质谱蛋白鉴定胶内酶解法

随着“一小时酵母蛋白质组”的实现, 短梯度下实现蛋白质组深度覆盖成为可能.本文利用全新 Q-OT-qIT 三合一质谱系统进行“一小时蛋白质组”分析与优化. 50 min 有效梯度, 单次实验分别从1 μ g和50 ngHeLa全蛋白中鉴定到20860和14100条肽段, 对应到3865和 2877 个非冗余蛋白, 而目前的文献报道至少需要 2~3 h. 同时, 本文考察了 Q-OT-qIT 碎裂模式、检测方法、最大注入时间和自动增益控制等参数对蛋白质组快速分析的影响, 证明了不同采集方法间的互补性, 阐述了不同扫描参数对鉴定结果的影响. 此外, 还讨论了Q-OT-qIT 的并列运行原理和扫描组合模式, 为不同实验目的和样本类型的蛋白质组快速分析奠定了基础.

本文建立了有效的 ICP-MS 辅助蛋白质组学方法，用于鉴定市售富硒酵母样品不溶性硒组分中的含硒蛋白。采用双向凝胶电泳分离含硒蛋白，并用胰蛋白酶进行裂解。采用LA-ICP-MS、毛细管 HPLC-ICP-MS 和 ESI MS/MS 组合方法对裂解产物进行鉴定、分析和表征。由于胰酶裂解产物量非常少，所以需要使用毛细管色谱。采用本方法鉴定出了甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶-3，这是富硒酵母中的主要含硒蛋白。证明由于蛋白链中的硫-硒取代途径而引入硒，存在于蛋氨酸 (M) 和半胱氨酸 (C) 残基中，后者在酵母样品中首次发现。

本研究提出了一个 ICP-MS 辅助的蛋白质组学方法，用于鉴定富硒酵母中的含硒蛋白。采用双向凝胶电泳分离不溶性含硒蛋白。使用 LA-ICP-MS 找出分离后的含硒蛋白斑点，经切割后，用胰蛋白酶消化；所得多肽通过毛细管HPLC-ICP-MS 进行分析，然后用电喷雾离子化 (ESI-)MS/MS进行表征，鉴定出富硒酵母中主要的含硒蛋白——甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶-3。由于胰蛋白酶裂解产物量非常少，所以需要使用毛细管色谱。

饮食是人体硒 (Se) 的主要来源，该必需元素的摄入主要取决于食品中的硒含量和所消耗的食物量。由于许多国家农产品中硒的含量很低，所以硒缺乏成为了一个值得注意的问题。人们已经开发了许多提高人体硒摄入的食品添加策略；富硒酵母就是人和动物添加剂最常用的硒来源之一。本研究提出了一个 ICP-MS 辅助的蛋白质组学方法，用于鉴定富硒酵母中的含硒蛋白。采用双向凝胶电泳分离不溶性含硒蛋白。使用 LA-ICP-MS 找出分离后的含硒蛋白斑点，经切割后，用胰蛋白酶消化；所得多肽通过毛细管 HPLC-ICP-MS 进行分析，然后用电喷雾离子化 (ESI-) MS/MS进行表征，鉴定出富硒酵母中主要的含硒蛋白——甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶-3。由于胰蛋白酶裂解产物量非常少，所以需要使用毛细管色谱。

本文采用岛津LCMS-9030飞行时间高分辨液质联用仪对牛血清白蛋白(BSA)进行鉴定研究，并结合岛津LabSolutions和pFind软件对BSA酶解肽段进行匹配打分。结果显示，在胰蛋白酶酶切的情况下，使用两种计算软件对BSA二级结构确认的匹配度分别为82.4%和85.7%。利用Byonic软件对肽段上的修饰基团进行解析，结果显示，除固定修饰乙酰胺化外，BSA仅存在少量的N-脱酰胺（Deamidated）等可变修饰。该方法快速、准确，分析精确度高，为蛋白类样品的肽质谱图分析提供参考。

了解凝乳酶诱导的酪蛋白胶束形成凝胶的凝血特性对牦牛奶酪加工具有重要意义。我们之前已经发现牦牛奶需要更长的发酵时间，但与牛奶相比，牦牛奶能形成更强的凝胶。在本研究中，我们的目标是了解凝乳酶诱导牦牛酪蛋白胶束的特性，并与奶牛酪蛋白胶束进行比较。本研究利用粒度分析、微观流变学、流变学、激光共聚焦扫描电镜图像(CLSM)和低温扫描电镜图像(cryo-SEM)等技术，研究牛奶和牦牛奶的凝胶机理。

本文采用胰蛋白酶酶解蛋白的方法，得到各种蛋白的肽谱，比较几款不同的反相色谱柱在分离蛋白酶解片断时的差异，同时借助质谱，评价蛋白酶解产物- 多肽在酸性或者碱性流动相条件下表现出分离性能的差异。

人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)检测试剂盒人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)抗原、生物素化的人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

本文采用胰蛋白酶酶解蛋白的方法，得到各种蛋白的肽谱，比较几款不同的反相色谱柱在分离蛋白酶解片断时的差异，同时借助质谱，评价蛋白酶解产物- 多肽在酸性或者碱性流动相条件下表现出分离性能的差异。

摘要: 以酶解小麦面筋蛋白为原料, 研究了与κ- 卡拉胶在加热条件下的成胶特性。以凝胶的硬度和熔点为响应值, 设计了四因素三水平的响应面实验, 研究了各因素对体系凝胶特性的影响。结果表明, 当水解度和反应时间增加时,凝胶的硬度不断提高 当KCl 浓度为0.09mol/ L 时, 凝胶的硬度最大, KCl 的添加能提高凝胶的熔点。关键词: 小麦面筋蛋白, 卡拉胶, 凝胶, 质构, 熔点

各种裂解液中含有的去垢剂均会影响胰蛋白酶活性，并且对质谱分析产生很大影响，因此均需要在蛋白质样品酶解前除去。不同的去垢剂也均有不同的去除方法，包括常用的超滤和丙酮沉淀等。在进行各种各样纷繁复杂的蛋白质组学实验时，我们需要根据我们具体的实验目的来选择合适的裂解液和裂解方法，才能保证我们后续实验顺利进行，并且获得可信的结果。

数据非依赖性的扫描模式（data-independent acquisition, DIA）是近几年来发展的一种新的质谱数据采集方式。它的理念是用二级碎片离子进行蛋白相对/绝对定量。DIA 扫描模式中，超高分辨质谱对特定质量范围内的所有母离子进行碎裂，采集所有母离子的碎片离子，并快速地依次扫描相邻的母离子宽口内的所有碎片离子。DIA 的数据中包含了所有碎片离子的保留时间和强度信息。用非常小的质量偏差宽口（如 10 ppm）目标性地抽提同一肽段的多个子离子，计算子离子的强度，就能对该肽段进行鉴定和定量。DIA 定量相比传统的基于母离子强度的 DDA 定量有选择性好，定量准确等优点，所以 DIA 成为定量蛋白组学新的发展方向。

本文展示了应用MALDImini-1 紧凑型基质辅助激光解吸电离数字离子阱质谱（MALDI-DIT）质谱仪通过肽指纹图谱（PMF）和二级质谱搜库成功鉴定牛血清白蛋白（BSA）的案例，表明MALDImini-1可以满足蛋白质种类鉴定分析的要求

液质联用鉴定肽段的样品制备，通常由多步骤工作流程组成，包括溶液内蛋白酶解、肽段纯化，以及肽段分馏。该过程通常需要根据样品特性及分析目的（ 即定量或表征）定制为具体的应用方法。样品制备工作流程的自动化可提高样品处理能力、降低差异性，并且无需熟练操作人员执行重复工作。然而，自动化平台通常并不用于最初的分析开发，这是因为分析开发者很少具有开发复杂自动化方案的经验。相反，分析通常是采用湿式工作台相关技术进行开发，然后在自动化专家的帮助下移植到自动化平台。采用 AssayMAP 肽段样品制备解决方案，无需掌握专门的技术也能实现自动化操作。开发者可通过一个简单的软件用户界面和灵活的实验方案对关键实验变量进行完全控制，从而能够专注于科学分析研究。如今，分析开发者、科学家或技术员无需具备自动化专业知识也能实现可扩展、精确的自动化操作。采用 AssayMAP 平台，整个工作流程可直接在相同的硬件上进行开发，如需实现高通量样品前处理，也易于对硬件进行扩展，从而可减少或避免已有实验方案实现自动化所需的额外时间和资源。本文将介绍发现（鸟枪法）蛋白组学研究的一种常规液质联用工作流程，包括溶液内酶解、反相肽段纯化，以及肽段的强阳离子交换分馏 (SCX)，所有这些操作均由 AssayMap Bravo 液体处理器完成。采用 SCX 小柱通过增加 pH 或离子强度对大肠杆菌蛋白裂解液进行逐步洗脱，在六个 SCX 馏分中鉴定出 15000 多条特定肽段序列，其中 64-67% 的肽段可专属性地在其中一个馏分中得到鉴定。

重组Ⅲ型胶原蛋白是通过生物工程技术将人体胶原蛋白的mRNA逆转录成cDNA并嫁接至载体上，再利用转录酶表达成原始蛋白，经过高密度发酵、分离、复性、纯化、酶切工艺成产的一种高分子生物蛋白。Ⅲ型胶原蛋白主要存在于婴儿皮肤或血管内膜、肠道，与皮肤损伤修复和修复质量密切相关，因此该类医药用品对改善皮肤质量、促进皮肤创伤修复具有重要作用。重组Ⅲ型胶原蛋白的有效含量直接决定了基于其研发的医药用品的效果。本方案给出了利用凯氏定氮法测定重组Ⅲ型胶原蛋白敷料贴、凝胶敷料、液体敷料的蛋白质含量的方法。

MMP11 简介Stromelysin-3（SL-3）也被称为基质金属蛋白酶-11（MMP-11），是一种由MMP11基因编码的酶。基质金属蛋白酶（MMP）家族的蛋白质参与正常生理过程中细胞外基质的分解，如胚胎发育、生殖和组织重塑，以及疾病过程，如关节炎和转移。大多数MMP是以非活性原蛋白的形式分泌的，当被细胞外蛋白酶裂解时被激活。然而，该基因所编码的酶在构成性分泌途径中被呋喃酶在细胞内激活。另外，与其他MMP不同的是，这种酶能裂解α-1蛋白酶抑制剂，但对细胞外基质的结构蛋白降解较弱。

人葡萄糖激酶调节蛋白(GKRP)检测试剂盒人葡萄糖激酶调节蛋白(GKRP)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人葡萄糖激酶调节蛋白(GKRP)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人葡萄糖激酶调节蛋白(GKRP)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人葡萄糖激酶调节蛋白(GKRP)抗原、生物素化的人葡萄糖激酶调节蛋白(GKRP)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人葡萄糖激酶调节蛋白(GKRP)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

肽图分析是蛋白质鉴定，特别是重组蛋白鉴定的最常用的方法。它通过酶解（一般使用胰蛋白酶）将蛋白质打碎形成肽段，然后以可重现的方式进行肽段的分离和鉴定。肽图分析是一种非常有用的方法，已成为生物技术领域中最有价值的工具之一，它能检测和监控单个氨基酸改变、氧化、去酰胺化，以及其它降解形式。它还能直接检测常见的单克隆抗体修饰变异，如 N 端环化，C 端赖氨酸处理，N- 糖基化，以及内含子表达等非预期的变异。肽图是蛋白质及其酶解产物的指纹图谱，它能提供待测蛋白质的全面信息。肽图分析包含四个主要步骤，蛋白质的分离和纯化；肽键的选择性酶切；多肽的色谱分离；多肽的分析和鉴定。对测试样品与参考标准品或对照样品进行同步的酶解和分析。肽图应该包括足够数量的肽段以进行有效的分析；它不仅要提供蛋白质鉴定所需的必要信息，还应尽可能地涵盖完整的蛋白质序列。

环氧树脂是现成的载体；没有强制的活化步骤。然而再开始固定程序前，可以使用具有所需缓冲液的步骤清洗。由于环氧基团倍蛋白石/酶基团的亲和攻击打开，所以会发生固定化。环氧开环将在载体与蛋白/酶亲核基团之间形成共价键。 蛋白质/酶固定化试验通常是分批进行的，用搅拌或轨道振动筛（不要使用磁棒搅拌器），以保持树脂悬浮状态，避免产生泡沫，这通常是蛋白质变性的结果。所提供的建议必须作为一般准则加以考虑，并不是针对所有具体的固定案例都详尽无遗。

岛津基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测疫苗各亚基存在分布与比例，直接得到了样品单电荷离子、二电荷离子的分子量信息，结果与理论一致。分析速度快、仪器维护方便、性能卓越，是蛋白类疫苗亚基分析的有力工具。

实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大豆胰蛋白酶抑制因子（STI）水平。用纯化的大豆胰蛋白酶抑制因子（STI）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入大豆胰蛋白酶抑制因子（STI），再与HRP 标记的大豆胰蛋白酶抑制因子（STI）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的大豆胰蛋白酶抑制因子（STI）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中大豆胰蛋白酶抑制因子（STI）浓度。

人抗胰蛋白酶(AT)检测试剂盒人抗胰蛋白酶(AT)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人抗胰蛋白酶(AT)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人抗胰蛋白酶(AT)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人抗胰蛋白酶(AT)抗原、生物素化的人抗胰蛋白酶(AT)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人抗胰蛋白酶(AT)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

新近研究表明，通过质谱法已建立了多种独特的血清多肽组表达模式库，而血清多肽组表达模式与临床症状密切相关。阐明血清中多肽组成的序列特征及其产生机制，将有助于将血清多肽组表达模式作为可靠的疾病标识而更加广为接受。我们采用一种高度优化的多肽提取方法和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术进行的研究表明，仅靠一套有限的血清多肽表达模式（一个特征），即可将3 种类型的实体肿瘤患者和未患癌的对照受试者准确地区分开来。61 个特征肽段的靶序列识别结果显示，这些肽又可分为密切相关的几个簇，大多数是由于造成肿瘤类型特异性差异的胞外蛋白酶活性影响了体内结合蛋白质的水解过程和补体的降解过程而产生的。这一特征肽段家族成员虽少、但功能极为强大，可精确预测前列腺癌样本的分级，其准确度与其他标准方法可比。总之，本研究表面，疾病的肽段标记物表达谱和蛋白酶活性的差异之间存在直接的相互关联，而且，本文中所描述的几种肽段表达模式在临床上有望用作癌症检出和分级的标记物，同时我们的发现对未来的肽段生物标记物的研究也具有重要的提示意义。

引起过敏的物质称为过敏原,一般为蛋白质类物质。 随着食物过敏患者的增多,以及可能导致过敏性休克甚至死亡等严重后果,已建立了一系列针对过敏原的法规及检测方法,包括核酸法(PCR)和酶联免疫法(ELISA)等。 新兴的质谱法(MS)灵敏度高、假阳性概率低,并具有方法开发快速、运行成本低等优势。葡萄酒酿造过程中需要加入澄清剂去除沉淀物质,使酒液获得长期稳定性。 酪蛋白是常用的澄清剂之一。 酪蛋白是一种来源于牛乳的过敏原,残留在葡萄酒中会对过敏人群产生危害。 但是葡萄酒,特别是红葡萄酒含有大量单宁等鞣质,单宁与蛋白质之间存在多点疏水键和氢键的作用,有很强的蛋白结合能力。 单宁常用作酶抑制剂使酶失活。 单宁极大地抑制了葡萄酒蛋白的提取与酶解,传统蛋白提取方法(超滤、透析、有机溶剂沉淀等)用于葡萄酒时回收率只有 20% ~30%。 因此,关于葡萄酒过敏原质谱分析的报道很少,研究对象也集中在单宁含量很低的白葡萄酒,对于含有大量单宁的红葡萄酒的前处理和质谱分析仍无成熟的策略。已报道的方法如十二烷基硫酸钾(KDS)法、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)法等,提取后蛋白仍需要电泳去除单宁和两性电解质,工作量大,分析通量低,蛋白质的回收率很低。交联聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)是 PVP 交联后形成的颗粒(约 110 μ m),具有很强的吸附能力。PVPP 竞争性地与单宁结合,释放蛋白,可以有效去除单宁等多酚类物质。本研究利用 PVPP 建立了快速、高效的红葡萄酒蛋白提取与酶解方法,使前处理时间缩短到 2 h 之内,回收率达到 80% 以上。 将本方法与三重四极杆液相色谱鄄串联质谱联用(LC-MS/ MS)结合,分析了红酒中 3 种亚型的酪蛋白,检出限达到 10 μ g/ L,比目前报道的方法提高了至少一个数量级。

人脂蛋白脂酶(LIPD)ELISA试剂盒人脂蛋白脂酶(LIPD)ELISA试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人脂蛋白脂酶(LIPD)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人脂蛋白脂酶(LIPD)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人脂蛋白脂酶(LIPD)抗原、生物素化的人脂蛋白脂酶(LIPD)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人脂蛋白脂酶(LIPD)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

人GTP酶活化蛋白(GAP)检测试剂盒人GTP酶活化蛋白(GAP)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人GTP酶活化蛋白(GAP)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人GTP酶活化蛋白(GAP)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人GTP酶活化蛋白(GAP)抗原、生物素化的人GTP酶活化蛋白(GAP)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人GTP酶活化蛋白(GAP)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

北京大学毛有东教授团队通过时间分辨冷冻电镜技术，揭示了与去泛素化酶动态调控人源蛋白酶体（proteasome）的机制，并利用Monolith分子互作仪检测了在有底物和无底物的条件下，蛋白酶体26S与USP14的相互作用。

人抗麦胶蛋白/麦醇溶蛋白抗体(AGA)检测试剂盒人抗麦胶蛋白/麦醇溶蛋白抗体(AGA)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人抗麦胶蛋白/麦醇溶蛋白抗体(AGA)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人抗麦胶蛋白/麦醇溶蛋白抗体(AGA)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人抗麦胶蛋白/麦醇溶蛋白抗体(AGA)抗原、生物素化的人抗麦胶蛋白/麦醇溶蛋白抗体(AGA)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人抗麦胶蛋白/麦醇溶蛋白抗体(AGA)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度

酵母水解物是以酵母为原料，经液体发酵得到的菌体，再经自溶或外源酶催化水解后，浓缩或干燥获得的产品。酵母水解物富含核酸、小肽、谷胱甘肽、游离氨基酸、甘露聚糖等营养功能性成分，是一种优质的单细胞蛋白饲料原料。本实验参照《GB/T 24318 杜马斯燃烧法测定饲料原料中总氮含量及粗蛋白质的计算》使用杜马斯定氮仪对酵母水解物中的粗蛋白含量进行测定。

本研究运用第二种方案，着重对生鸡蛋和熟鸡蛋样品中的已知致敏蛋白质进行了鉴定和定量分析。使用胰蛋白酶酶解萃取自生鸡蛋和熟鸡蛋样品的蛋白质，然后使用Waters SYNAPT G2-Si，运用离子淌度数据非依赖型方法(此方法会在交替扫描期间不断切换低碰撞能量和高碰撞能量状态)采集非标记蛋白质表达数据。