如图2所示，其中，激光全息测量系统由激光全息单元、透镜1、分光镜1和显微物镜组成。测量时，由激光全息单元中的半导体激光器发出的光束经过透镜1变为平行光束，该光束被分光镜1反射后，通过显微物镜汇聚在被测件表面。从被测件表面反射回来的光束反向通过显微物镜，一小部分光透过分光镜1用于观察，大部分光被分光镜1反射，通过透镜1，汇聚到激光全息单元上，被全息单元内部集成的光电探测器接收。这样，就将被测样品表面瞄准点的位置信息转换为电信号。在光学显微测头设计中选用的激光全息单元为松下HUL7001，激光波长为790 nm。图2　光学显微测头光学系统示意图　　当被测样品表面位于光学显微测头的聚焦面时，反射光沿原路返回激光全息单元，全息单元内两组光电探测器接收到的光斑尺寸相等，焦点误差信号为零。当样品表面偏离显微物镜聚焦面时，由样品表面反射回来的光束传播路径会发生变化，进入激光全息单元的反射光在两组光电探测器上的分布随之发生变化，引起激光全息单元焦点误差信号的变化。当被测样品在显微物镜焦点以内时，焦点误差信号小于零，而当被测样品在显微物镜焦点以外时，焦点误差信号大于零。因此，利用在聚焦面附近激光全息单元输出电压与样品位移量的单调对应关系，通过测量激光全息单元的输出电压，即可求得样品的位移量。　　2.2　显微物镜参数的选择　　在激光全息测量系统中，显微物镜是一个重要的光学元件，其光学参数直接关系着光学显微测头的分辨力。首先，显微物镜的焦距直接影响测头纵向分辨力，在激光全息单元、透镜1和显微物镜之间的位置关系保持不变的情况下，对于同样的样品位移量，显微物镜的焦距越小，样品上被测点经过显微物镜和透镜1所成像的位移越大，所引起激光全息单元中光电探测器的输出信号变化量也越大，即测量系统纵向分辨力越高。另外，显微物镜的数值孔径对测头的分辨力也有影响，在光波长一定的情况下，显微物镜的数值孔径越大，其景深越小，测头纵向分辨力越高。同时，显微物镜数值孔径越大，激光束会聚的光斑越小，系统横向分辨力也越高。综合考虑测头分辨力和工作距离等因素，在光学显微测头设计中选用大恒光电GCO-2133长工作距物镜，其放大倍数为40，数值孔径为0.6，工作距离为3.33 mm。　　2.3　定焦显微测头的实现　　除激光全息测量系统外，光学显微测头还包括一个光学显微成像系统，该系统由光源、显微物镜、透镜2、透镜3、分光镜1、分光镜2和CCD相机组成。光源将被测样品表面均匀照明，被测样品通过显微物镜、分光镜1、透镜2和分光镜2，成像在CCD相机接收面上。为了避免光源发热对测量系统的影响，采用光纤传输光束将照明光引入显微成像系统。通过CCD相机不仅可以观察到被测样品表面的形貌，而且也可以观察到来自激光全息单元的光束在样品表面的聚焦情况。　　根据图2所示原理，通过光学元件选购、机械加工和信号放大电路设计，制作了光学显微测头，如图3所示。从结构上看，该测头具有体积小、集成度高的优点。将该测头安装在纳米测量机上，编制相应的测量软件，可用于被测样品的快速瞄准和高分辨力非接触测量。图3　光学显微测头结构3　测量实验与结果分析　　为了检验光学显微测头的功能，将该测头安装在纳米三维测量机上，使显微物镜的光轴沿测量机的Z轴方向，对其输出信号的电压与被测样品的离焦量之间的关系进行了标定，并用其对台阶高度样板和一维线间隔样板进行了测量［16］。所用纳米三维测量机在25 mm×25 mm×5 mm的测量范围内，空间分辨力可达0.1 nm。实验在（20±0.5）℃的控温实验室环境下进行。　　3.1　测头输出电压与位移关系的建立　　为了获得光学显微测头的输出电压与被测表面位移（离焦量）的关系，将被测样板放置在纳米三维测量机的工作台上，用精密位移台带动被测样板沿测量光轴方向移动，通过纳米测量机采集位移数据，同时记录测头输出电压信号。图4所示为被测样板在测头聚焦面附近由远及近朝测头方向移动时测头输出电压与样品位移的关系。图4　测头电压与位移的关系　　由图4可以看出，光学显微测头的输出电压与被测样品位移的关系呈S形曲线，与第1节中所述的通过差动光斑尺寸变化测量离焦量的原理相吻合。当被测样板远离光学显微测头的聚焦面时，电压信号近似常数。当被测样板接近测头的聚焦面时，电压开始增大，到达最大值后逐渐减小；当样板经过测头聚焦面时，电压经过初始电压值，可认为是测量的零点；当样品继续移动离开聚焦面时，电压继续减小，到达最小值时，电压又逐渐增大，回到稳定值。在电压的峰谷值之间，曲线上有一段线性较好的区域，在测量中选择这段区域作为测头的工作区，对这段曲线进行拟合，可以得到测头电压与样板位移的关系。在图4中所示的3 μm工作区内，电压与位移的关系为　　式中：U为激光全息单元输出电压；∆d为偏离聚焦面的距离。　　3.2　台阶高度测量试验　　在对光学显微测头的电压-位移关系进行标定后，用安装光学显微测头的纳米三维测量机对台阶高度样板进行了测量。　　在测量过程中，将一块硅基SHS-1 μm台阶高度样板放置在纳米三维测量机的工作台上，首先调整样板位置，通过CCD图像观察样板，使被测台阶的边缘垂直于工作台的X轴移动方向，样板表面位于光学显微测头的聚焦面，此时测量光束汇聚在被测样板表面，如图5所示。然后，用工作台带动样板沿X方向移动，使测量光束扫过样板上的台阶，同时记录光学显微测头的输出信号。最后，对测量数据进行处理，计算台阶高度。图5　被测样板表面图像　　台阶高度样板的测量结果如图6所示，根据检定规程［17］对测量结果进行处理，得到被测样板的台阶高度为1.005 μm。与此样板的校准结果1.012 μm相比，测量结果符合性较好，其微小偏差反映了由测量时温度变化、干涉仪非线性和样板不均匀等因素引入的测量误差。图6　台阶样板测量结果　　3.3　一维线间隔测量试验　　在测量一维线间隔样板的过程中，将一块硅基LPS-2 μm一维线间隔样板放置在纳米测量机的工作台上，使测量线沿X轴方向，样板表面位于光学显微测头的聚焦面。然后，用工作台带动样板沿X方向移动，使测量光束扫过线间隔样板上的刻线，同时记录纳米测量机的位移测量结果和光学显微测头的输出信号。最后，对测量数据进行处理，测量结果如图7所示。　　根据检定规程［17］对一维线间隔测量结果进行处理，得到被测样板的刻线间距为2.004 μm，与此样板的校准结果2.002 μm相比，一致性较好。　　3.4　分析与讨论　　由光学显微测头输出电压与被测表面位移关系标定实验的结果可以看出：利用在测头聚焦面附近测头输出电压与样品位移量的单调对应关系，通过测量测头的输出电压变化，即可求得样品的位移量。在图4所示曲线中，取电压-位移曲线上测头聚焦面附近的3 μm位移范围作为工作区，对应的电压变化范围约为0.628 V。根据对电压测量分辨力和噪声影响的分析，在有效量程内测头的分辨力可以达到纳米量级。　　台阶高度样板和一维线间隔样板测量实验的结果表明：光学显微测头可以应用于纳米三维测量机，实现微纳米表面形貌样板的快速定位和微小位移测量。通过用纳米测量机的激光干涉仪对光学显微测头的位移进行校准，可将测头的位移测量结果溯源到稳频激光的波长。实验过程也证明：光学显微测头具有扫描速度快、测量分辨力高和抗干扰能力强等优点，适用于纳米表面形貌的非接触测量。4　结论　　本文介绍了一种用于纳米级表面形貌测量的高分辨力光学显微测头。在测头设计中，采用激光全息单元作为位移测量系统的主要元件，根据差动光斑尺寸变化原理实现微位移测量，结合光学显微系统，形成了结构紧凑、集测量和观察功能于一体的高分辨力光学显微测头。将该测头安装在纳米三维测量机上，对台阶高度样板和一维线间隔样板进行了测量实验，结果表明：该光学显微测头可实现预期的测量功能，位移测量分辨力可达到纳米量级。下一步将通过多种微纳米样板测量实验，进一步考察和完善测头的结构和性能，使其更好地适合纳米三维测量机，应用于微纳结构几何参数的非接触测量。作者简介李强，（1976-），男，高级工程 师，主要从事纳米测量技术研究，在微纳米表面形貌参数测量与校准、微纳尺度材料力学特征参数测量与校准、复杂微结构测量与评价等领域具有丰富经验。

蛋白分子膜（蛋白膜）在生物传感和生物材料领域应用广泛。从纳米尺度精确检测蛋白分子的成膜过程，对控制蛋白膜的品质、理解其形成机制和评价其功能表现具有重要意义。然而，目前尚缺少一种能够精确表征蛋白分子在成膜过程中所有形态结构的技术手段，例如，原子力显微镜虽然具有优异的表面成像功能，但是它难以提供样品的亚表面信息，无法揭示蛋白分子层的内部结构信息。      　　近日，中国科学院重庆绿色智能技术研究院研究员王化斌团队和上海大学材料生物学研究所教授李江团队等合作，报道了一种同时具有表面和亚表面探测能力的纳米级分辨太赫兹形貌重构显微技术。研究团队发展了多介质层有限偶极子近场理论模型，建立了基于样品太赫兹近场光学显微图像重构样品三维形貌的方法，实现了单个蛋白分子、蛋白网状结构、蛋白单分子层和蛋白复合层的精确检测。太赫兹形貌重构显微技术具有无损、无标记的特点，以及表面和亚表面检测能力；其侧向分辨率与原子力显微镜相当，垂直分辨率达0.5 nm。该技术为研究生物分子、功能材料和半导体器件等样品提供了一种全新的技术途径。相关研究成果以Near-Field Terahertz Morphological Reconstruction Nanoscopy for Subsurface Imaging of Protein Layers为题，发表在ACS Nano上。研究工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、重庆市自然科学基金等的支持。

“我预计今年年底提前博士毕业，虽然我的德国导师希望我继续留下做博后，但我更希望能回到老家江苏做科研。而在最近发表的论文里，我和所在团队首次将定量相位成像技术，用于超细光纤显微内窥镜中，实现了最高 1 微米的分辨率、以及纳米级的三维重建。并通过光纤实现无透镜光场成像，借此制备出一款新型无透镜光纤显微内窥镜。”德累斯顿工业大学生物医学计算激光系统能力中心博士生孙佳伟 表示。▲图 | 孙佳伟（来源：孙佳伟 ）此次提出的无透镜光纤显微内窥镜，具备 1000 倍的放大倍率，可通过图像重建让医生“看清”脑部神经元或是组织表面的细胞。（来源：Light: Science & Applications）研究中，他和同事使用无透镜光纤显微内窥镜，对无标记的癌细胞进行高对比度成像，让光纤内窥镜能进一步对体内癌症组织表面进行细胞级的高分辨率成像。这意味着，人们可通过此内窥镜尽早找出病变的癌细胞，实现癌症的早期预警。同时，鉴于光纤内窥镜探针只有头发丝量级，因此可在极大降低创口大小的同时，深入体内的狭小部位，如细微血管、肺泡、耳蜗等进行显微成像。另外，其所搭载的系统基于量产的多芯光纤，可做一次性的内窥镜探头，用完后可以轻松换上新的光纤以作为探头，从而彻底消除交叉感染的风险。据介绍，内窥镜成像（endoscopy）作为临床常用的体内成像方法之一，其常规直径至少在几十毫米以上，且图像放大倍率只有大约 50 倍，只能看清组织大概的形貌。而孙佳伟 的无透镜光纤显微内窥镜的探测端，没有使用任何透镜，探针的直径只有 0.35 毫米，大约在头发丝量级，能大大减轻创口的大小。对于神经外科手术来说，常常需要在大脑或脊柱开非常小的切口，进而通过内窥镜和特殊器械，进行复杂精密的手术。而内窥镜的尺寸越小，手术对患者造成的额外损伤就越小，患者术后恢复得也就越快。▲图 | 新型无透镜光纤显微内窥镜，探针直径仅为 0.35 毫米（来源：孙佳伟 ）多年来，荧光显微成像已成为生物医学中广泛使用的成像方法，通过对样品进行荧光标记、激发和检测，可对荧光标记的样品做以选择性成像，从而提升成像的对比度。此前市面上最新的光纤显微内窥镜，是通过共聚焦扫描来实现体内荧光显微成像，但其需要昂贵的光学系统和复杂的校准流程，同时还得预先对体内组织进行特殊荧光染色。然而，某些情况下荧光剂会影响组织正常功能，用后也不易去除。因此，无标记成像技术对内窥镜尤为重要。定量相位成像，是一种无标记显微成像技术。其原理是通过组织中不同成分的微小相位差，来实现生物医学样品的高对比度成像。从技术手段来讲，进一步重建光场的相位信息，还能实现纳米级轴向分辨率的三维成像，这让定量相位成像也常被用于芯片表面检测。但是，此次提出的光纤内窥镜系统，使用量产化的多芯光纤束作为体内成像探针。虽然多芯光纤束只有三根头发丝那样粗，里面却包含着一万根单模的光纤芯，每一根光纤芯都能独立传播光学信号，而把这一万根光纤芯的光学信号组合起来，就相当于有了一万个能成像的像素。但是，光在每一根纤芯中的传播距离有着微小的差别，而光波的相位又非常敏感，即使是 10 纳米以下的光传播距离差，也会引起可观的相位变化。由于光在这一万根光纤芯中的传播距离各不相同，这会带来非常严重的相位失真，就像把样品的光学信息进行了“加密”，故在多芯光纤束中实现定量相位成像，是一个颇具挑战性的难题。（来源：Light: Science & Applications）找到“解码”光场的“钥匙”那么，如何从“加密”光场信息中恢复样品信息呢？孙佳伟 等人提出一种名为远场散斑转换的算法，可从光纤输出端的散斑中，重建出光纤中的固有相位差，这就相当于拿到了“解码”光场的“钥匙”。这样一来，当使用无透镜光纤显微内窥镜去探测样品时，用这把“钥匙”来“解码”样品的光场信息，就能得到样品的相位信息。另外，鉴于可通过光纤显微内窥镜重建完整的光场信息，这时只用一张散斑图像重建出不同深度的图像，即可实现数字重新对焦，并能把无透镜光纤显微内窥镜的工作距离从 10 微米提到 10 毫米。得益于这样的数字对焦，以后医生们再也不用手动调整焦距，通过程序即可实现实时数字对焦，让无透镜光纤显微内窥镜的易用性得到极大提升。近日，相关论文以《通过超薄无透镜光纤内窥镜进行定量相位成像》（Quantitative phase imaging through an ultra-thin lensless fiber endoscope ）为题发表在 Light: Science & Applications 上。▲图 | 相关论文（来源：Light: Science & Applications）孙佳伟 担任一作兼通讯，德累斯顿工业大学测量和传感器系统技术实验室于尔根W查斯克（Juergen W. Czarske ）教授、以及同一实验室的内克塔里奥斯库库拉基斯（Nektarios Koukourakis ）博士担任共同通讯作者。该工作还得到清华大学精密仪器系曹良才 教授和马克思普朗克光科学研究所约亨顾克（Jochen Guck ）教授的指导。其中一位审稿人评价称，“论文中的实验结果令人信服，清楚地标明该方法能够对样品进行定量相位成像，并验证了三维成像的可能性。该项新技术开辟了在超细内窥镜进行相位成像的广阔前景。”另一个审稿人表示，“作者使用一种全新的计算重建算法，以便远场强度图像获得相位信息，实现了基于光纤的定量相位成像。”（来源：Light: Science & Applications）据悉，该研究主要由德国科学基金会支持，旨在通过自适应控制多芯光纤的输出光场，精准控制癌细胞的旋转。与此同时，对细胞进行全息成像，最终得到癌细胞完整的三维重建图。为了实现在纳米级精度下，用光精准地去控制癌细胞，孙佳伟 耗时一年搭建出一个非常复杂且昂贵的光学系统，单单研发实验器件的控制程序，他就写了近一万行代码。后来，又泡在实验室几个月，终于通过光纤光场调控，对细胞多轴旋转做以实时控制。这项成果的实现也是世界首次，相关论文在更早之前已发表在 Biomedical Optics Express 上 [1]。▲图 | 利用光纤输出光场，癌细胞进行光学无接触操控，实时控制细胞旋转轴（来源：孙佳伟 ）他说：“当时有一个误区，觉得越复杂的系统越高级，固然系统越复杂，需要解决的技术难题也就越多，其中的技术含量也就越高，但是繁杂的系统也就意味着高成本、高投入，难以获得广泛的应用。很多经典的研究，后人看起来其实只是解决了一个很小的问题，但最难的是从零到一的突破过程。”舍弃复杂昂贵的光学器件，只用一根光纤、一个相机和一些基本光学元件，在有限的成本内，通过程序提升成像性能。所以他一直在思考，如何把光学系统化繁为简？于是就有了关于此次论文的初步想法[2]。正好那时，清华大学精密仪器系曹良才 教授课题组的吴佳琛 博士来德国交流，曹教授团队在计算光学领域有着很深的造诣。“在和佳琛沟通了我的想法之后，他也对此特别感兴趣。因为光纤输出端的散斑太过复杂，一开始的算法效果并不理想。后来我们不断改进算法，终于在有天深夜，佳琛激动地跟我说算法成功了。我连忙从床上蹦下来打开电脑，把他的算法和我的代码整合起来，那天晚上兴奋地没怎么睡着。第二天一大早就立马赶去实验室验证算法，结果发现真的能在实验中完美重建出相位图像。”孙佳伟 说。（来源：Light: Science & Applications）计划将光纤显微内窥镜用于临床研究另据悉，因为光学仪器大多都非常精密，外界的微弱干扰都有可能对实验结果产生影响。因此为了减小外部震动，孙佳伟 所在的实验室专门建在地下一层。但是，他的实验室离马路比较近，每次有大型车辆经过的时候，都能在仪器数据上观测到微纳级的抖动。为了得到最佳的实验数据，那几周他每天等到半夜路上没有车的时候，一个人在漆黑的实验室里做实验。功夫不负有心人，最后的实验结果也非常稳定。家庭，也给他提供了软动力支持。他说：“我老婆虽然没有直接参与此次研究，但每次我的实验没有进展、焦头烂额的时候，她总能耐心地安慰我、鼓励我，等我焦躁的心安静下来后，理性地帮我梳理思绪找到问题所在。”据介绍，孙佳伟 是江苏南通人。本科就读于西北工业大学信息对抗技术专业。读研时，他来到德国留学，在波鸿大学读激光与光子学专业。那时，他开始接触到光学实验，并开始从事数字全息成像方面的研究。其说道：“一开始只是单纯觉得激光特别酷，但在实验室待久了之后，我深刻体会到光学实验是一个慢工出细活的过程，慢慢地也喜欢上泡在实验室的感觉。我的硕士论文获得了接近满分的成绩，导师把我推荐到现在的课题组继续攻读博士，我也得以继续从事光学成像的研究。”（来源：Light: Science & Applications）在德国读博更像是工作，他作为一名博士生的同时也是学校雇员，目前其还担任助理研究员一职，要承担一定的教学任务，以及指导本科生和硕士生的毕业论文。为此，孙佳伟 还开设了一门叫做“数字全息技术”的实验课程。疫情期间，他把实验课搬到线上，通过视频给学生呈现光学实验的过程，同时也在线上辅导学生处理数据。当下，他的重心依然是科研。目前的图像重建算法对电脑的硬件要求比较高，后续他计划使用人工智能提升算法效率，让图像重建程序在普通笔记本电脑上也能轻松运行，并能实时重建三维图像。同时，他和导师也申请了与所在大学的附属医院的合作项目，计划进一步将光纤显微内窥镜用于临床研究。参考资料：1.Sun J, Koukourakis N, Guck J, et al. Rapid computational cell-rotation around arbitrary axes in 3D with multi-core fiber[J]. Biomedical Optics Express, 2021, 12（6）: 3423-3437.https://doi.org/10.1364/BOE.4230352.Sun J, Wu J, Wu S, et al. Quantitative phase imaging through an ultra-thin lensless fiber endoscope[J]. Light: Science & Applications, 2022, 11（1）: 1-10.https://doi.org/10.1038/s41377-022-00898-2