核酸蛋白质定量荧光计

利用核磁是否可以观察到蛋白质、核酸等二级结构的动态变化过程？

核酸及蛋白质常用数据1．核苷三磷酸的物理常数化合物分子量λmax(pH7.0)1摩尔溶液（pH7.0）中λmax时的最大吸收值OD280/OD260ATP507259154000.15CTP48327190000.97GTP523253137000.66UTP484262100000.38dATP494259152000.15dCTP46727193000.98dGTP507253137000.66dTTP48226796000.712．常用核酸的长度与分子量核酸核苷酸数分子量[/

在发明蛋白质印迹法（Western Blot）出现了30多年之后，这项技术仍然是获取特定蛋白可靠鉴定的关键。许多近期涌现的产品利用各种方法来提高蛋白质印迹实验的可重复性、敏感性、定量性以及速度。有三个人都被认为发展了蛋白质的免疫印迹方法，但其中只有一人才算得上是“Western Blotting（蛋白质印迹法）”的命名者，他就是当时在西雅图哈钦森癌症研究中心Bob Nowinski实验室工作的W. Neal Burnette。“Western Blotting”的命名中暗含了Southern Blotting（Edwin Southern在1975年发明的一项技术，使用胶、尼龙膜和吸水纸去鉴定一个复杂个体中特定的DNA序列）、Northern Blotting（随后发明出的相似策略，用于鉴定RNA）以及位于西海岸（West Coast）的Nowinski实验室三者之意。http://www.ibioo.com/data/attachment/portal/201309/22/095234xzm2pso06fsmtbof.jpgBurnette的技术成果直到1981年才得以发表。他回想起来，当时审稿人“特别”反对使用“Western blotting”这一名称。但尽管如此，这个名称还是沿袭了下来，而且蛋白质印迹技术也成为了最广泛使用的免疫化学技术之一。工作原理蛋白质印迹法的第一步涉及到用凝胶电泳（Gelelectrophoresis）按照大小分离蛋白质，然后通过将膜置于胶上，将蛋白质转移到膜上（通常是硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜），并在膜上加上若干片吸水纸，然后将这套堆层放在缓冲溶液中，这样就能通过毛细管作用将蛋白质向上拉拽到膜上。这也就是所谓的湿法或槽式转印法。另外两项技术是干法和半干转印法，这两种方法比传统的湿转印法更快也更规整，但是对于高分子量蛋白质而言，效率更低。对于半干转印方法来说，膜和胶放置在被缓冲液浸泡过的滤纸层之间，将这些都夹在阴极和阳极之间，电流就能驱动蛋白质转移到膜上。三种方法中，干法转印最快，但转印效率也最低。转印结束后，膜被放在稀释过的蛋白质溶液中用来封闭非特异性的蛋白质结合。然后将膜与一抗进行孵育、洗脱，再与标记了信号检测探针的二抗进行孵育。最后一步是检测，通常采用化学发光或者荧光方法。在化学发光检测中，与酶交联的二抗能够与检测抗原产生光发生反应，可以被胶片或成像装置捕获。而在荧光检测中，抗体探针被荧光集团所标记。荧光检测方法的主要优势在于，它可以同时检测多个蛋白质，并且其信号更加一致。因此与化学发光检测相比，也更有利于量化研究。不少制造蛋白质印迹相关设备、软件和消耗品的公司正在努力推动其中一些或所有步骤的自动化，期望能够将这一实验变得更加简单有效。同时在实验中加入了一些验证点，让研究人员能够随时监测实验进展，甚至重新打造整个过程。科学家们寻求的是高效性、稳健性和策略化，从而能够帮助他们避免浪费宝贵的造价高昂的抗体。加速免疫检测过程转印、抗体孵育、上样和洗脱步骤占据了蛋白质印迹法实验80%的时间，EMD Millipore公司“蛋白质印迹法解决方案”产品经理Michele Hatler这样介绍。这家总部位于加州泰梅库拉的公司推出的SNAP i.d. 2.0蛋白质检测系统加速了整个过程，使用真空装置通过膜推入试剂，而不仅仅依赖于扩散作用。这样就能将免疫检测的时间从4小时缩短到30分钟，Hatler表示。她解释说：“我们真正致力于提高蛋白质印迹工作流程的效率。我们仍然是按照传统的步骤走，只是加了一个真空装置。”Hatler指出，2.0版本是于2012年9月推出的，相比之前的版本有几个方面的优势。它可以使用中等大小的凝胶（8.5×13.5厘米）和迷你凝胶（7.5×8.4厘米），之前则只能用迷你凝胶。“这一设备很便宜，操作也很简便，但切实提高了实验效率，节省了实验时间。” Hatler说。伯乐公司（Bio-Rad）的Trans-Blot Turbo蛋白质转移系统是实验台面大小的仪器，能够提供快速而高效的转印。得益于新的转印缓冲液配方，特殊的过滤材料和增强的电流强度（由一个集成电源调节），这一系统能够在短至3分钟的时间内完成转印，并且印迹结果能与槽式转移相媲美。传统的半干转移系统需要15到60分钟时间，而且通常无法提供高分子量蛋白质转移的有力结果。增加验证点以缓解忧虑蛋白质印迹法的高失败率常常令人感到非常沮丧，尤其是你需要若干天来换取一个结果。“这是一项非常不稳定的技术，”伯乐公司“蛋白质印迹组”市场经理Ryan Short说，“我们对用户调查时发现，一半的用户报告他们用此技术的失败率至少是25%。”Short还说：“几乎没有什么机会可以检查实验过程是否满足期望。由此就产生了焦虑。我们正在引入可视验证点的概念来增加信心和确定性。”这家公司的标准和Mini-PROTEAN免染色预制胶，利用其ChemiDoc MP胶成像系统，使得研究者可以快速观测到他们的蛋白是否正确地载入到凝胶上，进而确证高质量的蛋白质转移，便于决定是否应该转向下一个步流程或是重新开始。ChemiDoc MP系统是为化学发光和多元荧光斑点成像技术所设计，能够在个人电脑上用ImageLab软件来操作。这些验证点“真的很有用”，在实验室使用该系统的加州大学戴维斯分校助理教授Aldrin Gomes表示：“我们可以成像这些免染的凝胶，不用加入额外的染料，而且能够快速判断跑在胶上的样品是否出现问题。我们还能在蛋白质转膜之后再去对凝胶成像，如果其中任何一个步骤出现问题，我们都可以在这一点上停止实验进程。”成像和软件提高定量性当许多科学家仍在使用胶片分析蛋白质印迹时，世面上开始出现越来越多的宽范围免胶片凝胶记录成像系统，这些系统可以用来成像并分析化学发光的印迹、荧光的印迹斑点或者同时检测这两种印迹。许多公司开始纷纷努力，争相制造尽可能便捷的成像仪及其分析软件。很多公司提供了按键式成像捕捉系统，其大小可在实验台上操作。Syngene公司于2012年4月推出了非常简洁的一键操作系统PXi，分析化学发光和荧光印迹。该系统是基于该公司的G:BOX成像系统，并配有GeneSys成像软件。2012年10月，赛默飞世尔公司（Thermo Fisher Scientific）推出了myECL成像仪，使用紫外和可见光透射法，专业的滤镜和电荷耦合器件（CCD）摄影技术去捕获和分析蛋白质印迹以及蛋白和核酸凝胶。

蛋白质与多肽蛋白质粉 人类的营养物质有许多种类，最为重要的为蛋白质，碳水化合物和脂肪，其它则是微量营养物质，如维生素、电解质和微量元素等。虽然每一种营养物质对人体来说都是不可或缺的，但绝大多数的营养学家都会有充分的理由认为，真正最重要的营养物质是蛋白质。一、蛋白质是构成人体的基本物质。 蛋白质是由氨基酸通过肽链相连而构成的，它是人体包括骨骼、肌肉、皮肤和脑的重要物质基础，同时氨基酸也是生成核酸的基本物质。我们知道，核酸既形成遗传密码，也是体内储存能量的基本物质。因而从根本上说，人体是由蛋白质组成的。构成人体蛋白质的生理功能概括有如下三个方面：1）人体组织的主要构成成份：如肌肉、骨骼、血液、皮肤、神经、肝、心等等。2）具有特殊生理功能：可以这样说，人类的一切生理活动都与蛋白质有关。如酶蛋白能催化机体的一切化学反应，包括蛋白质、脂肪、碳水化合物的消化等；载脂蛋白运送脂肪；血红蛋白运送氧；激素蛋白调节代谢与生理活动包括情感；血浆白蛋白调节渗透压、运输金属离子、胆红素和抗生素等。3）供给机体能量：成年人每日约需要更新400g蛋白质，每克蛋白质彻底分解能释放出约4 Kcal的热量。4）为机体提供氮原料：人体内所必需的嘧啶、嘌呤、肌酸、胆碱、肾上腺素、肉碱、牛磺酸等，都是以多肽、氨基酸为原料的。表1. 世界粮食组织（FAD）和世界卫生组织（WHO）根据中国人的体质和膳食结构推荐的中国人蛋白质的摄入量（RNLs）。年 龄蛋白质RNL（g/d） 初生—6个月 1.5-3 1岁 35 3岁 45 5岁 55 7岁 60 9岁 65 10-16岁 75-85 成年女性 65 成年男性 75 妊娠 +15 乳母 +20 根据统计资料：由于贫困、工作紧张、精神压力、减肥节食、以及肠胃疾病、癌症、贫血、肾病、各种结核病、肝硬化、腹水、烧伤、失血等，以及老龄人均不同程度地存在着蛋白质的摄入不足。 上世纪80年代以来，我国营养学家对7个省18个贫困地区，1万名学龄前儿童进行了为期4年的连续调查，发现营养不良现象非常严重，其中蛋白质的摄入量不足WHO规定的60%。近年社会医学工作调查，在发达地区由于生活节奏加快，精神压力异常增加，以及办公室白领阶层的减肥节食，也导致蛋白质摄入不足，代谢异常的人群增加。二、蛋白质缺乏的体征和临床症状 单纯的蛋白质营养不良又叫加西长病，这或许是来源于非洲的单词，单纯的能量不足时叫消瘦；临床上通常把这两种现象叫单纯性蛋白质能量营养不良症或PEM。单纯的PEM症在临床上较少见到，但在慢性消耗性疾病患者中则常见，尤其是在癌症患者和艾滋病的患者中几乎占到90%以上。 现代都市和贫困地区存在着相当数量的蛋白质营养不良族群，他们的临床表现主要是能量损失或不足，如体力不支、睡眠不安、怕冷、怕热、性冷淡、无法进行正常的体力劳动和运动，其次为肌肉组织萎缩、皮肤松驰；腿部、脸部易水肿、脂肪肝、无名皮疹、伤口愈合不良、记忆力下降、视力减弱等。再者免疫力低下易感冒、感染。在做血检时通常会发现这些族群的血浆蛋白处于正常值的下限，其中白蛋白、转铁蛋白、甲状腺素结合前体蛋白和视轴蛋白（retinol-binding protein）均处于低水平时，患者易于感染各种疾病并且出现早衰症状，如果是儿童则感染后死亡率增加30%-40%，对于这类人群WHO的专家最好的建议就是迅速补充优质（或全价）的蛋白质。三、优质蛋白质和劣质蛋白质的区别。 要弄清楚何为优质蛋白质？何为劣质蛋白质？我们要引入什么是必需氨基酸的概念。营养生理学家、生化学家发现构成人体蛋白质的氨基酸共有21种，而这些氨基酸中其中有4种是可以由体内含碳和含氮底物自己合成的，被称为非必需氨基酸，还有10个必需的氨基酸，是人类机体无法制造需要从饮食中摄取的，另有7个是介于这两者之间的被称为条件必需氨基酸。表2. 必需、条件必需和非必需氨基酸 必需氨基酸条件必需氨基酸 非必需氨基酸 亮氨酸牛黄酸 丙氨酸 异亮氨酸酪氨酸 谷氨酸 缬氨酸甘氨酸 天冬氨酸 赖氨酸丝氨酸 天冬酰胺 苯丙氨酸（酪氨酸）脯氨酸 蛋氨酸（半胱氨酸）谷氨酰酸 苏氨酸 胱氨酸 色氨酸 组氨酸 精氨酸 虽然蛋白质广泛存在于许多动物性和植物性食物中，但是必需氨基酸的构成异差很大，WHO把“蛋白质其组成恰好符合人体需要”的蛋白质称为理想蛋白质，在自然界这种理想的蛋白质普遍认为是鸡蛋蛋白，因此就把鸡蛋蛋白作为衡量蛋白质优劣的参照蛋白，科学家把它作为一把尺子来衡量各种蛋白质，并制定出标准，以4种必需氨基酸为最低限来决定其优劣，即色氨酸、苏氨酸、赖氨酸或者蛋氨酸（半胱氨酸）。 通过比较科学发现，肉、鱼、蛋、牛奶、乳酪含有优质蛋白，大豆、花生、豌豆也含有较多的高质量蛋白。进一步研究发现它们都不够完美，因而要求大家对优质的动物性蛋白和植物性蛋白进行了科学搭配才是最完美的全价蛋白质（complete protein）。表3. 部分高质量蛋白

基因组(genome)包含的遗传信息经转录产生mRNA，一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的mRNA称为转录子组(transcriptome)。很显然，不同细胞在不同生理或病理状态下转录子组包含的mRNA的种类不尽相同。mRNA经翻译产生蛋白质，一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质称为蛋白质组(proteome)。同理，不同细胞在不同生理或病理状态下所表达的蛋白质的种类也不尽相同。蛋白质是基因功能的实施者，因此对蛋白质结构，定位和蛋白质-蛋白质相互作用的研究将为阐明生命现象的本质提供直接的基础。生命科学是实验科学，因此生命科学的发展极大地依赖于实验技术的发展。以DNA序列分析技术为核心的基因组研究技术推动了基因组研究的日新月异，而以基因芯片技术为代表的基因表达研究技术为科学家了解基因表达规律立下汗马功劳。在蛋白质组研究中，二维电泳和质谱技术的黄金组合又为科学家掌握蛋白质表达规律再铸辉煌。蛋白质组学(proteomics)就是指研究蛋白质组的技术及这些研究得到的结果。蛋白质组学的研究试图比较细胞在不同生理或病理条件下蛋白质表达的异同，对相关蛋白质进行分类和鉴定。更重要的是蛋白质组学的研究要分析蛋白质间相互作用和蛋白质的功能。蛋白质组学的研究内容包括：1.蛋白质鉴定：可以利用一维电泳和二维电泳并结合Western等技术，利用蛋白质芯片和抗体芯片及免疫共沉淀等技术对蛋白质进行鉴定研究。2.翻译后修饰：很多mRNA表达产生的蛋白质要经历翻译后修饰如磷酸化，糖基化，酶原激活等。翻译后修饰是蛋白质调节功能的重要方式，因此对蛋白质翻译后修饰的研究对阐明蛋白质的功能具有重要作用。3.蛋白质功能确定：如分析酶活性和确定酶底物，细胞因子的生物分析/配基-受体结合分析。可以利用基因敲除和反义技术分析基因表达产物-蛋白质的功能。另外对蛋白质表达出来后在细胞内的定位研究也在一定程度上有助于蛋白质功能的了解。Clontech的荧光蛋白表达系统就是研究蛋白质在细胞内定位的一个很好的工具。4.对人类而言，蛋白质组学的研究最终要服务于人类的健康，主要指促进分子医学的发展。如寻找药物的靶分子。很多药物本身就是蛋白质，而很多药物的靶分子也是蛋白质。药物也可以干预蛋白质-蛋白质相互作用。在基础医学和疾病机理研究中，了解人不同发育、生长期和不同生理、病理条件下及不同细胞类型的基因表达的特点具有特别重要的意义。这些研究可能找到直接与特定生理或病理状态相关的分子，进一步为设计作用于特定靶分子的药物奠定基础。不同发育、生长期和不同生理、病理条件下不同的细胞类型的基因表达是不一致的，因此对蛋白质表达的研究应该精确到细胞甚至亚细胞水平。可以利用免疫组织化学技术达到这个目的，但该技术的致命缺点是通量低。LCM技术可以精确地从组织切片中取出研究者感兴趣的细胞类型，因此LCM技术实际上是一种原位技术。取出的细胞用于蛋白质样品的制备，结合抗体芯片或二维电泳-质谱的技术路线，可以对蛋白质的表达进行原位的高通量的研究。很多研究采用匀浆组织制备蛋白质样品的技术路线，其研究结论值得怀疑，因为组织匀浆后不同细胞类型的蛋白质混杂在一起，最后得到的研究数据根本无法解释蛋白质在每类细胞中的表达情况。虽然培养细胞可以得到单一类型细胞，但体外培养的细胞很难模拟体内细胞的环境，因此这样研究得出的结论也很难用于解释在体实际情况。因此在研究中首先应该将不同细胞类型分离，分离出来的不同类型细胞可以用于基因表达研究，包括mRNA和蛋白质的表达。LCM技术获得的细胞可以用于蛋白质样品的制备。可以根据需要制备总蛋白，或膜蛋白，或核蛋白等，也可以富集糖蛋白，或通过去除白蛋白来减少蛋白质类型的复杂程度。相关试剂盒均有厂商提供。蛋白质样品中的不同类型的蛋白质可以通过二维电泳进行分离。二维电泳可以将不同种类的蛋白质按照等电点和分子量差异进行高分辨率的分离。成功的二维电泳可以将2000到3000种蛋白质进行分离。电泳后对胶进行高灵敏度的染色如银染和荧光染色。如果是比较两种样品之间蛋白质表达的异同，可以在同样条件下分别制备二者的蛋白质样品，然后在同样条件下进行二维电泳，染色后比较两块胶。也可以将二者的蛋白质样品分别用不同的荧光染料标记，然后两种蛋白质样品在一块胶上进行二维电泳的分离，最后通过荧光扫描技术分析结果。胶染色后可以利用凝胶图象分析系统成像，然后通过分析软件对蛋白质点进行定量分析，并且对感兴趣的蛋白质点进行定位。通过专门的蛋白质点切割系统，可以将蛋白质点所在的胶区域进行精确切割。接着对胶中蛋白质进行酶切消化，酶切后的消化物经脱盐/浓缩处理后就可以通过点样系统将蛋白质点样到特定的材料的表面（MALDI-TOF）。最后这些蛋白质就可以在质谱系统中进行分析，从而得到蛋白质的定性数据;这些数据可以用于构建数据库或和已有的数据库进行比较分析。实际上像人类的血浆，尿液，脑脊液，乳腺，心脏，膀胱癌和磷状细胞癌及多种病原微生物的蛋白质样品的二维电泳数据库已经建立起来，研究者可以登录www.expasy.ch/www/tools.html等网站进行查询，并和自己的同类研究进行对比分析。Genomic Solution可以为研究者提供除质谱外的所有蛋白质组学研究工具，包括二维电泳系统，成像系统及分析软件，胶切割系统，蛋白质消化浓缩工作站，点样工作站等；同时还可以提供相关试剂和消耗品。LCM-二维电泳-质谱的技术路线是典型的一条蛋白质组学研究的技术路线，除此以外，LCM-抗体芯片也是一条重要的蛋白质组学研究的技术路线。即通过LCM技术获得感兴趣的细胞类型，制备细胞蛋白质样品，蛋白质经荧光染料标记后和抗体芯片杂交，从而可以比较两种样品蛋白质表达的异同。Clontech最近开发了一张抗体芯片，可以对378种膜蛋白和胞浆蛋白进行分析。该芯片同时配合了抗体芯片的全部操作过程的重要试剂，包括蛋白质制备试剂，蛋白质的荧光染料标记试剂，标记体系的纯化试剂，杂交试剂等。对于蛋白质相互作用的研究，酵母双杂交和噬菌体展示技术无疑是很好的研究方法。Clontech开发的酵母双杂交系统和NEB公司开发的噬菌体展示技术可供研究者选用。关于蛋白质组的研究，也可以将蛋白质组的部分或全部种类的蛋白质制作成蛋白质芯片，这样的蛋白质芯片可以用于蛋白质相互作用研究，蛋白表达研究和小分子蛋白结合研究。Science，Vol.293，Issue 5537，2101-2105，September 14，2001发表了一篇关于酵母蛋白质组芯片的论文。该文主要研究内容为：将酵母的5800个ORF表达成蛋白质并进行纯化点样制作芯片，然后用该芯片筛选钙调素和磷脂分子的相互作用分子。最后有必要指出的是，传统的蛋白质研究注重研究单一蛋白质，而蛋白质组学注重研究参与特定生理或病理状态的所有的蛋白质种类及其与周围环境(分子)的关系。因此蛋白质组学的研究通常是高通量的。适应这个要求，蛋白质组学相关研究工具通常都是高度自动化的系统，通量高而速度快，配合相应分析软件和数据库，研究者可以在最短的时间内处理最多的数据。

一次可以同时标记4组/8组样品,4次/8次实验变成一次实验,大大提高了通量一个蛋白质有多个肽段被鉴定,提高了定量的准确性可以进行多个时间点蛋白质组动态变化的监测可以分析详细分期/型的临床疾病样本,并可设计样本重复甚至可以进行个体样本的研究细胞周期、细胞信号传导整个过程的蛋白质组动态学二级图谱质量更好,产生很好的y、b离子系列,蛋白序列覆盖率提高,鉴定结果更可靠操作简便,不需要更多的额外操作

为探究生物进程的分子机制，需要确定介导这个过程的蛋白质-蛋白质间的相互作用。研究蛋白质间相互作用的主要技术总结如下：一、酵母双杂交系统酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。二、噬茵体展示技术在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。三、等离子共振技术表面等离子共振技术（SurfacePlasmonResonance，SPR）已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。四、荧光能量转移技术荧光共振能量转移（FRET）广泛用于研究分子间的距离及其相互作用;与荧光显微镜结合，可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNA和RNA的时空信息。随着绿色荧光蛋白（GFP）的发展，FRET荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子的动态性质。提出了一种定量测量FRET效率以及供体与受体间距离的简单方法，仅需使用一组滤光片和测量一个比值，利用供体和受体的发射谱消除光谱间的串扰。该方法简单快速，可实时定量测量FRET的效率和供体与受体间的距离，尤其适用于基于GFP的供体受体对。五、抗体与蛋白质阵列技术蛋白芯片技术的出现给蛋白质组学研究带来新的思路。蛋白质组学研究中一个主要的内容就是研究在不同生理状态下蛋白水平的量变，微型化，集成化，高通量化的抗体芯片就是一个非常好的研究工具，他也是芯片中发展最快的芯片，而且在技术上已经日益成熟。这些抗体芯片有的已经在向临床应用上发展，比如肿瘤标志物抗体芯片等，还有很多已经应用再眼就的各个领域里。六、免疫共沉淀技术免疫共沉淀主要是用来研究蛋白质与蛋白质相互作用的一种技术，其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Pansobin珠上的金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)，若细胞中有正与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—SPA\|Pansobin”，因为SPA\|Pansobin比较大，这样复合物在离心时就被分离出来。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物四组分又被分开。然后经Westernblotting法，用抗体检测目的蛋白是什么，是否为预测蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内天然与兴趣蛋白结合的，符合体内实际情况，得到的蛋白可信度高。但这种方法有两个缺陷：一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；二是必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。七、pull-down技术蛋白质相互作用的类型有牢固型相互作用和暂时型相互作用两种。牢固型相互作用以多亚基蛋白复合体常见，最好通过免疫共沉淀（Co-IP）、Pull-down技术或Far-western法研究。Pull-down技术用固相化的、已标记的饵蛋白或标签蛋白（生物素-、PolyHis-或GST-），从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白。通过Pull-down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，从体外传路或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。

请教高手，我要测的那种蛋白质用ANS荧光探针法测的话没有查到明确的参数。这时候ANS荧光探针和蛋白质的量该怎么确定大致的范围才能测出有效的数据？还有激发波长和发射波长怎么办？

总结了所有经典蛋白质定量方法！

人类的营养物质有许多种类，最为重要的为蛋白质，碳水化合物和脂肪，其它则是微量营养物质，如维生素、电解质和微量元素等。虽然每一种营养物质对人体来说都是不可或缺的，但绝大多数的营养学家都会有充分的理由认为，真正最重要的营养物质是蛋白质。一、蛋白质是构成人体的基本物质。蛋白质是由氨基酸通过肽链相连而构成的，它是人体包括骨骼、肌肉、皮肤和脑的重要物质基础，同时氨基酸也是生成核酸的基本物质。我们知道，核酸既形成遗传密码，也是体内储存能量的基本物质。因而从根本上说，人体是由蛋白质组成的。构成人体蛋白质的生理功能概括有如下三个方面：1）人体组织的主要构成成份：如肌肉、骨骼、血液、皮肤、神经、肝、心等等。2）具有特殊生理功能：可以这样说，人类的一切生理活动都与蛋白质有关。如酶蛋白能催化机体的一切化学反应，包括蛋白质、脂肪、碳水化合物的消化等；载脂蛋白运送脂肪；血红蛋白运送氧；激素蛋白调节代谢与生理活动包括情感；血浆白蛋白调节渗透压、运输金属离子、胆红素和抗生素等。3）供给机体能量：成年人每日约需要更新400g蛋白质，每克蛋白质彻底分解能释放出约4 Kcal的热量。4）为机体提供氮原料：人体内所必需的嘧啶、嘌呤、肌酸、胆碱、肾上腺素、肉碱、牛磺酸等，都是以多肽、氨基酸为原料的。表1. 世界粮食组织（FAD）和世界卫生组织（WHO）根据中国人的体质和膳食结构推荐的中国人蛋白质的摄入量（RNLs）。年 龄 蛋白质RNL（g/d）初生—6个月 1.5-31岁 353岁 455岁 557岁 609岁 6510-16岁 75-85成年女性 65成年男性 75妊娠 +15乳母 +20根据统计资料：由于贫困、工作紧张、精神压力、减肥节食、以及肠胃疾病、癌症、贫血、肾病、各种结核病、肝硬化、腹水、烧伤、失血等，以及老龄人均不同程度地存在着蛋白质的摄入不足。上世纪80年代以来，我国营养学家对7个省18个贫困地区，1万名学龄前儿童进行了为期4年的连续调查，发现营养不良现象非常严重，其中蛋白质的摄入量不足WHO规定的60%。近年社会医学工作调查，在发达地区由于生活节奏加快，精神压力异常增加，以及办公室白领阶层的减肥节食，也导致蛋白质摄入不足，代谢异常的人群增加。二、蛋白质缺乏的体征和临床症状单纯的蛋白质营养不良又叫加西长病，这或许是来源于非洲的单词，单纯的能量不足时叫消瘦；临床上通常把这两种现象叫单纯性蛋白质能量营养不良症或PEM。单纯的PEM症在临床上较少见到，但在慢性消耗性疾病患者中则常见，尤其是在癌症患者和艾滋病的患者中几乎占到90%以上。现代都市和贫困地区存在着相当数量的蛋白质营养不良族群，他们的临床表现主要是能量损失或不足，如体力不支、睡眠不安、怕冷、怕热、性冷淡、无法进行正常的体力劳动和运动，其次为肌肉组织萎缩、皮肤松驰；腿部、脸部易水肿、脂肪肝、无名皮疹、伤口愈合不良、记忆力下降、视力减弱等。再者免疫力低下易感冒、感染。在做血检时通常会发现这些族群的血浆蛋白处于正常值的下限，其中白蛋白、转铁蛋白、甲状腺素结合前体蛋白和视轴蛋白（retinol-binding protein）均处于低水平时，患者易于感染各种疾病并且出现早衰症状，如果是儿童则感染后死亡率增加30%-40%，对于这类人群WHO的专家最好的建议就是迅速补充优质（或全价）的蛋白质。

蛋白质的质谱定量是一个新兴的发展方向，附件中的资料对蛋白质定量的策略进行了详细描述，供大家参考

请问一下大家，用荧光染料给蛋白质染色，同样的染色时间，不同分子量的蛋白质会表现出荧光强弱的差别吗？谢谢~

在蛋白质折叠研究中常用分子荧光光谱研究二级结构的变化，请教高手二者间有何关系？

蛋白质结构定量分析具体步骤？谢谢

[size=1][font=Arial][/font][/size][size=4][font=宋体]蛋白质的直接定量（[/font][font=Arial]UV[/font][font=宋体]法）[/font][font=Arial][/font][font=Arial] [/font][font=宋体]这种方法是在[/font][font=Arial]280 nm[/font][font=宋体]波长，直接测试蛋白。选择[/font][font=Arial] Warburg[/font][font=宋体]公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。[/font][font=Arial][/font][font=Arial] [/font][font=宋体]蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。由于缓冲液中存在一些杂质，一般要消除[/font][font=Arial]320 nm[/font][font=宋体]的[/font][font=Arial]“[/font][font=宋体]背景[/font][font=Arial]”[/font][font=宋体]信息，设定此功能[/font][font=Arial]“[/font][font=宋体]开[/font][font=Arial]”[/font][font=宋体]。与测试核酸类似，要求[/font][font=Arial] A 280 [/font][font=宋体]的吸光值至少大于[/font][font=Arial] 0.1A[/font][font=宋体]，最佳的线性范围在[/font][font=Arial]1.0-1.5 [/font][font=宋体]之间。实验中选择[/font][font=Arial] Warburg [/font][font=宋体]公式显示样品浓度时，发现读数[/font][font=Arial]“[/font][font=宋体]漂移[/font][font=Arial]”[/font][font=宋体]。这是一个正常的现象。事实上，只要观察[/font][font=Arial]A 280[/font][font=宋体]的吸光值的变化范围不超过[/font][font=Arial] 1%[/font][font=宋体]，表明结果非常稳定。[/font][font=Arial][/font][font=Arial] [/font][font=宋体]漂移的原因是因为[/font][font=Arial] Warburg[/font][font=宋体]公式吸光值换算成浓度，乘以一定的系数，只要吸光值有少许改变，浓度就会被放大，从而显得结果很不稳定。[/font][font=Arial][/font][font=Arial] [/font][font=宋体]蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如[/font][font=Arial]DNA [/font][font=宋体]的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。[/font][/size][size=1][font=Arial][/font][/size]

蛋白质化学与蛋白质组学夏其昌 曾嵘 等编著2004年4月出版ISBN 7-03-012401-4/Q.133116开，平装，580页定价: 75.00元 本书系统论述了蛋白质化学基础理论和实验技巧，也反映了蛋白质组学研究的最新成果。内容包括：蛋白质的表征，蛋白质的组成分析和序列测定，与此相关的实验方法，包括各种色谱、电泳、质谱技术等，以及应用在蛋白质表征研究和基因工程产品的质检方面的实际范例。在蛋白质组学领域介绍了基本概念、样品制备、双向凝胶电泳的图像分析和定量分析、质谱等常规方法，并介绍了国际上最新的多维技术在研究中的应用；同时充分体现了生物信息学在蛋白质组研究中的重要性。 本书可作为生物学、医学、化学专业大学生，研究生和教学人员的参考书，也是从事生物化学、分子生物学、医学等领域中分离分析工作人员的参考书。

现在，在实验研究基础上，借助多方面的生物信息学方法，可以快速高通量的预测和进行蛋白质鉴定蛋白翻译后修饰。分泌蛋白和膜相关蛋白附着于细胞膜上的或将被排泄出去的蛋白质是由细胞内质网膜上附着的核糖体合成。附着有核糖体的内质网被称为糙面型内质网。这类蛋白质都含有一个N-末端（或氨基端），我们称之为信号序列或信号肽。这个信号肽通常情况下含有13-36个主要疏水性残基，同时它含有多蛋白复合物，我们称之为信号识别粒子(SRP)。这种信号肽在通过内质网膜之后会被去除。信号肽的去除过程是在信号肽酶催化作用下完成的。含有一个信号肽的蛋白质被称为前蛋白，有别于原蛋白。然而，某些用于分泌的蛋白在分泌之后会进一步被蛋白水解，因此包含有原蛋白的序列。这类蛋白质被称为前原蛋白。蛋白水解性裂解许多蛋白质在翻译之后会经历水解性裂解过程。其中最为简单的形式是去除起始蛋氨酸。许多蛋白质合成了不活跃的前体细胞，这些细胞只能在合适的生理条件下通过限制性蛋白水解过程产生活性。在凝血过程中使用到的胰腺酶和酶类就是后者的例证。多肽去除时产生活性的不活跃的前体蛋白，我们称之为原蛋白。前原蛋白的翻译后加工过程的一个复杂的例子就是脑垂体分泌合成的前阿黑皮素原的裂解过程（有关前阿黑皮素原的讨论，见肽类激素页）。这类前原蛋白经过复杂的裂解，根据合成的前阿黑皮素原的细胞定位而不同，其路径也有所不同。另一个前原蛋白的例子就是胰岛素。由于胰岛素是由胰腺分泌的，因此它有一个前肽。随着含24个氨基酸的信号肽的裂解，这类蛋白也折叠成了胰岛素原。胰岛素原进一步分裂，产生活跃的胰岛素，它包含两个肽链，由二硫键进行连接。但仍有其他的蛋白（酶类）被合成为非活跃的前体细胞，被称为酶原。酶原在蛋白水解性裂解时会产生活性，在凝血串联蛋白质链的若干蛋白质中都会发生这种现象。甲基化作用蛋白翻译后的甲基化过程主要发生在氮原子和氧原子上。活性甲基供体是活性腺苷甲硫胺酸(SAM)。最常见的甲基化作用发生在赖氨酸残基的ε-amine上。脱氧核糖核酸组蛋白中赖氨酸残基的甲基化作用可调节核染色质结构，因此可调节其转录活性。赖氨酸原本被认为是一种常设共价标记，可提供长期信号，甚至包括转录记忆时的组蛋白依赖机制。然而，最近的临床研究表明赖氨酸甲基化作用与其他共价修饰体相似，作用时间短，并能通过反脱甲基化活动进行动态调节。最近的组学研究发现表明，赖氨酸残基的甲基化作用不仅发生在核染色质层面，而且还通过修订转录因子影响基因表达。组氨酸的咪唑环，精氨酸的胍基部分以及谷氨酸盐和天冬氨酸盐的R组酰胺（R-group amides ）上，都发现了额外的氮甲基化作用。谷氨酸盐和天冬氨酸盐的R组羧化物也会发生氧甲基化作用并形成甲基酯。蛋白可能在半胱氨酸的R[

一般的荧光分析的书关于蛋白质这方面说的不是很详细，谁能推荐一本详细一些的。谢谢

蛋白质折叠病 ▲许多疾病，如阿兹海默症(Alzheimer's)，疯牛病(Mad Cow, BSE)，可传播性海绵状脑病(CJD)，肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)，还有帕金森氏症(Parkinson's)等正是由于一些细胞内的重要蛋白发生突变，导致蛋白质聚沉或错误折叠而造成的。因此，深入了解蛋白质折叠与错误折叠的关系对于这些疾病的致病机制的阐明以及治疗方法的寻找将大有帮助。 ▲基因组序列的发展使我们得到了大量的蛋白质序列，结构信息的获得对于揭示它们的生物学功能是十分重要的。依靠现有手段（X-ray晶体衍射、NMR及电镜）测定蛋白质的结构需要较长的时间，因此结构解析的步伐已落后于发现新蛋白的步伐。而结构预测的方法虽然速度较快，但可靠性并不高，只有当我们对于维持蛋白质结构，驱动蛋白质折叠的理化因素更为了解，这一方法才可能有根本的改进。另外，我们对于蛋白质相互作用、配体与蛋白质的作用等结构与功能关系的研究也有赖于蛋白质折叠机制的阐明。【蛋白质折叠与“折叠病” 】 人们对由于基因突变造成蛋白质分子中仅仅一个氨基酸残基的变化就引起疾病的情况已有所了解，即所谓“分子病”，如地中海镰刀状红血球贫血症就是因为血红蛋白分子中第六位的谷氨酸突变成了颉氨酸。现在则发现蛋白质分子的氨基酸序列没有改变，只是其结构或者说构象有所改变也能引起疾病，那就是所谓“构象病”，或称“折叠病”。 大家都知道的疯牛病，它是由一种称为Prion的蛋白质的感染引起的，这种蛋白质也可以感染人而引起神经系统疾病。在正常机体中，Prion是正常神经活动所需要的蛋白质，而致病Prion与正常Prion的一级结构完全相同，只是空间结构不同。这一疾病的研究涉及到许多生物学的基本问题。一级结构完全相同的蛋白质为什么会有不同的空间结构，这与Anfinsen原理是否矛盾？显然这里有蛋白质的能量和稳定性问题。 从来认为蛋白结构的变化来自于序列的变化，而序列的变化来自于基因的变化，生命信息从核酸传递到蛋白。而致病Prion的信息已被诺贝尔奖获得者普鲁辛纳证明不是来自基因的变化，致病蛋白Prion导致正常蛋白Prion转变为致病的折叠状态是通过蛋白分子间的作用而感染！这种相互作用的本质和机制是什么？仅仅改变了折叠状态的分子又如何导致严重的疾病？这些问题都不能用传统的概念给予满意的解释，因此在科学界引起激烈的争论，有关研究的强度和竞争性也随之大大增强。 由于蛋白质折叠异常而造成分子聚集甚至沉淀或不能正常转运到位所引起的疾病还有老年性痴呆症、囊性纤维病变、家族性高胆固醇症、家族性淀粉样蛋白症、某些肿瘤等等。由于分子伴侣在蛋白质折叠中至关重要的作用，分子伴侣本身的突变显然会引起蛋白质折叠异常而引起折叠病。随着蛋白质折叠研究的深入，人们会发现更多疾病的真正病因和更针对性的治疗方法，设计更有效的药物。现在发现有些小分子可以穿越细胞作为配体与突变蛋白结合，从而使原已失去作战能力的突变蛋白逃逸“蛋白质质量控制系统”而“带伤作战”。这种小分子被称为“药物分子伴侣”，有希望成为治疗“折叠病”的新药。 新生肽的折叠问题或蛋白质折叠问题不仅具有重大的科学意义，除了上面提到的在医学上的应用价值外，在生物工程上具有极大的应用价值。基因工程和蛋白工程已经逐渐发展成为产值以数十亿美元计的大产业，进入21世纪后，还将会有更大的发展。但是当前经常遇到的困难，是在简单的微生物细胞内引入异体DNA后所合成的多肽链往往不能正确折叠成为有生物活性的蛋白质而形成不溶解的包含体或被降解。这一“瓶颈”问题的彻底解决有待于对新生肽链折叠更多的认识。

用荧光做有关药物与蛋白质相互作用，对药物有什么限制，比如光谱性质，药物发挥作用的机制，对于做这方面研究的意义我其实也不太明白，有大侠给点指导[em06]

[size=3]选择材料及预处理 　　以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。 　　微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。 蛋白质的分离纯化 一，蛋白质（包括酶）的提取 　　大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。 （一）水溶液提取法 　　稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。[/size]

蛋白质纯化及复性 重组蛋白在大肠杆菌（E. coli）高效表达时，往往以不溶的、无活性的蛋白聚集体，即包涵体(inclusion body)的形式存在于细胞内。必须从细胞内分离出包涵体，采用高浓度变性剂（如7.0mol/L盐酸胍、8.0mol/L脲）溶解包涵体，然后除去变性剂或降低变性剂的浓度，使包涵体蛋白得以复性，最后再用色谱法使目标蛋白质得到纯化。其中包涵体蛋白的复性和纯化是整个过程中的核心。 目前重组蛋白生产中普遍存在的问题是：（1）复性效率低。传统的复性方法稀释法和透析法。稀释复性法对样品几十倍，甚至上百倍的稀释会使样品的体积急剧增大，给后续的分离纯化带来很大的困难，而且复性过程中需要较大的复性容器。透析法耗时较长，而且要多次更换透析溶液。这两种方法的共同缺点是蛋白质在复性过程中会发生聚集而产生大量沉淀，复性效率低，通常蛋白质的活性回收率只有5~20%，而且复性后的蛋白质溶液中含有大量的杂蛋白，需要进行进一步的分离纯化。（2）工艺路线烦琐，生产周期长。在传统的重组蛋白质分离纯化工艺中，大多采用经典的软凝胶分离介质，由于这种介质的颗粒较大，分离效率较差，因此常常需要采用多种不同模式的色谱操作联用对目标蛋白质进行纯化，才能得到纯度符合一定标准的目标蛋白质。另外，这种色谱介质的耐压性很差，只能在流速较低的情况下进行操作，分离纯化时间较长。分离纯化步骤多和分离时间长使得蛋白质的质量回收率和活性回收率很低。而且在传统的重组蛋白质生产工艺中，蛋白质的复性和纯化是生产过程中两个独立的单元操作，也在很大程度上制约着生产效率。（3）生产成本高，设备投资大。由于复性和分离纯化分别单独进行，而且分离纯化步骤多，每一步都需要有与之配套的设备，致使设备投资大，生产成本高。随着生产规模的增加，这种弊端会愈来愈严重。 1991年耿信笃教授首先将高效疏水相互作用色谱(HPHIC)用于变性蛋白的复性，很好的解决了上述问题，现已成功用于重组人干扰素-g(rhIFN-g)、重组人干扰素-a(rhIFN-a)、人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)、重组人胰岛素原(proinsulin)、重组牛朊病毒(prion)等重组蛋白以及溶菌酶和核搪核酸酶等标准模型蛋白的复性与同时纯化中。目前，排阻色谱法、离子交换色谱法和亲合色谱法也已用于蛋白质的复性和同时纯化中。与传统的稀释法及透析法比较，用色谱法进行蛋白复性的优点是：①在进样后可很快除去变性剂；②由于色谱固定相对变性蛋白质的吸附，可明显地减少、甚至完全消除复性过程中蛋白质聚集体和沉淀的产生，从而提高蛋白质复性的质量和活性回收率；③在蛋白质复性的同时可使目标蛋白质与杂蛋白分离以达到纯化的目的，使复性和纯化同时进行；④便于回收变性剂，以降低废水处理成本。简言之，色谱法复性可以提高蛋白质的活性和质量回收率，将蛋白复性和纯化集成在一步操作完成，缩短了操作步骤和生产时间，减少了设备投资，使生产成本大大降低，已经引起了全世界范围内许多生化研究者和重组蛋白药物生产厂家的关注。由于高效液相色谱（HPLC）分离效率高，往往在一步操作中便可得到纯度符合要求的蛋白质，而且分离速度快，在应用方面具有更大的优势。

人类基因组计划的顺利实施，使生命科学研究的重心正逐渐转到生物功能的整体研究。基因组学由于自身的局限性，它不能回答诸如：蛋白质的表达水平和表达时间，翻译后修饰以及蛋白质与蛋白质或与其他生物分子的相互作用等问题。作为基因研究的重要补充，蛋白质组学在蛋白质的水平上定量的、动态的、整体的研究生物体。蛋白质组(Proteome)概念是最早是由澳大利亚学者Wilkins和Williams于1994年提出的，即基因所能表达的全部蛋白质，更为清楚的表达是细胞或组织或机体在特定时间和空间上表达的所有蛋白质。具体说它是对不同时间和空间上发挥功能的特定的蛋白质组群进行研究，进而在蛋白质的水平上探索其作模式、功能机理、调节调控以及蛋白质组群内的相互作用，从而为临床诊断、病理研究、药物筛选、新药开发、新陈代谢途径研究等提供理论依据和基础。 详情请见：[url=http://www.instrument.com.cn/hot/HA_56.htm]热点应用：蛋白质组学研究[/url]

磷酸化蛋白质及多肽相关研究的技术进展 摘要磷酸化修饰是一种重要的蛋白质化学修饰,对蛋白质功能的完成或改变起到重要作用。该领域的研究存在很多技术难点,对该领域研究形成了挑战。近年来相关技术有了很多突破,磷酸化研究也取得了很多新的成就。文章将从磷酸化蛋白的检出、磷酸化蛋白质和肽段的富集、生物质谱技术的改进以及磷酸化蛋白和多肽的定量与比较几个方面介绍该研究领域的技术进展。关键词磷酸化蛋白磷酸化肽生物质谱定量分析生命活动与蛋白质的动态变化密切 摘要 磷酸化修饰是一种重要的蛋白质化学修饰, 对蛋白质功能的完成或改变起到重要作用。该领域的研究存在很多技术难点, 对该领域研究形成了挑战。近年来相关技术有了很多突破, 磷酸化研究也取得了很多新的成就。文章将从磷酸化蛋白的检出、磷酸化蛋白质和肽段的富集、生物质谱技术的改进以及磷酸化蛋白和多肽的定量与比较几个方面介绍该研究领域的技术进展。 关键词 磷酸化蛋白 磷酸化肽 生物质谱 定量分析

人类基因组计划的顺利实施，使生命科学研究的重心正逐渐转到生物功能的整体研究。基因组学由于自身的局限性，它不能回答诸如：蛋白质的表达水平和表达时间，翻译后修饰以及蛋白质与蛋白质或与其他生物分子的相互作用等问题。作为基因研究的重要补充，蛋白质组学在蛋白质的水平上定量的、动态的、整体的研究生物体。蛋白质组(Proteome)概念是最早是由澳大利亚学者Wilkins和Williams于1994年提出的，即基因所能表达的全部蛋白质，更为清楚的表达是细胞或组织或机体在特定时间和空间上表达的所有蛋白质。具体说它是对不同时间和空间上发挥功能的特定的蛋白质组群进行研究，进而在蛋白质的水平上探索其作模式、功能机理、调节调控以及蛋白质组群内的相互作用，从而为临床诊断、病理研究、药物筛选、新药开发、新陈代谢途径研究等提供理论依据和基础。 详情请见：[url=http://www.instrument.com.cn/hot/HA_56.htm]热点应用：蛋白质组学研究[/url]

蛋白质组学研究的一般工具与方法随着人类基因组计划取得巨大的成功和许多物种基因组测序的完成，仅仅靠基因组的序列来试图阐明生命现象是远远不够的，因此，研究重心已经开始从揭示生命的所有遗传信息转移到在分子整体水平对功能的研究上，生命科学已实质性地跨入了后基因组时代。 　　尽管现在已经有多个物种的基因组被测序，但这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因组研究中所采用的策略，如微阵列法（microarray）（Wodicka et al., 1997）、基因芯片（gene chips）（Ramsay et al., 1998）、基因表达序列分析（SAGE）（Velculescu et al., 1995）等，都是从细胞中mRNA的角度来考虑的。但事实上，从DNA、mRNA到蛋白质存在三个层次的调控，mRNA自身也存在着贮存、转运和降解等问题，从mRNA角度考虑，实际上仅包括了转录水平调控，并不能全面代表蛋白质表达水平。实验也证明，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度的相关性并不好，尤其对于低丰度蛋白质来说，相关性更差。蛋白质复杂的翻译后修饰，蛋白质的亚细胞定位或迁移，蛋白质-蛋白质相互作用则几乎无法从mRNA水平来判断（曾嵘，夏其昌，2002）。新生肽链合成后存在多种加工、修饰过程，蛋白质间也存在类似于mRNA分子内的剪切、拼接，研究证明基本元件“intein”广泛存在于蛋白质中（Perler et al., 1997）。基因与其编码产物蛋白的线性对应关系只存在于新生肽链而不是最终的功能蛋白质中。 　　蛋白质是生理功能的执行者和生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制；蛋白质本身的存在形式和活动规律，如翻译后修饰、蛋白质间相互作用及蛋白质构象等问题，仍依赖于直接对蛋白质的研究来解决。因此要对生命的复杂活动有全面和深入的认识，必然要在整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行研究（钱小红，贺福初，2003）。 　　 　　蛋白质组学研究中常用的技术体系 　　方法学上，二维凝胶电泳－质谱仍然是目前最流行和可靠的技术平台（Rabilloud et al., 2000）。其一般过程是：细胞或组织样品——样品制备——二维凝胶电泳（2D－PAGE）分离蛋白质——计算机辅助分析2D－PAGE图象——对感兴趣的蛋白质进行酶解——质谱分析——数据库检索——蛋白质鉴定——分析蛋白质在细胞与组织中的表达情况。 　　2-D PAGE 　　样品制备 　　2D－PAGE 的操作流程基本上实现了程序化。但是，样品制备是一个非常关键与复杂的过程。成功的2D－PAGE取决于对样品中蛋白质有效的抽提和它的溶解性。与核酸不同，目前没有一种通用的方法适用于所有的蛋白质，来源不同的蛋白质都受到自身蛋白质制备方法的挑战。 　　正确的样品制备方法从收集样品开始时就要防止样品的裂解和被蛋白水解酶降解（Rabilloud et al., 2000）。要尽可能溶解更多的蛋白，并且在2D－PAGE过程中保持它的溶解性，阻止蛋白质的人为修饰。在样品制备过程中，各个实验室也通过实验建立了更为可行的方法。目前通过建立分步提取方法可以有效地提取出更多的蛋白质（兰彦等，2001）。另一种对蛋白质采用预分离的方法称为“多间隔电解法(multi-compartment-electrolyser)”，采用这种方法后，分辨率和胶的质量均明显改善（Herbert et al., 2000）。 　　但是，由于生物样品的多样性和复杂性，目前所采用的样品制备方法具有局限性。其它物质对蛋白质样品制备存在干扰。核酸通过与蛋白质结合，增加样品黏度而干扰等点聚焦（IEF）分离的效果。当然，通过实验探索，采取一些措施可以减轻它的干扰。例如，在样品制备过程中加入非特异性的核酸酶或RNase与DNase的混合物，在等电聚焦时将每个胶条的电流限制在50mA以内通常可以消除其影响。脂类物质的影响可以通过利用有机溶剂的方法将其去除，但是这常常会导致蛋白质的不可逆沉淀。除了蛋白质的降解之外，糖基化是蛋白质的最重要的人工修饰，样品中的尿素在这一过程中起着非常重要的作用。样品中的尿素在降解的过程中会形成能够与蛋白质的氨基反应的氰酸盐，这种结果会导致蛋白质带有更多的正电荷。所以，在2D－PAGE中要用新鲜的尿素溶液，在等电聚焦过程中要控制温度不能太高（Beranova-Giorgianni, 2003）。但是，目前还没有一种简单有效的方法来去除样品中的多糖。 　　样品分离和分析 　　样品制备完成后运用IEF和SDS-PAGE电泳对它进行分离，常采用银染和考马斯亮兰染色即可观察到具有许多蛋白质斑点的凝胶图像。等电聚焦电泳与SDS-PAGE的具体操作步骤已经实现了程序化，均有详细操作流程参考，但是由于样品的不同，不同样品的具体条件还需要试验探索。第二相SDS-PAGE运行结束，染色完毕后，利用计算机软件对凝胶图像进行分析，如PD-QUEST软件，LIPS，HERMES，GEMINI等，对凝胶图像上的蛋白质斑点进行匹配，对图像进行数字化处理等分析（贾宇峰等，2001），对感兴趣的蛋白质采用质谱分析。 　　低丰度蛋白质的检测 　　低丰度蛋白在蛋白质组学研究中常常是人们非常感兴趣的，因为细胞或组织中的一些生物活性物质，如细胞分泌的一些活性物质，受体等表达量都非常低。按照一般电泳的上样量，这些小分子是根本看不到的，但如果单纯地增加上样量，细胞或组织中的大量表达的蛋白就会将其覆盖，而且上样量过大也会影响电泳结果。所以对这些低丰度的样品可以进行富集，富集的方法可以通过层析，如亲和层析，离子交换层析等方法，还可以通过利用样品等电点性质等方法将pH范围相近的蛋白质富集（Santoni et al., 2000; Beranova-Giorgianni, 2003）。

建立二喹啉甲酸(BCA)测定牛奶中蛋白含量的方法。方法：用BCA 法和凯氏定氮法分别测定食用牛奶蛋白含量；同时，添加尿素作为含氮干扰因素，测定其对BCA 蛋白定量方法的影响。结果：BCA 法蛋白定量精密度实验显示，平均吸光度为0.2798，标准偏差为0.004，加标回收实验的回收率为98.00%～103.00%。分别测定50 倍、100 倍牛奶稀释样品，结果50 倍稀释样品组BCA 法和凯氏定氮法测得蛋白质量浓度的平均值分别为791.2μg/mL 和803.4μg/mL，100 倍稀释样品组分别为370.2μg/mL 和384.0μg/mL。添加尿素干扰实验显示，BCA法实验结果相对标准偏差在5% 以下，而凯氏定氮法大于5%。结论：BCA 法测定牛奶中蛋白含量结果可靠、稳定，与凯氏定氮法相比无显著差异；BCA 法能排除含氮物质的干扰，该方法操作简便、结果准确可靠，可替代微量凯氏定氮法。

质谱与蛋白质组学蛋白质组学对一个细胞或组织所表达的蛋白质进行的系统分析，而质谱是它的关键性分析工具。在过去的两年中，标准蛋白质组技术中的进展增进了更高水平自动化和敏感性的蛋白质识别技术。另外，新的技术促成了鉴定蛋白质功能相关特性的里程碑性的进展，包括它们的定量和在蛋白质复合物中复杂情况。缩写2DE two-dimensional gel electrophoresis双向凝胶电泳CID collision-induced dissociation碰撞诱导的解离ESI electrospray ionization电喷雾离子化FT-ICR Fourier-transform ion cyclotron resonance傅里叶-变换离子回旋加速器共振ICAT isotope-coded affinity tagsIEF isoelectric focusing等电聚焦MALDI matrix-assisted laser desorption ionization基质辅助的激光解析离子化Q-TOF quadrupole-TOFRP reversed phase反向TOF time-of-flight飞行时间简介蛋白质组学的核心组成是系统识别一个细胞或组织中表达的每一个蛋白质，以及确定每个蛋白质的突出特征(比如，丰度、修饰状态以及在多蛋白质复合体中的复杂状态)。这些分析的技术包括分离蛋白质和肽的分离科学、识别和定量分析物的分析科学和数据管理和分析的生物信息学。它的初步工具包括使用IEF(等电点聚焦)/SDS-PAGE凝胶的高分辨率的双向凝胶电泳(2DE)，结合质谱和数据库搜索来分离、识别和定量在一个复合样本中存在的个体蛋白质，最终识别被分离的蛋白质。一个常用的方法用在Fig1中用图解说明。此技术以及由此而来的变化(综述见[1])已经被用来识别和分类在复杂样本中存在的大量蛋白质，并在蛋白质组数据库中呈现它们，该过程我们这里称之为"描述蛋白质组学"比如，Shevchenko等[2]从2D凝胶上系统地鉴定了150个蛋白质。数目庞大的这样的数据库现在可以找到。同样的技术现在已经被作为普遍的发现工具来动态检测一个细胞或组织对外来或内部干扰反应而在蛋白质组中的改变。因为检测动态改变需要精确定量每个被检测成分，我们使用"定量蛋白质组学"来定义。在此报告中，我们总结了自1999年1月至2000年4月来报道的与蛋白质组学和质谱相关的最重要的进展。在核心质谱技术中的进展已经导致2DE为基础的蛋白质组学技术的进一步改进。它们同时又促进了传统凝胶为基础的方法的替代方法，诸如引入以同位素稀释理论为基础的精确蛋白质定量技术和蛋白质复合物的系统分析。蛋白质组分析的MS技术进展在此部分，我们总结了在MS设备、它们的控制和操作中的进展，以及比较质谱数据和序列数据库识别蛋白质所用的搜索工具的进展。随着新型质谱仪的引入，蛋白质组学研究现存类型的质谱仪性能已经显著改进了。在此综述期间最普遍使用的仪器是可以分为两类：单一阶段的质谱仪和串联质谱为基础的系统。单一阶段的质谱仪，最显著的是基质辅助的激光解吸电离(MALDI)飞行时间(TOF)仪器，被用于无数通过肽质谱图谱技术大规模蛋白质识别的项目中。此方法在鉴别表达自小一些的和完全测序的基因组的蛋白质特别成功[3,4]。串联质谱仪器诸如triple quadrpole、离子捕获(ion-trap)和近来引进的混合quadrupole飞行时间(Q-TOF)被常规应用于[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS或用电喷雾电离(ESI)来生成肽片段离子谱，以便通过搜寻序列数据库进行蛋白质鉴定。使用仪器控制程序来自动选择肽离子进行碰撞诱导的解离(CID)(数据依赖CID)的不断增多是这些MS/MS仪器的一个明显的趋势。一些新的构造的具有高潜能的质谱仪被引入到蛋白质组学研究中产生深刻影响。两个研究组近来一个MALDI离子源和一个混合Q-TOF耦联了起来[5,6]。Q-TOF提供的质量准确性和敏感性提升了数据库搜寻结果并同时使它成为MS/MS从头测序的当然仪器选择。MALDI Q-TOF构造提供了激动人心的机会进行自动化和高通量应用以及在一个样品盘上存档样品进行日后研究的可能。Medzihradszky等[7]描述了一个不同的混合仪器称之为MALDI TOF TOF。此设备享有许多MALDI Q-TOF的优点，另外能够进行高能量CID和非常快速的扫描速率。傅里叶-变换离子回旋加速器共振(FT-ICR)质谱对于蛋白质组学来说相对陌生。这些设备具有非常高的敏感性和分辨率，质量精确性可以达到1ppm。这些特征被用来在一次分析中测量和定量几百种蛋白质的完整的分子质量[8]。Goodlett等[9]表明FT-MS测量的一个肽的准确质量以及可以容易获得的限制因素能够通过序列数据库搜索被用来识别蛋白质。蛋白质组学如果没有软件工具来进行质谱数据和序列数据库的关联将变得几无可能。现存的数据库搜索程序已经变得越来越成熟和可以(从网络)可获得。另外，引入了新的算法。主要相关程序是Sequest[10]，MASCOT[11]，PeptedeSearch[12]，PROWL[13]和Protein Prospector[14]。在它们中间，Sequest使用CID谱设置了蛋白质识别的实验室标准(benchmark)，因为它与边界MS/MS数据工作得最好，并高度可信，可以从整个[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS实验中自动分析数据，并不需要任何使用者的破译工作。在所提的程序中，然而，只有Sequest不能在网络上搜索。MASCOT是一个新的、快速、网络可进入和多功能的程序，具有进行肽指纹分析、用部分破译或未破译的CID谱进行数据库搜索的功能。

第一次做红外，想用ATR红外做蛋白质二级结构的定量测定，但是ATR红外的样品应该要是膜状的吧，那蛋白质干粉的话要怎么制样呢？

一些蛋白质的分子量与Stokes半径：蛋白质 分子量（kD）Stokes半径（nm）乳清蛋白 12.4 2.01核糖核酸酶 13.7 1.92肌红蛋白 17.0 2.00大豆胰蛋白酶抑制剂 21.5 2.26碳酸酐酶 31.0 2.35辣根过氧化物歧化酶 40 3.00卵清蛋白 45 2.80血红蛋白（人）64.5 3.08牛血清白蛋白 70 3.65酵母醇脱氢酶 150 4.55血浆铜蓝蛋白 151 4.73谷氨酸脱氢酶 258 6.00甲状腺球蛋白 670 8.25芜菁花叶病毒 3500 ~12.0