液相色谱测定中剂外标法

摘要：采用超高效液相色谱一串联质谱技术，建立了水中5类共12种抗生素的同时检测方法。分析物包括4种四环素类、3种磺胺类、2种大环内酯类、2种喹诺酮类和1种酰胺醇类抗生素。样品经过0.22 um滤膜过滤，采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱拄(50 mill x2.1 mm，1.7 um)分离，以0.1%(体积分数)甲酸溶液一甲醇为流动相梯度洗脱，采用电喷雾离子源串联质谱，在正离子模式下采用多反应监测(MRM)模式检测，外标法定量。12种抗生素类药物在0.1～50 us/L质量浓度范围内线性关系良好(相关系数大于0.99)，检出限为0.0002&mdash 0.005 ug/L。以实验室纯水为基质，在2。0、10.0 ug/L 2个加标水平的平均回收率为90.9%一113.0%，相对标准偏差(RSD)为1.86%～7.87%。该方法准确可靠、方便快捷，适用于水体中抗生素类药物的定性定量分析。　　相关文献：超高效液相色谱一串联质谱法测定水中12种抗生素.pdf

链霉素和双氢链霉素（DHSTR）属于氨基糖苷类抗生素，对革兰氏阴性菌有明显的抗菌活性效果，可以预防和治疗多种动物疾病。由于链霉素和双氢链霉素能够有效地治疗蜜蜂的幼虫病，在养蜂行业应用普遍，但由于管理和使用的不科学，会造成蜂产品中该类物质的残留。长期食用链霉素和双氢链霉素超标的蜂产品，会对健康产生一定的危害，尤其是听觉神经。因此，国内和国际对蜂产品中链霉素、双氢链霉素的限量均有相关的规定。我国《绿色食品蜂产品》（NY/T 752-2012）中规定了蜂蜜中链霉素的最大残留限量为20μg/kg；英国食品标准署规定蜂蜜中链霉素的限量为50μg/kg；德国规定蜂蜜中链霉素的限量为20μg/kg。在山东省食品药品检验研究院组织的蜂蜜风险监测中，链霉素检出率较高。因此，建立蜂蜜中链霉素、双氢链霉素残留量的先进、高效、准确的检测方法，对保障公众的饮食健康具有重要意义。研制背景　　原有蜂蜜中链霉素和双氢链霉素的检验标准有三项，这三个标准存在如下问题：（1）在流动相或提取剂中使用离子对试剂，离子对试剂的使用会污染色谱柱，且与质谱检测器不兼容，易造成离子源污染和信号抑制，甚至造成其他目标物无法检测；（2）净化方式均采用双柱串联，检测成本较高，步骤繁琐、耗时、检测效率低；（3）对花粉含量较高的蜂蜜，净化时易造成固相萃取柱的阻塞；（4）采用液相色谱法测定链霉素，需衍生化，重现性差，对同时含有链霉素和双氢链霉素的样品无法准确定量。因此，各检验机构无法利用原有方法进行蜂蜜中链霉素和双氢链霉素的检测。检验方法的不完善造成2018年-2021年，蜂产品的国家风险监测方案将链霉素和双氢链霉素两项目取消。方法简介　　本方法适用于蜂蜜中链霉素和双氢链霉素的测定。方法采用含三氯乙酸的磷酸盐缓冲溶液提取试样中的链霉素和双氢链霉素，经离心和过滤后，HLB固相萃取柱净化，混合型两性离子键合的SIELC Obelisc R色谱柱分离，液相色谱-串联质谱仪进行检测，外标法定量。　　本标准与原有检测标准相比，具有以下优势：（1）摒弃了离子对试剂，与质谱检测器更好地兼容；（2）突破常规的双柱串联固相萃取方式，采用单柱净化模式，提高了检测效率，节约了检验成本。技术要点　　蜂蜜含有大量的果糖和葡萄糖，为了达到去除杂质的目的，需要在前处理过程中对目标物进行净化、富集。固相萃取因简单、快速、高效等特点被广泛应用于蜂蜜中链霉素和双氢链霉素的净化。HLB固相萃取柱在去除糖类、蛋白等杂质上有一定的优势，虽不能直接保留目标物，但是借助一定的提取溶剂，两种化合物均能得到很好地保留。　　链霉素和双氢链霉素属于碱性化合物，易溶于水，难溶于甲醇、乙腈等有机溶剂，因此可采用缓冲液进行提取。链霉素和双氢链霉素极性大，文献多采用提取溶液中添加离子对试剂或三氯乙酸的方法，以增加两种目标物在固相萃取柱上的保留。若前处理过程中离子对试剂去除不彻底，对色谱柱和质谱检测器将会有一定程度的污染，因此，本标准选择添加三氯乙酸的方法。研究发现，含20 g/L三氯乙酸的缓冲液pH在6~7之间时，回收率较高且比较稳定，之后再增加溶液的pH，回收率逐渐下降。　　在实际样品测定中，用2%TCA（pH 6.8）提取后，不同蜂蜜样品之间回收率差别较大，且回收率偏低。对提取后的样品处理液进行pH值测定，发现pH在3.5~6.2之间，这是引起回收率偏低的重要原因。蜂蜜样品含有多种有机酸，而提取液无缓冲能力，经提取后样品处理液的pH值会发生变化。为解决此问题，研究人员在提取液中加入10 mmol/L～50 mmol/L磷酸盐。研究结果表明，50mmol/L磷酸盐缓冲效果较好，样品处理液的pH值稳定在6.2~ 6.7。综合以上因素，50 mmol/L磷酸盐缓冲液（含20 g/L三氯乙酸，pH 6.8）作为最终的提取溶剂。　　研究人员进一步对洗脱溶剂中甲酸的浓度和洗脱体积对链霉素和双氢链霉素回收率的影响进行了考察，甲酸-乙腈-水（2: 5:93，v/v/v）溶液1.0 mL为最佳洗脱条件。操作注意事项　　蜂蜜在存放过程中很容易析出结晶，为保证分析结果的准确性和代表性，对无结晶的实验室样品，直接将其搅拌均匀；对有结晶的样品，检验前，在密闭情况下，置于不超过60℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，分出0.5 kg作为待测试样用于检验。　　在标准溶液配制过程中还需注意，若采用非本标准中形式的标准物质，需进行分子量折算后再进行标准品称量；若经常使用，建议将标准储备液分装成小包装，每次将小包装解冻使用。此外，氨基糖苷类药物易与玻璃器皿发生吸附，实验过程中尽量使用塑料器皿；提取溶液的pH值将影响目标物在固相萃取柱上的保留效果，因此需采用pH计准确调节pH值至指定范围。　　SIELC Obelisc R色谱柱是在硅胶表面修饰了羧酸类的官能团，醇类会酯化硅胶表面键合的羧酸，影响物质的保留时间与重现性，因此色谱柱使用过程不能接触甲醇。建议严格按照色谱柱使用说明进行色谱柱的活化与维护。方法应用　　BJS 202103《蜂蜜中链霉素和双氢链霉素的测定液相色谱-串联质谱法》已于2021年1月发布实施，已列入2022年全国食品安全风险监测计划中，在全国范围内得到广泛应用。本方法的发布实施可以为企业和监管部门提供技术支持，对市场监管具有重要意义。□山东省食品药品检验研究院　薛 霞

p　　维生素是生物生长和代谢所必需的微量有机物。分为脂溶性维生素和水溶性维生素两类。前者包括维生素A、维生素D、维生素E等，后者有B族维生素和维生素C。人和动物缺乏维生素时不能正常生长，并发生特异性病变，即所谓维生素缺乏症。目前随着国家对食品安全的重视，及国家GB5009. 82 — 2016新国标的执行，《食品安全国家标准 食品中维生素 A 、 D 、 E 的测定》，HPLC 法作为国标第一法测试维生素A,E及第四法测定维生素D的方法。此处，安捷伦液相色谱仪及EYELA前处理仪器则为新国标的实施诠释了完美的解决方案。/pp style="text-align: center "img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201803/insimg/3b0de762-c5f2-4811-add2-548a611ab3be.jpg" title="640-15.jpeg"//ppspan style="color: rgb(0, 112, 192) "strong　　1、维生素A、D、E的测定原理：/strong/span/pp　　食品或保健食品试样经过皂化后，经石油醚萃取，用液相色谱法分离，外标法定量。/pp检测试样举例：市售奶粉、奶粉伴侣、米粉、婴幼儿葡萄糖和复合维生素片维生素AD制剂或鱼肝油等样品。/ppstrongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "　　2、试剂与材料/span/strong/pp MILLIPORE MILLI-Q 一级超纯水/pp 无水硫酸钠：化学纯/pp 乙醇：色谱纯/pp 氢氧化钾：化学纯/pp 石油醚：沸程30 ℃～60 ℃，化学纯/pp 甲醇：色谱纯/pp 0.22um有机系针筒式微孔滤膜过滤器/pp 维生素A,D,E 标准品，美国 SIGMA 公司/ppspan style="color: rgb(0, 112, 192) "strong　　3、仪器和设备/strong/span/pp AGILENT 1220II-DAD梯度高效液相色谱仪/pp 旋转蒸发器EYELA N-1300V-WB/pp 恒温震荡空气浴摇床：EYELA NTS-4000BH(控温：》60度）/pp 氮吹仪EYELA MGS-2200/pp 超声波清洗器PM5-2000TD/pp 天平：感量为 0.1 mgMETTLER MS-204TS/pp HAIER 低温冰箱 DW-25L278(-20度）（保存标准品储备液）/pp 聚四氟乙烯漏斗/pp 500ml分析漏斗/pp 快速滤纸/pp 分液漏斗木头架/pp 分液漏斗振摇器EYELA MMV-1000W/ppspan style="color: rgb(0, 112, 192) "strong　　4、分析检测方法步骤/strong/span/pp 1. 皂化：/pp 1）准确称取样品：5-20g到250m皂化瓶中；/pp 2）加入40ml 含16g/l抗坏血酸的无水乙醇溶液，搅拌均匀后，加入氢氧化钾（KOH:H2O=1:1）25ml。/pp 3）确保在EYELA NTS-4000BH 水浴振荡箱 60℃下皂化60min 摇匀，避光 使皂化完全，皂化后立即置于冰水浴冷却；/pp 2.提取/pp 1）皂化液转入500ml分液漏斗，用150ml石油醚提取于strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "EYELA MMV-1000W/span/strong分液漏斗振摇器振摇5min，静止5min分层。/pp style="text-align: center "img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201803/insimg/32679560-a669-4dc4-b648-16b597efa4a2.jpg" title="640-16.jpeg"//pp 2）分层后转移至另一个分液漏斗，加100ml石油醚同法萃取，合并醚液，/pp 3）水洗有机相3次至中性/pp 醚液过无水硫酸钠，用250ml鸡心瓶收集。/pp 4）40℃EYELA N1300V-WB旋蒸蒸发旋蒸至1ml左右/pp 5) 用约5ml石油醚洗待测组分于50ml塑料离心管，EYELA MGS-2200氮吹仪吹干。/pp 6) 用10ml色谱甲醇复溶解，涡旋混合仪混匀。/pp 7) 样品过0.22μm滤膜，进样10ul上Agilent 1220HPLC./pp 5F维生素A、D、E 测定色谱/pp 色谱柱：Agilent色谱柱：Prooshell 120 PFP(五氟苯基）， 50 mm × 4.6 mm, 2.7μm，（备注：PFP柱对位置异构体具有良好的选择性的保留时间）/pp 检测波长：维生素A(325nm)；维生素:(294nm)；维生素D:264nm。/pp 波长检测方法：（0-4.5）min 325nm，（4.5-6）min 改变为294nm，5min左右切阀（时间长短0.4-0.45min）（6-15）min改变为264nm./pp 柱温：35 ℃± 2℃。/pp 进样量：10 μL。/pp 时间：15min/pp 流动相：一维:甲醇,水；流速：:1ml/min；/pp 维生素A D E 标准曲线的绘制/ppspan style="color: rgb(0, 112, 192) "strong　　标准曲线的制作/strong/span/pp　　本法采用外标法定量。将维生素A 和维生素 E 标准系列工作溶液分别注入高效液相色谱仪中,测定相应的峰面积,以峰面积为纵坐标,以标准测定液浓度为横坐标绘制标准曲线,计算直线回归方程。/p