质谱测定蛋白质分子量

各有关单位：经研究，国家标准委决定对《焊缝无损检测 磁粉检测 验收等级》等225项拟立项国家标准项目公开征求意见，征求意见截止时间为2023年7月5日。请登录请登录标准技术司网站征求意见公示网页http://std.samr.gov.cn/gb/gbSuggestionPlan?bId=10001282，查询项目信息和反馈意见建议。2023年6月5日相关标准如下：#项目中文名称制修订截止日期1蛋白质分子量测定 液相色谱-飞行时间质谱联用法制定2023-07-052肝素酶活性的测定制定2023-07-053硫酸软骨素酶活性的测定制定2023-07-054葡萄糖氧化酶活性检测方法制定2023-07-055包装袋 试验条件 第1部分：纸袋制定2023-07-056产品几何技术规范(GPS) 坐标测量机(CMM)确定测量不确定度的技术第3部分：应用已校准工件或标准件修订2023-07-057产品召回 生产者安全管理韧性评价制定2023-07-058电梯、自动扶梯和自动人行道的电气要求 信息传输与控制安全制定2023-07-059电梯安全要求 第2部分：满足电梯基本安全要求的安全参数修订2023-07-0510工业废硫酸的处理处置规范修订2023-07-0511工作场所环境用气体探测器 第1部分：有毒气体探测器性能要求制定2023-07-0512工作场所环境用气体探测器 第2部分：有毒气体探测器的选型、安装、使用和维护制定2023-07-0513合格评定 管理体系审核认证机构要求 第 14 部分：文件管理体系审核与认证能力要求制定2023-07-0514化学品 快速雄激素干扰活性报告（READR）试验制定2023-07-0515化学品 水-沉积物系统中穗状狐尾藻毒性试验制定2023-07-0516化学品 液态粪肥中的厌氧转化试验制定2023-07-0517化学品 鱼类细胞系急性毒性：RTgill-W1细胞系试验制定2023-07-0518环境试验 第2部分：试验方法 试验：温度/湿度/静负载综合制定2023-07-0519家用燃气快速热水器 通用技术规范制定2023-07-0520腈水合酶纯度和活性的测定制定2023-07-0521跨境电子商务 海外仓服务质量评价指标制定2023-07-0522实验动物 动物模型鉴定与评价技术规范制定2023-07-0523塑料 丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS) 模塑和挤出材料 第1部分：命名系统和分类基础修订2023-07-0524塑料 聚醚醚酮（PEEK）模塑和挤出材料 第1部分：命名系统和分类基础制定2023-07-0525搪玻璃层试验方法 第6部分：高电压试验修订2023-07-0526无损检测仪器 超声检测设备的性能与检验 第1部分：仪器修订2023-07-0527无损检测仪器 超声检测设备的性能与检验 第2部分：探头修订2023-07-0528无损检测仪器 超声检测设备的性能与检验 第3部分：组合设备修订2023-07-0529项目、项目群和项目组合管理 项目管理指南修订2023-07-0530项目成本管理制定2023-07-0531消费品缺陷工程分析 危险温度点测量方法制定2023-07-0532消费品缺陷线索采集与评估规范制定2023-07-0533医疗器械 制造商的上市后监督制定2023-07-0534邮政业术语修订2023-07-0535真空技术 真空计 皮拉尼真空计的规范、校准和测量不确定度制定2023-07-05

p　　用于生物样品分析的蛋白指纹法，该专利技术被国际顶级科学杂志《科学》以及医学界权威杂志《柳叶刀》评为世界蛋白指纹图谱和蛋白质芯片排名第一的技术。针对这项技术的一些问题，火石创造对许洋博士进行了深度的专访。/pp style="text-align: center "img width="300" height="385" title="001.png" style="width: 300px height: 385px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/ebf3be8e-c0c2-49d6-9891-a76d207d183f.jpg" border="0" vspace="0" hspace="0"//pp style="text-align: center "strong　　许洋博士/strong/pp　　许洋博士一直致力于蛋白质组学研究开发，怀揣近五十项蛋白分子质谱诊断技术的自主发明专利。2009年他创办了湖州赛尔迪生物医药科技有限公司，凭借专利产品蛋白指纹图谱仪成为行业领头羊，也成为此类器械行业标准的起草者。/ppstrong　　火石：请问您为什么做蛋白质谱?/strong/pp　　许洋博士：我研究蛋白质谱是偶然也是必然。在美国纽约著名的Sloan-Kettering研究所单克隆抗体实验室早期研究治疗白血病时，我们制造了全世界第一枚人源化单克隆抗体(抗CD33人源化单抗)。后来我又和顶尖美国公司合作第一个将人源化单克隆抗体做成了靶向药。有了扎实的基础，必然能在更窄的蛋白质谱领域做的更好。/pp　strong　火石：蛋白质谱当前的临床应用情况如何?/strong/pp　　许洋博士：只有拿到医疗器械注册证才算进入临床，蛋白质谱目前只有三种临床应用：对肿瘤的筛查 对早期肾脏疾病的分析 在细菌上的鉴定应用。蛋白质谱在国内仍处于非常早期的阶段，且具有垄断性，极少人能做且在做。/ppstrong　　火石：作为国家“千人计划”医疗器械特聘专家，您认为蛋白指纹图谱仪在医疗器械中的角色是什么?/strong/pp　　许洋博士：蛋白指纹图谱仪分析的大数据可以生动地比喻为人体疾病的健康地图。/pp　　蛋白指纹究竟是什么?把质谱仪的显示屏中的每一个蛋白质都用一个分子量来表达，这些分子量组合起来就叫蛋白指纹。就像每个人的指纹都是不同的，每种疾病的特定蛋白质表达物也不同，称之为指纹图谱。蛋白指纹图谱技术是由蛋白质芯片及分析仪器——表面加强激光解析电离飞行时间质谱仪两部分组成，可以将病人血清中蛋白质成分的变化记录下来，绘制成蛋白指纹质谱图，并显示样品中各种蛋白的分子量、含量等信息。将这张图谱与正常人、某种疾病病人的谱图或基因库中的谱图进行对照，就能最终发现和捕获新的特异性相关蛋白及其特征。这种方法具有微量、精确、简易、快速的特点，适应于基础和临床等各个领域。/pp　　之所以将蛋白指纹图谱仪分析的大数据比喻为人体疾病的健康地图(MAP)，是因为既然β2—微球蛋白是11731、人绒毛膜促性腺激素是37580、转甲状腺素蛋白是13761(数字对于计算机的应用更好管理)，而每个蛋白质在质谱仪分析中都是数字，它本身就是大数据。任何物质在质谱底下都是数字，综合起来就是大数据。我把大数据串联起来，就能将分子在身体的MAP做出来。譬如一位吸烟的男士来体检，能发现他吸了烟数年之后肺部出现影像学病理性位点，结合质谱仪分析发现相关的疾病标志物，我们能够模拟出肺部疾病的健康地图，即通过质谱仪检测的健康大数据，可以模拟出该患者肺部出现了数个小红点，点击每个红点后都会解释原因，如显示铅、铬等数据是否超标，以及告诉你相应的对策。这样的技术开启了全智能健康4.0时代。/pp　　Tips：β2—微球蛋白(β2—MG)被认为是诊断早期肾功能损伤的敏感指标，尤其对于糖尿病肾病、高血压肾病、红斑狼疮肾炎的早期诊断具有重要参考价值，因此β2—微球蛋白的测定在临床上是有多种价值的。/pp　　strong火石：您和您的团队在蛋白质组学研究的技术或者方法上有什么突破吗?/strong/pp　　许洋博士：蛋白质作为标志物对肿瘤的诊断，确实没有太大的进展。/pp　　一直以来蛋白质组学研究面临的重大瓶颈是蛋白质分离问题：人体内有十万种蛋白质与衍生物，多数可能与疾病有关联，但这十万种蛋白质与衍生物只有分开后，质谱才能分析清楚。此前蛋白质组学技术中最流行、最通用的蛋白质分离方法是双向电泳，基本上能分离近二千种血浆蛋白质，远远不及十万种，所以成为了瓶颈。/pp　　2006年我提出了一个设想：和蛋白有关的抗体至少有一万多种，那为什么不用抗体来分离蛋白质?这件事一直有人在做，但之前都没有人想到用抗体组把一千个蛋白质一次性快速、实时地分离出来。之后就诞生了免疫质谱分析方法(专利号ZL 200610140652.0)，可以在一个抗体组基质上同时捕获多个生物标志，并对捕获的变异的或修饰的生物标志进行质谱精确分析，还可以同时检测多个生物标志群。用免疫组质谱技术能测定抗原变异片段的分子量。另外，还可以将多种疾病特异性抗原的抗体同时标在一个基质点上。/pp　　Tips:免疫质谱分析方法：质谱与抗体分离技术联合应用即为免疫组质谱(Immunomic mass spectrometry，IMS)。免疫组质谱检测为一组多种(类)抗体与质谱联合来精确地鉴别变异或修饰生物标志群的方法。在一个抗体组基质上同时捕获多个生物标志，并对捕获的变异的或修饰的生物标志进行质谱精确分析。可以同时检测多个生物标志群(biomarkers)。/pp　　双向电泳(Two-dimensional electrophoresis)：是一种等电聚焦电泳与SDS-PAGE相结合，分辨率更高的蛋白质电泳检测技术。目前是快速成长的蛋白质组学技术中最流行最通用的蛋白质分离方法。目前2D-PAGE能够在同一块凝胶上同步检测和定量数千个蛋白质。/pp　　从整个2015年的政策看，医疗器械行业是受到国家大力扶持的，行业地位与重要性大幅提升，法规向国际化看齐，行业监管不断趋严，医疗器械正成为与药物齐头并进的新兴产业。/pp　　strong火石：是什么驱动着行业的高增长?/strong/pp　　许洋博士：一是需求，老龄化加剧，家庭支付能力增强，导致医疗需求高增长 二是政府加大医疗卫生投入，《医疗器械科技产业“十二五”专项规划》表示，“十二五”期间将扶植形成8～10家产值超过50亿元的大型医疗器械产业集团 三是为配合新医改完善基层医疗建设的目标 四是国内生物技术研发应用进入突破期。/pp　　strong火石：您认为接下来医疗器械未来发展的特点和前景会是怎么样的?/strong/pp　　许洋博士：未来5年，医疗器械和制药占比将会达到1:1。近十年，我国医疗器械市场规模快速增长，国内医疗器械工业总产值从2003年的189亿人民币上升到2013年的1889亿，2013年同比增长21%，增长速度远快于药品。预计在未来5年左右，我国医疗器械行业仍然将保持高速增长。医疗器械行业涉及到医药、机械、电子、塑料等多个行业，中高端医疗器械更是多学科交叉、知识密集、资金密集的高技术产业，研发成本高，决定了只有大型厂商才能在大中型医疗器械方面有所作为。此外，器械“国产化”也会成为必然趋势。/pp　　strong火石：赛尔迪当前开展的业务、研发的产品有哪些?公司部署战略是怎么样的?/strong/pp　　许洋博士：我们现在正在做一张人类的大健康MAP。通过精准医疗计划，基于环境健康大数据，通过蛋白指纹图谱仪完成健康管理。现在的疾病市场最关注的问题分别是：检测0～6岁儿童智力、优生优育(为什么生不出聪明宝宝)、高达5千万的肿瘤人群以及3.5亿的高血压、糖尿病人群。/pp　　其中糖尿病肾病是糖尿病最常见且严重的并发症之一，是糖尿病所致的肾小球微血管病变而引起的蛋白排泄和滤过异常那个渐进性肾功能损害。而微量白蛋白尿即早期糖尿病肾病是可逆的，这不同于大量白蛋白尿即临床糖尿病肾病，因此积极防治早期糖尿病肾病就显得尤为重要。去年底，赛尔迪公司与中国医学科学院北京协和医院签署协议，承担国家对糖尿病肾病体内铅、镉毒素的临床大样本检测。全新升级的蛋白指纹图谱仪，是目前唯一获国家药监局批准、能检测含微量白蛋白、β2—微球蛋白以及泛素3项指标的医疗器械。这对糖尿病肾病的早发现、早治疗具有重大意义。/pp　　赛尔迪接下来将按照个体化精准检测所附带的信息，由这些信息与大数据库交流，提出符合个体化治疗的方案，向个体化精准医学管理方式转变。/pp　　随着大数据时代的来临，“互联网+”概念的提出让医疗健康事业呈现出了新的发展势态和特征。医学知识体系正被大数据、精准医疗所重构，信息化进程提高了知识传递速度与医疗协同效率。/ppstrong　　火石：蛋白质组学技术如何助推精准医疗?/strong/pp　　许洋博士：常识知道铅、镉会引起糖尿病性肾病。但铅、镉指标不是医院常规检测的项目。如果采取个体化精准治疗，每年常规检查一次体内铅与镉的指标，发现异常就能进行针对性的从尿液排泄的治疗。已经得了肾病正在透析的病人，检测铅与镉指标后进行针对性排泄也会增强治疗效果。利用蛋白指纹图谱仪能够发现早期的肿瘤和心血管标志物，这就会对疾病的治疗带来极大的希望。随着质谱技术在精准医疗的应用，越来越多的个体化标志物将会被发现，人体的蛋白指纹图谱测定将会成为医院的常规工作。/pp　　精准医疗，即考虑每一个体健康的差异，制定个性化的预防和治疗方案。正确的选中一个工具，解决关键问题，这就是精准医疗。基于基因组测序技术、生物医学工具以及大数据工具逐步成熟和完善，精准医疗能够为个体基因特征、环境以及生活习惯进行疾病干预及治疗，但如何尽快与大数据结合才是发展重点。日前我与北京协和医院合作，创立了中国特色的首个百万人疾病与环境毒素数据库与IMS(爱睦世)特检中心：HZIMS2008，首次在复杂疾病系统中构建了基于环境毒素大数据的移动网络数据库的质量控制体系，使我国重大疾病，如高血压、糖尿病、肿瘤的大数据病因学研究处于世界领先。/pp/p

大家好，本周为大家分享一篇发表在Anal Chem上的文章，Native Ambient Mass Spectrometry Enables Analysis of Intact Endogenous Protein Assemblies up to 145 kDa Directly from Tissue [1]。该文章的通讯作者是来自英国伯明翰大学的Helen J. Cooper教授。非变性原位质谱（native ambient mass spectrometry, NAMS）是一种新型的自上而下质谱分析方法。它结合非变性质谱和原位质谱的优势，可直接在蛋白质及其复合物的生理环境中进行对其进行无标记表征。NAMS可提供蛋白质结构、空间及瞬时相互作用的信息，具有直接从组织中分析内源性蛋白质组装体的巨大潜力。但是，目前，NAMS仅成功应用于直接检测低分子量 (20kDa) 或高丰度的蛋白，如血红蛋白四聚体或RidA 同源三聚体。目前应用于组织中蛋白质NAMS分析的技术有液体萃取表面分析（LESA）与纳喷雾解析电喷雾电离 (nano-DESI) [2]。LESA需要对组织底物进行自动微液节点采样，然后进行纳喷雾电离（nanoESI）进行MS分析。nano-DESI则通过探针与流动相形成流动溶剂桥，与样品直接接触，之后进行质谱分析成像。在本研究中，作者采用NAMS对大鼠脑、肾、肝组织切片中的蛋白质组装体进行全面分析。主要通过调整质谱仪中的离子光学和气体压力以改善m/z传输与纳喷雾性能，来实现对较大蛋白质组装体的分析。结果鉴定出八种蛋白质组装体，证明了NAMS的可及分子量高达145kDa，并通过nano-DESI质谱成像在大脑和肾脏中绘制了高达94kDa的蛋白质组装体的空间分布。在脑组织中，作者通过nano-DESI NAMS绘制了大鼠大脑切片中分子量为37.0–66.4kDa的完整蛋白质复合物的空间分布以及对应的质谱图（图1a,b）。实验成功鉴定并成像出大鼠脑组织中三种蛋白质组装体，包括同源三聚体细胞因子巨噬细胞迁移抑制因子 (MIF, 37.0kDa)、同源二聚体磷酸甘油酸变位酶1 (PGAM1, 57.6kDa)和苹果酸脱氢酶2 (MDH2, 66.4kDa)。结果发现，MIF在整个脑组织区域是均匀分布（图1c）。作者通过nano-DESI-HCD MS2分析产生的单体 (5+、4+) 和二聚体 (5+) 亚基和序列离子的谱图，识别出MIF（图1d）。作者还利用nano-DESI-HCD MS2成功识别出PGAM1，并发现PGAM1在大脑皮层区域中显示出高丰度，而在中脑和胼胝体中的丰度较低（图1e，f）。相比之下，MDH2在脑组织中的空间分布基本均匀（图1g，h）。检测到的结果与蛋白在大鼠脑中的实际分布相符合，可信度较高。图 1. 离子图像和 HCD MS2光谱表明大鼠脑中蛋白质复合物的亚基解离。(a) H&E染色的连续组织切片的光学图像。标签：Ce,小脑；C，大脑皮层；CC，胼胝体；F，穹窿；V，侧脑室区；Mb，中脑；Me，髓质和脑桥；H，海马；Th，丘脑；Ht，下丘脑；BG，基底神经节；OR，嗅觉区域。(b) Nano-DESI 全扫描质谱，代表光学图像中标记为“(b)”的像素。（c，d）巨噬细胞抑制因子同源三聚体显示均匀分布。（e，f）PGAM1同型二聚体分布。（g，h）MDH2同型二聚体分布。此外，作者在大鼠肾脏中鉴定了四种同源二聚体蛋白组件（61.2-94.2kDa），包括ω-酰胺酶 (61.2kDa)、MDH2 (66.4kDa)、苹果酸脱氢酶1 (MDH1, 72.8kDa) 和α-烯醇化酶 (94.2kDa)，并将其成像（图2）。其中观察到的α-烯醇化酶为金属结合形式，每个亚基上结合了2个Mg 2+离子。图 2. (a)大鼠肾脏的H&E染色连续切片显示皮质(C)和髓质(M)组织。(b)在MSI期间获得的大鼠肾皮质组织中单个nano-DESI 像素的示例全扫描质谱。(c, d)α-烯醇化酶同型二聚体。(e, f)苹果酸脱氢酶1。(g, h) MDH2同型二聚体。(i, j) ω-酰胺酶。研究还从大鼠肝组织中鉴定出同型三聚体鸟氨酸转氨甲酰酶（OTC，108.8kDa）和同型四聚体乳酸脱氢酶A（LDHA，145.4kDa）（图3）。其中，在全扫描模式下，nano-DESI可以检测到145.4kDa的LDHA的较弱信号。通过nano-DESI-PTCR MS2的进一步确认，检测到的物质确实为LDHA。图3. (a) 直接来自大鼠肝组织的完整OTC同源三聚体的nano-DESI-PTCR MS 2。(b) 完整OTC同源三聚体的nano-DESI-HCD MS 2显示亚基质量为36.2kDa。(c)完整LDHA同源四聚体 (145.4kDa)的nanoESI-PTCR MS2。(d)完整LDHA 同源四聚体的nanoESI-HCD MS2。在此研究中，作者成功利用NAMS质谱分析方法，直接从组织中检测并鉴定出内源性蛋白质组装体，分子范围为37.0-145.4kDa，包括二聚体、三聚体以及四聚体。其中检测到的上限（145.4kDa）超出LESA MS报道的质量上限的两倍，比nano-DESI 报道过的质量上限高出100kDa。通过调整离子光学和高m /z的气体压力，或者后续仪器和方法的开发，NAMS有可能进一步突破145.4kDa的上限，检测到分子量更大的蛋白组装体。[1]Hale OJ, Hughes JW, Sisley EK, Cooper HJ. Native Ambient Mass Spectrometry Enables Analysis of Intact Endogenous Protein Assemblies up to 145 kDa Directly from Tissue. Anal Chem. 2022 Apr 12 94(14):5608-5614.[2]Hale OJ, Cooper HJ. Native Mass Spectrometry Imaging and In Situ Top-Down Identification of Intact Proteins Directly from Tissue. J Am Soc Mass Spectrom. 2020 Dec 2 31(12):2531-2537.

随着生命科学研究的深入开展,科学界对解析复杂生物大分子结构以揭示生命现象的渴望日益增加。在各种结构生物学技术快速发展的背景下,结构质谱技术凭借其独特的优势,日益成为连接静态结构与动态功能、实现从分子到细胞的跨尺度研究的重要手段。在12月12-15日即将召开的“第十四届质谱网络会（iCMS 2023）”同期，特别新增了“结构质谱新方法”主题专场,来自全国的顶尖科学家团队将汇聚一堂,围绕氢/重氢交换质谱、化学交联质谱、原位质谱等前沿技术,报告他们在蛋白质结构生物学研究中的最新进展。本次主题会议的召开,恰逢结构质谱技术发展的重要机遇,必将推动该领域技术的重要突破及交叉创新,开启生命科学研究的新篇章。热忱欢迎质谱界的科技工作者报名参会交流、了解前沿动态、开拓合作视野。部分报告预告如下，点击报名  》》》会议主持人：中山大学 教授 李惠琳中山大学药学院教授，博士生导师。主要从事生物质谱新技术的开发及应用，侧重于（1）开发整合结构质谱技术（包括native top-down MS, HDX-MS, CX-MS等），用于药物作用分子机制及蛋白复合物结构研究；（2）Middle-down/top-down蛋白质组学新技术的开发及应用。共发表SCI收录论文40篇，其中第一作者或通讯作者15篇，主要发表在Nat. Chem.、Anal. Chem.等期刊；2014年获得American Society of Mass Spectrometry Postdoctoral Career Development Award；2019年入选“珠江人才计划”青年拔尖人才；主持国家自然科学基金项目3项。报告人：香港理工大学 教授 姚钟平报告题目：氢氘交换质谱揭示β-内酰胺酶与抑制剂相互作用的动态构象复旦大学学士及硕士,香港科技大学博士,香港理工大学应用生物及化学科技学系教授。长期从事质谱、分析化学、化学生物学、组学的交叉学科研究，主要发展和应用质谱技术解决化学、生物、食品安全、信息科学等领域的基础和应用问题，在Nature Communications, PNAS, JACS等期刊发表论文100多篇。现任香港研究资助局专家委员会委员、深圳市中药药学及分子药理学重点实验室副主任、中国化学会有机分析专业委员会委员、Frontiers in Chemistry副主编以及Analytica Chimica Acta, Rapid Communications in Mass Spectrometry,《中国质谱学报》,《分析测试学报》等期刊编委。会上,姚钟平教授将作主题为《氢氘交换质谱揭示β-内酰胺酶与抑制剂相互作用的动态构象》的报告。利用氢氘交换质谱（HDX-MS）并结合原态离子迁移质谱（Native IM-MS）以及分子动态(MD)模拟，发现不同亚型的A型β-内酰胺酶在几个主要的结构域存在显著的动态构象差异。进一步研究了A型β-内酰胺酶与抑制蛋白结合界面的动态结构变化，结果揭示了H10区域是一个可调节β-内酰胺酶抑制作用的别构部位。报告人：浙江大学 研究员 周默为报告题目：非变性质谱剖析异质性蛋白复合体结构和功能信息浙江大学首位“求是实验岗”研究员，分析化学专业，长期从事前沿生物质谱技术和仪器的开发工作。2008年本科毕业于武汉大学，2013年博士毕业于美国俄亥俄州立大学，之后两站博士后分别在美国FDA和西北太平洋国家实验室PNNL。2018年成为PNNL的研究员开展独立研究，培养多名博士后和学生。2023年加入浙江大学。截至目前共发表60余篇学术论文，代表作包括在Angewandte Chemie, Nature Communications, Analytical Chemistry等期刊的论文。现任自上而下蛋白组协会（Consortium for Top Down Proteomics）的青年委员会主席，曾担任美国质谱协会（ASMS）的出版委员会委员、短课程讲师、评审委员等学术任职，努力推动新分析测试技术的开发和跨学科领域的应用研究。本次会议中，周默为研究员将为介绍题为《非变性质谱剖析异质性蛋白复合体结构和功能信息》的报告。精准表征生物大分子的微观结构对各类生物工程、生物医药领域的研究至关重要。由于大部分质谱检测到的分子量范围有限，在分析之前生物大分子需要先被剪切为分子量更小的片段。但是剪切和碎片化的过程中会丢失一些关键的结构信息。前沿质谱技术提高了仪器的分子量上限，使非变性条件“自上而下”研究完整的生物大分子更加容易。我将以具体案例，阐述自上而下非变性质谱技术在异质性蛋白质复合体结构和功能解析中的贡献，以及与其他方法的互补性。报告人：北京大学 研究员 王冠博报告题目：生物样本中蛋白高级结构的质谱分析北京大学生物医学前沿创新中心研究员。北京大学学士，美国马萨诸塞大学博士，曾于荷兰乌特勒支大学暨荷兰蛋白组学中心从事博士后研究；曾任南京师范大学教授、博士生导师。主要从事免疫反应相关蛋白质的高级结构及相互作用研究，以生物质谱为核心工具，结合新型分析设备研发，应用于生物物理学、蛋白质药物分析等领域。长年与国际药企合作研发新型药物表征技术并应用于新药研发。获国际国内授权专利，出版《Mass Spectrometry in Biopharmaceutical Analysis》等专著、译著、合著多部。任中国生物化学与分子生物学会蛋白质组学专业分会委员、国际学术组织Consortium for Top-Down Proteomics青委会委员。本次会议中，王冠博研究员将围绕生物样本中蛋白高级结构的质谱分析主题分享报告。生物质谱已成为蛋白质多次结构表征的重要工具。为将蛋白结构质谱技术的应用拓展至生物样本乃至临床样本中，我们针对背景基质复杂、糖基化等修饰异质性高、超大分子量颗粒结构层次多样等问题，以非变性质谱等质谱手段为核心工具开发了一系列组合策略，提供生物样本乃至临床样本中的蛋白高级结构和相互作用关系信息。报告人：中国科学院大连化学物理研究所 研究员 王方军报告题目：高能紫外激光解离-串联质谱仪器研发和应用2011年于中科院大连化物所获博士学位，师从邹汉法研究员。研究工作致力于生物大分子质谱新仪器、新方法及其在生命健康领域的应用研究，搭建了世界首台50-150 nm可调波长极紫外激光超快解离-串联质谱；提出了位点光解离碎片产率和原位化学标记效率定量表征蛋白质结构变化的两种质谱分析新原理，实现亚微克蛋白质复合物序列和结构变化单氨基酸位点分辨表征；发展了蛋白质-纳米材料界面相互作用精细结构的质谱分析新方法等。在Nat. Protoc.，J. Am. Chem. Soc.，Cell Chem. Biol.，Chem. Sci.，Anal. Chem.等期刊发表论文130余篇，他引5000余次。本次会议中，王方军研究员将分享题为《高能紫外激光解离-串联质谱仪器研发和应用》的报告。高能/真空紫外激光解离是表征生物大分子序列和动态结构的前沿结构质谱表征技术，但相关仪器和理论都亟待发展。报告人将介绍近年来自主研发的皮秒脉冲极紫外激光解离装置和蛋白质原位光化学标记仪器的原理、主要参数、与商品化质谱对比、及在蛋白质瞬态结构表征、蛋白-蛋白识别和相互作用机制分析等方面的应用情况。报告人：中国科学院大连化学物理研究所 研究员 赵群报告题目：活细胞内蛋白质原位构象和相互作用规模化解析新方法研究中国科学院大连化学物理研究所研究员，博士生导师。本科毕业于西北大学化学基地班。同年进入大连化学物理研究所攻读博士学位，师从张玉奎院士和张丽华研究员，2014年获得理学博士学位。毕业后留所工作至今，主要从事蛋白质组定性定量及相互作用分析新技术研究，共发表学术论文62篇，其中近五年以通讯/第一作者（含共同）在Nat. Commun., Angew. Chem. Int. Ed.，Anal. Chem.等SCI期刊发表论文23篇；已获20项发明专利授权。作为课题负责人承担国家重点研发计划，作为项目负责人承担国家自然科学基金面上基金等，2023年获国家自然科学基金优秀青年基金支持；2018年入选大连市科技之星，2020年入选中国科学院青年促进会会员，2023年获中国化学会菁青化学新锐奖；兼任《色谱》青年编委、中国化工学会理事、中国蛋白质组学会青年委员、中科院青促会沈阳分会委员等。本次会议中，赵群研究员将围绕题为《活细胞内蛋白质原位构象和相互作用规模化解析新方法研究》的报告。作为生命活动的执行者，蛋白质通过相互作用形成复合体等形式行使其特定的生物学功能。不同于细胞外的离体环境，细胞内的限域效应、拥挤效应和细胞器微环境等对于维持蛋白质复合体的结构和功能起着至关重要的作用。因此，实现细胞内蛋白质相互作用的精准解析对于深入研究其生物学功能，进而理解生命现象本质具有重要意义。近年来，化学交联质谱技术已逐渐成为蛋白质复合物解析的重要手段。它是利用化学交联剂将空间距离足够接近的蛋白质内/间的氨基酸以共价键连接起来，再利用质谱对交联肽段进行鉴定，进而实现蛋白质相互作用的组成、界面和位点的解析。现有化学交联技术主要用于解析体外表达纯化的或细胞裂解液中的蛋白质复合物，而在细胞内蛋白质复合物的原位构像解析方面仍处于起步阶段。 针对上述问题，我们团队发展了一系列新型高生物兼容性的可透膜多功能化学交联剂，实现了活细胞内蛋白质复合物构像的原位交联捕获；建立了多种高选择性的低丰度交联肽段的富集方法和高可信度的交联肽段鉴定方法，显著提高了原位交联信息的鉴定灵敏度、覆盖度和准确度；进而，通过靶向富集特定亚细胞器内的交联蛋白质复合物，实现了亚细胞器空间分辨的蛋白质相互作用精准解析；在上述基础上，利用基于化学交联距离约束的分子动力学技术获得了蛋白质复合物的动态系综构像，实现了活细胞微环境下蛋白质复合物组成、相互作用界面及作用位点的规模化精准解析，为规模化地揭示蛋白质复合物功能状态下的结构调控机制提供了重要的技术支撑。为了分享质谱技术及应用的最新进展，促进各相关单位的交流与合作， 仪器信息网与北美华人质谱学会（CASMS）将于2023年12月12-15日联合举办第十四届质谱网络会议（iCMS2023）  。以上仅是部分报告嘉宾的分享预告，更多精彩内容请参加会议页面：https://www.instrument.com.cn/webinar/meetings/iCMS2023/ （点击下图去报名）》》》

俗话说：文无第一，如果非要整出个蛋白质质谱与蛋白质组学领域世界第一牛人，显然并不是一件容易的事，也注定是一件有争议的事。作为一个半路出家的准业内人，我就本着无知者无畏的革命精神，说一下我自己心目中的第一牛人：Ruedi Aebersold。　　考虑到科学网的大多数网友对蛋白质组学并不了解，先简单科普一下，根据百度百科的定义：“蛋白质组学(Proteomics)一词，源于蛋白质(protein)与 基因组学(genomics)两个词的组合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。” 1995年(也有1994，1996年之说)Marc Wikins首次提出蛋白质组(Proteome)的概念1，1997年, Peter James(就职于有欧洲MIT之称的瑞士联邦工学院(ETH))又在此基础上率先提出蛋白质组学的概念2。基因组学和蛋白质组学的概念又进一步催生了N多的各种各样的组学(omics)，两者的诞生的发展，也使系统生物学成为可能，本文的主人公Ruedi Aebersold与Leroy Hood一起于2000年在美国西雅图创办了系统生物学研究所(ISB),该所的建立不但标志着系统生物学作为一门独立的学科的诞生(此句话貌似不靠谱，参见文后14楼的评论)，也带动了包括蛋白质组学在内的多种组学的发展，当然各种组学的发展也同时促进了系统生物学的发展。尽管日本也于2000年在东京建立了系统生物学研究所，但是同为第一个吃螃蟹的，东京的这个所，无论是学术水平还是世界影响都无法和西雅图的那个系统生物学领域的麦加相提并论。闲话少叙，我之所以认为Ruedi Aebersold是蛋白质质谱与蛋白质组学领域世界第一牛人，是基于如下原因：　　Ruedi Aebersold对蛋白质组学的最大贡献可谓是同位素代码标记技术(ICAT)，现在这一蛋白组定量技术自从1999年在Nature上发表以来，该技术已世界广泛应用，该论文迄今(截至2013年1月11日)已被引用了近3000次。Web of Science的检索结果显示，蛋白组学领域迄今已经至少有超过10万篇论文发表，按照被引用次数排名，该论文位居第三位。有意思的是，被引用次数排第四位的是Ruedi Aebersold和另外一位牛人Mathias Mann(下面会介绍)于2003年发表在Nature上的有关蛋白质质谱与蛋白质组学的综述论文，迄今也已被引用近2800次。而引用次数排第一和第二的两篇论文的通讯作者并算不上是蛋白质质谱与蛋白质组学领域的，蛋白质组学仅仅是他们使用的工具，他们的影响也在这个领域之外。蛋白质组学领域，最重要的专业协会应该算是HUPO (国际人类蛋白质组组织), 最重要的专业会议也当属HUPO世界大会，Ruedi Aebersold曾获HUPO含金量最高的成就奖，他本人也经常是HUPO世界大会的分会主席或大会特邀报告人。当然Aebersold还获得了包括美国质谱协会(ASMS)大奖在内的许多专业大奖。可能有人会列出另外的自己心中的第一牛人(如上述的Mathias Mann)，但Ruedi Aebersold无疑至少是领域内公认的前几位的世界级牛人。另外，顺便说一下德国马普所的Mathias Mann(其在丹麦首都也有实验室)，Mann和Aebersold可谓是蛋白质组学领域的双子星座，都是该领域的顶级牛人，Mann发表的论文有多篇都在蛋白质组学领域被引用次数前10位，不少被引用次数都上千次。上述的Mann和Aebersold两人能在Nature发表综述论文也说明了他们的江湖地位。Aebersold和Mann所发表的论文总被引次数分别超过了5万和3万次，这个数字在世界所有领域都是惊人的。另外，Mathias Mann在蛋白质组学最大的贡献可以说是发明了蛋白质组体内标记技术SILAC3,这种技术与Ruedi Aebersold发明的ICAT已及另外一种标记iTRAQ是公认的应用最为广泛的蛋白质组学定量标记技术。　　今年年近花甲的Ruedi Aebersold是世界蛋白质组学的开拓者之一，现在在上述的ETH的工作，和最早提出蛋白质组学Peter James在同一个大学。作为土生土长的瑞士人，Ruedi Aebersold是在2004年底、2005年初才开始在ETH全职工作的，可谓是瑞士的大海龟。Ruedi Aebersold此前在西雅图的ISB和华盛顿大学工作，作为ISB的元老和共同创办人，Ruedi Aebersold现在还是ISB的兼职教授，发表论文时也还署ISB地址。Mann和Aebersold都是欧洲人，现在又都致力于将蛋白质质谱与蛋白质组学应用到临床，尽管蛋白质组学已有十多年发展历史，现在最大的一个瓶颈可以说在基本无法应用到临床，现有的技术，对于临床应用而言，时间和经济成本都太高(无法高通量、检测成本太贵)。这一块硬骨头显然不是一般人能够啃得动的，需要从临床样品制备、质谱技术到数据分析都要有突破甚至革命性的创新，我很期待，也相信Mann和Aebersold有能力最终使蛋白质组学(尤其是基于此的生物标志物鉴定技术)应用到临床。　　我国在蛋白质质谱与蛋白质组学领域在世界上最出名的无疑非贺福初莫属，贺福初的名字在国内搞蛋白质组学应该都知道他的名字，他的头衔很多(如将军、院士)，我就不一一列举了，新年伊始他又多了一个牛头衔：万人计划中的科技领军人才。贺的工作和学术水平，我不熟悉，不敢评头论足。他的文章被引用次数最高的是发表在Cancer Research一篇论文，迄今已有126次，但并非是蛋白质组学领域。在蛋白质组学领域，他的被引次数(含自引)最高的论文是2007年发表在蛋白质组学顶级期刊MCP的文章4，迄今已有105次引用。蛋白质质谱领域，我国在世界上最出名的学者估计要数复旦大学的杨芃原了，他的被引用次数最高的一篇论文，是2005年发表在化学顶级期刊德国应用化学的文章5，迄今已被引用70次，杨芃原为该论文的共同通讯作者。我国在蛋白质组学目前被引用次数最高的是南开大学王磊(澳大利亚海归、长江学者)2007年发表在美国科学院院刊(PNAS)的论文6，迄今被引次数已经超过500次。　　蛋白质质谱仪主要生产商Thermo Fisher(即原来的Finnegan), 最近新出了本挂历，这本特别的挂历上列了13位在蛋白质质谱与蛋白质组学领域的牛人，上述的Ruedi Aebersold和Mathias Mann都在之列，其余11位简单介绍、列表如下。姓 名工作单位主要贡献Richard D. Smith美国太平洋西北国家实验室1990年首次用三重四级杆质谱Top-down（自上而下）分析完整蛋白John Yates III美国Scripps研究所SEQUEST MS/MS数据库搜索程序Joshua Coon美国威斯康星大学麦迪逊分校发明了电子转移解离技术(ETD)Neil Kelleher美国西北大学Top-down蛋白质组学Kathryn Lilley英国剑桥大学蛋白质组学定量技术Pierre Thibault加拿大蒙特利尔大学应用生物质谱和蛋白质组学到细胞生物学Michael MacCoss美国华盛顿大学（西雅图）稳定同位素标记技术Albert Heck荷兰Utrecht大学基于质谱的结构生物学Catherine Costello美国波士顿大学HUPO前任主席，质谱技术发展及应用Alexander Makarov德国Thermo Fisher Scientific 生物质谱全球研发总监领导研发Orbitrap质谱仪Donald Hunt美国弗吉尼亚大学FT-MS and ETD　　简单的说，上述13位世界级牛人都来自欧美，没有一位来自亚洲，也没有一位华人。我不知道以Ruedi Aebersold代表的上述牛人是如何炼成的，但可以肯定的是：他们不是欧美版的“百人”计划，也不是“千人”计划，更不是“万人”计划而“计划”出来的。网上的公开信息表明：Ruedi Aebersold除了在国际专业协会和期刊有学术兼职外，没有任何行政职务，就是一普通教授，但是这不妨碍他成为蛋白质质谱与蛋白质组学领域世界第一牛人。

回顾质谱的百年发展史，得益于机械、电子和计算机行业的不断创新，质谱仪的性能也在不断提升。而真正推动质谱实现飞跃的是那些偶然的革命性创新，即具有颠覆性的技术创新——创造全新的分析规模和能力水平。蛋白质组学的大规模分析亦是革命性创新所推动实现的，John Yates III便是实现这项工作的关键科学家之一。John Yates：I was instantly hooked when I first saw a mass spectrometer. 迷恋 | 与质谱的初见作为MudPIT (Multi-dimensional Protein Identification Technology) 与SEQUEST的发明者，John Yates为蛋白质组学技术带来了突破性的进展，而他的每一份成就离不开对质谱的热爱。Yates也在某次采访中直言，在他第一眼看到质谱时，就被“迷倒了 (instantly hooked)”！MudPIT与SEQUEST的发明者——John Yates据Yates回忆，当时他还是个本科生，看到质谱仪是怎么运作的那个瞬间，他惊呼：“这好酷！”；而当看到实验室里满满当当的计算机时，他又被其强大的数据处理能力所震撼。因此，1980年获得缅因大学 (University of Maine) 动物学学士学位的Yates，选择继续在本校攻读化学专业的研究生课程。在学习过程中，为了深入探究质谱法与蛋白质组学研究的关联性，实干派Yates联系了弗吉尼亚大学(University of Virginia)的Don Hunt（弗吉尼亚大学的化学和病理学系教授）。不久后，他收到了一封手写的邀请函，并就此开展了他在弗吉尼亚大学的研究。与此同时，Yates已经看到了质谱的潜力，并希望将其应用于蛋白质组学研究中，但受限于“无法通过人工对数据进行快速解析”。因此，他带领团队在1994年开发了质谱数据的翻译器——软件工具SEQUEST。 John Yates发明SEQUEST算法释放质谱的魅力 | “翻译器”SEQUEST某种程度上而言，SEQUEST的开发是一种必然。1990年，美国能源部 (United States Department of Energy) 和美国国立卫生研究院 (National Institutes of Health, NIH) 向美国国会 (United States Congress) 提交了人类基因组测序的联合计划。自那时起，数据库开始充满了DNA序列信息，用于挖掘数据生物信息学的相关算法也大量涌现。1994年是数据依赖型采集 (data-dependent acquisition, DDA) 的诞生元年，开创性成果SEQUEST也在这一年诞生，万众瞩目。作为自下而上蛋白质组学（自下而上法：对蛋白质进行酶解处理后，得到多肽进行分析) 检索程序的开山鼻祖，SEQUEST的开创不仅奠定了蛋白质组学研究的核心基础，使更多生命科学领域中的研究人员意识并认同蛋白质组学的价值，更向全世界展示了质谱的魅力与潜力。简单来说，SEQUEST是通过利用人类基因组学的信息来解释质谱的信息（即肽和蛋白)。在研究细胞中的蛋白时，得益于这个方法，研究人员不需要对每个蛋白进行纯化，只需要对整体蛋白进行剪切，再通过质谱分析其中的每一种蛋白，便可获得全部蛋白的信息。SEQUEST分析方法可分为四步：（1）对质谱数据进行压缩；（2）通过比对蛋白质数据库 (database)与实验质谱数据在分子质量层面的信息，匹配 (compare)可能的多肽序列；（3）将从数据库中得到的序列的预测片段离子与质谱信息进行比较，从而产生最佳匹配序列表；这个序列被用于进行打分和统计学运算，进而（4）得到分析结果。SEQUEST分析步骤这套方法不仅采用了彼时最前沿的技术，如求互相关性的快速傅里叶变换(fast Fourier transform, FFT)，还融入了作者在对质谱数据深入理解后的大胆假设，如对数据进行的系统归一化处理和多项经验打分权重等。SEQUEST提高了质谱技术的有效性和准确性，可以使关键性的生物和临床问题得以解决。自其开发以来，世界各地的研究人员对细胞器中的大部分蛋白质进行研究，根据正常和疾病状态中蛋白质表达差异进行“画像”，从而揭示疾病发生发展的机理。此外，这项工作也促进了蛋白质组学的大规模应用（将在下文进行介绍），他本人将其应用于确定单细胞生物体和哺乳动物细胞中蛋白质复合物成分的大规模研究中。一系列的其他软件亦在SEQUEST的影响下被开发，促进了蛋白质组在分子和细胞生物学研究中的各种应用，包括肽/蛋白的定性定量分析、翻译后修饰的鉴定、蛋白质结构动态研究等等。新战场 | 蛋白质大规模鉴定1998年，Yates提出鸟枪法蛋白质组学 (Shotgun proteomics)，以推动蛋白质组的大规模鉴定分析。这个思路来源于人类基因组草图的制作方之一——塞莱拉基因组公司 (Celera Genomics)。他们采用了彼时非常先进的基因测序技术：鸟枪法 (Shotgun)。这种方法跳过将基因组拆分、克隆的过程，直接将其打成小片段进行随机测序，就像拼图一样：我们把一块完整的拼图买回家，彻底打乱后，再开启游戏之旅。2001年，基于鸟枪法蛋白质组学的想法，John Yates团队开发了MudPIT技术，并将其成果发表于 Nature Biotechnology，文章题目为Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology。实现将鸟枪法应用于蛋白质组学是一件里程碑式的发展成就，其不仅颠覆了传统的蛋白质分析方法，还推动实现大规模分析。Yates带领团队开发MudPIT彼时应用最为广泛的蛋白质分析鉴定方法是二维聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Two-dimensional gel electrophoresis, 2D-PAGE)，该技术是通过等电点(isoelectric point, pI) 和分子量 (molecular weight, MW) 两个维度，对蛋白质进行鉴定，拥有高分辨率的特点。然而，2D-PAGE存在着一些难以克服的缺陷：（1）虽然该技术可以提供蛋白质的相对分子质量、等电点、表达丰度的相对量等信息，但它无法完成一些更为“精细”的任务，如低丰度蛋白质点的检测，极酸性和极碱性区蛋白质及高分子质量区蛋白质的分离等；另一方面，（2）这项技术自动化程度低，重复性差且耗时长；除此以外，（3）鉴定量和通量一直是这项技术的瓶颈。反观MudPIT，这是一种非凝胶技术，可以实现复杂蛋白质和多肽混合物中某一成分的分离与鉴定工作。首先，肽段先在二维液相色谱中被分离，然后再进入多维毛细管液相色谱中分离、而后进行串联质谱分析以及最后的数据库检索工作。该技术可对样品量较少的蛋白质进行快速分析，适用于蛋白质组学中大规模蛋白质的分离鉴定研究。Yates的文章将MudPIT较之2D-PAGE技术的优势全盘展示。他们完成了彼时鉴定量最大的蛋白质鉴定研究：从酿酒酵母 (S. cerevisiae) 的蛋白质组中分离鉴定了1484个蛋白质；作为对比，当时最大的基于2D-PAGE的蛋白质组学研究，仅鉴定出了流感嗜血杆菌 (Haemophilus influenza) 蛋白质组的502个蛋白质。总体来看，MudPIT的灵敏度和动态监测范围都有了更大的进步，且应用范围更广、自动化程度高。因此，MudPIT也成为了二十世的最初的十年里，研究复杂生物样本中大规模蛋白质表达、定性和定量的强有力工具。制胜密码 | 创新与协作John Yates：I’ve become very intrigued with the concept of innovation.科研进展十分依赖于研究人员的高强度攻坚，及不断创新。他们需要不停地“刁难”自己、“刁难”别人，保持新方向、新想法的敏感度。Yates也一直非常希望更多的科学家可以在他的方法上继续创新。为了帮助各位科学家早日创新、淘汰自己的方法，Yates分享了自己的“创新书单”，希望大家一起从书中学习创新路径并得到启发，如Jon Gertner的 The Idea Factory（这是一部关于传奇科研机构——贝尔实验室的传记，其中共孕育了9位诺贝尔奖得主），以及Steven Johnson的 Where Good Ideas Come from（在这本书中，作者深入发明的创新自然史，对其进行跨越学科、领域的追踪，确定了创新的七种关键模式）。Yates也回忆道，在2003年与一家质谱制造商讨论合作时，他的第一个问题是“扫描速度可以更快吗？”也正是这个问题使得我们迎来了现在的升级版质谱仪。此外，当新设备准备落地时，Yates还会不断提出新的想法，与合作方商讨，寻找更优解。除创新以外，Yates还十分主张团队协作性，并先后培养出来70多位优秀的科学家。其中一位曾在Yates实验室进行博士后工作的研究员Michael Washburn（目前是美国堪萨斯大学医学中心肿瘤生物学教授）称，Yates使他深刻认识到建立一个多学科团队的必要性。因为质谱研究不是一场单机游戏，它极度需要跨学科的方法论，复合型人才的相互教导，才能解决研究瓶颈取得成果。因此，在当年与Yates一起开发出MudPIT后，Washburn在蛋白质组学研究领域继续开疆拓土，并以基于质谱来研究染色质重塑复合物而闻名。Michael Washburn成就、扎根 | 年轻的蛋白质组学SEQUEST 与 MudPIT 的开发，及其他杰出的科研成果奠定了Yates在蛋白质组学领域的泰斗地位，他也毫不意外地入选了 2011年 “2000-2010年全球顶尖一百位化学家”名单。John Yates入选2011年 “2000-2010年全球顶尖一百位化学家”名单此外，他于2019年获得ASMS质谱杰出贡献奖及 Khwarizmi 国际奖，以表彰他对蛋白质组学的贡献。蛋白质组学诞生（1997年）至今才二十余年。得益于全球科学家和HUPO的不懈努力，这个年轻的前沿学科已获得许多令人振奋、惊叹的里程碑式成果。未来，我们亦期待、欢迎有更多的年轻研究人员参与进来，一同以蛋白质组学为支点，揭示生命的奥秘，开创疾病治疗的新篇章。年轻科研力量的崛起是科技创新、发展的重要引擎。2015年，HUPO特设Early Career Researchers (ECRs）项目，以推动年轻科研人员对新知识、新思想和前沿科技创新的引领作用。具体而言，该项目的主旨为：（1）为ECR提供更多研究和交流平台，提高他们的科学知名度：HUPO设立稿件竞赛 (Manuscript Competition)，以便让杰出的年轻科学们展示自己最新工作成果；（2）为ECR策划职业发展相关活动，提高他们在学术界、工业界的竞争力：HUPO邀请来自不同科研、技术和商业领域的世界知名科学家，分享他们的科研经历与职业生涯；（3）提高蛋白质组学领域的公平性、多样性和包容性。参考资料1. Washburn, M. P., Wolters, D., & Yates, J. R. (2001). Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology. Nature biotechnology, 19(3), 242-247.2. Proteomics goes global. Nature biotechnology, 24, 302–303 (2006). https://doi.org/10.1038/nbt0306-3023. Eng, K. J., McCormack, A. L., & Yates, J. R. (1994). An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. Journal of the American Society Mass Spectrometry, 5(11), 976–989.4. Yates, J. R. (2013). The revolution and evolution of shotgun proteomics for large-scale proteome analysis. Journal of the American Chemical Society, 135(5), 1629-1640.5. Vivien, M. (2013). Digging deep into proteomes. Nature Method, 10(1), 3.6. MICHGAN STATE UNIVERSITY. (n.d). Dr. Michael Washburn. Retrieved from https://bmb.natsci.msu.edu/about/awards/john-a-boezi-memorial-alumnus-award/dr-michael-washburn/7. Scripps Research. (2019). Chemist John Yates receives 2019 ASMS John B. Fenn Award for innovations that advanced mass spectrometry. Retrieved from https://www.scripps.edu/news-and-events/press-room/2019/20190614-yates-amsmaward.html

Fig. 1: View of the SuperMaMa laboratory at the University of Vienna. The hanging gold-plated insert is the radiation shield behind which the superconducting nanowire detectors are installed. C: Quantennanophysik @ Universität Wien　　Fig. 2: Counting single proteins with a superconducting nanowire. The background and nanowire are altered in Photoshop with the Generative Fill AI. (Human Insulin PDB:3I40). C: CC BY-ND 4.0 Quantum Nanophysics University of Vienna.　　据奥地利维也纳大学(University of Vienna, Boltzmanngasse, Vienna, Austria.)2023年12月4日提供的消息，由维也纳大学量子物理学家马库斯阿恩特(Markus Arndt)领导的国际研究团队在蛋白质离子检测方面取得突破：超导纳米线探测器凭借其高能量灵敏度，实现了蛋白质离子检测的突破(Quantum physics: Superconducting Nanowires Detect Single Protein Ions)。几乎100%的量子效率，比传统离子探测器在低能量下的探测效率高出1000倍。与传统探测器相比，它们还可以通过冲击能量来区分大分子。这允许更灵敏地检测蛋白质，并提供质谱分析中的附加信息。这项研究的结果于2023年12月1日已经在在《科学进展》(Science Advances)杂志网站发表——Marcel Straus, Armin Shayeghi, Martin F. X. Mauser, Philipp Geyer, Tim Kostersitz, Julia Salapa, Olexandr Dobrovolskiy, Steven Daly, Jan Commandeur, Yong Hua, Valentin Köhler, Marcel Mayor, Jad Benserhir, Claudio Bruschini, Edoardo Charbon, Mario Castaneda, Monique Gevers, Ronan Gourgues, Nima Kalhor, Andreas Fognini, Markus Arndt. Highly sensitive single molecule detection of macromolecule ion beams. Science Advances, 1 Dec 2023, Vol 9, Issue 48. DOI: 10.1126/sciadv.adj2801. https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adj2801　　参与此项研究的除了来自维也纳大学的研究人员之外，还有来自奥地利科学院(Austrian Academy of Sciences, Boltzmanngasse, Vienna, Austria)、荷兰MSVision(MSVision, Televisieweg 40, 1322 AM Almere, The Netherlands)、荷兰单量子(Single Quantum, Rotterdamseweg 394, 2629 HH, Delft, The Netherlands) 瑞士巴塞尔大学(University of Basel, St. Johannsring 19, CH-4056 Basel, Switzerland)以及瑞士洛桑联邦理工学院(école Polytechnique Fédérale de Lausanne简称EPFL, Rue de la Maladière 71b, CH-2002 Neuchatel, Switzerland)的研究人员。　　大分子的检测、识别和分析在生命科学的许多领域都很有趣，包括蛋白质研究、诊断和分析。质谱法通常用作检测系统即一种通常根据带电粒子(离子)的质荷比分离带电粒子(离子)并测量检测器生成的信号强度的方法。这提供了有关不同类型离子的相对丰度的信息，从而提供了样品组成的信息。然而，传统探测器只能对具有高冲击能量的粒子实现高探测效率和空间分辨率——这一限制现已被使用超导纳米线探测器的国际研究团队克服。　　低能粒子的合力(Joined forces for low energy particles)　　在当前的研究中，由维也纳大学与代尔夫特的单量子、EPFL、MSVision和巴塞尔大学的合作伙伴协调的欧洲联盟首次展示了超导纳米线的使用所谓的四极杆质谱(quadrupole mass spectrometry)中蛋白质束的优秀检测器。待分析样品中的离子被送入四极杆质谱仪并进行过滤。“如果我们现在使用超导纳米线而不是传统探测器，我们甚至可以识别以低动能撞击探测器的粒子，”维也纳大学物理学院量子纳米物理小组(Quantum Nanophysics Group at the Faculty of Physics at the University of Vienna)的项目负责人马库斯阿恩特 (Markus Arndt) 解释道。这是通过纳米线探测器的特殊材料特性(超导性)实现的。　　借助超导技术实现这一目标(Getting there with superconductivity)　　这种检测方法的关键是纳米线在非常低的温度下进入超导状态，在这种状态下它们失去电阻并允许无损电流流动。进入离子对超导纳米线的激发导致返回到正常导电状态(量子跃迁)。在此转变期间纳米线电特性的变化被解释为检测信号。“通过我们使用的纳米线探测器，”第一作者马塞尔 施特劳斯(Marcel Strauß / Marcel Straus)说，“我们利用了从超导到正常导电状态的量子跃迁，因此可以比传统离子探测器性能高出三个数量级。” 事实上，纳米线探测器在极低的冲击能量下具有显著的量子产率-并重新定义了传统探测器的可能性：“此外，配备这种量子传感器的质谱仪不仅可以根据分子的质量到电荷状态来区分分子，还可以根据分子的动能对它们进行分类。这改善了检测并提供了更好的空间分辨率的可能性，”马塞尔施特劳斯说道。纳米线探测器可以在质谱、分子光谱、分子偏转或分子量子干涉测量中找到新的应用，这些领域需要高效率和良好的分辨率，特别是在低冲击能量下。图 2(Fig. 2)是用超导纳米线计数单个蛋白质。　　团队和资金(Team & Funding)　　单量子(Single Quantum)领导超导纳米线探测器的研究，洛桑联邦理工学院的专家提供超冷电子学，MSVISION 是质谱专家，巴塞尔大学的专家负责化学合成和蛋白质功能化。维也纳大学将所有组件与其在量子光学、分子束和超导性方面的专业知识结合在一起。　　本研究得到了戈登和贝蒂摩尔基金会 (Gordon and Betty Moore Foundation: 10771)、欧盟地平线2020框架计划(European Union’s Horizon 2020 Framework Programme: 860713 and 777222)的资助。　　上述介绍，仅供参考。欲了解更多信息，敬请注意浏览原文或者相关报道。　　Abstract　　The analysis of proteins in the gas phase benefits from detectors that exhibit high efficiency and precise spatial resolution. Although modern secondary electron multipliers already address numerous analytical requirements, additional methods are desired for macromolecules at energies lower than currently used in post-acceleration detection. Previous studies have proven the sensitivity of superconducting detectors to high-energy particles in time-of-flight mass spectrometry. Here, we demonstrate that superconducting nanowire detectors are exceptionally well suited for quadrupole mass spectrometry and exhibit an outstanding quantum yield at low-impact energies. At energies as low as 100 eV, the sensitivity of these detectors surpasses conventional ion detectors by three orders of magnitude, and they offer the possibility to discriminate molecules by their impact energy and charge. We demonstrate three developments with these compact and sensitive devices, the recording of 2D ion beam profiles, photochemistry experiments in the gas phase, and advanced cryogenic electronics to pave the way toward highly integrated detectors.文章来源：科学网 诸平

《自然-方法学》：蛋白质结构分析新技术创测定速度纪录　　过去需几年时间完成的工作现在仅用几天即可完成　　据美国物理学家组织网7月20日报道，隶属于美国能源部的劳伦斯伯克利国家实验室的科学家开发出一种利用小角度X射线散射技术测定蛋白质结构的新方法，大大提高了蛋白质结构研究分析的效率，使过去需要几年时间完成的工作仅需要几天即可完成，这将极大地促进结构基因组学的研究进程。　　结构基因组学是一门研究生物中所有蛋白质结构的科学。通过对蛋白质结构的分析，可大致了解蛋白质的功能。结构基因组学重视快速、大量的蛋白质结构测定，而快速结构测定技术正是该学科研究面临的一个瓶颈问题。目前通常使用的两种测定技术，X射线晶体衍射和核磁共振质谱技术，虽然精确，但速度很慢，测定一个基因的蛋白质结构，动辄就需要几年的时间。随着新发现的蛋白质及蛋白质复合物越来越多，目前的分析速度远远不能满足研究的需要。　　为解决这个瓶颈问题，劳伦斯伯克利国家实验室的科学家们借助了该实验室的先进光源(ALS)。他们运用一种称为小角度X射线散射(SAXS)的技术，对处于自然状态下(如在溶液之中)的蛋白质进行成像，其分辨率大约为10埃米(1埃米等于1/10纳米)，足够用来测定蛋白质的三维结构。ASL产生的强光可以使实验所需材料减至最少，这使得该技术可以用于几乎所有生物分子的研究。　　为了最大限度提高测定速度，研究小组安装了一个自动装置，可自动使用移液器吸取蛋白质样品到指定位置，以便利用X射线散射进行分析研究。他们还使用美国能源部国家能源研究科学计算机中心(NERSC)的超级计算资源进行数据分析。利用这一系统，研究小组取得了惊人的研究效率，在1个月内分析测定了火球菌的40组蛋白质结构。如果使用X射线晶体衍射技术，这可能需要花几年时间。同时，他们所获取的信息十分全面，涵盖了溶液中大部分蛋白质样本的结构信息。相比于在结构基因组学启动计划中使用核磁共振和晶体衍射技术仅能获取15%的信息量来说，这是十分巨大的进步。　　高通量蛋白质结构分析有助于加快生物燃料的研究步伐，帮助解读极端微生物在恶劣环境中的繁荣之谜，更好地理解蛋白质的功能。研究小组之所以首先选择火球菌进行实验分析，就是因为它可用来生产清洁能源——氢。同时，在许多工业流程中都会出现高酸高热的环境状态，而这正是火球菌喜欢的生存环境。　　但这种技术也有不足之处，追求速度会造成一种失衡，使成像质量相应打了折扣。与X射线晶体衍射成像的超高分辨率相比，小角度X射线散射成像的分辨率比较低，大约是10埃米。但这并不妨碍该技术的应用前景，因为并不是所有的研究都需要超高精度成像。对于结构基因组学研究来说，有时只要知道一种蛋白质与另一种蛋白质具有相似的结构，就可以了解其功能。而且，小角度X射线散射技术能够提供溶液中蛋白质形状、结构及构造变化等方面的精确信息，足以弥补其在成像精度方面的不足。　　该研究成果刊登在7月20日《自然—方法学》杂志网络版上，美国斯克利普斯研究所和乔治亚州大学的科学家亦参与了该项研究。

6月美国质谱学会年会(ASMS)上发布的最新数据表明，新的仪器和工作流程极大地提高了基于质谱的血浆蛋白组学实验的覆盖深度和通量。这些进步可使质谱成为各应用领域中更有用的工具，包括血浆蛋白生物标志物的开发以及迄今由Olink和SomaLogic等亲和性平台主导的大规模人群研究。　　血浆是一种易于获取和常用的样本来源，尤其是在临床工作和人群研究中。然而，由于血浆含有大量丰度较高的蛋白质和较宽的动态范围，传统的质谱蛋白质组学分析能力不足。对于细胞裂解物的分析，质谱工作流程可测量8000到12000个蛋白质，但对血浆，类似的工作流程只能测量500到1000个蛋白质。虽然可通过去除丰度较高的蛋白质或进行粗分离来改善这一情况，但这也会牺牲通量。　　去年，瑞士蛋白质组学公司Biognosys在Journal of Proteome Research杂志上发表了一项研究，他们使用赛默飞的Orbitrap Exploris 480质谱仪，通过两小时的液相色谱梯度测量了180个去除了高丰度蛋白的血浆样品中的2732个蛋白质，这是未进行血浆分离处理情况下最高深度的血浆蛋白质组分析。　　最近，蛋白质组学公司Seer推出了一种新的血浆蛋白组学解决方案。该公司的Proteograph系统使用一组纳米颗粒来富集血浆蛋白质，然后可以使用质谱等技术对其进行鉴定和定量分析。与传统的血浆蛋白组学方法相比，Seer系统在覆盖深度和通量上都有所提升。在一份发表于四月BioRxiv 预印本的研究中，威尔康奈尔医学院-卡塔尔团队使用该系统分析了345个血浆样本，测量了大约3000种蛋白质，在其液相色谱-质谱法的运行时间下每天可分析大约10个样本。　　根据以上数据，Biognosys分析和Seer系统的覆盖深度都接近于Olink的Explore平台，后者可以在血浆中测量大约3000种蛋白质，但它们仍远远落后于SomaLogic的SomaScan平台，后者可以在血浆中测量大约7000种蛋白质。在每周约70个样本的处理量上，Biognosys和Seer系统的通量仍然落后于Olink和SomaLogic平台，后者每周分别可以处理多达1000个和340个样本。　　ASMS年会上，赛默飞展示了使用Seer最新发布的Proteograph XT试剂盒在其新的Orbitrap Astral仪器上测量大约6000种蛋白质的数据，每天处理大约30个血浆样本。这些数据标志着血浆蛋白组学工作流程的重大进展，并表明在大规模血浆研究方面，结合Seer Proteograph等血浆富集技术的质谱法与基于亲和性的平台现在可能成为竞争对手。　　剑桥大学临床医学院MRC流行病学单位的生物信息学家Maik Pietzner表示：“坦白说，我们没有预见到这么大的飞跃。”他和他的同事在大规模蛋白质基因组学研究中使用了SomaLogic的SomaScan和Olink的Explore。他指出，根据ASMS展示的数据，“看起来现在似乎变得可行了”，因为他们的研究需要1000个或更大的样本队列。　　华盛顿大学基因科学教授Michael MacCoss还表示，质谱技术具备的覆盖深度和通量使其成为大规模人群研究的有用工具。他说：“像英国生物库(UK Biobank)或弗雷明汉心脏研究(Framingham Heart Study)这样的大型队列……这些样本的价值是巨大的，研究人员希望能够以最少的资源获取最多的信息，很多实验都使用了Olink或SomaLogic。”　　如果质谱技术能够可靠地提供ASMS演示中展示的覆盖深度和通量，它可能成为亲和性平台的有力补充和竞争对手。许多蛋白质存在多种形式，或称为蛋白质变体，其变异包括氨基酸变异、截断或翻译后修饰等，这些变化会影响它们的功能，在亲和性平台上往往不清楚或不确定测量的是蛋白质的哪种变体。质谱方法更适合分析这些不同的蛋白质变体。　　Olink总裁Carl Raimond表示，他认为质谱和亲和性平台是“绝对互补的”，并补充说“看到蛋白质分析领域有创新是非常好的”。然而，他表示在Olink占据领先地位的大规模人群研究中质谱技术近期可能无法成为竞争对手，他同时也质疑ASMS展示的令人印象深刻的数据在广泛应用时是否能够经受考验。他说：“细节决定成败。提出要求很容易，但真正能够实现或提出关于这一要求背后的问题则是完全不同的事情。”Raimond补充说，虽然质谱技术不断改进，但亲和性平台也将不断进步。Olink正在将其Explore平台扩展到约5,000种蛋白质靶点，而SomaLogic计划在今年年底前将SomaScan平台扩展到覆盖约10,000种蛋白质。Pietzner同样表示，虽然在ASMS上发布的数据令人兴奋，但他和他的同事们期待看到更广泛的数据，包括总体的蛋白质覆盖范围，不同蛋白质和肽段在样本中检出的一致性和重复性。他说，“亲和性方法已经应用于规模大于50,000的人群队列中，并带来了惊人的发现。我们需要进行头对头的比较以评估这些新的质谱技术是否能够实现类似的扩展。”　　MacCoss表示，使用质谱进行此类研究的公司或研究人员需要提供数据，证明他们能够在每个样本中一致且可重复地测量一组核心蛋白。他说：“当人们使用Olink时会有一个清单，上面列出了每次都会测到的蛋白质。我们仍然需要这样做。我们仍然需要说，这是每次实验都会返回定量值的蛋白质列表……以及测量中获得高质量分析数值的蛋白。”　　Pietzner表示，他和他的同事目前正在努力扩展他们的蛋白质基因组学研究以包括质谱技术。强生和强生制药公司的神经科学数据科学主管，以及英国生物库药物蛋白质组学项目(PPP)主席Christopher Whelan表示，目前一个规模最大的蛋白质基因组学人群研究项目正在实施基于质谱的蛋白质组学。　　Seer本月宣布推出Seer技术访问中心，该中心将组合其XT试剂盒与Orbitrap Astral质谱仪，为没有质谱仪的用户提供蛋白质组学服务。　　尽管到目前为止很难全面评估赛默飞的Orbitrap Astral和Seer的Proteograph XT的性能，但一些早期用户表示其产生的结果很出色。　　Cedars-Sinai精准生物标志物实验室主任Jennifer Van Eyk一直在使用Orbitrap Astral进行血浆蛋白质分析，在这方面它比先前的仪器有更强的能力。Van Eyk表示，在每天运行60个样本时，新仪器可测得的蛋白质数量是相同工作流程下使用Thermo Fisher的Exploris 480仪器的2到2.5倍。　　她说：“我们不仅可以检测到更多蛋白质，而且可以定量更多蛋白质，并且这些蛋白质是可重复的，也就是说，如果我们运行一个样本五次，我们确实会五次都观察到同样的蛋白。这是一个很大的飞跃。”这台仪器最出色的或许是其高通量，Van Eyk表示，她和她的同事们每天可以运行多达180个的未去除高丰度蛋白的血浆样本并获得良好的数据和深度的覆盖。她说，“在每天运行180个样本的情况下，突然间你可以开始讨论运行10,000个样本，然后它就成为一个人群研究了。”Van Eyk和她的同事目前正在试验Seer Proteograph系统，以“充分测试”其性能，并评估是否要将其作为血浆蛋白质组学工作流程的一部分。　　威斯康星大学麦迪逊分校的生物分子化学和化学教授Joshua Coon指出，他的实验室能够使用50分钟的液相色谱梯度在未处理的血浆中测量大约1,500种蛋白质，并且已经在该仪器上开发出了一种一分钟的直接注射方法，能够在每个样本中测量约200种蛋白质。　　Coon还是SeerProteograph平台的用户，尽管他尚未将其与Orbitrap Astral结合使用。他的实验室一直在使用Seer XT试剂盒分析阿尔茨海默病患者的血浆样本以及长期新冠肺炎(long COVID)个体的样本。他说，尽管他的团队尚未开始处理大批量样本，但在初步工作中，实验室每个样本一致地测量到约3,000种蛋白质，这是不使用Seer系统时的五倍左右。他认为，当研究人员将工作流程应用于Orbitrap Astral系统时，这些数字还会进一步提高。　　除了覆盖深度外，Coon表示，Proteograph对简化质谱样品制备非常有用。他说：“我没有完全认识到到它的自动化程度，它非常方便。现在主要的用户是一个一年级和二年级的研究生……所以他们必须快速学习。他们在处理样本、获得消化产物和肽段方面取得了很大的成功。当你有新人或者长时间不做该工作的人时，进行大规模蛋白质组学研究的样品制备将耗费整个实验一半以上的精力，只需使用该平台然后熟练掌握。”　　尽管Seer Proteograph平台提供的覆盖深度使质谱血浆蛋白质组学在某些应用中与Olink和SomaLogic等亲和力平台更具竞争力，但Seer本身在血浆富集领域面临新的竞争。　　在ASMS会议上，蛋白质组学样品制备公司PreOmics推出了其ENRICH-ist富集血浆和血清蛋白质的试剂盒。该试剂盒使用非功能化顺磁性微珠来富集低丰度蛋白质，据该公司称，与未去除高丰度以及未富集的血浆相比，用该试剂盒处理血浆可将蛋白质检出率从50%提升至100%。PreOmics首席执行官Garwin Pichler表示，微珠与缓冲液的结合可在去除高丰度蛋白的同时富集低丰度蛋白以提高覆盖深度。Biognosys推出了一种新的基于微珠的血浆蛋白质组富集试剂盒，作为其TrueDiscovery服务平台的一部分。据该公司称，这种试剂盒可以高通量定量人类血浆中约4,000种蛋白质。　　此外，在本月，华盛顿大学研究人员领导的团队在BioRxiv预印本上发表了一篇论文，描述了一种使用ReSyn Biosciences的磁性微粒富集血浆蛋白质的方法，其通过结合血浆中的膜结合囊泡并分析相关蛋白质来提高覆盖深度。华大的MacCoss是这篇预印本的通讯作者，该预印本的第一作者Christine Wu也是该富集方法的主要开发者。他们能够在Orbitrap Astral上使用30分钟的液相色谱梯度稳定地定量约4,800种血浆蛋白质，每天可处理约40个样本。在使用一小时的液相色谱梯度时，他们能够测量5,000到6,000种蛋白质。MacCoss他们迄今没有过度挑战该方法的能力，所以这些数字是相对保守的。MacCoss表示，由于Seer公司的技术成本较高，研究人员对于血浆蛋白质组学富集的替代方法很感兴趣。他说：“Seer在制造这些产品方面做得很好，但成本是一个高门槛。”　　维也纳分子病理研究所的蛋白质组学负责人Karl Mechtler表示，他与Seer的讨论中，每个样品的报价大约是600美元。他说：“如果我有100个样品，对于一个蛋白质组学实验室来说，这是一笔巨款。”他指出，对于一个典型的蛋白质组学实验室，一个合适的价格范围应该在每个样品25到50美元左右。Wu表示，使用华大的富集方法进行实验的每个样品成本低于5美元。PreOmics将ENRICH-ist试剂盒作为完整蛋白质组学样品准备工作流程的一部分销售，每个样品总共80美元。　　在回答成本问题时，Seer公司董事长兼首席执行官Omid Farokhzad表示，他认为价格是“价值交换的问题”。他说：“并非所有内容都是等价的。问题在于，从Seer所提供的与其替代方案所提供的内容来说，价值交换是什么?”在血浆蛋白质组学领域最新的发展中，这个问题的答案似乎是一个不断变化的目标。　　参考文献：[1] Tognetti Marco,Sklodowski Kamil,Müller Sebastian et al. Biomarker Candidates for Tumors Identified from Deep-Profiled Plasma Stem Predominantly from the Low Abundant Area.[J] .J Proteome Res, 2022, 21: 1718-1735.[2] bioRxiv - Genomics Pub Date : 2023-04-21 , DOI：10.1101/2023.04.20.537640Karsten Suhre, Guhan Ram Venkataraman, Harendra Guturu, Anna Halama, Nisha Stephan,Gaurav Thareja, Hina Sarwath, Khatereh Motamedchaboki, Margaret Donovan, Asim Siddiqui, Serafim Batzoglou, Frank Schmidt

近日，郑州大学第一附属医院杨静华教授团队与空军军医大学朱平教授团队、上海大学陈亮教授团队合作在国际顶尖学术期刊Science上发表了题为“Cysteine carboxyethylation generates neoantigens to induce HLA-restricted autoimmunity”的长篇研究论文。 该研究报道了一种泛蛋白修饰组学技术并发现了新型蛋白修饰和诱导限制性自身免疫。 自身免疫性疾病，如强直性脊柱炎 (AS)，机体的免疫系统对外来的抗原会做出相应的免疫应答，结果通常是将外来抗原清除，而对自身的成分通常也会发生无伤害作用的免疫应答。 一般情况下，基因可编码并翻译成蛋白质。但现有蛋白质测定技术却发现了很多与基因编码不同的氨基酸，研究者把这些现代技术检测不到的“非编码氨基酸”（ncAAs）称为人类蛋白质中的黑色物质。 非编码氨基酸包括天然蛋白质中各种形式的氨基酸修饰、变异和衍生物，可反映基因编码以外的蛋白质序列和结构的改变信息，并直接影响着蛋白结构、功能和调控。每一个非编码的氨基酸都可能是蛋白质维度上的疾病标记物和药物靶点，与人类疾病发生发展的分子机制密切相关。 杨静华教授团队经过多年研究，基于超高分辨蛋白质谱和国家超算平台，建立了一套泛蛋白修饰组学的搜索引擎，用于测定大队列人群蛋白质组中的ncAAs图谱。ncAA图谱包括基因编码以外的蛋白质结构信息，是人类疾病发生、发展及转归的分子基础。本研究采用泛蛋白修饰组学搜索引擎，测定了强直脊柱炎患者外周单核细胞的泛蛋白修饰图谱，发现了一系列与疾病相关的非编码氨基酸。论文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.abg2482

p style="text-align: center "img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201601/insimg/4a14f65e-cb82-47d8-87d5-ea4b0d204756.jpg" title="sss_56a5b6877c56c.jpg"//pp　　1、蛋白质组和基因组br//pp　　蛋白质组是指一种基因组所表达的全套蛋白质1，其英文为“proteome”。 有关蛋白质组的系统研究是蛋白质组学，英文为“proteomics”。基因组是生命体中全部基因的集合体，其英文为“genome”。有关基因组的系统研究是基因组学，其英文为“genomics”。 “proteome”和“proteomics”是由Marc Wilkins 及其同事于20世纪90年代初参照基因组和基因组学两个英文单词而创造出来的2。蛋白质组学是研发、利用、改进各种技术手段研究蛋白质组或在细胞某一生理通路中相关蛋白质集合的组成、结构、功能、代谢的一门新兴科学。/pp　　基因决定蛋白质的水平，然而，蛋白质的水平分为转录水平和表达水平，mRNA只包含前者，后者则是由mRNA被翻译所实现，而在翻译过程中通常伴随对蛋白质功能和活性起至关重要的修饰过程，如糖基化、泛素化等3。通过研究蛋白质组学，可以获取蛋白定位与修饰的定性信息和相关定量数据，丰富认知蛋白质表达水平和相关蛋白作用，对了解生命复杂活动有更深更全的认识。/pp　　2、蛋白质组的发展背景/pp　　自二十世纪九十年代以来，传统生物学得以突飞猛进地发展，并取得瞩目成就，其中三个重要点彪炳史册，也促使传统生物学获得质的转变。/pp　　第一 基因、表达序列标记(EST, expressed sequence tag)、蛋白质序列数据库的成长。细菌、酵母、线虫、果蝇的全部基因序列逐渐明了，甚至后来人类基因组计划也顺利告捷 其它的植物、动物、微生物也不断在探索。人们把已经掌握的基因分门别类地建立了序列数据库。/pp　　第二 生物信息学的发展。易获取的浏览型生物信息工具层出不穷，这种免费的网页式数据库可以让我们从其中获得所需的特殊的物质结构，如蛋白质结构中的结构域和模体等。/pp　　第三 寡核苷酸微阵列技术的发展。通过不同荧光标记的DNA样本同时与微阵列反应，形成不同荧光的现象，大幅提高Northern blot 的效率4。/pp　　3、蛋白质组学分类/pp　　蛋白质组学分类可有不同原则。/pp　　根据蛋白质来源可分为植物蛋白质组学、动物蛋白质组学、微生物蛋白质组学。植物蛋白质组学是以来源于植物或与植物相关蛋白质为研究对象，分析其在植物发生、生长、调节、凋谢等生命过程中的作用、功能、代谢、结构等的体系。同理，动物蛋白质组学是以来源于动物或与动物相关蛋白质为研究对象，最重要的一大内容就是研究人类相关蛋白质。微生物蛋白质组学是以来源于微生物或与微生物相关蛋白质为研究对象。/pp　　根据研究目的和阶段不同可分为结构蛋白质组学、表达蛋白质组学、功能蛋白质组学。结构蛋白质组学主要分析蛋白质大分子的多级结构形态，包括氨基酸顺序、二级结构、三级结构和四级结构 并着重于研究其共性结构特征和特殊功能基团 也是用于建立细胞内信号转导的网络图谱并解释某些特定蛋白表达对细胞产生特定的作用5。表达蛋白质组学是以经典蛋白质组技术如双向凝胶电泳和图像分析为方法着重于研究细胞内蛋白质表达过程及结果的体系3。功能蛋白质组学是以细胞内单一同种蛋白质功能体现、蛋白质之间、蛋白质与其他大分子之间相互作用关系为研究目的，研究和表述选定蛋白质，探明有关蛋白的修饰和信号转导通路，疾病机制或蛋白-药物作用关系3。/pp　　根据研究内容，还可分为组成性蛋白质组学、差异显示蛋白质组学、相互作用蛋白质组学。组成性蛋白质组学是鉴定某个体系的蛋白质并阐述其翻译后修饰的特性。差异显示蛋白质组学又名比较蛋白质组学，是对重要生命过程或人类重大疾病进行生理、病理体系或过程的蛋白质表达比较。相互作用蛋白质组学则是研究蛋白质间相互作用，绘制某体系蛋白质作用网络图谱8。/pp　　4、白质组学研究工具/pp　　蛋白质组学研究的重要工具主要有四个。/pp　　第一，蛋白质、表达序列标记(EST, expressed sequence tag)、基因序列数据库的建立与成熟 也可以说是生物信息学。因为蛋白质组学中所用的大多数技术所获得的数据通常都是高通量、高复杂度的，只有通过生物信息学分析才能对蛋白质的种类、结构和功能进行分析确定。/pp　　第二，质谱(MS)技术。其将样品分子离子化，根据离子间质荷比的差异分离并确定质量，实现高灵敏度、高特异性。首先，质谱技术能准确测量高达100kDa的完整大分子蛋白质，其准确度和特异度比SDS-PAGE还要高。其次，质谱技术也能准确测量从蛋白质分解下来的多肽。最后，它还可以测定多肽的氨基酸顺序，即多肽测序4。现有三条途径，一是肽链质量图谱，二是串联质谱途径，三是联合途径7。其中一种较理想的技术平台是表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(SEL-DI)技术，可分析疏水性蛋白质、pI过高或过低蛋白质、低分子量蛋白质( 25 000)和未经处理的样品中许多被掩盖的低浓度蛋白质，短时间内即可获得蛋白质的分子量、PI、特殊修饰位点等参数8。/pp　　第三，能将MS数据与数据库中特异的蛋白质顺序匹配的软件。它是快速、特异地将第一和第二工具联系在一起的分析方式。/pp　　第四，蛋白分析分离方法。通过蛋白分析分离方法可以简化蛋白复合物，同时产生不同蛋白质差异比较方法。普通的蛋白质分析分离方法包括1D-SDS-PAGE、高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳(CE)、等点聚焦电泳(IEF)等。其中二维凝胶电泳如2D-SDS-PAGE是目前蛋白质组学中分离单一蛋白质的广泛应用方法。当然，多维分析分离方法是最理想的分离蛋白质和多肽的方法，譬如，离子交换液相色谱与反相高效液相色谱串联形成的分离系统是分离多肽混合物的有力方法4。/pp　　5、白质组学的应用/pp　　蛋白质组学原则性应用包括四个方面4：组成性应用、蛋白质表达模型、蛋白质网络图谱、蛋白质修饰图谱。组成性应用是指运用质谱及其相关技术将目的蛋白质按相关标准定性或定量地纳入蛋白质数据库，在此过程中研发相应技术的应用。蛋白质表达模型是指研究在生理或病理状态目的蛋白质在细胞内定位并表达情况，同时研究细胞在暴露物理、化学、药物等因素下蛋白质表达状况。蛋白质网络图谱是研究两种或两种以上蛋白质在生物体内组成结构、表达功能、调节控制间作用情况。蛋白质修饰图谱是探明蛋白质的修饰定位及修饰后功能表现。/pp　　当然，蛋白质组学在生活中无处不在，疾病、食品、植物、药品等等。/pp　　蛋白质组学在疾病中应用方向主要是发现新的疾病标志物，以探明疾病发生机制、发展变化，为治疗途径提供思路。Brea等利用双向电泳串联质谱技术，差异比较心源性脑栓塞患者和粥样硬化血栓性梗死患者各12例的血清蛋白，发现触珠蛋白相关蛋白和淀粉样蛋白A等蛋白质在粥样硬化血栓性梗死患者血清中显著升高9。/pp　　蛋白质组学在食品中应用方向主要是检测食品中过敏源检测、鉴定食品成分等，也给食品科学研究提供了新的研究思路和技术3。李明云等优化了相应的试验条件，并将蛋白质组双向电泳相关技术引入大黄鱼肝脏蛋白质分析中，得到了较清晰的大黄鱼肝脏蛋白双向电泳图谱。/pp　　蛋白质组学在植物中应用方向主要是植物群体遗传、环境信号应答与适应机制、植物组织器官、植物亚细胞等7。其中，如果研究的植物是农作物如棉花、马铃薯、水稻等，就可以简单地视作蛋白质组学在农业中的运用了。Chang等对玉米强制缺氧和低氧研究，发现低氧处理的效应不仅是氧气含量过低诱导增加糖酵解酶，通过质谱鉴定了46个相关蛋白质10。/pp　　蛋白质组学在药品中应用方向主要是药物研发、药物作用机制、耐药机制、药物毒理学等。在对紫杉醇类药物抗癌作用研究中，Bauer等对乳腺癌复发患者进行紫杉醇类药物治疗后进行蛋白质组学分析，发现a-防卫素可作为预测该类药物治疗乳腺癌治疗作用的生物标记物11。/pp　　6、展望/pp　　蛋白质组学在短短30年间发展迅猛，渗入到生活的许多方面，也对保证人类生存质量和良性繁衍有重大作用。但其思路不开阔，技术高效性、灵敏性、特异性仍有待提高，应用普及度低，蛋白质分离、纯化技术研发，基因组学丰富度低是制约蛋白质组学及其相关技术发展的瓶颈。不过，相信随着物理技术和化学方法的不断发展，研究水平的深入，蛋白质组学会随着基因组学的发展得到更进一步地丰富。/pp　　参考文献：/pp　　1.诗，吕建新主编《分子生物学检验技术》第2版/pp　　2.Pandey A, Mann M. Proteomics to study genes and genomics [J] Nature,2000,405(6788):837-846./pp　　3.尹稳、伏旭、李平《蛋白质组学的应用研究进展》 [J]. 生物技术通报 2014年第1期/pp　　4.aniel C. Liebler《Introduction to Proteomics》:1-13/pp　　5.英超，党源，李晓艳，等. 蛋白质组学及其技术发展 [J]. 生物技术通讯，2010,21(1)：139-144./pp　　6.鑫《比较蛋白质组学研究与应用进展》[J]. 国际免疫学杂志 2006年5月第29卷第3期:156-159/pp　　7.宇，荆玉祥，沈世华《植物蛋白质组学研究进展》 [J] 植物生态学报，2004,28(1)：114-125/pp　　8.ore LE，Pfeiffer R，Warner M，et al. Identification of biomarkers of arsenic exposure and metabolism in urine using SELDI technology . Biochem Mol Toxicol ， 2005,19(3)：176./pp　　9.rea D,Sobrino T,Blanco M, et al. Usefulness of haptog lob in and serum amyloid A proteins as biomarkers for atherothrombotic ischemic stroke diagnosis confirmation [J]. Atherosclerosis,2009,205:561-567./pp　　10.ng,W.W.,L.Huang,M.Shen,C.Webster,A.L.Burlingame& J.K.Roberts.2000.Patterns of protein synthesis and tolerance of anoxia in root tips of maize seedlings acclimated to a low oxygen environment,and identification of proteins by mass spectrometry.Plant Physiology,122:295~318./pp　　11.er JA,Chakravanhy AB,Rosenbluth JM,et al.Identification of markers of taxane sensitivity using proteomic and genomic analyses of breast tumors from patients receiving neo-adjuvant paclitaxel and radiation[J].Clin Cancer Res,2010,16(2):681-690./ppbr//p

贾伟、陈熙沃特世科技（上海）有限公司实验中心氢氘交换质谱法是一种研究蛋白质空间构象的质谱技术。它在蛋白质结构及动态变化研究、蛋白质相互作用位点发现、蛋白表位及活性位点鉴定方面有着广泛的应用。随着氢氘交换质谱技术的不断发展，它正在成为结构生物学家及生物药物研发的重要手段。 氢氘交换质谱（HDX MS，hydrogen deuterium exchange mass spectrometry）是一种研究蛋白质空间构象的质谱技术。其原理是将蛋白浸入重水溶液中，蛋白的氢原子将于重水的氘原子发生交换，而且蛋白质表面与重水密切接触的氢比位于蛋白质内部的或参与氢键形成的氢的交换速率快，进而通过质谱检测确定蛋白质不同序列片段的氢氘交换速率，从而得出蛋白质空间结构信息[1]。这个过程就像将握着的拳头浸入水中，然后提出水面并张开手掌。这时，湿润的手背表明它在&ldquo 拳头&rdquo 的结构中处于外表面，而较为干燥的手心表明它是&ldquo 拳头&rdquo 的内部。除样品制备外，氢氘交换质谱法的主要过程包括：交换反应、终止反应、将蛋白快速酶切为多肽、液相分离、质谱检测、数据解析。其中交换步骤需要在多个反应时长下进行，如0s、10s、1min、10min、60min等，以绘制交换率曲线，得到准确全面的信息。氢氘交换质谱技术在蛋白质结构及其动态变化研究[1]、蛋白质相互作用位点发现[2]、蛋白表位及活性位点鉴定方面有着广泛的应用[3]。 与经典的蛋白质结构研究方法相比，如X射线晶体衍射（X-Ray Crystallography）和核磁共振（NMR. Nuclear Magnetic Resonance）等方法，氢氘交换质谱不能够提供精确的蛋白空间结构，它直接提供的主要信息包括哪些氨基酸序列位于蛋白质空间结构的表面位置（包括动态变化中的）、可能的活性位点和蛋白-蛋白相互作用位点等。但是氢氘交换质谱技术有着其他经典方法不具备的优点：首先，可以进行蛋白质结构动态变化的研究是氢氘交换质谱的一个突出优点，包括变化中的活性位点及表位；其次，氢氘交换质谱在蛋白复合体构象的研究中也具有独到的优势；此外，氢氘交换质谱还具有对样品需求量小、纯度要求相对较低、研究对象为溶液环境下的蛋白质的天然构象而非晶体中构象等优势[1,4,5]。自1991年第一篇研究论文发表起，氢氘交换质谱技术不断发展，已经成为结构生物学及质谱技术中一个非常重要的应用领域[6]。但是氢氘交换质谱实验的复杂的实现过程在一定程度上影响了其应用的广泛度。主要的难点有：1、如何避免交换后氘代肽段的回交现象；2、实验控制的高精确性和重现性要求；3、交换后造成的叠加的质谱峰如何准确分辨；4、简易高效的分析软件需求；5、以氨基酸为单位的交换位点辨析。沃特世公司自2005年起，针对以上难点不断进行攻关，推出了目前唯一商业化的全自动氢氘交换质谱系统解决方案&mdash &mdash nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System(图1)。在全世界范围内，这套系统已经帮助科学家在包括Cell、Nature等顶级研究期刊中发表研究论文[7,8]。除科研需求外，沃特世氢氘交换质谱系统也受到众多国际领先制药公司的认可，并用于新药开发中蛋白药物活性位点及表位的研究工作中。氢氘交换实验中的回交现象将严重影响实验数据的可信度，甚至导致错误结果的产生。要避免回交需要做到两点：尽量缩短液质分析时间和保证液质分析中的温度和pH为最低回交反应系数所要求的环境。沃特世UPLC系统采用亚二纳米色谱颗粒填料，较HPLC使用的大颗粒填料，UPLC具有无与伦比的分离度。因此UPLC可以做到在不损失色谱分离效果的要求下，极大缩短液相分析时间的要求[9]。对于对温度和pH控制问题，在多年的工程学改进中，nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System已经实现了对酶切、液相分离等步骤的全程控制[10]。 对氢氘交换质谱实验精确性和重现性的要求是其应用的第二个主要难点。在实验中一般需要采集0s、10s、1min、10min、60min、240min等多个时间点的数据。如果进行人工手动实验，很难做到对10S-10min等几个时间点的精确操作。再考虑到重复实验的需求，人工手动操作会对最终数据可信度产生影响。而且实验过程重复繁琐，将给实验人员带来非常大的工作压力。nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System完全通过智能机械臂，精确完成交换、终止交换、进样、酶切等一系列实验过程，而且始终保证各个步骤所需不同的温度环境。这些自动化过程不但保证了实验数据的可靠性，提高了实验效率，也将科学家从繁琐的重复实验中解放出来。 氢氘交换实验的质谱数据中，随着交换时间的延长，发生了交换反应的多肽，由于质量变大，其质谱信号将逐渐向高质荷比方向移动。因此，这些质谱峰可能与哪些未发生交换反应的多肽质谱峰逐渐叠加、相互覆盖。相互叠加的质谱信号，不但影响对峰归属的判断，更会增加交换率数据的误差。因为交换率判断需要通过对发生交换的多肽进行定量，毫无疑问因叠加的而混乱的质谱数据将极大的影响对质谱峰的准确定量。这点对于单纯通过质荷比进行分析的质谱仪来说完全无能为力。但是，这个看似不可能完成的任务却被沃特世 nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System攻克了。这是因为，不同于其它常见质谱，沃特世的SYNAPT质谱平台还具备根据离子大小及形态进行分离的功能（行波离子淌度分离）。在数据处理时，除多肽离子的质荷比信息外，还可以通过离子迁移时间（离子淌度维度参数）将不同离子区分。因此这种SYNPAT独有的被命名为HDMSE的质谱分析技术可以将因质荷比相同而重叠的多肽分离开，轻而易举地解决了质谱信号叠加的问题，得到准确的交换率数据[11,12]（图2）。SYNPAT质谱平台一经推出就夺得了2007年PITTCON金奖，目前已经推出了新一代的SYNAPT G2HDMS、SYNAPT G2-S HDMS等型号，并具备ESI、MALDI等多种离子源。除氢氘交换技术外，SYNAPT质谱系统在蛋白质复合体结构研究中也是独具特色，已有多篇高质量应用文献发表[13,14,15]。 实现氢氘交换质谱技术的第四个关键点，是如何高效分析实验产生的多时间点及多次重复带来的大量数据。人工完成如此巨大的信息处理工作，将消耗科学家大量的时间。沃特世氢氘交换质谱解决方案所提供的DynamX软件可以为科学家提供简便直观的分析结果，并包含多种呈现方式。 在某些特殊研究中，要求对蛋白氢氘交换位点做到精确到氨基酸的测量，这是氢氘交换质谱研究的又一个难点。在常规的研究中采用CID（碰撞诱导解离）碎裂模式，可能导致氘原子在多肽内重排，而致使不能对发生交换的具体氨基酸进行精确定位。SYNPAT质谱提供的ETD（电子转移解离）碎裂模式可以避免氘原子重排造成的信息混乱，并具有良好的碎裂信号[16]。沃特世的nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System为氢氘交换质谱实验提供了前所未有的简易的解决方案，强有力地推动了氢氘交换技术在蛋白质结构及动态变化研究、蛋白质相互作用位点发现、蛋白表位以及活性位点鉴定方面的应用，正在成为众多结构生物学科学家和生物制药企业必不可少的工作平台。参考文献(1) John R. Engen, Analysis of Protein Conformation and Dynamics by Hydrogen/Deuterium Exchange MS. Anal. Chem. 2009,81, 7870&ndash 7875(2) Engen et al. probing protein interactions using HD exchange ms in ms of protein interactions. Edited by Downard, John Wiley & Sons, Inc. 2007, 45-61(3) Tiyanont K, Wales TE, Aste-Amezaga M, et al. Evidence for increased exposure of the Notch1 metalloprotease cleavage site upon conversion to an activated conformation. Structure. 2011, 19, 546-554(4) Heck AJ. Native mass spectrometry: a bridge between interactomics and structural biology. Nat Methods. 2008, 5, 927-933.(5) Esther van Duijn, Albert J.R. Heck. Mass spectrometric analysis of intact macromolecular chaperone complexes. Drug Discovery Today. Drug Discovery Today: Technologies Volume 3, 2006, 21-27(6) Viswanat ham Katta, Brian T. C hait, Steven Ca r r. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 1991, 5, 214&ndash 217(7) Chakraborty K, Chatila M, Sinha J, et al. Chaperonin-catalyzed rescue of kinetically trapped states in protein folding. Cell. 2010 Jul 9 142(1):112-22.(8) Zhang J, Adriá n FJ, Jahnke W, et al. Targeting Bcr-Abl by combining allosteric with AT P-binding-site inhibitors. Nature. 2010,463, 501-506(9) Wu Y, Engen JR, Hobbins WB. Ultra performance liquid chromatography (UPLC) further improves hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. 2006 , 17, 163-167(10) Wales T E, Fadgen KE, Gerhardt GC, Engen JR. High-speedand high-resolution UPLC separation at zero degrees Celsius. Anal Chem. 2008, 80, 6815-6820(11) Giles K, Pringle SD, Worthington KR, et al. Applications of a travelling wave-based radio-frequency-only stacked ring ion guide. Rapid Commun Mass Spectrom. 2004, 18, 2401-2414(12) Olivova P, C hen W, C ha kra borty AB, Gebler JC. Determination of N-glycosylation sites and site heterogeneity in a monoclonal antibody by electrospray quadrupole ion-mobility time-offlight mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 2008, 22,29-40(13) Ruotolo BT, Benesch JL, Sandercock AM, et al. Ion mobilitymass spectrometry analysis of large protein complexes. Nat Protoc.2008, 3, 1139-52.(14) Uetrecht C, Barbu IM, Shoemaker GK, et al. Interrogating viral capsid assembly with ion mobility-mass spectrometry. Nat Chem.2011, 3,126-132(15) Bleiholder C, Dupuis NF, Wyttenbac h T, Bowers MT. Ion mobility-mass spectrometry reveals a conformational conversion from random assembly to &beta -sheet in amyloid fibril formation. Nat Chem.2011, 3, 172-177(16) Kasper D. Rand, Steven D. Pringle, Michael Morris, John R., et al. ETD in a Traveling Wave Ion Guide at Tuned Z-Spray Ion Source Conditions Allows for Site-Specific Hydrogen/Deuterium Exchange Measurements. J Am Soc Mass Spectrom. 2011, in press

p　　G 蛋白偶联受体 (G-Protein-coupled reptors, GPCRs) 类的膜蛋白贡献了大约50%的药物靶点，因此对膜蛋白的结构表征意义重大。质谱做为蛋白研究最主要的工具之一已经发展的非常成熟，但由于膜蛋白一旦脱离了稳定的天然膜环境，天然结构就会遭到破坏，因此常规的质谱分析方法难以对膜蛋白等非共价连接的蛋白复合物进行研究。Native Mass 方法 (天然质谱法) 的出现则使对膜蛋白或共价连接的蛋白复合物质谱研究成为可能，Native Mass 可以在消耗少量样品的情况下同时提供分子量、化学计量、纯度等信息，更关键的是在这种方法下蛋白质能保持天然的状态，因此，Native Mass已经成为膜蛋白等非共价连接的蛋白复合物天然结构表征的利器。/pp　　Native Mass 最早被应用在四级杆-飞行时间质谱 (Q-TOF) 上用于膜蛋白分析，近来年在傅立叶变换质谱 (FT-ICR) 或质量范围扩展的轨道离子阱质谱 (Orbitrap-EMR) 上，采用 Native Mass 方法研究蛋白天然结构的报道越来越多。/pp　　2016年，加州大学洛杉矶分校 (UCLA) 的 Loo 教授团队[1]用 Bacteriorhodopsin?OGMicelle (细菌视紫红质-辛烷基葡糖苷胶束) 和 MSP1D1-Nd (膜骨架蛋白-纳米磷脂盘复合物) 作为膜蛋白复合物的模型，比较了 Q-TOF (Waters Synapt G2)、FT-ICR (Bruker Solarix 15T FT-ICR) 和 Orbitrap-EMR (Thermo Orbitrap Exactive-Plus EMR) 三种质谱仪器在 Native MS 时的表现。/pp　　分析结果表明 FT-ICR 和 Orbitrap-EMR 相对于 Q-TOF 能得到更高质量的数据，Orbitrap-EMR (图1b) 和 FT-ICR (图1c) Native Mass 质谱图显然比 Q-TOF (图1a) 具有更高的信噪比 (S/N)，并且 FT-ICR 和 Orbitrap-EMR 均可以基本做到基线分离，而 Q-TOF 无法做到。另外，由于 FT-ICR 独特的离子传输设计，能更好地保持蛋白 Native 状态，因此，比 Orbitrap-EMR 更容易得到更窄的电荷价态分布，从而使质谱图更简单。/pp style="text-align: center "img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201802/noimg/c791e6bd-562c-438b-9808-4781f1ab5d1b.jpg" title="001.png"//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong　　▲ 图1: MSP1D1-Nd 在 Q-TOF (1a)、Orbitrap-EMR (1b) 和 FT-ICR (1c) 上获得的 Native Mass 质谱图。质谱图的右上角为去卷积后的质量分布和电荷数分布热图。/strong/span/pp　　不同的解离技术对离子活化效率比较结果显示，相对 Q-TOF 采用的 CID (碰撞诱导解离)，FT-ICR 采用的 IRMPD (红外多光子解离) 更容易将 DMPC 从 MSP1D1-Nd 剥离，因此，经过解离后 MSP1D1-Nd 颗粒结合的 DMPC 数目更少，从而使MSP1D1-Nd 的谱图更简单 (图2a, 2b)。/pp style="text-align: center "img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201802/noimg/63195da6-1a75-42b7-a342-79db15d7835a.jpg" title="002.png"//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 112, 192) "　strong　▲ 图2: 在 Q-TOF 平台采用 CID 离子解离时 MSP1D1-Nd 的质谱图 (2a) 在 FT-ICR 采用 IRMPD 离子活化时 MSP1D1-Nd 的质谱图 (2b)。/strong/span/pp　　FT-ICR 在分析中的独特优势，使其成为 Loo 教授团队 Native Mass 研究首选质谱平台，并在近期完成了多项开创性研究，包括利用 FT-ICR 在 Native Mass 条件下进行 Top-down 分析，研究蛋白和蛋白复合物的结构[2]，并将 Native Mass 与 Top-down 技术相结合，用于研究蛋白序列与高级结构和功能的关系[3]，还利用 Native Mass 分析方法，精确测定了 ADC (Antibody Drug Conjugates) 的 DAR (Drug Antibody Ratio)[4]。/pp　　[1] Iain D.G. Campuzano, et al., Anal. Chem., 2016, 88(24), 12427-12436/pp　　[2] Huilin Li, et al., Anal.Chem., 2017, 89(5), 2731-2738/pp　　[3] HuilinLi, et al., Nat. Chem.,2018, 10, 139-148/pp　　[4] Iain D. G. Campuzano,et al., Anal. Chem., 2018, 90(1), 745-751/ppbr//p

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，Improved Label-Free Quantification of Intact Proteoforms Using Field Asymmetric Ion Mobility Spectrometry [1]，文章的通讯作者是美国俄克拉荷马大学的Luca Fornelli教授。完整proteoforms的非标记高通量定量方法的应用对象通常为从整个细胞或组织裂解物中提取的0 - 30 kDa质量范围内蛋白质。然而当前，即使通过高效液相色谱或毛细管电泳实现了proteoforms的高分辨率分离，可鉴定和定量的proteoforms的数量也不可避免地受到固有的样品复杂性的限制。近年来，随着质谱技术的发展，自上而下蛋白质组学质谱(top-down proteomics)研究中蛋白质的鉴定数量大大提升，生成了包含数万种proteoforms的数据集，但在proteoforms的量化能力方面并没有得到相应的性能提升。为克服这一问题，本文中作者通过应用场不对称离子迁移谱法(Field asymmetric ion mobility spectrometry, FAIMS)对大肠杆菌中的proteoforms进行了非标记定量。由此产生的改进允许在单次LC-MS实验中采用多个FAIMS补偿电压(Compensation voltages, C.V.)，而不会增加整个数据采集周期。与传统的非标记定量实验相比，FAIMS的应用在不影响定量准确性的情况下，大大增加了鉴定和定量的proteoforms数量。首先，作者优化了质谱stepped-C.V.数据采集方法对Orbitrap Eclipse性能的影响，并从中筛选出了最优条件(−40、−20、0 V组合)。所有最新的基于Orbitrap的质谱仪(包括Exploris platform和Orbitrap Ascend)都可以采用single time-domain transients(即单次微扫描)在top down FTMS实验中生成高质量的质谱图。作者认为这对于在单次LC - MS2运行期间应用多个C.V.值的采集策略特别有益。接下来，作者应用该方法对大肠杆菌中的蛋白质进行了检测，并与传统的LC - MS2 DDA采集方法进行了比较(图1)。如图所示，每个C.V.值下的总离子流图都不同，且这一额外的分离导致在LB(Luria broth)和M9(醋酸钠处理)样品中鉴定到的proteoforms的数量显著提升。　　图1. 样本制备方法和proteoforms鉴定结果总结虽然在LC-FAIMS和LC-only数据集中，大多数鉴定到的proteoforms质量都小于15 kDa，但其中约20%的质量大于18 kDa甚至高达33.3 kDa(图2)。对已鉴定的proteoforms列表的深入分析表明，达到鉴定低丰度proteoforms的关键参数之一是在串联质谱(MS2)中有足够的时间注入离子。　　图2. A. FAIMS和非FAIMS鉴定到的proteoforms的质量分布。B. 鉴定到的proteoforms与注射时间之间的关系。最后，作者采用ProSight PD v 4.2 (Proteineous, Inc)进行了基于MS1的非标定量，结果显示基于FAIMS的数据集在LB样品(蓝色)和M9样品中检测到的差异表达的proteoforms均有所增加(图3)。作者评估了两个数据集之间的差异(使用和不使用FAIMS采集数据)，以验证FAIMS的应用是否会对量化准确性产生不利影响，结果只有1个proteoform显示相互矛盾的丰度趋势。这种差异是由于该蛋白和一个共流出蛋白之间质谱峰几乎完全重叠造成的。它们具有非常接近的单同位素质量，这样高水平的信号干扰可以很容易地干扰基于MS1的量化。启用FAIMS可以使MS1谱图简化，因为两种proteoforms可以富集在两种不同的C.V. 值下。　　图3. 大肠杆菌proteoforms无标记定量结果分析。作者将LC - FAIMS - MS2数据集与通过BUP在类似样品上获得的非标定量结果进行比较，得出两个主要的结论:1. BUP仍然对蛋白质组提供了更深层次的定量表征 2. BUP提供了与单个基因相关的所有产物的整体丰度水平信息 而TDP方法表明，给定的UniProt accession可以由多个差异表达的proteoforms组成，可能具有不同的行为(即在给定条件下，一些被上调，另一些被下调)。这一额外的信息可能具有潜在的生物学意义，但在基于BUP的定量分析中可能会被遗漏。本文描述的基于FAIMS的定量数据采集方法与PEPPI(Passively eluting proteins from polyacrylamide gels as intact species)蛋白分离技术完全兼容，产生0 - 30 kDa的组分，并且可以方便地根据待分析蛋白的平均质量调整质谱参数(C.V.值)，未来在更大的蛋白质定量方面具有广阔的应用前景。　　撰稿：张颖　　编辑：李惠琳　　原文：Kline JT, Belford MW, Huang J, Greer JB, Bergen D, Fellers RT, Greer SM, Horn DM, Zabrouskov V, Huguet R, Boeser CL, Durbin KR, Fornelli L. Improved Label-Free Quantification of Intact Proteoforms Using Field Asymmetric Ion Mobility Spectrometry. Anal Chem. 2023 Jun 13 95(23):9090-9096.　　李惠琳课题组网址www.x-mol.com/groups/li_huilin　　参考文献　　1.Kline JT, Belford MW, Huang J, Greer JB, Bergen D, Fellers RT, Greer SM, Horn DM, Zabrouskov V, Huguet R, Boeser CL, Durbin KR, Fornelli L. Improved Label-Free Quantification of Intact Proteoforms Using Field Asymmetric Ion Mobility Spectrometry. Anal Chem. 2023 Jun 13 95(23):9090-9096.

阐明小分子（包括内源性代谢物和外源性化合物）如何发挥调控作用的关键问题之一是小分子的靶标发现和验证，即蛋白质-小分子相互作用研究。蛋白质与小分子的相互作用模式既有较稳定的共价结合，也有瞬时的弱相互作用。如何灵敏、高效地捕获并解析多种类型的蛋白质-小分子相互作用是分析难点。目前，蛋白质-小分子相互作用的分析策略大致可分为两类：一是靶向相互作用研究，以蛋白质（或小分子）为中心，发现并验证与之相互作用的小分子（或蛋白质）；二是非靶向相互作用研究，全面识别多种蛋白质-小分子的相互作用轮廓。应用的具有分析技术包括：表面等离子体共振技术（surface plasmon resonance，SPR）、氢氘交换质谱分析技术（hydrogen deuterium exchange mass spectrometry，HDX MS）、限制性蛋白水解-质谱分析技术（limited proteolysis-mass spectrometry，LiP-MS）、蛋白质热迁移分析技术（cellular thermal shift assay，CESTA）和药物亲和反应靶标稳定性分析技术（Drug affinity responsive target stability，DARTS）等。本期介绍限制性蛋白水解-质谱分析技术（LiP-MS）的原理、技术流程和其在蛋白质-小分子相互作用研究中的应用。1. 原理LiP-MS技术最初由瑞士苏黎世联邦理工学院的Paola Picotti课题组建立 [1] ：利用小分子结合蛋白后相较于原蛋白产生蛋白质空间构象和位阻的变化，经蛋白酶切后形成差异肽段，液质联用分析识别和鉴定差异肽段，基于差异肽段推测蛋白质与小分子的相互作用位点。2. 技术流程在非变性条件下提取蛋白，以保留蛋白活性和空间结构。先使用低浓度（1:100, w/w）蛋白酶K在较低温度（25℃）下短时间内（5 min）对蛋白-小分子复合物进行有限的蛋白酶切。蛋白与小分子结合后，相互作用位点存在空间位阻，从而避免被蛋白酶K切割，由此产生差异肽段。随后进行蛋白变性和胰酶酶切，蛋白质组分析识别和鉴定差异肽段，基于差异肽段所处位置预测蛋白质与小分子的相互作用位点（图1）。图1 限制性蛋白水解-质谱分析（LiP-MS）技术流程 [2]3. 试验试剂和分析仪器3.1 蛋白抽提：可依据实际目的和细胞类型选择不同的细胞/组织裂解液，如RIPA、N-PER、M-PER等，进行细胞/组织蛋白抽提，获得的细胞/组织全蛋白提取物可直接与目标小分子共孵育。3.2 蛋白酶切：关键的蛋白酶切试剂，例如蛋白酶K、胰酶等均有市售。3.3 分析仪器：目前多种类型的液相色谱-高分辨质谱联用仪均可用于蛋白质组学分析，已应用于LiP-MS的高分辨质谱仪包括，布鲁克、赛默飞、沃特世和SCIEX等品牌的飞行时间质谱、轨道阱质谱和傅里叶变换离子回旋共振质谱等。4. 应用实例研究人员基于LiP-MS技术在大肠杆菌中探索多种内源性代谢物和蛋白的相互作用模式 [1]，先采用凝胶过滤法除去大肠杆菌全蛋白提取物中的内源性代谢物，获得大肠杆菌全蛋白；随后将大肠杆菌蛋白与20个中心碳代谢相关的关键内源性代谢物（三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、6-磷酸葡萄糖、果糖-1,6-二磷酸、丙酮酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸等，见图2A）分别共孵育。基于LiP-MS流程发现，上述20个内源性代谢物可与大肠杆菌中1678个蛋白发生潜在相互作用，其中1447个相互作用是首次发现的（图2B）。作者将所发现的相互作用与在线数据库BRENDA对比（主要涉及酶的功能和代谢通路等信息），证明LiP-MS技术能够准确地识别已报道的蛋白-内源性代谢物相互作用，假阳性率低于6 %。图2 20个与中心碳代谢相关的关键内源性代谢物（图A）及其在大肠杆菌中发生相互作用的蛋白数量（图B）[1]参考文献：[1] Piazza, I., Kochanowski, K., Cappelletti, V., Fuhrer, T., Noor, E., Sauer, U., Picotti, P. A map of protein-metabolite interactions reveals principles of chemical communication. Cell, 2018, 172(1-2), 358-372.[2] Pepelnjak M, Souza N D, Picotti P. Detecting Protein–Small Molecule Interactions Using Limited Proteolysis–Mass Spectrometry (LiP-MS). Trends in Biochemical Sciences, 2020, 45(10), 919-920.

2011年6月8日，苏黎世联邦理工学院及 AB SCIEX(全球领先的生命科学分析技术公司)的科学家汇聚一堂，公布一项基于质谱应用的新技术，利用此项技术，科学家有史以来首次可以获得单独蛋白质组学样品分析中每个肽段的数据。SWATH 采集模式 是一项重大技术突破，使用质谱研究蛋白质组学的用户得以获知整个蛋白质组的完整数据。在与苏黎世联邦理工学院 Ruedi Aebersold 博士进行的 MRMAtlas 合作的过程中，AB SCIEX 将开发 MS/MSALL 增强功能，使 AB SCIEX TripleTOF™ 5600 系统可以运行 SWATH 采集模式供全球科学家使用。有关 SWATH 的详情将于本周在丹佛召开的美国质谱协会 (American Society of Mass Spectrometry, ASMS) 会议上公布。　　SWATH 采集模式是 Aebersold 博士及其在苏黎世联邦理工学院的团队共同开发，为未来的蛋白质组学研究提供的一种新的工作流程，该系统预计将产生令人震撼的蛋白质组学新发现，并克服目前的质谱平台中因数据重复而给科学家带来的困惑。本技术关键优势在于其能提供样品的完整定量与定性结果，该结果能按照提出的新假设经电脑模拟进行回溯性的挖掘。　　这一新技术是对 MRMAtlas 的完美补充，MRMAtlas 以质谱技术为基础，向大多数人类蛋白质组提供研究平台。全球科学家利用这一图谱极大推进了生物标志物研究、蛋白药物开发、基础生物及生物医学研究。MRMAtlas 提供简单及有效分析能力，探索蛋白质组中前所未见的新领域。利用 TripleTOF 5600 系统的 SWATH 采集模式，将有更多科学家能使用 MRMAtlas。　　现有高分辨率及轨道阱质谱系统仅能定性检测出复杂样品中的蛋白质子集，因为它们 MS/MS 获取速度相对较慢，且为探知更准确的定量结果，常常会采用其他仪器再次进样分析样品。面对这些挑战，AB SCIEX 开发出 SWATH 采集模式可以在单一进样分析中同时对所有蛋白质与肽进行定量与定性检测。　　与 Aebersold 博士及其团队共同展开的这一活动还将继续开发软件处理方法，更好解析 MRMAtlas 的数据。SWATH 采集模式 是 AB SCIEX 的 MS/MSALL 技术的延伸，只能在 TripleTOF™ 5600 上完成，这是因为需要将极高的采集速度与定量能力、精确质量及高分辨率整合在一起方可实现。MS/MSALL 以前已成功用于脂质组学及特种结构表达。现在进一步扩展此能力，MS/MSALL 采用 SWATH 采集模式，极大提高了工作效率，因此可以结合 LC/MS， 显著提高了质谱技术。　　瑞士联邦理工学院(苏黎世联邦理工学院)分子系统生物学学院Ruedi Aebersold 博士、教授　　“利用 SWATH 和 MRMAtlas，我们能够重新思考研究蛋白质组学的方法。我们能够利用前所未有的方法研究样品，我们预计这将产生令人震撼的新发现。与 AB SCIEX 合作使我们达到开发此项技术所必须的速度与定量层次，我们将向全球整个科学界提供这一技术。”　　AB SCIEX 制药与蛋白质组学业务部总经理兼副总裁 Dave Hicks　　“AB SCIEX 再一次与世界一流科学家紧密合作，推动质谱技术发展，达到其他任何厂家均难以想象的高度。TripleTOF 5600 系统提供的能力和速度使这一革命性的 SWATH 技术成为现实。我们预计这一发展将在接下来的几年中重振蛋白质组学研究。”

1．蛋白质组学研究的研究意义和背景 随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代。在这个时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。尽管现在已有多个物种的基因组被测序，但在这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因组中所采用的策略，如基因芯片、基因表达序列分析(Serial analysis of gene expression, SAGE)等，都是从细胞中mRNA的角度来考虑的，其前提是细胞中mRNA的水平反映了蛋白质表达的水平。但事实并不完全如此，从DNA mRNA 蛋白质，存在三个层次的调控，即转录水平调控(Transcriptional control )，翻译水平调控(Translational control)，翻译后水平调控(Post-translational control )。从mRNA角度考虑，实际上仅包括了转录水平调控，并不能全面代表蛋白质表达水平。实验也证明，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度的相关性并不好，尤其对于低丰度蛋白质来说，相关性更差。更重要的是，蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质－蛋白质相互作用等则几乎无法从mRNA水平来判断。毋庸置疑，蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。蛋白质本身的存在形式和活动规律，如翻译后修饰、蛋白质间相互作用以及蛋白质构象等问题，仍依赖于直接对蛋白质的研究来解决。虽然蛋白质的可变性和多样性等特殊性质导致了蛋白质研究技术远远比核酸技术要复杂和困难得多，但正是这些特性参与和影响着整个生命过程。 传统的对单个蛋白质进行研究的方式已无法满足后基因组时代的要求。这是因为：(1) 生命现象的发生往往是多因素影响的，必然涉及到多个蛋白质。(2) 多个蛋白质的参与是交织成网络的，或平行发生，或呈级联因果。(3) 在执行生理功能时蛋白质的表现是多样的、动态的，并不象基因组那样基本固定不变。因此要对生命的复杂活动有全面和深入的认识，必然要在整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行研究。因此在上世纪90年代中期，国际上产生了一门新兴学科－蛋白质组学（Proteomics），它是以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象。可以说蛋白质组研究的开展不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑，也是后基因组时代生命科学研究的核心内容之一。 虽然第一次提出蛋白质组概念是在1994年，但相关研究可以追溯到上世纪90年代中期甚至更早，尤其是80年代初，在基因组计划提出之前，就有人提出过类似的蛋白质组计划，当时称为Human Protein Index计划，旨在分析细胞内的所有蛋白质。但由于种种原因，这一计划被搁浅。90年代初期，各种技术已比较成熟，在这样的背景下，经过各国科学家的讨论，才提出蛋白质组这一概念。 国际上蛋白质组研究进展十分迅速，不论基础理论还是技术方法，都在不断进步和完善。相当多种细胞的蛋白质组数据库已经建立，相应的国际互联网站也层出不穷。1996年，澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心：Australia Proteome Analysis Facility ( APAF )。丹麦、加拿大、日本也先后成立了蛋白质组研究中心。在美国，各大药厂和公司在巨大财力的支持下，也纷纷加入蛋白质组的研究阵容。去年在瑞士成立的GeneProt公司，是由以蛋白质组数据库“SWISSPROT” 著称的蛋白质组研究人员成立的，以应用蛋白质组技术开发新药物靶标为目的，建立了配备有上百台质谱仪的高通量技术平台。而当年提出Human Protein Index 的美国科学家Normsn G. Anderson也成立了类似的蛋白质组学公司，继续其多年未实现的梦想。2001年4月，在美国成立了国际人类蛋白质组研究组织（Human Proteome Organization, HUPO）,随后欧洲、亚太地区都成立了区域性蛋白质组研究组织，试图通过合作的方式，融合各方面的力量，完成人类蛋白质组计划（Human Proteome Project）。2．蛋白质组学研究的策略和范围 蛋白质组学一经出现，就有两种研究策略。一种可称为“竭泽法”，即采用高通量的蛋白质组研究技术分析生物体内尽可能多乃至接近所有的蛋白质，这种观点从大规模、系统性的角度来看待蛋白质组学，也更符合蛋白质组学的本质。但是，由于蛋白质表达随空间和时间不断变化，要分析生物体内所有的蛋白质是一个难以实现的目标。另一种策略可称为“功能法”，即研究不同时期细胞蛋白质组成的变化，如蛋白质在不同环境下的差异表达，以发现有差异的蛋白质种类为主要目标。这种观点更倾向于把蛋白质组学作为研究生命现象的手段和方法。 早期蛋白质组学的研究范围主要是指蛋白质的表达模式（Expression profile）, 随着学科的发展，蛋白质组学的研究范围也在不断完善和扩充。蛋白质翻译后修饰研究已成为蛋白质组研究中的重要部分和巨大挑战。蛋白质-蛋白质相互作用的研究也已被纳入蛋白质组学的研究范畴。而蛋白质高级结构的解析即传统的结构生物学，虽也有人试图将其纳入蛋白质组学研究范围，但目前仍独树一帜。3．蛋白质组学研究技术 可以说，蛋白质组学的发展既是技术所推动的也是受技术限制的。蛋白质组学研究成功与否，很大程度上取决于其技术方法水平的高低。蛋白质研究技术远比基因技术复杂和困难。不仅氨基酸残基种类远多于核苷酸残基（20/ 4）, 而且蛋白质有着复杂的翻译后修饰，如磷酸化和糖基化等，给分离和分析蛋白质带来很多困难。此外，通过表达载体进行蛋白质的体外扩增和纯化也并非易事，从而难以制备大量的蛋白质。蛋白质组学的兴起对技术有了新的需求和挑战。蛋白质组的研究实质上是在细胞水平上对蛋白质进行大规模的平行分离和分析，往往要同时处理成千上万种蛋白质。因此，发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台是现在乃至相当一段时间内蛋白质组学研究中的主要任务。当前在国际蛋白质组研究技术平台的技术基础和发展趋势有以下几个方面：3.1 蛋白质组研究中的样品制备 通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。也可以进行样品预分级，即采用各种方法将细胞或组织中的全体蛋白质分成几部分，分别进行蛋白质组研究。样品预分级的主要方法包括根据蛋白质溶解性和蛋白质在细胞中不同的细胞器定位进行分级，如专门分离出细胞核、线粒体或高尔基体等细胞器的蛋白质成分。样品预分级不仅可以提高低丰度蛋白质的上样量和检测，还可以针对某一细胞器的蛋白质组进行研究。 对临床组织样本进行研究，寻找疾病标记，是蛋白质组研究的重要方向之一。但临床样本都是各种细胞或组织混杂，而且状态不一。如肿瘤组织中，发生癌变的往往是上皮类细胞，而这类细胞在肿瘤中总是与血管、基质细胞等混杂。所以，常规采用的癌和癌旁组织或肿瘤与正常组织进行差异比较，实际上是多种细胞甚至组织蛋白质组混合物的比较。而蛋白质组研究需要的通常是单一的细胞类型。最近在组织水平上的蛋白质组样品制备方面也有新的进展，如采用激光捕获微解剖(Laser Capture Microdissection, LCM) 方法分离癌变上皮类细胞。3.2 蛋白质组研究中的样品分离和分析 利用蛋白质的等电点和分子量通过双向凝胶电泳的方法将各种蛋白质区分开来是一种很有效的手段。它在蛋白质组分离技术中起到了关键作用。如何提高双向凝胶电泳的分离容量、灵敏度和分辨率以及对蛋白质差异表达的准确检测是目前双向凝胶电泳技术发展的关键问题。国外的主要趋势有第一维电泳采用窄pH梯度胶分离以及开发与双向凝胶电泳相结合的高灵敏度蛋白质染色技术，如新型的荧光染色技术。 质谱技术是目前蛋白质组研究中发展最快，也最具活力和潜力的技术。它通过测定蛋白质的质量来判别蛋白质的种类。当前蛋白质组研究的核心技术就是双向凝胶电泳－质谱技术，即通过双向凝胶电泳将蛋白质分离，然后利用质谱对蛋白质逐一进行鉴定。对于蛋白质鉴定而言，高通量、高灵敏度和高精度是三个关键指标。一般的质谱技术难以将三者合一，而最近发展的质谱技术可以同时达到以上三个要求，从而实现对蛋白质准确和大规模的鉴定。3.3 蛋白质组研究的新技术 做过双向凝胶电泳的人一定会抱怨它的繁琐、不稳定和低灵敏度等缺点。发展可替代或补充双向凝胶电泳的新方法已成为蛋白质组研究技术最主要的目标。目前，二维色谱 (2D-LC)、二维毛细管电泳 (2D-CE)、液相色谱－毛细管电泳 (LC-CE) 等新型分离技术都有补充和取代双向凝胶电泳之势。另一种策略则是以质谱技术为核心，开发质谱鸟枪法(Shot-gun)、毛细管电泳-质谱联用 (CE-MS)等新策略直接鉴定全蛋白质组混合酶解产物。随着对大规模蛋白质相互作用研究的重视，发展高通量和高精度的蛋白质相互作用检测技术也被科学家所关注。此外，蛋白质芯片的发展也十分迅速，并已经在临床诊断中得到应用。3.4 蛋白质组生物信息学 蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础。瑞士的SWISS-PROT拥有目前世界上最大，种类最多的蛋白质组数据库。丹麦、英国、美国等也都建立了各具特色的蛋白质组数据库。生物信息学的发展已给蛋白质组研究提供了更方便有效的计算机分析软件；特别值得注意的是蛋白质质谱鉴定软件和算法发展迅速，如SWISS-PROT、Rockefeller大学、UCSF等都有自主的搜索软件和数据管理系统。最近发展的质谱数据直接搜寻基因组数据库使得质谱数据可直接进行基因注释、判断复杂的拼接方式。随着基因组学的迅速推进，会给蛋白质组研究提供更多更全的数据库。另外，对肽序列标记的从头测序软件也十分引人注目。4． 蛋白质组学发展趋势 在基础研究方面，近两年来蛋白质组研究技术已被应用到各种生命科学领域，如细胞生物学、神经生物学等。在研究对象上，覆盖了原核微生物、真核微生物、植物和动物等范围，涉及到各种重要的生物学现象，如信号转导、细胞分化、蛋白质折叠等等。在未来的发展中，蛋白质组学的研究领域将更加广泛。 在应用研究方面，蛋白质组学将成为寻找疾病分子标记和药物靶标最有效的方法之一。在对癌症、早老性痴呆等人类重大疾病的临床诊断和治疗方面蛋白质组技术也有十分诱人的前景，目前国际上许多大型药物公司正投入大量的人力和物力进行蛋白质组学方面的应用性研究。 在技术发展方面，蛋白质组学的研究方法将出现多种技术并存，各有优势和局限的特点，而难以象基因组研究一样形成比较一致的方法。除了发展新方法外，更强调各种方法间的整合和互补，以适应不同蛋白质的不同特征。另外，蛋白质组学与其它学科的交叉也将日益显著和重要，这种交叉是新技术新方法的活水之源，特别是，蛋白质组学与其它大规模科学如基因组学，生物信息学等领域的交叉，所呈现出的系统生物学（System Biology）研究模式，将成为未来生命科学最令人激动的新前沿。

BiopharmaLynx软件在蛋白质肽图分析中的应用周春喜沃特世科技（上海）有限公司实验中心在新药研发中，蛋白质药物正在占据越来越大的比重，而蛋白质分子结构的复杂性又要求对蛋白质药物必须进行全面的表征，以满足新药报批、工艺改进和专利保护的要求。目前蛋白质药物的研发和表征还面临很多挑战，尤其是在重组蛋白的序列确证、微量杂质蛋白的检测和定量、不同批次间产品的比较和质量控制等方面。质谱在蛋白质的表征方面发挥着至关重要的作用，它不仅可以测定蛋白质药物的分子量和产品的异质性，还可以通过肽图分析确证蛋白质分子的一级结构，包括氨基酸序列、突变和修饰、二硫键定位等信息。但如果没有功能强大的软件帮助，质谱数据的分析、比较、注释、有效信息的提取和分析报告的产生将是一个十分费时耗力的复杂过程。如果进行人工分析，即使是经验丰富的分析人员也会感到很头疼，而且在如此复杂的分析过程中很难保证不出差错，而一旦出现差错，不仅会严重影响研发的进程，有些错误的判断还有可能导致整个项目的失败。因此，分析软件是必不可少的。理想的软件不仅可以按照标准的流程，自动地完成分析过程，还可以允许分析人员根据经验和知识对分析结果进行检查并修正错误的结果。沃特世公司的BiopharmaLynxTM软件就是这样的理想工具，它不仅可以自动地完成蛋白质分子量和肽图的分析，比较不同批次间的样品并确认有无差异，还具有以下特点：肽图分析覆盖率高肽图分析可以确证蛋白质分子的一级结构，包括氨基酸序列、突变和修饰、二硫键定位等。由于酶解后的样品中同时存在着蛋白质的完全酶切肽段、不完全酶切肽段、非特异酶切肽段、修饰肽段和杂蛋白肽段，因此肽图是非常复杂的。通过全信息串联质谱技术（MSE），可以同时记录样品中所有的母离子及其碎片离子信息。在全面信息的基础上，BiopharmaLynx软件将可以自动进行保留时间的对齐、强度归一化、痕量杂质分析、序列确证等工作。图1为BiopharmaLynx软件对两种干扰素产品肽图分析的鉴定覆盖率分析结果，及其序列对比界面。 二、BiopharmaLynx具有多种酶切功能在计算理论肽图时，BiopharmaLynx可以进行多种方式的理论酶切，包括半酶切、多酶联合酶切、非特异性酶切，以及自编辑酶切等。全面满足实验中的各种酶切分析需求。三、BiopharmaLynx具有多种翻译后修饰可选在计算理论肽图时，BiopharmaLynx还可以考虑各种翻译后修饰。在内置90种常见修饰可供选择外，分析人员还可自行编辑其需要的特殊修饰方式用于分析。四、修饰的肽段在不同样品间含量对比BiopharmaLynx软件可以比较不同样品间某种肽段（包括突变肽段和特定修饰肽段）的含量差异，发现样品间的细微差别，并用直观的方式显示出来。五、BiopharmaLynx的样品间肽图对比BiopharmaLynx软件这可以自动地将各个批次样品的肽图与参照样品的肽图进行对比，帮助我们快速而敏锐地发现不同批次的样品间有无细微差别。六、二硫键的定位二硫键对于蛋白质高级结构的形成和功能的维持具有重要的作用，二硫键的定位也是蛋白质结构分析的重要方面。但是二硫键的定位一直很耗时且非常具有挑战性的事情，尤其是对于含有多对二硫键的蛋白质，如免疫球蛋白等。沃特世公司的肽图分析完整解决方案通过独特的UPLC/MSE数据采集方式和功能强大的BiopharmaLynx软件，可以快速地自动完成二硫键的定位分析（见图6）。在生物药领域，BiopharmaLynx软件作为液质数据分析最为专业的软件已经被广泛使用。目前，全球前十大生物药企业都已成为沃特世生物制药解决方案的使用者。关于沃特世公司 (www.waters.com)50多年来，沃特世公司(NYSE:WAT)通过提供实用和可持续的创新，使医疗服务、环境管理、食品安全和全球水质监测领域有了显著进步，从而为实验室相关机构创造了业务优势。作为一系列分离科学、实验室信息管理、质谱分析和热分析技术的开创者，沃特世技术的重大突破和实验室解决方案为客户的成功创造了持久的平台。2011年沃特世公司拥有18.5亿美元的收入，它将继续带领全世界的客户探索科学并取得卓越成就。###联系人：叶晓晨沃特世科技（上海）有限公司 市场服务部xiao_chen_ye@waters.com周瑞琳(GraceChow)泰信策略(PMC)020-8356928813602845427grace.chow@pmc.com.cn

在多肽类药物的生产质控中，氨基酸序列的测定是必不可少的检测项目。对于常规组成单一的合成多肽药物来说，氨基酸序列的分析较为简单，可通过Edman降解法或质谱法进行测定，其中Edman降解法被认为更加直接可靠。但对于组成复杂的混合多肽药物来说，比如，醋酸格拉替雷（Glatiramer acetate，简写为GA），由于多肽组成形式复杂多变，可能具有超过一万亿个不同序列的独特多肽，如果对每种多肽成分的氨基酸序列进行精确测定，似乎既不可能，其实也无必要，我们需要考虑新的方法对混合多肽进行整体表征。 n 快速了解醋酸格拉替雷醋酸格拉替雷是一种人工合成的多肽类制剂，由Glu（谷氨酸）、Ala（丙氨酸）、Tyr（酪氨酸）和Lys（赖氨酸）四种氨基酸随机聚合而成，原研药由以色列药厂TEVA研发制造（商品名Copaxone），于1996年获美国FDA核准用于治疗多发性硬化症（MS），其2020年全球销售额达到13.37亿美元，2021年7月，TEVA的“醋酸格拉替雷注射液”在中国的上市申请获得受理。多发性硬化症是一种常见的以中枢神经系统炎性脱髓鞘为主要特征的自身免疫性疾病，临床表现包括视物模糊，感觉、运动异常，智能、情感等高级功能障碍，在中青年人群中多发，且有较高致残率。醋酸格拉替雷被认为是通过改变造成MS发病机制的免疫过程而起作用的，其疗效与耐受性在临床上获得了十足的肯定。 醋酸格拉替雷是一种由Tyr、Lys、Glu、Ala随机聚合而成的多肽混合物（CAS号：147245-92-9） 醋酸格拉替雷的第一个仿制药Glatopa （由Sandoz 公司和 Momenta公司共同开发）于2015年上市，由于原研药的专利到期，未来将有更多的仿制药上市。 n 醋酸格拉替雷的合成与质量评估在醋酸格拉替雷的生产过程中，通过聚合及解聚反应，可以将其分子量控制在一个较窄的范围（平均分子量4700～11000 Da）。生产工艺的改变以及所用试剂的变化都有可能使药物的组分比例发生变化。利用Edman降解法，通过监测N端每一个循环的4种氨基酸的组成比例以及变化趋势，可以对药品质量进行评估。 岛津解决方案 l 蛋白质测序仪对醋酸格拉替雷进行质量评价的原理Edman降解法是进行N端氨基酸序列分析的经典方法，岛津以其为原理设计的全自动蛋白质测序仪（以下简称PPSQ），由液相系统和可执行自动化Edman降解反应的主机组成，将氨基酸从多肽链的N端依次切割下来，通过色谱的保留时间判定氨基酸种类，结果直接可靠。PPSQ除了对N端氨基酸序列进行定性分析外，利用液相色谱稳定的定量能力，还可以对多肽特定循环氨基酸的摩尔生成量及组成比例进行定量分析。 岛津在售蛋白质测序仪PPSQ-51/53A Edman降解反应图解 l 样品前处理取适量稀释后的样品加入经聚凝胺处理的玻璃纤维膜上，干燥后安装到PPSQ反应器上进行分析。实验仅作示例，共测试了3个批次的原研药Copaxone以及4个批次的某在研仿制药，每个批次测试N端前6个循环。 反应器构造图 l 实验结果 1）N端氨基酸组成定性分析醋酸格拉替雷原研药每个循环均检测到Glu、Ala、Tyr、Lys等4种氨基酸，这与药品由Glu、Ala、Tyr、Lys等4种氨基酸随机聚合而来，结果一致。 醋酸格拉替雷原研药Copaxone与某在研仿制药N端氨基酸分析色谱图示例（1-6循环）（黑色：原研药Copaxone；红色：某在研仿制药；DTT、DMPTU、DPTU为试剂峰） 2）各循环中每种氨基酸的相对摩尔含量的分析根据仪器自动生成的氨基酸生成量，计算每种氨基酸的摩尔含量，例如，Glu的相对摩尔含量为： 根据氨基酸的相对摩尔含量，绘制各循环中各氨基酸生成量的趋势图，如下。 醋酸格拉替雷Copaxone 与某在研仿制药N端前6个循环相对氨基酸水平分析（纵坐标：相对摩尔含量；横坐标：循环数） 3）原研药与某在研仿制药的比较从趋势图来看，仿制药各循环氨基酸生成量趋势，与原研药整体相似，但GA仿制药-批次1的Glu的相对含量略低，GA仿制药-批次4的各循环Tyr的相对含量略高，批次1中Glu的偏低与批次4中Tyr的偏高是否正常，需要对原研药进行多批次实验，以判断是否超出正常范围。GA仿制药-批次2及GA仿制药-批次3的Tyr生成量趋势与其他样品有明显不同，提示仿制药生产工艺可能存在与原研不同的地方。 结 语通过醋酸格拉替雷N端各氨基酸生成量的趋势变化的分析比较，可为仿制药的开发及生产质控提供参考，醋酸格拉替雷N端相对氨基酸水平分析亦可作为醋酸格拉替雷仿制药与原研药一致性评价的依据。这也为我们今后分析类似混合蛋白或多肽药物提供了参考思路。 参考文献：J. Andersona, C. Bell, et al., Demonstration of equivalence of a generic glatiramer acetate (Glatopa™ ), Journal of the Neurological Sciences 359 (2015) 24–34 撰稿人：顿俊玲 *本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。

最近，来自瑞士和荷兰的科学家，对在22种不同生长条件下大肠杆菌表达的蛋白质，进行了定量和定性分析。确定了超过2300个蛋白质，其中一些处于每个细胞一个副本的平均水平。由此产生的数据集描述了细胞中大多数( 90%)的蛋白质量，对细胞生物学家来说这将是一个宝藏。相关研究结果发表在十二月出版的《Nature Biotechnology》。　　为了了解细胞内的基因组信息和它们的生理机能之间的关系，重要的是要评估哪些基因在不同条件下积极参与产生蛋白质。收集这些信息的最直接的方式是，对细胞中存在的蛋白质进行定量测量。　　随着技术的进步，最近才使得绝对蛋白质水平的大规模测量成为可能。来自巴塞尔大学和苏黎世大学(瑞士)、格罗宁根大学(荷兰)的科学家们，联手测量在22种不同条件下生长的大肠杆菌中的蛋白质。使用质谱法为基础的蛋白质组学方法，他们不仅确定了存在哪些蛋白质，而且还确定了每个细胞中有多少个副本。　　大型数据集　　系统生物学教授Matthias Heinemann说，来自大规模数据集的结果，将激励更多新的研究成果，他与巴塞尔大学的Alexander Schmidt一起协调实验。他解释说：“我们成功地分析了这些细胞中百分之90的蛋白质量。我们发现，有超过2300种不同的蛋白质，代表着4300个细菌基因中的超过一半。这使大肠杆菌中绝对定量的蛋白质数量增加了一倍。对于这些蛋白质中的一些，还没有确定其功能。但是，通过研究超过22种不同生长条件下的表达模式，我们现在获得了一个关于‘它们正在做什么’的线索。”　　免费索取Life Tech蛋白质组学产品信息　　蛋白质有非常不同的表达水平，从每个细胞平均超过100000个副本，到两个、一个甚至更少的水平。Heinemann说：“首先，这表明我们的方法是多么的敏感，但它也会让你想知道，在非常低的水平表达的蛋白质有什么功能，通过纯粹的随机效应，虽然一些基因可能是活跃的(从而随机产生蛋白质)，但我们并不排除一个细胞中一个蛋白单拷贝的一种适当功能。毕竟，其他的生物实体——显示为单拷贝(如基因)，也具有一种功能，研究还发现了对细菌蛋白质的新翻译后适应性。　　新问题　　在这篇论文中描述的数据集，正在被其他科学家所使用，并引发了新的令人兴奋的研究调查。作者指出：“我们的数据将作为新研究的参考数据，并已经促成了一些正待出版的研究结果。这个数据集可让科学家们能够提出并回答新的问题。”　　对于这项研究，在不同条件下生长的细菌是在格罗宁根大学培养的。样品被运到巴塞尔大学，蛋白质含量(包括膜结合蛋白)是通过质谱分析法分离和分析的。最后，整个团队对这些结果进行了分析。

仪器信息网讯，2009年11月24日由中国生物化学与生物学会蛋白质组学专业委员会、北京蛋白质组研究中心、岛津国际贸易(上海)有限公司共同主办的题为“翻译后修饰蛋白质组技术及应用”研讨会在北京蛋白质组研究中心成功举办，约200多位多从事相关研究的学者出席了此次研讨会 会议由钱小红教授、杨芃原教授共同主持。　　在大会上做报告的专家有：Koichi Tanaka(田中耕一，岛津公司研究实验室，2002年诺贝尔化学奖获得者)，Catherine Fenselau (University of Maryland)，Robert J. Cotter (Johns Hopkins University), Emmanuel Raptakis (Kratos Analytical., Shimadzu Biotech), Pengyuan Yang(复旦大学)，Siqi Liu (Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences), Xiaohong Qian (Bdijing Proteome Research Center) Fuquan Yang, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences)Koichi Tanaka(田中耕一，岛津公司研究实验室，2002年诺贝尔化学奖获得者) 　　Title：MALDI Matrix Development History　　蛋白质是生命的物质基础，每一种生命运动形式，都是特定蛋白质群体发挥功能的结果；因而蛋白质组研究是人类研究细胞功能和疾病发生发展过程的中心环节。目前蛋白质组研究采用的主要技术是双向凝胶电泳和质谱法。具备测定大分子、快速、大规模分析的MALDI-TOF技术是用于蛋白质组分析的主要手段之一，并被认为是蛋白质分析领域的一项重大突破。在蛋白质组研究中，除了研究蛋白质一级结构外，还要对翻译后修饰的进一步分析，如蛋白质的糖基化、蛋白质的磷酸化等，MALDI-TOF在其中发挥了极其重要的作用。　　田中耕一先生发明的“激光解吸附软电离技术”使分析生物大分子成为可能。MALDI是这一技术直接的商品化，广泛用于测定多肽和蛋白质的分子量、肽指纹图谱、以及氨基酸序列等。　　Catherine Fenselau (University of Maryland)　　Title: Proteomic Strategies for Longer Peptides: How and Way　　Robert J. Cotter (Johns Hopkins University)　　Titel: Characterization of Protein Post-Translational Modifications Using MALDI Mass　　Emmanuel Raptakis (Kratos Analytical., Shimadzu Biotech)　　Title: Using the Power of a MALDI-quadrupole Ion Trap-TOF to Elucidate Structures of Complex Biomolecules　　Pengyuan Yang(复旦大学)　　Titel:Mass Spectrometry Based Protein Glycosylation Analysis　　Siqi Liu (Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences)　　Title: Proteomic and Functional Analysis Towards the Nitrated Proteins in the Heart Mitochondria of db/db Diabetic Muse Model　　Xiaohong Qian (Beijing Proteome Research Center)　　Titel:Globel Analysis of Core-fucosylated Glycoprotein　　Fuquan Yang, (Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences)　　Title: Phosphoproteome Analysis of Rat L6 Myotubes Using Reverse Phase C18 Prefractionation and Titanium Oxide Enrichment大会现场

Postnova场流分离系统应用举例——蛋白质聚集体分离的理想解决方案 蛋白质聚集体已经成为药学发展和质检上一个重要的问题。其活性，生物利用度和可能的消极免疫响应等性能直接与不同程度的聚集态的存在有关。因此不仅FDA, 更多的官方和私人研究机构都对聚集态结构产生越来越大的兴趣。他们研究的目标是确定精确的聚集情况，即药物中的蛋白质中某个时间有多少聚集态结构形成以及如何避免这种情况。 场流分离技术是分离技术的一种，它可以与液相色谱（LC）相比。就像液相主要用来分离小分子一样，场流分离主要用来分离大分子或粒子（可称为：粒子色谱）。场流分离技术是一个独特的分离技术，所有场流分离技术都使用相同的基本分离的原则，但采用不同的分离场。根据不同分离场，场流分离技术可分为流动场流分离，沉淀场流分离，热场流分离等。当样品注射到场流分离通道时，分离应力作用于聚合物或粒子强迫它们向通道底层移动，通道底层就被称为聚集壁。样品不能透过聚集壁，所以它们再次扩散到通道中心。扩散应力被分离应力抵消，在很短的时间（一般是30～120秒）内两种力之间就建立起一个稳定的动态平衡。大小不同的颗粒有着不同的扩散系数，所以它们在通道内由于速度梯度而被分离。注射后的粒子/聚合物由于“垂直场力”的存在，受迫向垂直于流动相流动的方向移动。小粒子由于具有较大的扩散系数将会比大粒子在通道内扩散的更深远。结果就是，小粒子在通道内被“层流”更快的定位，并因此而被洗脱出来；而大粒子则定位较慢，后洗脱出来。上图是使用AF4非对称场流分离单克隆抗体的结果。在20分钟内，不同程度的聚集态被分开，整个分离过程由于没有固定相存在，因此蛋白质的空间结构不会被破坏。样品不需要前处理，更可以通过联用多种在线检测器（LS, UV, RI, SEM, DLS），方便迅速得到需要的数据。 场流分离技术具有以下优点：• 快速、温和的分离，可以兼容任何溶剂和缓冲液• 超高的分辨率（±1nm）• 没有任何固定相的分离通道• 宽分离范围：粒径1nm~100mm /分子量1000Da~1012Da• 无需前处理及过滤，直接进样复杂基质样品• 可收集所需要的样品，方便升级至制备级• 能够连接各种检测器，如在线串联紫外、光散射、荧光、质谱等检测器• 可同时测定分子的分子量及粒子的粒径。这些优点使场流分离技术在蛋白质及其聚集体分离方面可以发挥巨大的作用。更多产品详情，敬请登陆：www.tegent.com.cn德祥热线：4008 822 822info@tegent.com.cn

质谱仪器作为一种质量检测仪器，被应用到各个学科领域中，尤其是在化学化工、环境能源、医药、生命及材料科学等领域发挥着重要作用。在常规质谱分析中，被分析物质首先被离子化，随后各种离子被引入真空中的质量分析器，在分析器中的电场或磁场作用下，离子的运动特性随其质荷比不同而产生差异，因而造成时空上的分离，并由检测器依次检测出来。而在这种原理下，质谱仪测量的是离子的质荷比（m/z)，而不是质量本身。利用质谱仪器对样品的分析过程中，样品的雾化过程十分关键。目前，常用的电喷雾技术原理是由John Fenn提出的电喷雾电离（ESI）技术，这一理论也获得了2002年的诺贝尔化学奖。通常对蛋白质这种大分子来说，ESI质谱中都会呈现多种价态的谱峰群，群落中的每一组为某个电荷态该蛋白质的各个同位素峰、盐峰以及加合物峰等。由于电荷态z通常是连续的整数分布（例如z = 11，12....21,22...)，人们可以通过计算不同电荷数对应的群落m/z的间隔来推算各组的电荷数z，进而求出实际的质量m的分布，也可以使用软件进行解卷积得到m分布。这种分析手段对于分析分子量较小（分子量在5万以下）、简单纯净的蛋白样品还是很有效的。然而，在实际应用中对天然蛋白和病毒颗粒的分析却不那么简单。随着分子量上升，分子结构越来越复杂，各种翻译后修饰使被测蛋白的分子量出现差异化，很宽的质量分布（可达上千Da）使得不同价态的峰群连接在一起。如图1所示，这种缺少电荷状态以及同位素峰的“死亡驼峰”，我们很难通过解卷积的形式进行分析。并且，对于很多糖蛋白，分子量超过3、4万就出现峰群交叠，无法用解卷积软件来获得分子量的分布信息。因此，对于大生物分子的质谱分析，仅靠提高仪器的分辨率是无济于事的。在这种情况下，电荷检测质谱（CDMS）技术便成为了我们的“救命稻草”。电荷检测质谱（CDMS）通过同时测量单个离子的质荷比和电荷数，进而计算获得离子质量m。因此，相较于其他类型质谱，CDMS技术的关键是如何准确地测量单个离子的电荷。目前，电荷检测质谱技术还没有现成的商品化仪器，只有能够自己开发质谱仪器硬件，或自己改编FTMS软件的专家才能进行这样的实验。而在今年的ASMS会议上，赛默飞公司重磅推出了直接分析质谱技术（DMT），并将其结合在了Orbitrap上，这使得超大分子量的复杂蛋白的直接质谱检测成为了可能。直接分析质谱技术其原理是：在Orbitrap中检测来自离子沿中心电极的中心轴旋转的轴向频率，进而确定离子的m/z信息；与此同时，来自外电极上的感应电荷振幅也会被检测，从而确定离子的电荷z的信息。直接分析质谱技术模式为 Orbitrap 质量分析仪增加了电荷检测功能，能够同时测量数百个单个离子的质荷比 (m/z) 和电荷数 (z)。这使得 Orbitrap 质量分析仪可以直接计算分析物的质量，而不需要根据 m/z 去卷积。根据 m/z 去卷积的方法依赖于测量结果中已分辨的电荷状态和/或同位素分辨的信号。直接分析质谱技术模式提高了分辨率，并且扩展了动态范围，提高了可获得的质量测量结果的上限，同时由于单个离子测量的灵敏度较高，可以从浓度明显较低的样品中采集到更有价值的数据。

奥维尔多大学成功使用Thermo Scientific ICP-MS可靠且高效地测定蛋白质中的硫元素英国剑桥 (2011年1月13日) — 全球科学服务领域的领导者赛默飞世尔科技今日宣布，奥维尔多大学光谱分析研究组成功使用Thermo Scientific XSERIES 2 ICP-MS实现蛋白质中硫元素的测定，结果可靠且避免了干扰。一直以来，气态多原子对硫同位素的准确测定带来的干扰是令研究组特别困扰的问题。而XSERIES 2 ICP-MS成功攻克了这些难题，在提供高精度分析结果的同时优化了分析效率。位于西班牙阿斯图里亚斯的奥维尔多大学光谱分析研究组致力于解决科学技术研究中遇到的分析难题。在这个框架下个所成立的一个二级小组专注于研究采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)用于生物高分子（如DNA和蛋白质）定量分析的方法进展。该小组面临的主要问题之一就是在使用低分辨仪器测定硫元素时气态多原子（比如氧气）带来的干扰。为了消除这些问题，该小组选择使用碰撞/反应池(CRC)技术的Thermo Scientific XSERIES 2 ICP-MS。蛋白质的定量分析是目前分析化学领域要求最严格的应用之一。传统的质谱技术如电喷雾质谱 (ESI-MS)和基质辅助激光解吸质谱(MALDI-MS)，一直在蛋白质分析中发挥着关键作用。而ICP-MS用于蛋白质测定的潜力最近才被发掘。尽管ICP-MS的检测结果不提供任何关于结构方面的信息，但它对大多数元素都具有优越的定量能力，为蛋白质的准确测定带来极大价值。为了与最新科技发展保持一致，奥维尔多大学的研究小组将XSERIES 2 ICP-MS与一台反相毛细管液相色谱仪(μLC)进行联用，准确测定了标准蛋白质中的硫同位素。奥维尔多大学光谱分析研究组的Jö rg Bettmer博士说：“选择Thermo Scientific XSERIES 2 ICP-MS，是因为除它以外没有四级杆质谱仪能够在准确性、可靠性和整体性能等方面满足要求。这次的成功应用使我们实现了硫同位素的测定，结果可靠且无干扰。拥有该系统，我们得以准确高效地检测含硫的标准蛋白质，这在以前是不可能实现的。”基于四级杆技术的XSERIES 2 ICP-MS为常规分析和高性能分析应用提供了卓越的效率。操作人员能够更快地实现分析目标，获取置信度更高的实验结果，而所需操作时间更少。仪器创新的离子透镜设计能将简单磁场升级为碰撞池技术(CCT)的性能，不影响正常的（非CCT模式）灵敏度或背景。碰撞池可以匹配多种反应气，例如匹配纯氧气以抑制复杂基体的干扰。欲了解更多关于Thermo Scientific XSERIES 2 ICP-MS信息，请拨打电话：800-810-5118，400-650-5118，邮件：sales.china@thermofisher.com, 或访问网站：www.thermo.com.cn关于赛默飞世尔科技赛默飞世尔科技（纽约证交所代码： TMO）是科学服务领域的世界领导者。我们致力于帮助我们的客户使世界更健康、更清洁、更安全。公司年销售额超过 100 亿美元，拥有员工约35,000人。主要客户类型包括：医药和生物技术公司、医院和临床诊断实验室、大学、科研院所和政府机构，以及环境与工业过程控制行业。借助于Thermo Scientific 和 Fisher Scientific 两个首要品牌，我们将持续技术创新与最便捷的采购方案相结合，为我们的客户、股东和员工创造价值。我们的产品和服务有助于加速科学探索的步伐，帮助客户解决在分析领域所遇到的从复杂的研究项目到常规检测和工业现场应用的各种挑战。 欲了解更多信息，请浏览公司网站：www.thermofisher.com 或中文网站：www.thermo.com.cn，www.fishersci.com.cn。

CEM 公司&mdash &mdash 全球领先的实验室仪器设备供应商，近日宣布AOAC（美国官方分析化学师协会）已经通过了Sprint蛋白质快速测定方法为官方正式方法2011.04，该方法依据蛋白质标签技术适用于猪肉、牛肉和家禽的原料肉和加工肉以及肉制品的蛋白质含量的快速测定。 &ldquo 我们非常高兴AOAC①国际协会能够认可并通过这些方法&rdquo ，CEM公司总裁兼CEO Michael J. Collins说，&ldquo 这确实是一项革命性的技术，非常有价值，可以广泛地应用在食品领域，但一直缺少官方认可。现在，随着这个方法的被公众的普遍接受，未来将会有更多的公司享受到Sprint带来的省时、准确、高效和绿色环保。 在该方法的批准进程中，CEM 公司的Sprint蛋白质快速测定仪被作为该方法研究的指定仪器。方法有效性和准确性的验证过程建立在蛋白质含量在9%-40%之间的牛肉、猪肉及家禽肉和肉制品等具有广泛代表性产品蛋白含量数据之上。 Sprint 采用了iTAG这种专门的、无毒的蛋白质标签溶液，该溶液可以和原料肉、加工肉中蛋白质的赖氨酸、组氨酸和精氨酸及N末端结合并自动计算出蛋白质含量。一体化、操作简便的Sprint机器可以在2分钟内快速测出多种产品的蛋白质含量。该方法比传统的凯氏定氮法更加安全，无需高温以及强腐蚀性化学试剂。2009年，Sprint蛋白质快速测定仪基于它的绿色环保的反应条件，被美国国家环保局（US EPA）授予&ldquo 总统绿色化学挑战者奖&rdquo 。 目前，Sprint 蛋白质快速测定仪广泛应用于乳品、谷物蛋白含量的检测并作为标准方法得到AOAC和AACC认可： AOAC Method 967. 12 液态奶、花色奶、调味乳饮料、咖啡伴侣、黄油等； AOAC Method 930. 33 冰激凌、速冻甜食、雪糕等； AOAC Method 930. 29 全脂奶粉、脱脂奶粉、营养强化奶粉、婴幼儿配方奶粉等； AACC② Method 46-14B 适用于谷物、宠物食品、动物饲料等。 ①AOAC------Association of Analytical Communities（美国官方分析化学师协会）的缩写.是一个拥有127年历史的非营利性科学组织，在分析结果领域赢得了世界的信任，是美国食品生产领域的权威标准机构.经AOAC批准通过的方法，对于方法结果的准确性是一种认可，对采用AOAC方法的厂家生产产品的安全性和合理性提供了一定的信任。②AACC------American Association of Cereal Chemist（美国谷物化学师协会标准是由美国谷物化学师协会）的简称，负责制订的谷物分析与测试方法标准。AACC标准自1922年问世以来，一直是谷物科技领域的重要检验依据。此外用这些方法分析的结果还常常被用作诉讼或司法的依据。 参考 http://www.cem.com/{e_BASE}page74.html更多详情，请联系培安公司：电话：北京：010-65528800 上海：021-51086600 成都：028-85127107 广州：020-89609288Email: sales@pynnco.com网站：www.pynnco.com

仪器信息网讯，2010年5月15日，蛋白质组数据处理暨全国生物质谱学术交流会”在云南省丽江市召开。会议为期两天，主要讨论了蛋白质组学技术和应用、数据挖掘和生物质谱等方面的现状及其进展。在所有的大会报告中，除一些关于蛋白质组学技术最新研究进展的大会特邀报告外，第一天的专家报告集中讨论了糖蛋白组的最新分析技术与研究进展，第二天的报告集中讨论了蛋白质数据处理技术，包括蛋白质组生物数据库及分析平台的构建、数据统计分析方法的研究等方面。 　　近年来蛋白质组学发展迅速，其相应的方法学研究也取得了巨大的进步，一系列新技术融入了的蛋白质组学技术当中，极大的促进了这门学科的发展。在本届大会上，中国科学院北京基因组研究所的刘斯奇研究员、复旦大学的张祥民教授、中国科学院大连化学物理研究所张丽华研究员等专家的报告介绍了许多应用到蛋白质组学之中的新技术、新方法，本文作简要概述：　　报告题目：基于质谱的线粒体GST蛋白质组定性和定量分析　　报告人：中国科学院北京基因组研究所的刘斯奇研究员刘斯奇研究员　　刘斯奇研究员在报告中首次提出了“线粒体GSTs蛋白质组”的概念，系统地研究了属肝线粒体中的GSTs。可采用亲和色谱法及SDS-PAGE富集GST蛋白，使用MALDI Tof/Tof MS 和LC tandem MS/MS鉴别蛋白。研究结果表明，属肝线粒体中存在5种GSTs，分别为GSTA3, GSTM1, GSTP1, GSTK1 以及GSTZ1。　　为了对线粒体GSTs的相对丰度进行定量分析，其采用了质谱结合免疫印迹的综合分析方法：利用质谱对GSTs进行定性分析时，根据质谱谱图的多反应监测(MRM)推断GSTs结构 使用重组的GST蛋白作为标准物，建立了蛋白浓缩物的线性回归方程和胰蛋白酶GST多肽的MS/MS强度，同时，通过校准估算出了鼠肝线粒体中的GSTs含量。通过对特定GSTs抗体的强度识别，使用免疫印迹对GSTs进行了定量分析 获得了GST重组蛋白的5种单克隆抗体，将其用于GST浓度校准和免疫印迹强度分析 通过免疫印迹分析获得的定性分析结果基本与MRM数据获得的结果一致。　　报告题目：蛋白质水平的色谱分离与生物质谱鉴定新方法研究　　报告人：复旦大学张祥民教授张祥民教授　　张祥民教授在报告中表示，蛋白质的分离鉴定有更多困难。一方面，蛋白质分子量大，结构与构型上的变化导致分离效率下降，对色谱填料的孔径、分布与非特异性吸附等因素有更高要求 另一方面，蛋白质鉴定需要先进行酶解以得到质谱鉴定信息。　　在报告中，他给出了较好的解决方法，通过对液相色谱分离系统的优化，在实际蛋白质样品考察优化了系统的分离性能，构建了液相色谱分离蛋白质鉴定方法与平台。研制了蛋白水平富集预柱，并将其应用于蛋白质捕集。在离子交换色谱柱和反向色谱优化选择上，实现了蛋白质分析所需的高分辨分离。色谱分离组分点样至靶板上，利用发展的快速酶解技术完成蛋白质酶解，再通过MALDI-TOFTOFMS或LC-LTQMS进行蛋白质鉴定。该方法使得蛋白质的理论分离能力达到5000个以上，蛋白质组分能够得到浓度信息，质谱鉴定可以同时利用肽指纹图谱PMFs信息和串级序列信息，使得蛋白质鉴定的可靠性大为提高。　　报告题目：基于离子液体的新型膜蛋白质组预处理及分离鉴定技术　　报告人：中国科学院大连化学物理研究所张丽华研究员张丽华研究员　　膜蛋白质存在于细胞内环境、细胞与细胞外环境的界面，对执行细胞内外物质交换、信息转换、细胞识别、代谢调节、免疫应答等功能起着重要作用。深入开展膜蛋白质组学研究对于揭示细胞功能、寻找药物靶点以及研制癌症治疗药物等具有重要意义。然而，由于膜蛋白质具有疏水性强、溶解性差、易沉淀、难酶解、含量低等特点，因此在采用通常用于可溶性蛋白质组分离鉴定的方法对膜蛋白质组进行研究时遇到了很大的挑战。　　张丽华研究员在报告中指出，要提高膜蛋白质组的分析能力，必须发展可显著改善膜蛋白质组溶解性，又不影响后续分离鉴定的新方法。她在近期研究工作中，采用离子液体作为膜蛋白质组的增溶剂，并结合纳升二维液相色谱-质谱联用系统，对鼠脑和人肝内质网提取的膜蛋白质进行了分析。结果表明，离子液体不仅可以提高膜蛋白的溶解性，而且不用影响后续酶解过程中酶的活性。此外，在样品进入质谱鉴定前，易于在除盐步骤去除，不会影响质谱鉴定。与其他膜蛋白质组研究中常用的增溶剂相比，离子液体在膜蛋白质组样品预处理中表现出明显的优势。

糖是组成生命体的四大类重要分子之一，糖蛋白质是由糖链与肽链中的特定氨基酸残基以糖苷键共价连接而成的蛋白质。糖蛋白质普遍存在于生物体内，在很多生命过程中起着重要作用，如蛋白质的折叠、细胞之间的相互识别、炎症反应等。同时，糖基化修饰在疾病中，特别是肿瘤的发生、发展和转移过程中也起到重要作用，许多疾病诊断标志物及治疗的靶标都是糖蛋白质。糖蛋白质组学和糖组学的研究具有重要的科学意义。以基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)和电喷雾质谱(ESI-MS)为代表的生物质谱技术，因具有快速、灵敏、可提供结构信息等优点，已成为糖蛋白质组和糖组分析的重要工具。　　由复旦大学杨芃原教授团队撰写的综述文章“质谱技术在糖蛋白质组学与糖组学方面的研究进展”发表于2016年第3期的《国家科学评论》。这篇综述论文系统介绍了近年来以质谱为核心的糖蛋白质组和糖组的研究策略和方法，以及该领域重要的生物和临床发现。重点讨论了国内糖蛋白质组学和糖组学研究团队在糖蛋白质和糖链的分离富集、糖链的衍生，糖链和糖蛋白质的质谱碎裂技术，糖链及糖蛋白质序列组成分析的软件技术等方面的进展，并分析了基于质谱技术的糖蛋白质组和糖组研究的关键问题，展望了该领域未来的发展趋势。　　杨芃原教授团队在基于质谱的糖蛋白质组学和糖组学方面展开了系统的研究。他们发展了一系列糖蛋白质/糖链富集和质谱定性的新方法，建立了基于复合纳米材料的富集新方法，基于新的共价反应的富集新策略，以及基于协同富集思路的富集新流程 建立了一系列糖蛋白质/糖链的质谱定量新方法，提出了酶促去糖链过程中的标记定量新方法和糖蛋白质组在蛋白质水平、糖基化程度水平及糖链水平的同时定量新方法等 开发了高通量糖蛋白质质谱检索的新算法等。这些工作提升了中国糖蛋白质组学和糖组学的研究水平，为糖蛋白质组学和糖组学研究提供了新的研究方法。

贾伟 沃特世科技（上海）有限公司实验中心对蛋白药的分子量进行测定，可以在完整蛋白水平，对其进行宏观表征，以初步确定蛋白的表达是否正确。BiopharmaLynxTM软件中，专门设计了对蛋白整体分子量测定及表征的多种功能，它具有以下特点。 ■ 通过原始质谱数据，计算出蛋白分子量。■ 自动标注蛋白的各种不同修饰形态。■ 以直观方式，比较样品与标品间差异。■ 自动计算蛋白质的各种修饰形式间的峰强度比例。■ 界面友好、直观，操作简单。 通过原始质谱数据，计算分子质量，是蛋白分子量测定的基本功能。图1中左上为免疫球蛋白IgG的原始质谱数据，右下为软件分析后，得出的IgG分子质量信息。通过BiopharmaLynx软件的自动计算功能，复杂的质谱数据成为了直观的分子量形式。图1中，绿底色图为标准品蛋白的分子质量分布数据，蓝底色图为样品蛋白的分子质量分布图。在BiopharmaLynx给出的结果中，IgG的具有多个分子质量形式，这是由于其含有多种糖基化修饰的原因。图1. BiopharmaLynx软件的完整蛋白质量分析界面。 图中的紫色线条直观地显示出了样品蛋白与标品的质量分布差异差异。观察紫色线条形态可以发现，样品IgG具有更多的大分子量糖基化修饰形式，而标品蛋白中的小分子量糖型修饰较多。当将鼠标指针放置于峰尖时，将自动出现此处蛋白名称、修饰种类、峰强度、色谱保留时间等信息。通过以上两种信息，可以简单、直观地找到两者的差异之处了。 BiopharmaLynx软件可根据用户设置，对蛋白的不同修饰情况，自动标注。除内置的90种修饰外，用户还可根据需要自行创建修饰方式。特别是，考虑到生物蛋白药的一些具体情况，BiopharmaLynx内置了一些蛋白表达药品常见的蛋白改变修饰，如蛋白C端的Lysine缺失等（图2红色箭头指向）。这些细节设计，会帮助使用者极大地提高工作效率，节省精力。图2. 使用BiopharmaLynx软件的修饰设置界面。 BiopharmaLynx软件对蛋白各种修饰间的比例也可以直观地给出初步分析结果（图3）。 作为一家在液相与质谱技术都占有领先优势的企业，沃特世更提供了全面的蛋白分子量分析方案，包括色谱柱、色谱梯度方法、质谱条件等一系列已优化完成的实验操作流程(图4)。使用此整体解决方案，仅仅使用0.5微克的IgG蛋白，在4分钟内，就可完成液质数据采集全过程。此方案也包括对还原后IgG的分析方法(图4右上)。图4. 完整及还原后IgG质量测定解决方案示意图。参考文献(1) Rapid Profiling of Monoclonal Intact Antibodies by LC/ESI-TOF MS. Waters Application Note, 2007, 720002393 EN(2) Rapid Screening of Reduced Monoclonal Antibodies by LC/ESITOF MS. Waters Application Note, 2007, 720002394 EN(3) Characterization of an IgG1 Monoclonal Antibody and Related Sub-Structures by LC/ESI-TOF MS, 2007, 720002107 EN(4) Assessing the Quality and Precision of T herapeutic Antibody LC/MS Data Acquired and Processed using Automated Workflows. Poster presented at the ASMS meeting. 2008, 720002687 EN(5) Efficiently Comparing Batc hes of an Intact Monoclonal Antibody using t he Biop harma Lynx Software Package. Waters Application Note, 2008, 720002820 EN 联系方式： 叶晓晨沃特世科技（上海）有限公司 市场服务部xiao_chen_ye@waters.com 周瑞琳(GraceChow)泰信策略(PMC)020-8356928813602845427grace.chow@pmc.com.cn

大家好，本周为大家分享一篇发表在J Proteome Res.上的文章，Systematic Identification of Proteins Binding with Cisplatin in Blood by Affinity Chromatography and a Four-Dimensional Proteomic Method，该文章的通讯作者是华中科技大学药学院的杜支凤教授。以顺铂为代表的铂类抗癌药物广泛应用于治疗多种癌症肿瘤，如胃肠道癌、头颈部癌和卵巢癌等。在静脉滴注后，这些药物水解形成活性分子，与DNA结合并抑制DNA链的合成与复制，最终致使细胞死亡。然而，由于铂与硫醇的高亲和力，大多数铂在静脉注射后会与血液中的蛋白质结合；例如，人血清白蛋白 (HSA) 是含量最丰富的血清蛋白，也是血液中铂类药物的主要结合蛋白；另外，在红细胞中负责运输氧气的血红蛋白 (HB) 也被发现与铂结合，因此，有必要研究铂类药物在血液中的蛋白结合行为。先前的研究已经证明，利用质谱方法可以实现对高丰度蛋白质的可靠鉴定；然而，由于高丰度蛋白的干扰，占总蛋白的 80% 以上的低丰度蛋白则很少被鉴定。此外，由于缺乏足够信息，以及在胰蛋白酶消化过程中还原和烷基化剂的使用导致蛋白上的铂化位点无法被确定。更重要的是，目前排除假阳性结果的唯一方法是根据铂化肽的特征同位素模式，人工对比理论同位素和实验同位素，从而导致鉴定过程非常耗时并且具有较强的主观性。因此，有必要开发一种可靠、高效的方法来鉴定血液中铂类药物的结合蛋白质组。在血液蛋白质组学研究中，免疫亲和层析常用于消耗高丰度蛋白并富集低丰度蛋白。它有利于低丰度蛋白的鉴定和定量，从而可以提高血液中的蛋白质组覆盖范围。除了色谱分离外，离子淌度质谱 (IM−MS) 根据离子的迁移率差异进行分离，同样有助于低丰度蛋白质的分析。在金属化蛋白的鉴定中，金属化肽和游离肽的同位素分布模式明显具有差异，这有助于确定这些肽是否与金属药物结合。已经开发了一些数据处理软件程序来自动分配金属药物在已知蛋白质上的结合位点，如智能数字注释程序 (SNAP) 算法和 Apm2s 。本文结合高丰度蛋白分离和4D蛋白质组学方法 (IM-MS) ，系统、全面地鉴定了血液中顺铂的结合蛋白，并利用铂化肽的特征同位素模式和相似性算法来消除假阳性的识别。如图1所示，首先用超滤去除游离药物，然后使用多亲和去除柱分离血液样本中的高丰度和低丰度蛋白；用FAIMS Pro界面的nano-LC−MS/MS进行消化和分析；用MaxQuant对铂化的多肽和蛋白进行鉴定，用相似性算法Apm2s排除假阳性结果。在此基础上，采用基于平行反应监测 (PRM) 的方法测定了血浆中多肽与顺铂的结合率。本研究为系统鉴定血液中金属药物的结合蛋白提供了一种新方法，鉴定出的蛋白可能有助于了解铂类抗癌药物的毒性。图1 铂化蛋白的分离和鉴定以及用蛋白质组学方法测定顺铂与多肽之间的结合率的示意图本研究采用顺铂与人血浆的反应混合物建立了一种分析方法。为了与文献进行比较，样品的制备方法与文献中的制备方法相同1。选择CID作为碎裂方式，结果表明，从低丰度部分共鉴定出212个蛋白，从高丰度部分共鉴定出169个蛋白。在低丰度部分，共鉴定出1192个游离肽和208个铂化肽。其中，154个铂化肽被排除为假阳性结果，如文中表S1所示。高丰度部分的游离肽数和铂化肽数分别为1124个和169个，其中，144个铂化肽被排除为假阳性，如表S2所示。低丰度结合蛋白的鉴定在以往的研究中，由于高丰度蛋白的干扰，很少发现低丰度蛋白与铂的结合。本研究在高丰度蛋白被消耗后，从29个蛋白中共鉴定出54个铂化肽。APOA4中铂化肽的理论和实际质谱如图2所示，前体离子和铂化产物离子表现出特征的同位素峰。图片显示了关键的碎片离子的质谱图，用于分配铂化位点。在鉴定出的铂化蛋白中，CERU、FETUA、ITIH1和B4E1Z4有4个或更多的含铂肽，这表明铂可以与这些蛋白质的多条肽段结合。虽然低丰度蛋白只占血液中蛋白的一小部分，但它们具有非常重要的功能，对于维持正常生理活动不可或缺。例如，CERU可以将Fe2+氧化为Fe3+，并在铁代谢中发挥重要作用；B4E1Z4与补体激活相关。顺铂与这些蛋白的结合是否会对其功能产生影响仍有待进一步研究。图2 从低丰度蛋白部分鉴定出的铂化蛋白APOA4。(A)铂化肽的理论（左）和实验质谱（右）；(B)铂化肽的MS/MS和指示铂化位点的关键碎片离子的质谱图高丰度结合蛋白的鉴定IGHG1中一个铂化肽的理论和实验质谱如图3所示，其前体离子和铂化产物离子表现出特征同位素峰。根据关键的碎片离子确定了铂化位点。在已鉴定的蛋白中，ALBU（白蛋白）和CO3（补体C3）有4个或更多的含铂多肽。HSA负责血液中药物和小分子的运输，CO3在补体系统的激活中起着重要作用。高丰度蛋白与顺铂的结合已被用于提高肿瘤化疗的疗效和选择性，而新发现的高丰度结合蛋白有助于相关研究。与低丰度组分鉴定的铂化蛋白相比，大部分与低丰度组分蛋白不同，两个组分中仅共同检测到FETUA和CFAH作为铂化蛋白，这表明亲和层析对高丰度蛋白和低丰度蛋白的分离效果较好。图3 从高丰度蛋白部分鉴定出铂化蛋白IGHG1。(A)铂化肽的理论（左）和实验质谱（右）；(B)铂化肽的MS/MS和指示铂化位点的关键碎片离子的质谱图IM−MS分离铂化肽异构体如图4所示，通过nano-LC−IM−MS/MS成功分离了低丰度蛋白组分中FETUA的铂化肽异构体。同分异构体a和b是典型的铂化肽，由质谱图的同位素模式显示，它们被很好地分离。它们的MS/MS不同，根据关键碎片离子，异构体a和b的铂化位点分别被划分为M和H/T。这个例子显示了IM−MS对复杂样品的分辨能力。图4 用nanoLC−IM−MS/MS分离的低丰度蛋白组分中FETUA的铂化肽异构体。(A)m/z=764.67提取离子色谱和异构体a、b的质谱，理论质谱见中间；(B)异构体的MS/MS和关键碎片离子的质谱图结合蛋白的铂化位点在本文的两项研究中，His 和 Met 是首选的铂结合位点。此外，D、E、S和Y也被发现是铂结合位点。这也是合理的，因为血清蛋白的供氧氨基酸已被证明是顺铂的动力学首选结合位点。很少有Cys残基被鉴定为结合位点，这可能是由于没有还原和烷基化。肽的半胱氨酸常形成二硫键，不经还原和烷基化就无法识别，因此，序列覆盖率会很低。在未来的研究中，应使用替代还原剂来提高肽序列覆盖率。生物信息学分析 为了揭示铂化蛋白质的定位、功能和途径，将从高丰度和低丰度部分中鉴定的蛋白质组合起来并通过生物信息学工具进行分析。如图5A所示，GO分析表明大部分结合蛋白位于细胞外区域，发挥蛋白结合、金属离子结合、酶抑制剂等功能；因此，镀铂蛋白的定位证实了鉴定的可靠性。此外，这些蛋白质参与内肽酶活性、免疫系统过程、补体激活、炎症反应和凝血的负调节。为了阐明所涉及的途径，对鉴定的蛋白质进行了KEGG途径富集分析，结果表明最显着的富集途径是补体和凝血级联途径（图5B）。补体和凝血级联途径已被证明在造血干/祖细胞的动员中发挥关键作用，这对造血具有重要意义。顺铂的血液学毒性与其在补体和凝血级联途径中与血液蛋白的结合之间的相关性值得进一步研究。图5 (A)通过GO 分析确定的铂化蛋白的定位、分子功能和生物学过程；(B)铂化蛋白的富集途径血液蛋白与顺铂的结合率 由于未检测到一些铂化肽的游离形式，因此仅使用高丰度组分中的13种肽进行亲和力研究。可靠地计算了属于五种蛋白质的六种铂化肽的结合率。PRM分析中这些肽的信息见表S5，定量结果见图6。其中，富含组氨酸的糖蛋白的一种肽与顺铂的结合率最高，这可能是由于顺铂对含组氨酸和带负电荷的生物分子的高亲和力。Apoa1 蛋白的一个肽与顺铂的结合率最低。在本研究中可以确定结合率的铂化肽数量较少，这主要是由于某些肽的质谱响应低以及某些肽存在氧化形式。因此，这些肽的结合比率不能通过 PRM 方法确定。然而，与以往的研究相比，根据属于同一蛋白质的肽的质谱计数粗略估计某种蛋白质的丰度，这种方法可以更准确地确定高丰度肽与铂的结合率。图6 根据PRM分析多肽与顺铂的结合亲和力顺铂与血液蛋白的结合与其药代动力学、活性、毒性和副作用密切相关。然而，血液蛋白质组的复杂性限制了低丰度结合蛋白的鉴定。在本研究中，基于亲和色谱和nanoLC-IM-MS/MS 的 4D 蛋白质组学方法被用于分离低丰度和高丰度蛋白质并分析这两个部分。基于铂化肽的特征同位素分布和相似性算法，排除了假阳性鉴定。结果，共有 39 种蛋白质被鉴定为铂化蛋白质，这比之前研究中的数量要高得多。随后的生物信息学分析表明，这些结合蛋白位于细胞外区域，主要参与内肽酶活性、免疫系统过程、补体激活、炎症反应和凝血的负调控。最显着的富集途径是补体和凝血级联，这可能与顺铂的血液学毒性有关。高丰度部分的 PRM 分析表明，富含组氨酸的糖蛋白中的肽与高丰度组分中的顺铂的结合率最高。综上所述，本研究揭示了人类血液中与顺铂结合的蛋白质组，并计算了顺铂与血液蛋白的结合率。这种方法虽然在数据分析方面比较耗时，但它可以识别复杂系统中金属药物的低丰度结合蛋白，并且可以准确测量药物与血液蛋白的结合率。

大家好，本周为大家分享一篇2024年发表在Analytical Chemistry上的文章，Panda-UV Unlocks Deeper Protein Characterization with Internal Fragments in Ultraviolet Photodissociation Mass Spectrometry1。该文章的通讯作者是来自北京蛋白质组学研究中心的常乘研究员以及中国科学院大连化学物理研究所的王方军教授。　　在过去的十年里，UVPD (193nm)因其出色的碎裂效率而备受关注。它能够产生a/x, b/y, c/z等多种类型离子，并能够对小于30 kDa的蛋白质提供近乎完整的序列裂解。它是完整蛋白表征的有利工具，能够提供序列、PTM、次级结构等丰富信息。常规的UVPD分析主要依赖于识别N-端或C-端碎片(a/x, b/y, c/z)，尽管已经满足大部分的小分子蛋白质(20 kDa)的需求，而对于大分子蛋白质的表征仍然有限。通过解析内部碎片(ax, ay, az, bx, by, bz, cx, cy, cz)而进一步获得更深度的序列信息是常用的策略。但由于内部片段数量庞大和匹配的低置信度，导致内部片段在很大程度上仍未得到充分利用。为了解决这一问题，作者开发Panda-UV这一新型软件工具，通过结合质谱校准技术和皮尔逊相关系数(PCC)评分系统，实现了UVPD内部碎片的有效识别和高精准匹配。Panda-UV有非常友好的界面，即便不具备编程技能也能使用(图1)。使用者需要提供蛋白序列、去卷积后的质谱数据、固定修饰信息、甚至非共价结合配体还能作为unlocalized modification添加进去用于holo-fragmemts的搜索。PCC评分系统将对碎片离子实验测定的同位素分布与理论计算的同位素分布进行比较，由此过滤掉低置信度的匹配。此外，软件中还增加了Mass Calibration用于校正实验测定的m/z或去卷积后的mass，以便获得更准确的内部碎片匹配和打分。　　图1. Panda-UV使用界面　　具体工作流程如图2所示，当设定好所有参数提交后，程序会先进行碎片匹配。首先以20 ppm进行N-端或C-端的碎片匹配，计算所有匹配上离子的平均质量误差(ppm)，此误差将带入以下公式mass_calibrated = mass/(1 + error × 10-6)，用于去卷积后的质量校正。该步骤可以尽可能扣除由仪器测定引入的误差，以便后续更准确的打分和匹配。完成校准后，再使用用户自定义ppm对校准后的去卷积质量进行第二轮碎片匹配。完成碎片匹配后，进入碎片PCC打分阶段。通过根据碎片离子的带电荷量以及化学式生成理论的同位素分布，将其与实验测定的同位素分布进行比较，主要比较同位素峰之间强度的变化趋势。完成PCC打分之后，需要删除不明确的匹配。由于理论搜索空间大，一个实验碎片可以在定义的质量误差范围内(ppm)匹配多个理论碎片，综合考虑质量误差和PCC评分，以去除歧义匹配。完成碎片匹配后，Panda-UV会根据蛋白序列和碎片匹配结果绘制蛋白整体的碎裂图以及各个残基位点的末端/内部碎片强度汇总图。　　图2. Panda-UV工作流程　　通过在三种模型蛋白质上进行全面基准测试，展示了Panda-UV强大性能(图3)。内部片段的加入使得识别的片段数量提高了26%，并将平均蛋白质序列覆盖率提高到了93%，解锁了模型蛋白质中最大蛋白碳酸酐酶II的隐藏区域。此外，平均65%的内部片段可以在多次重复实验中被识别，展示了Panda-UV识别片段的高置信度。与现有的内部片段匹配软件ClipsMS进行对比，Panda-UV通过对代码框架的优化，搜索模型蛋白的一个质谱数据不超过9分钟，比ClipsMS快50倍。最后，在分析单克隆抗体时，Panda-UV将识别的片段数量翻倍，mAb亚基的序列覆盖率可以提高到86%，并且CDR几乎完全测序，显著提高了mAb的识别准确性(图4)。　　图3. A) B)Panda-UV与C) D)Clips MS解析CA、Mb、Ub三种蛋白的UVPD数据对比　　图4. Panda-UV在mAb UVPD数据分析中的应用　　总的来说，Panda-UV赋予研究人员解锁UVPD数据中内部片段的能力。尽管Panda-UV是专门为UVPD设计开发的，但是用一般解离方法(例如：HCD、ETD)得到的质谱图也是兼容的。Panda-UV揭露了完整蛋白质表征的隐藏深度，为蛋白质组学top-down深度分析提供了帮助。　　撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳文章引用：Panda-UV Unlocks Deeper Protein Characterization with Internal Fragments in Ultraviolet Photodissociation Mass Spectrometry　　参考文献　　1. Zhu Y, Liu Z, Liu J, et al. Panda-UV Unlocks Deeper Protein Characterization with Internal Fragments in Ultraviolet Photodissociation Mass Spectrometry. Anal Chem. 2024 96(21): 8474-8483.