高通量单细胞测序包裹仪

随着科学的发展，科学家们发觉许多群体细胞，完整个体水平的研究只是研究多种类细胞，多个细胞共同作用的“平均值”，淹没了细胞个体之间的差异。因此，针对单个细胞的研究技术，单细胞基因组学研究（Single Cell Genomics Study）成为生物学研究迫切的方向，并成为再生医学，发育生物学，肿瘤研究，免疫学研究必不可少的关键研究手段。 Dolomite Bio公司基于其已有的单细胞RNA测序模块系统和μEncapsulator单细胞包裹模块系统取得良好的销售业绩及客户反馈。2017年11月，Dolomite Bio公司隆重推出Nadia高通量单细胞建库仪，可平行运行1/2/4/8个样品， 每个样品18min内可生成6000个单细胞库；专为DropSeq方案设计；使用一次性试剂盒，防止污染；自动检测试剂盒状态，触摸屏控制，全自动运行。同时，添加Innovate新方法开发平台，可以使用自己的试剂，开发新的方法，可调节液滴大小、频率、温度、搅拌和时间等参数，一旦条件摸索成功，可通过Nadia高通量单细胞建库仪在相同条件下平行运行2/4/8个样品。 2018年4月24日-27日， Dolomite Bio公司在北京、上海、深圳和澳门成功举办了Nadia高通量单细胞转录组测序技术交流会，会议现场Dolomite Bio公司CEO Mark Gilligan先生详细介绍了液滴微流控技术应用在单细胞研究的优势，高通量单细胞RNA测序实验中遇到的问题以及B细胞和T细胞、FACS分选等应用，并现场利用Nadia单细胞建库仪和Innovate新方法开发平台演示了单细胞库制备的整个实验过程。现场部分客户被邀请亲自体验了实验过程，客户对实验结果非常满意，并对Nadia通量高、操作简单、Innovate灵活开放的特点给予了极大的肯定。清华大学会场中科院学术会议中心会场华大基因会场澳门大学会场Mark给客户演示Nadia样机

2011年7月第八期《自然&mdash 方法学》刊登了Monya Baker撰写的一篇人物特写，详细介绍了在当期发表的论文 &ldquo Fluorogenic DNA sequencing in PDMS microreactors&rdquo 的主要作者哈佛大学谢晓亮教授的高通量测序技术。全文翻译如下：　　在科学界，合情合理的实验也可能会出现令人吃惊的结果。当谈到他的实验室时，谢晓亮把他的主要研究分成三个领域：活体细胞中的动态基因表达研究，单分子酶学和免标记显微成像技术，而现在，又多了一个由于意外而诞生的新领域&mdash &mdash 高通量测序。　　目前常见的测序技术&ldquo 焦磷酸测序&rdquo 是通过边合成DNA边测序实现的，当加入新三磷酸核苷酸时，荧光素酶水解三磷酸键所产生的能量会以光的形式发出，然而光信号转瞬即逝，需要检测系统能够灵敏地捕捉到这一瞬间的光信号。 另一种常见的技术是基于荧光的测序，相比之下，它可以产生一个稳定的光信号，但需要很多额外的化学修饰步骤才能产生荧光。在这篇Nature Method的文章中(指Sims, P.A., Greenleaf, W.J., Duan, H. & Xie, X.S.. Nat. Methods 8, 575&ndash 580 (2011).)，谢晓亮和他的同事们推出了一种新型的测序技术，这种技术兼顾焦磷酸测序的简单流程和荧光检测的稳定信号，这使得高精确度并循环周期短的测序成为可能。　　单分子荧光酶学的开端要追溯到十多年前，当时谢晓亮作为美国太平洋西北国家实验室的一位研究员，正在研究表征单个酶分子活性的方法，为此，他和同事曾应用过一个含有可发荧光的吖啶黄素基团的酶。那时，诸如 Helicos和Pacific Bioscience等公司也刚刚宣布了他们的DNA单分子测序计划。谢晓亮对把单分子酶学应用于DNA测序领域很感兴趣，但由于他已经在哈佛就职，这个想法仅仅被搁置于专利层面。&ldquo 我需要学着做个教授&rdquo ，谢晓亮说。　　谢晓亮偶尔会尝试把基于荧光基团测序的想法推荐给一些研究生或博士后，但是年轻的科学家们通常不大敢尝试这一想法。&ldquo 提些建议对我来说是很容易的，因为我有很多项目，总有一些会成功的&rdquo ，谢晓亮解释道，&ldquo 但是对学生来说这是个很大的赌注，并不是所有人都敢于接受这种挑战。&rdquo 一位四年级的研究生Peter Sims听说了这个想法，当即接受了这个挑战，尽管当时他完全可以由单分子马达在活细胞的研究来获得学位。 Sims表示这种潜在的高通量测序激发了他的浓厚兴趣，但是对于所需的在核酸上修饰荧光基团的化学工作，他还没有经验。&ldquo 他当时刚刚涉足于此，才开始学习&rdquo ，谢晓亮说。谢晓亮和Sims共同商定了一个期限，如果Sims在此之前还没有获得显著的成绩，他就退回到原来的课题上，开始写毕业论文。　　捕捉荧光信号就像成功产生荧光一样重要。在博士后William Greenleaf帮助下，他们解决了这个难题。&ldquo 微反应容器和荧光化学二者的结合，便是这项测序新技术的精髓。&rdquo 谢晓亮说。Greenleaf设法加工出了这些含有微反应容器的芯片，它是由可以重复密封的聚二甲基硅氧烷(PDMS)聚合物制成。谢晓亮说，没有这种材料，他的实验室的研究人员不可能做出这种尝试。&ldquo 我想把推广PDMS的功劳归于George Whitesides(George也在哈佛大学工作)&rdquo ，他说，&ldquo 基于PDMS我们才能够制作出各式各样的芯片上的实验室，而且他们真的很好用。&rdquo 　　但是研究进展并非一帆风顺。在后来的实验中，含有荧光基团的分子总是会扩散到PDMS 中或是产生一些不可信的伪信号。实验室的另一位成员段海峰加入了他们的小组，负责合成新型的荧光分子。此时，Sims和谢晓亮定下的期限也快到了，但他们仍没有做出很好的结果。　　Sims和Greenleaf制定了另外一项计划，但是仅仅是对多拷贝的DNA测序而并非单分子测序。当时谢晓亮正在苏格兰出差，一天深夜他和Sims进行了一次电话长谈，讨论Sims是否应该退回到原来的项目来写毕业论文。谢晓亮回忆道： &ldquo 那真费了我好大一笔电话费。我说，&lsquo Peter，请你再想想，我们再尽快地尝试一下，如果你真的做到了，学术界将对你的毕业论文产生极大的兴趣。&rsquo &rdquo 几周后，他们果真拿到了数据，并且Sims在他的答辩中成功地阐述了这种测序方法。谢晓亮富有哲理地说：&ldquo 你开始一直在对着一堵墙作战，后来你稍微改变了方向，这就大不一样了&rdquo 。Sims也有另外的动机，他曾和谢晓亮开玩笑说，&ldquo 我做这个只是想毕业。&rdquo 　　虽然这项测序技术本身还是基于DNA扩增的，但谢晓亮希望它能为通用单细胞基因组测序提供一条道路。谢晓亮说：&ldquo 尽管我们的技术并不是我最初希望的DNA单分子检测，但它依然为单细胞中DNA单分子测序提供了可能。&rdquo

单细胞测序技术以前所未有的分辨率揭示了细胞组成和功能状态的异质性，已广泛应用在肿瘤、免疫、神经和发育生物学等研究领域。但现有的高通量单细胞测序平台还存在一定局限性，基于液滴捕获的方法依赖泊松分布实现细胞-微球配对，存在大量空液滴不可利用，导致试剂浪费和细胞损失；基于微孔捕获策略的平台利用细胞重力沉降随机捕获，存在有限稀释导致的微孔利用率低的问题，且存在微孔交叉污染的可能性；此外组织解离过程中细胞破裂产生游离的mRNA导致背景干扰，掩盖细胞之间真实的异质性。为克服上述问题，德运康瑞自主研发成功打造出一款创新性的高通量单细胞测序平台Well-Paired-Seq。该平台包括自动化单细胞测序文库构建系统DECODER, 芯片试剂盒、反转录与扩增试剂盒、文库构建试剂盒及相关生信分析工具。Well-Paired-Seq基于双孔嵌套式芯片，协同局部准静态流体力学和尺寸排阻原理，实现细胞和编码微球高效精准“配对”，利用准静态流体力学特性有效清洗背景，具有高效的细胞捕获率、细胞/微球配对效率以及游离RNA去除等优势，实现高通量细胞捕获、高灵敏基因检出和单细胞高保真分子解析。Well-Paired-Seq高通量单细胞测序解决方案平台技术优势（1）高通量，单张芯片即可完成1万个细胞捕获和单细胞测序分析；（2）高灵敏，基因检出数量优异，且有效检出稀有细胞类型；（3）高效率, 细胞捕获效率稳定在60%左右，提高样本细胞利用率；（4）高保真，在芯片上直接清洗游离RNA等杂质，降低背景干扰；（5）高质量，专利技术减少微孔交叉污染还原细胞真实分子表达信息。小结Well-Paired-Seq高通量单细胞测序技术基于双孔嵌套式芯片的创新设计，在细胞捕获、细胞/微球配对、游离mRNA去除等方面具有出色的效率，并显著地降低了细胞损失和背景噪音，以较低的双胞率实现了高通量单细胞测序分析，在细胞捕获效率和基因检出数量等多项指标表现稳定并领先行业。德运康瑞始终立足自主创新，此次重磅推出整合硬件设备、捕获芯片、配套试剂盒和生信工具的高通量单细胞测序整体解决方案，为单细胞测序技术推向精准医学应用奉献中国创新智慧。关于德运康瑞苏州德运康瑞生物科技有限公司（http://www.dynamic-biosystems.com/）是一家单细胞与空间多组学技术平台型企业，围绕单细胞富集与检测、单细胞测序、空间多组学技术，满足不同应用场景下的分析需求，公司聚焦挖掘在肿瘤精准医学、优生优育以及药物发现领域的巨大潜力，致力于推动精准医疗向单细胞与空间组学时代迈进，助力生命科学和临床医学，为人类健康事业贡献中国智慧。

随着科学的发展，科学家们发觉许多群体细胞，完整个体水平的研究只是研究多种类细胞，多个细胞共同作用的“平均值”，淹没了细胞个体之间的差异。因此，针对单个细胞的研究技术，单细胞基因组学研究（Single Cell Genomics Study）成为生物学研究迫切的方向，并成为再生医学，发育生物学，肿瘤研究，免疫学研究必不可少的关键研究手段。 英国Dolomite Bio公司基于其已有的单细胞RNA测序系统和μEncapsulator细胞包裹系统取得良好的销售业绩及客户反馈。2017年11月，Dolomite Bio公司隆重推出Nadia单细胞自动制备仪，可平行运行1,2,4,8个样品， 每个样品18min内可生成6000个单细胞库；专为DropSeq方案设计；使用一次性试剂盒，防止污染；自动检测试剂盒状态，触摸屏控制，全自动运行。同时，添加Nadia创新平台，可以使用自己的试剂，开发新的方法，可调节液滴大小、频率、温度、搅拌和时间等参数，一旦条件摸索成功，可通过Nadia单细胞自动制备仪在相同条件下平行运行2,4,8个样品。 Nadia单细胞自动制备仪及其创新平台的问世，为单细胞研究者提供了更多、更灵活的研究手段，相信将在很大程度上推进肿瘤、免疫和发育生物学的研究在真正的单细胞水平取得更大的进展！

北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）、昌平实验室谢晓亮/曹云龙课题组联合北京大学生命科学学院肖俊宇课题组、中国科学院生物物理所王祥喜课题组、中国食品药品检定研究院王佑春课题组、南开大学沈中阳课题组于2022年6月17日在《自然》杂志在线发表了题为BA.2.12.1, BA.4 and BA.5 escape antibodies elicited by Omicron infection的研究论文，发现奥密克戎突变株BA.2.12.1、BA.4、BA.5新亚型呈现出更强的免疫逃逸能力，并且对奥密克戎BA.1感染者康复后血浆出现了显著的中和逃逸现象。研究人员通过高通量单细胞测序、分离并表征上千个新冠单克隆中和抗体后，发现奥密克戎BA.2.12.1、BA.4、BA.5进化出的新突变能够特异性逃逸BA.1感染所诱导产生的中和抗体。并且，奥密克戎BA.1感染存在“免疫原罪”现象，即BA.1感染主要唤起之前原始株疫苗所诱导的记忆B细胞，而很难产生特异性针对BA.1的中和抗体。这些发现提示，基于BA.1的奥密克戎疫苗可能已不适合作为现有免疫背景下的加强针，所诱导出的抗体对新变异株将不具有广谱保护效力。并且，由于新冠病毒存在“免疫原罪”现象并且可以快速进化出免疫逃逸突变位点，通过奥密克戎感染实现群体免疫是极难实现的。目前主要的奥密克戎变异株都具有较高的传播能力，为了研究其传播能力与刺突蛋白（Spike glycoprotein）构象和受体结合能力的关系，合作团队解析了奥密克戎变异株BA.2、BA.3、BA.2.12.1、BA.2.13以及BA.4/5刺突蛋白三聚体的冷冻电镜结构，并分别测定各突变体刺突蛋白或受体结合域（RBD）与hACE2的亲和力。结构分析表明，BA.4/5携带的F486V突变可能导致hACE2亲和力下降，但L452R和493Q回复突变降低了这一影响。研究结果显示BA.2.12.1、BA.2.13和 BA.4/5对hACE2的亲和力与BA.2相当。图1 奥密克戎各突变株Spike结构与RBD的hACE2亲和力研究发现，接种三针疫苗人群的血浆对BA.2.12.1和 BA.4/5的中和能力相比BA.2有大幅下降，且BA.1突破感染的康复者血浆对BA.2.12.1和BA.4/5的中和能力也有明显下降。流式细胞分析和单细胞VDJ测序结果说明，BA.1突破感染主要唤起人体内接种疫苗后产生的对原始株的体液免疫记忆，由此诱发的抗体可以同时中和原始株和BA.1，但对新变体的广谱中和活性不佳，这符合“免疫原罪”理论，提示基于BA.1的奥密克戎疫苗难以对新的突变体提供广谱有效的预防能力，可能并不适合作为现有人群免疫背景下的加强针（图2）。图2 疫苗接种者、BA.1突破感染康复者、接种疫苗的SARS康复者血浆对各毒株的中和活性对抗体药物的研究也印证了奥密克戎株新亚型高度的中和抗体逃逸能力，多数现存抗体药物对奥密克戎中和活性大大下降。BA.2、BA.4和BA.5携带的S371F、D405N和R408S位点突变导致大部分乙型冠状病毒广谱抗体（如S309）失活，而LY-CoV1404（Bebtelovimab）和COV2-2130（Cilgavimab）仍然对BA.2.12.1和BA.4/BA.5保持中和活性。此外，团队筛选出了一对表位不冲突的广谱乙型冠状病毒中和抗体组合SA58和SA55，该抗体对能高效中和包括奥密克戎株新亚型在内所有流行过的突变株，以及非典病毒，RaTG13，Pangolin-GD等Sarbecovirus病毒，有望成为兼具强效预防和治疗效果的药物（图3）。图3 现存抗体药物对各毒株的中和活性为了进一步探究奥密克戎突变株的中和抗体逃避机制，团队利用高通量深度突变扫描技术确定了1640 个与RBD结合的抗体的逃逸图谱、表位分布和对奥密克戎株中和功效，其中614个和411个分别来源于BA.1 康复者血浆和接种新冠疫苗的SARS康复者血浆。通过对逃逸图谱的无监督聚类，抗体分为A、B、C、D1、D2、E1、E2.1、E2.2、E3、F1、F2、F3 12类，数据表明属于同一类内的抗体有相似的结合抗原和中和特征，各类抗体的主要逃逸位点与该类代表性抗体在复合物结构中的结合表位一致（图4）。图4 原始株RBD抗体的表位分类及各类抗体特征614个来自BA.1突破感染康复者血浆的抗体中包括512个原始株/BA.1 RBD交叉结合的抗体，以及102个仅结合BA.1 RBD的抗体。交叉结合抗体主要富集于E2.1、E2.2、E3、F1等非ACE2竞争表位，其中E3和F1类抗体的中和活性普遍较差，E2.2类抗体中和活性一般，E2.1类抗体虽有较好的中和活性，但受携带L452Q 的BA.2.12.1和携带L452R的BA.4/5的影响，中和活性降低。仅结合BA.1的抗体则几乎都与ACE2竞争，具体的结合位点与结合原始株RBD的抗体大不相同，这表明BA.1 RBD的抗原性相比原始株RBD有很大变化。同时，这部分抗体被BA.2和BA.2.12.1的D405N及BA.4/5的F486V/L452R严重逃逸。这些结果单个抗体水平解释了为何BA.1突破感染的康复者血浆被奥密克戎株新亚型逃逸（图4、图5）。图5 BA.1 RBD特异性抗体的表位分类、中和活性及逃逸位点假病毒中和实验和结构分析表明，SARS-CoV-1/2 RBD交叉结合的广谱中和抗体集中分布的表位（E1、F2、F3）也都受到BA.2、BA.2.12.1、BA.2.13和BA.4/5所携带的S371F、D405N、R408S突变的影响。其中E1类抗体由于S371F引起的局部构象变化导致亲和力下降，F2/F3类抗体多数被D405N和R408S突变逃逸。这表明乙型冠状病毒B支系（sarbecovirus）的广谱中和抗体也在很大程度上被奥密克戎BA.2、BA.2.12.1、BA.2.13和BA.4/5变异株逃逸（图6）。图6 乙型冠状病毒B支系广谱中和抗体的中和活性、结构特征及逃逸位点本研究展示了联合高通量单细胞测序技术和高通量深度突变扫描技术在抗体筛选表征工作上的强大应用潜力，结合逃逸图谱聚类和各个表位代表性抗体的结构分析，成功在单个抗体水平上解析出奥密克戎BA.1株突破感染康复者血浆中抗体的表位分布，以及奥密克戎株新亚型逃逸各类中和抗体的物理化学机制，并构建出新冠病毒RBD抗体结合表位、逃逸图谱、中和活性的综合数据库，为后续抗体药物和广谱疫苗的研发提供数据支撑。论文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-022-04980-y

—“HW—TORNADO龙卷风”系列大连华微生命科技有限公司（Dalian Life Huawei Technology Co., Ltd.）（以下简称大连华微），是一家拥有自主知识产权，集研发、生产、销售及服务为一体的微流控系统一站式解决方案供应商。大连华微推出“HW—TORNADO龙卷风”系列单细胞液滴制备、混匀、检测、柔性操控与分选综合控制系统，引起业内客户高度关注。“HW—TORNADO龙卷风”系列产品，全球业内具有特色的“N×”阵列式并行模块单元结构，可积木式定制扩展，针对细胞、细菌、酶、病毒、蛋白、线虫等尺寸在0.1微米至2000微米范围的活性生物颗粒，实现高通量筛选：5亿×N个液滴/日（N=1,2,4,8,16…选用阵列数，理论上速度可任意增加）；对尺寸在100纳米至2毫米米范围的生物颗粒进行液滴包裹、检测、分析及筛选，可删除空液滴，实现单个液滴只包含一个细胞、菌、酶（或其它生物颗粒）；多频激光（405/488/532/561/638等）可根据用户需求配置，共聚焦实时协同作业，并可实现灵活的更换和快速升级；触摸屏软件，智能识别，实现自动化的操作处理；系统可根据客户需求定制生物芯片，实现液滴检测、混匀，以及无损操控与筛选。 大连华微成立伊始，就定位于世界前沿科技的研发与生产，其自主研发的“细胞、菌、酶液滴高通量制备、检测及柔性筛选系统”秉持民族品牌，已经发展5个系列数十种型号，成为业内知名、拥有完全自主知识产权的单细胞液滴自动化控制产品。公司本次重磅推出的：阵列式100%单细胞-巨高通量柔性筛选系统“HW—TORNADO龙卷风”系列，支持全面广泛的应用及科研需求，涵盖单细胞基因测序、基因编辑、细菌分选、药物筛选、疾病诊断、酶活筛选、基因文库构建等多个重要领域。 近一两年，国内出现很多仿制的实验室DIY型“分选系统”——依靠国外成型的功能组件、电源、信号控制部件搭接而成，智能程度低、可靠性差、误差不可控，分选过程对生物颗粒活性影响不可逆，且操作繁琐。最重要的：如果采购这种DIY型“产品”，一旦其进口电源、主控功率部件出现故障或损坏，DIY供应者无法修复，只有更换，且更换成本极高（至少需要RMB十万元以上，维修周期超过两个月，如西方限制进口则无法继续使用）。华微产品源于元器件级别的自主研发，客户众多，质量经过中科院、三甲医院、985高校等高端客户应用及检验，产品可靠性、柔性控制的性能远优于上述DIY型“产品”。华微产品除保修一年外，部件还终身享受成本价格换修（最贵的单个元件更换，不高于前述DIY供应者换修价格的三分之一），维修周期一般不超过一周，自主研发产品不存在受西方限制的核心组件，可大幅节省客户后续使用成本,这是拥有自主核心技术的底气。大连华微生命科技有限公司，依靠自有专利技术，立足独立研发民族品牌，致力于国际前沿领域的微流体控制科技产品的研发与生产，历经十年的探索磨砺，为中国乃至世界的业内客户带来全新的选择。未来公司将一如既往地重视创新科研，与广大华微客户一起携手进步，共同推动着中国生命科学的发展，做世界细分领域有话语权的中国高科技民族企业。关于华微生命科技：大连华微生命科技有限公司，坐落于素有中国“浪漫之都”之称的海滨城市大连高新区火炬路，是大连市第六批“海创工程”企业；成立伊始，就定位于世界最前沿科技的研发与生产，提供生物技术、生命科学、医疗健康、环境保护等领域的专业设备、耗材、服务，以及相关完整解决方案。

单细胞多组学技术已成为生命科学的有力工具，但一个精准、低损伤、广谱适用、简捷的目标表型单细胞获取手段，是靶向性单细胞基因组、转录组、蛋白质组或代谢物组分析的先决条件。近日，青岛能源所单细胞中心发明了光镊辅助静态池成像分选技术（OPSI），能“所见即所得”、保持细胞原位活性、高通量地分选明场、荧光、拉曼成像下的目标单细胞，支撑高质量的单细胞基因组/转录组测序。该技术对于细菌、古菌、真菌、动植物、人体等各种大小的细胞均广谱适用。相关工作发表于微流控领域国际权威期刊《芯片实验室》Lab on a Chip。OPSI技术服务单细胞多组学研究明场图像、荧光图像、拉曼光谱均可反映细胞丰富的表型信息，汇集上述信息并具备单细胞精度索引、所见即所得特点的单细胞分选技术，在单细胞分析工作中具有广泛的适用性。单细胞中心前期基于单细胞拉曼光谱技术，开发出液相环境中测量与分选菌群中目标微生物单细胞的拉曼分选-测序技术RAGE-Seq（Raman-activated Gravity-driven Encapsulation and Sequencing；Xu et al., Small, 2020）。该技术可在无需标记条件下，通过拉曼光谱获得整个单细胞的化学物质指纹图谱，从而迅速识别活体单细胞的生理特性和代谢产物变化等，更重要的是借助其小体积分离反应的特点，可从单个细胞中得到几乎完整的全基因组信息，对微生物的功能鉴定和资源开发具有重要意义。然而该技术操作过程稍显繁琐，分选通量较低，对于大批量的单细胞分选与分析存在一定的难度。为解决上述问题，单细胞中心徐腾博士、李远东博士带领的研究小组，基于青岛星赛生物的单细胞微液滴分选系统EasySort Compact，在RAGE-Seq技术的基础上开发了基于OPSI的新一代的单细胞分选耦合培养/测序策略。不同于流式分选技术中细胞逐个流过窄通道后成像筛选的原理，OPSI提出了一种静态池成像分选的思路，即在微流控芯片中构建流速为0的稳定静态流场，对样本细胞进行限域，并在该流场内进行平面明场、荧光成像或拉曼扫描，选取目标细胞。之后通过低细胞损伤的1064 nm光镊将目标单细胞移出静态流场，并进行单细胞液滴包裹导出完成分选。该系统使细胞能够以精确索引的方式进行分类，“所见即所得”，并广泛适用于从细菌、古菌到人体细胞等不同尺寸大小的单细胞（直径1 ~ 40 μm）。验证试验表明，OPSI的单细胞分选准确率 99.7%，保证10~20细胞/min的分选通量，并高度保持了细胞活性。此外，OPSI继承了RAGE小尺寸分离反应的特点，显著降低了传统单细胞基因扩增中存在的歧化现象。例如，使用该系统分选人体MCF-7单细胞进行RNA-seq，可获得高质量和高可重复性的单细胞转录组谱。OPSI的通用性、方便性、灵活性和低成本等优势，为其在单细胞多组学研究中提供了广阔的应用前景。基于OPSI的上述特色，单细胞中心和青岛星赛生物合作推出了自动化、智能化的单细胞微液滴分选系统（EasySort Lego/Compact）系列产品，并与国际显微镜和显微光谱仪领军产商（如赛默飞Thermo Fisher Scientific、堀场HORIBA等）合作，在全球科学仪器市场进行推广。该工作由单细胞中心马波研究员和徐健研究员主持，与青岛星赛生物合作完成，得到了国家重点研发计划、山东省自然科学基金委和国家自然科学基金委的资助。（文/图 徐腾 刘阳）原文链接：https://doi.org/10.1039/D2LC00888BTeng Xu#, Yuandong Li#, Xiao Han, Lingyan Kan, Jing Ren, Luyang Sun, Zhidian Diao, Yuetong Ji, Pengfei Zhu, Jian Xu*, Bo Ma*. Versatile, facile and low-cost single-cell isolation, culture and sequencing by optical tweezer-assisted pool-screening. Lab on a Chip 2022.

随着单细胞测序技术的快速发展，科研工作者们可对每个独一无二的单细胞进行分析，认识到细胞间的异质性，深入了解如胚胎发育早期的分化特征、肿瘤微环境中的非均质性、罕见循环肿瘤细胞的转录组等等以往传统高通量测序方法难以攻克的领域。单细胞分析的应用已进入百花齐放的时代，涵括神经生物学、癌症、免疫学、微生物学、胚胎发育、临床诊断等多个领域。单细胞测序分析的第一步，即是单细胞样品的制备，同时确保其生物完整性不被破坏。高质量的样品制备影响着后续单细胞分析成功与否。高活性、无细胞碎片且均一的单细胞悬液可使测序结果在完整性、真实性、数据可重复性得到提升。最常见细胞分离的方法可用MACS磁珠或流式细胞仪进行目的细胞分选与富集。单细胞测序流程利用流式细胞分选法富集目的细胞群体缩小研究范围，对单细胞群体可进一步精细化解读。尤其在研究罕见细胞族群，单细胞测序前先以流式细胞分选富集稀有细胞，可大大增加实验数据真实性与可靠性。现今已有愈来愈多单细胞测序研究结合流式细胞分选，筛选目的细胞、过滤死细胞减少样本中無效细胞的比例，提高单细胞文库构建的成功率以及后续的数据质量，让单细胞测序更有深度与广度分析实验数据，推动进一步研究范畴。传统高压液滴分选仪分选单细胞传统液滴式流式细胞分选(Droplet cell sorter)，将目的细胞利用适宜的荧光标记。经荧光染色或标记的单细胞悬液，被高压压入流动室内，在鞘液的包裹和推动下，细胞被排成单列，以一定速度从流动室喷口喷出。通过相应荧光检测及充电，获得目的细胞，实现单细胞分离。然而操作过程中，分选的细胞相继受到高压、充电带有电荷、减压的刺激，常导致分选的目的细胞在分类过程中的损伤和溶解，活细胞回收率不高；即使回收的活细胞也因分选过程受刺激影响细胞基因转录图谱表现，无法维持其生物完整性。传统高压液滴分选仪进行单细胞分选Adapted from Technologies for Single-Cell IsolationInt. J. Mol. Sci. 2015, 16美天旎MACSQuant Tyto 革命性的细胞分选仪专利的微芯片技术，精准地控制阀门开合以进行细胞分选，该仪器的特性在于整个分选过程在一次性使用的全封闭样本舱(cartridge) 中进行，且无需鞘液、避免了样本污染和残留风险。上样简单、自动进行分选设置，无需操作人员进行高强度与长时间的培训就能轻松操作。由于实际分选过程都在样本舱进行，不会损失珍贵的样本材料；阳性和阴性分选组份均可在无菌洁净操作台内轻松回收。细胞不会受到高压、电荷及减压刺激，不同于传统的液滴分选仪，这种温和的分选方法可最大保持细胞活性和功能，即使经过多次分选，细胞活性也不会受影响，充分表明这种阀门介导的分选机制具有温和性质。美天旎MACSQuant Tyto细胞分选仪与样本舱功能示意图。A. 美天旎MACSQuant Tyto细胞分选仪；B. 样本舱；C.独特微芯片技术的分选示意图。单细胞测序前，使用美天旎MACSQuant Tyto细胞分选仪（MQ Tyto）进行目的细胞分选富集。分选过程不受到高压、电荷、减压与剪切力刺激，作用温和不影响细胞生物功能完整性，维持细胞基因转录图谱表现，提高细胞存活率与回收率。位于美国加州大学(University of California, Irvine- UCI)的Dr. Kai kessenbrock研究团队致力于研究机体正常组织内环境稳态和乳腺癌中的细胞通讯。他们在单细胞水平上系统性分析研究乳腺干细胞微环境(stem cell niche)中细胞通讯的机制和乳腺上皮組織内的异质性，进一步加深对早期肿瘤发生过程中系统性变化的理解；最终目的是开发用于早期检测的生物标记物以及改善乳腺癌的治疗策略。Dr. Kai kessenbrock团队在FVB小鼠取出小鼠乳腺组织，分别以美天旎MACSQuant Tyto细胞分选仪(MQ Tyto)与传统液滴式流式细胞分选(Droplet cell sorter)分离乳腺上皮细胞(CD49f+/EpCAM+)后，标记建库并进行单细胞测序；比较两种不同的流式细胞方法分选后，所获得的测序数据真实性与可靠性，也进行分选后的细胞培养，观察细胞存活与功能。小鼠乳腺上皮细胞分离与单细胞建库 (Data kindly provided by Quy Nguyen, UCI)1. MQ Tyto可有效分选出不同乳腺上皮细胞亞型（Luminal 1, Luminal 2, Basal-like subtypes），基因转录图谱完整呈现。聚类分析与差异基因热图展示2. 经由MQ Tyto分选，每个单细胞可捕获更多的mRNA数量(UMI)，获得更多可分析的基因数(Genes)；显示MQ Tyto保留了细胞的完整性。质控图3. 传统液滴式流式(Droplet cell sorter)细胞分选后细胞应激基因表现明显上调。这主要是来自于细胞分选操作过程中所受到的外力刺激，而非原始组织环境细胞的真实表现。应激基因表现量展示4. 细胞分选后，持续培养七天乳腺上皮细胞并形成乳腺球(mammosphere formation)进行计数。结果显示MQ Tyto组形成更多的乳腺球，表示其MQ Tyto分选后的上皮细胞维持其功能性与高存活率。综上，利用MQ Tyto对目的细胞进行分离与富集，作用温和不影响细胞生物功能完整性，维持细胞基因转录图谱表现，提高细胞存活率与回收率，开启单细胞测序成功的第一步。

为了满足考察自然界中细胞“原位功能”这一共性科学需求，“现场”、“实时”的单细胞分选与测序已成为生命科学装备研制领域的一个重要发展趋势。尽管第三代测序技术已实现仪器微型化，但与测序对接的单细胞精准分选装备却仍然相当笨重和昂贵，难以支撑各种科学考察中针对微生物组功能的现场分析。最近，中国科学院青岛生物能源与过程研究所单细胞研究中心研究员马波带领的微流控系统团队，通过设计简易高效的单细胞分选与测序对接装置，实现了每个试管有且只有一个细胞(One-Cell-One-Tube)，有望服务于“现场”、“实时”乃至“便携式”的单细胞分选与测序。　　与人体和高等动植物细胞相比，微生物细胞通常更小(0.1-10 微米)，更加难于精准操纵，因此分离获取目标单细胞、并且实现测序反应要求的“One-Cell-One-Tube”是一个关键难点。目前的自动单细胞分离方法大多依赖于昂贵且体积庞大的荧光流式细胞分选仪(FACS)，而现有的手动单细胞分离和测序方案在依赖于操作人员熟练程度的同时，同样需要显微单细胞移液平台、激光光镊等同样难以随身携带的大中型仪器。此外，单细胞分选及核酸制备过程极易受到环境中飘浮微生物及其DNA的污染，而且这种污染通常难以在测序数据处理环节完全去除。因此，尽管目前MinION等第三代测序仪已经实现了便携化，微生物单细胞分选和测序仍然操作繁琐、污染干扰严重，难以满足要求。　　针对上述挑战，青岛能源所单细胞中心张强和王婷婷等发明了一种名为“FOCOT”(Facile One-Cell-One-Tube的缩写)的方法，能够精确、高速、低成本地分离、获取与分装单个微生物细胞，从而与单细胞测序直接对接。该方法具体为：首先，通过微流控技术，将细胞分散包裹在数十微米直径的油包水微液滴中 其次，基于液滴显微光学成像识别技术，分选出单细胞包裹液滴 第三，将单细胞包裹液滴顺序分布于系列试管中，从而快速实现单个细胞的分离，以及每个试管有且只有一个细胞，以实现与单细胞全基因组扩增与测序的直接对接。　　FOCOT平台主要有三个特色。第一，在简易方便方面，FOCOT平台除自行设计的芯片之外，仅需要电磁阀、平板电脑和普通光学显微镜，不需外接任何高成本商品化仪器平台，具有易获取、易替换、低成本等优势。同时，模块化、小型化、操作简便的设计使得该装置适合在自然环境实地采样条件下的携带、装配和使用，也几乎不需要额外的人员培训和技术维护，因此尤其适用于面向各种极端自然环境的科学考察，也有利于在普通实验室的推广应用。第二，在分选高效方面，FOCOT平台通过显微镜下对包裹有单个细胞的液滴的准确识别和分选，能有效避免假阳性 而且其20秒/个的分选速度，与显微单细胞移液、激光光镊等现有的商品化分选装备相比具有明显优势。同时，单细胞获取率高于90%，培养成功比例至少80%，证明该方法能有效避免芯片表面吸附所导致的输运过程中细胞流失，而且对细胞活性没有或较小损伤。第三，在污染控制方面，FOCOT平台涉及部件少，体积小型化，相对封闭，因此在实验过程中能够方便地实现超洁净环境空间控制、芯片消毒等操作，严格控制环境DNA的污染。对分离获取的单个酵母细胞进行全基因组扩增与测序后结果显示，99%的有效序列可以与参考基因组匹配，表明该方法能有效避免环境中微生物带来的DNA污染，平均基因组覆盖率达到43.3%，与在昂贵的超净空间设施中采用FACS等大型仪器系统分离获取单细胞所获得的测序结果相当。　　目前，通过耦合FOCOT与中心前期开发的单细胞拉曼成像、拉曼流式细胞分选等技术，单细胞中心正在构建一个服务于岸基、船基乃至手基等不同需求的非标记式单细胞分析装备体系，以服务于能源、环境、健康、海洋、土壤等诸多微生物组应用领域。　　相关研究论文发表在《科学报告》上。研究工作由单细胞中心马波和徐健共同主持完成，获得了国家基金委科学仪器基础研究专项、面上项目和中科院生物高通量分析技术服务网络(STS)等项目的支持。　　论文信息：Development of a facile droplet-based single-cell isolation platform for cultivation and genomic analysis in microorganisms. Sci Rep, 7:41192, DOI: 10.1038/srep41192。FOCOT方法示意图

为了满足考察自然界中细胞“原位功能”这一共性科学需求，“现场”、“实时”的单细胞分选与测序已成为生命科学装备研制领域的一个重要发展趋势。尽管第三代测序技术已实现仪器微型化，但与测序对接的单细胞精准分选装备却仍然相当笨重和昂贵，难以支撑各种科学考察中针对微生物组功能的现场分析。最近，中国科学院青岛生物能源与过程研究所单细胞研究中心研究员马波带领的微流控系统团队，通过设计简易高效的单细胞分选与测序对接装置，实现了每个试管有且只有一个细胞(One-Cell-One-Tube)，有望服务于“现场”、“实时”乃至“便携式”的单细胞分选与测序。　　与人体和高等动植物细胞相比，微生物细胞通常更小(0.1-10 微米)，更加难于精准操纵，因此分离获取目标单细胞、并且实现测序反应要求的“One-Cell-One-Tube”是一个关键难点。目前的自动单细胞分离方法大多依赖于昂贵且体积庞大的荧光流式细胞分选仪(FACS)，而现有的手动单细胞分离和测序方案在依赖于操作人员熟练程度的同时，同样需要显微单细胞移液平台、激光光镊等同样难以随身携带的大中型仪器。此外，单细胞分选及核酸制备过程极易受到环境中飘浮微生物及其DNA的污染，而且这种污染通常难以在测序数据处理环节完全去除。因此，尽管目前MinION等第三代测序仪已经实现了便携化，微生物单细胞分选和测序仍然操作繁琐、污染干扰严重，难以满足要求。　　针对上述挑战，青岛能源所单细胞中心张强和王婷婷等发明了一种名为“FOCOT”(Facile One-Cell-One-Tube的缩写)的方法，能够精确、高速、低成本地分离、获取与分装单个微生物细胞，从而与单细胞测序直接对接。该方法具体为：首先，通过微流控技术，将细胞分散包裹在数十微米直径的油包水微液滴中 其次，基于液滴显微光学成像识别技术，分选出单细胞包裹液滴 第三，将单细胞包裹液滴顺序分布于系列试管中，从而快速实现单个细胞的分离，以及每个试管有且只有一个细胞，以实现与单细胞全基因组扩增与测序的直接对接。　　FOCOT平台主要有三个特色。第一，在简易方便方面，FOCOT平台除自行设计的芯片之外，仅需要电磁阀、平板电脑和普通光学显微镜，不需外接任何高成本商品化仪器平台，具有易获取、易替换、低成本等优势。同时，模块化、小型化、操作简便的设计使得该装置适合在自然环境实地采样条件下的携带、装配和使用，也几乎不需要额外的人员培训和技术维护，因此尤其适用于面向各种极端自然环境的科学考察，也有利于在普通实验室的推广应用。第二，在分选高效方面，FOCOT平台通过显微镜下对包裹有单个细胞的液滴的准确识别和分选，能有效避免假阳性 而且其20秒/个的分选速度，与显微单细胞移液、激光光镊等现有的商品化分选装备相比具有明显优势。同时，单细胞获取率高于90%，培养成功比例至少80%，证明该方法能有效避免芯片表面吸附所导致的输运过程中细胞流失，而且对细胞活性没有或较小损伤。第三，在污染控制方面，FOCOT平台涉及部件少，体积小型化，相对封闭，因此在实验过程中能够方便地实现超洁净环境空间控制、芯片消毒等操作，严格控制环境DNA的污染。对分离获取的单个酵母细胞进行全基因组扩增与测序后结果显示，99%的有效序列可以与参考基因组匹配，表明该方法能有效避免环境中微生物带来的DNA污染，平均基因组覆盖率达到43.3%，与在昂贵的超净空间设施中采用FACS等大型仪器系统分离获取单细胞所获得的测序结果相当。　　目前，通过耦合FOCOT与中心前期开发的单细胞拉曼成像、拉曼流式细胞分选等技术，单细胞中心正在构建一个服务于岸基、船基乃至手基等不同需求的非标记式单细胞分析装备体系，以服务于能源、环境、健康、海洋、土壤等诸多微生物组应用领域。　　相关研究论文发表在《科学报告》上。研究工作由单细胞中心马波和徐健共同主持完成，获得了国家基金委科学仪器基础研究专项、面上项目和中科院生物高通量分析技术服务网络(STS)等项目的支持。　　论文信息：Development of a facile droplet-based single-cell isolation platform for cultivation and genomic analysis in microorganisms. Sci Rep, 7:41192, DOI: 10.1038/srep41192。FOCOT方法示意图

近年来，单细胞基因组学是十分热门的研究方向，以“三高”著名——高逼格、高门槛、高分文章。此外，对于下游测序公司来说，还存在高利润的优势。单细胞基因组学在免疫学、肿瘤学和神经学研究等各个科学领域发挥着关键作用。2013年，Nature杂志将年度技术授予了单细胞基因测序，认为该技术将改变生物界和医学界的许多领域。单细胞基因组研究主要技术单细胞基因测序主要步骤为：单细胞的分离--DNA/RNA的提取和扩增(全基因组扩增和全转录组扩增)---测序以及后续的分析和应用。其中，单细胞的捕捉和分离是第一步，具有一定挑战性，目前主要包括流式细胞术、激光捕获显微切割技术和微流控技术。全基因组和全转录组扩增是单细胞测序的难点，近几年也取得了较大突破，目前扩增技术已逐渐成熟。全基因组扩增技术主要有：简并寡核苷酸引物PCR扩增(DOP-PCR)，多重置换扩增(MDA)；和基于多次退火和成环的扩增循环(MALBAC)几种技术。全转录组扩增技术，从PCR扩增（SMART-SEQ2等）到IVT扩增（CEL-SEQ2等），到现在的高保真DNA聚合酶扩增（SPLIT-SEQ等）。单细胞测序上游市场及主要供应商由于单细胞基因测序技术的应用前景被广泛看好，多家上游科技企业纷纷投入研发单细胞基因测序产品，2017年以后，更多商业化单细胞测序平台陆续走向市场。目前，国外品牌在单细胞基因组学技术中占主导地位，包括10x Genomics、伯乐、富鲁达、Illumina和凯杰、BD、安捷伦等。2020年，全球单细胞基因组学产品的销售额为5.19亿美元，预计到2025年将以高个位数的年复合增长率增长。富鲁达的 C1平台，是世界上第一个商业化的用于基因组学研究的自动化单细胞样本制备系统。通过采用创新的微流控专利技术，能够快速可靠地分离、处理、并对单细胞进行基因组分析。利用微流控芯片(IFC)，可快速捕获并实现96或800个单细胞的核酸样本制备。一步法完成从捕获、裂解到逆转录和预扩增的过程，进行各类单细胞测序建库。该平台的商业化开始让更多人涉足单细胞测序领域，但该技术成本较高，通量相对较低，目前一些非RNA类单细胞测序仍会采用该技术。Fluidigm C1平台10X Genomics是一家年轻的公司，于2012年成立，2019年9月在美国纳斯达克上市，同年营业收入为2.46亿美元，一开始就专注于单细胞测序。2016年2月10X Genomics推出主要产品Chromium单细胞转录组测序平台，该平台利用微流控、油滴包裹和baecode标记等技术来实现高通量的细胞捕获技术，能够一次性分离、并标记500–10000个单细胞，从而获得每个细胞的3’端的转录组信息。10X Genomics 近两年也多次陷入专利纠纷的官司中，2020年后，其单细胞测序产品 Chromium开始全部使用Next GE微流控芯片。为了解决常规测序系统读长限制所带来的的无法满足组装、结构变异、多态性等问题，10X Genomics推出了GemCode平台，通过条形码信息将Illumina短序列再次连接，获得更有研究价值的长片段信息。10X Genomics还推出了升级版的Chromium系统，在GemCode的基础上整合单细胞测序。每次实验可分析1000至10000个细胞，增加了检测稀有细胞的灵敏度和准确度。10X Genomics Chromium单细胞测序产品BD Rhapsod单细胞捕获系统比10X晚一年推出，2018年3月进入中国市场。BD Rhapsod平台采用分子标签技术，为单细胞中每个转录本标记特异性分子标签，实现单细胞水平上基因表达谱的绝对定量。平台源于Cytoseq蜂窝板技术，采用20万+个微孔（远超过细胞数量，目的就是为了一孔一个细胞），因此可以叫做“微孔捕获”，效率更高。捕获后也是裂解细胞，再进行mRNA抓取。结合Rhapsody特有的单细胞分离技术，单次实验可制备100-10000个单细胞文库，用户可根据需求定制引物，将检测范围集中在目标基因，大幅降低后续测序成本。BD Rhapsody单细胞分析平台2017年1月，Illumina和伯乐在JP摩根健康大会上发布了Illumina Bio-Rad Single-Cell Sequencing Solution。该综合解决方案是单细胞分析的第一个新一代测序(NGS)工作流程。解决方案包括ddSEQ™ Single-Cell Isolator和SureCell™ WTA 3’Library Prep Kit。伯乐最好的液滴分离技术，Droplet Digital™ 技术，可以对单细胞进行隔离和编制条形码，然后在Illumina的许多主要NGS仪器上进行下游测序。全面的工作流程解决方案包括使用BaseSpace Informatics Suite，Illumina的云端基因组学计算环境进行初级和中级数据分析，使用流式细胞分析技术的领先公司FlowJo, LLC所开发的SeqGeq™ 进行高级数据分析和可视化处理。该测序系统可一次性检测8个样本，每个样本可以得到500~10000个细胞，研究单细胞在组织功能、病情进展和治疗反应方面的协同作用。与其他高通量捕获平台相比：Illumina Bio-Rad捕获效率低，仅为3%，但测序成本相对较低。Illumina Bio-Rad Single-Cell Sequencing Solution包括全新的ddSEQ Single-Cell Isolato（与NextSeq 500合照）宝生物（Takara Bio），是一家集试剂、耗材、仪器和服务为一体的生物技术公司，旗下的Clontech品牌拥有单细胞RNA-Seq文库构建的核心专利——SMART技术，由此发展处单细胞全基因组扩增技术、高通量单细胞捕获分选技术等。2015年2月份，宝生物收购的Wafergen公司开发出ICELL8 Single-Cell System单细胞分选平台，平台基于微流控芯片的技术，ICELL8利用WaferGen SmartChip TE平台筛选细胞，平台拥有5184个反应孔，可进行单细胞RNA测序样本的制备、扩增、表达谱建库测序、生物信息分析，快速得到样本间的基因表达差异。该平台具有通量高，周期快等特点，解决了传统单细胞扩增中通量低，价格贵的问题，为需进行大量细胞捕获筛选的研究提供了高效单细胞分选平台。该平台的细胞捕获效率为30%，成本相对较低。ICELL8 Single-Cell System2017年11月，英国Dolomite Bio公司推出Nadia单细胞自动制备仪，可平行运行1,2,4,8个样品， 每个样品18min内可生成6000个单细胞库；专为DropSeq方案设计；使用一次性试剂盒，防止污染；自动检测试剂盒状态，触摸屏控制，全自动运行。Nadia创新平台，可以使用自己的试剂，开发新的方法，可调节液滴大小、频率、温度、搅拌和时间等参数，一旦条件摸索成功，可通过Nadia单细胞自动制备仪在相同条件下平行运行2,4,8个样品。此前，该公司已推出单细胞RNA测序系统和μEncapsulator细胞包裹系统。Nadia单细胞自动制备仪Namocell是专注于单细胞分离分选技术的生物仪器公司，其自主研发的微流体单细胞分离平台，在单细胞基因组产前基因筛查方面已有所应用。 单细胞分选分离仪是集流式细胞术和微流控技术于一体的新一代细胞分离技术，仪器能够通过光电检测系统，识别标有荧光抗体的目的细胞，在激光照射的后的微流体通道中，设有电子开关，能够将目的细胞所在液体捕获，并且单个分离出来。Namocell单细胞分选分离仪除了细胞分选、建库和测序的仪器产品，凯杰、安捷伦等公司也在单细胞基因组研究领域有所布局，凯杰公司有单细胞全基因组扩增试剂盒，安捷伦公司除了之前的高通量寡核苷酸微阵列芯片和试剂盒等产品外，就在今天（1月26日）还宣布与一家叫新格元的分子诊断公司合作，共同开发针对单细胞测序的一站式解决方案，其中安捷伦将提供质量控制产品仪确保获得高质量测序文库，同时可改进样品处理和文库制备流程。此外，还有众多初创公司瞄准单细胞基因组学市场，以下为来源于某网站的不完全统计名单：国内也有科研团队正在从事相关领域的研究。如2020年12月，厦门大学杨朝勇教授团队研发的Digital-WGS样品前处理平抬，可基于数字微流控的自动化处理功能来简化高性能单细胞的WGS。该平台集成了并行纳升体积多重置换扩增(MDA)的所有主要步骤，包括从单细胞分离到全基因组扩增(WGA)的自动处理。通过在DMF芯片上结合流体动力学和表面润湿性，无论细胞类型和输入如何，都可以通过液滴操作自动有效地(100%)分离单个细胞。Digital-WGS允许在所有步骤中对液滴进行可寻址的控制，以大大提高裂解效率和反应的均匀性。可寻址和非接触式工作流程减少了与污染物或内源性背景的竞争，从而提高了基因组模板的有效浓度，为执行单细胞测序提供了一种有效的途径，对于单细胞基因组测序有广阔的应用前景。小结总体来讲，单细胞基因组学市场的快速发展，主要得益于政府及科研单位的重视和资金投入、测序技术成本的降低以及RNA测序技术的进步。此外还有多组学分析的专门技术，涉及利用各种“组学”学科，如基因组学、蛋白质组学和转录组学来收集和分析复杂、大量的生物数据。虽前景大好，单细胞基因组学市场目前仍面临诸多挑战，如相较于群体细胞测序，单细胞样品的分离、获取难度会大幅度增加，由于管理大量测序数据输出而导致的潜在数据分析错误，相关企业卷入了各种涉及知识产权、并购和其他商业交易的诉讼案件，以及新冠疫情导致2020年初产品销售中断等可能存在的持续影响。目前，单细胞基因测序更多应用还处于基础科研阶段，预计到2025年，单细胞基因组学将在整个科学技术市场占有重要地位。

人体组织器官由具有不同细胞类型的异质细胞群组成。传统批量测序（Bulk Sequencing）方法仅能捕获器官与组织群体细胞成分的平均水平，或者只代表其中占优势数量的细胞信息，单个细胞独有的特性常常被忽略。近年来，随着单细胞测序（Single-cell sequencing）技术的发展，实现了单个细胞水平上DNA或RNA的测序，从而能够特异和精准地探索单个细胞的基因变异水平，弥补了传统批量测序的不足[1]。图1. 单细胞测序与传统批量测序比较[1]单细胞基因组测序技术，是在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项技术，广泛应用于癌症研究、胚胎发育、辅助生殖、细胞分化、免疫机制、微生物等生物医学方向的研究。本期主要对单细胞基因组测序的技术原理、技术流程、技术平台及其在生物医学领域的应用实例做简单介绍。技术原理单细胞基因组测序的原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基因组后进行高通量测序，揭示细胞间异质性的基因信息。技术流程单细胞基因组测序主要包括四个步骤，即单细胞分离→全基因组扩增→高通量测序→数据分析。目前单细胞基因组测序技术的发展依然面临两方面的技术挑战：一是易于分离和操作的单细胞分离工具（即第一步）；二是能够稳定复制单个细胞中微小核酸的方法（即第二步）[2]。2.1 单细胞分离从组织中将单个细胞分离出来是单细胞基因组测序的第一步。目前常用的单细胞分离方法主要有：有限稀释法、显微操作法、流式细胞分选术、激光捕获显微切割技术（LCM）、微流控芯片技术等，表1总结了上述提到的单细胞分离方法的原理和优缺点，在使用时可根据不同的科研需求及样品情况综合考虑选择适宜的分离方法[3,4]。表1. 单细胞分离技术分离方法原理优点缺点有限稀释法对细胞进行一系列的倍比稀释，最终使细胞处于单个状态，理论上每μL约1个细胞，然后用移液器吸取相应容积的细胞悬液进行单细胞分离。操作简便；成本低，一般不需要特殊的设备。分离效率低；需要研究人员排除大量空白孔和多细胞孔，费时费力；细胞分离过程依赖梯度计算，容易出现错误。显微操作法在高倍倒置显微镜下，利用显微镜操作器（手动或自动）实现单细胞分离。能够准确地控制单细胞的吸取与释放；可以从不同的发育阶段或多样化的群体分离单个细胞。通量低，需要大量的起始量；细胞特异性由显微镜决定，并利用微量移液管分离，可能不够准确。流式细胞分选术通过流式细胞仪，根据细胞特异性分子标志物或细胞光散射特性，分选出单个细胞或特殊细胞群，实现单细胞分离。通量高；基于细胞表面标志物的特异标记，能够确保特定细胞的分离；利用荧光标记可分离亚群。无法扩展到大规模项目；且需要流式细胞仪，设备昂贵。激光捕获显微切割技术（LCM）在显微镜下，从冰冻/石蜡包埋组织切片（或细胞固定在装配有可以激光脉冲激活的热塑膜的涂片）中分离某一类型细胞群或单个细胞，实现单细胞分离。无需解离组织，制备细胞悬液；能够直观准确、快速地获取单个细胞或单一细胞亚群；能够保留所分离细胞的完整性。需要适当的组织处理（冷冻保存或固定）；显微切割可能存在挑战；小的细胞可能难以分离；可能存在污染。微流控芯片技术通过微流控芯片隔离流动通道中的单个细胞从而达到单细胞分离的目的。通量高；上样体积小；周期短；可根据细胞表面标志物分离特定细胞。细胞大小必须均匀；消耗品昂贵。2.2 全基因组扩增（Whole-Genome Amplification , WGA）全基因组扩增是单细胞基因组测序的第二步。由于单个哺乳动物细胞中DNA的含量一般少于10pg，达不到测序仪的检测要求，因此在测序之前必须进行全基因组扩增（WGA）以获得足够的材料用于后续的文库制备。目前常用的全基因组扩增方法按原理可分为三类（见表2）[5-7]：基于聚合酶链式反应（PCR）的WGA方法{主要是简并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)}、多重链置换扩增法（Multiple Displacement Amplification , MDA）和多重退火环状循环扩增技术（Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles，MALBAC）等。表2. 全基因组扩增技术DOP-PCRMDAMALBAC原理基于PCR技术，通过加入部分简并的寡核苷酸引物与模板结合来实现扩增整个基因组的目的。基于恒温核酸扩增技术，恒温条件下，使用一条由6个随机碱基构成的随机引物与模板随机退火；紧接着在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下发生链置换反应，并最终完成扩增。结合了MDA法和PCR扩增法的特点，即由一组随机引物启动扩增（每个引物具有通用引物序列和随机碱基），随机引物与模板均匀杂交，随后在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下发生链置换反应，最终完成扩增示意图特点该方法实现了高度均匀的扩增，产物产量较高，操作较为简单；但仅产生基因组的稀疏覆盖，实验的条件需要较多优化。 MDA可以实现更好的基因组覆盖，产物片段长；但对模板质量要求高，可能产生非特异性产物。一种实现基因组广泛覆盖和均匀扩增的技术，灵敏度高，产物产量高。技术平台：目前，国内外研究机构使用的大规模单细胞测序技术平台主要有五种：Illumina® Bio-Rad® Single-Cell Sequencing Solution、BD Rhapsody™ Single-Cell Analysis System、10x Chromium Single Cell Gene Expression Solution、ICELL8 Single-Cell System和C1™ 单细胞全自动制备系统。国内也有多家企业进军单细胞测序领域，产品包括新格元自动化单细胞处理系统、万乘基因高通量单细胞测序平台、达普生物星海单细胞测序建库系统、墨卓生物高通量单细胞测序平台、德运康瑞痕量单细胞测序平台和原位测序平台等。各个平台各有特点，这里主要简单介绍一下两种应用较多的技术，即10X Genomics 公司的Chromium( 液滴法) 及 BD 公司的Rhapsody( 微孔法)。10x Genomics单细胞测序技术：10X Genomics单细胞测序起源自Drop-Seq技术，应用液滴微流体技术分选单细胞，将单个细胞与含有条形码（Barcode）和引物的凝胶珠一起包裹于油滴中；然后每个油滴中的凝胶珠溶解， 细胞裂解释放mRNA，通过反逆转录产生用于测序的带条形码的cDNA，cDNA在液体油层破坏后进行文库构建，使用测序平台对文库进行测序检测，即可一次性获得大量单细胞的基因表达数据。该平台具有“三高（high）两低（low）”的特点：即通量高，细胞捕获效率高，细胞活性要求高（大于90%），分析时长低，成本低。 图2. 10X Genomics Chromium Controller技术原理示意图3.2 BD Rhapsody单细胞测序技术：BD公司推出的这款Rhapsod™单细胞分析系统采用了Cytoseq分子标签技术，能为单细胞中每个转录本标记特异性分子标签，实现单细胞水平上基因表达谱的绝对定量。同时，将每个细胞标记上特异性细胞标签，实现了高通量平行建库。该技术在基因扩增和后续的测序部分等整体流程与10x Genomics单细胞测序技术相近，主要区别在于起始的单细胞分离和捕获技术。该技术并非基于微流控芯片技术，而是基于蜂巢板技术，基于微孔来保证单细胞的捕获，避免了10x Genomics单细胞测序技术中存在的概率碰撞对捕获效率从影响。细胞悬液经注入孔注入后，自然沉降到反应孔中，随后， 将磁珠同样由注入孔注入，即可在单个反应孔中捕获其中的细胞。微孔和纳米孔方法允许稀释的细胞悬浮液在每孔一个珠子和一个细胞的条件下与寡聚结合珠一起沉降到皮升大小的孔中，从而保证了单孔中是单细胞捕获。 图3. BD Rhapsody技术原理示意图4、应用实例：目前，单细胞基因组测序技术的应用可以归纳为两大类，即应用于人类细胞图谱研究和非细胞图谱研究。单细胞基因组学的优势就在于能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，反映细胞间的异质性。自2017年“人类细胞图谱计划”提出以来，单细胞测序技术已陆续揭示了多个组织器官的单细胞图谱，如通过对肾脏肿瘤进行单细胞测序，发现肾肿瘤细胞之间的突变频率和位置不尽相同，每个细胞的突变状态和转录情况也均不相同，表明肾肿瘤更加具有异质性，需要开发更加有效的细胞靶向疗法。2022年发表在Nature杂志上的研究，对人脑血管系统的单细胞图谱进行了分析，描绘出海马和皮质的脑血管细胞组成：内皮细胞、相邻的壁平滑肌细胞 (SMC) 和周细胞、血管周围的免疫细胞和星形胶质细胞等，这些细胞在大脑不同区域存在差异并沿动静脉轴变化，沿动静脉轴的细胞组成异质性产生了大脑健康所必需的功能分段的循环、代谢和渗透特性。揭示了人类大脑血管系统的细胞组成和分子特征，提示了阿尔茨海默病（AD）风险因素在人类中的进化转变，有助于对人类大脑健康基础的了解、疾病机制和治疗靶点的发现[8]。随着单细胞基因组覆盖范围扩大、通量提升以及多组学技术的不断进步，单细胞基因组学技术将为丰富发育谱系树、生殖细胞突变模式、癌症进化、基因组功能和微生物群落的分辨研究等提供策略[9]。参考文献：[1] Xia Y, Gawad C. Bringing precision oncology to cellular resolution with single-cell genomics[J]. Clinical and experimental metastasis, 2022(1):39.[2] Liang J, Cai W, Sun Z. Single-cell sequencing technologies: current and future. J Genet Genomics. 2014 Oct 20 41(10):513-28. doi: 10.1016/j.jgg.2014.09.005. Epub 2014 Oct 18. PMID: 25438696.[3] Wang Y, Navin N. Advances and Applications of Single-Cell Sequencing Technologies[J]. Molecular Cell, 2015, 58(4):598-609.[4] Gross A, Schoendube J, Zimmermann S, Steeb M, Zengerle R, Koltay P. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 2015 Jul 24 16(8):16897-919. [5] Gawad C, Koh W , Quake S R. Single-cell genome sequencing: current state of the science[J]. Nature Reviews Genetics, 2016.[6] Grün D, van Oudenaarden A. Design and Analysis of Single-Cell Sequencing Experiments. Cell. 2015 Nov 5 163(4):799-810.[7] 徐晓丽 吴凌娟.单细胞全基因组扩增技术与应用.[J]生物化学与生物物理进展 .2019.46(4)[8] Yang A C , Vest R T , Kern F , et al. A human brain vascular atlas reveals diverse mediators of Alzheimer's risk[J]. Nature, 2022, 603.[9] Evrony G D, Hinch A G, Luo C. Applications of Single-Cell DNA Sequencing[J]. Annual Review of Genomics and Human Genetics, 2021, 22(1).相关会议推荐：第六届基因测序网络会议来袭！六大会场，含单细胞和空间组学会场，点击下图免费报名！点击链接进入会议官网：https://www.instrument.com.cn/webinar/meetings/geneseq2023/

近日，Bio-Rad公司和Illumina公司达成合作协议共同开发针对单细胞的新一代测序工作站，单细胞分析领域在过去几年里发生着翻天覆地地变化，而两家公司的这项合作也将会对很多竞争性技术的企业带来一定影响。　　Illumina公司 CEO Jay Flatley在本周举办的摩根大通(JP Morgan)医疗会议上表示，这项合作被预期将会为单细胞分析带来一种具有成本效益、端到端、高通量且具有一定规模性的平台，公司这项合作计划预期将在2016年早些时候完成。我们认为结合两家公司的技术和知识产权将会为整个市场提供基本的产品需求。　　一旦这种新型工作站系统启动，其就会在短短几个小时时间内，以每个细胞1美元的价格来对10000个细胞进行分析。目前，公司并没有披露大概的总运行时间。基于这项合作协议，Bio-Rad公司也将开发出QX200仪器的修正版本及可产生微滴的试剂盒，这种微滴中将包括单细胞和条形码珠子。　　Bio-Rad公司高级副总裁Annette Tumolo在邮件中告诉GenomeWeb，公司目前正在开发新型仪器，这种新型仪器将利用公司的核心微滴分区技术来包裹细胞 在细胞裂解及细胞RNA同微滴中的珠子进行杂交后，乳浊液就会破碎，而且在一系列的样品准备步骤后，混合液就会进入到一种由Illumina公司开发的无菌文库准备过程中。测序过程完成后，数据就会流入到Illumina公司的BaseSpace平台中，BaseSpace是一种基于云服务的平台，其可以提供第三方及内部开发的生物信息学应用程序，以便被分析及报告。　　Flatley表示，这种工作站将会为整个市场提供最具有整合性的端到端的单细胞解决方案，同时在未来也会被进行有效的扩张来包括很多新型的应用 这项商业性的合作计划将会利用合作双方公司各自的渠道，即利用Bio-Rad公司销售修饰化液滴的生成工具，同时利用Illumina公司销售所有耗材，包括单一试剂盒中的液滴盒子(droplet cartridge)。　　两家公司目前在这项计划中已经取得了初步的进展，很多概念验证实验目前都已经进行了，而且样本中的细胞纯度都超过了90%，即包含了450个单一的细胞，利用大部分的RNA-seq方法都证明这些细胞具有良好的一致性。Illumina公司目前主要集中于围绕数字流体来改善开发工具的标准化 Flatley说道，目前公司的目的就是为第三方开发者提供新技术，从而帮助其利用数字流体技术来开发新的应用。　　目前在单细胞中进行的大量工作都很有必要利用小细胞数量来进行，而科学家们所开发的新型工作站也将会抑制这些细胞集群扩展成为大的细胞集群 早在2014年，Bio-Rad公司就已经收购了基于液滴测序的公司GnuBio，旨在进行临床新一代测序系统的商业化用途。但此次同Illumina公司进行合作与前者并无关联。　　目前在单细胞测序领域有很多公司，值得注意的是富鲁达(Fluidigm)公司是第一个开发并且进行产品推广的供应商 该公司发言人Howard High表示，我们在很多公司的公告中都发现他们都计划进入这个市场 该公司预计未来还有很多公司将会进入到这个飞速增长的市场中，从而扩大许多可用的解决方案。　　目前富鲁达公司的C1系统可以帮助科学家快速分离、处理并且对单一细胞的基因组进行分析，该系统可以同时分析多达800个细胞，还可以进行单细胞的mRNA测序，靶向DNA测序，进行全外显子组测序及基因组测序，同时还可以进行靶向基因表达及miRNA的表达特性研究。　　与此同时富鲁达公司还在瑞典和澳大利亚形成了全球的伙伴联盟来开启单细胞基因组中心 BD公司最近也发起了对但细胞基因组的细胞分类及分析研究，Qiagen公司同Cell Microsystems公司也达成了合作协议来开发分离且分析单细胞的商业化技术，同时WaferGen公司也早在去年10月份发起了一种名为ICell8的用于单细胞基因组学研究的单细胞系统。　　Cellular Research公司的Resolve系统预期会在2016年推出，该系统将和Illumina及Bio-Rad公司联合推出的工作站非常相似，用于对每细胞一美元的多达10000个细胞进行分析。

近日，天木生物DREM cell设备助力中国农大、清华大学完成蜜蜂肠道微生物单细胞高通量培养，实现菌株级别功能多样性研究。 各种不同的生态系统都存在微生物群落，典型的微生物群落包括土壤、海洋或江湖等环境微生物以及人体或动物肠道微生物等。其中，肠道微生物群越来越引起人类的重视，越来越多的证据表明人体肠道微生物群的组成和活性变化与多种疾病和生态表型有关，如糖尿病、肥胖、结肠炎和严重抑郁症等。因此，若研究肠道微生物与宿主的关系，则能够更好地了解肠道共生体对疾病的作用机制，指导从肠道微生物角度出发的新的治疗方法和策略的构建，以达到治疗或预防疾病的目的。 今年6月份，中国农业大学的郑浩团队和清华大学的张翀团队在 Microbiome 上发表了名为“Strain-level profiling with picodroplet microfluidic cultivation reveals host-specific adaption of honeybee gut symbionts”的研究论文，使用高通量皮升级液滴微流控细胞分选仪（DREM cell）开发基于液滴的微流控技术培养蜜蜂肠道微生物，验证了微流控液滴平台在肠道微生物培养组学中的可行性，为更复杂微生物群落的大规模研究铺平了道路。 （来源：Microbiome） 传统培养方式限制测序技术深入研究微生物的基因型和表型多样性复杂微生物群由多种微生物组成，这些微生物是多物种复合体的一部分。尽管属于同一属和种的微生物拥有一个共同的、且对于细胞功能和物种的生存至关重要的核心基因组，但它们仍然拥有相当数量的菌株特异性基因，导致它们在生理和毒性特性等方面的不同表型，这些差异菌株可能会在不同程度上改变肠道微生物群的功能，进而影响到宿主健康。 因此郑浩表示：仅在物种水平上研究微生物群落是不够的，需要深入调查基因型和表型的多样性。培养是微生物研究的基础方法之一，但实际上由于培养条件的不适合，或是缺少互利共生的个体，很少有微生物可以在实验室条件下轻松培养，对于复杂群落而言，往往也只能成功实现其中一部分占多数的，或快速生长菌株的有效表征，并且传统的培养方式通常是低通量的，丰富的菌株多样性往往会在这个过程中被掩盖。 幸运的是，越来越强大的测序技术出现了，该技术可更深入、更清楚地了解共生肠道微生物组的结构、功能和多样性。16S rRNA 基因测序（16S rRNA gene sequencing）和鸟枪法宏基因组测序（Shotgun metagenomic sequencing）是当前用于微生物群落分析的两种主要工具。 16S rRNA 基因测序一般用于通过选择性扩增和测序微生物 16S rRNA 基因的高变区来识别和分类微生物，可以通过相对少量的原始读长来获得有代表性的细菌分类学估计。其具有高通量，成本低的特点，并拥有相当多成熟的生物信息学工具。但这种方法的主要限制为分类群是根据基因组的单个区域的序列分配的，这导致了分辨率不足。此外，扩增引物的选择也影响很大，一些引物已被证明会导致特定分类群的代表性过高或过低，这可能导致对分类单元的表示存在潜在偏差。 鸟枪法宏基因组测序对从整个微生物群落中分离出来的所有微生物的基因组进行测序。它的优势在于通过收集有关广泛基因组区域的序列信息，能够支持在物种水平上进行更准确的定义，提供更高的分类分辨率。同时还能支持进一步进行菌株水平的重建，得到新的基因或基因组，并对它们进行功能注释和途径预测以产生微生物群落的详细描述。但这种方法成本较高，需要深度测序获得更高的覆盖度以达到令人满意的分辨率，以及更复杂的下游分析。“虽然基于测序的方法不限于可培养的微生物群，但 16S rRNA 基因测序方法在种内分析的分辨率上仍然极其有限，并且可能会被每个基因组的 16S rRNA 基因的多个不同拷贝混淆，这同样会造成对实际存在于环境中菌株功能的误判；鸟枪法宏基因组测序通过考虑更多标记基因或全基因组来提供更多信息，目前也已经开发了许多工具来分析宏基因组数据来解决这些问题，但来自取样时间的或空间的偏差往往需要更深的测序深度来弥补，但这也带来了急剧升高的成本。”郑浩说道。 液滴微流控平台可克服传统培养方式的缺陷因此，若有一种培养方法可突破传统培养方式的局限，则会大大减轻测序技术的压力。基于液滴的微流控平台或许是个不错的选择。液滴微流控微流控（Microfluidics）是指一种在微米尺度空间对流体进行操控的技术，在该技术下可以将化学、生物等实验室的基本功能微缩到一个几平方厘米芯片上，因此又被称为“芯片实验室”。作为微流控芯片研究中的重要分支，液滴微流控是一种在微尺度的通道内利用流动剪切力或表面张力的改变，将两种互不相溶流体中的离散相流体分割成纳升级及以下体积的微液滴，并驱动微液滴运动对其进行操控的技术。张翀表示：基于液滴微流控的特征，我们可以通过在直径为数十至数百微米并由不混溶的油和工程表面活性剂分割的介质液滴种划分微生物来消除群落培养中过度生长的快速增长种群的影响。由于微制造的物理孔或通道不会限制液滴，因此可以快速创建数百万个独立的培养系统实现单个肠道微生物体的高通量培养。这极大克服了传统培养方式的缺陷，为通过培养来表征来自肠道共生体的稀有类群提供了机会。为了证明微流控液滴平台在肠道微生物群研究中的可行性，郑浩和张翀团队将蜜蜂作为研究对象。原因是与其他动物相比，蜜蜂的肠道细菌简单且稳定，宏基因组分析也表明，虽然蜜蜂肠道由数量有限的细菌系统发育型组成，但仍然存在显著的菌株水平多样性，个别菌株具有独特的基因组潜力和关键能力，这些能力在功能上与宿主的营养代谢和健康相关，为在菌株水平分析肠道共生体与宿主关系提供了很好的模型。具体做法如下：首先，构建了一个微流体液滴平台，并产生了用蜜蜂肠道中的单个细菌细胞包裹的液滴；随后，收集液滴并进行孵育培养，确定了液滴中微生物的生长能力，宏基因组分析揭示了与常规测序方法相比蜜蜂肠道更高的菌株水平多样性，证明了微流体平台在分离和富集稀有微生物菌株方面的潜力。▲图丨微液滴生成（来源：郑浩）最后，结合分箱策略，得到了蜜蜂肠道微生物的大量基因组草图，并进行了功能预测和比较基因组分析。对双歧杆菌属的分析揭示了潜在分类单元的存在，它们在跨膜运输、肌醇利用以及多糖利用方面存在丰富的菌株多样性。研究人员还得到了来自 Lactobacillus panisapium 的新菌株，该菌种在以往的研究中被认为特异性来源于中华蜜蜂；通过进一步的基因组比较，发现来自西方蜜蜂的菌株中独特地含有一组与饮食阿拉伯糖利用相关的代谢基因簇，包括araf43A, rafB, abfA 和abfB，这可能与它对不同蜜蜂宿主的适应密切相关。 ▲图丨微流控液滴中蜜蜂肠道细菌的单细胞封装和培养（来源：研究论文）“总体而言，结果证明了基于液滴的培养在研究蜜蜂肠道微生物多样性方面的适应性，同时这种方法也有潜力适用于其他复杂群落，在稀有类群的获得以及功能鉴定方面发挥作用。”张翀说道。他补充道，对于肠道微生物，当前的研究主要集中在特定培养基质下的微流体液滴培养，结合 16s rRNA 扩增子测序以研究肠道微生物个体的膳食碳水化合物代谢或抗生素耐药性。我们的研究则着重于通过隔离培养以富集在常规状态下难以检测的稀有类群，结合宏基因组的测序和分析，以较高通量实现对肠道稀有微生物的发现，以及代谢途径和功能预测，提供关于宿主和肠道共生体关系的崭新理解。“未来，我们可能会通过调整液滴大小、改善培养条件和测序方法来研究肠道真核微生物，并实现对单胞的高通量识别，这将进一步扩大我们对肠道复杂成员的理解。同时，我们的流程也可以进一步应用于人类肠道共生体的研究，扩展对人类肠道稀有类群以及它们与健康关系的认知和了解。”相关产品 研究团队所使用的液滴微流控细胞分选仪（DREM cell）是天木生物基于液滴微流控技术开发的皮升级液滴微流控单细胞分选平台，可将待筛选细胞进行包被形成单细胞微液滴，结合荧光筛选模型，可以在细胞水平完成微生物的高通量分离、培养、检测、分选等。 ▲图丨液滴微流控细胞分选仪（来源：天木生物） ‍ 高通量皮升级液滴单细胞分选系统（DREM cell）相比于传统筛选方法，筛选效率可提升1万倍，试剂消耗量可下降至百万分之一，在筛选通量显著提升的同时，单克隆筛选成本大幅度降低。该仪器不仅可广泛应用于细菌、酵母、动物细胞等的高通量筛选，还可以应用于蛋白、核酸、抗体等生物大分子筛选等相关研究领域。 项目技术参数液滴体积1-1000pL荧光激发与检测可选波段：（1）激发波长488nm，检测波长525±15nm，灵敏度1μM荧光素/单液滴（2）激发波长532nm，检测波长578±11nm，灵敏度100nM试卤灵/单液滴液滴生产频率0-10000个/s液滴分选频率0-1000个/s微注入速度0-1000个/s样品低温控制系统4℃恒温控制，±0.5℃工作环境常压状态下，室温，30%≤湿度≤80%，洁净暗室整机功率600W应用范围细胞、酵母、细菌、蛋白、核酸等 参考资料：1.https://blog.csdn.net/woodcorpse/article/details/125118043具有菌株分辨率的高通量、单微生物基因组学，应用于人类肠道微生物组|科学 (science.org)

近日，测序领域发生一起大事——价值4000亿市值的国际基因测序巨头Illumina联手红杉中国，在上海张江成立的基因组学孵化器正式启用。这场基因测序全球领导者与领先投资机构强强联合打造的创新企业孵化平台引起业内人士的持续热议。经过层层选拔，孵化器选择了两家国内基因组学领域创新企业，而墨卓生物便是首批入住企业之一。墨卓生物成立于2018年，是一家“崭新”的企业，这里的“新”不仅是成立时间很近，更是指技术“创新”，他们选择被誉为颠覆性技术的微流控技术切入生命科学上游仪器领域。为深入了解国内创新型生命科学仪器企业，在11月初，仪器信息网生命科学团队联合“创新100”项目组、中国仪器仪表行业协会分析仪器分会，实地走访了浙江、江苏、上海的8家生命科学仪器研发创新企业，位于浙江嘉兴的墨卓生物便是此次走访的第一站。仪器信息网走访团队与墨卓生物团队合影（左三:墨卓生物联合创始人兼COO刘寒博士，右三:中国仪器仪表行业协会分析仪器分会秘书长曾伟高级工程师）硬核团队：院士领衔、哈佛归国三剑客创立 墨卓生物的核心创始人是一支朝气蓬勃的年轻队伍，其核心团队平均年龄仅为30岁！核心队伍在医疗器械研发领域已有较为丰富的项目经历和经验，团队硬核而专业的背景履历让走访团印象深刻。墨卓生物的首席科学家是由美国三院院士，也是微流控技术奠基人之一的David Weitz 担任。首席执行官（CEO）裴颢博士拥有十年微流体设计与产品经验，首席技术官（CTO）郑文山博士拥有八年单细胞测序研究经验，而首席运营官（COO）刘寒博士曾在全球顶级商业资讯公司麦肯锡担任医疗项目负责人，对医疗产品的商业逻辑有深刻的体会和见地。从左至右分别为墨卓生物首席运营官刘寒、首席执行官裴颢、首席技术官郑文山三位创始人均为哈佛大学博士，创始人专业优势互补，既拥有一流跨国医疗器械企业研发经验，也拥有产品商业化推广经验，可以说是一家“配置”齐全的高素质队伍。以微流控技术推动分子诊断技术的革新在交谈中，墨卓团队向我们表明了公司创立的终极目标——要以微流控技术推动分子诊断技术的革新。当前主流而前沿的分子诊断平台为荧光定量PCR（qPCR）和整体样本的二代基因测序（NGS）。然而从技术发展来看，这两大主流平台并不完美，仍有可以升级改进的地方。利用团队核心的微流控技术，可以将“更精密”、“集成”和“自动化”的技术特点加持到这两大分子诊断平台，使qPCR平台全面升级为数字PCR，二代基因测序仪从组织级别全面升级到单个细胞级别，从而大大提高生物信息获取的效率、准确性和研究深度。基于此，墨卓生物推出了基于微流控技术的MobiNova高通量单细胞测序平台和MobiGaea数字PCR一体机。单细胞测序平台墨卓团队将高通量的单细胞测序技术形象地比喻为“测序领域的显微镜”，传统的整体样本测序得到的是整体平均值，而单细胞测序可以得出精确到单个细胞的信息。此外单细胞测序可以高通量形式完成，实现大规模、高精度的解决方案。墨卓生物MobiNova高通量单细胞测序平台目前单细胞测序主要有两种核心的技术路径，一个是微孔法，一个是液滴法。两种技术路线各有千秋，但从商业转化角度来看，以微滴法为核心的平台在市场的推广无疑更成功。墨卓正是以微滴法为核心技术的关键一份子，且其独特的微流控技术路径可以让高昂的测序成本下降到不到市场主流平台价格的三分之一。数字PCR平台不同于传统PCR，数字PCR能够实现绝对定量，具有出色的灵敏度、特异性和精确性。该技术在药物研发、癌症筛查、疾病早期预防、肿瘤伴随诊断、液体活检、传染病检测、食品快检等诸多领域具有广阔的应用前景。墨卓生物MobiGaea数字PCR一体机墨卓推出的MobiGaea数字PCR一体机使用一体化全封闭体系，相较于大部分现有获证厂家的分体式设计，能更好的保障检测结果的一致性。且全封闭体系使系统在试验稳定性、抗污染性能方面能实现大幅提升。数字PCR系统灵敏度取决于液滴生成的数量，墨卓MobiGaea数字PCR生成液滴数可达百万级别，远高于市场平均的2万液滴，其灵敏度可以提高至少一个数量级。单细胞测序、数字PCR “双轮”驱动 最终目标是走向临床！科学仪器行业是一个研发周期长、技术壁垒极高的高风险投资项目，尽管如此，墨卓生物还是义无反顾切入这一领域，除了是看好生命科学技术在未来医学领域的发展，更深层的原因是他们已经规划好企业发展的每一个关键时期。前面提到，仪器研发周期及产品回报非常缓慢，那作为初创公司如何才能挺过仪器研发的这段艰难岁月？今年8月份，墨卓生物获得由华盖资本领投的1.5亿元A轮融资，在资本的参与下，公司能较为顺利度过仪器研发期。当然墨卓生物也没有辜负资本市场的青睐，相继推出了单细胞测序产品和数字PCR产品。墨卓生物位于嘉兴的试剂开发实验室墨卓把单细胞测序系统和数字PCR系统看作公司向前的“两个车轮”，认为这两个产品线的“双轮驱动”效应对于公司来说具有重要意义。中国单细胞测序市场广阔，且一旦单细胞测序应用进入制药市场和体外诊断市场，其前景更加不可限量。鉴于墨卓生物在单细胞测序领域的独特优势，短期来看公司便能够实现盈利、“吃饱喝足”。“但是我们的长远目标是走向临床！”选择数字PCR系统作为临床切入口，便是这一考量的深层原因。刘寒博士认为鉴于数字PCR技术本身在临床的特定优势，通过墨卓数字PCR产品能够打通公司进入医疗领域的路径。即通过墨卓在单细胞测序领域的业务支持数字PCR产品体系发展，当临床业务落地后又通过数字PCR业务在临床的积累，反哺单细胞平台及应用的开发和推广。“两个产品线有共性的地方，也有互补的存在，因此相互促进，相得益彰。”致力于做单细胞测序的国产替代在谈到公司未来的发展策略时，刘寒博士向我们介绍了墨卓生物想要重点攻克的三大方向。墨卓生物也将瞄准科研服务机构和药企研发部门这两类最大的目标客户，提供差异化解决方案。一是实现单细胞测序“高质、低价”的国产替代。单细胞测序主要应用的科研市场潜力巨大，相比数字PCR市场，单细胞测序领域市场竞争者并不多。目前10X Genomics产品在这一细分领域一家独大，但其价格和使用成本让不少用户望而生畏。墨卓单细胞测序的低价、高品质是用户期盼的单细胞测序国产替代方案。此外，当下国内整体舆论和政策环境对国产仪器研发厂商的友好程度史无前例，这将给墨卓带来极大机遇。二是开发新的热门应用领域。微生物是当前的热门研究方向，研究表明多类肿瘤都有独特的微生物组成，因此表征肿瘤微生物组对于解释肿瘤细菌对不同癌症标志的影响具有重要意义。基于此墨卓生物将推出世界上首个商业化的微生物单细胞测序系统，加深在微生物等前瞻性领域的科研布局。三是建立开创性的样本处理方法。世界上大约有数十亿份组织样品保存在医院或者组织样品库中，其中绝大多数是石蜡包埋的样品。数量巨大的样品蕴含着无限的科学研究机会，同时也是学者们很棘手的研究对象。福尔马林的固定容易使组织中的核酸发生不同程度的降解和分子间的交联，石蜡的高温渗入过程进一步加速核酸的降解，保存的时间及环境对样品中的核酸也有巨大的影响，从石蜡切片中提取出高质量基因组，并构建出信息完整、无偏好、可用于后续各类组学研究的文库，对于药企、临床研发等部门来说是一大难题。而墨卓生物致力于解决这一大临床难题，且近年来一直在突破。一旦关键技术得以攻克，这将是单细胞测序产品在临床的一大重磅应用。在访谈最后，墨卓团队表达了对于数字PCR市场的乐观看法：“数字PCR技术在肿瘤伴随诊断领域的应用绝对是一大爆点市场，但目前数字PCR技术在肿瘤诊断领域的应用并没有很好的推广开，根本原因还是同行并没有把数字PCR产品打造的十分完美。而IVD市场对于仪器品质、性能和使用便捷性等要求很高。”“我们非常看好dPCR在肿瘤伴随诊断、液体活检市场的应用，虽然应用开发和推广将充满挑战，但数字PCR将大放异彩！”【墨卓生物走访短片实录】PCR专场基因测序专场附：“创新100”介绍　　秉承“国产科学仪器腾飞行动”宗旨，仪器信息网于2018年启动“国产科学仪器腾飞行动”之“创新100”项目，通过筛选一批具备自主创新能力的中小仪器厂商，借助报道、走访、调研等方式，在企业发展的关键时期“帮一把”。　　项目自启动以来，已收到超过180家企业的踊跃申请，通过输出公益性的宣传报道，组织企业研学、参观交流、主题讨论等各类资源对接活动，得到广大科学仪器企业与用户单位的高度关注与一致好评，现已成为中国科学仪器市场颇具影响力的特色活动，对于提升国产仪器品牌影响力，为行业筛选优质仪器企业贡献重要力量。为延续“国产科学仪器腾飞行动”精神，筛选和服务更多国产科学仪器潜力企业，“创新100”将于2021年继续进行，为国产仪器企业输送更多公益资源。　　诚邀具备实力、符合条件的创新企业扫码申报“创新100”：　　如有疑问，欢迎咨询：　　邮箱：C100@instrument.com.cn　　电话：010-51654077-8129　　联系人：韦编辑　　更多活动详情，敬请关注“创新100”专题：https://www.instrument.com.cn/zt/chuangxin100-2021

p style="text-align: justify text-indent: 2em "大连华微生命科技有限公司（Dalian Life Huawei Technology Co., Ltd.）（以下简称大连华微）在业内率先推出“HW—TORNADO龙卷风”系列单细胞液滴制备、混匀、检测、柔性操控与分选综合控制系统，引起业内客户高度关注。/pp style="text-align: center"a href="https://www.instrument.com.cn/netshow/C378571.htm" target="_blank"img style="max-width: 100% max-height: 100% width: 386px height: 210px " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202004/uepic/db3d37f0-9eca-4460-bc35-a293604ec7cf.jpg" title="龙卷风 华微.jpg" alt="龙卷风 华微.jpg" width="386" height="210"//a/pp style="text-align: center "span style="text-decoration: underline "stronga href="https://www.instrument.com.cn/netshow/C378571.htm" target="_blank"单细胞分析_分选_滴内注液_龙卷风系列“HW-TORNADO/a（点击查看详情）/strong/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "“HW—TORNADO龙卷风”系列产品，全球业内独创的N× 阵列式并行模块单元结构，可积木式定制扩展，针对细胞、细菌、酶、病毒、蛋白、线虫等尺寸在0.1微米至2000微米范围的活性生物颗粒，strong实现极高的筛选通量/strong：5亿× N个液滴/日（N=1,2,4,8,16… 选用阵列数，理论上速度无上限）；对尺寸在100纳米至2毫米米范围的生物颗粒进行液滴包裹、检测、分析及筛选，可删除空液滴，实现单个液滴仅包含一个细胞、菌、酶（或其它生物颗粒）；多频激光（405/488/532/561/638等）可根据用户需求配置，共聚焦实时协同作业，并可实现灵活的更换和快速升级；触摸屏软件，智能识别，实现自动化的操作处理；系统可根据客户需求定制生物芯片，strong实现液滴检测、混匀，以及无损操控与筛选/strong。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "大连华微成立伊始，就定位于世界最前沿科技的研发与生产，其自主研发的“细胞、菌、酶液滴高通量制备、检测及柔性筛选系统”秉持民族品牌，已经发展5个系列数十种型号，成为国内唯一，国际领先的，拥有完全自主知识产权的单细胞液滴自动化控制产品。公司本次重磅推出全球领先的阵列式100%单细胞超高通量柔性筛选系统“HW—TORNADO龙卷风”系列，支持全面广泛的应用及科研需求，涵盖单细胞基因测序、基因编辑、细菌分选、药物筛选、疾病诊断、酶活筛选、基因文库构建等多个重要领域。/pp style="text-align: center"img style="max-width:100% max-height:100% " src="https://img1.17img.cn/17img/images/202004/uepic/855405f3-eec8-4fee-8d2e-85548ca7b48f.jpg" title="龙卷风 大连华微.jpg" alt="龙卷风 大连华微.jpg"//pp style="text-align: justify text-indent: 2em "近一两年，国内出现很多仿制的实验室DIY型“分选系统”——依靠国外成型的功能组件、电源、信号控制部件搭接而成，智能程度低、可靠性差、误差不可控，分选过程对生物颗粒活性影响不可逆，且操作繁琐。最重要的：如果采购这种DIY型“产品”，一旦其进口电源、主控功率部件出现故障或损坏，DIY供应者无法修复，只有更换，且更换成本极高（至少需要RMB十万元以上，维修周期超过两个月，如西方限制进口则无法继续使用）。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "华微产品源于元器件级别的自主研发，客户众多，质量经过中科院、三甲医院、985高校等高端客户应用及检验，产品可靠性、柔性控制的性能远优于上述DIY型“产品”。华微产品除保修一年外，部件还终身享受成本价格换修（最贵的单个元件更换，不高于前述DIY供应者换修价格的三分之一），维修周期一般不超过一周，自主研发产品不存在受西方限制的核心组件，可大幅节省客户后续使用成本,这是拥有自主核心技术的底气。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "strong关于大连华微生命科技有限公司/strong/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "大连华微生命科技有限公司（Dalian Life Huawei Technology Co., Ltd.），国家级高新技术企业，是一家拥有自主知识产权，集研发、生产、销售及服务为一体的微流控系统一站式解决方案供应商。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "大连华微生命科技有限公司，依靠自有专利技术，立足独立研发民族品牌，致力于国际领先的微流体控制科技产品的研发与生产，历经十年的探索磨砺，为中国乃至世界的业内客户带来全新的选择。未来公司将一如既往地重视创新科研，与广大华微客户一起携手进步，共同推动着中国生命科学的发展，做世界细分领域有话语权的中国高科技民族企业。/p

单细胞柔性高通量分选——超越进口仪器的独门绝技！——大连华微生命科技微流控优势技术综述 在生命科学、生物制药、环保以及医疗等领域，针对细胞（肿瘤细胞）、细菌（工程菌）、病毒、细胞团、酶、线虫等活性生物颗粒，在保证活性前提下，根据参数进行单细胞级、高通量、柔性分选分离，即高效筛选出特异性个体，对于科研应用意义重大，也是当前最前沿的技术之一。历经近半个实际的科技迭代发展，单细胞操控技术日新月异，从最初的人工方式，到风靡半个世界的流式分选技术，以及近些年出现的拉曼检测分选、视觉捕捉、气动高压分选、光镊控制、液流瞬动等手段，都具有一定的进步性，不断推动整个产业的进步发展。2015年之前，生命科学中的单细胞分选应用，甚至包括细胞分析、捕获、操控等领域，均是进口仪器的天下，“单细胞”成为制约中国生命科学、生物技术等领域“卡脖子”技术之一，仪器与耗材严重依赖进口，国产仪器只能做一些边边角角的低附加值外围部件。图1 常见进口流式细胞仪直到2016年之后，在中科院大连化物所、大连理工大学以及大连医科大学附属医院等合作伙伴单位的支持下，历时6年研发，国产单细胞分选设备终于诞生——大连华微生命科技科研团队，成功绕开国外知识产权壁垒，开发出拥有中国人自己知识产权的单细胞分选分离系统，并在科研、教育、医疗、制药、环保等领域陆续实现应用。2018年之后，借助独有的柔性高通量操控、多通道级联等专利技术，大连华微生命科技（以下简称大连华微），在业内率先提出单细胞“柔性”高通量分选的概念，实现与西方进口设备的中西方分选技术的正面PK，除多次竞标中以性价比、独有特色技术脱颖而出外，更是多次以“单一来源”方式中标。那么，从2010年开始，历经“十年一剑”的磨练，大连华微，有哪些超越进口仪器的独门绝技呢？单细胞之删除空滴技术众所周知，皮升至微升级液滴型微反应器（以下简称液滴），是下一代生化分析工具，小小液滴，可以实现微米级尺寸的隔离空间，除了对单细胞、单细菌等生物颗粒起到保护作用外，还可以防止特定个体及其衍生物、排泄物、裂解物等单体相关物质，与其它个体实验的混淆，实现了细胞（或菌等）单体实验成果的可溯源性。实现比重99%的单细胞液滴，删除空滴与多核液滴，才是最严谨的“单细胞”技术。即，一个液滴里只包含一个细胞（或其它生物颗粒），删除空液滴、多细胞液滴（多核液滴），这样巨量规模、相互隔离的活性单细胞液滴群，对基因工程、筛菌、筛酶、定向进化、文库制备、制药、医疗等领域研究意义重大，是科学家最期望的活性样本处理形式之一。大连华微众多的独有特色技术中，包含单细胞液滴柔性高通量制备，可在液滴包裹时，根据实时监测删除空滴及多核液滴，实现液滴制备结果中，只包含“单核液滴”，为生物颗粒个体的隔离型大规模并行研究，以及海量样本中特异性个体的筛选、分离，提供了可行且高效的技术基础。大连华微推出的暴风系列产品，因为该特色技术，获得“2019年度中国科学仪器优秀新产品”荣誉称号，并进入多家国家重点实验室、三甲医院，以及985高校实验室。而很多进口设备，不具备上述空液滴、多核液滴的删除机制——其“单细胞液滴制备”，指的是“能够制备单细胞液滴”，而非“制备成果都是单细胞液滴”，即：单细胞包裹符合泊松分布的规律，更详细的数据：除5%—20%的单细胞液滴外，会伴生超过70%的空液滴、5-10%的多核液滴，在多环节的生命科学、生化实验中，大幅降低实验效率，造成耗材、人工的严重浪费，也被客户戏称“假单细胞”。图2 大连华微推出的国产单细胞柔性高通量分选分离设备单细胞之柔性分选技术在全球单细胞分选细分领域，大连华微生命科技率先提出“柔性”控制策略。半个世纪以来，单细胞分选技术日新月异，但基于流式技术的分选设备，占据较大比重。而流式技术最被客户诟病的——就是较差的活性！概述而言，下列技术手段对活性生物颗粒，尤其细胞既有不同程度的损害，影响到后续活性实验环节，包括：高压直流电、高压强鞘液或油相、采用高压气流的“气吹”技术、强负压的“抽吸”技术、高压交流电的介电分选技术、采用有毒有害液体试剂、采用施力接触式目标操控、采用过强激光产生“光毒效应”等上述技术，分别从电、液流、化学、光学等方面，对生物颗粒的活性有不同程度的伤害（尤其流式细胞仪，具有高压直流电、高压强鞘液等“双高”特质，尤为明显），除一些比较“坚强”的工程菌、细胞外，多数分选的单体成果，在后续的生殖、扩增、单亲克隆、PCR等活性实验环节中表现较差，甚至无法应用。大连华微在针对单细胞液滴控制中，基于“柔性”控制策略，的制备、检测、柔性分选分离、混匀、切分、定位、滴内再注液等过程环节，不采用高电压直流电场、高压强鞘液，并注重生物颗粒操控过程中的营养物质的供给，实现整个分选即操控过程，生物颗粒的活性影响很小，不影响后续的生殖、扩增等实验环节。单细胞之高通量操控技术一位微流控业内大牛曾言：在针对海洋样本分选分离环节，一切低于秒级的检测技术，都是耍流氓！这句话的严谨性值得商榷，但代表了单细胞分选技术的客户需求——高通量！众所周知，很多时候，我们国产设备与进口设备的最显著差距，就在通量速度这方面。一个反面实例——拉曼单细胞分选，因无需标记在应用中具有很多技术优势，但当前不能广泛应用的原因，就是通量太低，单个细胞的检测，就需要数十秒，甚至数分钟的过程，对于生物样本的海量个体，效率明显力不从心。大连华微为满足不同客户需求，推出系列化高中低档单细胞分选分离设备，单细胞分选具有高通量特质，每秒细胞分选数量范围：数十至数万个，典型应用为：50 drop/s，150drop/s，300drop/s，500drop/s，1000drop/s，2000-20000drop/s等多种规格。单细胞之无标记分选众所周知，针对活性生物颗粒进行荧光标记，是当前生命科学、生物技术等微观个体科研领域的主要手段，但荧光标记本身，对细胞活性、再生性、伦理等方面，产生很多负面影响。业内付诸期望的拉曼检测技术，还需要技术进一步迭代升级，目前因过低的通量，还不能广泛应用。因此，其它高通量的无标记单细胞分选技术，是业内急需。大连华微的专利技术之一：采用独有的无标记高通量单细胞分选技术，针对96/384孔板的单细胞保活性分选，速度可以达到96孔板/5分钟的水平，活性保持95%，单孔单细胞率95%，当前该技术已经获得全球排名前五的世界科仪巨头的认可与合作邀约。该技术已经得到大连市科技局评估、考察、论证，并获得“大连市2021年度重点科研计划项目”立项支持，项目合作伙伴包括多年哈佛医学院科研工作经验的海归教授、三甲医院肿瘤学主治专家等，该技术是大连华微近年来最重视的科研利器之一，前景广阔，未来可期。单细胞之样本多样性兼容大连华微的商业化系列产品，目前可针对尺寸0.1-2000um范围的活性生物颗粒，包括：细胞、细菌、酶、病毒、线虫、细胞团等，进行液滴包裹、捕获、分选、孵育等控制。而切换不同尺寸、种类的样本目标，只需更换一块生物芯片，即可快捷完成。单细胞之实验平台开放性对于科研、教育类客户，基于显微镜平台的全开放式结构设计，方便客户进行各环节的实验观测、功能增加与特定技术环节的DIY实现，如自行增加/更换：激光器、滤光片、光路、高速相机等，或可实现全场景视频、图像记录，可以非常少的成本、经济的实现，并更方便科技文献撰写需求。单细胞之精确数字化分选大连华微的分选技术之一，即逐粒串行检测，也就是针对生物颗粒，单个评估并操控，可以完成千万、数亿甚至更大样本容量中1个特异型（野生型）的鉴别并分选出来。精确数字化，是与“相对”、“概率”等对立的名词术语，因为中国广告法的规定，不能用另一个常用名词。单细胞之液滴混匀单细胞液滴（或多细胞液滴）中，多组分混匀。单细胞液滴之比例切分单细胞液滴（或多细胞液滴），按比例进行分割。单细胞液滴之再注液针对已经生成的单细胞液滴（或多细胞液滴），可按其参数进行特定目标液滴的滴内再次加样、加液，比如细菌分选后裂解液滴注、营养物质补充、后期反应药液加注等场合。单细胞液滴之大规模并行阵列针对海量样本的超高通量单细胞检测、分选需求，大连华微推出的Nx阵列式并行控制方案，检测、分选速度可以高达5亿×N drop/24h，其中N=1,2,4,8,16。。。自然数，为采用测控单元阵列数，理论上无上限。单细胞分选设备之高性价比外国科技界有句广为流传的话：技术，不能让中国人掌握！以进口设备1/2-1/5，进口耗材（芯片）1/5-1/10的价格，可与进口设备媲美的技术，助力中国科学家，挑战世界单细胞领域最前沿科技。综上，大连华微自主研发的单细胞设备，基于多激光技术，采用皮升至微升级液滴（微反应器，下一代生化分析工具），可针对尺寸0.1-2000um范围的活性生物颗粒（细胞、细菌、酶、病毒、线虫、细胞团等），进行单核液滴包裹、高通量绝对检测、柔性分选分离、单体捕获、滴内PCR、器官功能细胞培育等操作，实现单亲克隆、药物筛选、单细胞基因测序、基因编辑、文库制备、酶活筛选、马牛羊雌/雄选育等应用。图3 大连华微推出的：单细胞操控商业化产品及其主要参数基于元器件级别的研发技术，大连华微生命科技，还推出微流控芯片实验室，一站式解决方案（设备、软件、可定制生物/微流控芯片）：对目标样本数无要求，保持活性前提，实现单细胞液滴高速制备、检测、柔性分选分离、混匀、切分、定位、滴内再注液等，液滴相互隔离，并可控制融合；生物芯片的片上温控系统，支持单细胞滴内PCR扩增、培养孵育。当然，最近几年，政治开始影响全球高端科技的融合与发展，前沿技术成为某些发达国家制约我国经济发展的手段，中国产业，如何从“卡脖子”的技术壁垒中突围？答案只有一个：自力更生！但生命科学等领域的新技术开发周期长、成本居高不下，企业希望国家能出台更多财政、税收、推广等层面支持，加速高新技术开发。大连华微生命科技有限公司（Dalian Life Huawei Technology Co., Ltd.），作为科技部评定的高新技术企业，已拥有国际先进水平的活性细胞控制技术，全球业内率先提出“单细胞柔性高通量分选（筛选）”概念，并成功研发、应用，获得市场广泛好评。但生命科学还有单细胞无标记柔性分选、高通量拉曼检测、微滴内生化反应等，更多的前沿未解课题，等待我们继续努力，攻坚克难，增强中国民族科技的市场话语权。而影响中国民族工业的核心技术，必须掌握在中国人自己手中！

2009年，单细胞测序技术问世。2013年被Nature Methods评为年度技术。2015年以来，10X Genomics、Drop-seq、Micro-well、Split-seq等技术的出现。2018年以来，以新格元为代表的国内单细胞平台如雨后春笋般涌现。Fig 0 单细胞平台一览图详细了解厂商和各家产品之前，预告一下“第六届基因测序网络大会”，会议上德运康瑞、墨卓等企业的专家代表将有精彩的分享。马上免费报名吧！报名页面：https://www.instrument.com.cn/webinar/meetings/geneseq2023/一、低通量单细胞平台低通量的单细胞平台主要是基于smart-seq2技术原理开发而来，典型代表有Fluidigm C1™ 单细胞全自动制备系统和WaferGen ICELL8® Single-Cell System两大平台。1、Fluidigm C1™ 单细胞全自动制备系统Fig1.1 富鲁达C1单细胞系统  2012年6月13日，Fluidigm 在日本横滨举行的国际干细胞研究学会 (ISSCR ) 上发布了C1™ 单细胞全自动制备系统，是真正第一个实现商业化的平台。  C1单细胞自动制备系统微流体技术，可以同时捕获多个单细胞（IFC：~96 cells；HT-IFC：~800 cells），在同一张芯片上完成细胞捕获、裂解、逆转录及预扩增的全过程，完成smart-seq全步骤的自动化。2、WaferGen ICELL8® Single-Cell SystemFig1.2 宝生物iCell8单细胞平台  2015年2月份，Wafergen公司开发出ICELL8 Single-Cell System单细胞分选平台，后被TaKaRa公司收购。  利用WaferGen Smart Chip TE平台筛选细胞，5184个反应孔，可进行单细胞RNA测序样本的制备、扩增、表达谱建库测序、生物信息分析，可快速得到样本间的基因表达差异。  每次运行可分离500~1800个细胞； 细胞的捕获效率大约37%； 细胞适用范围为5-100um； 样本通量为8（一枚ICELL8芯片上一次最多可以分析8种细胞样品）； 没有整合试剂，使用Takara试剂，需进行试剂优化； 自动成像技术系统：可实现单细胞反应孔可视化； 单细胞挑选软件：只挑选活的单细胞进入后续的处理，从而可以节约反应试剂，缩短数据分析时间。[点评]：虽然低通量测序现在不是市场上的主流，但是由于其实验的精密度是非常高的，已依旧没有被社会淘汰。二、高通量单细胞平台（进口）  2017-2018年，两大商业化的单细胞测序平台（10X Genomics, BD Rhapsody）出现，最终让单细胞测序技术进一步达到更大商业化。1、 Mission bio：专注于高通量单细胞DNA测序的平台Fig2.1 Mission bio Tapestri Single-cell Multi-omics Solution  Tapestri平台基于微液滴的微流控装置，利用油包水体系对细胞进行捕获与封装。封装时，细胞和蛋白酶等会被一起装入微液滴中，每一个微液滴相当于一个微容器。之后，细胞在微液滴中进行裂解、加条形码（barcoding）等步骤，再结合靶向 PCR 扩增技术，对特定的DNA目标序列与蛋白产物进行单细胞水平的建库。建库完成后，即可进行高通量测序和后续的生物信息学分析。• 专注单细胞DNA测序。• 高灵敏度，可检测含量低至0.1%的罕见亚克隆，以及突变的合子型和突-变共发生情况。• 多种检测类型，可检测SNV、InDel及CNV等多种变异类型。• 高通量，每个样本可测量5,000~10,000细胞。• 灵活性强，可定制化设计疾病基因检测靶点及CRISPR靶点 。2、Illumina® Bio-Rad®：基于数字PCR的高通量单细胞平台  2017年1月17日，Illumina公司和Bio-Rad实验室公司在JP摩根健康大会上发布了Illumina® Bio-Rad® Single-Cell Sequencing Solution。Fig2.2 Illumina Bio-Rad Single-Cell Sequencing Solution该系统包含Illumina® Nextseq 500和Bio-Rad® ddSEQ™ Single-Cell Isolator；Bio-Rad最好的液滴分离技术，Droplet Digital™技术，可以对单细胞进行隔离和编制条形码，然后在Illumina的许多主要NGS仪器上进行下游测序。• 可一次性检测8个样本，每个样本可以得到500~10000个细胞。• 捕获效率低，仅为3%，但测序成本相对较低。3、10x Genomics Chromium 高通量单细胞平台(controller/connect/X series)10X面对市场不同的需求推出了三款仪器。最早的这一款就是chromium controller，这款仪器配备了是标准通量和低通用的两款试剂盒。2021年的时候，10X上又推出了chromium X series这款仪器，目前这款仪器也是市场主推的一款。它适配的试剂盒的规格也更丰富。Fig2.3 10x Genomics Chromium 高通量单细胞平台另外10X推出的chromium connect仪器最大特点就是它能够实现从单细胞分离以及到最后NGS文库构建的一个全流程的过程，因此更加适合于一些大通量的实验室。• 每次运行提供8个通道，每个通道可以收集100-10000个细胞。（注：Chip M是16个通道）• 每次细胞分装运行时间为18min左右；• 细胞捕获效率最高可达65%；• doublet比例为0.9%/1000个细胞；• 针对单细胞ATAC分析，线粒体污染率低于2%；4、BD Rhapsody™：基于微孔板法的高通量单细胞分析系统  BD Rhapsody™单细胞分析系统包括BD Rhapsody™扫描仪和BD Rhapsody™ Express单细胞分析系统。BD Rhapsody™ Express 系统配备的专有单细胞捕获技术，以微孔为基础，稳定，能够捕获数百到数千个单细胞并为其打上条形码，分析基因组和蛋白质组信息。BD Rhapsody™扫描仪旨在可视化单个细胞捕获工作流程中的所有步骤，为每个步骤提供详细的分析度量，以便用户在整个工作流程中做出关键决策。Fig 2.4 BD Rhapsody™单细胞分析系统• 单细胞捕获效率：最高可达~80%• 单细胞检测通量：100-40000• 双细胞比例： ~2-3% for 10k cells load； ~8-10% for 40k cells load[点评]：1）10x Genomics仍是主力军，在国内拥有众多代理商和服务商，占据着80%左右的国内科研市场份额。同时该平台近两年注重空间组学平台开发，2022年推出了一系列新产品；10x Chromium X系列产品有多种应用类型，支持低中高3通通量模式，在推广上又与之前的Controller进行联动（增加保修年限），是10x的主力机型。2）BD Rhapsody™平台坚持微流控微孔板的原理，配备有扫描仪，可以实时监测单细胞状态，保证细胞的分离捕获效率；同时其配套有抗体和流式平台，在单细胞实验的组合解决方案上有明显优势（混样、与流式仪器上下互动组合）。3）Mission Bio单细胞平台专注单细胞基因组测序，在血液肿瘤方向深耕多年，接触临床应用时间较早；近些年在逐步增加国内服务商的覆盖，已有多家知名服务商与之合作。4）Bio-Rad与illumina合作推出的单细胞建库平台捕获效率较低，市场占有率及市场声音较低。点击图片即可报名参会，8位嘉宾将带来单细胞测序内容！三、高通量单细胞平台（国产）截止到2022.12.31，国内的单细胞平台共有10个，分为微流控微孔平台（以新格元Matrix系统为代表）和液滴微流控平台（以华大C4系统为代表）。1、新格元Singleron Matrix® 自动化单细胞测序文库构建系统可完成将单细胞悬液分散到微流控芯片的高密度微孔阵列中，并自动完成细胞分离、细胞裂解、细胞标记至mRNA捕获步骤，无需实验人员干预。Fig3.1 Singleron Matrix自动化单细胞测序文库构建系统• 单个样本单张芯片可捕获细胞数量500-30000个 • 每份样本捕获效率最高可达75% • 检测1000个细胞中含有双细胞的比例低于0.2％；[点评]新格元生物是国内首家一站式全方位的单细胞整体解决方案提供商，在产品方面既有单细胞转录组、核转录组、免疫受体等常规产品，同时也有单细胞转录动态监测、单细胞糖基化、单细胞靶向基因检测试剂盒等特色产品，能够给科研者提供更加多样的组学研究选择。是国产单细胞的主要玩家之一。2、华大智造：DNBelab C4高通量单细胞平台DNBelab C4是华大智造推出的基于负压的微流控单细胞技术。小巧轻便（长230mm、宽42mm、高57mm），无需电源，重量不到220g，操作简单，可随时开始单细胞建库。Fig3.2 DNBelab C4 Pocket Single-Cell Lab• 有效捕获细胞数：1000~12000 cells/run；• 细胞直径范围：5µm-25µm ；• 多胞率（Multiplet Rate）：8% ；• 捕获效率：30~60% ；3、寻因生物：SeekOne双平台体系（微孔板平台+液滴油包水平台）寻因生物有单细胞标记两大主流技术：油包水法SeekOne® DD和微孔芯片法SeekOne®MM（Microwell & Magnetic Beads)。1）微孔芯片法MM  SeekOne MM（Microwell & Magnetic Beads)高通量单细胞转录组试剂盒基于微孔技术原理，通过微孔芯片SeekOne Chip实现单细胞捕获，并利用核酸修饰的Beads 对不同细胞来源的RNA 进行分子标记，最终构建兼容Illumina及华大智造测序仪的高通量单细胞转录组文库。Fig3.3.1 SeekOne MM平台（手动法）• 单次可放置1-4张芯片，单人操作可同时处理1-4个样本；• 单张芯片微孔数：17w；• 单张芯片捕获细胞数：500-10000 cells；• 捕获率：最高可达60%；• 双胞率： 0.7% / 1000 cells；• 无需其他昂贵硬件配套2）油包水法DD  液滴油包水平台（DD）是寻因生物的主力平台，并基于该平台开发了相应试剂盒，其主要有单细胞3‘转录组试剂盒和单细胞5’免疫受体试剂盒。• 芯片通量：1~8个样本，可以拆卸不会有芯片浪费；• 运行时间：3 min生成15万个油包水液滴；• 单通道细胞捕获：500-12000 Cells；• 双胞率：0.3% / 1000 cells；[点评]寻因生物尽管对外宣称具有MM和DD双平台，但整体推广上仍侧重DD平台，并依托其可拆卸的芯片实现更加灵活的实验安排。目前该公司产品相对较单一，公司在推广上发力比较多，推出了相当多的视频专题进行客户教育，算是不错的行业先行者。4、墨卓生物在过去的2022年中，墨卓生物对外发布了单细胞液滴微流控平台及其试剂盒、微生物高通量单细胞基因组测序产品。其中单细胞液滴平台MobiNova-100引入了光激发分离（Light-CUT专利技术）原理，可以在单细胞核酸捕获阶段将分子标签与微珠进行分离，因此在实验中需要专门的配套设备。Fig4.1 墨卓生物单细胞仪器• 芯片通量：1~4个样本；• 试剂盒种类：目前仅有单细胞3‘转录组试剂盒；• 运行时间：10 min；• 单通道细胞捕获：500-20000；• 双胞率：5% / 10000 cells；此外墨卓生物还推出了MobiMicrobe 微生物高通量单细胞基因组测序解决方案及其仪器产品M1，主要是在菌株水平分析宿主-噬菌体关联信息及转录转移事件。• 样本通量：每次可处理1个样本；• 捕获通量：每个样本可捕获微生物细菌数量≥6000个；• 仪器配套高速相机，能够观测微芯片中微滴发生和融合；• 仪器配有低温存储模块能，可同时放置4个0.2 mL PCR反应管和4个1.5 mL离心管；• 仪器配有扩增模块（96x0.2ml，12x8连管或96孔 PCR板）• 仪器带有自检功能：仪器在开机和运行过程中会自动检测，遇到异常会发出报警提示。5、其他除了以上4个国产单细胞平台之外，在过去的两年中还出现过一些平台公司，他们均采用液滴法来作为技术源头，并处于早期产品阶段，以单细胞转录组、免疫受体等作为主推产品，为客户提供产品或者服务。这些厂家有万乘生物（10K genomics）、百迈克生物、跃真生物（m20 genomics）、德运康瑞、纯迅生物等。总结  截至2022年12月，目前国内市场共有2个低通量进口品牌、4个高通量进口品牌和10个国产品牌，均有各自的公司定位和产品体系以及对应领域解决方案。  纵览2022年国内市场单细胞信息，主要特点有：• 单细胞新平台频出。如墨卓，M20，百迈客均是2022年推出单细胞平台。• 单细胞平台特点突出，各有产品和市场定位，有从单品到一站式解决方法成长的趋势。• 单细胞市场更为成熟。各家单细胞平台对内完善了团队建设，对外加强服务商或产业端的合作。• 空间技术应用。10X主推空间原位，德运康瑞收购先能原位，华大和百迈客主推基于测序的空间技术。• 单细胞多组学，有单细胞平台的厂家基本在或计划开发单细胞多组学（免疫，表观，蛋白，突变，全长）产品矩阵。• 单细胞技术应用方向扩展到动物，植物，微生物。如联川，诺禾推出农口单细胞激励计划，BD联合华南农大推出经济作物单核文库构建方案。（信息来源于生物医学小站）第六届基因测序网络大会进入报名页面：https://www.instrument.com.cn/webinar/meetings/geneseq2023/点击图片报名

单细胞测序：少量细胞和稀有细胞的解决方案做单细胞测序的时，您是否遇到下列情况： ü 细胞样本量较少，不够做一次高通量单细胞测序… … ü 没有简便易用的设备分选单个细胞… … ü 保护细胞的基因完整性难度大… … ü 分选到单细胞后，找不到合适的试剂进行下一步操作… … 如果这些问题曾给您带来困扰，4月28日由Namocell联合Qiagen带来的关于“少量细胞和稀有细胞的单细胞测序解决方案”的讲座，一定会让您有所收获。 近年来的单细胞研究表明，生物体由数千种独特且不可重复的细胞类型组成。由于单细胞中核酸数量有限，使用二代测序（NGS）方法进行单细胞分析（类似于低样本量测序）传统上具有挑战性。当研究群体较小时，这种限制变得更加明显，例如稀有细胞样本（阳性细胞占比0.1%以下）。高保真度（HiFi）和高质量的DNA扩增对于单细胞测序至关重要，这在很大程度上取决于分离细胞的质量。因此，用于分离单个细胞的方法对于确保细胞活力和核酸完整性至关重要。 美国Namocell公司专利的轻柔分选和细胞富集技术为您克服上述挑战，为单细胞测序提供了更高数量和质量的细胞样本，让您能够轻松获得细胞样品的完整且准确的遗传信息。 无论您是单细胞分析的初学者还是专家，相信都能在这个信息丰富的网络研讨会中有所收获。让我们一起了解和探讨少量样本和稀有单细胞测序的重要因素和新技术。 会议时间2022.4.28 16:00-17:00（注册时选择观看时间为Thursday, April 28, 2022, 10:00 AM CEST） 报名通道（点击） 主讲人介绍

p　　自2009年以来，单细胞RNA测序一直是推动生物医学研究进步的重要动力。越来越多的单细胞RNA测序平台被应用于科研和临床。对于大规模的单细胞RNA测序研究来说，一个主要的技术障碍是高通量和灵敏度，还要考虑成本问题。随着低成本、高通量的液滴单细胞RNA测序平台的推出，研究人员在单细胞研究中有了更多的选择，但现有的平台性能如何?科研人员又该如何选择?/pp　　为帮助研究人员根据自身需求选择最适合单细胞RNA测序平台。部分国内外科学家对已有平台进行了系统的性能比较，今年4月，生物分子资源设施协会(ABRF)公布了四种单细胞RNA测序平台Fluidigm、WaferGen、10X Chromium Controlle和Illumina/Bio-Rad测序平台的性能差异。11月，中国北京大学黄岩谊研究组、清华大学王建斌研究组等研究人员，联合发表了三种基于液滴的单细胞RNA测序平台10X Genomics Chromium、inDrop和Drop-seq的性能比较结果。两项独立研究结果均显示，没有一种平台可以很好的满足用户的所有需求，各个平台均有优缺点以及各自的应用范围。/ppstrongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "研究一：10X Genomics Chromium、inDrop、Drop-seq性能比较/span/strong/pp　　img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201812/uepic/9a5662b2-a9e7-410e-a2a7-94d503182763.jpg" title="12.jpg" alt="12.jpg" style="text-align: center "//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(127, 127, 127) text-align: center "黄岩谊（左） 王建斌（右）/span/pp style="text-indent: 2em "黄岩谊、王建斌的联合研究成果已发表在Molecular Cell。研究人员利用同一个淋巴母细胞系，对常用的三种基于液滴的超高通量单细胞RNA测序平台10X Genomics Chromium和inDrop、Drop-seq进行了性能比较，每种平台进行2~3个重复检测。同时，他们还开发了可适用于三个分析平台的生物信息分析框架。研究团队表示，研究开始时BioRad的ddSeq平台尚未推出，所以未包括在内。/pp style="text-align: center "　　img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201812/uepic/c5b014fc-594b-4ba1-a190-a5cd100b026f.jpg" title="1.jpg" alt="1.jpg" style="text-align: center width: 485px height: 512px " width="485" height="512"//pp style="text-align: center"span style="color: rgb(127, 127, 127) "研究概要/spanbr//pp　　研究团队表示，该研究中的单细胞RNA测序平台各有优缺点，并适用于不同应用。strong总体来说，10X Genomics的Chromium系统比Drop-seq或inDrop表现更强大，其技术噪音最小，稳定性最高。/strong/pp　　img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201812/uepic/eaf126b2-b5e6-4153-a06e-fe83a0259c2f.jpg" title="0.jpg" alt="0.jpg" style="text-align: center "//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(127, 127, 127) "三个平台实验特征示意图及比较/span/pp　　该研究发现，基因表达聚类与分析使用的平台有关，表明存在基因水平的系统特异性量化偏差。研究人员仔细分析了每个平台中偏差的来源，strong发现Chromium平台偏爱较短的序列和GC含量较高的序列，而Drop-seq对GC含量较低的基因检测效果较好/strong。/pp　　分析结果显示，strong三个平台在重复性方面都是一致的，表明在同一平台上可以合并来自多个实验的检测数据/strong。但比较不同平台产生的数据仍非常有挑战性，为此，研究团队开发了可适用于三个分析平台的数据分析框架，方便数据比较。/pp　　img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201812/uepic/7f81f1a2-e4e6-4453-9409-dd9962161c24.jpg" title="4.jpg" alt="4.jpg" style="text-align: center "//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(127, 127, 127) "左：各平台检测性能 右：各平台技术噪音/spanbr//pp　　在该研究中，就性能而言，strong10X Genomics的灵敏度最高/strong，可在3000个基因中平均捕获17000个转录组 Drot-seq检测到2500个基因的8000个转录组；InDrop可检测到1250个基因的2700个转录组。灵敏度高的一个好处就是可以通过较少的reads获取相同级别的分子标记。此外，10X Genomics平台的噪音也最少。研究人员认为，inDrop平台噪音的一个来源是微珠的易变性，因为研究中出现了两批微珠检测同一样本的结果完全不同的情况。/pp　　该研究还意外发现了不同微珠对检测结果的影响。研究中的三个平台都在微珠上附加了条形码。为了确保一个细胞对应一个条形码，微珠和细胞都需要进行稀释。但微珠自身可能会影响稀释效果，进而影响细胞的捕获效率。例如，strong10X Genomics和inDrop都使用水凝胶珠，它们体积大、柔软灵活，流经系统的速度较低，能够避免两个细胞或两个微珠被包裹在一个水滴中，因此只需要较小的稀释就能获得较高的捕获效率/strong。Drop-seq使用的微珠更小更硬，需要更大的稀释度避免微珠成对出现，但这会降低细胞捕获效率。/pp　　此外，检测结果表明，10X Genomics微珠的条形码错配较少，另外两个平台有超过一半的细胞条形码出现明显的错配。其中，Drop-seq约10%微珠的条形码出现一个碱基缺失。/pp　　转录组检测的试验成本和效率取决于具体场景。为方便研究人员选择合适的单细胞RNA测序平台进行研究，研究团队针对三个平台的表现与特性给出了指导意见。虽然大多数项目的细胞数量相对较多，strong但对于稀少样本，如人类胚胎，需要细胞捕获效率更高的平台，10X Genomics是较为合适的选择/strong。但在三款平台中，10X Genomics的成本最高，定价为125000美元，仅运行单细胞实验的平台为75000美元，估计每个细胞的检测成本为0.50美元。/pp　　Drop-seq平台是较便宜的一个选择。Drop-seq平台制造成本为6000美元，购买花费不到30000美元，每个细胞的检测成本为0.10美元。但目前国内使用Drop-seq的成本明显高于国外。由于细胞捕获效率较低，Drop-seq平台适合样本丰富的研究，不太适合用于少量样本和珍贵样本的检测。/pp　　strong当低丰度转录组的检测可选择时，选择inDrop更合适/strong。研究团队估计inDrop仪器成本约为50000美元，每个细胞检测成本为0.25美元。InDrop的主要优势是开放系统，用户可以根据自己的需求对其进行调整和定制。研究人员表示，inDrop还没有10X Genomics平台那么强大，但预计它会不断改善。总体来说，这三个平台都能提供令人满意的检测效率。/ppstrongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "研究二：Fluidigm、WaferGen、10X Chromium Controller、Illumina/Bio-Rad平台性能比较/span/strong/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201812/uepic/0a19edf1-b943-4748-b6ee-dc3ec8f54b18.jpg" title="5.jpg" alt="5.jpg"//pp style="text-indent: 2em "ABRF研究小组针对一组经治疗和未经治疗的乳腺癌细胞系比较了Fluidigm、WaferGen、10X Chromium Controller和Illumina/Bio-Rad测序平台在易用性、成本和时间方面的差异。/pp　　在捕获能力方面，strongFluidigm平台具有较低的细胞捕获能力/strong，该平台最高捕获400个细胞。除Fluidigm外，其他平台的捕获能力约为单臂4000个细胞。在捕获效率方面，不同单细胞测序平台的表现不尽相同，如10X Chromium Controller平台的捕获效率为65%，WaferGen平台为30%，而Illumina / BioRad平台的效率仅为3%。但每个单细胞RNA测序平台都可以区分已治疗和未经治疗的癌细胞，只是有些平台更具有特异性，有些平台更加适合处理解决治疗组的相关问题。/pp　　就基因检测结果而言，各检测平台在测试条件下具有相似的灵敏度。其中，Fluidigm平台的表现稍好，其他平台则差异不大。此外，研究人员发现这些平台都非常擅长检测低表达的基因。这四种平台也存在一些系统特异性偏差，尤其在GC含量和基因长度方面。这与黄岩谊等人的研究结果相似。/pp　　该研究结果显示，不同单细胞RNA测序平台在易用性和周转时间方面也各不相同。根据报告，10X Chromium Controller和Illumina / BioRad平台更易于操作人员使用，但Fluidigm HT则被认为使用较为困难。此外，Fluidigm HT-IFC平台的耗时为12小时，时间最长 Fluidigm 96 IFC、Illumina / BioRad和10X Chromium Controller平台耗时均约为10小时，相比之下，WaferGen仅用7小时。/pp　　ABRF研究小组也做了成本分析。Fluidigm HT-IFC方法从细胞捕获到测序需花费2500美元，每个细胞花费在3.13美元到6.25美元之间，96 IFC方法则花费2000美元，即每个细胞20.83美元 Illumina / BioRad每个细胞花费1~4美元 WaferGen每个细胞约花费3美元 10X Chromium Controller每个细胞花费0.15~1.50美元。/pp　　由于测序平台的性能各不相同，所以在不同测序试验中选择使用什么平台非常重要。实验人员在选择测序平台时需要根据实际情况考虑多种因素，以选择一种最能满足试验需求的平台。/p

近期我们梳理了分子诊断技术中测序部分，测序技术根据样本类型不同包含：DNA测序、RNA测序、单细胞测序、甲基化测序等。本期开始我们将从以下几个方面逐一介绍单细胞测序技术：单细胞测序技术概念及发展历程、单细胞测序技术操作流程、单细胞全基因组测序技术、单细胞全转录组测序技术、单细胞测序技术的应用。单细胞测序技术单细胞测序（Single cell sequencing，SCS）技术是指在单个细胞水平上对转录组或基因组进行扩增并测序，以检测单细胞在基因组学、转录组学、表观组学和蛋白组学等多个组学的数据。主要涉及：单细胞基因组测序、单细胞转录组测序和单细胞表观基因组测序。单细胞基因组测序（图1A）：是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基因组后进行高通量测序，用于揭示单细胞中的遗传变异，如单核苷酸变异（SNVs）、拷贝数变异（CNVs）和基因组结构变异（SVs），细胞群体差异和细胞进化关系。单细胞转录组测序（图1B）：是将分离的单个细胞的微量全转录组RNA进行扩增后进行高通量测序，用于在单细胞中生成基因表达、基因融合和选择性剪接的图谱，此技术被认为是截至 2020 年定义细胞状态和表型的金标准。[1]单细胞表观基因组测序（图1C）：是检测DNA序列不变的情况下表型的可遗传变化，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质可及性等。在真核生物中，5-甲基胞嘧啶(5mC) 在基因组中广泛分布，并通过抑制转座因子在调节基因表达中发挥重要作用[2]。通过对单个细胞中的 5mC 进行测序，可以揭示来自单个组织或群体的遗传相同细胞的表观遗传变化如何产生具有不同表型的细胞。单细胞亚硫酸氢盐测序是DNA甲基化研究的金标准。图1 单细胞测序技术应用范围示意图[3]A:单细胞基因组测序应用范围；B:单细胞转录组测序应用范围；C:单细胞DNA甲基化测序应用范围；为什么要做单细胞测序呢？多细胞生物在细胞的分裂和分化过程中必然会带来不同细胞间的差异，形成遗传信息的异质性。传统的检测方法获得的信息来自于数百万甚至更多细胞的混合样本，因此得到的结果反映的是一群细胞中信号的平均值，或者只代表其中占优势数量的细胞信息，导致不同细胞间异质性信息被忽视。而单细胞测序可以检测单个细胞异质性、识别稀有细胞、揭示细胞间差异情况。[4]图2 单细胞测序（上）与传统混合细胞测序（下）对比示意图单细胞测序技术发展2009年汤富酬等完成首例哺乳动物单细胞RNA转录组测序后，单细胞测序经历了十几年突飞猛进的发展，同时，随着测序技术的更新迭代，各厂商基于不同检测原理开发出的单细胞分析系统不断推陈出新，单细胞测序逐渐实现了从低通量到高通量检测的转变。2017年“人类细胞图谱计划（Human Cell Atlas，HCA）”的正式公布，是高通量单细胞研究产业化的重要里程碑。图3 单细胞研究发展重大历程[5]单细胞测序技术流程最初单细胞测序是采用不同方法将单个细胞分离出来，独立构建成文库进行测序。但此法分离细胞通量低（仅检测数十个细胞且不足以反应真实情况）且成本较高。随着测序技术的发展，出现了基于标签（barcode）的单细胞识别技术，即不需要分离单个细胞，仅需对每个细胞加上单独的标签序列，通过一次建库测序即可，此方法使得单细胞测序进入了高通量时代，单细胞分离和测序的成本大大降低。与传统混合细胞测序不同的是，单细胞测序起始样本中核酸含量极低，需要对筛选出的细胞扩增后才能满足后期测序实验，目标是在尽量减少序列扩增偏差的前提下增加核酸总量利于后续分析。单细胞测序技术操作流程包括：样本细胞筛选、核酸提取及扩增、测序文库构建、测序和数据分析。图4 单细胞测序（上）与传统混合细胞测序（下）技术流程对比示意图参考文献[1] Tammela,Tuomas Sage,Julien (2020). "Investigating Tumor Heterogeneity in Mouse Models". Annual Review of Cancer Biology. 4(1):99–119.doi:10.1146/annurev-cancerbio-030419-033413.[2] Zemach A, McDaniel IE, Silva P, Zilberman D (May 2010). "Genome-wide evolutionary analysis of eukaryotic DNA methylation". Science. 328 (5980): 916-9. Bibcode:2010Sci...328..916Z. doi:10.1126/science.1186366. [3] Jialong Liang , Wanshi Cai , Zhongsheng Sun.Single-Cell Sequencing Technologies: Current and Future[J].Journal of Genetics and Genomics 41 (2014) 513-528[4] Eberwine J, Sul JY, Bartfai T, Kim J ,The promise of single-cell sequencing[J]. Nature Methods. 2014,11 (1): 25–7. doi:10.1038/nmeth.2769[5] 基因慧《2020单细胞行研报告》

众所周知，细胞株开发在单抗领域是一个至关重要的环节。现有的细胞株开发流程存在很多弊端，如单细胞分离效率低下、单细胞存活率低以及缺乏单克隆性证据等。近日，Molecular Devices推出了新品CloneSelect高通量单细胞分离系统c.sight及f.sight两款仪器，它们能提高单细胞分离的效率及活率，且增加单克隆性的可信度。系统采用一次性分离槽设计，省却清洗验证程序，降低交叉污染的风险。此外，系统具备除静电装置，保证高精度的接种，尤其是针对PCR孔板。CloneSelect高通量单细胞分离系统高效接种单个活细胞至微孔板后，用CloneSelect Imager细胞生长分析系统对孔板进行成像记录单个细胞及后续的细胞分离过程。结合单细胞接种前后的图像，以及单细胞在微孔内增殖最终形成细胞团的序列图像，可以为细胞株的单克隆性提供更高的可信度保证。CloneSelect高通量单细胞分离系统的高效率和高活率，可以在不增加工作量的前提下提升细胞筛选的通量，从而有助于发现更多更优质的细胞株或者稀有细胞。主要特点： • 单细胞分离、成像并接种至96或384孔板 • 克隆成活率提高至最多8倍 • 一次性无菌微流控分离槽确保细胞健康无污染 • 明场或荧光分离细胞 工作原理： 使用专有的喷墨式单向分离槽及微流控技术和智能图像分析技术将单个活细胞高效地接种至微孔板或PCR板，轻柔而高效地分离单个细胞。使用高分辨率的明场或荧光成像对细胞进行成像和分析，记录细胞分离过程的连续5张图像，用于增加单克隆性的可信度。应用领域：单细胞分离/分选，用于细胞株开发 单个B细胞技术，用于抗体发现 筛选稀有活细胞，如干细胞、基因编辑的细胞等 单细胞测序，尤其是转录组测序。 下载产品资料请联系美谷分子仪器

液滴微流控及分子诊断创新平台——达普生物科技有限公司（以下简称“达普生物”）宣布连续完成Pre-A和A轮融资，投资方为信正资本、玖菲特资本与德同资本，涵宇资本担任财务顾问。本轮融资资金将用于加速公司在液滴式数字PCR及单细胞赛道的布局，包括丰富液滴微流控平台技术在生命科学和医学领域的应用，分子诊断试剂的临床试验及注册报证，扩大市场推广和销售团队建设。达普生物科技有限公司孵化于香港科技大学，于2018年由多位海归博士共同创立。在深圳、嘉兴、香港三地设有研发中心，拥有微流控芯片、仪器及试剂GMP厂房。公司专注于将液滴微流控技术应用于精准医学领域，致力于成为集微流控芯片、仪器、试剂的研发和生产于一体的完整解决方案提供商。公司自主研发、生产两大技术平台：数字PCR系统和单细胞组学系统。应用于癌症早期筛查、靶向治疗、无创产前诊断、病毒定量检测、高通量药物和抗体筛选等领域。数字PCR作为“第三代PCR技术”，相较于普通PCR具有高灵敏、高特异、绝对定量等特点，广泛应用于肿瘤液体活检、生殖遗传、病原微生物检测等领域。经过多年发展，作为一种常用且有效的生命科学研究工具被广泛接受并开始进军临床市场，国际巨头纷纷布局。达普生物已于2020年和2021年分别向市场推出了星云数字PCR系统和星云全自动数字PCR系统，服务于各大国家重点实验室、医院、疾控中心和IVD企业，得到客户的广泛认同。其数字PCR法新冠病毒检测产品已获欧盟CE认证，同时也已启动NMPA仪器与肿瘤试剂盒的注册认证。单细胞测序是对单细胞基因组或转录组等进行测序，获得基因组、转录组或其他多组学信息，以揭示细胞群体差异和细胞进化关系。可用于检测单个细胞间异质性、区分少量细胞并描绘细胞图谱，对生物学研究有着重大意义。在肿瘤、微生物学、神经病学、生殖、免疫、消化和泌尿等领域有着极大的应用前景。达普生物单细胞产品线已完成全部研发，单细胞测序系统和液滴分选系统目前已向用户开放测试，计划于今年10月份向市场正式推出高通量单细胞测序整体解决方案。目前，无论是国外还是国内，各个单细胞厂家都专注于单细胞测序上的布局。而达普生物在液滴包裹单细胞的基础转录组测序功能上，结合液滴分选与多步加样融合技术，为液滴式单细胞文库制备流程提供更多功能，同时也拓展了单细胞技术在抗体筛查，微生物进化方面的应用。该解决方案涉及多项液滴微流控关键技术，极大地拓展了微流控在单细胞相关技术的应用范围，实现了应用层面上的超越。达普生物用了三年的时间，重注投入技术平台的开发，目前已经形成了单细胞与单分子检测联合的精准医学解决方案，也是国内唯一一家向市场推出双技术平台的企业。作为一家技术型驱动的公司，未来还将在仪器通量和自动化上进一步革新，以期更贴近临床使用的场景。同时在应用层面上加大投入，为药物研发、临床检测等提供更高价值的解决方案。 达普生物创始人表示：感谢信正、玖菲特和德同资本对团队的认可。接下来，达普生物计划用2-3年时间围绕数字PCR与单细胞技术平台，以为解决临床需求与生命科学的重大问题为导向，通过持续技术创新，不断推陈出新，同时建立高效的市场与商业转化能力，为科研工作者、临床医生和患者提供卓越的产品，为人类健康创造更大的价值。信正资本总经理冯海涛表示：信正资本长期关注医疗行业投资，精准医疗是未来医疗发展的方向，而微流控技术在精准医疗方面具有广泛的应用场景。一方面，技术的需求是明确的，国外已经有做得非常好、估值过百亿美元企业；同时，目前也是国内微流控行业处于技术快速迭代、百舸争流的阶段，是VC投资的有利时机。达普生物团队是一支研发能力极强的专业团队，经过多次沟通与了解，创始人团队所呈现的专注、执着与热情都说明这是一家优秀的创业公司。信正资本看好微流控技术的应用前景，将一如既往地支持公司的发展。玖菲特投资总经理林恒聪表示：达普生物的液滴微流控技术目前处于行业领先水平，拥有数字PCR与单细胞组成系统两大技术平台，在精准医学检测方面有广泛应用场景，相信未来该项技术的普及将惠及更多的患者。德同资本合伙人许谦表示：达普团队拥有多年的液滴微流控芯片、仪器、试剂研发经验，研发能力全面，技术领先。公司以液滴微流控平台技术为主导，应用于肿瘤筛查、单细胞研究，产品从液滴式数字PCR切入市场，产品线延展性好，有较大的发展潜力，未来有望成为液滴微流控领域的领航者。涵宇资本创始人金彬超表示：很有幸服务公司，达普团队是赛道里少有的能在微流控芯片、仪器、试剂研发和生产形成闭环的团队。研发拓展能力强，工业化设计出众，成本控制能力强。同时拥有数字PCR和单细胞组学系统这两大目前微流控赛道里热门产品，也体现了团队和公司的能力和价值。 关于信正资本深圳市信正资产管理有限公司成立于2014年，是一家注册在深圳前海以私募股权投资、上市公司定向增发、产业并购基金、政府引导基金为主营业务的专业投资机构，基金管理人登记编号为：P1071179。 关于玖菲特资本深圳市玖菲特私募股权投资管理有限公司成立于2015年6月，目前管理着五支人民币基金。公司目前专注于医药医疗、半导体、大消费等领域股权投资，目前已完成近20个项目的投资，多个项目已成功IPO或正在启动IPO申报工作。关于德同资本德同资本是一家国内综合实力名列前茅的专业私募股权基金管理公司，目前管理基金规模近二百亿人民币。近年来在医疗健康领域培育了六家上市公司及一批在技术创新上有重大突破的早期企业，包括首家在科创板上市的创新药企业微芯生物。德同资本也是最早与多个地方政府及实力产业集团建立战略合作关系的投资机构之一，为被投企提供全方位的服务与支持。关于涵宇资本涵宇资本总部位于杭州，是一家扎根医疗健康和科技领域的精品投资银行，为企业提供专业的私募融资顾问、战略顾问、并购顾问、技术转让、行业研究等一站式金融服务。公司拥有广泛合作的活跃VC、PE和战略投资人资源，同时打造差异化的超高净值家族直投服务，建立差异化资金优势。

近日，墨卓生物科技（浙江）有限公司（以下简称“墨卓生物”）宣布完成近亿元A+轮融资，本轮融资由LYFE Capital（洲嶺资本）领投，老股东源码资本和地方政府引导基金云祥基金跟投，全面支持公司发展。据悉，本轮融资所募资金将主要用于进一步扩充公司单细胞产品研发管线，大力推进全球独有的高通量微生物单细胞基因组学平台（MobiMicrobe™ ）的研发和推广，并持续推进各产品的研发生产、商业化落地和市场的开拓，着力加速和其他的产业从业者一同打造多元、高效的单细胞生态系统。墨卓生物2018年创立于哈佛大学。基于世界领先的液滴微流控技术平台，墨卓生物致力于用创新微流控和单细胞测序技术赋能科学研究与精准医疗，升级诊断与检测质量，提高生命科学研究水平，为科研人员与医生、患者带来更高效的解决方案。此前，墨卓生物于2021年8月获得华盖医疗长三角早期基金领投，源码资本和比邻星创投跟投的1.5亿A轮融资；此次A+轮再一次获得专业投资者的青睐，彰显了墨卓生物强大硬核的自主创新研发实力及广阔的商业化发展前景。墨卓生物自成立以来，专注于微流控和单细胞测序技术创新和开发，目前已经建立了单细胞测序、数字PCR两大产品线，拥有微流控、测序、生化、硬件开发、生信等关键技术。据了解，墨卓生物正在推进包括单细胞转录组产品在内的多个管线。同时，有超过15个开发项目也在进展中。现阶段墨卓生物推出的核心产品MobiNova-100高通量单细胞转录组解决方案，包括MobiNova-100单细胞测序文库构建系统，MobiCube单细胞转录组建库试剂和芯片，以及MobiVision 生信分析软件。这一系列产品比肩国际一流水平，可实现高质量、高性价比、全面替代。其应用覆盖生命科学研究、液体活检、伴随诊断等多个领域。MOBINOVA-100+单细胞测序建库系统（点击查看在线展位）此外，墨卓生物产品在全球微生物领域实现技术突破，其 MobiMicrobe™ 微生物高通量单细胞基因组测序技术带领微生物的研究进入高通量单细胞时代，研究成果经世界顶级期刊《Science》发表并引起广泛关注，具有极高的科学意义和应用价值。墨卓生物创始人兼首席执行官裴颢博士表示：墨卓生物团队厚积薄发，凭借其国际领先的技术水平，高效开发完成国内一流水平的单细胞测序技术平台和产品——MobiNova-100高通量单细胞转录组解决方案，并于今年正式走上商业化道路。本轮融资顺利完成，代表了资本界和产业界对单细胞测序赛道和墨卓生物的深刻理解和认可，衷心感谢LYFE Capital洲嶺资本及老投资人对墨卓生物的信任和支持。本轮融资后，墨卓生物将投入更多的资源用于打造完整的单细胞多组学产品矩阵，不断扩大产品线，丰富产品维度，建立产品体系和技术壁垒；继续提高通量、降低价格，使得单细胞技术惠及更多科学研究，加速科研向临床的转化，为生命健康服务。墨卓生物致力于打造国内外一体的研发平台，期待和其他的产业从业者一起打造多元、高效的生态系统。LYFE Capital洲嶺资本投资副总裁郭振君表示：墨卓生物深耕微流控和单细胞测序技术多年，奠定了其扎实、系统化的技术优势和平台优势。目前单细胞检测在科研领域的应用得到了广泛认可，未来正在向临床应用拓展，无疑将具有更巨大的应用潜力。我们坚信墨卓成熟的管理模式、顶尖的研发实力以及稳健的商业化路径将带领公司实现新的辉煌。LYFE Capital洲嶺资本长期关注生物医药领域，我们坚定看好墨卓生物的长期发展，亦将与新老股东一道为公司的成长提供全方位支持与助力。源码资本投资人表示：墨卓生物首创的微生物高通量单细胞测序技术，实现了微生物组学领域的科学突破，代表着生命科学领域交叉跨界的新范式。墨卓生物创业团队背景多元，学科跨界，也拥有数十年一流跨国医疗器械企业的研发和商业化经验。源码一贯重视交叉跨界的创新，将凭借丰富的行业经验和全球资源网络，支持墨卓生物不断创新。更期待墨卓生物凭借科学研究成果，迎来更远大发展。云祥基金温广宇表示：作为一家以创新为驱动的科学研究与精准医疗企业，墨卓生物始终致力于为用户提供更好的产品和服务，来帮助用户实现科研和临床的目标，实现用生命科学服务人类健康的愿景。单细胞测序被明确写入“十四五”国家生物医疗产业重点研发计划中，充分体现出单细胞测序技术的战略性意义。我们期待与墨卓生物合作，共同加速单细胞多组学在临床的落地应用。关于LYFE Capital（洲嶺资本）LYFE Capital 洲嶺资本系全球领先的医疗投资平台，我们笃信“医疗无国界”，每一次投资选择皆为推进生命医学的进步、解决全球医疗未满足的临床需求。洲嶺资本运用平台丰富的投资管理经验和遍布全球的行业资源为被投企业创造价值。我们国际一体化的投资团队全力支持各阶段的前沿企业，助企业家在全球市场中充分实现公司增长潜力。关于源码资本源码是具有创业者精神的投资机构。自2014年春创立以来，源码坚持投资于科技驱动的创新，投资于持久真实价值的创造，已经投资了超过300余家创业公司（如字节跳动、美团(3690.HK)、贝壳找房(NYSE:BEKE)、理想汽车 (NASDAQ:LI，2015.HK)等），阶段跨越种子期、早期和成长期，行业涵盖生命科学、绿色发展、智能制造、产业数字化、出海、消费科技等。源码管理资金规模人民币和美元基金总计折合约350亿元人民币。关于云祥基金云祥基金设立于2019年12月，是一家重点投资于战略新兴产业内的智能制造领域的私募股权投资企业，是乌镇为更好建设“一区三地”，支持乌镇创业创新和产业转型升级成立的政府引导基金。主要面向“乌镇院士智慧谷”平台落地和拟落地项目开展投资活动。关于墨卓生物云祥基金设立于2019创新驱动、卓鉴未来，墨卓生物创立于美国波士顿，落地中国浙江，汇集了由国际一流科学家和跨国医疗器械公司高管等组成的一批优秀人才。墨卓致力于用创新微流控和单细胞测序技术赋能科学研究与精准医疗。目前已经成为拥有微流控、测序、生化、硬件开发、生信等关键技术，推出单细胞测序与数字PCR双技术平台，在液体活检、伴随诊断、生命科学研究等多领域并行发展的科研+IVD解决方案领跑者。

5月7日，上海多宁生物科技股份有限公司（“多宁生物”）与上海涛烜科学仪器有限公司（“涛烜科学”）签署战略合作协议，双方就高通量单细胞筛选平台HypercellⓇ等系列产品的全球化销售达成合作，基于行业前沿的目标单细胞筛选技术，为抗体发现提供经济、高效的一站式解决方案。单克隆抗体是生命科学领域的重要工具，也是肿瘤及自身免疫疾病的核心疗法之一。在传统的单抗制备流程中，选择性培养、杂交瘤阳性克隆筛选等步骤的周期较长，对单抗的快速开发造成了限制。高通量单细胞筛选平台——HypercellⓇ是一套采用先进的微流控、人工智能视觉识别技术的平台，能在2小时内完成数十万个单细胞的筛选实验。基于其高通量、易操作，可在1天内完成细胞分选的产品优势，HypercellⓇ广泛应用于抗体、ADC、细胞疗法等领域的基础研究和商业化阶段，并可显著缩短抗体的开发周期。涛烜科学是一家专注于单细胞/单菌工具开发的公司，其研发上市的首款高通量单细胞筛选平台HypercellⓇ是基于明场单B细胞分选的平台。依托于HypercellⓇ和Smartculture XⓇ（单菌筛选平台）两大核心技术，涛烜科学可为客户提供端到端的解决方案。作为一站式生物工艺解决方案提供商，多宁生物的产品及服务涵盖了细胞培养、过滤纯化、制剂灌装及流体管理一整条生物工艺链路，并将服务范围拓展至美国、印度、日本、韩国等海外市场。此次合作，双方将协力支持海内外研发人员对单细胞的精准操控和高效筛选，从而加快抗体开发的速度，简化生物疗法的研制流程。顾红峰 多宁生物副总裁“很高兴能与涛烜科学成为合作伙伴，涛烜拥有行业一流的单细胞分选技术和强势的产品开发能力，而多宁具备完整的生物工艺解决方案和国际化的销售网络。双方的优势加成，将进一步满足客户对高端科学仪器以及一站式生物工艺解决方案的需求。此次合作，我们将以提高抗体开发效率为着力点，将优质的国产仪器逐步推向全球市场。” 孙建军 涛烜科学创始人“非常荣幸与多宁生物达成战略合作，多宁生物以其一站式生物工艺解决方案，确保药物研发及生产流程的高效、稳定、可控。我们则凭借高通量、快速的单细胞分选技术，以及操作便捷、广泛适用的设备，为客户提供卓越服务。双方强强联合，将为客户提供从细胞筛选到工艺优化的全面解决方案，共同推动生物医药领域的进步，期待共同创造更多价值。”关于多宁生物上海多宁生物科技股份有限公司是一家中国领先的一站式生物工艺解决方案提供商，致力于提供生物制药产品从研发到商业化生产的综合解决方案，包括试剂及耗材、仪器设备、服务。公司主要运营生物工艺解决方案、实验室产品及服务两大业务线，通过一站式生物工艺体系帮助合作伙伴实现高效、稳定、质量及成本可控的药物研发及生产流程。关于涛烜科学上海涛烜科学作为一家专注于单细胞/单菌工具开发的公司，一直致力于推动生物医药领域的技术进步和创新。通过不断研发和推广先进的单细胞筛选技术，涛烜科学为生物医药产业的发展注入了新的活力和动力。HypercellⓇ平台的推出，更是展现了涛烜科学在技术创新和市场应用方面的领先地位和实力。在未来，涛烜科学将继续秉承“创新、专业、高效、可靠”的理念，不断推出更多先进的单细胞筛选技术和产品，为生物医药产业的发展做出更大的贡献。

2021 年 1月26 日，南京——安捷伦科技公司（纽约证交所：A）今日宣布将与新格元生物科技有限公司开展合作，共同致力于加速单细胞测序技术的发展和应用。双方领导带领团队合影高通量单细胞测序技术可在单细胞分辨率下获得基因组和遗传信息。与传统基因组分析相比，这种方法具有诸多优势，它可以支持研究人员检测复杂和罕见的细胞群，并阐明不同细胞谱系的发展轨迹。它是研究癌症和免疫系统等复杂和异质性系统的有力工具。安捷伦大中华区诊断与基因组学事业部总经理郑晓玮（左）与新格元创始人、首席执行官方南（右）签署战略合作协议新格元是一家创新型分子诊断公司，致力于将突破性的单细胞分析技术应用于临床诊断、药物开发和健康管理。安捷伦和新格元将共同为客户提供针对单细胞测序的一站式解决方案。双方领导为《安捷伦单细胞测序质控认证实验室》揭牌安捷伦大中华区诊断与基因组学事业部总经理郑晓玮评论道：“新格元拥有先进的一站式单细胞测序系统，可提供从组织样品处理到数据分析和挖掘的全面解决方案。安捷伦的质量控制产品可确保获得高质量测序文库，同时可改进样品处理和文库制备流程。两家公司强强联手，将共同建立适合不同样品类型的单细胞测序流程质控标准，以确保单细胞测序数据的准确性。我们期待未来能够推动单细胞测序迈上新台阶！”新格元创始人、首席执行官方南博士说道：“可靠的单细胞测序工作流程需要每个实验步骤都有准确的质量控制方法。我们很荣幸能与安捷伦科技公司这一世界领先的生命科学仪器公司达成战略合作，为我们的客户提供包括样本保存处理、单细胞分离、条形码编码、扩增、文库构建和质量控制在内的一体化解决方案。我们将与安捷伦一起，共同开发针对不同临床样品单细胞测序工作流程的QC金标准，以推进突破性单细胞测序技术在临床中的应用。”除此次的合作外，新格元目前也是安捷伦认证的测序质量控制实验室，拥有向客户演示安捷伦 NGS 质量控制仪器的资质。关于安捷伦科技安捷伦科技公司（纽约证交所：A）是生命科学、诊断和应用化学市场领域的全球领导者，致力于提供敏锐洞察与创新，帮助提高生活质量。我们的仪器、软件、服务、解决方案和专家能够为客户最具挑战性的难题提供更可靠的答案。在2020财年，安捷伦的营业收入为53.4亿美元，全球员工数为16400人。关于新格元新格元生物成立于2018年，专注高通量单细胞多组学平台产品的自主开发及临床转化。公司成立后发展迅速，现已拥有国际领先的一站式高通量单细胞测序平台，提供从组织样本处理，高通量单细胞分离及测序文库构建，到数据分析和临床意义挖掘的全面解决方案。现有产品包括自主开发生产的Singleron Matrix™自动化单细胞测序文库构建仪器，GEXSCOPE®高通量单细胞转录组试剂盒、单细胞核转录组试剂盒、免疫受体试剂盒，FocuSeq™靶向高通量单细胞测序产品，CeleScope™生信分析软件，及SynEcoSys™单细胞数据库，并已服务近300家知名医院，药企，及科研院所。

谢晓亮　　12月21日出版的美国《科学》杂志发表了题为《单细胞全基因组测序探索精子重组规律和遗传缺陷》的论文。同时，该期《科学》杂志也将单细胞全基因测序列为2013年六大值得关注的科学领域之一。　　该论文由美国科学院院士、哈佛大学教授谢晓亮课题组与北京大学生物动态光学成像中心(BIOPIC)研究员李瑞强课题组等联合完成。谢晓亮在接受《中国科学报》记者采访时表示，这项工作首次实现了高覆盖度的单个精子全基因组测序，构建了迄今为止重组定位精度最高的个人遗传图谱，这一技术方法在男性不育症研究和肿瘤早期诊断及个体化治疗等生物医学领域有着广泛的应用前景。　　谢晓亮指出，单细胞DNA扩增技术和高通量测序技术的发明，使得测序单个细胞(精子)的基因组成为可能，利用单细胞全基因组测序技术来研究人类的染色体重组规律，具有以往技术无法比拟的优势。　　首先，精子是天然重组产生的单倍体，取材方便，而且一个人身上可取的精子数量几乎是无限的，可以很容易地研究个人水平的重组分布规律 其次，单细胞全基因组测序技术提供了最高的分子标记密度，减少了偏差，能够得到最为精确的片段交叉重组定位结果，可以非常清晰地揭示片段交叉重组的分布以及个人水平上重组率的分布规律 第三，测序技术本身具有高通量、自动化等特点，随着未来测序成本的进一步降低，可以对一个人更多的精子进行测序，从而获得精度更高的个体特异性的重组率分布图谱，也可以通过比较很多人的精子来研究重组率分布在不同个体之间的差异。　　据谢晓亮介绍，以往对人类染色体重组的研究，由于受到实验技术的限制，分辨率一直都比较低，此外由于一个家庭内的孩子数目有限，以往的研究都是在群体水平上开展的，而无法开展个体水平的遗传重组规律研究。　　需要注意的是，重组率在整个基因组中并非均匀分布，而是集中在一些散布的狭小区域内，且不同物种之间以及相同物种的不同个体之间都可能存在明显差别。其中，为什么基因区附近的重组率会降低，成为长期困扰学术界的一个难题。　　研究人员使用新近发明的MALBAC扩增技术，对一个亚洲男性的99个精子进行了单细胞全基因组DNA扩增，并且利用HiSeq高通量测序技术对每个精子分别进行了一倍深度的测序，其定位精度远远超过几个月前斯坦福大学一个小组的报道。研究人员首次发现，基因区附近重组率的降低由分子机制所决定，而非自然选择的结果，从而一举解决了多年来困扰学术界的生物学难题。　　谢晓亮强调，单细胞全基因组测序是一种先进的技术方法，在未来生物医学研究中大有“用武之地”。　　例如，谢晓亮等人在此次精子测序结果中发现，有5%的精子基因组是非整倍体的，而非整倍体会造成严重的先天性出生缺陷。因此，利用单细胞全基因组测序技术，有望揭示更多的导致男性不育症的原因。　　谢晓亮还指出，已有的研究表明，基因或基因组变异是肿瘤发生的根本原因，利用单细胞全基因组测序技术，可以对获取的肿瘤细胞进行更为精确和深入的分析，了解癌细胞的基因如何突变，以及肿瘤的来源、属于哪种基因型等，为早期检测和诊断肿瘤和肿瘤的个体化治疗提供指导。

一个世纪之前，诺贝尔奖得主、德国化学家Paul Ehrlich 曾经说过：如果我们可以设计出特异性靶向某个病原体的化合物，那么，我们就可以在不伤害宿主的基础上杀死这一病原体【1】。多年过去了，尽管Ehrlich尝试了多种方法来寻找特异性肿瘤靶点，但精准抗癌，也就是在不伤害机体的情况下靶向杀伤肿瘤细胞这一概念，似乎仍停留在概念阶段【2】。时隔多年，以免疫细胞修饰为基础的免疫治疗，包括抗体-药物偶联物（antibody-drug conjugates，简称ADCs）、双特异性T细胞衔接器（bispecific T cell engagers，简称BiTEs）和嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T cells，简称CAR-T）似乎是现今的新方向。有报道指出，靶向CD19的CAR-T疗法，可以将一些B细胞淋巴瘤的治愈率提高至43%～71%【3】，但是，有40%患者出现一定程度的神经损伤。这一“脱靶效应”很可能是由其他表达CD19的细胞类型引起的【4】。事实上，作者通过提取数目稀少的血脑屏障壁细胞，并进行全基因组单细胞测序确定，上述CAR-T疗法靶向B细胞淋巴肿瘤的同时，也会靶向这些壁细胞。这也说明，单细胞全基因组测序这一方法，不但可以预测免疫治疗的脱靶效应，还可以以数据为基础分析出特异的靶标。2021年12月13日，来自美国斯坦福大学Caleb A. Lareau，Ansuman T. Satpathy和来自Cartography 公司的Kevin R. Parker 在Cancer cell上发表题为Charting the tumor antigen maps drawn by single-cell genomics的评论性文章，全面展示了这一研究方法。在概念上，作者认为，寻找和确定免疫治疗的靶点应该基于数据。下图展示了通过结合大尺度但细胞图谱和特定肿瘤分析来确定抗原靶点。高通量的单细胞全基因组测序数据库可以提供肿瘤细胞抗原的潜在靶点以及这些靶点是否存在于其他细胞上。接下来，作者阐述了目前精准抗癌的现状和存在的问题。首先，目前在临床上精准抗癌的靶点主要有三类：一是在肿瘤细胞和正常体细胞上同时表达的细胞特异性标签，比如上述针对B细胞的CD19。这一类目前应用最为广泛，并且，如果其对应的体细胞不算十分重要的话，这一诊疗方案可以说是行之有效；二是与正常体细胞相比，在肿瘤细胞上过表达的分子，比如HER2。靶向这类分子可以使得杀伤作用更为精准和强大，并且，其过表达程度，还可以表征肿瘤发展水平；三是特异性表达在肿瘤细胞上的分子，比如1997年发现的NY-ESO-1【5】。当然，高通量基因组学数据库显示这一分子还表达在免疫豁免器官和组织，比如睾丸和胎盘。这也就是说，仅通过传统手段来确定表达靶标分子的细胞类型不够精确，还需要高通量单细胞基因组数据库来进行有力补充。其次，上述数据库可以用来预测和减低免疫治疗的脱靶效应所带来的细胞毒性。如上述靶向CD19治疗B细胞淋巴瘤案例所示，免疫治疗常常会出现脱靶效应。虽然研究脱靶效应对病人的副作用这方面至关重要，但是从单细胞基因组学分析来确定特定免疫疗法对正常体细胞的影响也十分必要。接下来，作者表明，单细胞全基因组测序这一方法也适用于表达量十分稀少的细胞类型，比如CD4+T细胞，CD4的RNA水平很低，但是蛋白质水平却很高，这一类分子需要高通量数据库进行修正。最后，作者提出了单细胞全基因组测序所面临的挑战：一是如何界定某一类型细胞重要与否，并且，随年龄、性别等影响，其重要性是否有所区别。二是如何确定一标准，使得某分子在肿瘤细胞与体细胞的表达量超过这一标准，才可以认定为是潜在靶标。三是影响抗原表达水平的因素都有什么。最后，理论上可行的靶标在临床上也可能出现各类未知问题。综上所述，作者给出了有别于组织学水平和单一突变水平研究肿瘤以及肿瘤治疗的方法，也就是基于高通量单细胞全基因组测序和图谱数据分析方法。并预测，这一方法可以在预测免疫治疗靶标和临床精准抗癌方面发挥重要作用。原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ccell.2021.11.005

来自北京大学的研究人员报告称，他们开发出了一种基于乳液的扩增方法来抑制扩增偏移检测单细胞拷贝数变异(CNV)，同时以高精确度检测单核苷酸变异(SNV)。这一方法能够与各种扩增实验方案包括广泛使用的多重置换扩增(MDA)相兼容。这一重要的成果发布在9月4日的《美国国家科学院院刊》(PNAS)上。　　北京大学的谢晓亮(X. Sunney Xie) 教授及黄岩谊(Yanyi Huang)教授是这篇论文的共同通讯作者。　　谢晓亮教授是单分子生物物理化学和相干拉曼散射显微成像的开拓者之一，其研究组在离体实验及活细胞内生物系统在单分子水平的动力学研究方面取得了不少重要的成果，尤其是单分子荧光显微技术，比如相干拉曼显微成像技术(CARS、SRS)等方面成果斐然。近年来，他又在单细胞测序技术上取得突破，发表了不少重要成果。黄岩谊教授课题组主要致力于发展应用于集成生物学研究的新技术。　　过去二十几年里，随着基因测序技术水平的提高以及千人基因组计划、癌症基因组计划、Meta-Hit计划等重大国际合作项目的相继开展，基因组研究日渐被推向高潮。　　然而，一直以来的测序材料都是数百万甚至更多细胞的混合DNA样本。这种方法能够得到全基因组序列信息，但是对其进行研究得到的结果只是一群细胞中信号的平均值，或者只代表其中占优势数量的细胞信息，单个细胞独有的特性被忽视。　　另一方面，有些样品稀少无法在实验室培养，样品量不足以进行全基因组分析，例如肿瘤循环细胞、组织微阵列、早期发育的胚胎细胞等。这些都是全基因组测序遇到的难题。　　作为“在单个细胞水平上对基因组进行测序”的单细胞测序技术能够解决上述难题。与传统的全基因组测序相比，单细胞测序不仅测量基因表达水平更加精确，而且还能检测到微量的基因表达子或罕见非编码RNA，其优势是全方位和多层次的。近年来单细胞基因组学揭示出了各种生物学过程，如肿瘤进化、胚胎发育和神经体细胞嵌合前所未有的细节。　　下一代测序的全基因组扩增(WGA)技术已被广泛应用生物学和医学领域用于确定单细胞基因组特征。WGA的高度均一性和保真度是精确测定CNVs和SNVs等基因组变异的必要条件。扩增产量沿基因组波动及SNV识别假阳性及假阴性结果限制了当前流行的WGA方法。　　在这篇新文章中研究人员报告称，他们开发出了一种乳液WGA (eWGA)方法来克服这些问题。他们将单细胞基因组DNA分到油溶液包裹的大量(105)微微升水滴中。每个水滴中只包含少量的DNA片段，在反乳化作用之前每个水滴便达到了DNA扩增的饱和，因此将片段间扩增的差异被降至最小程度。研究人员进而采用MDA对eWGA方法进行了原理证明。　　研究人员表示，这种容易操作的方法可实现在单个人类细胞中同时检测CNVs和SNVs，大大改善了扩增均一性和精确度。

2014年4月29日，北京大学生物动态光学成像中心黄岩谊、汤富酬课题组在《美国科学院院刊》(PNAS)上发表题为&ldquo Microfluidic single-cell whole-transcriptome sequencing&rdquo 的论文。该研究利用微流控芯片技术实现了高质量单细胞的全转录组测序样品准备，全面提高了单细胞全转录组分析的准确性和可靠性。　　细胞是生命活动的基本功能单位，而在生物体内没有任何两个细胞是完全相同的。传统的生命科学与医学研究，绝大多数情况下都是针对混合的大量细胞进行的，无法观察到单个细胞之间细微的差别。近年来不断发展的实验技术，提供了更加定量与客观的证据，表明在许多关键生命过程例如胚胎发育、细胞分化、疾病发生与发展等过程中，特定的单个细胞行为，以及其间的个体化差异与异质性，导致了极其重要甚至是决定性的结果。而之前基于大量细胞平均测量所获得的结果并无法正确反映复杂生物体系的全面真实信息，严重掩盖了独立个体样本的行为以及生命现象中大量存在的随机行为。针对单个细胞的研究，是细胞生命分析技术所追求的极限状态，是对传统技术极大的挑战。　　单细胞测序利用新一代的测序技术来分析单个细胞内的基因信息，成为解读单细胞的最佳工具。单细胞全转录组测序是单细胞高通量测序需求量最大的应用，它所测定的是单个细胞内所有基因的表达量，同时还可以测定除了mRNA分子外，其他长非编码RNA(lncRNA)以及小RNA的含量，定量获取单个细胞完整的表达谱。目前采用的新一代测序技术中，绝大多数方法都需要特定的前处理过程，制备&ldquo 测序文库&rdquo 。而针对单细胞样品，已有的方法均存在很多缺陷，导致检测灵敏度不高、基因表达信息丢失严重、技术噪音高、操作失误率高、重复性差。　　为了解决这一矛盾，两个课题组合作开发了新的文库制备方法，将最关键的单细胞转录组文库构建步骤集成在一个微流控芯片上，可以同时进行多个样品的操作。这一技术的开发，大大减少了试剂用量，在反应效率得到提升的同时极大地抑制了污染的发生，还减少了操作误差，实现了更高的可靠性和更好的平行性。　　通过对几十个细胞的分析表明，这一方法可以有效地消除转录组高度动态特性所带来的测量差异，实现对单细胞异质性的分析和判断。通过多个细胞较低深度的转录组测序，可以获取比同等成本下单个细胞高深度测序更重要的细胞异质性信息，而更好地展现生物体系的复杂性、随机性和动态过程。而通过微流控芯片上的精确细胞操控和主动俘获过程，还可以摆脱其他类似方法中随机俘获的局限性，实现对极其少量细胞的完全俘获和反应前的表型观察，以更好地理解和验证单个细胞的异质性。与已有的技术相比，这一工作展示了目前最好的单细胞转录组测序检测灵敏度和平行性。　　黄岩谊博士同时任北京大学工学院教授，汤富酬博士同时任北京大学生命科学学院研究员。黄岩谊组博士后Aaron Streets博士、赵亮博士和研究生张先念为论文的主要作者。这一工作得到了国家科技部973计划、863计划、国家自然科学基金委及霍英东教育基金会的资助。