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垂直电泳槽蛋白胶电泳

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垂直电泳槽蛋白胶电泳相关的论坛

  • 【资料】电泳知识介绍(三)电泳槽

    电泳槽是凝胶电泳系统的核心部分,其系统的迅猛发展主要也是体现在电泳槽上。根据电泳的原理,凝胶都是放在两个缓冲腔之间,电场通过凝胶连接两个缓冲腔。缓冲液和凝胶之问的接触可以是直接的液体接触,也可以间接通过凝胶条或滤纸条。管状凝胶电泳和垂直板状电泳大多采取直接液体接触方式。这种方式可以有效地使用电场,但在装置设计上有一些困难,如液体泄漏,电安全和操作麻烦等问题。水平板状电泳槽大多通过间接方式,用滤纸桥搭接以及最近使用缓冲液制作的凝胶条和滤纸条搭接,即半干技术,后种方式使装置简化,操作也大大方便。

  • 垂直电泳仪特点参数及应用

    [url=http://www.f-lab.cn/electrophoresis/10wdsys.html][b]垂直电泳仪[/b]MV-10WDSYS[/url]是一款通用型多功能[b]凝胶电泳槽[/b],非常适合[b]琼脂糖凝胶电泳[/b]等实验室日常电泳使用。最大样品梳和样品盘具有192个样品容积的能力,使用多通道[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]可快速完成样品加载,是进口垂直电泳仪品牌中垂直电泳仪价格合理的电泳仪器.[b]垂直电泳仪[/b]具有内锁功能的盖子,能够阻止电泳过程中有害物质溢出,是一种非常安全的电泳仪。[b]垂直凝胶电泳仪[/b]可广泛用于:Northern blotting, Southern blotting, cosmid library restriction analysis, STS screening, microsatellite analysis,PCR fragment analysis, RFLP analysis, DNA finger-printing and High Throughput analysis.[img=垂直电泳仪]http://www.f-lab.cn/Upload/MV-10WDSYS.jpg[/img][b]垂直电泳仪[/b]特色快速凝胶灌注和加载电泳液冲洗消耗少单个铸造电泳槽安全可靠方便样品加载电泳指示功能冰块制冷[b]垂直电泳槽参数[/b]体积:W260xL160xH160mm凝胶盘尺寸: W180xL80mm 最大样品数:192个 缓冲液容积:600~2800ml构造:注塑铸造,耐用防漏。电极:可更换抗腐蚀99.99%铂金上盖:安全而通风可快速凝胶灌制更多凝胶电泳仪请浏览官网:[url]http://www.f-lab.cn/electrophoresis.html[/url]

  • 蛋白电泳小技巧2

    4. 电泳时虽然小电泳分离效果要好一些,但2小时以上的等待的时间实在是痛苦,因此可以提高电泳至150V,但需要将整个电泳槽放在放满冰水的脸盆里散热,这样跑出来的胶分离效果丝毫不比低电压来的差,关键是时间大大节省,不需1h即可看结果了。5. 做SDS-PAGE的时候,除了蛋白量上样一致,最好体积也一致,这样跑出来的胶各个泳道之间的band能做到一样宽,方便后面的比较,特别是WB。做法就是拿1X的上样缓冲补全要加的样做到体积一致,否则跑出来会有的宽有的窄,特别是上样体积相差较大的。

  • 电泳仪分类

    根据电泳仪原理、电泳仪功能、电泳仪的使用方法、电泳仪的用途不同可以为:琼脂糖凝胶电泳、毛细管电泳、凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、醋酸纤维薄膜电泳、高效毛细管电泳、琼脂糖电泳、SDS-PAGE凝胶电泳、蛋白质电泳、血清蛋白电泳、dna电泳、血红蛋白电泳、蛋白质双向电泳、免疫电泳、等电聚焦电泳、单细胞凝胶电泳、蛋白质凝胶电泳、质粒电泳、对流免疫电泳、变性电泳等。电泳仪分类:1、毛细管电泳仪:其主要部件有0~30kV可调稳压稳流电源,内径小于100μm(常用50~75μm)、长度一般为30~100cm的弹性石英毛细管、电极槽、检测器和进样装置。检测器有紫外/可见分光检测器、激光诱导荧光检测器和电化学检测器,前者最为常用。进样方法有电动法(电迁移)、压力法(正压力、负压力)和虹吸法。成套仪器还配有自动冲洗、自动进样、温度控制、数据采集和处理等部件。 2、常规电泳仪:其组成部件为可调稳压稳流电源,垂直电泳槽,水平电泳槽,电极连接线,支持体【非凝胶性支持体区带电泳(支持体有:①淀粉②纤维素粉③玻璃粉,硅胶等) ;凝胶支持体区带电泳支持体有:①淀粉液②聚丙烯酰胺凝胶③琼脂(糖)凝胶】;陶瓷板,抽水泵,输水管,冰水曹等部件组成。3、其他电泳仪:Tiselius或微量电泳、显微电泳、等电点聚焦电泳技术、等速电泳技术、密度梯度电泳等。是一种非支持体的电泳仪也称为自由电泳法的发展并不迅速,因为其电泳仪构造复杂、体积庞大,操作要求严格,价格昂贵等很少使用。毛细管电泳仪、凝胶电泳仪、垂直电泳仪、微电泳仪、高压电泳仪、水平电泳仪、高效毛细管电泳仪、双向电泳仪、bio rad 电泳仪、脉冲场电泳仪、伯乐电泳仪、北京六一电泳仪上海巴玖均可提供!

  • 等电聚焦电泳法测定蛋白质的等电点

    一、实验目的了解等电聚焦的原理。通过蛋白质等电点的测定,掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直管式等电聚焦电泳技术。二、实验原理等电聚焦(Isoelectric focusing,简称IEF)是六十年代中期出现的新技术。近年来等电聚焦技术有了新的进展,已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。目前等电聚焦技术已可以分辨等电点(pI)只差0.001pH单位的生物分子。由于其分辨力高,重复性好,样品容量大,操作简便迅速,在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用。蛋白质分子是典型的两性电解质分子。它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子,向电场的正极泳动,在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子,向电场的负极泳动。这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中,即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。如果在一个有pH梯度的环境中,对各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳,则在电场作用下,不管这些蛋白质分子的原始分布如何,各种蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置处进行聚焦,经过一定时间的电泳以后,不同等电点的蛋白质分子便分别聚焦于不同的位置 。这种按等电点的大小,生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为就称为“等电聚焦”。等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度,使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦,从而达到分离、测定和鉴定的目的。两性电解质载体,实际上是许多异构和同系物的混合物,它们是一系列多羧基多氨基脂肪族化合物,分子量在300~1000之间。常用的进口两性电解质为瑞典Pharmacia-LKB公司生产的Ampholine 和Pharmalyte,价格昂贵。国产的有中国军事医学科学院放射医学研究所和上海生化所生产的两性电解质,价格便宜,质量尚佳。两性电解质在直流电场的作用下,能形成一个从正极到负极的pH值逐渐升高的平滑连续的pH梯度。若不同的pH值的两性电解质的含量与pI值的分布越均匀,则pH梯度的线性就越好。对Ampholine两性电解质的要求是缓冲能力强,有良好的导电性,分子量要小,不干扰被分析的样品等。在聚焦过程中和聚焦结束取消了外加电场后,如保持pH梯度的稳定是极为重要的。为了防止扩散,稳定pH梯度,就必须加入一种抗对流和扩散的支持介质,最常用的这种支持介质就是聚丙烯酰胺凝胶。当进行聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳时,凝胶柱内即产生pH梯度,当蛋白质样品电泳到凝胶柱内某一部位,而此部位的pH值正好等于该蛋白质的等电点时,该蛋白质即聚焦形成一条区带,只要测出此区带所处部位的pH值,即为其等电点。电泳时间越长,蛋白质聚焦的区带就越集中,越狭窄,因而提高了分辨率。这是等电聚焦的一大优点,不像一般的其他电泳,电泳时间过长则区带扩散。所以等电聚焦电泳法不仅可以测定等电点,而且能将不同等电点的混合的生物大分子进行分离和鉴定。早期的等电聚焦电泳是垂直管式的,其特点是体系是封闭的,不与空气接触,可防止样品氧化。近年来,又发展了超薄层水平板式等电聚焦电泳。此法的优点是加样数量多,节省两性电解质,电泳后固定、染色、干燥都十分迅速简便,其最大优点是防止了电极液的电渗作用而引起正负两极pH梯度的漂变。测定pH梯度的方法有四种:1.将胶条切成小块,用水浸泡后,用精密pH试纸或进口的细长pH复合电极测定pH值,然后作图。2.用表面pH微电极直接测定胶条各部分的pH值,然后作图。3.用一套已知不同的pI值的蛋白质作为标准,测定pH梯度的标准曲线。4.将胶条于-70℃冰冻后切成1mm的薄片,加入0.5ml 0.01M KCl,用微电极测其pH。三、仪器和用具1.电泳仪2.垂直管式园盘电泳槽一套3.注射器与针头4.移液管:10ml、5ml、2ml、1ml、0.1ml5.小烧杯若干6.培养皿一套7.直尺8.小刀9.精密pH试纸和带细长复合pH电极的pH计10.塑料薄膜和橡皮筋

  • 【资料】电泳技术

    电泳技术发展简史 1809年俄国物理学家Рейсе首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极,加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊,即带负电荷的粘土颗粒向正极移动,这就是电泳现象。 1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。 1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进,创造了Tiselius电泳仪,建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法,并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白组成的,由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。 1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法,对氨基酸的分离进行过研究。 从本世纪50年代起,特别是1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后,开创了利用各种固体物质(如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等)作为支持介质的区带电泳方法。 1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质,创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳,极大地提高了电泳技术的分辨率,开创了近代电泳的新时代。30多年来,聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍,分辨率最高的分析鉴定技术,是检验生化物质的最高纯度:即“电泳纯”(一维电泳一条带或二维电泳一个点)的标准分析鉴定方法,至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段,即“Last Check”。 由80年代发展起来的新的毛细管电泳技术,是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展,己受到人们的充分重视。4.2 电泳的基本原理 电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子,如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团,它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电,在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下,由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异,使带电分子产生不同的迁移速度,从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。 电泳过程必须在一种支持介质中进行。Tiselius等在1937年进行的自由界面电泳没有固定支持介质,所以扩散和对流都比较强,影响分离效果。于是出现了固定支持介质的电泳,样品在固定的介质中进行电泳过程,减少了扩散和对流等干扰作用。最初的支持介质是滤纸和醋酸纤维素膜,目前这些介质在实验室已经应用得较少。在很长一段时间里,小分子物质如氨基酸、多肽、糖等通常用滤纸或纤维素、硅胶薄层平板为介质的电泳进行分离、分析,但目前则一般使用更灵敏的技术如HPLC等来进行分析。这些介质适合于分离小分子物质,操作简单、方便。但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展,使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝胶,但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。 电泳装置主要包括两个部分:电源和电泳槽。电源提供直流电,在电泳槽中产生电场,驱动带电分子的迁移。电泳槽可以分为水平式和垂直式两类。垂直板式电泳是较为常见的一种,常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。电泳槽中间是夹在一起的两块玻璃板,玻璃板两边由塑料条隔开,在玻璃平板中间制备电泳凝胶,凝胶的大小通常是12cm ? 14 cm,厚度为1mm~2 mm,近年来新研制的电泳槽,胶面更小、更薄,以节省试剂和缩短电泳时间。制胶时在凝胶溶液中放一个塑料梳子,在胶聚合后移去,形成上样品的凹槽。水平式电泳,凝胶铺在水平的玻璃或塑料板上,用一薄层湿滤纸连接凝胶和电泳缓冲液,或将凝胶直接浸入缓冲液中。由于pH值的改变会引起带电分子电荷的改变,进而影响其电泳迁移的速度,所以电泳过程应在适当的缓冲液中进行的,缓冲液可以保持待分离物的带电性质的稳定。

  • 关于测序电泳槽???

    各位大神: 最近有个朋友跟我提到了一个测序电泳槽,想问问各位大神什么事测序电泳槽啊?它的工作原理是怎么样的,电泳基本知识我知道,但测序电泳它是如何实现测序和微卫星分析等等功能的?

  • 电泳槽细菌测试

    电泳槽细菌测试流程如下。所用仪器:小冰箱、培养盘、温度控制在30摄氏度的细菌培养盘、无菌棉棒、可以长期保存的标签、可以自由处置的含90%的无菌水瓶。操作流程:1、打开稀释瓶倒入10ml电泳漆。2、塞上瓶塞并且轻摇瓶身,充分摇匀。3、将培养盘移出冰箱,并根据标签进行区分。4、将棉棒伸入稀释过的样品,滴三滴在琼脂上,进行测试。5、保持温度和湿度的稳定性。6、两天后定期做检查,7天后丢弃样品。根据以上实验,电泳漆的主槽要每周进行一次细菌含量的检测,当主槽进行过两次细菌测试时,对包括洗涤系统在内的整个系统进行UF或RO预处理;将主槽内使用的加仑数再加上软管中的加仑数(折合为主槽的10%),来计算增加的杀菌剂的数量。 先后用1.5%的Kathon EDC及硝酸银处理细菌。用在电泳槽以及洗涤槽内的杀虫剂必须是与存在的细菌是相配的。 在24小时内保持细菌的水平。

  • 【求助】谁知道水平电泳槽呢

    水平电泳槽中UV 盘,胶模盘 ( 可用来制胶 ),电梳都是做什么用的。是SCIE-plas HU13型号。借宝地发个贴,tutm你知道吗?有没个什么的说明书呢?急用。

  • 【分享】生物化学实验讲义1-电泳技术

    生化实验讲义(理论部分)--电泳技术   4.1 电泳技术发展简史1809年俄国物理学家Рейсе首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极,加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊,即带负电荷的粘土颗粒向正极移动,这就是电泳现象。1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进,创造了Tiselius电泳仪,建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法,并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白组成的,由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法,对氨基酸的分离进行过研究。从本世纪50年代起,特别是1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后,开创了利用各种固体物质(如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等)作为支持介质的区带电泳方法。1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质,创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳,极大地提高了电泳技术的分辨率,开创了近代电泳的新时代。30多年来,聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍,分辨率最高的分析鉴定技术,是检验生化物质的最高纯度:即“电泳纯”(一维电泳一条带或二维电泳一个点)的标准分析鉴定方法,至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段,即“Last Check”。由80年代发展起来的新的毛细管电泳技术,是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展,己受到人们的充分重视。4.2 电泳的基本原理电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子,如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团,它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电,在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下,由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异,使带电分子产生不同的迁移速度,从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。电泳过程必须在一种支持介质中进行。Tiselius等在1937年进行的自由界面电泳没有固定支持介质,所以扩散和对流都比较强,影响分离效果。于是出现了固定支持介质的电泳,样品在固定的介质中进行电泳过程,减少了扩散和对流等干扰作用。最初的支持介质是滤纸和醋酸纤维素膜,目前这些介质在实验室已经应用得较少。在很长一段时间里,小分子物质如氨基酸、多肽、糖等通常用滤纸或纤维素、硅胶薄层平板为介质的电泳进行分离、分析,但目前则一般使用更灵敏的技术如HPLC等来进行分析。这些介质适合于分离小分子物质,操作简单、方便。但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展,使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝胶,但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。电泳装置主要包括两个部分:电源和电泳槽。电源提供直流电,在电泳槽中产生电场,驱动带电分子的迁移。电泳槽可以分为水平式和垂直式两类。垂直板式电泳是较为常见的一种,常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。电泳槽中间是夹在一起的两块玻璃板,玻璃板两边由塑料条隔开,在玻璃平板中间制备电泳凝胶,凝胶的大小通常是12cm 14 cm,厚度为1mm~2 mm,近年来新研制的电泳槽,胶面更小、更薄,以节省试剂和缩短电泳时间。制胶时在凝胶溶液中放一个塑料梳子,在胶聚合后移去,形成上样品的凹槽。水平式电泳,凝胶铺在水平的玻璃或塑料板上,用一薄层湿滤纸连接凝胶和电泳缓冲液,或将凝胶直接浸入缓冲液中。由于pH值的改变会引起带电分子电荷的改变,进而影响其电泳迁移的速度,所以电泳过程应在适当的缓冲液中进行的,缓冲液可以保持待分离物的带电性质的稳定。为了更好的了解带电分子在电泳过程中是如何被分离的,下面简单介绍一下电泳的基本原理。在两个平行电极上加一定的电压(V),就会在电极中间产生电场强度(E),L是电极间距离。在稀溶液中,电场对带电分子的作用力(F),等于所带净电荷与电场强度的乘积。这个作用力使得带电分子向其电荷相反的电极方向移动。在移动过程中,分子会受到介质粘滞力的阻碍。粘滞力(F’)的大小与分子大小、形状、电泳介质孔径大小以及缓冲液粘度等有关,并与带电分子的移动速度成正比,对于球状分子,F’的大小服从Stokes定律,即:

  • 蛋白等电聚焦凝胶电泳技术

    1.原理等电聚焦凝胶电泳是依据蛋白质分子的静电荷或等电点进行分离的技术,等电聚焦中,蛋白质分子在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯度中电泳。载体两性电解质是脂肪族多氨基多羧酸,在电场中形成正极为酸性,负极为碱性的连续的pH梯度。蛋白质分子在偏离其等电点的pH条件下带有电荷,因此可以在电场中移动;当蛋白质迁移至其等电点位置时,其静电荷数为零,在电场中不再移动,据此将蛋白质分离。 等电聚焦中,只有在凝胶两端给以高电压时,才能获得较好的蛋白质条带分辨率,这就需要非常有效的凝胶冷却系统(否则会导致烧胶),即凝胶同期周围液体之间的热传递效率要高。由于平板胶热传递能力高,并可方便的同时比较多种蛋白质样品,所以平板胶用在等电聚焦上的居多。由于等电聚焦对蛋白质的电荷差异非常敏感,若要好的重复性,制备蛋白样品时一定要小心,要避免任何对蛋白质化学组成和结构的修饰。另外,蛋白质-脂类、蛋白质-蛋白质相互作用可引起电荷改变,进而导致等电点迁移或纹理现象。除非特殊需要研究蛋白质-蛋白质相互作用或者必须保持蛋白质的生物学功能,等电聚焦通常在含有尿素的变性凝胶系统中进行。使用非离子去垢剂也可以提高分辨率。 2.主要仪器、试剂仪器:微型电泳系统、电源、注射器、固定和染色用容器 试剂:丙稀酰胺、双-丙稀酰胺、载体两性电解质、尿素、过硫酸胺、TEMED、TritonX-100、2-巯基乙醇、溴酚蓝、磷酸、氢氧化钠、氯化钾、三氯乙酸、考马斯亮蓝、甲醇、乙酸。 储存液:1)30%(w/v)丙稀酰胺,1%(w/v)双-丙稀酰胺;2)20%Triton X100;3)10%三氯乙酸;4)1%三氯乙酸;5)1%溴酚蓝;6)考马斯亮蓝染色液;7)考马斯亮蓝脱色液;

  • 蛋白电泳小技巧7

    13. 垂直电泳时,可在电泳糟中放入青霉素小瓶等,可自然使液面提高而不影响电泳,又很节约电泳缓冲液。(管家哥没试过,慎用)14. 配胶时不要反复用枪混,稍微摇混就可以了,用枪混多次会导致胶凝不好影响电泳图的分辨率。15. AP分装成500微升一管保存放-20度,避免AP用太久失效。16. 倒胶时把玻璃板中的水用滤纸尽量吸干,因为微量的水存在会影响配的胶浓度。17. 电泳完撬胶时根本不需要用撬胶板,在一平皿里装好水,把有胶一面的放在水中晃动几次胶很容易就脱落下来,一点没有问题,方便的很。

  • 【求助】电泳槽缓冲液容量

    想请教一下各位老师,关于电泳实验里面,电泳槽的缓冲液容量对实验有什么影响没,容量大小对设备的评估有什么意义么?非常感谢。[em09508]

  • 双向电泳 实验技术

    双向电泳篇 1. 重泡胀后的胶可以不用转移到另一个电泳槽,直接跑 2D 的一向吗? 一般情况下是可以的。但当上样量特别大时,可能会有一部分蛋白质没有被胶条吸收,这样跑完 1D 和 2D 胶后,会有很多横向条纹。所以在这种情况下,最好在重泡胀后,将胶条转移到另外一个电泳漕中进行电泳。 2. 为什么我在等电聚焦前加的矿物油在聚焦后会减少,暴露出了胶条的背面? 这是因为 BioRad 的电泳槽有个盖子。为了固定电泳槽中的胶条,这个盖子上设计了对应的突起,以便压住胶条。由于虹吸作用,这个突起会导引矿物油到相邻的空电泳槽,从而降低有胶条的电泳槽中的矿物油液面。如果由此把胶条暴露在空气中,那对等电聚焦的影响将是毁灭性的。为了防止这个现象的发生,可以在相邻的空电泳槽里,也加入适量( 80 %满)的矿物油。 3. 跑第一向时,为什么要设定一个电流的最大值电压(50 μ A/ 胶)? 电流的平方和功率成正比。电流增大,功率增大,放出的热量也随之增大,就会导致胶条的温度增加。当温度超过 30 摄氏度时,缓冲液里的尿素就容易解离,产生一些极性分子,从而对等电聚焦产生影响。 4. 跑第一向时,为什么刚开始的电压比较低,而后逐渐增高? 刚开始时,体系内的带电小分子比较多(比如无机盐和双极性分子)。所以在这个阶段,电流主要是由这些小分子的移动所产生的。由于这些分子质量小,移动他们不需要很高的电压。当这些小分子移动到他们的目的地时(无机盐移动到极性相反的电极;两性分子移动到对应的 pH 条带),体系内的蛋白质才开始肩负起运载电流的任务,逐渐向所对应的 pH 区域移动。 5. 跑第一向时,为什么会产生一条蓝色的条带,并逐渐向酸性端移动? 蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的。溴酚蓝也是 pH 指示剂,当它移动到酸性区时( pH4 ),颜色会变成黄色。溴酚蓝的这个移动过程大体上发生在极性小分子的聚焦之后,蛋白质大分子聚焦之前。 6. 跑第一向时,为什么电压总达不到预定值? 当上样量比较大时或体系内盐分比较多时,聚焦的电压有可能达不到所设定的数值。 7. 跑第一向时,在电压达到预定值后,电流为什么会降低? 当上样量比较少时,所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的 pH 值区域值,从而变成中性分子。这样,体系的电阻越来越大,在恒定的电压下,电流就会越来越小。 8. 跑第一向时,为什么在两个电极丝附近有气泡产生? 等电聚焦完成后,所有的蛋白质都移动到了相应的 pI 值区域,而成为中心分子。这是加在体系上的电压就开始电解水分子,在阳极产生氧气,在阴极产生氢气。 9. 重泡胀缓冲液(rehydration buffer)中的硫脲的作用是什么,双极性分子的作用是什么? 硫脲的作用是增加蛋白质的溶解性,特别是碱性蛋白的溶解性。双极性分子的作用也是增加蛋白质的溶解性。当蛋白移动到相应的 pH 值后,就变成了中性分子。而不带电荷的蛋白质分子容易聚集,从而降低其在随后的二向胶时的迁移效率,可能会造成竖的脱尾。而硫脲和双极性小分子则会鉴定中性蛋白质之间的相互作用,防止它们的聚集。 10. 怎样估计 2D 胶上蛋白质点的分子量和 pI 值? 可以用 BioRad 生产的 2D 胶标准蛋白来校准。也可以用体系内已知蛋白来做比对。 11. 为什么 2D 胶上的蛋白点有横的和竖的脱尾? 横的脱尾可能是: 1 )一向等电聚焦不完全; 2 )某些蛋白质本身的原因(糖蛋白); 3 )蛋白的丰度太高。竖的脱尾是因为跑二向时,蛋白的溶解度不好。 12. 什么成分会影响 2D 胶的效果? 核酸,盐,去垢剂等等。 13. 2D 胶的上样量应该在什么范围? 上样量和样品有关。样品内蛋白种类多的上样量要大些,这样每个点才有足够的量被检测到。一般的全细胞裂解体系,上样量大概在 100 微克(银染)到 500 微克(考染)之间。 14. 我的蛋白质浓度很低,应该用什么方法来浓缩? 蛋白质的浓缩有很多方法。大致有超滤法,沉淀法和透析法。超滤比较温和,对蛋白质不会有修饰和改变,蛋白的种类一般不会有丢失。它的缺点是总样品的量可能会减少(被膜所吸附)。另外超滤对样品的要求比较高。甘油,去垢剂都会堵塞滤膜,影响超滤的效果。沉淀法比较快速,容易操作,对盐,甘油,去垢剂的耐受性好。缺点是可能会有部分种类的蛋白没有被沉淀下来(丢失)。沉淀法中,又以 TCA 法最为普遍使用。使用 TCA 法时,一定要用冷的纯丙酮清洗蛋白沉淀两次,去处残留的 TCA 和其他沉淀下来的杂质。透析法只使用于量比较大的样品,量小时,操作困难。 透析法可以和超滤法联用。先把样品透析到一个比较干净的环境( 不含盐,甘油,去垢剂或其它杂质,比如碳酸氢氨溶液),然后再进行超滤。

  • 民工级琼脂糖电泳制胶TIPs

    1.称量agarose和buffer Buffer不要用成H2O,称量相对准确。 这步悄悄地说可以稍微粗糙点,影响不大。2.融胶,加热到胶产生大量的气泡时,拿出摇匀,继续加热到完全溶解,拿出摇匀,再加热到沸腾。非常热,小心烫手,另外注意不要加热过度使胶冲出瓶子。因此注意选择起码为胶体积2倍以上的瓶子。保证胶混匀和完全溶解,减少可能因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果。这步非常重要,如果胶热不匀会跑出非常科幻的条带。 3.倒胶,可用水浴的办法使胶冷却到60度左右,即手可以握住瓶子的温度,沿着制胶板的一侧,缓缓地一次性倒入。梳子最好是预先放好并固定的,注意梳孔的体积能点的下所有的样。用枪头赶掉气泡。 制胶的桌面相对水平。倒胶时尽量减少气泡的产生。EB如果在制胶时加入,在60度左右时加入,使终浓度为0.5ug/ml。不宜过低,染色成像不明显;不宜过高,导致背景太深。摇匀要沿着瓶壁摇动,尽量减少气泡产生的可能性。高浓度胶例如2%以上的EB很难摇匀,而且凝的速度也相对快,强烈建议跑完胶之后再用EB染色。 其实也可以滴加EB进胶槽,用枪头搅匀,跑完了再染有时候效果不是很好。至于60度怎么掌握。。。勉强不烫手就是了 4.室温凝胶30分钟 过程中不要碰到梳子,尽量保持胶的位置不移动。时间不宜过久,导致胶干燥变形;不宜过短,影响胶内部孔径形成。 这个一定要晾够时间,建议盖个一次性手套,不然胶失水过多就没法用了。5.拔梳子,放入电泳槽。缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出,尽可能使梳子是同时从各个胶孔拔出的。暂时不用的胶最好放入电泳槽电泳液中浸泡。电泳液要浸没胶1mm。这个不比PAGE胶,一般拔不出问题来。

  • 【原创】第一次用六一电泳仪做蛋白电泳时出的chou

    以前一致用伯乐的蛋白电泳仪,现第一次用六一的工具做了SDS-PAGE胶,上电泳,结果电压加到250v了电流还只有9mA,电泳了很久也没有太大的变化,开始以为是电泳液有问题,重装重配还是这样,终于电泳完了,很丑的结果。为什么会这样呢,在拆胶的时候发现配胶用的胶条还在上面,原来是胶条阻止了电流通过!望大家注意哟!!哈

  • 【求助】有人做过GPO的蛋白电泳吗?

    有人做过GPO的蛋白电泳吗?今天做GPO(甘油磷酸氧化酶,MW:75KD)的还原型SDS-PAGE电泳,5%浓缩胶,12%的分离胶,理论上应该可以进行的,但什么都没有染出(其他蛋白都是正常的)。

  • 琼脂糖电泳步骤之超级基础篇

    琼脂糖电泳步骤之超级基础篇一、电泳前准备准备内容作用1.刷干净电泳制胶的梳子,板子,槽子,蒸馏水洗净晾干防止不必要的重复污染,减少外来的污染。梳子干净有利于梳孔的形成。2.检查电泳槽,根据情况更换buffer排除电泳槽的电极接触不良,确保buffer的缓冲能力,减少污染。3.根据DNA的分离范围选择合适的胶浓度并记录达到较好的分离效果,防止样过快跑出胶或者是过慢浪费时间。4.计算agarose的用量和制胶 buffer的用量记录,胶最终越薄越好。实验记录备查 二、制胶步骤注意事项1.称量agarose和bufferBuffer不要用成H2O,称量相对准确2.融胶,加热到胶产生大量的气泡时,拿出摇匀,继续加热到完全溶解,拿出摇匀,再加热到沸腾。非常热,小心烫手,另外注意不要加热过度使胶冲出瓶子。因此注意选择起码为胶体积2倍以上的瓶子。保证胶混匀和完全溶解,减少可能因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果。3.倒胶,可用水浴的办法使胶冷却到60度左右,即手可以握住瓶子的温度,沿着制胶板的一侧,缓缓地一次性倒入。梳子最好是预先放好并固定的,注意梳孔的体积能点的下所有的样。用枪头赶掉气泡。制胶的桌面相对水平。倒胶时尽量减少气泡的产生。EB如果在制胶时加入,在60度左右时加入,使终浓度为0.5ug/ml。不宜过低,染色成像不明显;不宜过高,导致背景太深。摇匀要沿着瓶壁摇动,尽量减少气泡产生的可能性。高浓度胶例如2%以上的EB很难摇匀,而且凝的速度也相对快,强烈建议跑完胶之后再用EB染色。4.室温凝胶30分钟过程中不要碰到梳子,尽量保持胶的位置不移动。时间不宜过久,导致胶干燥变形;不宜过短,影响胶内部孔径形成。5.拔梳子,放入电泳槽。缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出,尽可能使梳子是同时从各个胶孔拔出的。暂时不用的胶最好放入电泳槽电泳液中浸泡。电泳液要浸没胶1mm。 三、上样电泳[

  • 电泳仪电源使用推荐

    简单的说,电泳仪电源一般可分为两类:精简型和多用型,精简型均为双稳型,而多用型都是三稳(三恒)型。无论有几种稳定功能,电泳仪电源在实际工作时只能稳其中一种参数,至于稳哪一种参数,要看电泳仪电源的设定以及电泳仪的等效负载电阻而定。市面上销售的电泳仪电源,按电压分为高压1500~5000V、中压500~1500V、低压500V以下三种;按电流分为大电流500mA~2000mA、中电流100~500mA、小电流100mA以下三种;按功率分为大功率200~400W、中功率60~200W、小功率60W以下三种。从电压的角度来看,用于核酸(琼脂糖)水平电泳、PCR电泳、DNA回收、印迹转移等实验只需最高电压300V;用于蛋白垂直电泳、种子纯度电泳、醋酸纤维膜电泳等需要使用最高电压600V左右的电泳仪;用于DNA测序(SSR分子标记)、等点聚焦电泳、双向电泳等要求最高电压3000V;用于DNA测序电泳(AFLP分子标记)要求最高电压3800V。电泳仪电源输出的所有参数根据其型号的不同都有一个特定的工作范围,如果实际需要超过这一范围,就应当选择能够满足使用的另外型号的电泳仪电源。因为高、低压电泳仪内部结构特征不同,由于高压电泳仪常附加着多功能,而且高压电泳仪决不能空载运行(容易造成人身伤害内部器件损坏),导致操作上难易程度的不同等。因此,选用合适规格的电泳仪很重要。用户如果需要一台电泳仪电源带几个电泳槽工作时,首先要确定总电流不要超过仪器的最大范围,其次各电泳仪之间是并联的,因而每个电泳仪的电压都是相同的,总电流为各电泳仪电流之和。使用时注意不能超出电泳仪电源额定的范围。

  • 蛋白电泳溴酚蓝水溶液的配置

    亲们,跑蛋白电泳时,0.05%的溴酚蓝水溶液怎么配比较好呢,因为它不溶于水。还有SDS溶液应该怎么配,它也不溶于水啊,一搅拌全是泡沫

  • 做电泳实验需要知道的基础知识

    [b]*样品制备[/b][list][*]样品必须完全溶解于上样缓冲液,否则不能在凝胶中移动。样品太浓可能产生假相。[*]样品缓冲液包含盐类(维持样品)、甘油(增加重量从而使样品下沉至点样孔)、以及示踪染料(以便监测电泳进程)。[*]样品缓冲液可以分装成小部分冻存。[*]缓冲液加到凝胶上之后才能点样。[*]样品缓冲液中的示踪染料可以指示什么时候终止电泳。两种最常用的染料是漠酚蓝(BPB) 与二甲基苯青FF 。[/list][b]*标准分子质量[/b][list][*]标准分子质量应同时电泳,用来检测电泳进展以及分析结果。[*]使用相适应的标准分子质量。[*]胶连同分子质量标准物一起拍照。标上各条带的大小。[*]标准分子质量有带标记的与不带标记的两种。标记可以是荧光、发光体或者放射性元素。如果手边没有带标记的标准物,可以将染色后的胶与事后标记的印迹相比较。[*]在每一块胶的同一泳道点上标准物。把标准物加在第一个泳道,就能知道胶的方向。[*]点上正对照与负对照。[/list][b]*样式[/b][list][*]琼脂糖凝胶一般以水平方向进行电泳,而聚丙烯酰胺凝胶则是以垂直方向进行电泳。潜水型胶是一种水平方向胶,凝胶被浸淹在电泳槽的底部。[*]凝胶可以制成多种大小。测序胶必须制成大胶,但是对于大多筛选与转移用胶,甚至包括双向凝胶来说,只要不是把分子量相近的条带区分割,小型胶就可以了。[*]毛细管电泳利用开口狭小的毛细管来进行DNA 、蛋白质和其他小分子的自动高效分离。分离是与检测分析相连,就像色谱仪器一样。只有专门实验室才有毛细管电泳设备。[/list][b]*凝胶[/b][list][*]聚丙烯酰胺VS 琼脂糖。尽管凝胶电泳可以在滤纸、醋酸纤维素、淀粉或者其他基质上进行,大多数研究者还是只采用聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶。两种都是多孔性胶,像分子筛样起作用(聚丙烯酰胺或者琼脂糖的百分比越高孔越小)。理论上,任何一种都可以用来分离DNA 、RNA 或者蛋白质。但是,聚丙烯酰胺在低百分比浓度时很软,难以用手操作。一般采用高百分比浓度,用以分析蛋白质和小核苷酸。[*]低百分比琼脂糖凝胶相对较硬,易于操作,用来分离目的分子,如DNA和RNA或者巨大的蛋白质和蛋白质复体。[*]胶的浓度必须与片断大小相适应。[*]每次切去胶的同一小角。这样,万一胶掉落、翻转或在转移过程中放置凝胶,都能给定位做参考。[/list][b]*缓冲液[/b][list][*]大多数电泳缓冲液配成高浓度母液,在电泳前稀释。[*]每一种缓冲液在某一电流时会有特定的电压。要认识每一种缓冲液的特性,这样,出错时,就马上可以注意到。[/list][b]*电源[/b][list][*]电源输出有几种模式:稳压(mV) 、稳流(安培,或者简称安)以及稳功率(瓦特,瓦) 。许多型号允许设定程序,在各种模式之间自动转换。这样可以使用最佳的电压( 在电泳过程中可能发生变化)同时不超出容量。[*]不是所有的电源输出装置都相同,所以不能简单地将电泳装置接到任意装置上。要清楚你需要什么电流或者电压,然后找出需要的装置。[*]大多数实验室都有不止一个电源装置用于测序胶(要求高电压)、电泳转移(要求高电流)以及用于琼脂糖和聚丙烯酰胺电泳(使用大范围的电压)的装置。很少有电源装置能同时满足所有的要求。[*]变性蛋白胶与DNA和RNA胶中的样品会从负极(阴极)移到正极(阳极) 。用红色导线接正极(+),黑色导线接负极(一)。可以用同一个电源输出装置同时进行几块胶的电泳,但是没问过其他人前不要这样做,因为电泳条件会发生变化。[*]设置闹钟提醒自己察看胶。特别是当你要察看低分子质量的分子时,样品很容易跑出胶进入缓冲液中。[*]接触任何东西前,确信电泳装置必须处于断电状态。如果电源没被切断,不要进行任何操作! 电流效应[/list][b]固定[/b][list][*]凝胶是否需要固定取决于用途。需要染色的胶一般需要固定,而用于转移的胶则不需要固定。[/list][b]*干燥[/b][list][*]通过出去胶上的水,胶基质变薄。干燥之后的胶在放射自显影后条带更清晰。[*]在凝胶干燥仪上干燥一块胶不需1小时。凝胶干燥仪可以加热,从而加快干燥过程。[/list][b]*染色[/b][list][*]DNA与RNA的染色可以通过在电泳前把染料加到样品中完成,也可以在事后染色。[*]蛋白质胶在电泳后染色。[/list][b]*记录[/b][list][*]凝胶经溴化乙锭染色后的Polaroid照片与蛋白质凝胶的35 mm照片是最常用的记录方式。[*]数字记录与分析系统最常使用,所有数据可以直接用来演示。[*]各种转移的记录方式取决于体系与实验。例如,放射自显影与化学发光结果可以记录在X射线胶片上,而信号可用光密度计定量。[/list][b]*确定分子质量[/b][list][*]蛋白质的分子质量可用SDS-PAGE确定,而DNA与RNA的分子质量可以由琼脂糖凝胶电泳来确定。对某一分子而言,其分子质量的对数与其Rf(相对迁移距离)存在线性关系。以标准物的迁移距离对其分子质量的对数作图,得到标准曲线,而样品的Rf 值一也就是分子质量一可以由图外推得到。1.制胶,胶的浓度应最适宜分离分子质量相近的分子。同时电泳分子质量标准物,其范围涵盖有目的分子的大致大小。2.跑胶,防止染料前沿跑出胶的边际。3.胶染色,拍照。如果样品是放射性标记的,你可以使用放射性标记的标准物或者把胶与放射自显影胶片相比较。4.测定从样品孔到每一标准条带的距离。计算每个数值的对数,画到常规图纸的Y 轴上。X 轴上是迁移的距离(以厘米计最方便)。对大多数标准物条带应该得到一条盲线。5.把样品迁移距离画到图上。外推标准曲线,确定分子质量。[/list]

  • 单细胞凝胶电泳步骤

    单细胞凝胶电泳步骤:1. 分离制备单细胞悬液:(1) 体外培养的细胞株:用胰酶消化,最后用PBS悬浮吹打成单细胞悬液,细胞要计数,具体的量我前边已经说过。(2) 体内脏器细胞:处死动物,取出脏器,于Hanks’液中制备成单个细胞悬液。2. 胶板制备:(1) 取100μl于45℃水浴中保温的0.5%NMA,铺于磨沙载玻片上,形成底胶。盖玻片推匀,不能有气泡,4度凝固5至8分钟。(2) 水平取下盖片,取100μl于37℃水浴中保温的0.5%LMA与20μl细胞悬液(约400个细胞)混匀,立即铺片,加上盖玻片,4度凝固5至8分钟。3. 细胞裂解与电泳:(1) 将制备好的胶板去掉盖玻片后,浸于4℃预冷的细胞裂解液中,在4℃下裂解2.5到3小时。(2) 取出胶板,用双蒸水浸没漂洗后放入电泳槽中,浸泡在4℃预冷的电泳液中解旋20分钟。(3) 玻片水平放置阳极端附近,4℃电泳20到25分钟(25V,300mA)。可在电泳槽周围加冰块以保持低温。4. 中和与染色:(1) 电泳结束,将胶板浸泡于中和液中,每次10分钟,共中和3次,每次要更换中和液。最后晾干。(2) 取出胶板,置于染色缸中,在2μg/ml的EB染色液中,暗处染色5到10分钟。(3) 蒸馏水漂洗2次,每次5分钟。稍晾干,滤纸吸去多余水分,尽快在荧光显微镜下观察。从胶板制备开始到最后都应该在暗光下操作。先讲这些,你们可以先开始摸索,真正做了才能发现具体的问题,到时我们再探讨。

  • 蛋白电泳小技巧4

    7. 做SDS-PAGE跑胶通常都是现配现用,但配胶要1h,所以如果想第二天睡个懒觉而又不耽误跑胶可以于前一天晚上做好浓缩胶和分离胶,待凝聚后不要拔下梳子,把含胶玻璃板从制胶槽取下,用保鲜膜包上,注意玻璃板上下两边缘会有气体,所以需要加一点电泳缓冲液以避免胶内水分蒸发.然后放4度过夜.第二天直接拔下梳子行后续.国外好多公司出售脚既是如此,可以保存上星期。8. 配置分离胶或者非变性胶时因胶凝时收缩可导致加样孔变浅.可以将加剩的胶放入4度以降低凝聚速度,而将凝胶放入37度促聚,并随时用4度加剩的胶补充下降的胶面。

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