暗视野显微镜

自然界中一些最基本的过程发生在微观尺度上，远远超出了我们肉眼所能看到的极限，这推动了技术的发展，使我们能够超越这个极限。早在公元4世纪，人们发现了光学透镜的基本概念，并在13世纪，人们已经在使用玻璃镜片，以提高他们的视力和放大植物和昆虫等对象以便更好地了解他们。随着时间的推移，这些简单的放大镜发展成为先进的光学系统，被称为光学显微镜，使我们能够看到和理解超越我们感知极限的微观世界。今天，光学显微镜是许多科学和技术领域的核心技术，包括生命科学、生物学、材料科学、纳米技术、工业检测、法医学等等。在这篇文章中，我们将首先探讨光学显微镜的基本工作原理。在此基础上，我们将讨论当今常用的一些更高级的光学显微镜形式，并比较它们在不同应用中的优缺点。　　　　什么是光学显微镜?　　光学显微镜用于通过提供它们如何与可见光相互作用(例如，它们的吸收、反射和散射)的放大图像来使小结构样品可见。这有助于了解样品的外观和组成，但也使我们能够看到微观世界的过程，例如物质如何跨细胞膜扩散。　　显微镜的部件以及光学显微镜的工作原理　　从根本上说，显微镜包括两个子系统：一个用于照亮样品的照明系统和一个成像系统，该系统产生与样品相互作用的光的放大图像，然后可以通过眼睛或使用相机系统进行观察。　　早期的显微镜使用包含阳光的照明系统，阳光通过镜子收集并反射到样品上。今天，大多数显微镜使用人造光源，如灯泡、发光二极管(LED)或激光器来制造更可靠和可控的照明系统，可以根据给定的应用进行定制。在这些系统中，通常使用聚光透镜收集来自光源的光，然后在聚焦到样品上之前对其进行整形和光学过滤。塑造光线对于实现高分辨率和对比度至关重要，通常包括控制被照亮的样品区域和光线照射到它的角度。照明光的光学过滤，使用修改其光谱和偏振的光学过滤器，可用于突出样品的某些特征。图1：复合显微镜的基本构造：来自光源的光使用镜子和聚光镜聚焦到样品(物体)上。来自样品的光被物镜收集，形成中间图像，该图像由目镜再次成像并传递到眼睛，眼睛看到样品的放大图像。　　成像系统收集与样品相互作用的照明光，并产生可以查看的放大图像(如上图1)。这是使用两组主要的光学元件来实现的：首先，物镜从样品中收集尽可能多的光，其次，目镜将收集的光中传递到观察者的眼睛或相机系统。成像系统还可包括诸如选择来自样品的光的某些部分的孔和滤光器之类的元件，例如仅看到已从样品散射的光，或仅看到特定颜色或波长的光。与照明系统的情况一样，这种类型的过滤对于挑出某些感兴趣的特征非常有用，这些特征在对来自样本的所有光进行成像时会保持隐藏。　　总的来说，照明和成像系统在光学显微镜的性能方面起着关键作用。为了在您的应用中充分利用光学显微镜，必须充分了解基本光学显微镜的工作原理以及当今存在的变化。　　简单复合显微镜　　单个镜头可以用作放大镜，当它靠近镜头时，它会增加物体的外观尺寸。透过放大镜看物体，我们看到物体的放大和虚像。这种效果用于简单的显微镜，它由单个镜头组成，该镜头对夹在框架中并从下方照明的样品进行成像，如下图2所示。这种类型的显微镜通常可以实现2-6倍的放大倍率，这足以研究相对较大的样本。然而，实现更高的放大倍率和更好的图像质量需要使用更多的光学元件，这导致了复合显微镜的发展(如下图3)。图2：通过创建靠近它的物体的放大虚拟图像，将单个镜头用作放大镜。图3：左：简单显微镜。右：复合显微镜。　　在复合显微镜中，从底部照射样品以观察透射光，或从顶部照射样品以观察反射光。来自样品的光由一个由两个主要透镜组组成的光学系统收集：物镜和目镜，它们各自的功率倍增，以实现比简单显微镜更高的放大倍率。物镜收集来自样品的光，通常放大倍数为40-100倍。一些复合显微镜在称为“换镜转盘(nose piece)”的旋转转台上配备多个物镜，允许用户在不同的放大倍数之间进行选择。来自物镜的图像被目镜拾取，它再次放大图像并将其传递给用户的眼睛，典型的目镜放大率为10倍。　　可以用标准光学显微镜观察到的最小特征尺寸由所使用的光学波长(λ)和显微镜物镜的分辨率决定，由其孔径数值(NA)定义，最大值为NA =1空中目标。定义可区分的最小特征尺寸(r)的分辨率极限由瑞利准则给出：　　r=0.61×(λ/NA)　　例如，使用波长为550nm的绿光和典型NA为0.7的物镜，标准光学显微镜可以分辨低至0.61×(550nm)/0.7≈480nm的特征，这足以观察细胞(通常为10µm大小)，但不足以观察较小生物的细节，例如病毒(通常为250-400nm)。要对更小的特征成像，可以使用具有更高NA和更短波长的更先进和更昂贵的物镜，但这可能不适用于所有应用。　　在标准复合显微镜(如下图4a)中，样品(通常在载玻片上)被固定在一个可以手动或电子移动以获得更高精度的载物台上，照明系统位于显微镜的下部，而成像系统高于样本。然而，显微镜主体通常也可以适应特定用途。例如，立体显微镜(如下图4b)的特点是两个目镜相互成一个小角度，让用户可以看到一个略有立体感的图像。在许多生物学应用中，使用倒置显微镜设计(如下图4c)，其中照明系统和成像光学器件都在样品台下方，以便于将细胞培养容器等放置在样品台上。最后，比较显微镜(如下图4d)常用于法医。图4：复合显微镜。a)标准直立显微镜指示(1)目镜，(2)物镜转台、左轮手枪或旋转鼻镜(用于固定多个物镜)，(3)物镜、调焦旋钮(用于移动载物台)(4)粗调，(5)微调，(6)载物台(固定样品)，(7)光源(灯或镜子)，(8)光阑和聚光镜，(9)机械载物台。b)立体显微镜。c)倒置显微镜。　　光学显微镜的类型　　下面，我们将介绍一些当今可用的不同类型的光学显微镜技术，讨论它们的主要操作原理以及每种技术的优缺点。　　亮视野显微镜　　亮视野显微镜(Brightfield microscopy，BFM)是最简单的光学显微镜形式，从上方或下方照射样品，收集透射或反射的光以形成可以查看的图像。图像中的对比度和颜色是因为吸收和反射在样品区域内变化而形成的。BFM是第一种开发的光学显微镜，它使用相对简单的光学装置，使早期科学家能够研究传输中的微生物和细胞。今天，它对于相同的目的仍然非常有用，并且还广泛用于研究其他部分透明的样品，例如透射模式下的薄材料(如下图5)，或反射模式下的微电子和其他小结构。图5：亮视野显微镜。左图：透射模式-在显微镜下看到的石墨(深灰色)和石墨烯(最浅灰色)薄片。在这里，图像上看到的亮度差异与石墨层的厚度成正比。右图：反射模式-SiO2表面上的石墨烯和石墨薄片，小的表面污染物也是可见的。　　暗视野显微镜　　暗视野显微镜是一种仅收集被样品散射的光的技术。这是通过添加阻挡照明光直接成像的孔来实现的，这样只能看到被样品散射的照明光。通过这种方式，暗场显微镜突出显示散射光的小结构(如下图6)，并且对于揭示BFM中不可见的特征非常有用，而无需以任何方式修改样品。然而，由于在最终图像中看到的唯一光是被散射的光，因此暗场图像可能非常暗并且需要高照明功率，这可能会损坏样品。　　图6：亮视野和暗视野成像。a)亮视野照明下的聚合物微结构。b)与a)中结构相同的暗视野图像，突出显示边缘散射和表面污染。c)与a)和b)相似的结构，被直径为100-300nm的纳米晶体覆盖。仅观察到纳米晶体散射的光，而背景光被强烈抑制。　　相差显微镜　　相差显微技术(Brightfield microscopy，PCM)是一种可视化由样品光路长度变化引起的光学相位变化的技术.这可以对在BFM中产生很少或没有对比度的透明样品进行成像，例如细胞(如下图7)。由于肉眼不易观察到光学相移，因此相差显微镜需要额外的光学组件，将样品引起的相移转换为最终图像中可见的亮度变化。这需要使用孔径和滤光片来操纵照明系统和成像系统。这些形状和选择性地相移来自样品的光(携带感兴趣的相位信息)和照明光，以便它们建设性地干涉眼睛或检测器以创建可见图像。图7：人类胚胎干细胞群落的相差显微图像。　　微分干涉显微镜　　与PCM类似，微分干涉显微镜(differential interference contrast microscopy，DICM)通过将由于样品光路长度变化引起的光学相位转换为可见对比度，从而使透明样品(例如活的未染色细胞)可视化。然而，与PCM相比，DICM可以实现更高分辨率的图像，并且减少了由PCM所需的光学器件引入的清晰度和图像伪影。在DICM ，照明光束被线性偏振器偏振，其偏振旋转，使其分裂成两个偏振光束，它们具有垂直偏振和小(通常低于1µm)间隔。穿过样品后，两束光束重新组合，从而相互干扰。这将创建一个对比度与图像成正比的图像差在两个偏振光束之间的光相位，因此命名为“差”干涉显微镜。DICM产生的图像出现与采样光束之间的位移方向相关的三维图像，这导致样品边缘具有亮区或暗区，具体取决于两者之间的光学相位差的符号(如下图8)。图8：微分干涉对比显微镜。左：DICM的原理图。右图：通过DICM成像的活体成年秀丽隐杆线虫(C.elegans)。　　偏光显微镜　　在偏振光显微镜中，样品用偏振光照射，光的检测也对偏振敏感。为了实现这一点，偏振器用于控制照明光偏振并将成像系统检测到的偏振限制为仅一种特定的偏振。通常，照明和检测偏振设置为垂直，以便强烈抑制不与样品相互作用的不需要的背景照明光。这种配置需要一个双折射样品，它引入了照明光偏振角的旋转，以便它可以被成像系统检测到，例如，观察晶体的双折射以及它们的厚度和折射率的变化(如下图9)。图9：偏光显微镜。橄榄石堆积物的显微照片，由具有不同双折射的晶体堆积而成。整个样品的厚度和折射率的变化会导致不同的颜色。　　荧光显微镜　　荧光显微镜用于对发出荧光的样品进行成像，也就是说，当用较短波长的光照射时，它们会发出长波长的光。示例包括固有荧光或已用荧光标记物标记的生物样品，以及单分子和其他纳米级荧光团。该技术采用了滤光片的组合，可阻挡短波长照明光，但让较长波长的样品荧光通过，因此最终图像仅显示样品的荧光部分(如下图10)。这允许从由许多其他非荧光颗粒组成的样品中挑出和可视化荧光颗粒或已被染料染色的感兴趣细胞的分布。同时，荧光显微镜还可以通过标记小于此限制的粒子来克服传统光学显微镜的分辨率限制。例如，可以用荧光标记标记病毒以显示其位置在生物样品的情况下，可以表达荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白。结合各种新颖形式的样品照明，荧光显微镜的这一优势实现了“超分辨率”显微镜技术，打破了传统光学显微镜的分辨率限制。荧光显微镜的主要限制之一是光漂白，其中标记物或颗粒停止发出荧光，因为吸收照明光的过程最终会改变它们的结构，使它们不再发光。图10：荧光显微镜。左：工作原理-照明光由短通激发滤光片过滤，并由二向色镜反射到样品。来自样品的荧光通过二向色镜，并被发射滤光片额外过滤以去除图像中残留的激发光。右图：有机晶体中分子的荧光图像(晶体轮廓显示为黄色虚线)。由于来自其他分子和晶体材料的荧光，背景并不完全黑暗。　　免疫荧光显微镜　　免疫荧光显微镜是主要用于在微生物的细胞内的生物分子可视化的位置荧光显微镜的具体变化。在这里，用荧光标记物标记或固有荧光的抗体与感兴趣的生物分子结合，揭示它们的位置。(如下图11)图11：免疫荧光显微镜。肌动蛋白丝(紫色)、微管(黄色)和细胞核(绿色)的免疫荧光标记的两个间期细胞。　　共聚焦显微镜　　共聚焦显微镜是一种显微镜技术，它可以逐点成像来自样品的散射或荧光。不是一次对整个样品进行照明和成像，而是在样品区域上扫描源自点状光源的照明点，敏感检测器仅检测来自该点的光，从而产生2D图像。这种方法允许以高分辨率对弱信号样本进行成像，因为来自采样点之外的不需要的背景信号被有效抑制。在这里，所使用的波长和物镜在所有三个维度上都限制了成像光斑的大小。这允许通过将物镜移动到距样品不同的距离，在样品内的不同深度处制作2D图像。然后可以组合这些2D图像“切片”以创建样本的3D图像，这是所讨论的其他宽视场显微镜技术无法实现的，并且还允许以3D方式测量样品尺寸。这些优势的代价是无法一次性拍摄图像，而是必须逐点构建图像，这可能非常耗时并阻碍样本的实时成像(如下图12)。图12：单分子荧光的共聚焦荧光图像。小点对应于单个分子的荧光，而较大的点对应于分子簇。此处的荧光背景比简单的荧光显微镜图像弱得多，如亮点之间的暗区所见。　　双光子显微镜　　双光子显微镜(Two-photonmicroscopy，TPM)是荧光显微镜的一种变体，它使用双光子吸收来激发荧光，而不是单光子激发。在这里，通过吸收两个光子的组合来激发荧光，其能量大约是单个光子激发所需能量的一半。例如，在该方案中，通常由单个蓝色光子激发的荧光团可以被两个近红外光子激发。在TPM中，图像是逐点建立的，就像在共聚焦显微镜中一样，也就是说，双光子激发点在样品上扫描，样品荧光由灵敏的检测器检测。与传统荧光显微镜相比，激发和荧光能量的巨大差异导致了多重优势：首先，它允许使用更长的激发波长，在样品内散射较少，因此穿透更深，以允许在其表面下方对样品进行成像并创建3D样品图像。同时，由于激发能量低得多，光漂白大大减少，这对易碎样品很有用。激发点周围的荧光背景也大大减少，因为有效的双光子吸收仅发生在激发光束的焦点处，因此可以观察到来自样品小部分的荧光(如下图13)。　　TPM的一个缺点是双光子吸收的概率远低于单光子吸收，因此需要高强度照明，如脉冲激光，才能达到实用的荧光信号强度。图13：双光子显微镜。花粉的薄光学切片，显示荧光主要来自外层。　　光片显微镜　　光片显微技术是荧光显微术的一种形式，其中样品被垂直于观察方向的薄“片”光照射，从而仅对样品的薄切片(通常为几微米)进行成像。通过在样品在光片中旋转的同时拍摄一系列图像，可以形成3D图像。这要求样品大部分是透明的，这就是为什么这种技术通常用于形成小型透明生物结构的3D图像，例如细胞、胚胎和生物体。(如下图14)图14：光片显微镜。左：工作原理。右：通过荧光成像用光片显微镜拍摄的小鼠大脑的荧光图像。　　全内反射荧光显微镜　　全内反射荧光(Totalinternal reflection fluorescence microscopy ，TIRF)是一种荧光显微技术，可通过极薄(约100nm厚)的样品切片制作2D荧光图像。这是通过照明光的渐逝场激发样品的荧光来实现的，当它在两种不同折射率(n)的材料之间的边界处经历全内反射时就会发生这种情况。消逝场具有与照明光相同的波长，但与界面紧密结合。在TIRF显微镜中，激发光通常在载玻片(n=1.52)和样品分散的水介质(n=1.35)之间的界面处发生全内反射。渐逝场的强度随距离呈指数下降来自界面，这样在最终图像中只能观察到靠近界面的荧光团。这也导致来自切片外区域的荧光背景的强烈抑制，这允许拾取微弱的荧光信号，例如在定位单个分子时。这使得TIRF非常适用于观察参与细胞间相互作用的荧光蛋白(如下图15)的微弱信号，但也需要将样品分散在水性介质中，这可能会限制可以测量的样品类型。图15：TIRF图像显示培养的视网膜色素上皮细胞中的蛋白质荧光。每个像素对应67nm。　　膨胀显微镜　　膨胀显微镜背后的基本概念是增加通常需要高分辨率显微镜的样品尺寸，以便可以使用标准显微镜技术(尤其是荧光显微镜)对其进行成像。这适用于保存的标本，例如生物分子、细胞、细菌和组织切片，可以使用下图16中所示的化学过程在所有维度(各向同性)均匀扩展多达50倍。扩展样本可以隔离感兴趣的个别特征通常是隐藏的，可以使它们透明，从而可以对它们的内部进行成像。图16：膨胀显微镜的样品制备。细胞首先被染色，然后连接到聚合物凝胶基质上。然后细胞结构本身被溶解(消化)，使染色的部分随着凝胶各向同性地膨胀，从而使染色的结构更详细地成像。　　光学显微镜中的卷积　　除了使光学系统适应特定用例之外，现代光学显微镜还利用了数字图像处理，例如图像去卷积。该技术通过补偿光学系统本身固有的模糊，可以提高空间分辨率以及光学显微镜拍摄图像的定位精度。这种模糊可以在校准步骤中测量，然后可以用于对图像进行去卷积，从而减少模糊。通过将高性能光学元件与先进的图像处理相结合，数字显微镜可以突破分辨率的极限，以更深入地观察微观世界。(如下图17)图17：图像解卷积。左：原始荧光图像。右：解卷积后的图像，显示细节增加。　　光学显微镜与电子显微镜　　光学显微术通常使用可见光谱中的光波长，由于瑞利准则，其空间分辨率固有地限制为所用波长的大约一半(最多约为200nm)。然而，即使使用具有高NA和高级图像处理的物镜，也无法克服这一基本限制。相反，观察较小的结构需要使用较短波长的电磁辐射。这是电子显微镜的基本原理，其中使用电子而不是可见光照亮样品。电子具有比可见光短得多的相关波长，因此可以实现高达10000000倍的放大倍数，甚至可以分辨单个原子。(如下图18)　　图18：同心聚合物结构中纳米晶体放大15000倍的扫描电子显微镜图像，即使是细微的细节，例如基材的孔隙，也能分辨出来。　　总结与结论　　光学显微镜是一种强大的工具，可用于检查各种应用中的小样本。通过调整用于特定用例的照明和成像技术，可以获得高分辨率图像，从而深入了解样品中的微观结构和过程。文中，我们讨论了各种光学显微镜技术的特点、优势和劣势，这些技术在光线照射和收集方式上有所不同。显微镜种类优点技术限制典型应用亮视野显微镜结构相对简单，光学元件很少低对比度、完全透明的物体不能直接成像，可能需要染色对彩色或染色样品和部分透明材料进行成像暗视野显微镜显示小结构和表面粗糙度，允许对未染色样品进行成像所需的高照明功率会损坏样品，只能看到散射图像特征细胞内颗粒成像，表面检测相差显微镜实现透明样品的成像复杂的光学设置，需要的高照明功率会损坏样品，通常图像较暗跟踪细胞运动，成像幼虫微分干涉对比显微镜比PCM更高的分辨率复杂的光学设置，需要的高照明功率会损坏样品，通常图像较暗活的、未染色的细胞和纳米颗粒的高分辨率成像偏光显微镜来自样品非双折射区域的强背景抑制，允许测量样品厚度和双折射需要双折射样品成像胶原蛋白，揭示晶体中的晶界荧光显微镜允许挑出样品中的单个荧光团和特定的感兴趣区域，可以克服分辨率限制需要荧光样品和灵敏的检测器，光漂白会减弱信号成像细胞成分、单分子、蛋白质免疫荧光显微镜使用抗体靶向可视化特定的生物分子大量样品制备，需要荧光样品，光漂白识别和跟踪细胞和蛋白质共聚焦显微镜低背景信号，可以创建3D图像成像速度慢，需要复杂的光学系统3D细胞成像，荧光信号较弱的成像样品，表面分析双光子显微镜样品穿透深度、背景信号低、光漂白少成像速度慢，需要复杂的光学系统和大功率照明神经科学，深层组织成像光片显微镜图像仅样品的极薄切片，可通过旋转样品创建3D图像成像速度慢，需要复杂的光学系统细胞和生物体的3D成像全内反射荧光显微镜强大的背景抑制，极精细的垂直切片成像仅限于样品的薄区域，需要复杂的光学系统，样品需要在水介质中单分子成像，成像分子运输膨胀显微镜提高标准荧光显微镜的有效分辨率需要对样品进行化学处理，不适用于活体样品生物样品的高分辨率成像　　参考：　　1. 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生物课上，一台显微镜、一片菜叶子加上一只青蛙或者鲫鱼，一场生物显微解剖课开场了。各自不免兴奋，显微镜是多么神奇的一个东西!它让我们能够看到流淌江水中的各种微生物，能够知晓细胞内形形色色的细胞器，能够区分出猩猩有24对染色体而人却只有23对。　　这都要归功于16世纪一个叫Zacharias Jansen的荷兰人，我们不清楚他如何想到将两个镜片叠在一起并放在管子的两头，但是这个奇怪想法催生出的工具，却能够在压缩最小的时候放大3倍，拉到最长时可以放大达到10倍。他在孩童时期的嘻哈把玩，将我们带进了令人瞠目结舌的微观世界。　　▲玩出来的显微镜　　很奇怪，做出显微镜的第一人不是生物学家，而是一个观星的人&mdash &mdash 现代物理学与天文学之父伽利略。1609年，在听说了这个孩子的发明后，他不仅研究明白了这些镜片在一起能够放大很多倍的原理，还制造出了一台更为精密的工具，并将其命名为occhiolino(也被称为little eye)。从此，现代意义上的显微镜走进人们的视野。　　然而，显微镜真正发展成为一个学科，成为窥视微观世界的独门兵器，还是要等到17世纪六、七十年代。列文虎克，这个出生于1632年的荷兰小伙子，在稚嫩的年纪就不得不面对父亲的去世，被迫来到阿姆斯特丹的一家干货商店当学徒，在那里他接触到放大镜，产生极大的兴趣。闲暇之余，他便耐心地磨起了自己的镜片。或许是太无聊，或许是太好玩，他一生中竟然磨制了400多个透镜，放大倍数竟然可以达到300倍!利用自制的显微镜，列文虎克为我们展现了一个全新的微观世界，他第一个发现并描绘了细菌，展现了一滴水中的世界，准确地描述了红细胞，证明了马尔皮基推测的毛细血管层是真实存在的，他成为了微生物学的奠基人。　　与列文虎克同期的，还有一个叫做罗伯特&bull 胡克，被称为&ldquo 伦敦的莱奥纳多&bull 达&bull 芬奇&rdquo 的英国博物学家。你说对了，&ldquo 胡克定律&rdquo 就是以他名字命名的。他不仅提出了弹性材料的胡克定律，万有引力的平方反比关系，设计了真空泵，还利用自制的显微镜发现了软木中的&ldquo 小室&rdquo ，并将&ldquo cell&rdquo 一词深深地刻进了现代人的脑海中。从此，显微镜的发展进入了快车道，出现了形式多样、拥有不同功能的各色显微镜。　　▲光学显微镜　　灯泡的发明让那些狂热的显微镜粉丝们欣喜不已，终于可以在晚上也可以使用高倍镜片来触摸微观世界了。但是当他们将光源经聚光镜投射在被检样本上后，却发现在视野中除了有那些小东西，竟然还发现了灯丝的影像。直到1893年，一个叫柯勒的年轻人，发明了二次成像技术，成功地将热焦点落在了被检样本之外，不仅光线均匀了，而且也不会损伤样本。这种被称为柯勒照明的光源系统，成为了现代光学显微镜的关键部件。　　显微镜的变革，也使细胞学迎来了最为辉煌的发展时期。细胞器、染色体等细胞染色方法的出现，使人们对于细胞这一生命最基本单位有了相当深入的认识。但是，染色毕竟影响甚至杀死了细胞，跟一堆死细胞玩真是太没意思了!直到20世纪二、三十年代，弗里茨&bull 泽尔尼克在研究衍射光栅的时候，发明了相差显微技术，这一情况才被彻底改变。　　再后来，出现了各种形形色色的显微镜，按照设计方式的不同，有正立的、倒立的，还有解剖显微镜，按照目镜的个数，有单目镜的、双目镜的，还有直接数码相机采集图像的，有使用偏振光作光源的，还有不将光直接射入样本的暗视野显微镜，还有选定特定波长的光波照射样本，以产生荧光的荧光显微镜。　　▲瓶颈所在　　十八世纪，光学显微镜的放大倍数已经可以达到1 000倍，直到现在人们也只能将其提高到1 600倍左右这个极限了。不是因为技术不够，而是因为显微镜的最大分辨率受到光源波长的限制。　　光在传播途径中，如果碰到的障碍物或者小孔的尺寸远大于光的波长时，就会被反射回去或者穿透过去，可以看作是沿直线传播。但是当物体尺寸与光波差不多甚至还要小的时候，光波就会发生衍射现象并绕过去。不论我们怎样磨镜片，或者使用油镜来提高清晰度，显微镜的分辨率最多也只能达到光波长的一半。而我们肉眼通常能感知的可见光，波长范围在0.39&mu m ~0.76&mu m，即便使用0.39&mu m左右的紫外光，理想状况下，也就能达到0.2&mu m的分辨率。所以，要想提高分辨率，只能改变光源，并且改用仪器来探测放大的图像。　　▲新时代的骄子　　当人们意识到用光学显微镜看不到原子般细微的物质，那么就会想法进一步提高显微镜的分辨率，别的办法行不通，那就只能寻找比光波波长还短的光源。还有哪些波的波长比光波还短?当然是电子。注意，是电子，不是家里电线中220 V的电&hellip &hellip 　　1924年，德布罗意提出了波粒二象性的假说，根据这一假说，电子也会具有干涉和衍射等波动现象，这被后来的电子衍射试验所证实。接着汉斯&bull 布什又开创了电磁透镜的理论。这些使人们产生了制作显微镜的新想法：为什么不用具有波动性的电子做&ldquo 光源&rdquo ，再用电磁透镜来放大呢?于是，1932年德国工程师恩斯特&bull 鲁斯卡和马克斯&bull 克诺尔制造出了第一台透视电子显微镜，这是近代电子显微镜的先导，鲁斯卡也因此获得了1986年度的诺贝尔物理奖。　　电子显微镜有着与光学显微镜相似的成像原理，它的神奇之处在于用电子束代替光源，而电磁场也化身成了透镜：高速的电子束在真空通道中穿越聚光镜再透过样品，带着样品内部的结构信息投射在荧光屏板上，最终转化成可见光影像。另外，由于电子束的穿透力很弱，用于电子显微镜的标本，需要用超薄切片机制成厚50纳米左右的超薄切片，稍微厚一点，电子就可能做无用功。如果给飞奔的电子再来一马鞭，电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍，分辨率可以达到纳米级(10-9 m)。　　用电子束代替光看起来已经是一个反常规的奇妙主意，但让人想不到的还在后面。1983年，IBM公司苏黎世实验室的两位科学家格尔德&bull 宾宁和海因里希&bull 罗雷尔，发明了扫描隧道显微镜，这是一种利用量子理论中的隧道效应探测物质表面结构的仪器。这种显微镜比电子显微镜更激进，它的出现完全抛开了传统显微镜的概念。　　最神奇的是，扫描隧道显微镜没有镜头!没有镜头也敢叫&ldquo 显微镜&rdquo ?没错，这不是山寨的时候出了问题，它原原本本就是这么设计的。扫描隧道显微镜依靠&ldquo 隧道效应&rdquo 进行工作，如同一根唱针扫过一张唱片。一根有着原子般大小的探针慢慢通过被分析的物体，当探针距离物体表面很近时(大约在纳米级的距离)，电子会穿过物体与探针之间的空隙，形成一股微弱的电流。如果探针与物体的距离发生变化，这股电流也会相应改变，通过测量电流我们就能知道物体表面的形状。所以，当电流经过一个原子，便能极其细致地描绘出它的轮廓，通过绘出电流量的波动，我们就可以得到单个原子的美丽图片。　　电子显微镜的出现，&ldquo 神马&rdquo 细菌、病毒、DNA、蛋白质大分子、原子核、电子云啥的，都得规规矩矩老实听话，要不，来探针下现个原形?　　▲未知的微观世界　　对人来说，安全电压是36 V，可是对于电子显微镜下的观测样品，其接收到的辐射剂量等同于10万吨当量的氢弹在30米远处爆炸的辐射量!当生物标本暴露于电子束中时，细胞结构和化学键将迅速崩溃，所以电子显微镜虽然精妙却无法用于活细胞的观察。　　麻省理工大学Mehmet教授的研究小组提出，通过使用量子力学的测量技术可以让电子束被约束起来，在稍远的距离感应被观察的物体，一次扫描样品的一个像素，并将这些像素组合起来拼出整个样品的图像，从而避免损坏实验样品。倘若研究成功，它可以使研究人员看到分子在活体细胞内的活动，比如酶在活细胞中的功能或是DNA的复制过程，用以揭示生命和物质的基本问题。　　看电影，你一定希望看到3D的画面。同样的，长期的2D显微镜成像，也让人们感到审美疲劳，于是3D图像技术如雨后春笋般发展起来。共聚焦显微镜已经能够通过移动透镜系统对一个半透明的物体进行三维扫描，通过计算机系统的辅助，对实验材料从外观到内在、从静态到动态、从形态到功能进行观察。　　同时，随着数码摄影技术、信息技术和自动化技术的革新，显微镜的外观、舒适性、自动化程度以及方便性都在提高。例如近几年的大屏幕倒置显微镜，直接通过液晶显示器来观察，研究细胞结构就像在电脑上看电影，大大减轻了显微镜观察时的疲劳。

现如今，全球跨国际性的合作已很常见，而有效促进合作更便利的工具就显得尤为重要。为此，Octonus开发了3DDM，这是一款高度精确且灵活的3D数字显微镜，能够让身处不同位置的团队成员在虚拟会议室中同时查看3D物体。而且3DDM还提供各种图像增强选项，使查看者可以使用单个系统快速查看更详细和完整的物体图片。Octonus凭借超过20年生产工业图像处理和分析系统的经验，已为许多项目提供硬件和软件。该公司是重构半透明物体内部结构的光学方法开发以及2-50毫米尺寸物体的精确3D模型开发方面的先驱者。3DDM的含义及工作原理Octonus 3DDM是以Leica Microsystems 的（Wetzlar，德国）M205a立体显微镜为基础。3DDM由一个标准的Leica平台和以下附件组成：一个安装在电动精密滑台上的物体支架，一个定制的LED照明系统以及一对FLIR Grasshopper3 相机。FLIR Grasshopper3相机FLIR Grasshopper3 相机系列将新的CCD和CMOS技术与Point Grey的专利技术相结合，实现了高性能、高质量的成像。其中Grasshopper3 GigE相机系列主要使用Sony CCD传感器和Sony Pregius IMX174传感器。为了创建图像，操作者在3DDM的物体支架上安装了一个样本。操作者可以使用鼠标、键盘或3D操纵杆等标准设备在相机的视野下旋转样本。同时，根据相机和系统的光学孔径调整聚焦驱动装置，从而捕获清晰的3D视频图像。随着被照明的样本在物体支架上旋转，两个FLIR Grasshopper GS3- U3-23S6C-C彩色相机会捕获实时的高质量视频流。PC以压缩视频格式将相机捕获的数据存储为3D视频流或3D/2D图像。它还在图像或视频序列的基础上存储每帧的完整数据集（光学孔径、光照系统和支架的所有数字设置），这使处理实时或录制数据成为可能。在PC上运行的图像分析软件以高十微米的精度测量物体特性。合并的2D/3D模式允许在3D空间中和沿穿透物体的投影面进行测量。3DDM的物体照明和数字增强选项凭借显微镜的多功能LED光源，可通过多种方式照明样本。光源可以同轴提供可见的近红外或紫外照明，到样品的背面，或到侧面，具体取决于其编程。暗视野照明是一种非常适用于捕获天然活体生物样本图片序列的技术，可增强所收集图片的对比度。3DDM还提供各种数字增强选项，使操作者能够捕获细节。这些选项的示例包括：★ 高动态范围成像 (HDRI) 可在原本曝光不佳的区域增强正确捕获的图像细节；★ 12位色调映射在标准显示器上支持精确的HDR图像显示；★ 扩展景深 (EDF) 技术用显示整个聚焦物体的单张照片的分析替代照片序列的分析；★ 自动提高图片分辨率和视野的图像切换算法。3DDM的更多功能虚拟会议室3DDM使用3D电视和立体眼镜来创建虚拟会议室，从而促进全球团队合作。演讲者可以添加经过标注的图像，或通过使用鼠标光标、切换图像、放大和缩小、更改FPS或者添加和删除图层来将同事的注意力引导到重要的细节上。还可以通过3D模型、测量工具和增强现实等计算机生成的输入，对现实世界的元素进行补充。定制3DDM为客户和开发人员提供C++ SDK（软件开发工具包）。该SDK可用于控制系统的光照、光学单元和支架，它还允许对现有图像处理算法进行扩展或添加。后续步骤在不久的将来，Octonus将通过把其相机从2.3 MP 升级到5-12 MP，提高3DDM所捕获的3D视频图像的分辨率。Octonus开发的3DDM中最核心的要素就是FLIR Grasshopper相机它让图像细节捕获的更加清晰让全球各地的团队合作更加紧密