免疫组化原位杂交系统

目前，国内外最好的原位杂交仪，是什么品牌阿 ，大概价位是多少，原位杂交仪是杂交炉吗？

急购一台国产原位杂交仪，需要提供资料，价钱和试用期限联系bbfsun@126.com电话02137601298[em0805]

关键词免疫组化，抗原，一抗，二抗目的：蛋白物质的定性、定位检测。背景知识：20世纪30年代，随着生物化学的发展和电子显微镜技术的应用，组织化学迎来了复兴时代。自从E. Takamatsu（高松英雄）和G. Gomori 1939年同时证明了硷性磷酸酶的组织化学方法，以后的30年间，酶组织化学得到了飞速发展，高松证明了磷酰胺酶、ATP酶；Gomori设计了酸性磷酸酶、脂酶、酯酶等组织化学证明法。 此间，金属盐法，硫化钴法，偶氮色素法，偶氮色素四唑盐法（tetrazolium salts method）以及磷酸化酶组织化学证明法等相继问世。特别是H. Scheldon和D. Brandes等人把电镜与酶组织化学结合起来，以金属沉淀法观察了酸性磷酸酶和硷性磷酸酶，奠定了电镜酶组织化学（electron microscope enzyme histochemistry）基础。后来A. M. Seligman(1967)提出锇黑化法（Osmification method）进一步阐述了电镜组织化学的基本原理和反应过程。 1950年A. H. Coons等人提出了荧光抗体法，从而把免疫学引入组织化学实验中，后来P. K. Nakane，S. Avrameas 和L. A. Sternberger等人以辣根过氧化物酶为标记物对酶进行观察，创立了酶标抗体法，从而为组织化学开辟了新途径。 随着分子生物学的发展，1969年人们把分子杂交技术应用到组织切片和细胞标本上，开始探索原位杂交技术，经过30年不断应用、完善和发展，特别是探针制备与标记物两大关键技术的突破，目前原位杂交技术已广泛应用于遗传学、病毒学、神经内分泌学、病理学、免疫学和发育生物学等各个领域，显示出巨大的应用潜力。 现代组织化学已经渗透和应用于生命科学的许多学科，经过近几十年的发展，产生了许多分支，如核酸与核蛋白、蛋白质与氨基酸、脂类与脂蛋白、碳水化合物与粘蛋白及粘多糖、无机物组织化学、酶组织化学电镜组织化学、荧光组织化学、免疫组织化学、同工酶组织化学、定量组织化学、原位杂交组织化学和放射自显影技术等。总之，现代组织化学的概念已经远远超过了原有范围，无论从理论、内容、技术手段、研究范围都比过去更广泛、更深入。 原理：理论基础是基于利用放射性核素和其他标记物（荧光素，酶， 重金属离子等）作为示踪剂，通过免疫亲和（抗原-抗体特异性结合）和核酸杂交（碱基配对特异性连接）途径，在组织切片或细胞涂片上，原位显示生物大分子的动态变化而建立的一门染色技术。 主体内容（一）、仪器设备1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2）水浴锅 （二）、试剂 1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA•2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。 5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。7）封裱剂：a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合； b、油和TBS(或PBS)配制。 8）TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。 [font='Helvetica Neue', Hel

原位杂交组织化学的方法和常用试剂配制　　一、杂交前准备　　（一）DEPC水是经DEPC处理过的灭菌蒸馏水。　　DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可灭活各种蛋白质，是RNA酶的强抑制剂。原位杂交在杂交及其以前的各步处理中，所有液体试剂都应经DEPC处理。方法是：取市售DEPc 1ml，加入1L待处理水（蒸馏水等）中，经猛烈振摇后，于室温静止数小时，然后高压灭菌，以除去降解DEPC（DEPC分解为CO2和乙醇）。有些试剂可直接加入DEPC，终浓度一般为0.1%～0.4%，原则上在杂交及其以前的步骤中，所有液体试剂均需用DEPC处理，或用DEPC水配制，包括乙醇的稀释。此外，接触标本以及标本有关的空中的洗涤也需DEPC水洗涤。　　注意：DEPC是一种潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的条件下进行，并避免接触皮肤。②含有Tris缓冲液的溶液中，不能加入DEPC。　　（二）载玻片的处理　　组织原位杂交，常在载玻片上进行，故载玻片的洗涤至关重要，必须保持清洁，并且不能有任何核酸的污染。处理方法如下：　　（1）先经洗衣粉浸泡过夜，次日自来水冲洗后，泡酸数小时以上，取出后再用流水冲洗，双蒸水冲洗2～3次，置160℃以上烤箱中烧烤4h以上，或经15磅高压灭菌20min。经以上处理可清除载片上的核酸酶。（2）HCl处理法试剂: 1M HCL, DEPC 水, 95%乙醇步骤: a. 玻片在室温下于1M HCL中浸泡30分钟 b. DEPC水中洗片 c. 95%乙醇中洗片 d. 空气中干燥 e. 重复一遍 a—d. f. 铝箔包好备用.　　（三）硅化　　【方法１】（1）将一扎新的盖玻片散开，在通风条件下于0.1mol/L的HCI中煮20min,等其冷却后,倒掉盐酸。　　（2）用去离子水沉漂洗玻片，竖放在架子上自然干燥。　　（3）硅化盖玻片：通风条件下，将单块的盖玻片在二甲二氯硅浣（dimethyldichorsilane,DMDC）液中浸几下，竖入在架子上干燥。　　（4）收集干燥的盖玻片于一可耐热的petri氏盘（或培养皿）中，用去离子水漂洗数次，彻底清洗。　　（5）用铝箔将装有盖玻片的培养皿包好，于180℃烘烤4h过夜。取出待冷至室温后，即可进行后续处理。附：2%DMDCDMDC 2ml 三氯乙烷 98ml　　配制：按比例两者充分混匀，静止待气泡消失即可使用。　　用途：硅化玻片（载片、盖片均可）。　　【方法2】将经过洗净的玻璃盖片分散开放在一金属网中，并将该网放入一接有真空泵的干燥器中。同时，在干燥器中放一盛有约1m二甲二氯硅浣（dimethyldiorosilane,DMDC）的小烧杯。盖好干燥器（确保密闭），抽真空约5min，然后让空气冲入。取出盛有盖片的金属网架，用锡箔纸包埋，于250℃以上烘烤4h以上，最好过夜。冷却后备用。　　　本法可用于玻璃及塑料器皿的硅化。塑料器皿只能于60℃烧干。【方法3】APES（氨丙基三乙氧基硅浣）法 试剂: 2%的APES/丙酮(V/V), 丙酮, DEPC水 步骤: 1. 玻片先于室温中在APES液中浸泡10秒2. 丙酮中洗涤3.DEPC水中漂洗4.空气中干燥5.4度保存(最好用铝箔包好,避免污染)

一、定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。二、原理 根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。三、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。四、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1）免疫荧光方法 是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。2）免疫酶标方法 免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。 本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是：定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。 免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，且随着方法的不断改进和创新，其特异性和灵敏度都在不断提高，使用也越来越方便。目前在病理诊断中广为使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法检测系统等。3）免疫胶体金技术 免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。五、被检测的物质 组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激 素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。六、特点 1）特异性强。免疫学的基本原理决定抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时，才会出现交叉反应。2）敏感性高。在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍；现在由于ABC法或SP三步法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。3）定位准确、形态与功能相结合。该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学领域开展深入研究是十分有意义的。七、从蛋白水平检测角度，免疫组化技术与Western blotting、ELISA的异同 1）Western blotting：蛋白质免疫印迹，也是利用抗体抗原反应原理，结合化学发光等技术来检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法。与免疫组化技术相比，定量可能更加准确；当然Western blotting也可定性和定位（通过提取膜蛋白或核蛋白、胞浆蛋白分别检测其中抗原含量，进而间接反映它们的定位），但敏感性远远低于免疫组化技术。2）ELISA：酶联免疫吸附试验，也是利用抗体-抗原-抗原结合反应原理来检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测。与免疫组化技术相比，定量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一。

[font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/immunofluorescence-service][b]免疫荧光技术[/b][/url]（[/font][font=Calibri]Immunofluorescence technique [/font][font=宋体]）是在免疫学、生物化学和荧光成像系统基础上建立起来的检测技术。技术原理是根据抗体[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗原特异结合，以荧光标记抗体示踪组织或细胞内相应抗原。免疫荧光技术因特异性强、灵敏度高和操作简便的优势广泛应用于免疫学、微生物学、病理学、肿瘤学以及临床检验等生物学和医学。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]免疫组化，是应用免疫学基本原理[/font][font=宋体]——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究，称为免疫组织化学技术[/font][font=Calibri](immunohistochemistry)[/font][font=宋体]或免疫细胞化学技术[/font][font=Calibri](immunocytochemistry)[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]区别：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]免疫组化和免疫荧光都经过免疫原，原理相似，只是显色剂不同，免疫荧光是免疫组化技术之一。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、免疫组化是应用免疫学的基本原理，即抗原和抗体特异性结合的原理，通过化学反应确定组织细胞中的抗原，使标记有抗体的显色试剂显色，并对其进行定位、定性和相对定量研究。在免疫组化过程中，常用的显示剂包括荧光素、酶、金属离子或同位素。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、免疫荧光是一种不会影响抗原和抗体活性的荧光色素，被标记在抗体或抗原上，然后与其对应的抗原或抗体结合，在荧光显微镜下呈现特异性的荧光反应。免疫荧光是免疫组化技术之一，具有特异性强、灵敏度高、速度快的特点。但相对结果判断的客观性不足，技术程序复杂。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]免疫组化与免疫荧光的真正目的均为明确病理诊断，以便患者获得精准治疗。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州拥有专业的技术人员和共聚焦显微镜等仪器平台，为客户提供高质量的免疫荧光检测服务，包括对细胞爬片、石蜡切片、冷冻切片和组织芯片等进行免疫荧光单染、双染、及多重染色等。可以为客户提供免疫荧光（[/font][font=Calibri]IF[/font][font=宋体]）检测服务和石蜡切片免疫组化（[/font][font=Calibri]IHC[/font][font=宋体]）检测服务，有需求的朋友可以来义翘官网进行查询，详情参看[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/immunofluorescence-service[/font][/font]

[font=Calibri][font=宋体]免疫组化技术，运用免疫学的基本原理[/font][font=Calibri]——[/font][font=宋体]抗原抗体反应，即抗原与抗体之间的特异性结合。通过化学反应，使标记在抗体上的显色剂（如荧光素、酶、金属离子、同位素）显现颜色，从而确定组织细胞内的抗原（多肽和蛋白质）。该技术不仅对这些抗原进行定位，还能进行定性和相对定量的研究。这种技术被称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](immunocytochemistry)[/font][/font][font=Calibri][font=宋体]。[/font][/font][font=Calibri][font=宋体]免疫组化，简而言之，是免疫学、组织学和化学的完美结合。它利用免疫学方法对组织进行标记，再通过化学方法进行染色，从而标记出组织中的特定蛋白或一组蛋白。这项技术目前在临床病理诊断中得到了广泛应用，并衍生出了多种技术变种，如免疫细胞化学、免疫组织荧光等，为生物医学研究提供了强大的工具。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]一、免疫组化技术的基本原理[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂[/font][font=Calibri]DAB[/font][font=宋体]显示为棕黄色颗粒）。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]二、免疫组织化学染色方法[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）；与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、按结合方式可分为抗原—抗体结合，如过氧化物酶[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗过氧化物酶（[/font][font=Calibri]PAP[/font][font=宋体]）法和亲和连接，如卵白素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]生物素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]过氧化物酶复合物（[/font][font=Calibri]ABC[/font][font=宋体]）法、链霉菌抗生物素蛋白[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]过氧化物酶连结（[/font][font=Calibri]SP[/font][font=宋体]）法等，其中[/font][font=Calibri]SP[/font][font=宋体]法是最常用的方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]三、几种常用免疫组织化学方法的原理[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、免疫荧光方法[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、免疫酶标方法[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]免疫酶标方法是继免疫荧光后，于[/font][font=Calibri]60[/font][font=宋体]年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是：定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，且随着方法的不断改进和创新，其特异性和灵敏度都在不断提高，使用也越来越方便。目前在病理诊断中广为使用的当属[/font][font=Calibri]PAP[/font][font=宋体]法、[/font][font=Calibri]ABC[/font][font=宋体]法、[/font][font=Calibri]SP[/font][font=宋体]法等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、免疫胶体金技术[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]如葡萄球菌[/font][font=Calibri]A[/font][font=宋体]蛋白[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]四、免疫组化技术的优点[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、特异性强 免疫学的基本原理决定了抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（[/font][font=Calibri]keratin[/font][font=宋体]）显示上皮成分，[/font][font=Calibri]LCA[/font][font=宋体]显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、敏感性高 在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍；现在由于[/font][font=Calibri]ABC[/font][font=宋体]法或[/font][font=Calibri]SP[/font][font=宋体]法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、定位准确、形态与功能相结合 该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学研究的深入是十分有意义的。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=Calibri][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/immunohistochemistry-service][b]石蜡切片免疫组化（[/b][/url][/font][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/services/immunohistochemistry-service][b]IHC[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/immunohistochemistry-service][b]）检测服务[/b][/url]，更多详情可以关注：[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/immunohistochemistry-service[/font][/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=Calibri] [/font]

[font=宋体]在生物学和医学领域，免疫组化和免疫分型是两种常用的实验技术，它们各自具有独特的应用和优势。虽然这两种技术都涉及到免疫学的原理和方法，但它们在实验目的、操作过程、结果解读等方面存在显著的差异。本文将对免疫组化和免疫分型进行详细的比较和讨论，以揭示它们之间的区别。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]定义区别：[/font][/b][font=宋体][font=宋体]免疫组化（[/font][font=Calibri]Immunohistochemistry[/font][font=宋体]）是一种利用免疫学原理，通过特异性抗体与细胞或组织中的抗原进行反应，进而通过染色或标记等方法来定位和检测抗原的技术。其主要应用于组织切片或细胞涂片的染色，以观察和研究抗原在细胞或组织中的分布、定位及表达情况。免疫组化技术可以帮助我们了解细胞或组织的类型、功能状态以及病理变化，对于疾病的诊断、预后评估以及药物研发等方面具有重要意义。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]免疫分型（[/font][font=Calibri]Immunophenotyping[/font][font=宋体]）是一种通过检测细胞表面或细胞内的特定抗原，来识别和分析细胞类型的技术。该技术主要应用于对免疫细胞（如淋巴细胞、巨噬细胞等）进行分型，以了解其在免疫系统中的功能和作用。免疫分型技术可以帮助我们深入了解免疫系统的结构和功能，揭示免疫细胞在疾病发生和发展过程中的作用，为疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]实验目的区别：[/font][/b][font=宋体]免疫组化主要关注抗原在细胞或组织中的定位和表达情况，而免疫分型则侧重于对免疫细胞进行分型和功能分析。从操作过程来看，免疫组化通常需要对组织或细胞进行切片、固定、染色等步骤，而免疫分型则可能涉及到细胞的分离、培养、流式细胞术等操作。从结果解读来看，免疫组化的结果主要表现为抗原在细胞或组织中的分布和表达模式，而免疫分型的结果则提供了关于免疫细胞类型、比例和功能状态的信息。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]应用领域区别：[/font][/b][font=宋体]免疫组化在病理学、肿瘤学、神经科学等领域有广泛应用，可以帮助医生进行疾病的诊断和预后评估。而免疫分型则更多地应用于免疫学、血液学、感染病学等领域，有助于深入了解免疫系统的功能和疾病发生机制。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]综上所述，免疫组化和免疫分型是两种具有不同特点和应用领域的实验技术。虽然它们都涉及到免疫学的原理和方法，但在实验目的、操作过程、结果解读以及应用领域等方面存在显著的差异。因此，在实际应用中，我们需要根据研究目的和需求选择合适的技术手段，以获取准确、可靠的实验结果。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/flow-cytometry-service][b]流式细胞检测技术服务[/b][/url]，详情关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/flow-cytometry-service[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

（一）、仪器设备 医用微波炉； 水浴锅。 （二）、试剂 0.2mol/L HCl：HCl 8.2ml，H20 定容0.5L。0.1mol/L三乙醇胺(pH8.0):三乙醇胺 5.33ml，H20 定容0.4L。.5ml/L醋酸-2.5ml/L醋酸酐:三乙醇胺 13.2ml，NaCl 5g，浓HCl 4ml，H20 定容0.98L，醋酸酐 （用前加）2.5ml。20×SSC(pH7.0)：NaCl 175.3g，枸橼酸钠 88.2g，H20 定容1L。100×Denhardt's：Ficoll 1g，PVP 1g，BSA 1g，H20 定容50ml。杂交液：Formamide 5ml，20×SSC 2.5ml，Dextran sulfate 1g，100×Denhardt's 0.5ml，10%SDS 0.5ml，10g/L sperm DNA 0.1ml，H20 1.4L。BufferⅠ（pH7.5）：0.1mol/L ris·Cl，0.15mol/L NaCl。BufferⅢ（pH9.5）：0.1mol/L Tris·Cl，0.1mol/L NaCl，0.05mol/L MgCl2。BufferⅣ（pH8.0）：10mmol/L Tris·Cl，1mmol/L EDTA。

[font=宋体]多重免疫组化（荧光）染色技术，以其高精度描绘肿瘤微环境中肿瘤与免疫细胞状态的能力，为肿瘤的精准诊断提供了不可或缺的参考信息。该技术不仅深入揭示了免疫细胞亚群的比例和分布，还特别关注免疫细胞与肿瘤细胞间的空间关系，这些关键信息对于肿瘤预后评估和免疫治疗策略制定具有重大意义。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]mIHC[/font][font=宋体]还可通过与组织芯片、转录[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]蛋白组测序、单细胞测序等技术相结合，去完成各项高通量检测技术的验证任务。根据不同的原理，有不同的方法。下面我们就来一起来了解下这[/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]类常用的技术。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]1.[/font][font=宋体]染色去除技术[/font][/b][/font][font=宋体][font=宋体]作为[/font][font=Calibri]mIHC[/font][font=宋体]常用的方法之一，染色去除技术在不同的平台上被开发出来用于研究肿瘤组织样本。该技术的基本原理是清除样品中的一种标记后，再用一种新的不同标记对样品进行染色，并重复该过程，并实现在单个样品中检测多种抗原，不同的染色去除技术如图[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]2.[/font][font=宋体]荧光基团失活技术[/font][/b][/font][font=宋体][font=宋体]荧光基团失活技术（[/font][font=Calibri]Fluorophore inactivation technologies[/font][font=宋体]）的技术原理与荧光去除技术的原理大体相似。差别在于，它不是通过改变[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]条件，变性、光漂白来去除荧光，而是通过化学灭活来消除荧光基团。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]在该技术原理基础上开发的芯片式成像深度分析系统（[/font][font=Calibri]ChipCytometry[/font][font=宋体]），是一种基于成像的细胞术平台，结合了多重标志物显微成像和流式数据分析法，从根本上实现了对传统方法的各类局限的突破，并可以对细胞和组织切片的生物标志物的表达和空间分布进行成像可视化检测分析。德国柏林[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]勃兰登堡再生医学中心也借助该技术完成了人胎盘冷冻切片中原位检测间充质干细胞（[/font][font=Calibri]MSCs[/font][font=宋体]）多种表面标志物如[/font][font=Calibri]CD73/CD90/CD105/CD45/CD34/CD19[/font][font=宋体]的表达及空间分布分析。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]3.[/font][font=宋体]多重信号放大技术[/font][/b][/font][font=宋体][font=宋体]为了克服检测低表达抗原的局限性，随着科技的发展，多重信号放大技术应运而生。该技术包括基于多重修饰半抗原、酰胺信号放大（[/font][font=Calibri]TSA[/font][font=宋体]）和纳米晶体量子点等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]其中，[/font][font=Calibri]TSA[/font][font=宋体]是常用的多重信号放大技术之一。[/font][font=Calibri]TSA[/font][font=宋体]是在传统的免疫组化染色基础上，基于信号分子沉淀原理，在[/font][font=Calibri]H2O2[/font][font=宋体]存在时，抗体上标记的[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]将荧光物质标记的底物酪胺（[/font][font=Calibri]t[/font][font=宋体]）转化为具有短暂活性的中间状态（[/font][font=Calibri]t*[/font][font=宋体]），然后被激活的底物分子迅速与相接蛋白分子的富含电子区域（酪氨酸残基）进行稳定的共价结合；由于相接蛋白（抗原、[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]等）都含有大量的酪氨酸结合位点，所以会富集大量信号，使得信号被有效放大。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]经过多轮不同种类荧光物质标记的底物酪胺的染色，即可在一张样本上实现多色免疫荧光标记。[/font][font=Calibri]TSA[/font][font=宋体]技术的优点是，可通过共价结合的方式将荧光信号结合到目标样本上，不易丢失，且经[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]放大后信号更强。缺点则是由于荧光信号的交叉作用，针对一份样本染色种类较多时，容易出现串色的情况（这一点[/font][font=Calibri]ChipCytometry[/font][font=宋体]技术倒是做的很好），也因此，多色标记的数量受到了限制，最多仅能做到在一张样本切片上进行[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]～[/font][font=Calibri]7[/font][font=宋体]色的荧光染色。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]4.DNA[/font][font=宋体]条形码技术[/font][/b][/font][font=宋体][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]条形码技术（[/font][font=Calibri]DNA Barcoding Technologies[/font][font=宋体]）是利用标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]片段（[/font][font=Calibri]DNA barcode[/font][font=宋体]）在物种种内的特异性以及种间的多样性而创建的一种新的生物身份识别系统，该技术利用[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的特性，可以达到扩展[/font][font=Calibri]mIHC[/font][font=宋体]能力的目的。基于[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]条形码技术开发的[/font][font=Calibri]mIHC[/font][font=宋体]技术种类较多，这里我们简单介绍下，空间多靶标分析技术（[/font][font=Calibri]Digital Spatial Profiling[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]DSP[/font][font=宋体]）是一种基于紫外光可切割的寡核苷酸标签，可与抗体或[/font][font=Calibri]mRNA[/font][font=宋体]杂交探针耦合，来检测蛋白质与[/font][font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]的高复杂度空间信息的分析方法。该技术使用紫外线将抗体上的高聚寡核苷酸标签解耦，并从组织表面提取，使样品可以重复使用。寡核苷酸条形码再经过定量分析，并反应组织的空间原位信息，可以帮助研究者在复杂的疾病或是组织中快速、精准地量化其异质性，有助于生物标记的发掘及疾病致病机理的深入研究。[/font][font=Calibri]DSP[/font][font=宋体]已被成功用于分析接受检查点阻断治疗的黑色素瘤患者的肿瘤特征，并证明基线免疫浸润与治疗反应之间存在相关性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]5.[/font][font=宋体]质谱流式细胞技术[/font][/b][/font][font=宋体][font=宋体]质谱流式细胞技术（[/font][font=Calibri]Mass Cytometry[/font][font=宋体]）是利用质谱原理对单细胞进行多参数检测的流式技术。它既有传统流式细胞仪高速分析的特点，又具有质谱检测的高分辨能力。[/font][/font][font=宋体]与传统[url=https://cn.sinobiological.com/services/flow-cytometry-service][b]流式细胞技术[/b][/url]的差别在于：[/font][font=宋体]第一、传统流式使用各种荧光基团作为抗体的标签，质谱流式则使用各种金属元素作为标签；[/font][font=宋体][font=宋体]第二、传统流式使用激光器和光电倍增管作为检测手段，质谱流式则逐个通过[/font][font=Calibri]ICP[/font][font=宋体]质谱检测装置，对每个细胞中各种金属标签进行定量检测，进而得知每个细胞中各目标蛋白的含量。应用该技术所引申出的[/font][font=Calibri]mIHC[/font][font=宋体]技术。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]成像质谱流式技术（[/font][font=Calibri]Imaging mass cytometry[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]IMC[/font][font=宋体]），其实是将免疫组化方法与经过充分验证的[/font][font=Calibri]CyTOF[/font][font=宋体]（质谱流式）技术完善融合，可以生成细胞标志物、转录产物以及转导信号等多种因子的组织结构图像。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供的[/font][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/services/fluorescent-multiplex-ihc-services][b]TSA[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/fluorescent-multiplex-ihc-services][b]法多重荧光免疫组化服务[/b][/url]，有一系列屏蔽自发荧光干扰的手段，配合激光共聚焦显微镜的拍摄条件，提供更优质的图像质量，收获更特异的染色结果。更多多重染色服务详情可以关注[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/fluorescent-multiplex-ihc-services[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

[url=http://www.f-lab.cn/hybridization/traymix-s4.html][b]自动分子杂交仪[/b]traymix-s4[/url]是一种进口[b]分子杂交站[/b]和[b]分子杂交微混合器[/b]，采用主动混合中的混沌平流技术 Chaotic Advection technolog实现先进的[b]分子混合杂交仪[/b]。[b]自动分子杂交仪[/b]能够在整个杂交区域（21×60毫米）实现分子的均匀分散，从而得到最好的杂交效果。我们的专利技术-主动混合混沌平流专利技术能够使用 更少样本数量（5皮摩尔），并显著减少杂交时间 大大提高杂交效率，并且可以显著降低背景噪声，提高荧光信号强度，达到最佳杂交效果。我们主动混合混沌平 流专利消除了人为现象，如通常与其他系统一起观察到的死角或气泡，这样可以让使用者一开始就注意到问题，很快在杂交和清洗实验中取得成功，避免浪费时间。[img=自动分子杂交仪]http://www.f-lab.cn/Upload/traymix_s4_5_.jpg[/img][b]自动分子杂交仪[/b]是全自动化分子杂交站，可避免任何错误，能够确保用户获得可重复的结果。自动杂交站具有直观的和方便操作的软件WinTrayMix™ ，非常方便 用户使用，即使是非专业人员经过阅读手册后也可操作。生物学家可以使用一个简单明了的图形用户界面，输入各种的参数和杂交后的步骤：预杂交，杂交和多次清 洗。自动杂交清洗工作站为用户提供了两种操作模式，专家模式和常规模式。其中专家模式允许用户定制自己的方案，具有制定复杂实验进行多级杂交的可能性。这种模式 可用于实验室研究。常规模式可由医院和诊断实验室使用，在他们的诊断检测中的使用可靠的治疗方案。自动化杂交站TrayMix™ S4也可以用于变性操作。[b]自动分子杂交仪[/b]具有显著技术进步 :[list][*]减少微流体混合循环：250μL，以前系统中是513μL。这种减小允许使用更少的试剂和浓度增加的样品，与主动混合技术相结合，提高了杂交精确性（降低背景噪声和更高的斑点强度）。[*]温度调节改进（+/-0.1°C）[*]变性步骤具有可能性[*]与几个温度阶段杂交可在一个简单的方法（专家模式）进行设置。[/list]使用[b][b]自动分子杂交仪[/b][/b]用户可以提高应用的分析结果，如基因表达分析，基因分型，SNP基因分型，染色体异常和遗传性疾病的检测分析 结果，比较基因组杂交（CGH），荧光原位杂交（FISH）蛋白质芯片实验（如DNA /蛋白质相互作用，蛋白质/蛋白质相互作用）。[b][b]自动分子杂交仪[/b]特色[/b]自动化和主动混合 可获得一致和可重复结果减少每次分析的时间和成本[b]自动分子杂交仪[/b]参数外形尺寸：52.6x46.5x21cm重量：19kg处理能力：可单独处理或同时处理4个玻片杂交面积：21x60mm杂交容量： 杂交室60uL 微流体循环：250uL微流体系统： manifold +chamber+caplillaries, 兼容所有常用试剂并具有抗化学腐蚀功能采样量：5uL ~60uL温度范围：25~75°C (+/-0,1°C)编程控制软件：Windows XP， vista, windows7自动分子杂交仪：[url]http://www.f-lab.cn/hybridization/traymix-s4.html[/url]

随着对多种重要生物的大规模基因组测序工作的完成，基因工程领域又迎来了一个新的时代---功能基因组时代。它的任务就是对基因组中包含的全部基因的功能加以认识。生物体系的运作与蛋白质之间的互相作用密不可分，例如：DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、修饰和定位以及信息传导等重要的生物过程均涉及到蛋白质复合体的作用。能够发现和验证在生物体中相互作用的蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质是认识它们生物学功能的第一步。 　　酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到，它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明，酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作，也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此，它在许多的研究领域中有着广泛的应用。本文就酵母双杂交的技术平台和应用加以介绍。　　酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有DNA结合功能域(DNA binding domain,DNA-BD)和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD）。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。　　根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein。将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。在酵母双杂交的基础上，又发展出了　　酵母单杂交、酵母三杂交和酵母的反向杂交技术。它们被分别用于核酸和文库蛋白之间的研究、三种不同蛋白之间的互作研究和两种蛋白相互作用的结构和位点。　　基于酵母双杂交技术平台的特点，它已经被应用在许多研究工作当中。 1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能　　酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径。当我们将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY载体，并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段，并对该片段的编码序列在GENEBANK中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上的联系。另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。例如：Engelender等人以神经末端蛋白alpha-synuclein 蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交CLONTECH MATCHMARKER SYSTEM 3为操作平台，从成人脑cDNA文库中发现了与alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1，并证明了Synphilin-1与alpha-synuclein 之间的相互作用与帕金森病的发病有密切相关。为了研究两个蛋白之间的相互作用的结合位点，找到影响或抑制两个蛋白相互作用的因素，Michael等人又利用酵母双杂交技术和基因修饰证明了alpha-synuclein的1-65个氨基酸残基和Synphilin-1的349-555个氨基酸残基之间是相互作用的位点。研究它们之间的相互作用位点有利于基因治疗药物的开发。　　2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用　　利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应，可以研究抗原和抗体之间的相互作用，但是，它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。例如：来源于矮牵牛的黄烷酮醇还原酶DFR与其抗体scFv的反应中，抗体的单链的三个可变区A4、G4、H3与抗原之间作用有强弱的差异。Geert等利用酵母双杂交技术，将DFR作为诱饵蛋白，编码抗体的三个可变区的基因分别被克隆在AD-LIBRARY载体上，将BD-BAIT载体和每种AD-LIBRARY载体分别转化改造后的酵母菌株中，并检测报告基因在克隆的菌落中的表达活性，从而在活细胞的水平上检测抗原和抗体的免疫反应。　　3、利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药 物对蛋白质之间相互作用的影响　　酵母双杂交的报告基因能否表达在于诱饵蛋白与靶蛋白之间的相互作用。对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。例如：Dengue病毒能引起黄热病、肝炎等疾病，研究发现它的病毒RNA复制与依赖于RNA的RNA聚合酶（NS5）与拓扑异构酶NS3，以及细胞核转运受体BETA-importin的相互作用有关。研究人员通过酵母双杂交技术找到了这些蛋白之间相互作用的氨基酸序列。如果能找到相应的基因药物阻断这些蛋白之间的相互作用，就可以阻止RNA病毒的复制，从而达到治疗这种疾病的目的。　　4、利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图（Genome Protein Linkage Map）众多的蛋白质之间在许多重要的生命活动中都是彼此协调和控制的。基因组中的编码蛋白质的基因之间存在着功能上的联系。通过基因组的测序和序列分析发现了很多新的基因和EST序列，HUA等人利用酵母双杂交技术，将所有已知基因和EST序列为诱饵，在表达文库中筛选与诱饵相互作用的蛋白，从而找到基因之间的联系，建立基因组蛋白连锁图。对于认识一些重要的生命活动：如信号传导、代谢途径等有重要意义。

[font=宋体][font=宋体]多重荧光免疫组化（[/font][font=Calibri]TSA[/font][font=宋体]技术）是一种基于酪胺信号放大技术的染色方法，利用抗原抗体反应对样本中的多种蛋白标志物进行荧光染色标记。这种技术能在同一组织切片上实现多个靶标蛋白的共染色，最多可同时标记数十种蛋白，从而揭示组织微环境中的复杂信息。通过荧光图像分析，我们可以进行定量分析、细胞分型、以及空间关系分析等多方面的深入研究。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]一、技术原理[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]酪酰胺信号放大（[/font][font=Calibri]TSA[/font][font=宋体]）技术利用辣根过氧化酶（[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]）对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记。在[/font][font=Calibri]H2O2[/font][font=宋体]环境下，荧光标记的酪胺分子被[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]催化激活，产生大量酶促反应，使荧光素与抗原紧密结合部位沉积，实现信号放大。[/font][font=Calibri]TSA[/font][font=宋体]技术通过循环使用不同荧光染料，可在一张组织切片上实现多种蛋白的共染色。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]二、优势[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①[/font][font=Calibri]TSA[/font][font=宋体]技术能够显著增强荧光放大信号，其增强幅度大约是普通荧光的[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]～[/font][font=Calibri]10[/font][font=宋体]倍，使得检测更为敏感和准确。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]②在[/font][font=Calibri]TSA[/font][font=宋体]技术中，一抗抗体的种属来源不受限制。不同于普通荧光免疫组化共染的要求，[/font][font=Calibri]TSA[/font][font=宋体]技术每一轮染色后可以将上一轮的一抗和二抗洗掉，对后续染色无影响。这意味着同一种属来源的一抗并不会影响实验结果，为实验提供了更大的灵活性。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]③在[/font][font=Calibri]TSA[/font][font=宋体]技术的实验过程中，无需严格避光。这是因为荧光素具有较高的稳定性，不易淬灭。即使在实验操作过程中没有采取避光措施，也不会对实验结果产生影响。更为便利的是，染色后的玻片可以保存数月之久而不发生淬灭，方便后续重新扫描和分析。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]三、注意事项[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①在准备染料时，要确保完全溶解并混合均匀。若试剂含有有机溶剂并出现沉淀，需先行过滤。[/font][font=宋体]②实验过程中，要防止切片干燥并注意避光，以保持荧光染料的稳定性，防止其淬灭，从而提高实验的准确性和可靠性。[/font][font=宋体]③选择高特异性的第一抗体是关键，它能更准确地识别目标蛋白，减少非特异性染色，从而提高实验的敏感性和特异性。[/font][font=宋体]④选择荧光染料时，要根据第一抗体的表达量来搭配。表达量高的应与弱光搭配，而表达量低的应与强光搭配，以平衡不同抗体间的荧光强度，使实验结果更准确可靠。[/font][font=宋体]⑤在实验前，务必制定详细的方案，包括确定染色顺序、修复条件和每一种抗体所搭配的荧光染料。通过合理的方案设计，可以确保实验的顺利进行，提高实验的一致性和可重复性。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/fluorescent-multiplex-ihc-services][b]多重荧光免疫组化服务[/b][/url]，详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/fluorescent-multiplex-ihc-services[/font][/font]

偶系新人最近要进实验室了，方向是免疫组化方面但是这方面的知识太缺乏了，想找点这方面的资料在这里求助了，谢谢

[quote][b]项目概况[/b]莆田市第一医院罗氏全自动免疫组化染色试剂采购项目（重新招标） 招标项目的潜在投标人应在莆田市公共资源交易中心网获取招标文件，并于2022年12月27日 10点20分（北京时间）前递交投标文件。[/quote][font=inherit]一、项目基本情况[/font]项目编号：PTXH2022009-2项目名称：莆田市第一医院罗氏全自动免疫组化染色试剂采购项目（重新招标）预算金额：200.0000000 万元（人民币）最高限价（如有）：200.0000000 万元（人民币）采购需求：[table][tr][td][align=center]合同包[/align][/td][td][align=center]品目号[/align][/td][td][align=center]货物（服务）名称[/align][/td][td][align=center]主要技术规格[/align][/td][td][align=center]数量[/align][/td][td][align=center]最高限价[/align][align=center]（人民币：万元）[/align][/td][td][align=center]投标保证金(人民币：元)[/align][/td][td][align=center]是否办理进口产品审批手续[/align][/td][td][align=center]备注(是否核心产品)[/align][/td][/tr][tr][td][align=center]1[/align][/td][td][align=center]1-1[/align][/td][td][align=center]罗氏全自动免疫组化染色试剂[/align][/td][td][align=center]详见招标文件第五章招标内容及要求[/align][/td][td][align=center]1批[/align][/td][td][align=center]200[/align][/td][td][align=center]20000[/align][/td][td][align=center]是[/align][/td][td][align=center]是[/align][/td][/tr][/table]合同履行期限：详见招标文件本项目( 不接受 )联合体投标。

[font=宋体][font=宋体]杂交瘤技术作为生产单克隆抗体的主流方法之一，其在生物医学领域的贡献不可忽视。该技术通过免疫小鼠后分离出能够产生抗体的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞，再与永生性骨髓瘤细胞系融合，形成杂交瘤细胞，进而在实验室中培养这些杂交瘤细胞，以产生针对特定抗原的单克隆抗体。杂交瘤抗体的大量生产，既可通过体内腹水制备方法，也可通过体外摇瓶培养方法。杂交瘤技术之所以在制备单克隆抗体上备受青睐，关键在于其制备的抗体具有高纯度、高灵敏度以及高特异性。[/font][/font][font=Calibri] [/font][b][font=宋体]杂交瘤技术的不同应用[/font][/b][font=Calibri] [/font][font=宋体]一旦得到稳定的杂交瘤细胞系后，[/font][font=Helvetica][color=#060607][font=宋体]该细胞系能够持续且高效地分泌出高度均一化的单克隆抗体[/font][/color][/font][font=宋体]。这种稳定的抗体生产能力不仅确保了抗体的稳定供应，而且显著降低了抗体的生产成本。由于这些抗体能高特异性和高灵敏度地识别目标抗原，因此，杂交瘤技术成为了多个研究领域的重要工具，包括毒理学、动物生物技术、医学、药理学、细胞生物学和分子生物学等。[/font][font=Calibri] [/font][font=宋体]单克隆抗体在诊断、成像和治疗等领域具有广泛的应用。[/font][font=Helvetica][color=#060607][font=宋体]在诊断领域，单克隆抗体因其高度的特异性，常用于免疫组化、酶联免疫吸附试验（[/font]ELISA[font=宋体]）和流式细胞术等方法中，以检测和识别特定的生物标志物。[/font][/color][/font][font=宋体]在治疗领域，很多抗体药如[/font][font=Helvetica][color=#060607][font=宋体]利妥昔单抗[/font][/color][/font][font=宋体][color=#060607]（[/color][/font][font=Helvetica][color=#060607]Rituximab[/color][/font][font=宋体][color=#060607][font=宋体]）、曲妥珠单抗[/font] [font=Helvetica](Trastuzumab)[/font][font=宋体]、西妥昔单抗（[/font][font=Helvetica]Cetuximab[/font][font=宋体]）是[/font][/color][/font][font=宋体]利用杂交瘤技术开发的，用于治疗[/font][font=Helvetica][color=#060607][font=宋体]非霍奇金淋巴瘤[/font][/color][/font][font=宋体][color=#060607]、[/color][/font][font=Helvetica][color=#060607][font=宋体]乳腺癌[/font][/color][/font][font=宋体][color=#060607]、[/color][/font][font=Helvetica][color=#060607][font=宋体]非小细胞肺癌和结肠癌[/font][/color][/font][font=宋体][color=#060607]等癌症。这些抗体药物的成功开发和应用，展示了杂交瘤技术在制备治疗性单克隆抗体方面的重要性，[/color][/font][font=宋体]为癌症等复杂疾病的治疗提供了新的可能性。[/font][font=Calibri] [/font][b][font=宋体]杂交瘤技术的局限性[/font][/b][font=Calibri] [/font][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology][u][font=宋体][color=#0000ff]杂交瘤技术[/color][/font][/u][/url][font=宋体]目前也面临一些挑战[/font][font=Helvetica][color=#060607][font=宋体]，如融合效率低、产生抗体多样性有限以及可能的免疫排斥反应等[/font][/color][/font][font=宋体]。目前，大多数单克隆抗体都是在小鼠或大鼠中产生的，这增加了疾病从动物转移到人类的风险。虽然这些抗体在实验室条件下表现出色，但在实际应用中，特别是在人类疾病的治疗中，可能会引发免疫反应，影响治疗效果。因此，寻找更安全、更有效的抗体生产方法，是当前生物医学领域的重要课题。[/font][font=Calibri] [/font][font=宋体]未来，杂交瘤技术有望在多个方面取得新的突破。一方面，通过优化杂交瘤细胞的培养条件，可以进一步提高抗体的产量和质量。另一方面，利用基因工程技术对杂交瘤细胞进行改造，可以使其产生具有特定功能或特性的抗体，从而满足更多样化的应用需求。此外，随着人工智能和大数据技术的发展，我们有可能对杂交瘤技术的各个环节进行更精准的调控和优化，从而推动其在生物医学领域的更广泛应用。[/font][font=Calibri] [/font][font=宋体]综上所述，杂交瘤技术以其独特的优势在单克隆抗体的制备中占据了重要地位，其产生的抗体在多个领域都发挥着重要作用。然而，该技术也面临一些挑战，需要我们在未来的研究中不断探索和解决。我们有理由相信，随着科学技术的不断进步，杂交瘤技术将在生物医学领域发挥更大的作用，为人类的健康事业作出更大的贡献。[/font][font=Calibri] [/font][font=宋体]本篇文章由义翘神州编辑整理，同时义翘神州提供[/font][url=https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-culture-antibody-production-service][u][font=宋体][color=#0000ff]杂交瘤细胞培养及抗体生产服务[/color][/font][/u][/url][font=宋体]，点击了解详情！[/font][font=Calibri] [/font][font=Calibri] [/font][font=宋体]参考文献：[/font][font=宋体]Mitra S, Tomar PC. Hybridoma technology advancements, clinical significance, and future aspects. J Genet Eng Biotechnol. 2021 19(1):159. Published 2021 Oct 18. doi:10.1186/s43141-021-00264-6[/font]

10 um厚切片) 和免疫细胞化学中一般用Triton X-100 作为细胞通透剂，在膜上打孔。（2）其作用原理：Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，故在细胞免疫组化时尤为推荐使用，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。（3）Triton X-100既是一种表面活性剂，也有抗氧化作用4、封闭血清的选择原则是什么？ （1）膜上或切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性！（2）封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。（3）也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗来源一致。

[font=宋体][font=宋体]免疫组化法（[/font][font=Calibri]IHC[/font][font=宋体]）是使用抗体检测组织切片（例如肝脏、胰腺或心脏）中细胞蛋白质（抗原）的过程。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]当组织样本被送到实验室进行疾病检查时，有几个细节不易确定。几种疾病或疾病亚型在显微镜下可能看起来相似或看起来具有相似大小的细胞，但具有不同的行为和必要的治疗，区分它们的最佳方法是检测这些细胞上作为标记的特定分子。免疫组化法（[/font][font=Calibri]IHC[/font][font=宋体]）是一种使用抗体（匹配分子）的技术，用于寻找、识别附着在细胞上的标记物。在显微镜下可以看到抗体本身，这有助于技术人员进行精确识别。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]免疫组化法（[/font][font=Calibri]IHC[/font][font=宋体]）已广泛应用于医学中，特别是癌症诊断。淋巴瘤是依赖于[/font][font=Calibri]IHC[/font][font=宋体]进行正确诊断和治疗决策的癌症之一。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]免疫组化常见问题：[/font][font=宋体][font=宋体]问题一：我应该使用[/font][font=Calibri]PIER[/font][font=宋体]还是[/font][font=Calibri]HIER[/font][font=宋体]进行抗原修复？[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]固定过程可能会掩盖抗原，导致抗体结合无法进行。这种掩盖可以通过一种称为抗原修复[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]抗原去掩蔽的技术来逆转，该技术可以通过加热（[/font][font=Calibri]HIER[/font][font=宋体]；热诱导抗原修复）或蛋白酶（[/font][font=Calibri]PIER[/font][font=宋体]；蛋白水解诱导抗原修复）介导。后者使用蛋白酶[/font][font=Calibri]K[/font][font=宋体]、胰蛋白酶和胃蛋白酶等酶。[/font][font=Calibri]PIER[/font][font=宋体]方法通过降解掩盖表位的肽而起作用。然而，[/font][font=Calibri]PIER[/font][font=宋体]也可能导致样品形态或抗原本身的改变。因此，[/font][font=Calibri]PIER[/font][font=宋体]的使用频率低于[/font][font=Calibri]HIER[/font][font=宋体]，后者通过恢复表位的二级和三级结构而起作用。[/font][/font][font=宋体]为了确定是否应该进行抗原修复以及采用哪种方法，应遵循以下指南：[/font][font=宋体]进行文献检索，以确定其他研究人员如何可视化您感兴趣的抗原。[/font][font=宋体]检查抗体供应商是否推荐了特定的抗原修复方案。[/font][font=宋体][font=宋体]如果没有特定的协议可用，我们建议使用[/font][font=Calibri]HIER[/font][font=宋体]而不是[/font][font=Calibri]PIER[/font][font=宋体]协议。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]对于[/font][font=Calibri]HIER[/font][font=宋体]，总是使用中性抗原修复缓冲液，如[/font][font=Calibri]AbD Serotec[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]BUF025A[/font][font=宋体]，并与未进行抗原修复的样品进行比较。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]如果中性染色溶液没有产生良好的染色效果，则应测试碱性或酸性抗原修复缓冲液。除了[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值外，其他需要优化的参数是温度和持续时间。理想情况下，尝试各种[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值、温度和时间组合。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]为了排除由[/font][font=Calibri]HIER[/font][font=宋体]过程引起的伪影，始终包括一个控制样品，该样品在没有[/font][font=Calibri]HIER[/font][font=宋体]步骤的情况下进行染色。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]问题二：如何选择[/font][font=Calibri]IHC[/font][font=宋体]实验的抗体，单克隆抗体还是多克隆抗体？[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]单克隆抗体和多克隆抗体的抗体特性决定了其优缺点。单克隆抗体是针对单个表位的同种免疫球蛋白。抗体是由一个动物的单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆产生的，因此在免疫化学上相似。多克隆抗体是针对同一抗原的各种表位的异质抗体混合物。抗体是由动物的不同[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆产生的，因此在免疫化学上不同。多克隆混合物中的抗体可能具有略微不同的特异性和亲和力。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]如果蛋白质靶标具有相同的氨基酸序列，单克隆抗体更合适。一旦抗原因各种原因发生构象变化，如蛋白质相互作用、翻译后修饰、温度、[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值、固定、盐浓度等，单克隆抗体和抗原的联合作用将受到严重影响。由于多克隆抗体具有多个表位，不受蛋白质构象变化的影响，一般来说，在一定范围内的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]和盐浓度内，多克隆抗体之间的抗原结合比单克隆抗体更稳定。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]问题三：一抗的孵育时间多久？[/font][/b][font=宋体][font=宋体]一抗的孵育时间与温度[/font][font=Calibri],[/font][font=宋体]抗体浓度有关。一般情况下[/font][font=Calibri],[/font][font=宋体]在[/font][font=Calibri]37[/font][font=宋体]℃的条件下[/font][font=Calibri],[/font][font=宋体]孵育[/font][font=Calibri]1-2[/font][font=宋体]小时左右。在室温的条件下[/font][font=Calibri],[/font][font=宋体]孵育[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]小时左右。在[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]℃的条件下[/font][font=Calibri],[/font][font=宋体]孵育[/font][font=Calibri]18-24[/font][font=宋体]小时左右。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/immunohistochemistry-service][b]石蜡切片免疫组化（[/b][/url][/font][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/services/immunohistochemistry-service][b]IHC[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/immunohistochemistry-service][b]）检测服务[/b][/url]，更多免疫组化的问题可以上义翘神州网咨询！[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/immunohistochemistry-service[/font][/font][font=宋体] [/font][font=Calibri] [/font]

[b]职位名称：[/b]销售经理[b]职位描述/要求：[/b]岗位职责：1、负责销售公司整体科研服务产品及单项实验产品；2、高通量测序服务：环状RNA，小RNA，mRNA，lncRNA及外显子测序等；3、生物功能实验服务：Qrt-PCR，WB，免疫组化，原位杂交，稳定株构建，细胞功能实验，动物模型实验，文章编辑业务等。任职资格：1、大专以上学历，生物或医学相关专业，有行业资源者优先考虑；2、有生物行业销售及医学医药销售行业经验者优先；3、热爱销售服务工作，能够承受较大的工作压力优先；4、工作地点：广州、武汉、重庆。薪资福利：1、高提成薪资方案，每年进行多次调薪；入职一个月内购买五险一金；2、法定假日、带薪年假，丰富节日礼品、春节礼包；3、年度进行集中化培训，邀请公司内部博士团队或外部专家教授进行授课。[b]公司介绍：[/b] 公司简介 广州永诺生物科技有限公司成立于2010年，总部位于广州国际生物岛，旗下有广州永诺医学检验所、广东顺德永诺生物科技有限公司等子公司，是一家专注于医学科学技术开发与服务、分子诊断产品研发与生产的高新技术企业。公司目前占地面积3000m2，硕、博士以上学历员工占比近40%，团队骨干曾参与多项国家973、863肿瘤研究项目，具备丰富的科研和产品开发经验。目前与华南地区包括中山大学附属各...[url=https://www.instrument.com.cn/job/user/job/position/49192]查看全部[/url]

激光共聚焦显微镜系统的原理和应用激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起来的一项具有划时代的高科技产品，它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率提高了30%--40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察诸如Ca2+ 、PH值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。激光共聚焦成像系统能够用于观察各种染色、非染色和荧光标记的组织和细胞等，观察研究组织切片，细胞活体的生长发育特征，研究测定细胞内物质运输和能量转换。能够进行活体细胞中离子和PH值变化研究（RATIO），神经递质研究，微分干涉及荧光的断层扫描，多重荧光的断层扫描及重叠，荧光光谱分析荧光各项指标定量分析荧光样品的时间延迟扫描及动态构件组织与细胞的三维动态结构构件，荧光共振能量的转移的分析，荧光原位杂交研究（FISH），细胞骨架研究，基因定位研究，原位实时PCR产物分析，荧光漂白恢复研究（FRAP），胞间通讯研究，蛋白质间研究，膜电位与膜流动性等研究，完成图像分析和三维重建等分析。一.激光共聚焦显微镜系统应用领域：涉及医学、动植物科研、生物化学、细菌学、细胞生物学、组织胚胎、食品科学、遗传、药理、生理、光学、病理、植物学、神经科学、海洋生物学、材料学、电子科学、力学、石油地质学、矿产学。二.基本原理传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一点扫描，标本上的被照射点，在探测针孔处成像，由探测针孔后的光点倍增管（PMT）或冷电耦器件（cCCD）逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点。三.应用范围：细胞形态学分析（观察细胞或组织内部微细结构，如：细胞内线粒体、内质网、高尔基体、微管、微丝、细胞桥、染色体等亚细胞结构的形态特征；半定量免疫荧光分析）；荧光原位杂交研究；基因定位研究及三维重建分析。1.细胞生物学：细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、受体、细胞器结构和分布变化2.生物化学：酶、核酸、FISH（荧光原位杂交）、受体分析3.药理学：药物对细胞的作用及其动力学4.生理学：膜受体、离子通道、细胞内离子含量、分布、动态5.神经生物学：神经细胞结构、神经递质的成分、运输和传递、递质受体、离子内外流、神经组织结构、细胞分布6.微生物学和寄生虫学：细菌、寄生虫形态结构7.病理学及临床应用：活检标本诊断、肿瘤诊断、自身免疫性疾病诊断、HIV等8.遗传学和组胚学：细胞生长、分化、成熟变化、细胞的三维结构、染色体分析、基因表达、基因诊断四.激光共聚焦显微镜在医学领域中的应用A.在细胞及分子生物学中的应用1.细胞、组织的三维观察和定量测量2.活细胞生理信号的动态监测3.粘附细胞的分选4.细胞激光显微外科和光陷阱功能5.光漂白后的荧光恢复6.在细胞凋亡研究中的应用B.在神经科学中的应用1.定量荧光测定2.细胞内离子的测定3.神经细胞的形态观察C.在耳鼻喉科学中的应用1.在内耳毛细胞亚细胞结构研究上的应用2.激光扫描共聚焦显微镜的荧光测钙技术在内耳毛细胞研究中的应用3.激光扫描共聚焦显微镜在内耳毛细胞离子通道研究上的应用4.激光扫描共聚焦显微镜在嗅觉研究中的应用D.在肿瘤研究中的应用1. 定量免疫荧光测定2. 细胞内离子分析3. 图像分析：肿瘤细胞的二维图像分析4. 三维重建 E.激光扫描共聚焦显微镜在内分泌领域的应用1. 细胞内钙离子的测定2. 免疫荧光定位及免疫细胞化学研究3. 细胞形态学研究：利用激光扫描共聚焦显微镜 F.在血液病研究中的应用1. 在血细胞形态及功能研究方面的应用2. 在细胞凋亡研究中的应用 G.在眼科研究中的应用1. 利用激光扫描共聚焦显微镜观察组织、细胞结构2. 集合特殊的荧光染色在活体上观察角膜外伤修复中细胞移行及成纤维细胞的出现3. 利用激光扫描共聚焦显微镜观察视网膜中视神经细胞的分布以及神经原的树枝状形态4. 三维重建H. 激光扫描共聚焦显微镜在肾脏病中的应用可以系统观察正常人肾小球系膜细胞的断层扫描影像及三维立体影像水平，使图像更加清晰，从计算机分析系统可从外观到内在结构，从平面到立体，从静态到动态，从形态到功能几个方面对系膜细胞的认识得到提高。

激光共聚焦显微镜系统的原理和应用激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起来的一项具有划时代的高科技产品，它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率提高了30%--40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察诸如Ca2+ 、PH值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。激光共聚焦成像系统能够用于观察各种染色、非染色和荧光标记的组织和细胞等，观察研究组织切片，细胞活体的生长发育特征，研究测定细胞内物质运输和能量转换。能够进行活体细胞中离子和PH值变化研究（RATIO），神经递质研究，微分干涉及荧光的断层扫描，多重荧光的断层扫描及重叠，荧光光谱分析荧光各项指标定量分析荧光样品的时间延迟扫描及动态构件组织与细胞的三维动态结构构件，荧光共振能量的转移的分析，荧光原位杂交研究（FISH），细胞骨架研究，基因定位研究，原位实时PCR产物分析，荧光漂白恢复研究（FRAP），胞间通讯研究，蛋白质间研究，膜电位与膜流动性等研究，完成图像分析和三维重建等分析。一.激光共聚焦显微镜系统应用领域：涉及医学、动植物科研、生物化学、细菌学、细胞生物学、组织胚胎、食品科学、遗传、药理、生理、光学、病理、植物学、神经科学、海洋生物学、材料学、电子科学、力学、石油地质学、矿产学。二.基本原理传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一点扫描，标本上的被照射点，在探测针孔处成像，由探测针孔后的光点倍增管（PMT）或冷电耦器件（cCCD）逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点。三.应用范围：细胞形态学分析（观察细胞或组织内部微细结构，如：细胞内线粒体、内质网、高尔基体、微管、微丝、细胞桥、染色体等亚细胞结构的形态特征；半定量免疫荧光分析）；荧光原位杂交研究；基因定位研究及三维重建分析。1.细胞生物学：细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、受体、细胞器结构和分布变化2.生物化学：酶、核酸、FISH（荧光原位杂交）、受体分析3.药理学：药物对细胞的作用及其动力学4.生理学：膜受体、离子通道、细胞内离子含量、分布、动态5.神经生物学：神经细胞结构、神经递质的成分、运输和传递、递质受体、离子内外流、神经组织结构、细胞分布6.微生物学和寄生虫学：细菌、寄生虫形态结构7.病理学及临床应用：活检标本诊断、肿瘤诊断、自身免疫性疾病诊断、HIV等8.遗传学和组胚学：细胞生长、分化、成熟变化、细胞的三维结构、染色体分析、基因表达、基因诊断四.激光共聚焦显微镜在医学领域中的应用A.在细胞及分子生物学中的应用1. 细胞、组织的三维观察和定量测量2. 活细胞生理信号的动态监测3. 粘附细胞的分选4. 细胞激光显微外科和光陷阱功能5. 光漂白后的荧光恢复6. 在细胞凋亡研究中的应用B.在神经科学中的应用1. 定量荧光测定2. 细胞内离子的测定3. 神经细胞的形态观察C.在耳鼻喉科学中的应用1. 在内耳毛细胞亚细胞结构研究上的应用2. 激光扫描共聚焦显微镜的荧光测钙技术在内耳毛细胞研究中的应用3. 激光扫描共聚焦显微镜在内耳毛细胞离子通道研究上的应用4. 激光扫描共聚焦显微镜在嗅觉研究中的应用D.在肿瘤研究中的应用1. 定量免疫荧光测定2. 细胞内离子分析3. 图像分析：肿瘤细胞的二维图像分析4. 三维重建 E.激光扫描共聚焦显微镜在内分泌领域的应用1. 细胞内钙离子的测定2. 免疫荧光定位及免疫细胞化学研究3. 细胞形态学研究：利用激光扫描共聚焦显微镜 F.在血液病研究中的应用1. 在血细胞形态及功能研究方面的应用2. 在细胞凋亡研究中的应用 G.在眼科研究中的应用1. 利用激光扫描共聚焦显微镜观察组织、细胞结构2. 集合特殊的荧光染色在活体上观察角膜外伤修复中细胞移行及成纤维细胞的出现3. 利用激光扫描共聚焦显微镜观察视网膜中视神经细胞的分布以及神经原的树枝状形态4. 三维重建H. 激光扫描共聚焦显微镜在肾脏病中的应用可以系统观察正常人肾小球系膜细胞的断层扫描影像及三维立体影像水平，使图像更加清晰，从计算机分析系统可从外观到内在结构，从平面到立体，从静态到动态，从形态到功能几个方面对系膜细胞的认识得到提高。北京中科研域科技有限公司（蔡司显微镜代理商）地址：北京市朝阳区建国路15号院甲1号北岸1292，一号楼406室联系人：张辉13911188977 邮编：100024电话：010-57126588 传真：010-85376588E-mail：[email=zhs_8000@126.com][color=#0365bf]zhs_8000@126.com[/color][/email]

[font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology][b]杂交瘤技术[/b][/url]是指建立杂交瘤细胞系的技术，其用于产生大量单克隆抗体，所以又称单克隆抗体技术。其是在细胞融合技术上发展起来的：将[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞和骨髓细胞融合，即可形成在体外长期存活并分泌免疫蛋白的杂交瘤细胞。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原结合位点的抗体，即单克隆抗体（[/font][font=Calibri]monoclonal antibody[/font][font=宋体]），简称单抗。单克隆抗体具有高度专一性，一种单克隆抗体只能识别一种特定的抗原决定簇。正是由于其特异性强，因此被广泛应用于生物学，药学，医学等领域，具有极其远大的应用前景，因此用于制备单克隆抗体的杂交瘤技术也变得越来越重要。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]杂交瘤技术原理：[/font][/font][font=宋体]杂交瘤技术基于三种关键技术。[/font][font=宋体][b]一、动物免疫[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]将特定的抗原注射到哺乳动物（如小鼠）体内，在外来抗原刺激下，被免疫动物脾脏内的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞大量增殖并且分泌针对于该抗原的特异性抗体。动物免疫的作用就是用特定外来抗原对动物进行免疫，以刺激能分泌特异性抗体的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞大量增殖。 [/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体][b]二、细胞融合[/b][/font] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞受外来抗原刺激后可以分泌抗体，但[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细胞分裂，存活一段时间（两周）便死亡[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]短命细胞；而骨髓瘤细胞不分泌抗体，却能在体外无限增殖存活。如果能将这两种细胞的特性结合起来，就能得到既能分泌抗体又能在体外长期存活的细胞，细胞融合杂交瘤细胞中非常关键的一个步骤。 [/font][/font][font=宋体][font=宋体]通常使用的细胞融合技术有生物方法如仙台病毒，化学方法如聚乙二醇（[/font][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]），物理方法如电融合。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后，能产生五种细胞类型；未融合脾细胞，未融合骨髓瘤细胞，脾细胞[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]脾细胞融合体，骨髓瘤细胞[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]骨髓瘤细胞融合体，脾细胞[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]骨髓瘤细胞杂合体（杂交瘤细胞）。其中，我们需要利用另一个关键技术[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]杂交瘤细胞筛选[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]将所需的杂交瘤细胞分离出来。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体][b]三、杂交瘤细胞筛选[/b][/font] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]筛选杂交瘤细胞一般使用[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基筛选方法基本原理：[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基成分：含有次黄嘌呤[/font][font=Calibri](H)[/font][font=宋体]、氨基喋呤[/font][font=Calibri](A)[/font][font=宋体]和胸腺嘧啶[/font][font=Calibri](T)[/font][font=宋体]三种成分。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]细胞[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成途径：主要合成和补救合成途径两种方式。主要合成就是利用糖和氨基酸在二氢叶酸还原酶的催化下来合成[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]；而补救合成途径则是通过次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶[/font][font=Calibri](Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase[/font][font=宋体]， [/font][font=Calibri]HGPRT)[/font][font=宋体]和胸腺嘧啶激酶[/font][font=Calibri](thymidine kinase[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]TK)[/font][font=宋体]将核苷酸前体合成核苷酸以供[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成原料。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基中氯基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂，能有效地阻断[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成的内源性途径。融合前的骨髓瘤细胞不能产生抗体，并且缺乏次黄嘌呤 – 鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]）基因，使得它们对[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基敏感，阻断了[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]补救合成途径。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]将融合的细胞在[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基中孵育大约[/font][font=Calibri]10[/font][font=宋体]至[/font][font=Calibri]14[/font][font=宋体]天，未融合的以及自身融合的骨髓瘤细胞死亡。这是因为[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基阻断了骨髓瘤细胞两大[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成途径。未融合的以及自身融合的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞虽然能够合成[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]酶，但其是正常细胞，存活一段时间（两周）也死亡。因此，在[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]养基中，只有[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]骨髓瘤杂合体存活，因为杂交瘤细胞继承了[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞和骨髓瘤细胞的双重特性，能够合成[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]酶和[/font][font=Calibri]TK[/font][font=宋体]酶。这些杂交瘤细胞能够分泌抗体（[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞特性）并且无限增殖（骨髓瘤细胞特性）。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]然后将培养基稀释到多孔板中，使得每个孔仅含有一个杂交瘤细胞。再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株。由于孔中的抗体由相同的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞产生，针对相同的抗原表位，所以产生的抗体又被称之为单克隆抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]接下来采用体内或者体外方式对筛选的能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞进行扩大培养，最后收集提纯获取单抗。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]杂交瘤技术的优缺点介绍：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、优点：与传统的免疫动物方法制备抗体相比，利用杂交瘤技术可以制备出高纯度的单抗，并且可以进行单克隆抗体的大量生产。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、缺点：[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]a.[/font][font=宋体]操作步骤繁琐。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]b.[/font][font=宋体]利用杂交瘤技术生产出的单克隆抗体多为鼠源性，而鼠源性抗体在应用中有诸多问题，例如被人类免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体[/font][font=Calibri](HAMA[/font][font=宋体]）反应、在人体循环系统中很快被清除等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]目前义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-culture-antibody-production-service][b]杂交瘤细胞培养及抗体生产服务[/b][/url]，服务内容从细胞复苏[/font][font=宋体]→细胞驯化→生产及纯化→[/font][font=Calibri]QC[/font][font=宋体]分析→交付内容 义翘神州都有严格的质量把控，更多详情可以参看：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-culture-antibody-production-service[/font][/font]

分子杂交仪又称“分子杂交炉”或“分子杂交箱”根据不同实验的需要可以选择不同的规格型号的杂交仪。是现代实验室采用杂交技术的理想设备，可替代塑料杂交袋和水浴摇床，并避免杂交袋破损带来污染危险。杂交炉采用微机控温精确，炉内空气循环装置设计独特，升温速度快等特点。　　广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。因而它不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用,而且在临床诊断上的应用也日趋增多。file:///c:/DOCUME~1/ADMINI~1/APPLIC~1/360se6/USERDA~1/Temp/T0129F~1.JPG感觉就以烘箱有木有？

[font=宋体][font=宋体]杂交瘤技术（[/font][font=Calibri]hybridoma technique[/font][font=宋体]）即淋巴细胞杂交瘤技术，又称单克隆抗体技术。它是在体细胞融合技术基础上发展起来的。克勒（[/font][font=Calibri]Kohler[/font][font=宋体]）和米尔斯坦（[/font][font=Calibri]Milstein[/font][font=宋体]）（[/font][font=Calibri]1975[/font][font=宋体]）证明，骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体——单克隆抗体，这种技术通称为杂交瘤技术。这一技术的基础是细胞融合技术。骨髓瘤细胞在体外可以连续传代，而脾细胞是终末细胞，不能在体外繁殖。如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体或因子的淋巴细胞融合，则融合细胞既具有肿瘤细胞无限繁殖的特性，又具有淋巴细胞能分泌特异性抗体或因子的能力，同时也克服了免疫淋巴细胞不能在体外繁殖的缺点，融合的细胞称为淋巴细胞杂交瘤。[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体]杂交瘤技术原理及步骤：[/font][/b][font=宋体][font=宋体]杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞（[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞）的主要特征是它的抗体分泌功能，但不能在体外连续培养，小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即具有所谓永生性。在选择培养基的作用下，只有[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力，形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]其原理从下列[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]个主要步骤阐明。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]([/font][font=宋体]一[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]细胞的选择与融合[/font][/font][font=宋体][font=宋体]建立杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异的单克隆抗体，所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。脾是[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞聚集的重要场所，无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现明显的抗体应答反应。融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不断增殖，只有肿瘤细胞才具备这种特性。选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。多发性骨髓瘤是[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞系恶性肿瘤，所以是理想的脾细胞融合伴侣。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]使用细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易于相互粘连而融合在一起。最佳的融合效果应是最低程度的细胞损伤而又产生最高频率的融合。聚乙二醇[/font][font=Calibri](PEG1 000[/font][font=宋体]～[/font][font=Calibri]2 000)[/font][font=宋体]是最常用的细胞融合剂，一般应用浓度为[/font][font=Calibri]40%(W/V)[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]([/font][font=宋体]二[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]选择培养基的应用[/font][/font][font=宋体][font=宋体]细胞融合是一个随机的物理学过程。在小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞混合细胞悬液中，经融合后细胞将以多种形式出现。如融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。正常的脾细胞在培养基中仅存活[/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]～[/font][font=Calibri]7d[/font][font=宋体]，无需特别筛选；细胞的多聚体形式也容易死去；而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]细胞[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成一般有两条途径。主要途径是由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]，叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程。另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶[/font][font=Calibri](HGPRT)[/font][font=宋体]和胸腺嘧啶核苷激酶[/font][font=Calibri](TK)[/font][font=宋体]的催化作用合成[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]。细胞融合的选择培养基中有[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]种关键成分：次黄嘌呤[/font][font=Calibri](hypoxanthine[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]H)[/font][font=宋体]、甲氨蝶呤[/font][font=Calibri](aminopterin[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]A)[/font][font=宋体]和胸腺嘧啶核苷[/font][font=Calibri](thymidine[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]T)[/font][font=宋体]，所以取三者的字头称为[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基。甲氨蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]，而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的[/font][font=Calibri]HGPRT-[/font][font=宋体]细胞株，所以不能在该培养基中生长。只有融合细胞具有亲代双方的遗传性能，可在[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基中长期存活与繁殖。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]([/font][font=宋体]三[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]有限稀释与抗原特异性选择[/font][/font][font=宋体][font=宋体]在动物免疫中，应选用高纯度抗原。一种抗原往往有多个决定簇，一个动物体在受到抗原刺激后产生的体液免疫应答实质是众多[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞群的抗体分泌，而针对目标抗原表位的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞只占极少部分。由于细胞融合是一个随机的过程，在已经融合的细胞中有相当比例的无关细胞的融合体，需经筛选去除。筛选过程一般分为两步进行：一是融合细胞的抗体筛选，二是在此基础上进行的特异性抗体筛选。将融合的细胞进行充分稀释，使分配到培养板的每一孔中的细胞数在[/font][font=Calibri]0[/font][font=宋体]至数个细胞之间[/font][font=Calibri](30%[/font][font=宋体]的孔为[/font][font=Calibri]0[/font][font=宋体]才能保证每个孔中是单个细胞[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]，培养后取上清液用[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]法选出抗体高分泌性的细胞；这一过程常被习惯地称作克隆化。将这些阳性细胞再进行克隆化，应用特异性抗原包被的[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株，增殖后进行冻存、体外培养或动物腹腔接种培养。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体]杂交瘤技术应用：[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、单克隆抗体的重要性和价值[/font][/font][font=宋体]单克隆抗体不仅在生物学和免疫学基础研究中具有重要的价值，而且在实践中的应用范围亦极为广泛。[/font][font=宋体]单克隆抗体在医学诊断中的应用[/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、在医学中，单克隆抗体已用于疾病的诊断，其优点是诊断准确，无交叉反应。[/font][/font][font=宋体]例如，单克隆抗体诊断乙型肝炎及潜伏的乙型肝炎病毒，则很少发生假阴性的漏诊。[/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、单克隆抗体作为药物载体的应用[/font][/font][font=宋体]单克隆抗体对靶组织有专一亲和性，故在体内有特异定位分布的特点。[/font][font=宋体]把抗肿瘤药物和抗某种肿瘤的单克隆抗体结合，则可使药物在体内有选择地集中向该肿瘤细胞攻击，只杀灭靶细胞，而不损伤正常组织，大大减轻了抗癌药物的副作用。[/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、单克隆抗体在治疗中的挑战和未来的发展方向[/font][/font][font=宋体][font=宋体]制做的单克隆抗体多为鼠[/font][font=宋体]——鼠型，对人来说属异种蛋白质，因此难于用于治疗。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以查看[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology][b]杂交瘤技术[/b][/url]：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

[font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology][b]杂交瘤技术[/b][/url]，作为现代生物技术的瑰宝，自诞生以来便在生物医学领域产生了深远的影响。其基本原理在于利用细胞融合技术，将免疫的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，从而得到一种新型的杂交细胞——杂交瘤细胞。这种细胞既保留了[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞产生特异性抗体的能力，又继承了骨髓瘤细胞无限增殖的特性。通过筛选和克隆，我们可以获得稳定产生特定抗体的杂交瘤细胞系，进而制备出高纯度、高特异性的单克隆抗体。下面是具体的关于杂交瘤技术原理及应用：[/font][/font][font=宋体][b]杂交瘤技术的基于三种关键技术。[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]一、动物免疫[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]将特定的抗原注射到哺乳动物（如小鼠）体内，在外来抗原刺激下，被免疫动物脾脏内的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞大量增殖并且分泌针对于该抗原的特异性抗体。动物免疫的作用就是用特定外来抗原对动物进行免疫，以刺激能分泌特异性抗体的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞大量增殖。 [/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]二、细胞融合[/font] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞受外来抗原刺激后可以分泌抗体，但[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞本身是一种终末分化细胞，通常不再进行细胞分裂，存活一段时间（两周）便死亡[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]短命细胞；而骨髓瘤细胞不分泌抗体，却能在体外无限增殖存活。如果能将这两种细胞的特性结合起来，就能得到既能分泌抗体又能在体外长期存活的细胞，细胞融合杂交瘤细胞中非常关键的一个步骤。 [/font][/font][font=宋体][font=宋体]通常使用的细胞融合技术有生物方法如仙台病毒，化学方法如聚乙二醇（[/font][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]），物理方法如电融合。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后，能产生五种细胞类型；未融合脾细胞，未融合骨髓瘤细胞，脾细胞[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]脾细胞融合体，骨髓瘤细胞[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]骨髓瘤细胞融合体，脾细胞[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]骨髓瘤细胞杂合体（杂交瘤细胞）。其中，我们需要利用另一个关键技术[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]杂交瘤细胞筛选[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]将所需的杂交瘤细胞分离出来。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]三、杂交瘤细胞筛选[/font] [/font][font=宋体][font=宋体]筛选杂交瘤细胞一般使用[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基筛选方法基本原理：[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基成分：含有次黄嘌呤[/font][font=Calibri](H)[/font][font=宋体]、氨基喋呤[/font][font=Calibri](A)[/font][font=宋体]和胸腺嘧啶[/font][font=Calibri](T)[/font][font=宋体]三种成分。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]细胞[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成途径：主要合成和补救合成途径两种方式。主要合成就是利用糖和氨基酸在二氢叶酸还原酶的催化下来合成[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]；而补救合成途径则是通过次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶[/font][font=Calibri](Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase[/font][font=宋体]， [/font][font=Calibri]HGPRT)[/font][font=宋体]和胸腺嘧啶激酶[/font][font=Calibri](thymidine kinase[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]TK)[/font][font=宋体]将核苷酸前体合成核苷酸以供[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成原料。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基中氯基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂，能有效地阻断[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成的内源性途径。融合前的骨髓瘤细胞不能产生抗体，并且缺乏次黄嘌呤 – 鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]）基因，使得它们对[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基敏感，阻断了[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]补救合成途径。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]将融合的细胞在[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基中孵育大约[/font][font=Calibri]10[/font][font=宋体]至[/font][font=Calibri]14[/font][font=宋体]天，未融合的以及自身融合的骨髓瘤细胞死亡。这是因为[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基阻断了骨髓瘤细胞两大[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成途径。未融合的以及自身融合的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞虽然能够合成[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]酶，但其是正常细胞，存活一段时间（两周）也死亡。因此，在[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]养基中，只有[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]骨髓瘤杂合体存活，因为杂交瘤细胞继承了[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞和骨髓瘤细胞的双重特性，能够合成[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]酶和[/font][font=Calibri]TK[/font][font=宋体]酶。这些杂交瘤细胞能够分泌抗体（[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞特性）并且无限增殖（骨髓瘤细胞特性）。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]然后将培养基稀释到多孔板中，使得每个孔仅含有一个杂交瘤细胞。再由这些单细胞克隆生长，最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株。由于孔中的抗体由相同的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞产生，针对相同的抗原表位，所以产生的抗体又被称之为单克隆抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]接下来采用体内或者体外方式对筛选的能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞进行扩大培养，最后收集提纯获取单抗。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]杂交瘤技术应用：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①疾病诊断：单克隆抗体在疾病诊断中发挥着重要作用，以其准确且无交叉反应的特点，显著提高了诊断的准确性。例如，在乙型肝炎及潜伏的乙型肝炎病毒的诊断中，单克隆抗体能显著减少假阴性的漏诊。[/font][font=宋体]②治疗载体：单克隆抗体也可以作为治疗疾病的载体。通过与抗肿瘤药物结合，单克隆抗体能在体内选择性集中攻击肿瘤细胞，具有靶向性，从而减少对正常组织的损伤并减轻抗癌药物的副作用。这种载药单克隆抗体被誉为“生物导弹”。[/font][font=宋体][font=宋体]③抗体序列保护：获取抗体基因序列后，可以通过专利对[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]区进行保护，从而保护创新性的抗体序列。[/font][/font][font=宋体]④生产方式备份：由于杂交瘤存在退化转阴的风险，抗体序列可以通过基因工程方式轻松获得抗体样品，为生产方式提供备份。[/font][font=宋体]⑤抗体工程改造：获得的抗体序列可用于抗体人源化、双特异性抗体等抗体工程改造项目，进一步拓展抗体的应用范围和效果。[/font][font=宋体]⑥癌症研究：杂交瘤技术可以制备大量的特异性抗体，用于检测肿瘤标志物、研究癌细胞的生物学特性、筛选分子靶点等。此外，该技术还可以用于检测肿瘤细胞表面的抗原，通过对来自不同患者的癌瘤细胞进行克隆化和筛选，发现不同肿瘤的抗原异质性，为临床肿瘤治疗提供新的思路和策略。[/font][font=宋体]总的来说，杂交瘤技术以其独特的优势在多个领域都有着广泛的应用，为生物医学研究和疾病治疗提供了有力的工具。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-sequencing-service][b]杂交瘤细胞抗体基因测序服务[/b][/url]和[url=https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-culture-antibody-production-service][b]杂交瘤细胞培养及抗体生产服务[/b][/url]，有需求可以咨询。[/font][font=宋体][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-sequencing-service[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-culture-antibody-production-service[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

免疫组化常用溶液的配制　1、 PBS：取PBS溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，测pH值应在7.2~7.4之间，若偏离此范围，请用0.1N的HCL或NaOH调整。2、 TBS：　　2.1 Tris 缓冲液配方：(0.5M pH7.6)　　Tris (三羟甲基氨基甲烷) 60.57g　　　1N HCL 约420ml　　双蒸水 加至1000ml　　Tris缓冲液配制方法：　　先以少量双蒸水 (300~500ml)溶解Tris，加入HC1后，用HC1(1N)或NaOH(1N)将pH调至7.6，最后双蒸水加至1000ml。此液为储备液，4℃冰箱中保存。　　2.2 TBS配方：　　Tris-HCI 缓冲液(0.5M pH7.6) 100ml　　NaCI 8.5~9g(0.15mol/L)　　双蒸水 加至1000mlTBS配制方法：　　先以少量双蒸水溶解NaC1，再加入Tris-HC1缓冲液，最后加双蒸水至1000ml，充分摇匀。3、 枸橼酸盐缓冲液 (Citrate buffer)：　　3.1 储存液：　　A. 0.1M枸橼酸溶液：称取21.01g枸橼酸 (C6H8O7H20) 溶于1000ml蒸馏水中。　　B. 0.1M枸橼酸钠溶液：称取29.41g枸橼酸钠 (C6H5Na32H20)溶于1000ml蒸馏水中。　　3.2 工作液：　　取9ml A液和41ml B液加入450ml蒸馏水中，溶液pH 值应为6.0±0.14、 胰酶 (Trypsin)：　　4.1 胰蛋白酶消化液：　　常用浓度为0.125%，即使用前将一滴试剂1胰酶浓缩液和三滴试剂2胰酶稀释液均匀混合(1:3稀释)，则可直接滴加使用。胰酶的最终浓度可以根据使用者的要求进行调整，浓度范围可以从0.05% (1:10稀释)至0.25% (1:1稀释)。　　4.2 胰蛋白酶：取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入到100ml 0.05%或0.1% pH7.8的无水氯化钙水溶液中，溶解即可。5、 胃酶 (Pepsin)：　　0.4%胃蛋白酶，用0.1mol/L HCL配制。6、 DAB (3.3-二氨基联苯胺)：　　6.1 DAB Kit：使用前只需将试剂盒提供的A、B、C三种试剂各一滴加至1ml双蒸水中，即可获得1ml DAB工作液，简单易用。　　6.2 DAB：6mgDAB溶于10mlTBS (0.05M pH7.6)，再加入0.1ml浓度为3%的H2O2，过滤掉沉淀物，即可。7、 AEC：4mg AEC溶于1ml二甲基甲酰胺中，加入14ml浓度为0.1M的醋酸缓冲液(pH5.2)，然后加入0.15ml 3%H2O2，过滤掉沉淀物。8、 Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)　　免疫细胞化学中，Triton X-100常用浓度为1%和0.3%，但通常是先配制成30%的Triton X-100储存液，临用时稀释至所需浓度。　　8.1 30%Triton X-100的配制：　　Triton X-100 28.2ml　　0.1M PBS (pH7.3) 或 0.05M TBS (pH7.4) 72.8ml双蒸水 加至1000ml配制方法：取Triton X-100 及PBS(或TBS)混合，置37~40℃水浴中2~3小时，使其充分溶解混匀。用前取该储备液稀释至所需浓度　8.2 Triton X-100 工作液的配制：Triton X-100是一种非离子型表面活性剂(或称清洁剂)，分子量为646.86 (C34H62O11)。它能溶解脂质，以增强抗体对细胞膜的通透性。1%的Triton X-100常用于漂洗组织标本，0.3%的Triton X-100则常用于稀释血清，配制BSA等。9、 甲醇-H2O2溶液吸取30%的H2O2 0.1ml，加入100ml纯甲醇中，充分混匀即可，使H2O2终浓度为0.3%。

[font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology][b]杂交瘤技术[/b][/url]是一种将[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合生产单克隆抗体的传统方法。该技术通过将动物脾细胞与骨髓瘤细胞融合，产生永生化杂交瘤细胞系，然后筛选其上清液中的抗原特异性克隆，并进一步循环亚克隆以产生严格的单克隆抗体。[/font][/font][font=宋体][font=宋体][b]利用杂交瘤技术制备单克隆抗体通常操作流程为[/b]：抗原制备、抗原免疫动物、杂交瘤细胞制备、融合细胞的筛选、培养杂交瘤细胞制备抗体。（详细实验流程：杂交瘤单克隆抗体制备[/font][font=Calibri]SOP[/font][font=宋体]）在单克隆抗体制备过程中，常常会遇到细胞污染，细胞融合后不生长、亚克隆后的细胞株不分泌抗体以及细胞难以克隆等问题，本文将详细分析以上常见问题的产生原因以及解决该问题的方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]一、微生物污染[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①细菌、真菌污染主要是由于实验人员操作不当或者消毒不到位引起的。人身上可能携带各种孢子，如果操作不当，或者是未能及时到位的消杀，就有可能会引入污染。除此之外，还须注意平时使用的一些消毒剂，比如[/font][font=Calibri]84[/font][font=宋体]消毒液或者[/font][font=Calibri]75%[/font][font=宋体]酒精，要确认它的纯度以及质量。如果是因为这些问题导致的消毒不到位，是非常不容易发现的。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]②支原体污染则可能由血清制品、关键试剂材料或实验人员带入。正常的[/font][font=Calibri]SP2/0[/font][font=宋体]细胞圆润透亮，当被支原体污染后，短期内细胞没有明显的变化，当污染严重后，细胞生长会变得极为缓慢，生长周期变长，细胞形态多样。可通过加入商品化的清除支原体试剂，或者通过将污染的杂交瘤细胞注射进小鼠腹腔，待产生实体瘤后或产生腹水后，无菌分离重新获得杂交瘤细胞。[/font][/font][font=宋体]③原生生物污染主要是大家比较头疼的黑胶虫，污染后会陆续出现多少不等的小黑点。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]二、融合后细胞不生长[/font][font=宋体][font=宋体]①融合后细胞不生长可能是因为融合试剂有毒性，部分毒性试剂作用时间过长引起的。如[/font][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]在[/font][font=Calibri]10%~60%[/font][font=宋体]都可以进行融合，但浓度越高毒性越大。[/font][/font][font=宋体]②也有可能是使用血清质量比较差，推荐使用胎牛血清。[/font][font=宋体][font=宋体]③还有可能是因为添加的[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]试剂中氨基喋呤（[/font][font=Calibri]A[/font][font=宋体]）含量过高或[/font][font=Calibri]HT[/font][font=宋体]（次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷）含量过低。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]三、杂交瘤细胞不分泌抗体或者停止分泌抗体[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、杂交瘤细胞不分泌抗体，可能的原因有以下几种：[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]a.[/font][font=宋体]抗原免疫原性弱，免疫效果不好，可以通过多方案检测血清效价进行进一步评估；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]b.[/font][font=宋体]操作过程中脾细胞损伤较多，抗原特异性淋巴母细胞大量死亡；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、杂交瘤细胞前期有抗体分泌，后期在克隆化过程中抗体分泌量减少或停止分泌抗体，可能的原因有以下几种：[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]a.HAT[/font][font=宋体]试剂中氨基喋呤（[/font][font=Calibri]A[/font][font=宋体]）失效，骨髓瘤细胞增殖抑制杂交瘤细胞的生长；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]b.[/font][font=宋体]未及时克隆，不分泌抗体的杂交瘤大量生长挤占生存空间；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]c.[/font][font=宋体]骨髓瘤细胞返祖化，抵抗氨基喋呤（[/font][font=Calibri]A[/font][font=宋体]）的选择；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]d.[/font][font=宋体]梁色体丢失（突变）[/font][font=Calibri] [/font][/font][font=宋体][font=Calibri]e.[/font][font=宋体]支原体污染。[/font][/font][font=宋体]解决方法有三种：第一，及时进行细胞建库；第二，高频次检查细胞状态和是否污染；第三，定期进行抗原筛选。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]四、杂交瘤细胞难以克隆化[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]一旦确认有分泌抗体的杂交瘤细胞，就应尽快进行克隆化。克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体，反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞若难以克隆化，可以尝试以下解决方法：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①使用已有杂交瘤细胞株对血清进行筛选，确定最佳批次的血清和使用浓度；[/font][font=宋体][font=宋体]②融合后第一次克隆（一亚）仍需采用含[/font][font=Calibri]HT[/font][font=宋体]的条件培养；[/font][/font][font=宋体][font=宋体]③在培养体系中加入白细胞介素[/font][font=Calibri]6[/font][font=宋体]（[/font][font=Calibri]IL6[/font][font=宋体]），一般商品化的杂交瘤因子都含有[/font][font=Calibri]IL6[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]义翘神州提供杂交瘤测序服务和杂交瘤细胞培养及抗体生产服务，具体关于杂交瘤相关问题详情可以参看[/font][font=宋体][font=宋体]杂交瘤技术：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology[/font][/font][font=宋体][font=宋体]杂交瘤细胞培养及抗体生产服务：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-culture-antibody-production-service[/font][/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-sequencing-service][b]杂交瘤测序服务[/b][/url]：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-sequencing-service[/font][/font]

[font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology][b]杂交瘤技术[/b][/url]又称细胞融合技术，是将两个或多个细胞融合成一个。[/font] [font=宋体]融合后形成的杂交瘤细胞承袭了两亲本细胞的特征。[/font] [font=宋体]自发的细胞融合很少发生，当加入一种融合剂，如：聚乙二醇（常用）、仙台病毒或溶血卵磷脂后，两种细胞就可发生融合。[/font] [font=宋体]首先是质膜互相融合，形成具有两个或多个核的异核体，细胞进一步分裂时，核互相融合，形成了杂交细胞。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]杂交瘤技术优缺点：[/font][/b][font=宋体]优点：与传统的免疫动物方法制备抗体相比，利用杂交瘤技术可以制备出高纯度的单抗，并且可以进行单克隆抗体的大量生产。[/font][font=宋体][font=宋体]缺点：[/font][font=Calibri]a.[/font][font=宋体]操作步骤繁琐。[/font][font=Calibri]b.[/font][font=宋体]利用杂交瘤技术生产出的单克隆抗体多为鼠源性，而鼠源性抗体在应用中有诸多问题，例如被人类免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体[/font][font=Calibri]( HAMA[/font][font=宋体]）反应、在人体循环系统中很快被清除等。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]杂交瘤技术应用：[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]①诊断应用：单克隆抗体在疾病诊断中发挥了重要作用，其优点在于诊断准确且无交叉反应，例如在乙型肝炎及潜伏的乙型肝炎病毒的诊断中，单克隆抗体能显著减少假阴性的漏诊。[/font][font=宋体]②治疗载体：单克隆抗体也可作为治疗疾病的载体。通过与抗肿瘤药物结合，单克隆抗体能在体内选择性集中攻击肿瘤细胞，具有靶向性，从而减少对正常组织的损伤并减轻抗癌药物的副作用。因此，载药单克隆抗体被誉为“生物导弹”。[/font][font=宋体][font=宋体]③异种蛋白质问题：目前大多数单克隆抗体为鼠[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]鼠型，对于人体来说属于异种蛋白质，容易引起排异反应，限制了其在治疗中的应用。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]④人[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]人型单克隆抗体的研究：为了解决排异问题，研究者正在努力研发人[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]人型单克隆抗体，以利于其在治疗中的广泛应用。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]杂交瘤技术常见问题解析：[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①电融合和[/font][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]融合的区别？[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]化学融合是利用聚乙二醇分子能够改变细胞膜结构的特性来实现细胞融合的过程。聚乙二醇可以使两个细胞接触点质膜的脂质分子发生疏散和重组，两个细胞接触部位的质膜由于相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而发生细胞融合。电融合则是先通过高频交流电压，使细胞成串珠状排列，实现点接触；然后施加方波脉冲，击穿两个细胞接触部位的质膜，质膜脂质分子发生重组，同时由于细胞表面张力作用，完成细胞融合。电融合法比[/font][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]融合法有明显的优点：细胞融合率高，有利于杂交瘤的筛选；电脉冲击穿对细胞的损伤小，有利于融合后细胞的生长增殖；可直接观察融合过程；便于有目的地控制选择融合条件。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]②为什么要推荐进行[/font][font=Calibri]2~3[/font][font=宋体]轮有限稀释获得稳定的杂交瘤细胞株？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]阳性单克隆细胞的获得通常进行至少[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]轮有限稀释，原因主要考虑两点。第一，有限稀释过程中，大多数是通过实验者在显微镜下观察细胞团状态来判定是否是单克隆，存在一定的主观经验值，至少进行两轮有限稀释可以增加判断的准确性；第二，杂交瘤细胞由两个细胞融合而成，存在基因的不稳定性，连续[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]轮有限稀释，客观上增加了筛选中细胞培养时间，有利于淘汰不稳定的杂交瘤细胞株。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③为什么要使用核酸免疫？[/font][font=宋体]重组蛋白由于免疫靶向明确、剂量可控等优势，通常作为动物免疫阶段的首选免疫原。但有些重组蛋白因为表达纯化困难，很难大量获得并用于动物免疫；另外，重组蛋白与天然样本之间存在或多少的结构差异。而核酸免疫，跳过了蛋白表达纯化的过程，成功避开了蛋白生产的难题，通过核酸体内表达的蛋白结构也更加接近天然蛋白，故而可以作为重组蛋白免疫的有效补充手段。但核酸免疫的免疫剂量很难判断，整体免疫效价也会普遍低于蛋白和多肽免疫。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]④除弗氏佐剂之外，免疫佐剂还有哪些？[/font][font=宋体][font=宋体]免疫佐剂是指那些同抗原一起或预先注入机体内能增强机体对抗原的免疫应答能力或改变免疫应答类型的辅助物质。佐剂的免疫生物学作用是增强免疫原性、增强抗体的滴度、改变抗体产生的类型、引起或增强迟发超敏反应等。除经典的弗氏佐剂外，各类不同功能的佐剂也层出不穷，比较常见的有：[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）无机佐剂，如磷酸铝佐剂、氢氧化铝佐剂；[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）生物类佐剂，如以细菌胞壁或产物为主要组成的佐剂；[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）具有佐剂活性的细胞因子类，如[/font][font=Calibri]GSF[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]IL1[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]IL2[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]IFN -[/font][font=宋体]γ等；[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]）人工合成佐剂，如[/font][font=Calibri]cpG[/font][font=宋体]等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]⑤杂交瘤融合后主克隆接种[/font][font=Calibri]96[/font][font=宋体]孔细胞培养板数量通常是多少？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]融合后的主克隆细胞接种[/font][font=Calibri]96[/font][font=宋体]孔细胞培养板的数量与融合效率和脾细胞多少有密切关系。[/font][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]化学融合后的主克隆，通常一只小鼠的脾细胞可以接种[/font][font=Calibri]8-15[/font][font=宋体]块[/font][font=Calibri]96[/font][font=宋体]孔细胞培养板；电融合因为融合效率大大提高，通常一只小鼠的脾细胞可以接种[/font][font=Calibri]30~50[/font][font=宋体]块[/font][font=Calibri]96[/font][font=宋体]孔细胞培养板。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多[url=https://cn.sinobiological.com/services/platform/hybridoma-development][b]杂交瘤开发平台[/b][/url]详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/platform/hybridoma-development[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

《自然—遗传学》：中美科学家揭示玉米杂交机制 作者：刘传书 来源：科技日报由中国农业大学玉米中心、华大基因研究院、美国爱荷华大学、明尼苏达大学等单位合作的研究成果“基因丢失与获得的多态变化揭示玉米中的杂交优势的机制”近日在国际著名杂志《自然—遗传学》上发表。该研究报道了中国重要玉米骨干亲本的全基因组的单核苷酸多态性、插入/缺失多态性以及基因获得和缺失变异图谱，为玉米的遗传学研究和分子育种提供了宝贵资源。该研究对6个中国重要玉米杂交组合骨干亲本进行全基因组重测序，发现了100多万个单核苷酸多态性位点（SNPs）和3万多个插入缺失多态性位点（IDPs），建立了高密度分子标记基因图谱；同时研究还发现了101个低序列多态性区段，在这些区段中含有大量在选择过程中与玉米性状改良有关的候选基因。此外，通过将玉米自交系Mo17及其他自交系的基因序列与玉米自交系B73的基因序列比对，研究人员对玉米自交系中基因丢失与获得的多态性进行了研究，发现在不同的自交系中存在不用数量的基因丢失与获得性变异；利用SAOPdenovo软件对在其他自交系中存在而在B73中缺失的序列进行组装，研究人员发现了很多目前公布的B73参考基因组序列中丢失的基因。这些发现不仅为高产杂交玉米育种骨干亲本的培育提高了重要的多态性标记，同时也补充了玉米基因数据集，为进一步挖掘玉米基因组和遗传资源提供了大量数据。玉米具有非常显著的杂交优势，利用该优势是提高产量的主要手段之一。研究人员选择了中国历史上和目前广泛流行的高产杂交组合骨干亲本，并根据多态性追踪了这些骨干亲本育成过程中基因组的变化方式。该研究还发现这些骨干亲本组合基因组的组合可弥补另一方功能元件的缺失，此种基因丢失与获得的多态变化和其他无义突变的互补作用可能与杂种优势有关。