超高效液相色谱质谱联用仪

[b]超高效液相色谱[/b][i]高效液相色谱方法及应用（第二版）作者:于世林[/i]由以上讨论中，可知在HPLC分析中，使用粒度dp为5～10μm固定相，色谱柱长10～25cm, Δp为3～10MPa，就可获得n≥3000的柱效，使用大多数有机溶剂或水作流动相，可在2～30min内，实现大多数不同组成样品的分析要求。上述结论是在20世纪80年代末期获得的，90年代后，液相色谱使用了粒度dp＝3.5μm的固定相，2000年很道了使用dp＝2.5μm的固定相，由于高压愉液泵提供压力的限制，实现了仅用色谱柱长为3～5cm的快速分析。直至2004年美国Waters公司在匹茨堡会议上展出了最新研制的ACQUITY超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatographay，UPLC)，它使用dp仅为1.7μm的新型固定相，色谱仪提供的Δp达140MPa（2000psi），可使在常规高效液相色谱需要30min时间的样品分析在超高效液相色谱短短为仅需5min，.并呈现出色谱柱柱效达20万块/m理论塔板数的超高柱效。 UPLC保持了HPLC的基本原理，全面提升了液相色谱的分离效能，不仅提高了分辨率，也使检侧灵敏度和分析速度大大提高、使液相色谱更高水平上实现了突破。因此，必将大大拓宽液相色谱的应用范围，井大大加强了UPLC在分离科学中的重要地位。一、超高效液相色谱的理论基础在高效液相色谱的速率理论中，范第姆特方程的简化表达式（7-23）：[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2006/11/200611251040_33593_1613333_3.jpg[/img]如果仅考虑固定相的粒度dp对H的影响，其简化方程式可表达为[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2006/11/200611251042_33595_1613333_3.jpg[/img]

[align=left]超高效液相色谱–四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪（UPLC-Q/Orbitrap HRMS），在药物分析、代谢组学、脂质组学、安全风险物质筛查、环境分析等领域具有分辨率高、灵敏度高、准确性好的优势，在生物医药、食品安全、生命科学、环境健康、法医毒物、残留分析、产品检验等领域应用广泛。[/align][align=left][/align]

[b]摘要:[/b]建立了快速、准确、灵敏的蔬菜中仲丁胺的超高效液相色谱串联三重四极杆质谱(UP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS)检测方法，仲丁胺使用甲醇水溶液（8+2）提取，调节pH后，经丹磺酰氯衍生，使用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LCMS[/color][/url]MS测定，串联质谱 ESI 正模式电离，多反应监测(MRM)模式检测，以保留时间和子离子比定性，外标法定量。在5~100μg/L范围内线性关系良好，相关系数均大于 0.999,方法检出限 ( S /N ＞ 3)为 2.0 μg/kg ，加标水平为 10～100μg/kg时(n = 6)，平均回收率为 84%～95%。方法准确、灵敏，适用于蔬菜中仲丁胺残留量的测定。[b]前言仲丁胺(2-aminobutane，2-AB)，是一种保护性杀菌剂 , 对多种真菌有抗菌活性, 广泛用作蒜薹、青椒、柑桔、葡萄等蔬菜与水果贮运输、贮藏过程[sup][/sup]，虽然至今国内外尚未发现因2-AB而导致的癌变、突变、畸形的报道[sup][/sup]，但美国已把其对人体健康的危害等级定为三级，并对其使用范围和允许残留量做了规定。日本于2006年5月29日起正式实施《食品中残留农业化学品肯定列表制度》，其中也对仲丁胺进行做出了最大残留限量要求[sup][/sup]。《食品添加剂使用标准》对蔬菜和水果的最大残留限量作出规定。由于 2-AB 分子量小(73.14)，结构上没有生色基团用于最终检测。国内外报道的果蔬仲丁胺残留检测的方法主要有分光光度法[sup][/sup]、[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url]法[sup][/sup]、薄层扫描、荧光胺衍生-液相色谱法及其他液相色谱方法等。现行的检测标准方法操作困难，柱前衍生剂2,4 二硝基氟苯的毒性较大,不易获得，且价格昂贵[sup][/sup]，方法的检出限不高，仅为 0.67 mg/kg。本文利用仲丁胺在pH=9碳酸盐体系下与丹磺酰氯发生衍生反应[sup][/sup]，用高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液相色谱质谱联用仪[/color][/url]进行检测[sup][/sup]，具有操作简单、快速、灵敏、准确的特点，能满足水果中仲丁胺保鲜剂检测的要求[sup][/sup]。1 实验部分1.1 仪器与试剂1290 infinity II超高效液相色谱仪；6460 Triple Quad LC/MS(美国Agilent) SHA-C往复式水浴恒温振荡器（金坛科析）；XW-80A漩涡混合器(上海沪西)；离心机（湘仪）。仲丁胺（含量99.0%，德国，Dr）；甲醇和丙酮（HPLC 级，德国 Merck 公司）；甲酸(HPLC 级，CNW 公司)；丹磺酰氯（色谱纯，CNW）；滤膜（PTFE Hydrophilic 0.22μm）；一级水(蒸馏水)；碳酸钠（优级纯，上海国药），盐酸（优级纯，上海国药）。1.2 标准工作液及其他溶液的配制[/b]1.2.1准确称取仲丁胺标准品10mg左右，用甲醇-水（8+2）定容10ml，配置1000mg/L的标准储备液，放置冷藏冰箱储存；1.2.2丹酰氯丙酮溶液（50g/L）：称取5g丹酰氯用丙酮定容至100mL；1.2.3盐酸溶液（1mol/L）:吸取9ml分析纯盐酸，用水稀释并定容至100ml；1.2.4碳酸盐缓冲溶液:称取 8.45g无水碳酸钠，加440ml水溶解，称取9.41g碳酸氢钠加入560mL水溶解，将两种溶液混合。[b]1.3 样品前处理1.3.1采样和试样制备[/b]抽取有代表性的样品, 用四分法缩减取200 g, 粉碎后, 混匀, 装入自封袋中, 冷藏避光, 备用。[b]1.3.2提取[/b]称取10g(±0.01g)样品于50mL离心管中,加入15mL 甲醇水溶液（8+2）并超声15min，然后定容至20mL,于4000r/min下离心5min。[b]1.3.3衍生[/b]移取5mL上清液于新50mL离心管中，加入2mL pH=9.0的碳酸盐缓冲溶液，再加入1.5mL 50g/L丹酰氯丙酮溶液，在40℃下水浴振荡2h,冷却后用甲醇定容至10mL,于4000r/min下离心5min，吸取1mL过0.22μm滤膜，待上机分析。[b]1.3.4标准品衍生[/b]准确移取1mL 100mg/L的仲丁胺于50mL离心管内，加入1mL甲醇水溶液（8+2）和2mL pH=9.0的碳酸盐缓冲溶液，加入1.5mL 50g/L丹酰氯丙酮溶液，在40℃下水浴振荡2h,冷却后用甲醇定容至10mL,于4000r/min下离心5min，过滤膜即为10mg/L工作液。[b]1.4液相色谱-串联质谱条件1.4.1液相色谱条件[/b]色谱柱: Agilent EclipsePlus C18 RRHD 1.8μm 2.1*100mm；流动相: A 为0.1%甲酸水，B 为甲醇，梯度洗脱程序：0.0～1.0 min,50%B 1.0～3.0 min,50%～95% B 3.0～ 4. 0 min,95%～ 95% B 4.1～6.0 min,95%～50% B 流速: 0. 40 mL /min 柱温: 40℃ 进样量:2 μL，外标法定量。[b]1.4.2质谱条件[/b]ESI 正模式 离子源温度 350 ℃ 雾化气流速：10L/min 喷嘴压力：45psi 去溶剂气温度 375 ℃ 流速 11 L /min 检测模式: 多反应监测(MRM)模式 化合物的监测离子对(m /z)、丰度比及其它优化的质谱参数(锥孔电压、碰撞能等)见表 1,每个离子对的驻留时间均为 0. 1 s。[b]2 结果与讨论2.1 质谱条件的优化丹磺酰氯是强[url=http://baike.baidu.com/item/%E8%8D%A7%E5%85%89%E5%89%82/6185591][color=windowtext]荧光剂[/color][/url]，能专一地与链N-端α-氨基反应，所以仲丁胺的仲胺将丹磺酰氯的Cl[sup]-[/sup]取代，除去HCl（分子量36.5），得到新化合物N-仲丁基一丹磺酰胺（分子量306.3），使用两通连接液相色谱与质谱, 首先在正离子模式下进行全扫描, 确定化合物的分子离子, 将分子离子作为母离子, 给予一定的碰撞能量和碰撞气体, 全扫描二级离子, 选取丰度较强、干扰较小的两个子离子分别作为定性及定量离子, 并优化母离子电压和碰撞电压[sup][[b]15[/b]][/sup], 仲丁胺衍生物质谱参数优化结果见表1表 1 仲丁胺衍生物的质谱分析条件 [/b][table=444][tr][td]中文名称[/td][td]母离子 [/td][td]子离子 [/td][td]碰撞电压 [/td][td]碰撞能[/td][td]加速电压[/td][/tr][tr][td=1,3]仲丁胺衍物[/td][td=1,3]307.2[/td][td]157[sup]*[/sup][/td][td]135[/td][td]25[/td][td]4[/td][/tr][tr][td]128[/td][td]135[/td][td]70[/td][td]4[/td][/tr][tr][td]115[/td][td]135[/td][td]70[/td][td]4[/td][/tr][/table][align=left][b]2.2 色谱条件的选择[/b]试验中考察了 0.1%甲酸水-甲醇、0.1%甲酸水-乙腈、0.1%甲酸-5mmol/L乙酸铵水-甲醇3 种流动相体系对分析效果的影响，结果表明，采用0.1% 甲酸水-甲醇作为流动相时目标化合物的离子化效率高，峰型好，灵敏度高目标物标准溶液(50 μg /L)的总离子流图(TIC)和提取[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/3p][color=#3333ff]离子色谱[/color][/url]图见图 1。[/align][align=center][img=,249,106]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708011647_01_3081717_3.png[/img][/align][align=left][/align][align=left][b]2.3 前处理条件的确定2.3.1 提取条件优化[/b]仲丁胺是有机碱，易溶于水，能与乙醇、乙醚、甲醇等多种有机溶剂混溶，还能与酸形成易溶于水的盐，它的化学性质稳定。因丹磺酰氯与2-A B 的反应在含水的碱性有机溶剂中进行，试验中考察了用水、及水与乙腈、丙酮、甲醇混合作为提取溶剂，用丙酮水时提取溶液颜色很深，纯水提取后离心效果很差，乙腈水和甲醇水提取颜色差不多，但体系流动相为甲醇，为消除容积效应及提取溶液的离心后的溶液状态，最后选择本试验选用甲醇+水=8+2，水作为提取溶剂，离心后定量取样，这样可大大减少干扰。[b]2.3.2 衍生条件优化2.3.2.1 衍生化试剂量[/b]为了能够充分衍生化，添加不同量的衍生化试剂，[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LCMS[/color][/url]MS 分析，以1.0mg/L为基准，添加50g/L丹酰氯丙酮溶液0.5，1.0，1.5和 2.0 mL 的衍生化试剂。可以看出，衍生化试剂为1.5 mL 时仲丁胺衍生物的响应面积最大。[/align][align=left][b]2.3 前处理条件的确定2.3.1 提取条件优化[/b]仲丁胺是有机碱，易溶于水，能与乙醇、乙醚、甲醇等多种有机溶剂混溶，还能与酸形成易溶于水的盐，它的化学性质稳定。因丹磺酰氯与2-A B 的反应在含水的碱性有机溶剂中进行，试验中考察了用水、及水与乙腈、丙酮、甲醇混合作为提取溶剂，用丙酮水时提取溶液颜色很深，纯水提取后离心效果很差，乙腈水和甲醇水提取颜色差不多，但体系流动相为甲醇，为消除容积效应及提取溶液的离心后的溶液状态，最后选择本试验选用甲醇+水=8+2，水作为提取溶剂，离心后定量取样，这样可大大减少干扰。[b]2.3.2 衍生条件优化2.3.2.1 衍生化试剂量[/b]为了能够充分衍生化，添加不同量的衍生化试剂，[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LCMS[/color][/url]MS 分析，以1.0mg/L为基准，添加50g/L丹酰氯丙酮溶液0.5，1.0，1.5和 2.0 mL 的衍生化试剂。可以看出，衍生化试剂为1.5 mL 时仲丁胺衍生物的响应面积最大。[b]2.3 前处理条件的确定2.3.1 提取条件优化[/b]仲丁胺是有机碱，易溶于水，能与乙醇、乙醚、甲醇等多种有机溶剂混溶，还能与酸形成易溶于水的盐，它的化学性质稳定。因丹磺酰氯与2-A B 的反应在含水的碱性有机溶剂中进行，试验中考察了用水、及水与乙腈、丙酮、甲醇混合作为提取溶剂，用丙酮水时提取溶液颜色很深，纯水提取后离心效果很差，乙腈水和甲醇水提取颜色差不多，但体系流动相为甲醇，为消除容积效应及提取溶液的离心后的溶液状态，最后选择本试验选用甲醇+水=8+2，水作为提取溶剂，离心后定量取样，这样可大大减少干扰。[b]2.3.2 衍生条件优化2.3.2.1 衍生化试剂量[/b]为了能够充分衍生化，添加不同量的衍生化试剂，[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LCMS[/color][/url]MS 分析，以1.0mg/L为基准，添加50g/L丹酰氯丙酮溶液0.5，1.0，1.5和 2.0 mL 的衍生化试剂。可以看出，衍生化试剂为1.5 mL 时仲丁胺衍生物的响应面积最大。[/align][align=left][b]2.3.2.2衍生温度和时间优化[/b]在其他条件相同的情况下，分别选取了30℃，40℃，50℃和60℃进行衍生试验，并对50℃样品进行1h，1.5h，2h和2.5h监测。可以看出，衍生化温度在40℃和50℃时相当，就能源考虑选40℃；衍生化反应时间在2h时仲丁胺衍生物的响应面积最大。[b]2.3.2.3.缓冲溶液PH[/b]在其他条件相同的情况下，分别选取了缓冲液PH8.6，PH9.0，PH9.4和PH9.8进行衍生试验，缓冲溶液PH9.0 时仲丁胺衍生物的响应面积最大。综上，衍生化试剂为1.5mL 、衍生化温度在40℃、衍生化反应时间在2H、缓冲溶液PH9.0 时仲丁胺衍生物的响应面积在各因素中最大，因此选用上述条件进行后续实验。[/align][align=left][b]2.4线性关系、检出限[/b]在该试验条件下配制浓度为1、5、10、50、100μg/L仲丁胺标准溶液衍生进样，记录色谱图，线性方程为[i]Y=8022.82x+37937.19[/i]和相关系数R[sup]2[/sup]=0.999（如图6），由样品前处理回收率和稀释倍数关系，检出限(LOD，S /N＞3)为 2.0μg /kg，定量下限(LOQ， S/N ＞ 10)为 5.0 μg /kg 表明方法较高的灵敏度。[/align][align=center][img=,505,217]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/08/201708011650_01_3081717_3.png[/img][/align][align=left][b]2.5方法的回收率与精密度[/b]选取阴性白菜样品，按本实验方法进行 3个加标水平(LOQ、2LOQ、5LOQ)的回收率和精密度实验，检出限水平加标测定6次，2倍和5倍检出限水平加标各测定3次，计算其回收率和相对标准偏差，目标物的平均回收率为70% ～ 90% ，相对标准偏差均不高于10.0% ，表明方法的准确度和精密度良好[sup][/sup]。[/align][align=left]3. 结 论本实验建立了超高效液相色谱串联三重四极杆质谱(UP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS)测定蔬菜水果中仲丁胺的方法，以甲醇-水=（8+2）混合体系协同提取，调节pH后，经丹磺酰氯衍生，优化了色谱、质谱和前处理条件，有效提高了检测的灵敏度和准确度；方法具有良好的回收率和精密度，适用于蔬菜中仲丁胺残留量检测。[/align][align=left][/align][align=left][/align]

【作者】 吴永江； 朱炜； 邵青； 程翼宇；【Author】 Wu Yongjiang,Zhu Wei,Shao Qin,Cheng Yiyu~*(College of Pharmaceutical Sciences,Zhejiang University,Hangzhou 310031)【机构】 浙江大学药学院； 浙江大学药学院 杭州310031； 杭州310031；【摘要】 利用高效液相色谱-二极管阵列检测器-质谱联用方法对洛伐他丁及其杂质成分进行分离分析和结构鉴定。实验采用D iamonsil C18(5μm,4.6 mm×250 mm)为分离柱,乙腈-水(含0.1%乙酸)(65∶35)为流动相,分离并检测了洛伐他丁及其杂质;通过与DAD检测器和离子阱质谱联用,获得了它们的紫外光谱和质谱数据;紫外光谱表明除氢化洛伐他丁外其余杂质与洛伐他丁基本结构相同,利用MS和MS2数据确定了杂质的分子量和侧链结构,由此鉴定了其中10个杂质的结构。实验结果表明,高效液相色谱-二极管阵列检测器-质谱联用技术可以快速鉴定洛伐他丁中的杂质化学成分。 http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/07/201207301723_380642_2379123_3.jpg