质谱鉴定蛋白结果分析

在翻译后修饰和/或极碱肽的序列分析方面，电子转移裂解（ ETD ）线性离子阱质谱是很有优势的工具。传统的诱导活化裂解（CAD）常用来鉴定蛋白，并试图确定和找到他们修饰的位点，但这种技术有其本身固有的缺点，下面将详细叙述。与线性离子阱的结合使用的ETD是蛋白质组学研究的一个可靠的技术，可以很容易鉴定用CAD不能鉴定的多肽。ETD 是一个相对较新的肽/蛋白质碎裂的技术，能够大大推进质谱鉴定蛋白质这个领域的进步。 翻译后修饰 翻译后修饰（PTM）是翻译后的蛋白质进行的一种化学修饰，是蛋白质生物合成的后续步骤之一。蛋白的分析及其翻译后修饰的分析对于研究许多疾病是非常重要的，如癌症、糖尿病、心血管疾病和神经退行性疾病---阿尔茨海默病。这是因为在蛋白质的合成的过程中以及合成之后，可能发生各种蛋白修饰。对于正常细胞的功能，这些修饰是必须的，但调节这些修饰的变化可能会导致疾病的发生，如阿尔茨海默病，癌症和勃起功能障碍。蛋白质修饰可提高/降低蛋白质的活性，可以与其他蛋白质发生相互作用和将某一蛋白质定位到细胞的特定地方。 翻译后修饰，如磷酸化，乙酰化和甲基化被用作化学开关，激活/灭活组蛋白基因转录调控， DNA复制和DNA损伤修复。组蛋白是染色质的主要蛋白，DNA盘绕时，它们起到线轴的作用，而且在基因调控中发挥重要作用。因此，鉴定这种翻译后修饰是必需的，因为它在生物系统中对于某些蛋白的功能和作用至关重要。 用CAD鉴定蛋白 质谱在确定蛋白及其翻译后修饰上发挥了不可或缺的作用。CAD是一种常见的分析鉴定蛋白质的技术。一般用胰蛋白酶将蛋白质消化成较小的多肽，然后用反相色谱将其分离，并直接注入电喷雾质谱仪检测，通过串联质谱（ MS / MS法）获得序列信息。通过电喷雾电离这些多肽形成几种带电状态的肽离子，而较低带电状态的最适合CAD分析。低能量的CAD串联质谱一直是最常用的分析方法，通过裂解肽离子进行后续的序列分析。 翻译后修饰分析，如磷酸化，磺酸化和糖基化很难用CAD进行分析，因为这些修饰通常是不稳定且容易丢失肽骨架的碎裂信息，从而导致很少或几乎不能得到肽序列和磷酸化位点。利用常规的CAD质谱对于含多个碱性残基多肽测序也是极为困难。 根据不同的蛋白质序列，有时胰蛋白酶会产生过小或过大的肽段。在这种情况下，缺乏可信的序列分析手段。因此CAD对短的，低带电的多肽是最有效的。对于鉴定蛋白和了解蛋白的生物学功能，这是一种广泛使用的方法，然而，限制了研究者分析了所有的肽段，这也阻止多个翻译后修饰位点的检测和了解这些蛋白的生物学功能。 先进的碎裂方式：ETD ETD是基于离子/离子气相化学一种碎裂多肽的新方法。ETD通过从阴离子自由基到质子肽转移电子的化学能量将肽碎裂，这引起多肽骨干的分裂。 ETD产生的骨干肽序列和肽侧链的信息往往与CAD互补。 ETD已成功应用与线性离子阱以及其前身三维离子阱。虽然ETD在三维阱的执行价格具有竞争力且和CAD自身相比提供了独特好处 ，这样的组合并没有提供蛋白质组学分析所需的技术能力。非线性离子阱的ETD，它一直未能很好控制裂解过程，而且由于三维阱离子存储能力的有限不能处理大量的多肽。基于此，研究人员已经提出ETD功能应用于线性离子阱（Thermo Scientific LTQ XL mass spectrometer质谱仪） 。 相对于传统的CAD技术， ETD提供了更稳定的方法来定性PTMs，鉴定大型多肽或甚至整个蛋白质。 ETD能够将普通翻译后修饰的多肽，或者多个碱性残基的多肽甚至整个蛋白质生成离子。 ETD也可以轻易碎裂含有二硫键的的多肽。 ETD是为更复杂的FT-ICR仪器开发相似的裂解技术。使用电子转移试剂，而不是影响肽碎裂的自由电子使ETD在广泛使用的射频四极离子阱中得到应用。射频离子阱质谱仪具有低成本，低维护费用以及更易接受优点，相对于CAD碎裂方法，ETD碎裂技术能够产生更多的产物离子，利于肽段的解读。 ETD的线性离子阱提供了强有力的工具鉴定蛋白及其翻译后修饰 。LTQ XL线性离子阱质谱仪比其他任何离子阱提供更多的结构信息，ETD能够得到常规方法无法得到的序列信息。相比非线性离子阱，ETD的线性离子阱的显著特征在于离子和离子发生反应。虽然ETD功能是完全自动的且通常无需用户干预，但是当需要对离子数进行累积的时候，用户可通过软件完全控制线性离子阱的离子。线性离子阱质谱仪有能力处理大量的样品，并分析低浓度的大分子和小分子。与非线性离子阱的相比，该过程更为复杂和费时 应用实例 在最近的应用中，极碱的多肽和大量重要的翻译后修饰已经用含CAD和ETD线性离子阱质谱分析了。通常CAD碎裂方式产生的普通只显示有限的肽碎裂信息。然而，用ETD碎裂这些多肽的时候， 肽骨架碎裂信息能完全或几乎完全产生，因此得到更广泛的多肽序列的信息。 ETD的灵敏度和稳定性对于蛋白质组学分析是必不可少的。 ETD提供了高度可靠的解决方案，此方案具有用户友好性，几乎不需要日常维护，并提供高度准确的数据，而且ETD的数据分析有相应的软件支持，非常方便简单。 结论： 在蛋白质组学研究领域，ETD的应用对于研究疾病的机理，如癌症，药物开发研究以及细胞功能和信号转导有重大意义，ETD将扩大目前的分析，包括更多的碱性、非胰酶切肽段和蛋白质。它们能确定各种翻译后修饰以及鉴定新的蛋白亚型。 配备ETD的线性离子阱质谱可应用于蛋白质组学各个领域内。ETD的线性离子阱将继续推动蛋白质组学的发展，而且已被证明是替代CAD一种有效技术，而且ETD同样可以应用于非线性离子阱进行肽序列分析。在不久的将来，配备ETD的线性离子阱预计将成为碎裂技术的一种新选择。 参考文献 Leann M. Mikesh et al, The utility of ETD mass spectrometry in proteomic analysis, Biochemica et Biophysica Acta (2006), doi:10.1016/j.bbapap.2006.10.003 关于 Thermo Fisher Scientific （赛默飞世尔科技，原热电公司） Thermo Fisher Scientific纽约证交所代码：TMO）是全球科学服务领域的领导者，致力于帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。公司年销售额超过100亿美元，拥有员工约30000人，在全球范围内服务超过350000家客户。主要客户类型包括：医药和生物公司，医院和临床诊断实验室，大学、科研院所和政府机构，以及环境与工业过程控制装备制造商等。公司借助于ThermoScientific和FisherScientific这两个主要的品牌，帮助客户解决在分析化学领域从常规的测试到复杂的研发项目中所遇到的各种挑战。ThermoScientific能够为客户提供一整套包括高端分析仪器、实验室装备、软件、服务、耗材和试剂在内的实验室综合解决方案。FisherScientific为卫生保健，科学研究，以及安全和教育领域的客户提供一系列的实验室装备、化学药品以及其他用品和服务。赛默飞世尔科技将努力为客户提供最为便捷的采购方案，为科研的飞速发展不断地改进工艺技术，提升客户价值，帮助股东提高收益，

近日，北京大学深圳医院检验科纪玲博士团队使用融智生物的QuanTOF质谱平台再次发现新型变异血红蛋白（hemoglobin variant），即Hb-柳州，这是该团队继Hb-辽宁后发现的又一种新型变异血红蛋白。相关研究结果已经发表在Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation上，在此，小融将此篇文献进行解读分享给大家，供参考。血红蛋白（Hb）是由两对α和β珠蛋白链组成的多肽四聚体。血红蛋白变异是最常见的遗传性单基因疾病之一，以血红蛋白结构缺陷为特征。迄今为止，已有超过1350种主要由α-或β-珠蛋白基因突变引起的变异血红蛋白被记录在案，每种变体都具有特定的生物学特性。虽然大多数Hb变异杂合子是无症状的，但一些复合杂合子或纯合子会产生显著的临床症状。因此，对Hb进行产前基因鉴定和咨询具有重要意义。目前，检测血红蛋白组分及其糖化形式的最常用方法是基于阳离子交换高效液相色谱（HPLC）或毛细管电泳（CE）技术。此外，质谱（MS）已被用于分析血红蛋白变异。本文报道了用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）测定HbA1c时发现的一种新的变异血红蛋白，而基于 HPLC和CE技术的HbA1c检测程序未能确定其存在。一位来自广西柳州的23岁妇女来我院做例行检查。她的血糖结果为3.99 mmol/L（参考区间：3.90–6.10 mmol/L）。HbA1c分析最初由Variant II Turbo 2.0进行，与正常对照组相比，在展开色谱图右侧观察到异常凸起。因此，我们进一步检测了残留样本，发现了一个新的Hb变异体，用病人的出生地把它命名为Hb-柳州。使用HPLC系统、硼酸盐亲和层析系统、CE系统（HbA1c程序）和MALDI-TOF MS系统（QuanTOF，融智生物）重新分析HbA1c，用CE系统的Hb程序进行Hb分析。图. 糖化血红蛋白和血红蛋白分析。通过Variant II Turbo 2.0（A），HPLC系统（B），和CE系统（HbA1c程序）（C）检测糖化血红蛋白。血红蛋白分析是通过CE系统的Hb程序（D）。如上图所示，HbA1c结果分别为4.8%（29 mmol/mol，Variant II Turbo 2.0）、4.7%（28 mmol/mol，硼酸盐亲和层析系统）、4.2%（22 mmol/mol，HPLC系统）和4.6%（27 mmol/mol，CE系统）。上述HbA1c技术均未检测到异常峰值。血红蛋白分析也显示97.7%HbA和2.3%HbA2没有异常。图. MALDI-TOF MS（QuanTOF）血红蛋白分析。（A）非变异样品的质谱图显示α-链（15127 Da）、β-链（15868 Da）以及相应的糖基化α-链（15289 Da）和糖基化β-链（16030 Da）。（B） Hb-柳州的质谱图显示一个变异的α-链峰（15155Da）。QuanTOF检测的HbA1c值为4.8%（29 mmol/mol）。同时，在质谱图中发现了质量为15155da的变异链，变异链占总α链的26.4%。基因分析证实了QuanTOF的检测结果。通过Sanger测序发现在HBA1基因上存在一个新的杂合突变[HBA1:C.182A→G]，该突变导致密码子60处的编码从赖氨酸（分子量：146 Da）改变为精氨酸（分子量：174Da）。该结果与QuanTOF的检测结果一致。图.Hb-柳州Sanger序列测定结果。箭头表示杂合突变[HBA1:C.182A→G] 在HBA1基因中。该研究发现了一个新的变异株Hb-柳州，用MALDI-TOF MS代替传统的阳离子交换HPLC和CE的HbA1c检测方法，可以很容易地鉴别出是否存在Hb-柳州。研究结果表明，阳离子交换HPLC和CE法在检测新的血红蛋白变异方面面临挑战。然而，MALDI-TOF MS通过正常和变异链之间足够的质量差可以检测到变异链，可以作为鉴别和定量变异血红蛋白（hemoglobin variant）的选择方法。参考文献：Anping Xu, Weidong Chen, Weijie Xie & Ling Ji (2020): Identification of a new hemoglobin variant Hb Liuzhou [HBA1:C.182A→G] by MALDI-TOF mass spectrometry during HbA1c measurement, Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation, DOI:10.1080/00365513.2020.1783698

p 　　感染性疾病的爆发与流行是我国乃至全球的公共卫生威胁，感染性疾病占全部死因的25%以上，而微生物快速准确鉴定是感染性疾病治疗的关键因素。国家卫计委关于全国食物中毒事件情况的通报中，微生物性中毒事件及中毒人数均居首位。2010年美国沙门氏菌感染、2015年肉毒杆菌污染奶粉等生物安全公共事件，都突显出致病菌的严重危害。 /p p 　　目前微生物国标的生化培养鉴定方法，鉴定时间超过72小时，鉴定范围在600种以内。该项目在国家重大科学仪器设备开发专项和传染病重大专项的支持下，由军事科学院牵头，中科院微生物所、国家疾控中心、301医院、302医院、毅新质谱等十几家国内知名医疗单位及机构联合，攻克离子聚焦与双场加速、脉冲延迟与例子推斥等质谱技术难题 研发了微生物全细胞蛋白组提取试剂 历时5年，经过3万株菌的蛋白组生物信息分析，开创了非线性相似性度量的人工智能算法，共同建立了超过370属、2200种、7900株的微生物蛋白指纹图数据库及全球首个微生物质谱云中心，实现了2200种微生物在培养后5分钟内快速鉴定的飞行时间质谱系统。时至今日，该数据库已经拓展至8100株，临床验证数量超过15万株。项目。该成果已在40余家医院及科研单位开展应用，获得了包含北京协和医院、解放军302医院、浙江大学附属第二医院、深圳北大医院、北大口腔医院等机构在内的一致好评，以下为部分医院发表的相关文章及用户体验。 /p p 　　该项目成果获发明专利4项、实用新型4项、软件著作权6项，发表论文20余篇。此次获奖，源于以下5大技术创新点。 /p p img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201802/noimg/ba6a6a60-1e36-40a0-b1d7-e9e0320bc21e.jpg" title=" 001.jpg" width=" 650" height=" 406" border=" 0" hspace=" 0" vspace=" 0" style=" width: 650px height: 406px " / /p p img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201802/noimg/0330b28c-ee31-406e-bdfb-b5696a52f9e1.jpg" style=" width: 650px height: 409px " title=" 002.jpg" width=" 650" height=" 409" border=" 0" hspace=" 0" vspace=" 0" / /p p img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201802/noimg/24544e0d-ef9b-465e-9ac6-d2001ca5981b.jpg" style=" width: 650px height: 406px " title=" 003.jpg" width=" 650" height=" 406" border=" 0" hspace=" 0" vspace=" 0" / /p p img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201802/noimg/e9e88416-68d0-450f-b1ee-2ce1b24916e0.jpg" style=" width: 650px height: 406px " title=" 004.jpg" width=" 650" height=" 406" border=" 0" hspace=" 0" vspace=" 0" / /p p img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201802/noimg/d2ab5146-3d85-47f7-91dc-33c45d5e98bc.jpg" style=" width: 650px height: 406px " title=" 005.jpg" width=" 650" height=" 406" border=" 0" hspace=" 0" vspace=" 0" / /p p img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201802/noimg/5fc87af2-2f89-4da1-9ec1-a352ada32350.jpg" style=" width: 650px height: 406px " title=" 006.jpg" width=" 650" height=" 406" border=" 0" hspace=" 0" vspace=" 0" / /p p 　　 strong 数据来源：北京科学技术奖答辩文件 /strong /p p 　　2月5日，北京市科学技术奖励大会隆重召开，北京市政府颁发了2017年度北京市科学技术奖。本次获奖领域涵盖纳米材料、生命科学、电子通讯、信息科学等领域，兼有原始创新、应用创新等环节。其中，由军事科学院牵头，由中科院微生物所、国家疾控中心、301医院、302医院、毅新质谱等十几家国内知名医疗单位及机构共同完成的 “2200种微生物蛋白谱数据库及飞行时间质谱鉴定系统研发及产业化”项目，喜获该奖项。 /p p img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201802/noimg/bfb99ddb-b294-4d67-b8c9-5ca1686ab4c7.jpg" title=" 001.jpg" width=" 650" height=" 433" border=" 0" hspace=" 0" vspace=" 0" style=" width: 650px height: 433px " / /p p style=" text-align: center " strong “2200种微生物蛋白谱数据库及飞行时间质谱鉴定系统研发及产业化”荣获北京科学技术奖 /strong /p p 　　北京市科学技术奖的设立，旨在奖励在本市科学技术进步活动中做出突出贡献的个人和组织，调动科学技术人员的积极性和创造性，加速本市科学技术进步，促进首都的经济建设和社会发展。 本项目的完成， 是对该项目参与单位多年来所做贡献的认可与肯定。 /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201802/noimg/2343ebb0-dad2-4ad0-ab27-eee3b166f74a.jpg" title=" 00.jpg" width=" 580" height=" 436" border=" 0" hspace=" 0" vspace=" 0" style=" width: 580px height: 436px " / /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201802/noimg/f86e6cd4-3705-4b2e-b685-07ee0947c396.jpg" title=" 002.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong 中共中央政治局委员、北京市委书记蔡奇，市委副书记、市长陈吉宁，国家科技部副部长李萌等领导为获奖者颁奖 /strong /p p br/ /p

p 　　何为非变性质谱?就是选用温和的溶液体系及质谱条件，使蛋白保持在非变性状态下被分析。听到这，有些小伙伴可能会一头雾水：师兄师姐教我处理蛋白质样品的时候，第一步就是要变性啊，怎么现在又不要变性了? /p p 　　在通常的蛋白质相关分析中，为了破坏蛋白质的三维立体空间结构，便于酶解等操作，会通过加热或是加入高浓度的变性试剂(如尿素、盐酸胍等)，使蛋白质变性 另外，对于常用的分离手段——反相色谱来讲，其流动相的酸性pH条件与高有机相同样也会使蛋白质变性。当需要对蛋白质中的非共价结合进行研究时，为了避免非共价结合被强烈的变性条件所破坏，则需在非变性的液相-色谱条件下(通常为50mM醋酸铵，pH=7的中性体系)进行研究 另外，对于组成较为复杂的蛋白样品，在非变性条件下分析时，由于体系中质子数减少，所以蛋白电荷态数目也会相应减少，电荷态之间的相互重叠度也会下降，进而减少复杂组分之间的相互影响，从而能够得到复杂蛋白样品中每个组分的分子量信息(图1)。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 图1_副本.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/56171fe8-be7c-4cc8-a672-814a9fe87e30.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　 strong 图1 /strong 同一样品分别于变性及非变性条件下进行分子量测定的原始谱图 /p p 　　目前， strong 非变性质谱技术主要应用在两个方面 /strong ：一是 strong 生物制药领域 /strong ，通过打开单克隆抗体链间二硫键后在Cys位点上偶联小分子药物(Cys-ADC)的完整分子量分析，此类药物的链间仅靠非共价力结合，故变性条件下各条链会分离，无法测得其完整状态的分子量 另一应用方向为 strong 研究蛋白质多聚体 /strong ，非变性条件下不仅可以保持各个亚基间的非共价相互作用，同时由于中性条件更接近生理状态，得到的结果更具意义。 /p p 　　现在，非变性质谱与氢氘交换、X-ray衍射、核磁共振、冷冻电镜和cross-linking等技术联合使用、互为补充，已经越来越多的被应用在结构生物学、生物医药等领域的研究中。本期文章将会重点介绍非变性质谱在治疗性生物医药制品完整分子量测定中的研究，下期文章将会侧重介绍非变性质谱用于蛋白复合物的研究进展。 /p p span style=" COLOR: #002060" strong Orbitrap超高分辨质谱：非变性质谱研究的理想平台 /strong /span /p p 　　古人云：工欲善其事，必先利其器。要想研究做得好，趁手工具不可少!针对于非变性质谱研究中的需求，我们在Orbitrap质谱平台上对相关参数进行了优化，包括离子源区脱溶剂能量、质量范围的扩展以及高质荷比离子传输效率的优化等，使Orbitrap在固有的高分辨率、高质量精度及高灵敏度基础上，在非变性质谱领域也能有出色表现。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 图2_副本.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/caeec8f3-896f-4e02-a44a-84aae9ecd287.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　 strong 图2 /strong Orbitrap质谱平台用于非变性质谱分析 /p p 　　上文中提到，在生物制药领域中，会通过分子工程设计，在单克隆抗体的特定氨基酸上通过化学反应，偶联上小分子治疗药物，通过单克隆抗体的靶向识别功能将小分子药物精确带至病变细胞处并释放，达到精确给药、减少毒副作用的目的，这类药物被称作抗体药物偶联物(Antibody Drug Conjugates，ADCs)。在这类药物中，通过将单抗链间二硫键打开从而在Cys位点上偶联药物的Cys-ADC，由于其链间仅靠非共价力结合，故需在非变性质谱条件下才能对其完整分子量进行测定(图3)。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 图3_副本.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/270ff8dd-d5c1-442b-baf1-f287fcb557b9.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　 strong 　图3 /strong Cys-ADC结构示意图 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　图4展示了使用非变性质谱平台对Cys-ADC进行完整分子量测量的结果。由图中不难发现，使用体积排阻色谱(SEC)，可以将单克隆抗体与其他杂质分离开，而Orbitrap质谱平台能够得到基线分离、信噪比高的原始谱图。经数据处理软件解卷积处理后，可见偶联了0/2/4/6/8个小分子药物的簇峰分布，符合Cys-ADC的典型分布特征 解卷积后计算所得该ADC的药物/抗体比值(Drug to Antibody Ratio, DAR)，与之前报道过的DAR值相符。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 图4_副本.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/b494de8a-6ac5-42cf-ad12-d84637e32bef.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　 strong 图4 /strong 使用非变性质谱平台对Cys-ADC进行完整分子量测量。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　(上)，原始色谱/质谱图 (下)，解卷积后谱图。 /p p 　　作为对照，在变性条件下也对同一个样品进行了分子量测定(图5)，发现链间的非共价结合在强烈的变性条件下均被破坏，只能观察到部分ADC的分子量信息。该实验进一步说明了在非变性条件下对Cys-ADC进行分子量测定的必要性。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 图5_副本.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/46b85220-b769-47dc-b534-f92c93b56cff.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　 strong 图5 /strong 变性质谱条件下对Cys-ADC进行分子量测量。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　(上)，原始色谱/质谱图 (下)，解卷积后谱图。 /p p 　　对于常见的另外一种ADC——Lys-linked ADC，虽然其小分子药物与单克隆抗体是通过共价键相结合，但偶联上小分子药物后，ADC的复杂度大大增加，此时若在非变性条件下进行分子量测定，可以减少信号之间的干扰，得到更加准确的测量结果(图6)。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 图6_20170406090915_副本.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/7c9e60f0-f01a-45eb-85eb-f9dceece9c46.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　▲非变性条件可减少复杂组分间信号重叠 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 非变性2_20170406090518_副本.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/e634be51-bf68-49f2-b7be-e205227a7242.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　▲非变性条件下Lys-ADC完整分子量测量结果 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　 strong 图6 /strong 使用非变性质谱平台对Lys-ADC进行完整分子量测量。 /p p 　　 strong 小结 /strong /p p 　　本期我们对非变性质谱技术的原理、适用范围进行了介绍，并以Cys-ADC与Lys-ADC样品的完整分子量测量为例展示了该方法的应用，不知道小伙伴们有没有对非变性质谱技术有个初步的了解呢?下期我们将会介绍该技术在蛋白复合物研究中的应用，各位看官走过路过不要错过，我们下期见! /p p 　　参考文献 /p p 　　[1] Dabaene et al., Anal Chem. 2014, Nov 4 86 (21):10674-83. /p p & nbsp /p

近日，北京大学王初课题组与芝加哥大学Ben May癌症研究所赵英明课题组合作，在Science Advances杂志上发表题为“Identification of 113 new histone marks by CHiMA, a tailored database search strategy”的研究文章。在这项工作中，作者详细探索了传统数据分析方法应用于组蛋白修饰组鉴定修饰肽段存在的问题，并进行了针对性优化发展了一种名为“Comprehensive Histone Mark Analysis (CHiMA)”的数据分析方法。应用CHiMA对此前的组蛋白修饰组数据进行重分析发现了113个新的组蛋白修饰位点(histone mark)。　　组蛋白翻译后修饰是细胞对DNA转录调控的重要手段之一。蛋白质组作为一种高通量全局性分析蛋白质翻译后修饰的技术，在组蛋白修饰的发现和功能研究中发挥了重要作用。如赵英明课题组在2019年利用蛋白质组手段首次鉴定到了组蛋白上来源于L型乳酸(L-lactate)的赖氨酸乳酰化修饰，并揭示了其在调控基因表达中的重要作用。组蛋白修饰组相对于全蛋白质组数据有着显著的区别，譬如：1)组蛋白修饰组中包含的肽段数目远少于全蛋白质组中的肽段数目 2) 组蛋白由于富含赖氨酸和精氨酸，经过胰蛋白酶切后，氨基酸数目小于或等于6个的短肽占比远超全蛋白质组中比例。尽管如此，目前还没有研究探索传统蛋白质组数据分析策略是否适用于组蛋白修饰组中修饰位点的鉴定，以及针对组蛋白修饰组优化开发的搜库方法。为了验证传统蛋白质组数据分析策略应用于组蛋白修饰位点鉴定是否会产生漏报的情况，作者首先准备了四组组蛋白乳酰化修饰组数据。这些数据使用同样色谱条件和质谱条件采集，因此同一条修饰肽段在四组数据中应在相似时间被色谱洗脱并送入质谱鉴定，从而可以利用在其他三组数据中的鉴定肽段来检查漏报。作者使用ProLuCID+DTASelect2.0作为搜库软件并使用传统分析策略进行搜库，发现在这四组数据中均存在着不同比例(12.5%-36.4%)的修饰位点漏报。为了验证这一结果不是由特定搜库引擎的算法所导致，作者使用另一种常用的搜库引擎Andromeda(内置于MaxQuant)进行了同样的测试并得到了相似的结果。　　搜库分析首先将实验产生的二级谱图与蛋白质数据库中模拟酶切产生肽段的理论谱图进行比对，以得到每个二级谱图潜在的匹配肽段。随后需要对所有的肽段-谱图匹配(peptide-spectrum matches, PSMs)进行过滤以筛选出高置信度的鉴定结果。传统的搜库方法通常使用target-decoy策略来进行PSM筛选[3]。这一策略首先在蛋白质数据库中产生与正确蛋白质序列(target)同样数目的诱饵序列(decoy，通常为正确序列的反向序列)。诱饵序列不存在于细胞中，所以匹配于诱饵序列的鉴定结果均为假阳性。同时由于数据库中正确序列与诱饵序列数目相同，可以通过decoy PSMs的数目估算出同等打分筛选条件下的target PSMs数目，从而估算出假阳性率(false discovery rate, FDR)。由于组蛋白修饰组通常只含有数十条或最多上百条修饰肽段，作者猜测使用 target-decoy-based FDR进行PSM过滤会导致打分线完全取决于打分最高的1-2个decoy PSM，从而丧失统计效力。为了验证这一猜测，作者对数据A搜库过程每一步的结果进行了仔细检查，发现所有漏报的修饰肽段均被搜库软件正确匹配到了相应的二级谱上，而漏报确实产生于后续的PSM过滤过程。作者随后绘制了测试数据中target PSM和decoy PSM的打分分布曲线，发现两者也几乎完全重合，只有65个target PSMs的打分高于打分最高的decoy PSM，因此在该数据中打分线仅由这一个decoy PSM决定，导致其他正确修饰肽段被漏报。作者随后对搜库策略进行优化以解决这一问题。谱图匹配的质量是最重要的衡量肽段鉴定可靠性的标准。因此，对于组蛋白修饰组这样的小数据集来说，完全可以根据谱图质量来筛选高置信度的PSM。由于数据中仅含有少量阳性肽段，筛选出的鉴定结果可以在随后很方便地进行手动验证。通常来说，一个正确的PSM中肽段的碎片离子(fragment ion)应该尽可能多地被匹配到谱图中的离子。因而，我们选择碎片离子覆盖率(fragment ion coverage，FIC)作为筛选高质量PSM的标准。经过一系列的评测，作者证明基于FIC的筛选策略在测试数据集中显著优于基于FDR的筛选策略，而50% 的FIC可以在不引入过多假阳性鉴定的情况下鉴定到所有的正确修饰肽段。　　作者随后对组蛋白修饰组数据更进一步探索发现组蛋白赖氨酸乙酰化(Kac)和一甲酰化(Kme1)和精氨酸一甲基化(Rme1)在测试数据集中被广泛发现共存于目标修饰的肽段上。这些赖氨酸和精氨酸上的背景修饰(尤其是Kac)可以导致酶切效率的降低，产生更长的含目标修饰的肽段，从而使得短肽上的修饰位点被鉴定到。因此考虑这些高丰度的背景修饰可以促进对目标修饰位点的鉴定，同时也有助于对组蛋白修饰crosstalk的研究。在两个测试数据集中，作者证明在搜库时考虑Kac，Kme1和Rme1帮助多鉴定到了45%和75%的组蛋白乳酰化修饰位点。基于以上对搜库分析流程的优化，作者建立了深度组蛋白修饰鉴定分析方法CHiMA (Comprehensive Histone Mark Analysis)。作者在两个测试数据集中对CHiMA进行详细地测试证明其相对传统搜库方法能够多鉴定到近一倍的组蛋白修饰位点。在以上方法开发过程中，所有鉴定结果作者均进行了手动验证以确保准确性。　　作者最后使用CHiMA对组蛋白赖氨酸乳酰化、2 -羟基异丁酰化、巴豆酰化和苯甲酰化的数据进行重分析，发现了113个新的组蛋白修饰位点(histone mark)，将此前的数目提高了几乎一倍。作者手动检查了所有新鉴定位点肽段的PSM质量，并将其分为了高置信度和中等置信度两类，其中后者的PSM可能有如下瑕疵：1) 肽段碎片离子的信号强度过低 2)谱图中高质核比区间(大于母离子质核比)有无法被解释的高强度离子。为了确保这些新鉴定的组蛋白修饰位点的可靠性，作者合成了所有中等置信度的乳酰化和巴豆酰化新鉴定位点的肽段。所有合成肽段的二级谱图均与鉴定肽段的谱图一致，证明了这些新鉴定位点的正确性。除了这些新鉴定位点之外，作者还总结了所有共存于同一条肽段上的修饰组合，并人工合成了其中部分肽段以验证其正确性。　　综上所述，CHiMA提供了第一个专为组蛋白修饰鉴定量身定做的数据分析方法，为组蛋白修饰参与的表观遗传学研究提供了重要工具。在本工作中新发现的组蛋白修饰位点也将为未来表观遗传学的机制研究提供重要的基础。本文的通讯作者为芝加哥大学Ben May癌症研究所的赵英明教授和北京大学化学与分子工程学院、北大-清华生命联合中心、北京大学合成与功能生物分子中心的王初教授。赵英明课题组博士后高晋君(王初课题组2019届毕业生)为本文第一作者，明尼苏达大学陈悦教授、北京大学张迪教授、赵英明课题组盛心磊博士等合作者为本课题做出了贡献。该工作得到了国家自然科学基金委、科技部重点研发计划、北京市杰出青年科学家等项目的经费支持。　　文章链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adf1416　　原文引用：DOI: 10.1126/sciadv.adf1416

p style=" text-align: justify " 　　美国威斯康星大学麦迪逊分校的李灵军教授在《美国质谱学会杂志》上发表了题为& quot Faces of Mass Spectrometry”的文章。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 进展1： /strong /p p 　　本月，李教授的团队在分析化学杂志上发表了一篇文章“HOTMAQ: A Multiplexed Absolute Quantification Method for Targeted Proteomics”。 /p p style=" text-align: center " img title=" 1111111.webp.jpg" alt=" 1111111.webp.jpg" src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201902/uepic/04527389-10d7-4d2c-9392-40078abb0c71.jpg" / /p p style=" text-align: justify " 　　靶向蛋白组学中的绝对定量研究由于复杂背景下的低特异性、有限的分析通量及广泛的动态范围等诸多因素而具有挑战性。为解决这些问题,其课题组开发了一个混合offset-triggered多路复用绝对量化(HOTMAQ)方法。此方法结合了具有成本效益的质量差异和等压标签，能够在MS1前体扫描中同步构建内部标准曲线,在MS2水平上实时识别多肽,并在同步前体选择(SPS)-MS3光谱中对目标蛋白进行质量偏移触发的精确定量。这种方法将目标定量蛋白质组学的分析通量提高了12倍。采用HOTMAQ策略对临床前阿尔茨海默病候选蛋白生物标志物进行高精度验证。HOTMAQ的高通量和定量性能，加上样品的灵活性，使其广泛应用于靶向肽组学、蛋白质组学和磷蛋白组学的研究中。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 进展2： /strong /p p style=" text-align: justify " 　　清华大学欧阳证和瑕瑜教授与普渡大学学者共同在《自然通讯》上发表“Online photochemical derivatization enables comprehensive mass spectrometric analyses of unsaturated phospholipid isomers” 文章。 /p p style=" text-align: center " img width=" 600" height=" 304" title=" 22222222.webp.jpg" style=" width: 600px height: 304px " alt=" 22222222.webp.jpg" src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201902/uepic/f219c925-a096-478e-a956-d221f5b56fbd.jpg" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: justify " 　　质谱技术是脂质结构分析的主要工具，但如何在不饱和脂质中有效定位碳碳双键(C=C)以区分C=C位异构体仍是一个难题。本文通过Paterno-Buchi反应与液相色谱-串联质谱联用在线C=C衍生化，开发了大型的脂质分析平台。这为脂质C=C位异构体提供了丰富的信息，揭示了牛肝脏中200多种不饱和甘油磷脂的C=C位，鉴定出55组C=C位异构体。通过对乳腺癌患者和2型糖尿病患者血浆样本的分析，其课题组发现C=C同分异构体的比例受个体丰度的影响较小，这说明同分异构体比例可能用于脂类生物标志物的发现。 /p p & nbsp /p

贾伟、陈熙 沃特世科技（上海）有限公司实验中心 氢氘交换质谱法是一种研究蛋白质空间构象的质谱技术。它在蛋白质结构及动态变化研究、蛋白质相互作用位点发现、蛋白表位及活性位点鉴定方面有着广泛的应用。随着氢氘交换质谱技术的不断发展，它正在成为结构生物学家及生物药物研发的重要手段。 氢氘交换质谱（HDX MS，hydrogen deuterium exchange mass spectrometry）是一种研究蛋白质空间构象的质谱技术。其原理是将蛋白浸入重水溶液中，蛋白的氢原子将于重水的氘原子发生交换，而且蛋白质表面与重水密切接触的氢比位于蛋白质内部的或参与氢键形成的氢的交换速率快，进而通过质谱检测确定蛋白质不同序列片段的氢氘交换速率，从而得出蛋白质空间结构信息[1]。这个过程就像将握着的拳头浸入水中，然后提出水面并张开手掌。这时，湿润的手背表明它在&ldquo 拳头&rdquo 的结构中处于外表面，而较为干燥的手心表明它是&ldquo 拳头&rdquo 的内部。除样品制备外，氢氘交换质谱法的主要过程包括：交换反应、终止反应、将蛋白快速酶切为多肽、液相分离、质谱检测、数据解析。其中交换步骤需要在多个反应时长下进行，如0s、10s、1min、10min、60min等，以绘制交换率曲线，得到准确全面的信息。氢氘交换质谱技术在蛋白质结构及其动态变化研究[1]、蛋白质相互作用位点发现[2]、蛋白表位及活性位点鉴定方面有着广泛的应用[3]。 与经典的蛋白质结构研究方法相比，如X射线晶体衍射（X-Ray Crystallography）和核磁共振（NMR. Nuclear Magnetic Resonance）等方法，氢氘交换质谱不能够提供精确的蛋白空间结构，它直接提供的主要信息包括哪些氨基酸序列位于蛋白质空间结构的表面位置（包括动态变化中的）、可能的活性位点和蛋白-蛋白相互作用位点等。但是氢氘交换质谱技术有着其他经典方法不具备的优点：首先，可以进行蛋白质结构动态变化的研究是氢氘交换质谱的一个突出优点，包括变化中的活性位点及表位；其次，氢氘交换质谱在蛋白复合体构象的研究中也具有独到的优势；此外，氢氘交换质谱还具有对样品需求量小、纯度要求相对较低、研究对象为溶液环境下的蛋白质的天然构象而非晶体中构象等优势[1,4,5]。自1991年第一篇研究论文发表起，氢氘交换质谱技术不断发展，已经成为结构生物学及质谱技术中一个非常重要的应用领域[6]。但是氢氘交换质谱实验的复杂的实现过程在一定程度上影响了其应用的广泛度。主要的难点有：1、如何避免交换后氘代肽段的回交现象；2、实验控制的高精确性和重现性要求；3、交换后造成的叠加的质谱峰如何准确分辨；4、简易高效的分析软件需求；5、以氨基酸为单位的交换位点辨析。沃特世公司自2005年起，针对以上难点不断进行攻关，推出了目前唯一商业化的全自动氢氘交换质谱系统解决方案&mdash &mdash nanoACQUITY UPLC® HD-Exchange System(图1)。在全世界范围内，这套系统已经帮助科学家在包括Cell、Nature等顶级研究期刊中发表研究论文[7,8]。除科研需求外，沃特世氢氘交换质谱系统也受到众多国际领先制药公司的认可，并用于新药开发中蛋白药物活性位点及表位的研究工作中。 氢氘交换实验中的回交现象将严重影响实验数据的可信度，甚至导致错误结果的产生。要避免回交需要做到两点：尽量缩短液质分析时间和保证液质分析中的温度和pH为最低回交反应系数所要求的环境。沃特世UPLC® 系统采用亚二纳米色谱颗粒填料，较HPLC使用的大颗粒填料，UPLC具有无与伦比的分离度。因此UPLC可以做到在不损失色谱分离效果的要求下，极大缩短液相分析时间的要求[9]。对于对温度和pH控制问题，在多年的工程学改进中，nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System已经实现了对酶切、液相分离等步骤的全程控制[10]。 对氢氘交换质谱实验精确性和重现性的要求是其应用的第二个主要难点。在实验中一般需要采集0s、10s、1min、10min、60min、240min等多个时间点的数据。如果进行人工手动实验，很难做到对10S-10min等几个时间点的精确操作。再考虑到重复实验的需求，人工手动操作会对最终数据可信度产生影响。而且实验过程重复繁琐，将给实验人员带来非常大的工作压力。nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System完全通过智能机械臂，精确完成交换、终止交换、进样、酶切等一系列实验过程，而且始终保证各个步骤所需不同的温度环境。这些自动化过程不但保证了实验数据的可靠性，提高了实验效率，也将科学家从繁琐的重复实验中解放出来。 氢氘交换实验的质谱数据中，随着交换时间的延长，发生了交换反应的多肽，由于质量变大，其质谱信号将逐渐向高质荷比方向移动。因此，这些质谱峰可能与哪些未发生交换反应的多肽质谱峰逐渐叠加、相互覆盖。相互叠加的质谱信号，不但影响对峰归属的判断，更会增加交换率数据的误差。因为交换率判断需要通过对发生交换的多肽进行定量，毫无疑问因叠加的而混乱的质谱数据将极大的影响对质谱峰的准确定量。这点对于单纯通过质荷比进行分析的质谱仪来说完全无能为力。但是，这个看似不可能完成的任务却被沃特世 nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System攻克了。这是因为，不同于其它常见质谱，沃特世的SYNAPT® 质谱平台还具备根据离子大小及形态进行分离的功能（行波离子淌度分离）。在数据处理时，除多肽离子的质荷比信息外，还可以通过离子迁移时间（离子淌度维度参数）将不同离子区分。因此这种SYNPAT独有的被命名为HDMSE的质谱分析技术可以将因质荷比相同而重叠的多肽分离开，轻而易举地解决了质谱信号叠加的问题，得到准确的交换率数据[11,12]（图2）。SYNPAT质谱平台一经推出就夺得了2007年PITTCON金奖，目前已经推出了新一代的SYNAPT G2HDMS、SYNAPT G2-S HDMS等型号，并具备ESI、MALDI等多种离子源。除氢氘交换技术外，SYNAPT质谱系统在蛋白质复合体结构研究中也是独具特色，已有多篇高质量应用文献发表[13,14,15]。 实现氢氘交换质谱技术的第四个关键点，是如何高效分析实验产生的多时间点及多次重复带来的大量数据。人工完成如此巨大的信息处理工作，将消耗科学家大量的时间。沃特世氢氘交换质谱解决方案所提供的DynamX软件可以为科学家提供简便直观的分析结果，并包含多种呈现方式。 在某些特殊研究中，要求对蛋白氢氘交换位点做到精确到氨基酸的测量，这是氢氘交换质谱研究的又一个难点。在常规的研究中采用CID（碰撞诱导解离）碎裂模式，可能导致氘原子在多肽内重排，而致使不能对发生交换的具体氨基酸进行精确定位。SYNPAT质谱提供的ETD（电子转移解离）碎裂模式可以避免氘原子重排造成的信息混乱，并具有良好的碎裂信号[16]。 沃特世的nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System为氢氘交换质谱实验提供了前所未有的简易的解决方案，强有力地推动了氢氘交换技术在蛋白质结构及动态变化研究、蛋白质相互作用位点发现、蛋白表位以及活性位点鉴定方面的应用，正在成为众多结构生物学科学家和生物制药企业必不可少的工作平台。 参考文献 (1) John R. Engen, Analysis of Protein Conformation and Dynamics by Hydrogen/Deuterium Exchange MS. Anal. Chem. 2009,81, 7870&ndash 7875 (2) Engen et al. probing protein interactions using HD exchange ms in ms of protein interactions. Edited by Downard, John Wiley & Sons, Inc. 2007, 45-61 (3) Tiyanont K, Wales TE, Aste-Amezaga M, et al. Evidence for increased exposure of the Notch1 metalloproteasecleavage site upon conversion to an activated conformation. Structure. 2011, 19, 546-554 (4) Heck AJ. Native mass spectrometry: a bridge between interactomics and structural biology. Nat Methods. 2008, 5, 927-933. (5) Esther van Duijn, Albert J.R. Heck. Mass spectrometric analysis of intact macromolecular chaperone complexes. Drug Discovery Today. Drug Discovery Today: Technologies Volume 3, 2006, 21-27 (6) Viswanat ham Katta, Brian T. C hait, Steven Ca r r. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 1991, 5, 214&ndash 217 (7) Chakraborty K, Chatila M, Sinha J, et al. Chaperonin-catalyzed rescue of kinetically trapped states in protein folding. Cell. 2010 Jul 9 142(1):112-22. (8) Zhang J, Adriá n FJ, Jahnke W, et al. Targeting Bcr-Abl by combining allosteric with AT P-binding-site inhibitors. Nature. 2010,463, 501-506 (9) Wu Y, Engen JR, Hobbins WB. Ultra performance liquid chromatography (UPLC) further improves hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. 2006 , 17, 163-167 (10) Wales T E, Fadgen KE, Gerhardt GC, Engen JR. High-speed and high-resolution UPLC separation at zero degrees Celsius. Anal Chem. 2008, 80, 6815-6820 (11) Giles K, Pringle SD, Worthington KR, et al. Applications of a travelling wave-based radio-frequency-only stacked ring ion guide. Rapid Commun Mass Spectrom. 2004, 18, 2401-2414 (12) Olivova P, C hen W, C ha kra borty AB, Gebler JC. Determination of N-glycosylation sites and site heterogeneity in a monoclonal antibody by electrospray quadrupole ion-mobility time-offlight mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 2008, 22,29-40 (13) Ruotolo BT, Benesch JL, Sandercock AM, et al. Ion mobilitymass spectrometry analysis of large protein complexes. Nat Protoc.2008, 3, 1139-52. (14) Uetrecht C, Barbu IM, Shoemaker GK, et al. Interrogatingviral capsid assembly with ion mobility-mass spectrometry. Nat Chem.2011, 3,126-132 (15) Bleiholder C, Dupuis NF, Wyttenbac h T, Bowers MT. Ion mobility-mass spectrometry reveals a conformational conversion from random assembly to &beta -sheet in amyloid fibril formation. Nat Chem. 2011, 3, 172-177 (16) Kasper D. Rand, Steven D. Pringle, Michael Morris, John R., et al. ETD in a Traveling Wave Ion Guide at Tuned Z-Spray Ion Source Conditions Allows for Site-Specific Hydrogen/Deuterium Exchange Measurements. J Am Soc Mass Spectrom. 2011, in press

血红蛋白（Hb）变异，是一组由珠蛋白基因突变引起的常见遗传性变异，其特征是血红蛋白分子结构发生变化。迄今为止，已鉴定出1300多个变异体，其中，超过150个不稳定的Hb变异体被记录为引起不同严重程度的溶血性贫血的原因。对Hb变异体进一步的研究，可用于新生儿筛查、产前筛查… … 此外，许多研究表明Hb变异可能会对糖化血红蛋白（HbA1c）的测量产生干扰，因此，临床相关Hb变异体的鉴定和表征对于做出正确诊断至关重要。目前，高效液相色谱法（HPLC）和毛细管电泳（CE）是HbA1c测量和Hb分析的一线方法。近日，北京大学深圳医院检验科纪玲博士团队使用融智生物科技（青岛）有限公司的QuanTOF发现了一种新的Hb变种，即Hb辽宁，这是国内首次由MALDI-TOF MS鉴定出来的血红蛋白变异体。相关研究结果已经发表在Clin Chem Lab Med 2019上，论文题为“Detection of a novel hemoglobin variant Hb Liaoning by matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry”（https://doi.org/10.1515/cclm-2019-0300）。先证者是来自中国辽宁省的一名36岁汉族男子，被送往北京大学深圳医院进行例行健康检查。首先使用毛细管电泳（CE）分析仪测量HbA1c水平，该分析仪没有产生HbA1c值，非典型电生理图显示无明显异常峰值。电泳软件将配置文件识别为“非典型”，主要是由于存在额外的峰值。因此，研究人员假设Hb变异可能会干扰HbA1c分析。随后，使用高效液相色谱法（HPLC）、硼酸亲和力高效液相色谱法、免疫分析法和MALDI-TOF分析仪分别进一步定量HbA1c。其中，MALDI-TOF分析仪为融智生物科技（青岛）有限公司的新一代宽谱定量飞行时间质谱QuanTOF。 融智生物新一代宽谱定量飞行时间质谱平台QuanTOF HbA1c测试结果分别为：5.2％（33mmol/mol，高效液相色谱法），5.1％（32mmol/mol， 硼酸亲和力高效液相色谱法），4.9％（30mmol/ mol，免疫分析法）和4.9％（30mmol/mol， QuanTOF）。与从硼酸亲和力高效液相色谱法获得的结果比较，观察到高效液相色谱法（2.0％），免疫分析法（-3.9％）和QuanTOF（-3.9％）的可接受偏差（国家糖化血红蛋白标准化计划[NGSP]标准，偏差在±5.0％内）。高效液相色谱法的色谱图未显示变异体。然而，QuanTOF的质谱图显示出异常的Hb链（m/z=15,169.4），相对强度占总αHb的26.0％（图1B）。在谱图中还发现了正常的Hb链，包括αHb亚基（m/z=15,127.9），βHb亚基（m/z = 15,868.0）和糖化-βHb（m/z=16,030.0）（图1A，B）。 对照血红蛋白和Hb辽宁的MALDI-TOF质谱。（A）来自正常成人的对照血红蛋白和（B）来自先证者的Hb辽宁。分开的两个峰质量相差41.5Da，清楚地表明存在变异体α链（m/z=15,169.4）。箭头表示存在正常α链（m/z=15,127.9），正常β链（m/z=15,868.0）和糖化-βHb（m/z=16,030.0）。 使用毛细管电泳（CE）和离子交换高效液相色谱进行随后的Hb分析。令人惊讶的是，没有出现异常峰或非典型色谱图的迹象。研究人员随后进行Sanger测序以确认Hb变异体的存在以及性质。测序数据显示α2基因中存在新的杂合突变[α15（A13）（GGT GTT），Gly Val，HBA2：c.47 G T]，导致甘氨酸的编码转换（分子量：75.1 Da）在密码子15处的缬氨酸（分子量：117.1Da）。如图1B所示，从甘氨酸到缬氨酸（42.0Da）的取代诱导的相对分子量的变化也可以从αHb亚基和变异体Hb亚基（41.5Da）之间的m/z变化中找到。由于以前没有报道该变种，研究人员根据患者所在的地区将其命名为Hb辽宁。 Sanger测序的结果。 Sanger测序揭示了一种新的突变[α15(A13)(GGTGTT), GlyVal, HBA2:c.47 GT]。 为了确定患者与Hb辽宁相关的血液学特征，对其进行血液学数据测量显示，得到的血液学指标并没有发现贫血迹象，这表明患者非病理性Hb变异。Hb变异是溶血性贫血的原因之一，同时也是HbA1c测量中的分析干扰。在本研究的案例中，Hb辽宁没有显示出明显的临床表现。然而，该变异体在使用CE法的HbA1c测量中引起干扰。在以前的研究中，通常使用硼酸盐亲和HPLC方法作为比较方法，因为它无论Hb种类如何都测量总糖化血红蛋白，因而被认为不受大多数Hb变异体的影响。结果中提到的可接受的偏差表明Hb辽宁对高效液相色谱和QuanTOF的HbA1c测量没有显著影响。高效液相色谱法（HPLC）和毛细管电泳（CE）是HbA1c测量和Hb分析的一线方法。仅有有限的研究显示了MALDI-TOF MS在HbA1c测量中的应用。在目前的研究中，阳离子交换HPLC和电泳方法在检测Hb辽宁时面临挑战，因为电荷差异不明显且超出检测限。而MALDI-TOFMS能够通过m/z差异区分Hb辽宁。当然了，MALDI-TOF MS可能无法区分所有类型的Hb变异体，尤其是当m/z差异很小且超出仪器分辨率时。最后同样重要的是，鉴定Hb变异和识别HbA1c检测中的干扰是至关重要的，尤其是在Hb变异的高患病率区域。

p style=" line-height: 1.5em " & nbsp & nbsp & nbsp & nbsp 中国科学院计算技术研究所研究员贺思敏及其研究团队设计和实现了新一代开放式搜索算法Open-pFind，可提高质谱数据解析的数量与质量，有望成为蛋白质组学日常数据分析的主力工具。相关成果10月9日在线发表于《自然—生物技术》。 br/ /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/419b4d61-469e-48e0-baf9-3ef492f7ff8b.jpg" title=" 2018-10-12_165404.png" alt=" 2018-10-12_165404.png" / /p p style=" line-height: 1.5em " 　　质谱数据的低解析率直接影响着肽段和蛋白质鉴定数目和鉴定精度的提高。质谱数据解析率一直较低，是由于质谱数据中通常有大量存在意外修饰或发生意外酶切的肽段，传统的限定式搜索因搜索空间有限，通常无法对上述肽段进行有效检索。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　　新一代开放式搜索引擎Open-pFind采用基于序列标签索引的开放式搜索流程，快速扫描蛋白质数据库并对部分高质量谱图进行鉴定。在此过程中，意外修饰、突变、半特异及非特异性酶切肽段均在引擎的搜索空间内。Open-pFind通过基于支持向量机的肽谱匹配重打分算法，挖掘数据中的特征信息，并据此进行第二次精细搜索。同时，Open-pFind集成了前端数据处理的pParse模块，对肽段母离子进行校准，并有效提取混合谱图，进一步提升了谱图解析率。 /p p style=" line-height: 1.5em " 　　在四组典型质谱数据集上，Open-pFind解析率均达到了70%~85%，比同类软件鉴定结果多出50.5%~117.0%。对于高质量的串联质谱图，Open-pFind甚至基本实现了完全解析。在搜索空间是常规引擎5个量级的基础上，Open-pFind的速度仍然是常规引擎的2~3倍，是同类开放式引擎的数十倍甚至上百倍。在超大规模人类蛋白质组数据集上，Open-pFind报告了超过12000种蛋白，且准确度远远超过以往常规分析结果。 /p p 　　 /p p br/ /p

阐明小分子（包括内源性代谢物和外源性化合物）如何发挥调控作用的关键问题之一是小分子的靶标发现和验证，即蛋白质-小分子相互作用研究。蛋白质与小分子的相互作用模式既有较稳定的共价结合，也有瞬时的弱相互作用。如何灵敏、高效地捕获并解析多种类型的蛋白质-小分子相互作用是分析难点。目前，蛋白质-小分子相互作用的分析策略大致可分为两类：一是靶向相互作用研究，以蛋白质（或小分子）为中心，发现并验证与之相互作用的小分子（或蛋白质）；二是非靶向相互作用研究，全面识别多种蛋白质-小分子的相互作用轮廓。应用的具有分析技术包括：表面等离子体共振技术（surface plasmon resonance，SPR）、氢氘交换质谱分析技术（hydrogen deuterium exchange mass spectrometry，HDX MS）、限制性蛋白水解-质谱分析技术（limited proteolysis-mass spectrometry，LiP-MS）、蛋白质热迁移分析技术（cellular thermal shift assay，CESTA）和药物亲和反应靶标稳定性分析技术（Drug affinity responsive target stability，DARTS）等。本期介绍限制性蛋白水解-质谱分析技术（LiP-MS）的原理、技术流程和其在蛋白质-小分子相互作用研究中的应用。1. 原理LiP-MS技术最初由瑞士苏黎世联邦理工学院的Paola Picotti课题组建立 [1] ：利用小分子结合蛋白后相较于原蛋白产生蛋白质空间构象和位阻的变化，经蛋白酶切后形成差异肽段，液质联用分析识别和鉴定差异肽段，基于差异肽段推测蛋白质与小分子的相互作用位点。2. 技术流程在非变性条件下提取蛋白，以保留蛋白活性和空间结构。先使用低浓度（1:100, w/w）蛋白酶K在较低温度（25℃）下短时间内（5 min）对蛋白-小分子复合物进行有限的蛋白酶切。蛋白与小分子结合后，相互作用位点存在空间位阻，从而避免被蛋白酶K切割，由此产生差异肽段。随后进行蛋白变性和胰酶酶切，蛋白质组分析识别和鉴定差异肽段，基于差异肽段所处位置预测蛋白质与小分子的相互作用位点（图1）。图1 限制性蛋白水解-质谱分析（LiP-MS）技术流程 [2]3. 试验试剂和分析仪器3.1 蛋白抽提：可依据实际目的和细胞类型选择不同的细胞/组织裂解液，如RIPA、N-PER、M-PER等，进行细胞/组织蛋白抽提，获得的细胞/组织全蛋白提取物可直接与目标小分子共孵育。3.2 蛋白酶切：关键的蛋白酶切试剂，例如蛋白酶K、胰酶等均有市售。3.3 分析仪器：目前多种类型的液相色谱-高分辨质谱联用仪均可用于蛋白质组学分析，已应用于LiP-MS的高分辨质谱仪包括，布鲁克、赛默飞、沃特世和SCIEX等品牌的飞行时间质谱、轨道阱质谱和傅里叶变换离子回旋共振质谱等。4. 应用实例研究人员基于LiP-MS技术在大肠杆菌中探索多种内源性代谢物和蛋白的相互作用模式 [1]，先采用凝胶过滤法除去大肠杆菌全蛋白提取物中的内源性代谢物，获得大肠杆菌全蛋白；随后将大肠杆菌蛋白与20个中心碳代谢相关的关键内源性代谢物（三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、6-磷酸葡萄糖、果糖-1,6-二磷酸、丙酮酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸等，见图2A）分别共孵育。基于LiP-MS流程发现，上述20个内源性代谢物可与大肠杆菌中1678个蛋白发生潜在相互作用，其中1447个相互作用是首次发现的（图2B）。作者将所发现的相互作用与在线数据库BRENDA对比（主要涉及酶的功能和代谢通路等信息），证明LiP-MS技术能够准确地识别已报道的蛋白-内源性代谢物相互作用，假阳性率低于6 %。图2 20个与中心碳代谢相关的关键内源性代谢物（图A）及其在大肠杆菌中发生相互作用的蛋白数量（图B）[1]参考文献：[1] Piazza, I., Kochanowski, K., Cappelletti, V., Fuhrer, T.,Noor, E., Sauer, U., Picotti, P. A map of protein-metabolite interactions reveals principles of chemical communication. Cell, 2018, 172(1-2), 358-372.[2] Pepelnjak M, Souza N D, Picotti P. Detecting Protein–Small Molecule Interactions Using Limited Proteolysis–Mass Spectrometry (LiP-MS). Trends in Biochemical Sciences, 2020, 45(10), 919-920.

近日，北京大学化学与分子工程学院、北大-清华生命联合中心、北京大学合成与功能生物分子中心王初课题组在RSC Chemical Biology杂志上发表了题为“ Discovery of Cisplatin-binding Proteins by Competitive Cysteinome Profiling”的研究文章。在这项工作中，作者应用基于竞争的定量化学蛋白质组学策略rdTOP-ABPP，在MCF-7活细胞体系中全局性地鉴定了顺铂(cisplatin)结合蛋白与其结合顺铂的位点,发现并证明了顺铂可以结合谷氧还蛋白1(GLRX1)与具有硫氧还蛋白结构域的蛋白17(TXNDC17)的活性位点。除此之外也发现了一个全新的顺铂结合蛋白甲硫氨酸氨肽酶1(MetAP1)，并发现其对顺铂的细胞毒性有一定的保护作用。顺铂是1965年被发现的化疗药物，其在如睾丸癌，卵巢癌等癌症的治疗过程中被广泛应用。其在进入细胞后生成的活性的二价铂离子会进攻DNA上的腺嘌呤或鸟嘌呤，从而引起DNA损伤，最终杀死癌细胞，这个过程被认为是顺铂细胞毒性的主要原因。而近年来很多研究也发现活性二价铂离子除了结合DNA之外，其也会与细胞质中大量亲核性物质反应，比如GSH，RNA以及金属硫蛋白等进行结合，据统计，仅有1%左右的铂是结合到DNA上。大量游离的活性二价铂离子会与细胞中多种有功能的蛋白质结合，从而影响其正常的功能，因此对顺铂结合蛋白的研究有助于我们更完整的理解顺铂细胞毒性的机理以及帮助我们避免顺铂耐药性。目前已经有很多组学上鉴定顺铂结合蛋白的方法，例如利用Pt的特征同位素分布的特点，在一级质谱层面筛选那些潜在的顺铂结合蛋白 或者将ICP-MS与二维凝胶电泳结合，从而在组学层面鉴定潜在的顺铂结合蛋白等，但这些方法受限于较低的灵敏度和通量。对顺铂进行生物正交基团改造，从而通过生物素-亲和素富集来鉴定顺铂结合蛋白的方法也被开发，并成功在酵母细胞中鉴定到数百种潜在的顺铂结合蛋白。但由于顺铂的分子较小，并且其作为无机药物，在其上进行官能团化修饰可能会一定程度上改变顺铂本身的性质，并影响最终的鉴定结果。鉴于活性二价铂离子易与半胱氨酸残基反应并结合，因此作者考虑使用基于竞争的定量化学蛋白质组学策略rdTOP-ABPP来鉴定顺铂结合蛋白。首先作者在活细胞水平上证明了顺铂可以与半胱氨酸特异性反应的探针IAyne竞争结合蛋白质的半胱氨酸残基。在优化了质谱条件后，作者在三次重复的质谱实验中共鉴定并定量到1947个肽段，对其进行条件筛选，定义顺铂处理后肽段的色谱强度与对照组中相同肽段色谱强度比值为Ratio，作者认为三次重复的Ratio平均值与对应的p value满足-log10(p value) x log2(ratio) 1.5的是潜在的顺铂结合位点，共筛选到125个肽段归属于107种蛋白。这些蛋白显著富集于核质交换通路以及氧化还原相关通路，这与之前报道的顺铂会引起DNA损伤以及顺铂会引发细胞产生氧化应激相对应。　　随后作者在筛选的107种蛋白中，选择了归属于氧化应激通路的已知的与顺铂有关的靶点蛋白GLRX1以及TXNDC17进行验证，纯蛋白层面的竞争标记与ICP-MS结果均表明这两种蛋白为顺铂结合蛋白，并且其顺铂结合位点均是质谱鉴定到的位点，且均是两个蛋白的活性中心位点，暗示了顺铂结合可能会影响两种氧化还原相关的酶的活性，进而引起氧化应激。纯蛋白质谱实验中，二级谱也表明两个蛋白与顺铂的结合均是桥连结合，这与文献中报道过的其中一种顺铂与蛋白结合的模式是相对应的。　　之后作者选择了另一种尚未明确是否与顺铂有相互作用的蛋白MetAP1进行了后续的生化验证。纯蛋白层面的竞争标记实验与ICP-MS的实验结果证明MetAP1是顺铂结合蛋白，且其顺铂结合位点为我们鉴定到的C14位。随后我们测量了顺铂对MetAP1活性的影响，发现顺铂不会明显影响MetAP1纯蛋白的活性，但可以抑制MetAP1在体内的活性，表明顺铂会在活细胞中影响新生成蛋白的N端甲硫氨酸切割，最后通过比较MetAP1的敲除细胞系和野生型的细胞系对顺铂的MTT曲线，作者发现MetAP1在顺铂引起的细胞毒性中起到了一定程度的保护作用。　　总之，作者应用竞争性ABPP策略，在MCF-7活细胞中鉴定到了107种潜在的顺铂结合蛋白，并对其中的三个靶标进行了验证。作者发现顺铂可以结合与氧化还原相关的酶GLRX1与TXNDC17的关键酶活中心，暗示了顺铂结合可能会影响两种氧化还原相关的酶的活性，进而可能影响细胞的ROS水平。也证明了顺铂通过结合来影响MetAP1的活性从而影响新生成蛋白的N端甲硫氨酸的加工，并表明MetAP1可以作为提高顺铂细胞毒性以避免肿瘤耐药性的潜在靶点。本文的通讯作者为北京大学化学与分子工程学院、北大-清华生命联合中心、北京大学合成与功能生物分子中心的王初教授。其指导的化学与分子工程学院2019级博士研究生王相贺为本文的第一作者。该工作得到了国家自然科学基金委、国家重点研发计划的经费支持。　　本文作者：WXH　　责任编辑：JGG　　原文链接：https://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2023/cb/d3cb00042g　　文章引用：DOI: 10.1039/D3CB00042G

瓜氨酸化是影响蛋白质结构和功能的关键的翻译后修饰。尽管它与各种生物过程和疾病发病紧密相关，但由于缺乏有效的方法来富集、检测和定位该翻译后修饰，其潜在机制仍然知之甚少。近期，威斯康星大学麦迪逊分校李灵军教授课题组报道了生物素硫醇标签的设计和开发，该标签能够通过质谱法对瓜氨酸化进行衍生化、富集来实现可靠的鉴定。作者对小鼠组织的瓜氨酸化蛋白质组进行了全局分析并且从432种瓜氨酸化蛋白质中识别出691个修饰位点，这是迄今为止最大的瓜氨酸化数据集。作者发现并阐述了这个翻译后修饰的新的分布和功能并且表示该方法有希望为进一步破译瓜氨酸化的生理和病理作用奠定基础。这项工作以“Enabling Global Analysis Of Protein Citrullination Via Biotin Thiol Tag-Assisted Mass Spectrometry”为题发表在国际化学权威杂志Analytical Chemistry上 (https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c03844)，文章作者为Yatao Shi#, Zihui Li#, Bin Wang#，Xudong Shi , Hui Ye, Daniel G. Delafield, Langlang Lv, Zhengqing Ye, Zhengwei Chen, Fengfei Ma，Lingjun Li*。此外，李灵军教授课题组进一步拓展了此方法的实用性。作者通过应用二甲基化亮氨酸(DiLeu)等重标记策略第一次实现了瓜氨酸化的高通量定量研究，并利用这一方法揭示了瓜氨酸化在人体细胞DNA损伤及修复过程中的重要作用。相关成果以“12-Plex DiLeu Isobaric Labeling Enabled High-Throughput Investigation of Citrullination Alterations in the DNA Damage Response”为题同样发表在Analytical Chemistry上(https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c04073)，文章作者为Zihui Li, Bin Wang, Qinying Yu, Yatao Shi, Lingjun Li*。　　研究的主要内容　　作者设计了一种生物素硫醇标签，它可以很容易的以低成本合成并且可以与瓜氨酸残基和2,3-丁二酮发生特异性反应(图 1a)。这种衍生化不仅增加了质量转移以允许更可靠的鉴定，而且还引入了生物素部分，使修饰分子的后续富集成为可能。该生物素硫醇标签设计具有紧凑的结构，在高能碰撞解离 (HCD) 期间仅产生两个碎片/诊断离子(图 1b)。 因此，肽主链可以保持良好的裂解效率，并在 HCD 或电子转移解离 (ETD) 期间分别产生丰富的b/y或c/z离子系列。在 HCD(图 1c)、ETD或电子转移/高能碰撞解离(EThcD)碎裂下，衍生化肽标准品的序列收集质谱图几乎完全覆盖相应的肽序列。实验结果表明生物素硫醇标签衍生的瓜氨酸化肽可以产生用于解析及标注的高质量的串联质谱图，并且与各种裂解技术相结合时可以提高瓜氨酸化位点的识别可信度。　　图1|用于瓜氨酸化分析的生物素硫醇标签设计。a，使用生物素硫醇标签和 2,3-丁二酮对瓜氨酸肽进行衍生化。 b，HCD、ETD 或 EThcD 片段化后生物素硫醇标签衍生的瓜氨酸化肽的片段化位点。c，HCD裂解后生物素硫醇标签衍生的瓜氨酸肽标准品 SAVRACitSSVPGVR 的串联质谱图。　　在接下来的实验中作者使用该生物素硫醇标签和基于质谱的自下而上的蛋白质组学方法对瓜氨酸化进行分析(图2a)。作者在体外利用 PAD(一种可以催化瓜氨酸化的酶)催化的人组蛋白 H3 蛋白来验证这个过程。作为未被PAD催化的阴性对照，未发现组蛋白的肽段被鉴定为瓜氨酸化，证明了生物素标签反应的高特异性(图 2b)。在体外 PAD 处理后，作者 发现许多精氨酸残基被催化为瓜氨酸，并且大量的位点被高可信度的鉴定为瓜氨酸化位点(图 2c)，进一步表明该方法的高效性。在 HCD 碎裂后，其产生了一系列丰富的 b/y 离子，可以帮助准确的表征在同一肽段上单个(图 2d)以及多个(图 2e)瓜氨酸化位点。　　图2|使用生物素硫醇标签进行体外瓜氨酸化分析。a，使用生物素硫醇标签进行蛋白质瓜氨酸化分析的实验工作流程。b、c，在体外 PAD 处理之前 (b) 和之后 (c) 组蛋白 H3 蛋白的瓜氨酸化分析。 已识别的瓜氨酸化位点在序列中以蓝色字母突出显示。 序列下方的红色矩形表示鉴定的瓜氨酸化肽，而瓜氨酸化位点以蓝色显示。 d，PAD处理的组蛋白 H3 (R64Cit) 的已鉴定瓜氨酸化肽的串联质谱图示例。 e，PAD 处理的组蛋白 H3 的同一肽上鉴定的两个瓜氨酸化位点(R70Cit 和 R73Cit)的串联质谱图示例。　　接下来，作者们尝试利用所开发的方法对复杂的生物样本中的瓜氨酸化进行全局分析，并希望能够以此提供阐明生物体中瓜氨酸化调节机制的依据。首先，作者对小鼠的六个身体器官和五个大脑区域进行了深入的瓜氨酸组分析，生成了第一个小鼠瓜氨酸组组织特异性数据库。作者从432种瓜氨酸化蛋白质中以高置信度的方式鉴定了691个瓜氨酸化位点(图 3a)。更重要的是，这些蛋白质中约有 60% 未曾在UniProt 数据库检索并被报道，这一结果极大地扩展了对瓜氨酸化以及这些底物蛋白质如何受到瓜氨酸化影响的理解。作者发现结果中与 UniProt 数据库的已知的瓜氨酸位点重叠部分较少(图 3b)，这可能是因为 UniProt 中描述的近 40% 的瓜氨酸化位点是基于相似性外推理论而没有实际的实验证据。此外，许多报道的位点位于组蛋白上，尤其是蛋白质末端，可能会逃过自下而上质谱策略的检测(图 3b)。图 3c 展示了单位点瓜氨酸化和多位点瓜氨酸化蛋白质分布情况，其中 70% 的已鉴定蛋白质仅有一个瓜氨酸化位点被检测到。　　这个新发现的瓜氨酸化蛋白质组为推测瓜氨酸化的调控机制提供了宝贵的资源。例如，作者在髓鞘碱性蛋白(MBP)上鉴定到了九个瓜氨酸化位点，而在 UniProt 数据库中只有四个(图3d)。作者的结果提供了高质量的串联质谱图，不仅证实了已知修饰位点的存在(图3e)，而且还高可信度的识别了未知的位点(图 3f)。然后作者进行了瓜氨酸化肽段的序列分析，发现在鉴定的瓜氨酸化位点两侧并没有高度保守的氨基酸序列模式(图3g)，但是谷氨酸残基更频繁地出现在瓜氨酸的N末端侧附近。这与Fert-Bober 等人报道的小鼠瓜氨酸组分析结论一致。另一方面，Tanikawa 等人发现在人体组织和血浆中大约五分之一的 PAD4 底物含有 RG/RGG 基序。同样，Lee 等人及相关研究人员观察到天冬氨酸和甘氨酸残基在瓜氨酸化位点出现频率偏高。值得注意的是，这些研究使用了不同的人源细胞系或组织，因此作者的结果可能表明在不同物种之间瓜氨酸化位点周围的序列模式是不同的。为了更好地辨别瓜氨酸化蛋白质所涉及的功能，作者展示了基因本体论(GO)富集分析的热图，其显示了二十个最显著富集的细胞成分(图3h)以及KEGG途径(图3i)。作者发现小鼠大脑组织和身体器官之间存在明显差异，而瓜氨酸蛋白更多地参与大脑功能。具体来说瓜氨酸化蛋白质集中在轴突、髓鞘、核周体和突触中，因此在中枢神经系统中可能发挥着重要的作用。　　图3|不同小鼠组织的大规模瓜氨酸组分析。a，不同小鼠组织中已鉴定的瓜氨酸化蛋白和瓜氨酸化位点的数量。 b，本研究中鉴定的瓜氨酸化位点与 UniProt 数据库中报告的位点比较。 c，每个鉴定的瓜氨酸化蛋白质的瓜氨酸化位点数量分布。d，本研究中确定的瓜氨酸化位点与 UniProt 数据库中关于髓鞘碱性蛋白的瓜氨酸化位点的比较。e、f，在髓磷脂碱性蛋白 R157Cit (e) 和 R228Cit (f) 上鉴定的两个瓜氨酸化位点的示例串联质谱图。g，鉴定的瓜氨酸化肽的序列。瓜氨酸化位点位于中间的“0”位置。字母的高度表示每个氨基酸在特定位置的相对频率。 h,i，使用 Metascape 生成的热图显示不同小鼠组织中显着丰富的(p 值 0.01)细胞成分 (h) (KEGG) 通路 (i)。　　为了进一步拓展该方法的实用性，作者应用了二甲基化亮氨酸(DiLeu)等重标记策略，第一次实现了对瓜氨酸化进行高通量的定量研究。作者首先使用瓜氨酸化标准肽段进行测试，证明在优化反应条件下DiLeu标记和生物素硫醇标记反应可以分步进行而不互相干扰(图 4B，4C)。同时，将标准肽段按照已知比例进行4-plex DiLeu标记并混合，再进行生物素硫醇标记和瓜氨酸化分析，结果显示了非常好的定量准确性(图5)。作者进一步优化了运用该方法在复杂生物样品中进行定量分析的实验方法，并且证明此方法依然可以实现极佳的定量准确度和精确度(图6)。　　图4|瓜氨酸化标准肽段测试DiLeu标记和生物素硫醇标记分步反应的特异性和效率　　图5|瓜氨酸化标准肽段测试DiLeu标记和生物素硫醇标记定量分析的准确性　　图6|复杂生物样品测试DiLeu标记和生物素硫醇标记定量分析的准确度和精确度　　作者接下来应用该方法对DNA损伤中瓜氨酸化的作用进行了研究。作者在MCF7细胞中用三种方法造成了DNA损伤，并定量分析了蛋白质瓜氨酸化的变化。作者一共鉴定到63种瓜氨酸化蛋白以及其包含的78个瓜氨酸化位点，并发现三个实验组中的瓜氨酸化表达相比于对照组呈现出非常不同的趋势(图7A)，这一结果表明瓜氨酸化在不同类型的DNA损伤模型中具有差异性的作用。通过对实验组中显著变化的瓜氨酸化蛋白进行生物过程网络分析，作者发现瓜氨酸化主要对DNA代谢，蛋白结构变化，翻译以及DNA修复等过程进行调控(图 7B，7C)。该实验结果表明蛋白瓜氨酸化对DNA损伤以及相关发病机理具有非常重要的作用。　　图7|高通量定量分析研究瓜氨酸化在DNA损伤中的变化及作用(来源：Anal. Chem.)　　小结　　本文章介绍了一种生物素硫醇标签的设计和开发，该标签可与瓜氨酸化肽段发生特异性反应并极大地提高了瓜氨酸化的富集和检测效率。在使用标准肽和重组蛋白证明该方法的有效性后，作者进一步优化了从复杂生物样品中检测瓜氨酸化的实验过程。通过此方法对小鼠五个大脑区域和六个身体器官的蛋白质瓜氨酸化进行分析，作者鉴定出432个瓜氨酸化蛋白以及691个瓜氨酸化位点，这是迄今为止最大的数据集。该研究揭示了这种翻译后修饰可能在神经系统中发挥的关键作用，并表明它们在包括呼吸和糖酵解在内的许多代谢过程中也可能发挥着重要作用。总的来说，实验结果表明蛋白质瓜氨酸化在不同组织中具有广泛分布并参与各种生物过程，这扩展了目前对蛋白质瓜氨酸化生理作用的认知和理解。此外，作者进一步拓展了此方法的实用性，通过应用DiLeu等重标记策略第一次实现了瓜氨酸化的高通量定量研究，并利用这一方法揭示了瓜氨酸化在人体细胞DNA损伤及修复过程中的重要作用。更重要的是，该方法可以提供一种普适、简单而强大的检测方法来明确鉴定蛋白质瓜氨酸化，这也将启发和有益于未来对这种翻译后修饰在生理和病理条件下的功能作用的研究。　　相关研究成果近期发表在Analytical Chemistry上的两篇文章中, 通过生物素硫醇标签辅助质谱法对蛋白质瓜氨酸化进行全局分析文章的共同第一作者是威斯康星大学麦迪逊分校博士生石亚涛，李子辉，王斌，并与中国药科大学叶慧教授课题组合作 应用二甲基化亮氨酸等重标记策略进行蛋白质瓜氨酸化高通量定量研究文章的第一作者是威斯康星大学麦迪逊分校博士生李子辉，两篇文章通讯作者为李灵军教授。更多关于李灵军教授研究团队的最新研究进展欢迎登陆课题组网站：https://www.lilabs.org/

基因转录产生的mRNA前体可以通过可变剪接产生不同的mRNA剪接异构体，这些mRNA可以翻译成序列不同的蛋白质，即蛋白质异形体。蛋白质异形体与许多疾病的病理机制密切相关，如癌症、多发性硬化症、心肌肥大、自身免疫病、糖尿病等，蛋白质异形体还被用作生物标志物和疾病治疗的靶标1，因此，开展针对蛋白质异形体的研究有着重要意义。蛋白质异形体的发现、注释与验证是其功能研究的基础，得益于高通量转录组深度测序技术以及可变剪接分析技术的迅速发展，人类基因组编码的蛋白质异形体已经得到了较充分的注释，但由于大多数基因都有一个主要的编码产物，而与疾病发生和蛋白功能调节密切相关蛋白质异形体往往表达量较低，所以，一部分低丰度的蛋白质异形体仍然可能没有被注释。　　近日，北京大学医学部精准医疗多组学研究中心黄超兰团队针对蛋白质新异形体的鉴定开发了整合新连接肽段鉴定策略的蛋白质基因组学分析流程，并应用于深度覆盖的人蛋白质组质谱数据集的分析，成功发现并验证了分别来自2个功能重要的基因NHSL1(编码NHS样蛋白1)和EEF1B2(编码真核翻译延伸因子eEF1B的亚基eEF1β)的3个新蛋白质异形体。该研究以“Proteogenomics integrating novel junction peptide identification strategy discovers three novel protein isoformsof human NHSL1 and EEF1B2”为题于2021年8月21日线上发表在Journal of Proteome Research期刊上。　　本研究首先聚焦了“新连接肽段”这一概念，即被内含子分隔开的新外显子和已注释外显子共同编码的肽段，新连接肽段可提供关于新可变剪接位点的信息，对于鉴定新蛋白质异形体至关重要。目前从质谱数据中挖掘新蛋白质异形体，主要是通过搜索转录组数据的三框翻译库。由于漏注释的蛋白质异形体往往缺少已知转录本和同源蛋白，传统的基于全基因组六框翻译库的蛋白质基因组学策略不能鉴定到新连接肽段，无法获知新可变剪接位点。因此，研究者首先提出了一种鉴定新连接肽段的策略，基本思路为：①假设一个基因可以编码一个新的蛋白质异形体，那么就意味着该基因中存在一个新的蛋白质编码区(CDS)，这个CDS的具体位置是未知的，它可能出现在任意一个已注释CDS的5’端或3’端 ②通过理论酶切的方式枚举所有可能的由新CDS与已注释CDS共同编码的新连接肽段，对于枚举出来的新连接肽段，由新CDS编码的氨基酸序列是未知的，用“X”表示 ③对所有的人类已注释基因都做同样的处理，从而构建一个理论新连接肽段数据库 ④对质谱数据集，采用多参数下的从头测序获取每张二级谱图的所有候选肽段，用以与理论新连接肽段数据库进行匹配，如果候选肽段在理论新连接肽段数据库中存在，那么它就被认为是该谱图对应的可能的连接肽段 ⑤通过这种方式，可以将质谱数据中存在的所有可能的连接肽段枚举出来，然后可加入到已注释蛋白质组数据库中进行搜库，以进一步排除假阳性结果，鉴定高可信新连接肽段 ⑥新连接肽段的来源分析，溯源新可变剪接位点。作者已将上述策略写成自动化软件CJunction，并上传至GitHub (https://github.com/CProteomics/CJunction)，供广大读者直接使用。 　　图1. CJunction枚举质谱数据中可能存在的新连接肽段的原理图随后，研究者建立了针对新蛋白质异形体发现的整合新连接肽段鉴定策略的人蛋白质基因组学分析流程，并应用于一组深度覆盖的HeLa质谱数据集的分析，成功鉴定并验证了1个新连接肽段和2个由外显子单独表达的新肽段。通过生物信息学分析，最终发现并验证了分别来自2个基因NHSL1和EEF1B2的3个新的蛋白质异形体，依次命名为：NHS-like protein 1 isoform X15、NHS-like protein 1 isoform X16和elongation factor 1-beta isoform X2。值得注意的是，上述2个基因的新蛋白质异形体相较经典的编码产物分别有一个96个氨基酸和60个氨基酸长的新N端，这种序列差异暗示它们可能发挥着重要的不同功能，值得进一步探究。本文所提出的策略可应用于更多深度覆盖的蛋白质组质谱数据集中，未来有助于发现更多新的蛋白质异形体。　　图2.基因NHSL1表达的新蛋白质异形体的鉴定　　北京大学医学部精准医疗多组学研究中心、北大-清华生命科学联合中心黄超兰教授为本文的通讯作者，北大-清华生命科学联合中心博士研究生何崔同为本文的第一作者。　　原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jproteome.1c00373

胰蛋白酶消化，质谱法轻松鉴定蛋白质，已经是非常成熟的工作流程。即使是刚接触MS的使用者也可以很快掌握。在质谱法鉴定蛋白的工作流程中，蛋白质鉴定是通过使用搜索引擎，例如 Mascot或Matrix Science进行简单的数据库搜索来实现的。然而，对于数据库中未列出的蛋白质鉴定需求，或需要进行蛋白质末端序列分析的这两种情况，通常采用更昂贵的高端仪器和更复杂的工作流程，需要熟练的操作员。此外，蛋白质测序仪也通常用作蛋白质末端序列分析的方法，但遇到 N 端封闭的蛋白质，去封闭是必要的。作为样品序列分析前的预处理，预处理效果取决于蛋白质类型，可能效果不佳，对操作人员有一定要求，需要一定程度的技能和经验，这些可能会限制其使用。 近年来，利用MALDI-TOF离子源（ISD：In-Source Decay）中发生的蛋白质碎裂离子，可以分析N末端被封闭或未在数据库中登记的蛋白质序列MS图谱。此外，ISD理论上不受每个样品质量的限制，因此无需胰蛋白酶消化即可直接对高质量蛋白质进行测序。结合电泳胶提取蛋白和岛津台式机MALDI-8020，通过N端封闭蛋白的分子量测定和序列分析的例子，让我们来了解下大蛋白分子直接测序技术MALDI-ISD。 将模型样品N 端被乙酰化的牛碳酸酐酶 (Sigma-Aldrich)溶解在缓冲溶液中进行电泳， 95 °C 下加热 5 分钟，然后在聚丙烯酰胺凝胶（ATTO 12.5 %，预制 e-PAGEL）上进行电泳。所得聚丙烯酰胺凝胶用考马斯亮蓝染色以检测蛋白质斑点。使用含有表面活性剂的提取缓冲溶液，我们从凝胶分离的碳酸酐酶的条带中提取蛋白质。使用氯仿/甲醇在提取缓冲溶液中沉淀蛋白质以去除表面活性剂和盐，并使用 MALDI-TOF 质谱仪进行测量。芥子酸用作 MALDI 基质用于蛋白质分子量测量，1,5-二氨基萘 (DAN) 用于 ISD 的序列分析。 图1、碳酸酐酶电泳图图2、从凝胶中提取的碳酸酐酶MS图（基质芥子酸） 接下来，从25 pmol凝胶蛋白条带中提取碳酸酐酶，与基质DAN混合，MALDI-8020线性模式进一步分析。结果如图3所示，主要检测到c离子（从蛋白质N段产生的片段）质量一致的峰。通过使用免费软件Mass++ TM和蛋白质氨基酸序列比对工具Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)，我们对从检测到的峰中获得的氨基酸序列进行了同源性搜索。 图3、MALDI-ISD鉴定结果 鉴定结果显示匹配结果最高的是碳酸酐酶。通过检测到的c离子片段质量和数据库中已有的碳酸酐酶氨基酸序列，我们可以推断出N段序列是SHHWGYGKH...，并且是N-乙酰化的。 MALDI-8020线性模式MALDI-ISD技术，无需复杂的工作流程，无需胰蛋白酶消化即可直接对高质量蛋白质（如本文所述m/z 29030示例）进行N端测序。 该方法在岛津应用专家与美国佛罗里达州立大学、日本爱媛大学高级研究支持中心生物医学分析部、利物浦大学生化与系统生物学系等共同发表的一篇文献中也有应用到。PEPPI-MS基于聚丙烯酰胺凝胶的预分馏，实现质谱法鉴定完整蛋白或蛋白复合物。凝胶分离回收14种人血清蛋白，提取后，用MALDI-8020的MALDI-ISD产生的产物离子鉴定人血清白蛋白N端氨基酸序列。 MALDI-8020是岛津MALDI家族一款体积小巧，性能卓越的特色产品。荣获2018 IBO工业设计大奖银奖。 主要特点：● 线性台式MALDI-TOF● 200Hz固态激光器，355nm波长● 进样速度快● TrueClean™ 自动源清洁功能。配备大口径离子光学系统，使仪器长期使用中源的污染风险降到最低。配备基于紫外激光器的源清洁功能，可自动快速实现源自清洁。● 静音（参考文献：岛津应用新闻 No.B83J. Proteome Res. 2020, 19, 3779−3791

蛋白质组学是指在大规模水平上以蛋白质的生物多样性为基础，研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律、蛋白质翻译后修饰以及蛋白与蛋白之间相互作用等，从而揭示疾病发生、发展和药物治疗相关的规律与机制。随着质谱技术以及色谱与质谱联用技术的快速发展，蛋白质组学分析技术在未知蛋白质的鉴定、蛋白质结构的解析、靶向蛋白质定量、以及生物技术药物研发、质量控制和体内药代动力学研究方面应用越来越广泛。药典委拟制定《中国药典》蛋白质组学分析方法及应用指导原则，并于2024年2月20日发布公示稿（详见附件）并征求意见。该指导原则适用于蛋白质组学在蛋白质组成及其变化规律、蛋白质翻译后修饰以及蛋白与蛋白之间相互作用方面的分析研究，规范蛋白质组学分析方法建立，分析过程质量控制和数据分析，确保蛋白质组学分析结果的重复性与可靠性。蛋白质组学分析方法需要具备实用性强、多肽和蛋白的检测特性好以及合适的质控过程，保证分析结果的可靠性。同时蛋白质组学在操作过程中能够处理大量样品。蛋白质组学分析基本流程主要包括：1. 蛋白样品的提取，变性还原，酶解与多肽分离富集；2. 多肽的分析与鉴定；3. 数据分析。分离和富集技术：凝胶电泳和色谱技术分析与鉴定技术：质谱、二维凝胶电泳、X射线分析、核磁共振波谱和透射电子显微镜技术附件： 蛋白质组学分析方法及应用指导原则草案公示稿（第一次）.pdf

赛默飞世尔科技，世界领先的服务商，于2008年1月29日宣布将在其BioWorks™ 软件中整合入Matrix Science’s Mascot™ 蛋白鉴定搜索技术。源于华盛顿大学的SEQUEST® 搜索算法（BioWorks软件成分之一）和Mascot技术是蛋白质鉴定和转译修饰(PTM)领域两种最为广泛接受的搜索引擎技术。此次两种搜索技术的整合将为用户提供更可靠的鉴定结果，两种技术的搜索信息互为补充、交叉验证。研究表明，不同的搜索引擎技术匹配于不同的质谱，使得了出现大量重复的分析结果，而不同的搜索技术也能特有地鉴定表征某些蛋白质。在一个软件平台中整合入两种搜索技术，将为蛋白质的鉴定提供更高的可靠性。此次Thermo Scientific Bioworks平台中整合入SEQUEST和Mascot技术，大大增强了质谱数据查询平台的灵活度，切合用户的需求。 Matrix Science总裁John Cottrell先生表示：“我们很高兴赛默飞世尔科技为他们的用户提供了购买Mascot以完善仪器和软件平台的机会。”Thermo Fisher Scientific蛋白质组学市场总监Andreas Hühmer先生表示, “我们致力于为已经选择我们优质仪器平台的用户提供最大的分析灵活度，使用户可以使用他们喜欢的某种技术，也可以结合两种技术的分析结果扩大他们的蛋白鉴定覆盖范围。 欲了解Mascot, 请登陆www.matrixscience.com. 欲了解BioWorks软件更多信息，请登陆： www.thermo.com/bioworks. 关于ThermoFisherScientific（赛默飞世尔科技，原热电公司） 　　Thermo Fisher Scientific（赛默飞世尔科技）（纽约证交所代码：TMO）是全球科学服务领域的领导者，致力于帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。公司年销售额超过90亿美元，拥有员工约30000人，在全球范围内服务超过350000家客户。主要客户类型包括：医药和生物公司，医院和临床诊断实验室，大学、科研院所和政府机构，以及环境与工业过程控制装备制造商等。公司借助于ThermoScientific和FisherScientific这两个主要的品牌，帮助客户解决在分析化学领域从常规的测试到复杂的研发项目中所遇到的各种挑战。ThermoScientific能够为客户提供一整套包括高端分析仪器、实验室装备、软件、服务、耗材和试剂在内的实验室综合解决方案。FisherScientific为卫生保健，科学研究，以及安全和教育领域的客户提供一系列的实验室装备、化学药品以及其他用品和服务。赛默飞世尔科技将努力为客户提供最为便捷的采购方案，为科研的飞速发展不断地改进工艺技术，提升客户价值，帮助股东提高收益，为员工创造良好的发展空间。欲了解更多信息，请登陆：www.thermofisher.com .

大家好，本周为大家介绍的是一篇发表在Analytical Chemistry上的文章Charting the Proteoform Landscape of Serum Proteins in Individual Donors by High-Resolution Native Mass Spectrometry1，文章通讯作者是来自荷兰乌得勒支大学的Albert J. R. Heck教授。　　血清中大多数蛋白都是糖基化蛋白，这些糖蛋白对疾病诊断有着重要意义，基于质谱的糖链释放后分析和糖肽分析是目前普遍使用的糖蛋白分析方法，但仍存在一些局限，例如可能遗漏同时发生的翻译后修饰、缺乏对O-糖的研究、遗漏某些糖肽覆盖不到的糖基化位点等。高分辨非变性质谱为完整糖蛋白的分析提供了新的思路，本文开发了一种基于离子交换色谱的分离纯化方法，能够从150μL血清中分离和分析20多种血清(糖)蛋白，质量范围在30-190 kDa之间。　　图1为血清糖蛋白的分离和分析方法。150μL血清首先经过亲和柱以快速去除大量的白蛋白、IgG和血清转铁蛋白等，这一步骤使用的是作者内部制造的机器人，可以加快过柱子的速度。接着血清被送入离子交换(IEX)色谱，使用40分钟的梯度时，大多数蛋白在14-27分钟内洗脱，故作者在13-30分钟内每隔0.5分钟收集一次级分，并将每个级分缓冲液换为乙酸铵溶液，最后进行Thermo Exploris Orbitrap质谱仪分析。　　　　图1.血清糖蛋白非变性质谱分析方法　　作者使用该方法分离了大约24种血清蛋白，并在文中详细介绍了其中4种蛋白的分析过程：α-1抗胰蛋白酶、补体C3、血红素结合蛋白、铜蓝蛋白。　　(1)α-1抗胰蛋白酶(A1AT)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，在呼吸系统的功能中起重要作用，作者使用唾液酸酶和PNGase F确认了蛋白上的糖型，又通过TCEP的还原处理发现大部分血清样品的A1AT都是半胱氨酸化的，也确认了A1AT存在N端截短的特征，综上，作者共统计出了13个A1AT异质体。针对捐献者提供的血清，作者区分出了携带V237A和E400D突变的A1AT蛋白的供体。　　(2)补体C3蛋白在免疫调节过程中发挥作用，在血清中浓度相对较高，分子量为187kDa。与该蛋白共流出的还有两种约137kDa和80kDa的蛋白，在唾液酸酶处理后，只有80kDa的蛋白质量减少很多，证明其存在唾液酸，而C3和137kDa蛋白的糖型上无唾液酸。通过对级分的糖肽分析确定N糖位点在Asn 63和Asn 917。137kDa蛋白鉴定为C3缺失α链后降解而成。　　(3)血红素结合蛋白(HPX)在血清中的主要功能是结合和运输游离的血红素，进行血红素和铁的再循环。非变性质谱显示HPX质量范围在58-63 kDa，而蛋白质主链质量仅50 kDa。本文首次解析了血清HPX的蛋白型谱，证明了4-5个N-糖和1个O-聚糖的存在，共17种独特的糖型。　　(4)铜蓝蛋白(CER)负责在人体内转运大部分的铜，分子量132kDa，每个CER分子可以携带6-7个铜离子。CER在非变性质谱检测后的分子量比理论质量多409±5Da，作者将其归为6个铜离子和1个钙离子的结合所致，并发现了CER完全去糖后失去结合金属离子的能力。　　　　图2.绘制血清糖蛋白组的全貌图。观察到的血清蛋白质量范围为30-190 kDa，浓度范围为0.2-50g/L　　总结：本文开发了一种从少量人血清中分离多种糖蛋白的方法，并通过高分辨非变性质谱表征了蛋白型谱，为蛋白全貌提供完整视图。该方法的优势在于非变性质谱需要的样品处理步骤少，最大程度的还原了蛋白的生理状态，劣势在于目前通过完整质量只解析了20余种蛋白中的8种，后续需要结合自下而上或自上而下的蛋白质组学方法进行辨别。在未来的研究中，作者建议联用分子排阻色谱和离子交换色谱，实现高通量在线血清蛋白分离分析。　　撰稿：英语佳 编辑：李惠琳　　原文：Charting the Proteoform Landscape of Serum Proteins in Individual Donors by High-Resolution Native Mass Spectrometry

临床质谱成为精准医疗新方向临床检验需求的提升不断推动着检验技术的发展。生化、免疫等传统检验技术虽然具有自动化程度高、检测速度快的优势，但是已经不能满足临床对于检验方法灵敏度、特异性、多指标联检等的需求。近年来，临床质谱逐渐进入临床，由于其本身具有高灵敏度、高特异性、多指标联检等的优势，可以提高现有检验项目的精准度，也可以作为生化、免疫技术的有力补充，更好地指导临床诊断，有望成为精准医疗的新方向。所谓临床质谱，是指针对临床上特定分子的检测需求，结合了质谱仪器、试剂、耗材及样本前处理的一整套解决方案的统称。临床质谱技术目前在新生儿遗传代谢病筛查、维生素检测、药物浓度监测、激素检测、微生物鉴定、微量元素检测等多个临床场景应用广泛，主要集中在临床小分子代谢物的定量检测以及蛋白、核酸等大分子的定性检测方面，鲜见对于蛋白标志物的定量检测。MALDI-TOF质谱：临床大分子检测利器临床小分子代谢物的检测主要采用的是三重四极杆串联质谱技术（LC-MS/MS），这也是一段时间内临床质谱的主流技术。随着生命科学的进展，以及质谱技术的发展，能用于蛋白质、多肽、核酸等生物大分子检测的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术越来越受到人们的关注。MALDI-TOF MS的工作原理是用一定强度的激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量，与样品之间发生电荷转移使得样品分子电离。离子在高压电场作用下加速进入飞行管中，小离子飞得快，先到达探测器，大离子飞得慢，后到达探测器，从而得出检测结果。图 MALDI-TOF MS工作原理示意图由于其“软电离”的工作原理，MALDI-TOF MS非常适用于蛋白质、多肽、核酸等生物大分子的检测。临床质谱新高地——蛋白定量质谱目前常用的临床蛋白标志物的检测主要采用化学发光、免疫等方法，这些方法普遍存在依赖于抗体、抗干扰能力差、检测通量低、成本高等问题；串联质谱应用于蛋白质的检测虽然具有灵敏度、准确度、特异性高的优势，但是由于临床样本基质复杂，样本前处理繁琐，较难实现自动化，其对蛋白标志物的检测仍然停留在大规模蛋白标志物的筛选即科研层面，真正能用到一线临床蛋白标志物检验的质谱尚未出现。也就是说，临床质谱的蛋白定量检测目前仍然是一块空白的区域。MALDI-TOF MS在众多质谱中原理较简单、操作简便、对样本要求较低，是最容易实现自动化的一类临床质谱类型，这对于临床质谱的蛋白定量检测而言是一项巨大的优势。然而，上一代的MALDI-TOF MS由于重现性较差（SD＞30%），不能满足临床定量的要求，所以其应用集中在定性检测方面，临床上我们所熟知的微生物质谱、以及近两年热门的核酸质谱都是MALDI-TOF MS在临床上的定性应用场景。随着技术的更新迭代，如今MALDI-TOF MS也能实现临床定量检测应用了。融智生物自主研发的新一代的MALDI-TOF MS平台——QuanTOF新一代宽谱定量飞行时间质谱，通过速度和空间同步聚焦、靶板和离子探测器同时接地、极高频率数据采集等专利技术的改进，首次实现在宽质量范围内（10-1,000,000Da）具有高的检测灵敏度和分辨率，且仪器的重现性达到SD＜5%，完全能够满足临床定量的性能要求。图 QuanPRO蛋白定量质谱解决方案依托于高性能的QuanTOF质谱平台，融智生物正在朝蛋白定量检测方向积极布局，已经推出了包含试剂盒、全自动前处理仪器、质谱仪、数据处理软件在内的QuanPRO蛋白定量质谱全流程解决方案，可以一站式解决临床蛋白定量检测的面临的挑战，为临床疾病蛋白标志物的筛查提供更加快速、准确、经济的新方法。未来，临床蛋白标志物的快速筛查将是QuanTOF除微生物鉴定、核酸检测以外的一个重要的应用领域。

北京蛋白质组研究中心/蛋白质组学国家重点实验室朱云平研究员课题组张纪阳博士等通过建立贝叶斯模型分析“鸟枪法”鉴定蛋白质组数据，大幅提升蛋白质组质谱数据的利用率。相关论文发表在最新一期国际蛋白质组学权威杂志：《分子与细胞蛋白质组学》(Molecular & Cellular Proteomics, MCP)上面，同期杂志还发表了该所姜颖副研究员课题组、钱小红研究员课题组的两篇研究论文，创该刊单期同一单位发文数之最。 　　大规模、高通量的蛋白质组研究产生了海量的数据，其中包含了大量的噪声，而高可靠的数据是进一步生物学分析的基础，故目前的分析方法均采用了过严的标准，但在降低假阳性的同时也人为地造成了数据较高的假阴性及较低的利用率。因此，"在保证高可信度的前提下，最大限度地利用实验数据"一直是蛋白质组学界的追求。"鸟枪法"是目前蛋白质组鉴定中地位最重要、应用最广泛的技术策略。他们基于随机数据库策略、非参概率密度模型和贝叶斯公式，建立了串联质谱数据过滤的多元贝叶斯非参模型。通过标准蛋白和复杂样品的严格考核，表明该模型具有良好的灵敏性和普适性，可将质谱数据的利用率提高10~40%，创本领域最好水平。 　　原始出处： 　　Molecular & Cellular Proteomics 8:547-557, 2009.doi:10.1074/mcp.M700558-MCP200

近日，中国科大生命科学学院、合肥微尺度物质科学国家实验室田长麟教授和清华大学刘磊教授合作，基于蛋白质化学全合成方法制备了不同类型的双泛素蛋白，在特定位点引入光活化交联基团，并成功鉴定高选择性双泛素结合蛋白。相关研究成果以“Chemical synthesis of diubiquitin-based photoaffinity probes for selectively profiling ubiquitin-binding proteins”为题发表在《Angewante Chemie Int. Ed.(DOI: 10.1002/anie.201611659)》上，该文章于2017年2月1日在网上公开发布。　　泛素化修饰是蛋白质翻译后修饰中非常复杂的一类体系，目前发现存在8种多泛素连接方式，分别在泛素蛋白的Met1、Lys6、Lys11、Lys27、Lys29、Lys33、Lys48、ys63等不同位点上接入下一个泛素蛋白。这些不同类型的蛋白质多泛素修饰在细胞自噬、蛋白酶体降解、细胞信号传导及DNA损伤修复等生命活动中执行非常多样的功能。但是，目前针对多泛素蛋白的生物法制备较为困难，导致选择性识别并结合多泛素修饰的蛋白质的了解非常贫乏。近年来，中国科大田长麟实验室和清华大学刘磊实验室通过紧密合作，在蛋白质化学全合成尤其是含有特种标记、翻译后修饰的膜蛋白、蛋白质复合物的化学全合成及组装等方面取得了多项重要突破(Angew Chemie2013,52:9558，JACS2014, 126:3695，Angew Chemie2015, 54:14276， JACS2016, 128:3553等)，并于近期发展了蛋白质泛素化修饰的化学合成技术并应用于含泛素化修饰核小体的冷冻电镜(cryo-EM)结构解析(ChemBioChem2017, 18:176)。这些为基于蛋白质化学全合成制备含有光交联基团的不同类型双泛素蛋白制备和高选择性结合蛋白的质谱鉴定提供了重要基础。　　 含有光交联基团的双泛素蛋白化学全合成及不同类型双泛素特异性结合蛋白的质谱鉴定　　近期，中国科大田长麟实验室、严以京实验室和清华大学刘磊实验室密切合作，应用基于蛋白质化学全合成方法制备了Lys48连接、Lys63连接的双泛素蛋白，并在蛋白质化学合成过程中在Ala46位点上引入不同的光交联基团。通过和标准泛素蛋白结合实验，确认了双泛素蛋白合成的有效性，并优化了光交联基团的反应条件。在此基础上，从哺乳动物细胞HEK293裂解液中通过光激活双泛素蛋白，并应用质谱方法鉴定出多个能和Lys48-连接双泛素、Lys63-连接双泛素结合的蛋白质，为后续进一步分析这些双泛素结合蛋白在细胞自噬、DNA损伤修复等生理活动中的功能机制提供了重要的前期基础。相关工作将为分析其他蛋白质相互作用、细胞中配体-受体发现等重要科学问题提供可靠的方法学手段。　　合肥微尺度物质科学国家实验室、化学物理系博士研究生梁军为该研究工作的第一作者。该研究工作得到了科技部、国家自然科学基金的资助。

沃特世公司（纽约证券交易所代码：WAT）近日在北京成功举办了以“质谱技术在蛋白表征及高级结构中应用”为主题的技术研讨会，吸引了60余位来自国家蛋白质组中心、中国食品药品检定研究院、中国科学院、清华大学、北京大学、军事医学科学院、中国农业科学院等知名高校、科研院所、分析测试平台及生物制药企业等相关领域的研究人员参加了会议。 研讨会的主旨为 “提升国内蛋白表征领域对蛋白高级结构研究的认知”，涵盖三大议题：蛋白药物深度结构表征所需要的质谱技术与生物信息学软件、氢氘交换（HDX）技术及IMS在结构生物学特别是表位学研究、蛋白质相互作用研究领域的最新进展及SONAR技术在蛋白质鉴定和非标记定量蛋白质组学研究中的进展。 会上国际知名学者、日本大阪大学副教授Susumu Uchiyama博士指出，氢氘交换质谱（HDX MS）逐渐成为蛋白质高级结构研究不可或缺的技术，并介绍了氢氘交换质谱技术及其在表位学和蛋白相互作用研究上的具体应用 。同时对其最近发表在Nature Communication上的题为《Haem-dependent dimerization of PGRMC1/sigma-2 receptor facilitates cancer proliferation and chemoresistance》论文的研究成果进行了汇报，获得了与会科研学者的一致高度评价。 日本大阪大学副教授Susumu Uchiyama博士做大会报告 沃特世（Waters® ）总部制药业务部高级市场拓展经理Asish Chakraborty博士对生物制药行业普遍关注的宿主蛋白残余测定进行了报告演讲，并介绍了使用通用型UPLC/MS分析对生物治疗性蛋白质中的HCP进行全面鉴定和定量。此分析方法采用在线二维液相色谱法分离多肽，然后利用高分辨率、高质量准确度的质谱仪进行蛋白质鉴定和定量。另外，Chakraborty博士对当前氢氘交换质谱方案的新进展也作了更新介绍。 沃特世公司总部Asish Chakraborty博士做大会报告 来自沃特世亚太区的高级科学家陈熙博士作了题为“非变性质谱技术及IMS行波离子淌度质谱技术在蛋白质高级结构研究上的应用进展”的精彩报告，介绍了行波离子淌度高分辨质谱技术在生物药分析上的最新应用进展，成熟的行波离子淌度分离技术为常规高分辨质谱增加了更多一个维度的分离能力，在蛋白质药物常规结构表征如二硫键错配、氢-氘交换质谱技术进行蛋白质药物高级结构和动态变化研究以及HCP(宿主细胞蛋白)残留的鉴定和定量上发挥着重要作用。 沃特世亚太区高级科学家陈熙博士做大会报告 沃特世中国应用科学家殷薛飞博士作了 “最新DIA质谱技术-SONAR在非标记定量蛋白质组学研究中的应用”的报告。殷博士介绍的 SONAR数据采集模式于今年9月发布，科学家们只需执行一次进样即可完成更准确的定性和定量分析，对复杂样品中脂质、代谢物和蛋白质的定量和鉴定，可免去采用MS/MS方法分析时通常需要额外进行方法开发的麻烦。 大会还邀请了来自美国Genentech的蛋白质化学部科学家甘雨田博士分享了她运用蛋白质组学思路进行生物药物研究开发的思路与实践，甘博士还介绍了她今年8月发表于Nature Biotechnology上的ISDetect快速自动蛋白末端质谱检测法，引起与会人员的强烈兴趣。 会议最后 ，沃特世中国生物制药高级经理宋兰坤女士作了“LC/MS平台化方案助力生物药研究开发”的报告，并对会议进行了总结。宋经理说：“质谱技术是蛋白质研究中不可取代的工具，其在蛋白质常规表征及高级结构研究中均有很好的应用方案及研究文献, 为揭示生命科学的奥秘发挥着越来越重要的作用。作为全球生物制药领域解决方案顶尖供应商，沃特世公司为生物药物产业界及蛋白质研究相关科学领域提供先进的仪器和技术。希望本次会议的议题可以激发与启迪科研工作者的思路，为生物药物产业的从业人员搭建一个学术讨论与经验分享的平台。 会议同期展出的蛋白科学研究先进生物技术墙报

p 　　用于生物样品分析的蛋白指纹法，该专利技术被国际顶级科学杂志《科学》以及医学界权威杂志《柳叶刀》评为世界蛋白指纹图谱和蛋白质芯片排名第一的技术。针对这项技术的一些问题，火石创造对许洋博士进行了深度的专访。 /p p style=" text-align: center " img width=" 300" height=" 385" title=" 001.png" style=" width: 300px height: 385px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/ebf3be8e-c0c2-49d6-9891-a76d207d183f.jpg" border=" 0" vspace=" 0" hspace=" 0" / /p p style=" text-align: center " strong 　　许洋博士 /strong /p p 　　许洋博士一直致力于蛋白质组学研究开发，怀揣近五十项蛋白分子质谱诊断技术的自主发明专利。2009年他创办了湖州赛尔迪生物医药科技有限公司，凭借专利产品蛋白指纹图谱仪成为行业领头羊，也成为此类器械行业标准的起草者。 /p p strong 　　火石：请问您为什么做蛋白质谱? /strong /p p 　　许洋博士：我研究蛋白质谱是偶然也是必然。在美国纽约著名的Sloan-Kettering研究所单克隆抗体实验室早期研究治疗白血病时，我们制造了全世界第一枚人源化单克隆抗体(抗CD33人源化单抗)。后来我又和顶尖美国公司合作第一个将人源化单克隆抗体做成了靶向药。有了扎实的基础，必然能在更窄的蛋白质谱领域做的更好。 /p p 　 strong 　火石：蛋白质谱当前的临床应用情况如何? /strong /p p 　　许洋博士：只有拿到医疗器械注册证才算进入临床，蛋白质谱目前只有三种临床应用：对肿瘤的筛查 对早期肾脏疾病的分析 在细菌上的鉴定应用。蛋白质谱在国内仍处于非常早期的阶段，且具有垄断性，极少人能做且在做。 /p p strong 　　火石：作为国家“千人计划”医疗器械特聘专家，您认为蛋白指纹图谱仪在医疗器械中的角色是什么? /strong /p p 　　许洋博士：蛋白指纹图谱仪分析的大数据可以生动地比喻为人体疾病的健康地图。 /p p 　　蛋白指纹究竟是什么?把质谱仪的显示屏中的每一个蛋白质都用一个分子量来表达，这些分子量组合起来就叫蛋白指纹。就像每个人的指纹都是不同的，每种疾病的特定蛋白质表达物也不同，称之为指纹图谱。蛋白指纹图谱技术是由蛋白质芯片及分析仪器——表面加强激光解析电离飞行时间质谱仪两部分组成，可以将病人血清中蛋白质成分的变化记录下来，绘制成蛋白指纹质谱图，并显示样品中各种蛋白的分子量、含量等信息。将这张图谱与正常人、某种疾病病人的谱图或基因库中的谱图进行对照，就能最终发现和捕获新的特异性相关蛋白及其特征。这种方法具有微量、精确、简易、快速的特点，适应于基础和临床等各个领域。 /p p 　　之所以将蛋白指纹图谱仪分析的大数据比喻为人体疾病的健康地图(MAP)，是因为既然β2—微球蛋白是11731、人绒毛膜促性腺激素是37580、转甲状腺素蛋白是13761(数字对于计算机的应用更好管理)，而每个蛋白质在质谱仪分析中都是数字，它本身就是大数据。任何物质在质谱底下都是数字，综合起来就是大数据。我把大数据串联起来，就能将分子在身体的MAP做出来。譬如一位吸烟的男士来体检，能发现他吸了烟数年之后肺部出现影像学病理性位点，结合质谱仪分析发现相关的疾病标志物，我们能够模拟出肺部疾病的健康地图，即通过质谱仪检测的健康大数据，可以模拟出该患者肺部出现了数个小红点，点击每个红点后都会解释原因，如显示铅、铬等数据是否超标，以及告诉你相应的对策。这样的技术开启了全智能健康4.0时代。 /p p 　　Tips：β2—微球蛋白(β2—MG)被认为是诊断早期肾功能损伤的敏感指标，尤其对于糖尿病肾病、高血压肾病、红斑狼疮肾炎的早期诊断具有重要参考价值，因此β2—微球蛋白的测定在临床上是有多种价值的。 /p p 　　 strong 火石：您和您的团队在蛋白质组学研究的技术或者方法上有什么突破吗? /strong /p p 　　许洋博士：蛋白质作为标志物对肿瘤的诊断，确实没有太大的进展。 /p p 　　一直以来蛋白质组学研究面临的重大瓶颈是蛋白质分离问题：人体内有十万种蛋白质与衍生物，多数可能与疾病有关联，但这十万种蛋白质与衍生物只有分开后，质谱才能分析清楚。此前蛋白质组学技术中最流行、最通用的蛋白质分离方法是双向电泳，基本上能分离近二千种血浆蛋白质，远远不及十万种，所以成为了瓶颈。 /p p 　　2006年我提出了一个设想：和蛋白有关的抗体至少有一万多种，那为什么不用抗体来分离蛋白质?这件事一直有人在做，但之前都没有人想到用抗体组把一千个蛋白质一次性快速、实时地分离出来。之后就诞生了免疫质谱分析方法(专利号ZL 200610140652.0)，可以在一个抗体组基质上同时捕获多个生物标志，并对捕获的变异的或修饰的生物标志进行质谱精确分析，还可以同时检测多个生物标志群。用免疫组质谱技术能测定抗原变异片段的分子量。另外，还可以将多种疾病特异性抗原的抗体同时标在一个基质点上。 /p p 　　Tips:免疫质谱分析方法：质谱与抗体分离技术联合应用即为免疫组质谱(Immunomic mass spectrometry，IMS)。免疫组质谱检测为一组多种(类)抗体与质谱联合来精确地鉴别变异或修饰生物标志群的方法。在一个抗体组基质上同时捕获多个生物标志，并对捕获的变异的或修饰的生物标志进行质谱精确分析。可以同时检测多个生物标志群(biomarkers)。 /p p 　　双向电泳(Two-dimensional electrophoresis)：是一种等电聚焦电泳与SDS-PAGE相结合，分辨率更高的蛋白质电泳检测技术。目前是快速成长的蛋白质组学技术中最流行最通用的蛋白质分离方法。目前2D-PAGE能够在同一块凝胶上同步检测和定量数千个蛋白质。 /p p 　　从整个2015年的政策看，医疗器械行业是受到国家大力扶持的，行业地位与重要性大幅提升，法规向国际化看齐，行业监管不断趋严，医疗器械正成为与药物齐头并进的新兴产业。 /p p 　　 strong 火石：是什么驱动着行业的高增长? /strong /p p 　　许洋博士：一是需求，老龄化加剧，家庭支付能力增强，导致医疗需求高增长 二是政府加大医疗卫生投入，《医疗器械科技产业“十二五”专项规划》表示，“十二五”期间将扶植形成8～10家产值超过50亿元的大型医疗器械产业集团 三是为配合新医改完善基层医疗建设的目标 四是国内生物技术研发应用进入突破期。 /p p 　　 strong 火石：您认为接下来医疗器械未来发展的特点和前景会是怎么样的? /strong /p p 　　许洋博士：未来5年，医疗器械和制药占比将会达到1:1。近十年，我国医疗器械市场规模快速增长，国内医疗器械工业总产值从2003年的189亿人民币上升到2013年的1889亿，2013年同比增长21%，增长速度远快于药品。预计在未来5年左右，我国医疗器械行业仍然将保持高速增长。医疗器械行业涉及到医药、机械、电子、塑料等多个行业，中高端医疗器械更是多学科交叉、知识密集、资金密集的高技术产业，研发成本高，决定了只有大型厂商才能在大中型医疗器械方面有所作为。此外，器械“国产化”也会成为必然趋势。 /p p 　　 strong 火石：赛尔迪当前开展的业务、研发的产品有哪些?公司部署战略是怎么样的? /strong /p p 　　许洋博士：我们现在正在做一张人类的大健康MAP。通过精准医疗计划，基于环境健康大数据，通过蛋白指纹图谱仪完成健康管理。现在的疾病市场最关注的问题分别是：检测0～6岁儿童智力、优生优育(为什么生不出聪明宝宝)、高达5千万的肿瘤人群以及3.5亿的高血压、糖尿病人群。 /p p 　　其中糖尿病肾病是糖尿病最常见且严重的并发症之一，是糖尿病所致的肾小球微血管病变而引起的蛋白排泄和滤过异常那个渐进性肾功能损害。而微量白蛋白尿即早期糖尿病肾病是可逆的，这不同于大量白蛋白尿即临床糖尿病肾病，因此积极防治早期糖尿病肾病就显得尤为重要。去年底，赛尔迪公司与中国医学科学院北京协和医院签署协议，承担国家对糖尿病肾病体内铅、镉毒素的临床大样本检测。全新升级的蛋白指纹图谱仪，是目前唯一获国家药监局批准、能检测含微量白蛋白、β2—微球蛋白以及泛素3项指标的医疗器械。这对糖尿病肾病的早发现、早治疗具有重大意义。 /p p 　　赛尔迪接下来将按照个体化精准检测所附带的信息，由这些信息与大数据库交流，提出符合个体化治疗的方案，向个体化精准医学管理方式转变。 /p p 　　随着大数据时代的来临，“互联网+”概念的提出让医疗健康事业呈现出了新的发展势态和特征。医学知识体系正被大数据、精准医疗所重构，信息化进程提高了知识传递速度与医疗协同效率。 /p p strong 　　火石：蛋白质组学技术如何助推精准医疗? /strong /p p 　　许洋博士：常识知道铅、镉会引起糖尿病性肾病。但铅、镉指标不是医院常规检测的项目。如果采取个体化精准治疗，每年常规检查一次体内铅与镉的指标，发现异常就能进行针对性的从尿液排泄的治疗。已经得了肾病正在透析的病人，检测铅与镉指标后进行针对性排泄也会增强治疗效果。利用蛋白指纹图谱仪能够发现早期的肿瘤和心血管标志物，这就会对疾病的治疗带来极大的希望。随着质谱技术在精准医疗的应用，越来越多的个体化标志物将会被发现，人体的蛋白指纹图谱测定将会成为医院的常规工作。 /p p 　　精准医疗，即考虑每一个体健康的差异，制定个性化的预防和治疗方案。正确的选中一个工具，解决关键问题，这就是精准医疗。基于基因组测序技术、生物医学工具以及大数据工具逐步成熟和完善，精准医疗能够为个体基因特征、环境以及生活习惯进行疾病干预及治疗，但如何尽快与大数据结合才是发展重点。日前我与北京协和医院合作，创立了中国特色的首个百万人疾病与环境毒素数据库与IMS(爱睦世)特检中心：HZIMS2008，首次在复杂疾病系统中构建了基于环境毒素大数据的移动网络数据库的质量控制体系，使我国重大疾病，如高血压、糖尿病、肿瘤的大数据病因学研究处于世界领先。 /p p /p

p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " strong 仪器信息网讯 /strong & nbsp span style=" text-indent: 2em " 2020年，美国质谱学会（American Society for Mass Spectrometry, ASMS）将质谱界内“最高荣誉”之一的Biemann奖章授予了威斯康星大学麦迪逊分校的葛瑛教授 （https://labs.wisc.edu/gelab/），以表彰其应用基于高分辨率质谱的top-down蛋白质组学技术在心脏疾病研究领域所做出的重大贡献。该奖项是对质谱先驱—Klaus Biemann教授的纪念，表彰获奖者个人在其学术生涯的早期就在基础和应用质谱领域获得显著成就，因此该奖项的获得者均为中青年的杰出科学家。 strong Biemann奖章自1997年颁布以来共授予了24位科学家，作为2020年的奖项获得者，葛瑛教授既是该奖项自颁布以来的第七位女性科学家，也是该奖项历史上第三位获得此荣誉的华人学者。 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 葛瑛本科毕业于北京大学化学学院，毕业后赴美国康奈尔大学攻读博士学位。她基于top-down的蛋白质组学研究也起始于博士求学期间，彼时她师从Fred W. McLafferty，后者提出了著名的 strong 麦克拉弗蒂重排反应 /strong ，也被喻为质谱界泰斗。葛瑛在博士毕业后做出了一个与多数科研学者不同的抉择，她决定先加入美国惠氏制药(后并入辉瑞制药公司)从事药物研发工作，这段工作经历需要她与不同研究领域的工作者合作完成研究内容，也让她切身感受到了交叉学科研究模式的可行性和高效性，更为她日后赴任高校开启交叉学科的研究之路“凿”开了一道光。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 葛瑛团队突破了传统化学、生物学和医学的界限，利用高分辨质谱技术和top-down方法开展蛋白质组学研究，并通过新的方法策略获得了对心脏疾病等病理学研究的新颖洞见。仪器信息网近期采访了这位优秀的女性质谱工作者——威斯康星大学的葛瑛教授，与她进行了深入的交谈，探寻她光环加身的科研成果背后有何奥秘。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 300px height: 450px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/50b38277-e0d1-4e19-92d0-ffef8ecafdd6.jpg" title=" 葛瑛.jpg" alt=" 葛瑛.jpg" width=" 300" height=" 450" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center text-indent: 2em line-height: 1.75em " 威斯康辛大学麦迪逊分校细胞与再生生物系及化学系教授 葛瑛 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 以质谱为中心的技术开发 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 翻译后修饰的蛋白质(PTMs)在许多关键细胞中发挥着重要作用，因此对蛋白质组进行全面的分析，对于解释分子作为一个系统如何相互作用，以及了解细胞系统在健康和疾病中的功能至关重要。当前蛋白质组学的质谱分析主要有bottom-up(自下而上)和top-down（自上而下）两种方法，Bottom-up是传统的手段，它将蛋白质的大片段混合物消化/酶解成小片段的肽后再进行分析，是在蛋白质组学的研究中广泛使用的一种质谱技术，但该方式无法取得与PTMs之间相关联系的信息。而Top-down技术则不再需要酶切的过程，可以直接对完整的蛋白——包括翻译后修饰蛋白以及其它一些大片段蛋白测序，而非仅仅针对多肽，这就使得与翻译后修饰相关的信息能最大程度的保存下来。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 基于top-down质谱技术的蛋白质组分析是表征完整蛋白质组的新兴手段，它可以对来自于全细胞或组织裂解液的复杂混合物中的完整蛋白进行快速、灵敏的分析，提供一个系统、定量的蛋白质评估。然而，由于蛋白质组的高度复杂性和动态性，蛋白质组学的分析依然面临着巨大的挑战。比如蛋白质难溶于水、新的蛋白分离纯化方法有待探索以及根据top-down获得的数据来确定蛋白特性和有效翻译后修饰蛋白质的计算机工具十分匮乏等。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 因此葛瑛团队就蛋白质组学分析面临的难题开展了系列研究，首先便是蛋白质溶解度的问题。在蛋白质的分析过程中，为了有效地从细胞或组织中提取蛋白质，提取缓冲液中通常含有表面活性剂，但是传统的表面活性剂与质谱不相容，它们通常存在极大的抑制蛋白质的质谱信号，因此在质谱分析前要先除去表面活性剂。基于此，葛瑛团队创造性地合成了可光降解的表面活性剂Azo，Azo的功能与常规表面活性剂非常相似，但却在表面活性剂分子的中间加入了可以通过简单紫外线照射被破坏的化学键。在进行质谱分析之前，可以通过暴露于光来裂解键，这样Azo就会分裂，仅留下蛋白质分子。葛瑛说到：“Azo能够对整个蛋白质进行有效的质谱分析，开辟了研究膜蛋白质的新道路。” /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 其次，针对完整蛋白质色谱分离法并不完善的问题，葛瑛团队发展了一种新型的多维色谱法——在线HIC/MS（疏水性相互作用色谱质谱）分析方法，用于在非变性模式下高分辨率分离完整蛋白，展示了该方法在Top-Dwon蛋白质组分析的潜力。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 不仅如此，针对难以使用质谱检测低丰度蛋白质等难题，葛瑛团队研发了新型纳米材料用于富集蛋白质，实现了利用top-down质谱法富集、鉴定、定量和表征完整的磷酸化蛋白。近日，葛瑛教授团队和威斯康星大学麦迪逊分校化学系金松教授团队合作的研究成果发表于自然子刊《自然· 通讯》，团队开发了基于纳米材料的蛋白质组学新方法，将功能化的超顺磁性纳米颗粒（NPs）与自上而下蛋白组学质谱分析结合，在有效地从血清中富集心脏肌钙蛋白I（cTnI）（cTnI是一种心脏疾病的生物标志物）的同时也能很好的去除血清白蛋白。该研究成果将在蛋白组学研究上得到广泛的应用，有助于揭示cTnI的分子指纹图谱，便于精准医疗研究。 a href=" https://www.nature.com/articles/s41467-020-17643-1" target=" _blank" style=" color: rgb(0, 32, 96) text-decoration: underline " span style=" color: rgb(0, 32, 96) " （原文链接：《Nanoproteomics enables proteoform-resolved analysis of low-abundance proteins in human serum span style=" color: rgb(0, 32, 96) text-indent: 2em " 》） /span /span /a /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 此外，对于top-down数据分析工具开发不足的问题，其团队开发了综合软件工具MASH Explorer软件，实现了不同质谱厂商的数据统一分析，并结合了多种用于反卷积和数据库搜索的算法，以进一步推动top-down蛋白质组学在生物医学研究中的发展。 span style=" color: rgb(0, 32, 96) " （软件免费下载 /span a href=" https://labs.wisc.edu/gelab/MASH_Explorer/index.htm" target=" _blank" style=" color: rgb(0, 32, 96) text-decoration: underline " span style=" color: rgb(0, 32, 96) " https://labs.wisc.edu/gelab/MASH_Explorer/index.htm /span /a span style=" color: rgb(0, 32, 96) " ） /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 在不断钻研的基础上，葛瑛团队进一步将其开发的方法应用于生物医学等问题的研究上，比如在正常和患病条件下建立心脏肌丝蛋白修饰的图谱，探究其调节心脏和骨骼肌收缩力的功能结果，以及利用蛋白质组学和代谢组学等综合研究方法评估干细胞疗法治疗心力衰竭的功效，并了解心脏再生过程中的信号传导机制。她在心脏生物学领域取得了重要发现，例如，其团队确定了心肌肌钙蛋白I的磷酸化和肌动蛋白同工型转换是慢性心力衰竭的潜在生物标记。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 跨界要知己知彼 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 从上文不难看出，葛瑛的研究内容不仅跨越了化学、生物学和医学的传统界限，更创造性地将其在生物化学方面的专业知识与医学相结合，获得了对心脏疾病等病理学研究的新颖见解。“科学界越来越多的人认识到，一个领域内真正的突破，很多时候来自于这个领域之外，来自于其它领域科学家的研究成果。也就是人们经常所说的‘跨界’研究。” 葛瑛说道：“从另外一个‘视角’去解决问题，往往能得出意想不到的结果。” /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 交叉学科很热门，但研究难度也不小。如何克服跨领域探索的挑战？笔者向葛瑛抛去这个问题。结合其自身的经历，在跨领域的学习过程中葛瑛一直积极地、努力地保持着好奇心，在不同的专业领域积蓄知识和力量。葛瑛表示：“随着长期对一个研究方向的不断深入，自然需要不断扩展，我当时进行跨界研究的契机是在加入麦迪逊医学院组建蛋白质中心后，开始有很多机会与生物学家以及医生合作，这就需要我去学习更多的知识，包括阅读其他领域的文献，跨领域沟通研究等等。” /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " “另外，想要真正深入了解一个科研领域，也必须要找到对应的‘圈子’，并且要知己知彼。”葛瑛分享了一段故事：“当我准备利用系统生物学方法深入了解心脏病等研究时，我阅读了上千篇心脏医学的文章，去参加该领域的学术研讨会，不断地扩充我的知识，有一次在一场心脏学会研讨会上，我遇见该领域的一位‘大伽’，并主动上前与他交谈，过程中他提到看过我发表的关于心肌钙蛋白的文章，对我赞誉很高，借那次机会，他推荐了多位医学领域的学者给我认识，也为我后来进行跨界研究提供了资源和平台。这是我认为很重要的一点，跨界，你必须要知己知彼。当然我很幸运能够得到多个领域（质谱，蛋白质组学，色谱 和 心脏学会）的前辈和朋友们的大力支持， 非常感激。” /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 对科学研究来说，跨界是必然的，而当跨界研究的时候找到一个突破口也十分必要。葛瑛的团队是多元化的，既有生物学、化学方向的学生，也有医学方向的学生。围绕课题组的两大主要方向，技术开发和生物医学研究，化学系的学生以发展技术为中心，最终落地到应用上，而生物系的学生以研究一种疾病为中心展开课题。此外，课题组实验室的设置也同样多元化，一层楼里有化学实验室、生物工程实验室和临床实验室，这样的环境也为组内的学生提供了跨界沟通、交流和合作的机会与平台。“我们实验室已经不是单纯的化学实验室或生物实验室，某种意义上我们可以称为‘交叉研究中心’。” /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 采访的最后，葛瑛也表示，不管从事的是化学研究还是生物学研究，最终都是想要解决生命科学的问题，因此质谱技术也好，生物医学应用也好，团队都希望能更好地实现精准医学，最终造福人类。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " br/ /p p style=" text-align: right text-indent: 2em line-height: 1.75em " 采访编辑：万鑫 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " 后记： /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " 当下时代的科学研究已经不仅仅需要培养“标准型人才”，更多的创新成果和研究领域的成长点都发生在领域的边缘或几个不同领域的交界处，因此，越来越需要像葛瑛这样掌握各种知识的研究学者。与此同时，科研学者如果能够自由发挥，把自己培养成“非标准型人才”，也许更利于将来的创新研究。 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" font-family:楷体, 楷体_GB2312, SimKai" 点击图片了解葛瑛团队更多内容： a href=" https://labs.wisc.edu/gelab/" target=" _blank" style=" color: rgb(0, 32, 96) text-decoration: underline " span style=" color: rgb(0, 32, 96) " https://labs.wisc.edu/gelab/ /span /a /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" font-family:楷体, 楷体_GB2312, SimKai" /span /p p style=" text-align: center" a href=" https://labs.wisc.edu/gelab/" target=" _blank" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/a7c8ff9b-cf8b-40b8-bcf2-b2a9d68a1b5a.jpg" title=" 葛瑛团队.jpg" alt=" 葛瑛团队.jpg" / /a /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" font-family:楷体, 楷体_GB2312, SimKai" /span br/ /p

近日美国质谱学会年会（ASMS）上发布的最新数据表明，新的仪器和工作流程极大地提高了基于质谱的血浆蛋白组学实验的覆盖深度和通量。这些进步可使质谱成为各应用领域中更有用的工具，包括血浆蛋白生物标志物的开发以及迄今由Olink和SomaLogic等亲和性平台主导的大规模人群研究。　　血浆是一种易于获取和常用的样本来源，尤其是在临床工作和人群研究中。然而，由于血浆含有大量丰度较高的蛋白质和较宽的动态范围，传统的质谱蛋白质组学分析能力不足。对于细胞裂解物的分析，质谱工作流程可测量8000到12000个蛋白质，但对血浆，类似的工作流程只能测量500到1000个蛋白质。虽然可通过去除丰度较高的蛋白质或进行粗分离来改善这一情况，但这也会牺牲通量。　　去年，瑞士蛋白质组学公司Biognosys在Journal of Proteome Research杂志上发表了一项研究，他们使用赛默飞的Orbitrap Exploris 480质谱仪，通过两小时的液相色谱梯度测量了180个去除了高丰度蛋白的血浆样品中的2732个蛋白质，这是未进行血浆分离处理情况下最高深度的血浆蛋白质组分析。　　最近，蛋白质组学公司Seer推出了一种新的血浆蛋白组学解决方案。该公司的Proteograph系统使用一组纳米颗粒来富集血浆蛋白质，然后可以使用质谱等技术对其进行鉴定和定量分析。与传统的血浆蛋白组学方法相比，Seer系统在覆盖深度和通量上都有所提升。在一份发表于四月BioRxiv预印本的研究中，威尔康奈尔医学院-卡塔尔团队使用该系统分析了345个血浆样本，测量了大约3000种蛋白质，在其液相色谱-质谱法的运行时间下每天可分析大约10个样本。　　根据以上数据，Biognosys分析和Seer系统的覆盖深度都接近于Olink的Explore平台，后者可以在血浆中测量大约3000种蛋白质，但它们仍远远落后于SomaLogic的SomaScan平台，后者可以在血浆中测量大约7000种蛋白质。在每周约70个样本的处理量上，Biognosys和Seer系统的通量仍然落后于Olink和SomaLogic平台，后者每周分别可以处理多达1000个和340个样本。　　ASMS年会上，Thermo Fisher Scientific展示了使用Seer最新发布的Proteograph XT试剂盒在其新的Orbitrap Astral仪器上测量大约6000种蛋白质的数据，每天处理大约30个血浆样本。这些数据标志着血浆蛋白组学工作流程的重大进展，并表明在大规模血浆研究方面，结合Seer Proteograph等血浆富集技术的质谱法与基于亲和性的平台现在可能成为竞争对手。　　剑桥大学临床医学院MRC流行病学单位的生物信息学家Maik Pietzner表示：“坦白说，我们没有预见到这么大的飞跃。”他和他的同事在大规模蛋白质基因组学研究中使用了SomaLogic的SomaScan和Olink的Explore。他指出，根据ASMS展示的数据，“看起来现在似乎变得可行了”，因为他们的研究需要1000个或更大的样本队列。　　华盛顿大学基因科学教授Michael MacCoss还表示，质谱技术具备的覆盖深度和通量使其成为大规模人群研究的有用工具。他说：“像英国生物库（UK Biobank）或弗雷明汉心脏研究（Framingham Heart Study）这样的大型队列……这些样本的价值是巨大的，研究人员希望能够以最少的资源获取最多的信息，很多实验都使用了Olink或SomaLogic。”　　如果质谱技术能够可靠地提供ASMS演示中展示的覆盖深度和通量，它可能成为亲和性平台的有力补充和竞争对手。许多蛋白质存在多种形式，或称为蛋白质变体，其变异包括氨基酸变异、截断或翻译后修饰等，这些变化会影响它们的功能，在亲和性平台上往往不清楚或不确定测量的是蛋白质的哪种变体。质谱方法更适合分析这些不同的蛋白质变体。　　Olink总裁Carl Raimond表示，他认为质谱和亲和性平台是“绝对互补的”，并补充说“看到蛋白质分析领域有创新是非常好的”。然而，他表示在Olink占据领先地位的大规模人群研究中质谱技术近期可能无法成为竞争对手，他同时也质疑ASMS展示的令人印象深刻的数据在广泛应用时是否能够经受考验。他说：“细节决定成败。提出要求很容易，但真正能够实现或提出关于这一要求背后的问题则是完全不同的事情。”Raimond补充说，虽然质谱技术不断改进，但亲和性平台也将不断进步。Olink正在将其Explore平台扩展到约5,000种蛋白质靶点，而SomaLogic计划在今年年底前将SomaScan平台扩展到覆盖约10,000种蛋白质。Pietzner同样表示，虽然在ASMS上发布的数据令人兴奋，但他和他的同事们期待看到更广泛的数据，包括总体的蛋白质覆盖范围，不同蛋白质和肽段在样本中检出的一致性和重复性。他说，“亲和性方法已经应用于规模大于50,000的人群队列中，并带来了惊人的发现。我们需要进行头对头的比较以评估这些新的质谱技术是否能够实现类似的扩展。”　　MacCoss表示，使用质谱进行此类研究的公司或研究人员需要提供数据，证明他们能够在每个样本中一致且可重复地测量一组核心蛋白。他说：“当人们使用Olink时会有一个清单，上面列出了每次都会测到的蛋白质。我们仍然需要这样做。我们仍然需要说，这是每次实验都会返回定量值的蛋白质列表……以及测量中获得高质量分析数值的蛋白。”　　Pietzner表示，他和他的同事目前正在努力扩展他们的蛋白质基因组学研究以包括质谱技术。强生和强生制药公司的神经科学数据科学主管，以及英国生物库药物蛋白质组学项目（PPP）主席Christopher Whelan表示，目前一个规模最大的蛋白质基因组学人群研究项目正在实施基于质谱的蛋白质组学。　　Seer本月宣布推出Seer技术访问中心，该中心将组合其XT试剂盒与Orbitrap Astral质谱仪，为没有质谱仪的用户提供蛋白质组学服务。　　尽管到目前为止很难全面评估Thermo Fisher的Orbitrap Astral和Seer的Proteograph XT的性能，但一些早期用户表示其产生的结果很出色。　　Cedars-Sinai精准生物标志物实验室主任Jennifer Van Eyk一直在使用Orbitrap Astral进行血浆蛋白质分析，在这方面它比先前的仪器有更强的能力。Van Eyk表示，在每天运行60个样本时，新仪器可测得的蛋白质数量是相同工作流程下使用Thermo Fisher的Exploris 480仪器的2到2.5倍。　　她说：“我们不仅可以检测到更多蛋白质，而且可以定量更多蛋白质，并且这些蛋白质是可重复的，也就是说，如果我们运行一个样本五次，我们确实会五次都观察到同样的蛋白。这是一个很大的飞跃。”这台仪器最出色的或许是其高通量，Van Eyk表示，她和她的同事们每天可以运行多达180个的未去除高丰度蛋白的血浆样本并获得良好的数据和深度的覆盖。她说，“在每天运行180个样本的情况下，突然间你可以开始讨论运行10,000个样本，然后它就成为一个人群研究了。”Van Eyk和她的同事目前正在试验Seer Proteograph系统，以“充分测试”其性能，并评估是否要将其作为血浆蛋白质组学工作流程的一部分。　　威斯康星大学麦迪逊分校的生物分子化学和化学教授Joshua Coon指出，他的实验室能够使用50分钟的液相色谱梯度在未处理的血浆中测量大约1,500种蛋白质，并且已经在该仪器上开发出了一种一分钟的直接注射方法，能够在每个样本中测量约200种蛋白质。　　Coon还是SeerProteograph平台的用户，尽管他尚未将其与Orbitrap Astral结合使用。他的实验室一直在使用Seer XT试剂盒分析阿尔茨海默病患者的血浆样本以及长期新冠肺炎（long COVID）个体的样本。他说，尽管他的团队尚未开始处理大批量样本，但在初步工作中，实验室每个样本一致地测量到约3,000种蛋白质，这是不使用Seer系统时的五倍左右。他认为，当研究人员将工作流程应用于Orbitrap Astral系统时，这些数字还会进一步提高。　　除了覆盖深度外，Coon表示，Proteograph对简化质谱样品制备非常有用。他说：“我没有完全认识到到它的自动化程度，它非常方便。现在主要的用户是一个一年级和二年级的研究生……所以他们必须快速学习。他们在处理样本、获得消化产物和肽段方面取得了很大的成功。当你有新人或者长时间不做该工作的人时，进行大规模蛋白质组学研究的样品制备将耗费整个实验一半以上的精力，只需使用该平台然后熟练掌握。”　　尽管Seer Proteograph平台提供的覆盖深度使质谱血浆蛋白质组学在某些应用中与Olink和SomaLogic等亲和力平台更具竞争力，但Seer本身在血浆富集领域面临新的竞争。　　在ASMS会议上，蛋白质组学样品制备公司PreOmics推出了其ENRICH-ist富集血浆和血清蛋白质的试剂盒。该试剂盒使用非功能化顺磁性微珠来富集低丰度蛋白质，据该公司称，与未去除高丰度以及未富集的血浆相比，用该试剂盒处理血浆可将蛋白质检出率从50%提升至100%。PreOmics首席执行官Garwin Pichler表示，微珠与缓冲液的结合可在去除高丰度蛋白的同时富集低丰度蛋白以提高覆盖深度。Biognosys推出了一种新的基于微珠的血浆蛋白质组富集试剂盒，作为其TrueDiscovery服务平台的一部分。据该公司称，这种试剂盒可以高通量定量人类血浆中约4,000种蛋白质。　　此外，在本月，华盛顿大学研究人员领导的团队在BioRxiv预印本上发表了一篇论文，描述了一种使用ReSyn Biosciences的磁性微粒富集血浆蛋白质的方法，其通过结合血浆中的膜结合囊泡并分析相关蛋白质来提高覆盖深度。华大的MacCoss是这篇预印本的通讯作者，该预印本的第一作者Christine Wu也是该富集方法的主要开发者。他们能够在Orbitrap Astral上使用30分钟的液相色谱梯度稳定地定量约4,800种血浆蛋白质，每天可处理约40个样本。在使用一小时的液相色谱梯度时，他们能够测量5,000到6,000种蛋白质。MacCoss他们迄今没有过度挑战该方法的能力，所以这些数字是相对保守的。MacCoss表示，由于Seer公司的技术成本较高，研究人员对于血浆蛋白质组学富集的替代方法很感兴趣。他说：“Seer在制造这些产品方面做得很好，但成本是一个高门槛。”　　维也纳分子病理研究所的蛋白质组学负责人Karl Mechtler表示，他与Seer的讨论中，每个样品的报价大约是600美元。他说：“如果我有100个样品，对于一个蛋白质组学实验室来说，这是一笔巨款。”他指出，对于一个典型的蛋白质组学实验室，一个合适的价格范围应该在每个样品25到50美元左右。Wu表示，使用华大的富集方法进行实验的每个样品成本低于5美元。PreOmics将ENRICH-ist试剂盒作为完整蛋白质组学样品准备工作流程的一部分销售，每个样品总共80美元。　　在回答成本问题时，Seer公司董事长兼首席执行官Omid Farokhzad表示，他认为价格是“价值交换的问题”。他说：“并非所有内容都是等价的。问题在于，从Seer所提供的与其替代方案所提供的内容来说，价值交换是什么？”在血浆蛋白质组学领域最新的发展中，这个问题的答案似乎是一个不断变化的目标。

大家好，本周为大家分享一篇发表在Anal Chem上的文章，Native Ambient Mass Spectrometry Enables Analysis of Intact Endogenous Protein Assemblies up to 145 kDa Directly from Tissue [1]。该文章的通讯作者是来自英国伯明翰大学的Helen J. Cooper教授。非变性原位质谱（native ambient mass spectrometry, NAMS）是一种新型的自上而下质谱分析方法。它结合非变性质谱和原位质谱的优势，可直接在蛋白质及其复合物的生理环境中进行对其进行无标记表征。NAMS可提供蛋白质结构、空间及瞬时相互作用的信息，具有直接从组织中分析内源性蛋白质组装体的巨大潜力。但是，目前，NAMS仅成功应用于直接检测低分子量 (图 1. 离子图像和 HCD MS2光谱表明大鼠脑中蛋白质复合物的亚基解离。(a) H&E染色的连续组织切片的光学图像。标签：Ce,小脑；C，大脑皮层；CC，胼胝体；F，穹窿；V，侧脑室区；Mb，中脑；Me，髓质和脑桥；H，海马；Th，丘脑；Ht，下丘脑；BG，基底神经节；OR，嗅觉区域。(b) Nano-DESI 全扫描质谱，代表光学图像中标记为“(b)”的像素。（c，d）巨噬细胞抑制因子同源三聚体显示均匀分布。（e，f）PGAM1同型二聚体分布。（g，h）MDH2同型二聚体分布。此外，作者在大鼠肾脏中鉴定了四种同源二聚体蛋白组件（61.2-94.2kDa），包括ω-酰胺酶 (61.2kDa)、MDH2 (66.4kDa)、苹果酸脱氢酶1 (MDH1, 72.8kDa) 和α-烯醇化酶 (94.2kDa)，并将其成像（图2）。其中观察到的α-烯醇化酶为金属结合形式，每个亚基上结合了2个Mg 2+离子。图 2. (a)大鼠肾脏的H&E染色连续切片显示皮质(C)和髓质(M)组织。(b)在MSI期间获得的大鼠肾皮质组织中单个nano-DESI 像素的示例全扫描质谱。(c, d)α-烯醇化酶同型二聚体。(e, f)苹果酸脱氢酶1。(g, h) MDH2同型二聚体。(i, j) ω-酰胺酶。研究还从大鼠肝组织中鉴定出同型三聚体鸟氨酸转氨甲酰酶（OTC，108.8kDa）和同型四聚体乳酸脱氢酶A（LDHA，145.4kDa）（图3）。其中，在全扫描模式下，nano-DESI可以检测到145.4kDa的LDHA的较弱信号。通过nano-DESI-PTCR MS2的进一步确认，检测到的物质确实为LDHA。图3. (a) 直接来自大鼠肝组织的完整OTC同源三聚体的nano-DESI-PTCR MS 2。(b) 完整OTC同源三聚体的nano-DESI-HCD MS2显示亚基质量为36.2kDa。(c)完整LDHA同源四聚体 (145.4kDa)的nanoESI-PTCR MS2。(d)完整LDHA 同源四聚体的nanoESI-HCDMS2。在此研究中，作者成功利用NAMS质谱分析方法，直接从组织中检测并鉴定出内源性蛋白质组装体，分子范围为37.0-145.4kDa，包括二聚体、三聚体以及四聚体。其中检测到的上限（145.4kDa）超出LESA MS报道的质量上限的两倍，比nano-DESI 报道过的质量上限高出100kDa。通过调整离子光学和高m /z的气体压力，或者后续仪器和方法的开发，NAMS有可能进一步突破145.4kDa的上限，检测到分子量更大的蛋白组装体。[1]Hale OJ, Hughes JW, Sisley EK, Cooper HJ. Native Ambient Mass Spectrometry Enables Analysis of Intact Endogenous Protein Assemblies up to 145 kDa Directly from Tissue. Anal Chem. 2022 Apr 12 94(14):5608-5614.[2]Hale OJ, Cooper HJ. Native Mass Spectrometry Imaging and In Situ Top-Down Identification of Intact Proteins Directly from Tissue. J Am Soc Mass Spectrom. 2020 Dec 2 31(12):2531-2537.

大家好，本周为大家分享一篇最近发表在 Journal of the American Chemical Society上文章，Native Top-Down Mass Spectrometry with Collisionally Activated Dissociation Yields Higher-Order Structure Information for Protein Complexes1。该文章的通讯作者是美国加利福尼亚大学洛杉矶分校的Joseph A. Loo教授。非变性质谱(native MS，nMS)通常用于揭示蛋白及其复合物的分子量大小和化学结合计量比，但若要进一步阐明深层次的结构信息，则需要与串联质谱结合，即非变性自上而下质谱（nTDMS），通过对母离子进行二级甚至多级碎裂可获取额外的序列、翻译后修饰(PTMs)以及配体结合位点信息。此外，nTDMS能以构象敏感的方式断裂共价键，这样就可以从碎片模式推断出有关蛋白高级结构的信息。值得注意的是，使用的激活/解离方式会极大地影响得到的蛋白质高阶结构信息。电子捕获/转移解离(ECD、ETD或ExD)和紫外光解离(UVPD)等快加热的活化方式因其能够在保留蛋白整体结构的情况下先对共价键进行断裂而被广泛应用于nTDMS分析中。而慢加热的活化方式如碰撞活化解离(CAD)会在断键前进行能量重排，导致一些较弱的非共价相互作用先发生破坏，例如：亚基的释放和展开，因此对高阶结构表征没有帮助。而此次Joseph A. Loo课题组的研究结果显示使用基于orbitrap的高能C-trap解离(HCD)同样也可以从天然蛋白复合物的中直接获得序列信息，并且碎片模式可以提供有关其气相和溶液相高阶结构信息。此外，CAD还可以生成大量的内部碎片(即不包含N-/ C-端的片段)用于揭示蛋白质复合物的高阶结构。为了研究蛋白复合物HCD的碎裂化情况，作者比较了酵母来源的乙醇脱氢酶四聚体（ADH）在Complex-down MS (psedo-MS3)和nTDMS两种分析策略下的碎片模式。如图1所示，在Complex-down MS分析中，ADH经源内解离（ISD）释放出单个亚基，该亚基经HCD碎裂生成肽段b/y离子。而在nTDMS分析中，肽段离子则可以从复合物中直接获得。如图2（上）所示，在Complex-down MS分析中总共获得了24个b离子和18个y离子，能够实现11.8%的序列覆盖率。近乎相等数目的b、y离子表明Complex-down MS分析中释放的ADH亚基N-端和C-端均具有较高的表面可及性，即亚基发生去折叠。此外，碎片模式也揭示了N-端乙酰化、V58T突变体以及Zn2+结合位点等信息。相比之下，nTDMS分析则更反映ADH的高阶结构，如图2（下）所示，在nTDMS分析中主要检测到b离子，几乎没有亚基信号，说明b离子是直接由复合物中共价键断裂产生的。ADH的nTDMS分析共产生了60个N-端b离子和3个C-端y离子（17.6%序列覆盖率）。由HCD产生的大量N端碎片类似于ADH基于电子和光子解离技术产生的nTDMS产物。将这些片段映射到ADH的晶体结构上可以看出，N端区域比C端区域更容易暴露于溶剂，而C端区域主要形成复合物的亚基-亚基界面。ADH的碎片离子中来源亚基界面断裂的仅占8%，大部分碎裂都发生在溶剂可及的N-端。图1 Complex-down MS和nTDMS分析流程图1 Complex-down MS（上）和nTDMS（下）碎片模式比较ADH的nTDMS分析充分展现了CAD在蛋白复合物高阶结构表征上的潜力，为了进一步验证，作者还选择了其他的蛋白复合物进行实验，如醛缩酶同源四聚体、谷胱甘肽巯基转移酶A1二聚体、肌酸激酶二聚体等。这些蛋白复合物在n-CAD-TDMS分析中都产生了与结构对应的碎片离子，说明基于CAD的nTDMS分析是具有普适性。当然也会存在一些例外，膜蛋白水通道蛋白(AqpZ)同源四聚体在nTDMS分析过程中产生了高丰度的单体亚基、二聚体、三聚体信号，这应该归因于AqpZ四聚体亚基之间的弱疏水结合界面，导致亚基的释放发生在共价键断裂之前，因此产生的b/y离子无法反映蛋白复合物的空间结构。相较而言，以盐桥为主要稳定作用的蛋白复合物，如ADH、醛缩酶等则更容易在nTDMS分析中产生肽段碎片离子。此外，基于CAD的nTDMS分析中还发现了大量的内部碎片，ADH产生的大部分内部碎片来源于溶剂可及区。尽管内部碎片难以辨认，但可以大幅度提高序列覆盖率，提供更精细的结构信息。一个从小分子裂解衍生到大分子解离的假设是，在实验的时间尺度内，由碰撞引起的激活是完全随机化的，并以沿着最低能量途径引导碰撞诱导的解离。然而，这些假设没有考虑到熵的要求，缓慢重排可能是释放亚基所必须的，例如重新定位盐桥将一个亚基与其他亚基相连。在碰撞次数或每次碰撞能量不足以碰撞出能释放亚基的罕见构型的情况下，以释放出更小的多肽碎片(具有更少的约束) 代替重排可能具有更高的竞争性。总之，本文展示CAD在nTDMS分析中的应用，无需基于光子或电子的活化方式，CAD可直接从蛋白复合物中获得肽段离子，并且该碎裂离子能够反映蛋白复合物的空间结构。撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：Native Top-Down Mass Spectrometry with Collisionally Activated Dissociation Yields Higher-Order Structure Information for Protein Complexes参考文献1. Lantz C, Wei B, Zhao B, et al. Native Top-Down Mass Spectrometry with Collisionally Activated Dissociation Yields Higher-Order Structure Information for Protein Complexes. J Am Chem Soc. 2022 144(48): 21826-21830.

大家好，本周为大家分享一篇发表在J Proteome Res.上的文章，Systematic Identification of Proteins Binding with Cisplatin in Blood by Affinity Chromatography and a Four-Dimensional Proteomic Method，该文章的通讯作者是华中科技大学药学院的杜支凤教授。以顺铂为代表的铂类抗癌药物广泛应用于治疗多种癌症肿瘤，如胃肠道癌、头颈部癌和卵巢癌等。在静脉滴注后，这些药物水解形成活性分子，与DNA结合并抑制DNA链的合成与复制，最终致使细胞死亡。然而，由于铂与硫醇的高亲和力，大多数铂在静脉注射后会与血液中的蛋白质结合；例如，人血清白蛋白 (HSA) 是含量最丰富的血清蛋白，也是血液中铂类药物的主要结合蛋白；另外，在红细胞中负责运输氧气的血红蛋白 (HB) 也被发现与铂结合，因此，有必要研究铂类药物在血液中的蛋白结合行为。先前的研究已经证明，利用质谱方法可以实现对高丰度蛋白质的可靠鉴定；然而，由于高丰度蛋白的干扰，占总蛋白的 80% 以上的低丰度蛋白则很少被鉴定。此外，由于缺乏足够信息，以及在胰蛋白酶消化过程中还原和烷基化剂的使用导致蛋白上的铂化位点无法被确定。更重要的是，目前排除假阳性结果的唯一方法是根据铂化肽的特征同位素模式，人工对比理论同位素和实验同位素，从而导致鉴定过程非常耗时并且具有较强的主观性。因此，有必要开发一种可靠、高效的方法来鉴定血液中铂类药物的结合蛋白质组。在血液蛋白质组学研究中，免疫亲和层析常用于消耗高丰度蛋白并富集低丰度蛋白。它有利于低丰度蛋白的鉴定和定量，从而可以提高血液中的蛋白质组覆盖范围。除了色谱分离外，离子淌度质谱 (IM−MS) 根据离子的迁移率差异进行分离，同样有助于低丰度蛋白质的分析。在金属化蛋白的鉴定中，金属化肽和游离肽的同位素分布模式明显具有差异，这有助于确定这些肽是否与金属药物结合。已经开发了一些数据处理软件程序来自动分配金属药物在已知蛋白质上的结合位点，如智能数字注释程序 (SNAP) 算法和 Apm2s 。本文结合高丰度蛋白分离和4D蛋白质组学方法 (IM-MS) ，系统、全面地鉴定了血液中顺铂的结合蛋白，并利用铂化肽的特征同位素模式和相似性算法来消除假阳性的识别。如图1所示，首先用超滤去除游离药物，然后使用多亲和去除柱分离血液样本中的高丰度和低丰度蛋白；用FAIMS Pro界面的nano-LC−MS/MS进行消化和分析；用MaxQuant对铂化的多肽和蛋白进行鉴定，用相似性算法Apm2s排除假阳性结果。在此基础上，采用基于平行反应监测 (PRM) 的方法测定了血浆中多肽与顺铂的结合率。本研究为系统鉴定血液中金属药物的结合蛋白提供了一种新方法，鉴定出的蛋白可能有助于了解铂类抗癌药物的毒性。图1 铂化蛋白的分离和鉴定以及用蛋白质组学方法测定顺铂与多肽之间的结合率的示意图本研究采用顺铂与人血浆的反应混合物建立了一种分析方法。为了与文献进行比较，样品的制备方法与文献中的制备方法相同1。选择CID作为碎裂方式，结果表明，从低丰度部分共鉴定出212个蛋白，从高丰度部分共鉴定出169个蛋白。在低丰度部分，共鉴定出1192个游离肽和208个铂化肽。其中，154个铂化肽被排除为假阳性结果，如文中表S1所示。高丰度部分的游离肽数和铂化肽数分别为1124个和169个，其中，144个铂化肽被排除为假阳性，如表S2所示。低丰度结合蛋白的鉴定在以往的研究中，由于高丰度蛋白的干扰，很少发现低丰度蛋白与铂的结合。本研究在高丰度蛋白被消耗后，从29个蛋白中共鉴定出54个铂化肽。APOA4中铂化肽的理论和实际质谱如图2所示，前体离子和铂化产物离子表现出特征的同位素峰。图片显示了关键的碎片离子的质谱图，用于分配铂化位点。在鉴定出的铂化蛋白中，CERU、FETUA、ITIH1和B4E1Z4有4个或更多的含铂肽，这表明铂可以与这些蛋白质的多条肽段结合。虽然低丰度蛋白只占血液中蛋白的一小部分，但它们具有非常重要的功能，对于维持正常生理活动不可或缺。例如，CERU可以将Fe2+氧化为Fe3+，并在铁代谢中发挥重要作用；B4E1Z4与补体激活相关。顺铂与这些蛋白的结合是否会对其功能产生影响仍有待进一步研究。图2 从低丰度蛋白部分鉴定出的铂化蛋白APOA4。(A)铂化肽的理论（左）和实验质谱（右）；(B)铂化肽的MS/MS和指示铂化位点的关键碎片离子的质谱图高丰度结合蛋白的鉴定IGHG1中一个铂化肽的理论和实验质谱如图3所示，其前体离子和铂化产物离子表现出特征同位素峰。根据关键的碎片离子确定了铂化位点。在已鉴定的蛋白中，ALBU（白蛋白）和CO3（补体C3）有4个或更多的含铂多肽。HSA负责血液中药物和小分子的运输，CO3在补体系统的激活中起着重要作用。高丰度蛋白与顺铂的结合已被用于提高肿瘤化疗的疗效和选择性，而新发现的高丰度结合蛋白有助于相关研究。与低丰度组分鉴定的铂化蛋白相比，大部分与低丰度组分蛋白不同，两个组分中仅共同检测到FETUA和CFAH作为铂化蛋白，这表明亲和层析对高丰度蛋白和低丰度蛋白的分离效果较好。图3 从高丰度蛋白部分鉴定出铂化蛋白IGHG1。(A)铂化肽的理论（左）和实验质谱（右）；(B)铂化肽的MS/MS和指示铂化位点的关键碎片离子的质谱图IM−MS分离铂化肽异构体如图4所示，通过nano-LC−IM−MS/MS成功分离了低丰度蛋白组分中FETUA的铂化肽异构体。同分异构体a和b是典型的铂化肽，由质谱图的同位素模式显示，它们被很好地分离。它们的MS/MS不同，根据关键碎片离子，异构体a和b的铂化位点分别被划分为M和H/T。这个例子显示了IM−MS对复杂样品的分辨能力。图4 用nanoLC−IM−MS/MS分离的低丰度蛋白组分中FETUA的铂化肽异构体。(A)m/z=764.67提取离子色谱和异构体a、b的质谱，理论质谱见中间；(B)异构体的MS/MS和关键碎片离子的质谱图结合蛋白的铂化位点在本文的两项研究中，His 和 Met 是首选的铂结合位点。此外，D、E、S和Y也被发现是铂结合位点。这也是合理的，因为血清蛋白的供氧氨基酸已被证明是顺铂的动力学首选结合位点。很少有Cys残基被鉴定为结合位点，这可能是由于没有还原和烷基化。肽的半胱氨酸常形成二硫键，不经还原和烷基化就无法识别，因此，序列覆盖率会很低。在未来的研究中，应使用替代还原剂来提高肽序列覆盖率。生物信息学分析 为了揭示铂化蛋白质的定位、功能和途径，将从高丰度和低丰度部分中鉴定的蛋白质组合起来并通过生物信息学工具进行分析。如图5A所示，GO分析表明大部分结合蛋白位于细胞外区域，发挥蛋白结合、金属离子结合、酶抑制剂等功能；因此，镀铂蛋白的定位证实了鉴定的可靠性。此外，这些蛋白质参与内肽酶活性、免疫系统过程、补体激活、炎症反应和凝血的负调节。为了阐明所涉及的途径，对鉴定的蛋白质进行了KEGG途径富集分析，结果表明最显着的富集途径是补体和凝血级联途径（图5B）。补体和凝血级联途径已被证明在造血干/祖细胞的动员中发挥关键作用，这对造血具有重要意义。顺铂的血液学毒性与其在补体和凝血级联途径中与血液蛋白的结合之间的相关性值得进一步研究。图5 (A)通过GO 分析确定的铂化蛋白的定位、分子功能和生物学过程；(B)铂化蛋白的富集途径血液蛋白与顺铂的结合率 由于未检测到一些铂化肽的游离形式，因此仅使用高丰度组分中的13种肽进行亲和力研究。可靠地计算了属于五种蛋白质的六种铂化肽的结合率。PRM分析中这些肽的信息见表S5，定量结果见图6。其中，富含组氨酸的糖蛋白的一种肽与顺铂的结合率最高，这可能是由于顺铂对含组氨酸和带负电荷的生物分子的高亲和力。Apoa1 蛋白的一个肽与顺铂的结合率最低。在本研究中可以确定结合率的铂化肽数量较少，这主要是由于某些肽的质谱响应低以及某些肽存在氧化形式。因此，这些肽的结合比率不能通过 PRM 方法确定。然而，与以往的研究相比，根据属于同一蛋白质的肽的质谱计数粗略估计某种蛋白质的丰度，这种方法可以更准确地确定高丰度肽与铂的结合率。图6 根据PRM分析多肽与顺铂的结合亲和力顺铂与血液蛋白的结合与其药代动力学、活性、毒性和副作用密切相关。然而，血液蛋白质组的复杂性限制了低丰度结合蛋白的鉴定。在本研究中，基于亲和色谱和nanoLC-IM-MS/MS 的 4D 蛋白质组学方法被用于分离低丰度和高丰度蛋白质并分析这两个部分。基于铂化肽的特征同位素分布和相似性算法，排除了假阳性鉴定。结果，共有 39 种蛋白质被鉴定为铂化蛋白质，这比之前研究中的数量要高得多。随后的生物信息学分析表明，这些结合蛋白位于细胞外区域，主要参与内肽酶活性、免疫系统过程、补体激活、炎症反应和凝血的负调控。最显着的富集途径是补体和凝血级联，这可能与顺铂的血液学毒性有关。高丰度部分的 PRM 分析表明，富含组氨酸的糖蛋白中的肽与高丰度组分中的顺铂的结合率最高。综上所述，本研究揭示了人类血液中与顺铂结合的蛋白质组，并计算了顺铂与血液蛋白的结合率。这种方法虽然在数据分析方面比较耗时，但它可以识别复杂系统中金属药物的低丰度结合蛋白，并且可以准确测量药物与血液蛋白的结合率。

蛋白组学是当今生命科学和精准医学的研究热点，目前仍处于早期快速发展阶段。其发展轨迹与早期的基因组学相似，随着时间的推移，蛋白组学在研究和临床中的应用潜力将逐渐释放，有望接近基因组学的市场规模。当前，全球蛋白组学市场规模已达500亿美元，且呈现快速增长趋势。随着资本市场的关注，不断有新公司进入并获得融资，推动了新技术的不断涌现。 蛋白组学技术的扩展与应用 蛋白质组学技术已从最初的蛋白质定性鉴定扩展至多个领域，包括蛋白质定量表达分析、翻译后修饰鉴定和定量、蛋白质互作分析、蛋白质复合物成分解析、空间蛋白质组分析以及单细胞蛋白质组分析。这些技术不仅应用于基础科学研究，更在药物开发、临床医学和转化医学等领域展现出巨大潜力。这一切得益于质谱技术、蛋白质分离技术、生物化学技术和计算机技术的快速发展。 质谱技术：蛋白组学发展的关键 质谱技术是推动蛋白质组学发展的关键技术，特别是在生物标志物发现方面具有黄金标准地位。在全球范围内，只有少数制造商发明了能够区分小至单肽分子的复杂质谱技术，包括布鲁克公司（Bruker）、赛默飞公司（Thermo Fisher Scientific）、安捷伦公司（Agilent）、沃特世公司（Waters）和 Sciex 公司。其中，赛默飞世尔公司在蛋白组学研究质谱市场中拥有超过90%的市场份额，主要归功于其创新的Orbitrap系列。布鲁克公司的TimsTOF系列则是蛋白组学领域增长最快的质谱之一，从赛默飞公司那里获得了市场份额，以约30%的速度增长。质谱技术的持续创新将对蛋白组学的发展产生深远影响。然而，质谱技术的标准化和应用流程的复杂性，尤其是样品制备阶段的缺乏标准化，成为其进一步推广的瓶颈。正是在这一背景下，像Evosep等公司在液相色谱标准化方面取得了突破，逐步占据了60%以上的市场份额。这种创新反映了市场对流程效率提升的迫切需求。与此同时，新兴技术如Seer、Olink和Somalogic通过纳米粒子分离技术和适配体蛋白质检测技术，正在改变传统的蛋白质组学检测方式，显著提高了检测精度和通量。 蛋白组学的产业链 蛋白组学市场已形成涵盖上游质谱仪器和蛋白质组学试剂供应商、中游蛋白组学技术服务公司以及下游蛋白组学终端客户的完整产业链条： 颠覆性技术与企业的崛起 近年来，Seer、Olink、Somalogic、Nautilus和Quantum-Si等企业凭借其颠覆性技术，改变了传统的蛋白组学检测方式，极大地提升了检测的通量、准确性、特异性和敏感性：&bull Seer：发明了一种在液相色谱分离之前对蛋白质进行标准化消化和分离的工作流程。其专有的纳米粒子技术将蛋白质分成4组，增强了低丰度蛋白质的检测。&bull Olink：通过DNA编码连接到蛋白质上，实现蛋白质定量可通过基因测序的基础设施进行。其PEA（临位延伸分析）检测技术在qPCR仪器或Illumina的下一代测序仪上工作，提供高通量和特异性。&bull Somalogic：利用适配体进行蛋白质检测，其SomaScan平台可以识别并检测大量的蛋白质。该公司拥有一个由7000个独特适配体组成的文库，能够在48小时内从单个样品中识别7000种不同的蛋白质。&bull Nautilus：其技术利用专有仪器、流动池和试剂，对样品中95%的蛋白质组进行量化。设计了一个"超密集单分子蛋白质纳米阵列"，实现了单分子分辨率。 国内市场的快速发展 在蛋白组学行业，欧美企业布局早，经过多年发展成熟后逐渐得到资本市场认可。包括Seer、Olink、Nautilius、Quantum-Si以及Somalogic在内的多家生物科技公司从2020年开始陆续上市。Seer、Olink、Somalogic是欧美三家蛋白质组学的标杆企业，Seer是其中最年轻的公司，但是为下一代蛋白质组学带来了创新技术和路径。与之相比，国内企业起步较晚，但发展迅速。景杰生物、中科新生命等专注于蛋白组学，而诺禾致源、华大基因、美吉生物、欧易生物等企业也同时提供蛋白组学服务。国内市场规模从2016年的1.2亿元增长到2020年的5.8亿元，年复合增长率高达49.1%，预计2025年将达到22.6亿元。（摘自弗若斯特沙利文分析）与此同时，随着精准医学和转化医学的快速发展，越来越多新发现蛋白质生物标志物的检测工作，将为蛋白质组分析带来巨大的市场需求。我们发现抗体-药物偶联物（ADC）药物正在快速发展，其结合了单克隆抗体的靶向能力和细胞毒性药物的强效性，成为癌症治疗领域的突破性疗法。在ADC药物的研发过程中，蛋白组学起到了至关重要的作用。（点击查看→ADC药物如何精准制导癌症治疗、质谱如何推进ADC药物研发）蛋白组学技术可用于鉴定和验证ADC的靶标蛋白，帮助研究人员筛选出最具潜力的治疗靶点。此外，蛋白组学在分析抗体与抗原的结合位点、优化抗体结构以提高药物效力和降低副作用方面也具有重要价值。总而言之，蛋白组学还是处于发展的黄金时代，质谱技术的不断进步将推动着整个行业的快速前进。随着多组学整合、人工智能赋能、空间蛋白质组学兴起和临床应用加速落地等趋势的出现，蛋白组学将在生命科学、精准医学和药物研发等领域发挥越来越重要的作用。在全球蛋白质组学有着千亿美元市场的机遇下，就需要加强核心技术研发，尤其是在质谱、单细胞和空间蛋白质组学等领域实现突破。同时，积极推动多组学整合，结合基因组学、代谢组学等数据，构建全面的生物学信息网络，深化对复杂疾病的理解。此外，深化国际合作与交流，吸收全球先进技术和经验，增强自身的创新能力，参与全球市场竞争，提升国际影响力。通过这些努力，中国企业将有望在全球蛋白组学市场中分得一杯羹，为生命科学和精准医学的发展做出更大贡献。

质谱流式细胞术可在数百万个单细胞中同时采样并量化分析50多种蛋白质或蛋白质修饰水平。应用质谱流式可从全新的角度判别细胞种类、细胞表型，评估其功能状态和异质性以研究疾病发生和发展的机制。然而，作为一种新兴单细胞蛋白组方法，质谱流式因其技术特性也存有一些功能上的不足之处。目前该技术最大的瓶颈在于其灵敏度的极限，在单细胞中的每种抗原表位需要累积上百个金属标签标记的抗体才可在质谱流式分析中检测到特异性信号。灵敏度不足的问题，使得一些在人类疾病中至关重要的低丰度蛋白，如大量的转录因子、一部分细胞表面受体蛋白以及某些与特定功能相关的磷酸化位点难以被准确分析。在对小体积细胞，例如免疫细胞和微生物细胞的研究中，质谱流式在技术上则更具挑战性。而之前在多个不同实验室进行的放大质谱流式信号的尝试由于信噪比低、放大效果不强、可控性差等问题并没有获得显著效果。如何在不影响信噪比的情况下对质谱流式进行信号放大是一直以来亟待解决的问题。2024年7月29日，哈佛大学Wyss研究所尹鹏教授团队（伦小康博士、盛宽玮博士为共同第一作者）等在 Nature Biotechnology 期刊发表了题为：Signal amplification by cyclic extension enables high-sensitivity single-cell mass cytometry 的研究论文。该研究开发了一种名为循环延伸扩增（Amplification by Cyclic Extension，ACE）的信号放大技术，通过设计DNA动态探针实现对质谱流式技术（mass cytometry）中抗原表位金属同位素标记信号的高效放大，解决了质谱流式分析中的灵敏度瓶颈问题。ACE技术可同时放大30种以上蛋白表位信号。应用在悬浮质谱流式和成像质谱流式（imaging mass cytometry或IMC）中，ACE皆可大幅提升低丰度蛋白信号检测的灵敏度及准确性。在这项最新研究中，研究团队运用独特的DNA动态探针设计方法，创立了单链DNA循环延伸信号放大（Amplification by Cyclic Primer Extension，ACE）技术，实现了同时对多通道抗原表位信号的高信噪比高效放大，并应用于质谱流式技术上以大幅提高其灵敏度。ACE利用超短DNA序列作为起始探针（initiator）标记抗体并对胞内靶蛋白进行染色（图1）。在低温条件下，反应体系内的延伸探针（extender，含有两个相邻的起始探针互补序列）可互补结合在起始探针上，体系中的DNA聚合酶应用延伸探针为模版延长起始探针。提高体系温度后，延伸探针从延长过起始探针上解离，此时一个反应循环结束。当体系温度再次降低时，下一个延伸循环开始，起始探针进一步被延长。通过对起始探针序列的温控循环延伸，ACE可快速复制金属检测探针（detector）结合位点，引入检测探针后，单个抗体所携带的金属同位素标记物数量大幅提升。为提升DNA结构的热稳定性，该团队又结合3-cyanovinylcarbazole phosphoramidite (CNVK) 紫外交联方法将携带金属标记的检测探针共价结合在延伸后的起始探针上，使得检测探针在质谱流式仪内高温环境中不易解离（图1）。线型ACE（linear ACE）信号放大技术可平均提升信号13倍（图2）。但当分析极低丰度蛋白的单细胞信号或微生物单细胞蛋白信号需要更强信号时，可在线型ACE基础上应用分支ACE（branching ACE）以达到对抗原信号的500倍以上的放大。为配合质谱流式多维度蛋白表位分析特点，该团队通过设计正交DNA探针序列实现了对33种蛋白表位互不干扰的同时信号放大。图1. ACE技术流程示意图图2. 应用ACE逐级提高质谱流式抗原表位信号ACE技术建立后，研究团队首先将其应用与分析上皮-间质转化（EMT）和间质-上皮转化（MET）过程中的分子调控机制。通过对32个上皮和间质标记物、信号分子和转录因子的单细胞分析，将单个小鼠乳腺癌细胞从上皮状态到间质状态再回到上皮状态的转化过程进行时间重构，精准的展示细胞如何通过调节关键转录因子如Zeb-1和Snail/Slug的数量变化来驱动了EMT和MET分子程序。在第二个应用中，团队聚焦于单个T细胞胞内磷酸化信号网络。由于T细胞体积较小，在单细胞分辨率下每种磷酸化位点的表位数量有限，所以此前针对单个T细胞信号网络反应异质性的研究一直较难开展。团队应用ACE同时放大T细胞受体（TCR）信号网络内的30种关键磷酸化位点（图3），研究样本中T细胞在受到外部信号刺激时的胞内磷酸化网络特异性激活状态是如何分别调控介导应激、炎症、细胞增殖等反应的。应用该技术，团队分析了“组织损伤诱导T细胞麻痹”的分子信号机理，利用从手术患者获取的“术后引流液”（POF）样本刺激T细胞，并捕捉TCR信号网络的动态特征，揭示出导致部分CD4+ T细胞停止分裂并引起免疫抑制的胞内信号网络变化。图3. 应用ACE技术分析T细胞胞内信号网络动态变化最后，团队使用ACE结合成像质谱流式（Imaging mass cytometry，IMC）对人体肾脏组织切片中的蛋白表位进行高维度空间分析。通过检查从一名多囊肾病患者获得的肾皮质切片并对经信号放大后的20种肾脏标记物的空间表位分析，团队发现了存在于肾皮质部位细胞和组织结构的新病理特征：与组织修复相关的干细胞标记物Nestin在肾小球中的不均匀表达可能意味着组织的不同部位可能同时经历不同的病理阶段。ACE质谱流式信号放大技术是单细胞蛋白分析中一项革命性的突破。这套独特的生物技术在生物医学的各个层面都有着广泛的应用前景，尤其可将单细胞高维蛋白表位定量分析扩展到之前由于技术限制而从未涉及到的低丰度蛋白组。另外，结合成像质谱流式IMC，可在未来实现基于ACE信号放大的超分辨率空间蛋白组学成像分析。

近年来，随着人们对医疗健康行业需求的不断增长，生物制药行业也在随之蓬勃发展。近两年的新冠疫情quan球大流行，在改变人们日常生活的同时更是催生了生物制药行业对于先进分析技术的需求。蛋白质分离、纯化和分析是生物zhi疗药物开发中的关键组成部分，但该过程可能复杂且极具挑战性。而全柱成像等电毛细管电泳（whole column imaged capillary isoelectric focusing, WC-iCIEF）技术，可以根据蛋白质的等电点（isoelectric point, pI）差异将其分离，在此基础上，将iCIEF与高分辨质谱联用，可以借助质谱的高灵敏度、高分辨率和高质量精度使各种蛋白质变异体的鉴定更容易、更准确。从2021年6月开始，我们与蛋白质成像技术专家 Advanced Electrophoresis Solutions Ltd (AES)宣布达成协议，将蛋白质分离技术与质谱相结合，通过简化表征来推进zhi疗性蛋白质药物的开发。 到目前为止，通过将iCIEF技术与高分辨质谱联合使用，我们已经对单抗、ADC和融合蛋白等多种产品进行了各种层面的表征。下图1~3展示了iCIEF技术对单抗\ADC\融合蛋白的分离结果，可见对于不同种类的重组生物zhi疗性产品，均可根据pI差异将其电荷变异体进行分离，且系统具有优异的稳定性与重现性。图1 iCIEF-UV分析帕博利珠单抗电荷变异体，8针平行进样（点击查看大图）图2 iCIEF-UV分析恩美曲妥珠电荷变异体，3针平行进样图3 iCIEF-UV分析依那西普电荷变异体，3针平行进样我们使用的CEInfinite iCIEF平台（AES）除了高质量的iCIEF-UV功能外，还可以与高分辨质谱直接在线串联，直接测定电荷变异体的分子量，无需额外转换接口。下图4展示了我们使用iCIEF-MS直连技术分析帕博利珠单抗的结果，可见即使是pI仅差0.02的碱峰B1和主峰，也可以在iCIEF上得到基线分离，随后的高分辨质谱分子量测定结果显示该碱峰与主峰相比，主要差异是其中一条重链的N端未发生焦谷氨酸环化。另外观察原始质谱谱图不难发现，得益于Orbitrap高分辨质谱的灵敏度，即使是强度比主峰低2~3个数量级的碱峰B3，仍可得到糖型分布清晰的谱图。图4 iCIEF-MS在线直联分析帕博利珠电荷变异体。上，iCIEF-UV分离图谱。中，碱峰B1与主峰解卷积结果镜像图对此。下，主峰与所有碱峰原始质谱图对比。（点击查看大图） 与市面上其他供应商相比，AES的CEInfinite iCIEF平台具有一个独特优势：可以实现全自动的馏分收集。我们选择了帕博利珠单抗，对其电荷变异体的每个峰离线收集后进行酶解，随后上样至高分辨液质联用平台进行肽图分析。图5展示了酸/碱峰中各种CQA含量的变化，可见轻重链末端、重链糖型和侧链常见PTM的变化趋势。另外通过表1中分离之前/之后特定CQA含量对比可以很明显的发现，经iCIEF分离后，酸/碱峰中特定修饰的比率有明显zhen高，可见基于pI差异，将生物zhi疗性产品的电荷变异体进行分离后，接下来采用肽图进行深入表征的分析策略，能够帮助研究人员将导致电荷异质性的修饰精确定位到氨基酸位点的层面。