质谱定位二硫键方法

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，Online Electrochemical Reduction of Both Inter- and Intramolecular Disulfide Bridges in Immunoglobulins1。该文章的通讯作者是来自荷兰伊拉斯姆斯大学医学院的Martijn M. Vanduijn研究员。许多蛋白质中都包含着二硫键，二硫键是指连接不同肽链或同一肽链中两个不同半胱氨酸残基的巯基组成的化学键（-S-S-）。在蛋白质分子中，二硫键起着稳定肽链空间结构的作用。二硫键数目越多，蛋白质分子对抗外界影响的能力就越大。维持二硫键的完整有利于蛋白质的液相色谱分离，但却给后端的质谱分析带来了挑战。常规的方法是在质谱分析前期对蛋白质进行变性、还原、烷基化处理，这些前处理过程可以有效的减少二硫键对后续酶切或二级碎裂（MS/MS）的干扰，但却非常繁琐耗时，除了会产生副反应以外，蛋白样品也可能在前处理过程中发生丢失。一个有效的替代方法是采用电化学还原。一个配备金属电极的流通池，仅需要施加适当电压于电极上，流通池中蛋白分子上的二硫键就可以被还原。目前，这种微型电化学反应池已实现商业化，可在线连接至质谱前端，蛋白样品经电化学还原，离子源活化，二级碎裂后可直接进行基于MS/MS谱图的序列匹配。尽管如此，电化学反应池在设计、电极材料组成、流通池的大小以及施加的电势等方面仍在不断的提高与创新。免疫球蛋白（抗体）包含有多个链间/链内二硫键。Simone Nicolardi等人曾在2014年将电化学反应器与FTICR质谱联用用于单克隆抗体的分析，从MS1谱图中可以明显地观察到单克隆抗体由于链间二硫键还原后生成的重链和轻链。然而，由于还原不完全，导致重链/轻链上的链内二硫键仅部分打开。类似的不完全还原在Kasper D. Rand组中电化学还原与氢氘交换质谱联用中也能观察到。这种不完全还原会影响蛋白中肽链的精准测量（一对二硫键引起2 Da的质量偏差），同时，关闭的二硫键也会干扰其跨度区域的二级碎裂，碎裂产物也较难通过计算软件进行预测或分析。本文介绍了一种改进的在线电化学还原方法可以实现单克隆抗体链间/链内的完全还原。装置如图1所示，蛋白样品注入系统后在1μL/min的流速下进行色谱分离，色谱柱后流出液与19 μL/min的补充液（1%甲酸，50%乙腈）在T型管中混合，随后以20 μL/min的流速经过电化学反应池（电化学反应池固有体积为19 μL），最终还原后的反应液进入质谱进行检测。值得注意的是，补充液中的50%乙腈有利于蛋白变性，而1%甲酸则为还原反应提供氢原子，促进还原反应的进行。图1. 在线电化学反应池耦联质谱装置示意图为了考察整个方法的可行性及普遍适用性，作者利用该装置对一系列的单克隆抗体进行了电化学还原和质谱检测。如图2A为贝伐珠单抗在800 mV还原电势下色谱分离的总离子流图（TIC），图2B为图2A中色谱峰所对应的一级质谱图（MS1）。从MS1可以看出有两组电荷态分布分别对应重链和轻链，说明在800 mV电势下，贝伐珠单抗链间二硫键发生了还原，由于还原发生在色谱分离之后，所以重链和轻链产生了共流出，仅在TIC图中观察到一个色谱峰。相比较柱前还原，这种色谱柱后二硫键还原会导致肽链的共流出，质荷比接近的肽链则会产生重叠的电荷分布进而干扰谱图的解析。但这种方法在分析复杂的蛋白样本具有明显有优势，可以将还原后生成的肽链与蛋白母体相关联，方便溯源。图2C则为贝伐珠单抗在不同电势下的还原情况，随着电势的逐渐增加，MS1去卷积谱图上逐渐观察到部分还原生成的重链、轻链或重轻链组合，当电势达到1000 mV时，几乎所有的链间二硫键都实现了还原。对于链内的二硫键，由于还原产生的质量改变较小（轻链包含两个二硫键，还原后质量增加4.032 Da），且存在未还原、部分还原以及完全还原肽链间的信号干扰，所以不太容易从MS1谱图确认链内二硫键的还原情况。但轻重链朝高电荷态偏移（图2D）间接说明链内二硫键在打开，肽链更加舒展，更容易质子化。图2. 在线还原系统分析贝伐珠单抗：A）贝伐珠单抗总离子流图；B）对应色谱峰的一级质谱图；C）在不同还原电势下的一级质谱图（去卷积）；D）重链在不同还原电势下电荷态的偏移。为了更加准确地评估链内二硫键的还原情况，作者模拟了不同氧化还原态的贝伐珠单抗轻链19+电荷态的同位素分布情况。如图3A，从上到下分别是模拟的完全还原（4 x SH）、部分还原（SS + 2 x SH）以及未还原（2 x SS）同位素分布。将实验测得同位素分布与模拟的同位素分布进行比对，计算每种氧化还原形式对总信号的贡献占比（图3B）。经过比对发现在1000 mV的电化学还原下是可以实现链内二硫键的完全还原的。因此，最终电化学还原设置为1000 mV。链内二硫键的完全还原可以极大的提高肽链的碎裂效率，获得更加丰富的MS/MS数据用于序列匹配。如图4所示，贝伐珠单抗以及西妥昔单抗的轻链19+电荷态被分离并碎裂。可以看到当施加1000 mV还原电势在质谱分析的前端时，轻链的二级碎片明显增加，特别是横跨链内二硫键的区域（图4，黄色阴影）。此外，在质量匹配的过程中也可以观察到二硫键处于还原状态，考虑还原氢引起的质量增加可以实现更多二级碎片的匹配。图3. A）不同氧化还原态的贝伐珠单抗轻链19+电荷态的同位素分布模拟；B）不同实验条件下的二硫键还原情况图4. MS/MS数据评估链内二硫键的还原情况总之，本文开发了一种在线电化学还原方法能够实现免疫球蛋白链间/链内二硫键的完全还原。该方法能够简化蛋白样品的前处理过程，方便后续的质谱测定。与之前的电化学反应器相比，该系统能实现链内二硫键还原的主要原因可能有以下几点：1、电化学流通池所用的表面材料，之前是全钛的设计，现在是表面镀铂。2、之前是三电极配置（工作电极，参比电极，辅助电极），而现在的设计减少至两个电极，驱动还原的电势适用于这种调整后电极配置。3、补充液的条件（50%乙腈和1%甲酸）对还原有利。此外，该电化学系统仍有需要改进的地方，例如：电化学反应池的体积过大、还原电势过高会影响质谱检测的信噪比等。该方法具有广阔的应用前景，无论是在蛋白质组学还是在结构质谱分析中。撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：Online Electrochemical Reduction of Both Inter- and Intramolecular Disulfide Bridges in Immunoglobulins参考文献1.Vanduijn MM, Brouwer HJ, Sanz de la Torre P, Chervet JP, Luider TM. Online Electrochemical Reduction of Both Inter- and Intramolecular Disulfide Bridges in Immunoglobulins. Anal Chem. 2022, 94(7): 3120-3125. 2.Nicolardi S, Deelder AM, Palmblad M, van der Burgt YE. Structural analysis of an intact monoclonal antibody by online electrochemical reduction of disulfide bonds and Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal Chem. 2014, 86(11): 5376-5382.3.Trabjerg E, Jakobsen RU, Mysling S, Christensen S, Jørgensen TJ, Rand KD. Conformational analysis of large and highly disulfide-stabilized proteins by integrating online electrochemical reduction into an optimized H/D exchange mass spectrometry workflow. Anal Chem. 2015, 87(17): 8880-8888.

仪器信息网讯，2009年11月7日，由中国质谱学会有机质谱专业委员会与中国分析测试协会联合举办的“2009年中国有机质谱年会”在北京成功召开，会议为期三天，出席会议人数达300人。仪器信息网作为特邀媒体也应邀参加。　　此次质谱年会为与会代表准备了丰富的报告内容，内容涉及生命科学、医学、药学、环境科学、食品安全、毒物分析中的质谱应用研究以及质谱仪器研发的新技术、新进展等。仪器信息网将进行系列报道。　　中科院长春应化所的刘淑莹研究员选取了含有二硫键的蛋白质和多肽为研究对象，详细研究了其测定分析的问题。二硫键是一种常见的蛋白质翻译后的修饰，文献报道的研究方法有：NMR、部分还原与烷基化、Edman降解与MS相结合(FAB、ESI-MS、MALDI-MS)，但是NMR方法需要相当多的被拆分物，部分还原与烷基化需要耗费相当长的时间，因此课题组选择Edman降解与MS相结合中的MALDI-MS方法进行研究。中科院长春应化所的刘淑莹研究员　　课题组利用MALDI-MS研究了胰岛素、β2-微球和溶菌酶的二硫键断裂，发现MALDI线性和反射模式下均观察到了二硫键的快速裂解，并且这些裂解碎片是在气相中产生的，而不是来源于样品制备时在液相中的分解。在上述研究的基础上，课题组建立含有二硫键蛋白/多肽的新方法——还原后巯基与特定基质加成反应。实验中发现了样品与某些基质发生了加合反应，并进一步研究了基质、pH等对加合反应的影响，确定了其反应的机理，最后用于实际样品的研究。　　最后，刘淑莹研究员与大家相约长春，邀请大家参加明年在长春举办的第三届世界华人质谱大会。

大家好，本周为大家分享一篇文章，Added Value of Internal Fragments for Top-Down Mass Spectrometry of Intact Monoclonal Antibodies and Antibody−Drug Conjugates [1]，文章的通讯作者是加州大学洛杉矶分校化学与生物化学系的Joseph A. Loo教授。　　抗体-药物偶联物(Antibody - drug conjugates, ADC)是一种很有前景的治疗药物，它通过linker为抗体提供高效的细胞毒性有效载荷，以提高其抗肿瘤功效。将linker和有效载荷偶联到抗体上，给ADC带来了额外的异质性，增加了对其全面表征的挑战。自上而下的质谱(TD-MS)技术近年来在单克隆抗体的表征中得到了广泛的应用，与自下而上质谱(BU-MS)和中下质谱(MD-MS)相比，TD-MS具有最简单的样品制备流程和保留单克隆抗体内源性修饰的优势。然而，对于抗体大小的蛋白质和具有显著二硫键组成的蛋白质，TD-MS的断裂效率较低，获得的序列和药物偶联位点信息有限。　　为了增加TD-MS的序列信息含量，一种策略是将不包含蛋白质序列N端和C端的内部片段纳入数据分析工作流程中，这种方法已被证明有助于二硫化完整蛋白的TD-MS表征。在这篇文章中，作者发现在TD-MS中分配内部片段将mAb序列覆盖率提高到75%以上，并允许确定链内二硫键连接和各种N-糖基化类型。对于治疗性非特异性赖氨酸连接ADC，几乎60%的假定药物偶联位点被识别。　　内部片段可以在不破坏二硫键的情况下进入结构紧密、碎片化效率高度受限的区域，因此有可能大大增强完整单克隆抗体的序列信息。作者对完整的NIST单抗的5个最丰富的电荷态采用了ECD和HCD两种碎片化方法，并将每个电荷态的两种碎片化方法的TD-MS结果结合分析。内部片段的纳入提高了二硫键约束区域的序列覆盖，例如，轻链Cys133和Cys193之间的二硫约束序列几乎完全由内部片段覆盖(图2A)，重链的Cys147-Cys203和Cys264-Cys324序列区也是如此(图2B)，而这些区域是末端片段难以触及的。CDR的覆盖率从53%增加到60%，这表明纳入内部片段可以更深入地了解这一关键区域。总体来说，轻链的序列覆盖率从54%提高到83%，重链从28%提高到72%，合并后整个NIST单抗的序列覆盖率从36%增加到76%(图1)。重链比轻链的覆盖率提高更为显著，这表明随着蛋白质分子量增大，分配内部片段变得更有价值。　　图1. 考虑(A)轻链、(B)重链和(C)全单抗内部片段前后不同序列区域的序列覆盖率，包括非二硫约束序列(Free)、二硫约束序列(SS-constrained)、全序列(Full)和CDR序列(CDR)　　图2. (A)轻链和(B)重链的NIST mAb序列覆盖图谱。蛋白质骨架上的蓝色、红色和绿色切割分别代表b/y、c/z和by/cz片段。序列上方的实线表示末端片段序列覆盖率，序列下方的实线表示内部片段序列覆盖率。紫色虚线表示链内二硫键，浅灰色表示受二硫键约束的序列区域，橙色表示互补决定区域(cdr)。　　HCD能够在不破坏二硫键的同时仅碎裂蛋白质主干，因此作者在完整的NIST单抗上应用HCD来生成含有完整二硫键的片段，以确定二硫键连接。在每个形成链内二硫键的半胱氨酸上应用-1H的修饰，以表明它们的完整性。对于轻链，52个末端片段和12个内部片段穿过S - S键I, 17个末端片段穿过S - S键II, 6个末端片段穿过两个二硫键，清楚地显示了这两个二硫键的连接模式(图3A)。靠近重链两端的两个二硫键，S - S键I和S - S键IV，被89个末端片段和9个内部片段穿过 而中间的两个二硫键，S−S键II和S−S键III，只有24个内部片段穿过，没有末端片段穿过(图3B,C)。这些结果证明了NIST单抗重链的链内S - S连通性，重要的是，中间的两个S - S键模式只能由内部片段确定。除了确定链内S - S连通性外，分配内部片段也有助于鉴定N糖基化。当纳入内部片段时，额外分配了25个含有G0F的片段，42个含有G1F的片段和34个含有G2F的片段，这表明分析内部片段对N-糖基化鉴定的能力。　　图3. (A)轻链、(B)重链、(C)仅含完整NIST单抗内部片段的重链，在每个形成链内二硫键的半胱氨酸上施加一个氢损失后，通过HCD TD-MS生成片段位置图。　　内部片段可以确定赖氨酸连接ADC的药物偶联位点。作者采用了类似的方法，将ECD和HCD应用于先前已充分表征的非特异性赖氨酸连接ADC。ADC的TDMS在轻链上仅产生8个与DM1结合的末端片段(图4A)。分配内部片段显著提高了DM1偶联位点的测定。ADC的TD-MS在轻链上产生61个1- dm1结合和15个2 - dm1结合的内部片段，定位了3个偶联位点(K106, K114, K133)，并将鉴定的两个偶联位点缩小到4个赖氨酸残基(K153, K160, K170, K175)(图4A)。对于重链也观察到类似的结果。综上所述，对于完整的ADC，仅用末端片段确认了16个偶联位点，而在包含内部片段后，这一数字增加到52个，覆盖了约58%的抗体所有假定的偶联位点。　　图4. 由ECD和HCD TDMS生成的完整IgG1-DM1 ADC (A)轻链和(B)重链片段位置图。黑色垂直虚线表示赖氨酸的位置。　　在这项工作中，作者首次报道了在完整的NIST单抗和异质赖氨酸连接ADC的TD-MS表征中分析内部片段的好处。内部片段的包含末端片段难以达到的二硫键约束区域，显著增加了完整单克隆抗体的序列覆盖率。重要的PTM信息，包括二硫键模式和N糖基化，可以通过包含内部片段获得。最重要的是，内部片段可以帮助确定高度异质赖氨酸连接ADC的药物偶联位点。　　撰稿：夏淑君　　编辑：李惠琳　　文章引用：Added Value of Internal Fragments for Top-Down Mass Spectrometry of Intact Monoclonal Antibodies and Antibody-Drug Conjugates

p　　单克隆抗体的生产方式赋予了它们复杂且具有异质性的分子特点。通常需要借助多种正交分析技术才能全面表征各种变体。 在本应用纪要中，我们使用质谱这种强大的工具对阿达木单抗进行了表征。/pp　　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "简介/span/strong/pp　　Humira® (阿达木单抗)是一种FDA和EMA批准的抗TNFα抗体，被用于治疗多种炎症性疾病，包括类风 湿性关节炎、幼年特发性关节炎、银屑病关节炎、银屑病和克罗恩病。它是2014年销量最高的单克隆抗体产品，全球销售额超过130亿美元。/pp　　阿达木单抗是由CHO细胞表达的完全人重组抗体。 和所有通过重组DNA技术制备的蛋白质一样，其最终产品是不同变体的混合物。我们必须全面表征产品的异质性，因为这会影响其安全性和功效。/pp　　质谱是目前被广泛使用的生物药物表征技术之一。得益于硬件和软件的创新，该技术现已得到常规应用。在本应用纪要中，我们将使用质谱对Humira® 进行不同水平的表征。/pp　　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "完整阿达木单抗的表征/span/strong/pp　　利用质谱分析单克隆抗体最简单的方式就是测定完整蛋白质的分子量。该检测可提供有关蛋白质鉴定和糖基化谱图的有用信息。/pp　　测定时需要对抗体脱盐，去除制剂缓冲液中的非挥发性盐类。脱盐步骤可使用超滤装置离线完成，但该过程非常耗时。配备反相色谱柱的液相色谱是一种替代方法：盐类在死体积内洗脱并被导入废液，然后用乙腈水溶液梯度将单克隆抗体洗脱到质谱仪的离子源中。/pp　　典型分析条件如表1所示。应当注意，考虑到传质限制，须采用较高的柱温以改善峰形，进而提高MS灵敏度。/pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "表1：阿达木单抗完整质量数测定的分析条件/span/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/83d0cd65-f7b9-4177-b0f7-5ff513e8505b.jpg" title="1_副本.jpg"//pp　　所得电喷雾质谱图为包络迹线，其中包括不同电荷态的蛋白质。使用MaxEnt® 算法进行去卷积处理，得到更容易解析的谱图(见图1)。通过去卷积谱图可轻松确定糖基化谱图。/pp　　在阿达木单抗上观察到的主要糖型为G0F/G0F和G0F/G1F，质量精度通常低于20 ppm。/pp　　如果需要测定不含糖基的蛋白质的分子量，为了简化谱图，可进行去糖基化。通常采用PNGase F酶去糖基化，但反应时间相当长(需要数小时甚至过夜)。为了加快分析速度，我们选用了Rapid PNGase F酶(纽英伦生物技术公司)。在50 ° C下温育10～15 min后， 获得完全去糖基化的抗体。该反应可在大多数制剂缓冲液中直接进行，无需更换缓冲液。对应的质谱图如图2所示。由于质谱图得以简化，我们可轻松观察到其它修饰，例如C端赖氨酸剪裁。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/da262e93-2bdb-4c3b-b5df-dfcf6b1eb709.jpg" title="2_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图1：完整阿达木单抗的电喷雾质谱图(A)和MaxEnt® 去卷积质谱图(B)。/span/ppstrongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "/span/strong/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/175a864c-b84f-4c37-bd2f-de937b179ade.jpg" title="3_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　strong　span style="color: rgb(0, 112, 192) "/span/strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "图2：N-去糖基化阿达木单抗的电喷雾质谱图(A)和MaxEnt® 去卷积质谱图(B)。/span/pp　　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "IdeS酶解后的阿达木单抗亚基分析/span/strong/pp　　尽管完整质量数测定(经过或不经过去糖基化处理)已经能够快速简单地鉴定抗体及确定糖基化分布，高分离度对于色谱分离和质谱测定而言通常也很有价值。/pp　　完整抗体的大小(约150 kDa)限制了分离度。还原二硫键可得到轻链和重链，但在低丰度变体的测定中，重链(约50 kDa)仍然是一个问题。/pp　　IdeS酶(Genovis，商品名FabRICATOR® )是采用质谱法表征单克隆抗体时的重要工具。酶解并还原二硫键之后得到的肽段(见图3)分子量约为25 kDa，因此可采用LC/MS分析，而且色谱分离度和质量精度极佳。 此外，样品制备仅需不到一小时。该方法通常被称为 “自中而上”策略。/pp　　或者，也可使用IdeS和Rapid PNGase F(后者须在还原条件下反应)进行连续酶解，获得去糖基化的肽段。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/b21e335e-8fd8-445a-a855-c340edabcbd1.jpg" title="4_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图3：用IdeS酶解mAb之后还原二硫键/span/pp　　为了大限度提高色谱分离度，我们优化了分析条件。 最关键的参数是色谱柱的性质以及流动相中所用的改性剂。 使用不同色谱柱获得的色谱图如图4所示。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/d4c71121-5a2b-4cc0-b26d-53ba57dfce8f.jpg" title="5_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图4：使用不同HPLC色谱柱分离经IdeS酶解和二硫键还原所得的阿达木单抗肽段的结果比较/span/pp　　由图可观察到明显差异，购自Thermo的MabPac RP色谱柱所得的结果最佳。我们在该色谱柱上测试了两种改性剂： 甲酸(FA)和三氟乙酸(TFA)，以及这两种改性剂的混合物。/pp　　最佳分析条件如表2所示。图5展示了用IdeS酶解阿达木单抗之后，还原或不还原二硫键所得的色谱图。测得分子量的质量精度低于1 Da。得益于良好的色谱分离度，我们还可分离并定量各种变体，例如N端焦谷氨 酸、无糖基化变体或氧化物质。/pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "表2：阿达木单抗亚基分析条件/span/pp style="text-align: center"br//pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/6afe117f-4c86-4523-8404-641d94e12497.jpg" title="无标题_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图5：经IdeS酶解和DTT还原的阿达木单抗样品的LC/MS分析结果/span/pp style="text-align: left "　　该方法还可用于研究抗体氧化。我们使用不同浓度的H2O2 进行了强制氧化研究。在20 ° C下温育45分钟后， 用IdeS酶解样品，然后用DTT还原，最后通过LC/MS 进行分析。所得液相色谱图如图6所示。/pp　　不同峰的质谱鉴定非常简单直接。可明确测得Fc/2和 F(ab’)2 区域的氧化物质浓度增加。/pp　　在稳定性研究中，这种分析方法非常适用于监测单克隆抗体的氧化。亚基水平的分析能够粗略定位氧化位点。更精确的定位可通过肽图分析实现。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/e3b20720-c738-41e3-91c0-9912e87e02a5.jpg" title="6_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　span style="color: rgb(0, 112, 192) "　图6：色谱图随H2O2 浓度增加发生的变化/span/pp　　strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "通过UPLC-UV-MSsupE/sup肽图分析对阿达木单抗进行鉴定和目标纯度分析/span/strong/pp　　肽图分析策略涉及使用特定的蛋白酶(例如胰蛋白酶) 得到小分子肽，再利用LC与UV和/或MS检测联用的方法分析所得的肽混合物。/pp　　随着液相色谱和质谱技术不断进步，采用肽图分析法分析单克隆抗体现在已经能够达到接近100%的序列覆盖率，同时详尽表征翻译后修饰。 如今，人们在常规分析中使用亚2 µ m色谱柱获取高分离度肽图，而借助高分辨率质谱则能够以低于 5 ppm的质量精度实现肽的鉴定。/pp　　除了质量测定以外，还可使用MSE模式记录碎片数据。 在MSE采集模式下，仪器每秒交替采集低能量和高能量谱图，因此几乎可以同时获得分子质量和序列信息 (图7)。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/fbe321ec-3274-4d6b-acb9-2fe1c51b3e85.jpg" title="7_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图7：MSE采集模式的原理。/span/pp　　过去MS检测通常仅用于方法开发，但随着功能强大且经过验证的软件被开发出来，质谱法现在也被应用于常规分析中。/pp　　放大后的阿达木单抗肽图分析基峰离子(BPI)色谱图如图9所示。这些数据使用表3所列的分析条件获得。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/4fac9c35-d14d-446a-89bb-bbf9abfa6226.jpg" title="yaji_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "表3：阿达木单抗肽图分析的分析条件/span/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/d1e374ea-bc16-4db0-a1c8-2da8667c190f.jpg" title="8_副本.jpg"//pp　　使用UNIFI软件解决方案(沃特世)基于分子量对每个峰进行鉴定(质量数容差5 ppm)，进而计算出序列覆盖率 (图8)。 必要时，可使用碎片数据(MSE)确证胰蛋白酶肽的鉴定结果。图10展示了碎片离子谱图的一个示例(MSE-高 能量)。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/b0cc8c39-7298-4968-af6d-87b4ec76d53a.jpg" title="9_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图8：利用UPLC-UV-MSE对阿达木单抗进行肽图分析并采用UNIFI软件解决方案处理数据之后所得的序列覆盖图/span/pp　　肽图分析法还可用于评估单克隆抗体的纯度。完整质量数测定和亚基分析能够提供单克隆抗体纯度的大体情况，肽图分析法则能够进行目标纯度分析。可评估的主要修饰包括：/pp　　■ 脱酰胺化/pp　　■ 氧化/pp　　■ 糖基化/pp　　■ N端焦谷氨酸/pp　　■ C端赖氨酸截断/pp　　即使UPLC肽图的分离度再高，色谱分离度通常也不足以通过UV检测对修饰进行相对定量。因此，我们使用MS数据进行定量分析。该过程可使用UNIFI等软件解决方案完全自动化地完成。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/daf3b1a7-ab1b-4c9c-ac80-08dea0ac6ed9.jpg" title="10_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图9：阿达木单抗的肽图(BPI色谱图)/span/pp　　使用该方法分析阿达木单抗样品，获得了如下结果：/pp　　■ 序列覆盖率：100%(质量数容差10 ppm)。/pp　　■ 使用更苛刻的标准(质量数容差5 ppm， 至少以2b/y碎片离子确证鉴定结果)所得的序列覆盖率仍然非常高(93%)。/pp　　■ 重链上2.9%的N端谷氨酸以焦谷氨酸形式存在。/pp　　■ 大部分重链都不含C端赖氨酸(89%)。/pp　　■ 在轻链的152N上观察到了显著的脱酰胺化。/pp　　■ 观察到的主要糖型为G0F、G1F和G2F，相对强度分别为75%、23%和2%(基于糖肽EEQNSTYR)。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/93a63c98-dd03-4921-a7cf-236379984a3c.jpg" title="11_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图10：阿达木单抗轻链T1肽的高能量MSE谱图(带标注)/span/pp　　利用UPLC与荧光检测和高分辨率质谱检测联用的方法对阿达木单抗进行N-糖分析/pp　　大多数治疗性单克隆抗体都是IgG类抗体，在重链的Fc 区氨基酸297N处有一个糖基化位点(见图11)。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/30b15311-c672-40c6-aa50-920177aaee2e.jpg" title="12_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图11：单克隆抗体中常见的N-糖/span/pp　　糖基化是单克隆抗体的一项关键品质属性，因为Fc区 域的N-糖特征可影响抗体与Fc受体的结合，从而调控 ADCC和ADCP活性。末端半乳糖对于补体依赖性细胞毒性(CDC)也很重要。最后，糖基还会影响治疗性抗体的安全性。/pp　　因此，必须采用灵敏且可重现的方法来表征单克隆抗体的糖基化以及批次间一致性。得益于优异的分离度和重现性，使用亚2 µ m色谱柱分析2-AB标记的N-糖成为了表征单克隆抗体的首选方法。不同游离寡糖的相对定量通常采用荧光检测法。/pp　　该方法的两个缺点是样品制备时间长(通常为2～3天)， 且很难鉴定低丰度游离寡糖。/pp　　我们对方案进行了优化，将样品制备时间缩短为不到一天，并结合高灵敏度MS/MSE和荧光检测建立了自动化MS工作流程。包括数据处理和报告在内的整个流程可在24小时内完成(见图12)。表4汇总了分析条件。/pp　　阿达木单抗的UPLC/FLUO色谱图如图13所示。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/448b85af-dfca-4b58-a3af-3513a8a0c928.jpg" title="13_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图12：N-糖分析工作流程/span/pp　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "表4：阿达木单抗游离N-糖的分析条件/span/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/df32e840-8042-4c12-a9a9-bffa7781485a.jpg" title="Ntang_副本.jpg"//pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/8bd603a8-3e4d-4b31-8107-a23999844b42.jpg" title="15_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图13：阿达木单抗N-糖分析所得的UPLC/FLUO色谱图/span/pp　　鉴定不仅基于游离寡糖的分子量，还基于“葡萄糖单元 ”(GU)校准。大多数情况下，将这两种方法相结合都能准确鉴定N-糖。必要时，可使用MSE模式下采集的碎片数据来确证鉴定结果，或者在两个假定结果之间做出选择。GlycoWorkbench应用程序可用于解析碎片谱图。带标注的MSE谱图示例如图14所示。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/3092e407-ec1b-42c8-b670-c1ca726e5f52.jpg" title="16_副本.jpg"//pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "图14：分析阿达木单抗样品中的2-AB标记G0F游离寡糖所得的高能量MSE谱图(带标注)/span/pp　　检出的主要N-糖(占所有检出N-糖的95%)列于表5中。/pp style="text-align: center "　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "表5：阿达木单抗样品中检出的主要N-糖/span/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/de10208a-c2b3-41e2-91a2-acf08569e5c8.jpg" title="17_副本.jpg"//pp　　有趣的是，使用本应用纪要所列的不同方法测得的要糖型比率非常一致(仅考虑所有方法都能检出的糖型，即G0F、G1F和G2F)，如表6所示。/pp　　表6：使用不同方法获得的阿达木单抗糖型测定结果比较/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/753139b8-e6e8-4a94-9a6e-a0411df6303b.jpg" title="18_副本.jpg"//pp　　strong注：本文引自Quality Assistance的应用文章。/strong/ppbr//p

仪器信息网讯 2014年3月21日，由北京理化分析测试技术学会北京质谱学会(以下简称为北京质谱学会)主办，国家大型科学仪器中心北京质谱中心协办的&ldquo 2014年度北京质谱年会&rdquo 在北京召开，约300名来自科研院所、高校、政府实验室及仪器公司等单位的代表参加了此次会议。会议现场清华大学张新荣主持大会报告环节　　作为北京理化分析测试技术学会主办的系列年会，北京质谱年会每年举办一次。据北京质谱学会理事长再帕尔· 阿不力孜介绍，&ldquo 随着多年的坚持，北京质谱会也逐渐创出了品牌，形成自己的特色。&rdquo 此次质谱年会，主办方特邀请了两位从事医学和材料学研究的院士作报告，从另一个角度看质谱 并且针对与会者多是青年工作者及研究生的特点，安排了学术沙龙及质谱知识技巧培训，尽量地为青年学者提供交流和学习的机会 同时质谱厂家也带来了最新的质谱技术及解决方案。北京质谱学会理事长再帕尔· 阿不力孜致辞　　本次质谱年会的大会报告凸显&ldquo 生命科学&rdquo 主题。军事医学科学院张学敏院士、中国科学院化学所万立骏院士、北京大学刘小云、北京生命科学研究所董梦秋、北京大学医药卫生分析中心王京宇介绍了质谱技术在生命科学方面的应用和创新。军事医学科学院张学敏院士　　张学敏院士介绍了《基于临床信息的肿瘤分子网络研究》，据其介绍，肿瘤的发生、发展的机制已经非常成熟了，但这些研究成果主要在实验室完成，无法反映临床肿瘤发生、发展的复杂性和多样性。肿瘤分子网络研究拟基于临床信息的分子网络研究，将肿瘤生物学关于细胞生长信号调控的研究成果转化成可应用于临床实践的应用成果，旨在解决肿瘤精确分型、预后分析、药物反应性及靶向治疗方面的问题。在此研究中，质谱技术不可或缺。但是也遇到挑战即肿瘤样品的均质性不好，质谱很难准确定量。中国科学院化学所万立骏院士　　万立骏院士介绍了中科院化学所承担的重大科研仪器专项&ldquo 高分辨多功能化学成像系统&rdquo 中的质谱技术。高分辨多功能化学成像系统以高分辨光学成像为基础，结合光谱、质谱、扫描探针显微技术，对样品形貌、化学组成、结构分子间相互作用及其动态变化，进行分子水平的高时空分辨的多参数表征。该项目中涉及的质谱技术包括MALDI-TOF及SIMS。万立骏院士介绍了质谱技术部分需要解决的关键问题等。北京大学刘小云　　刘小云介绍的主题是&ldquo 病原菌与宿主相互作用的蛋白质组学分析&rdquo 。据介绍，低信噪比是胞内细菌蛋白质组学研究的挑战。刘小云课题组，以沙门氏菌为研究对象，运用优化的细菌分离方法研究了胞内沙门氏菌蛋白质组学。北京生命科学研究所董梦秋　　董梦秋介绍了蛋白质二硫键的鉴定。蛋白质二硫键的鉴定至关重要，FDA规定，申请蛋白药物必须将蛋白质的二硫键鉴定清楚。但二硫键鉴定的问题是样品处理呈偏碱性会影响二硫键的鉴定。应对鉴定挑战，董梦秋课题组开发了新的方法，并与中科院计算所贺思敏合作开发了相关软件。北京大学医药卫生分析中心王京宇　　王京宇做了题为&ldquo ICP-MS(OES)在医学领域中的应用&rdquo 的报告。王京宇课题组从2005年开始了生命元素组学研究，研究生命体中无机元素的种类、浓度、分布、比例(同位素)、价态、形态及相应的生物学功能，以及元素组学与其他组学的关系。目前，课题组已经研究了精神分裂症、癌症组织等多元素组学的情况。 AB SCIEX 王祝伟 岛津 崔巍 赛默飞 江峥 安捷伦 吴嘉嘉东西分析 Andrew Flynn Saint　　在新方法及解决方案方面，来自岛津的崔巍介绍了岛津串联质谱快速全面的解决方案 赛默飞的江峥介绍了利用赛默飞高分辨质谱技术提升未知物分析的通量和可靠性 AB SCIEX王祝伟介绍了液质联用技术在假羊肉鉴定应用的实例 安捷伦的吴嘉嘉介绍了GC-QTOF质谱技术在环境暴露研究中的应用展望 东西分析的Andrew Flynn Saint介绍了ICP-Q-TOF的最新应用。现场互动　　在学术沙龙环节，食品、环境与公共安全，医药与生命科学，无机质谱技术及其应用，质谱分析新方法、新技术4个组分别进行讨论，参会者就自己关心的问题进行了充分的交流，与会资深专家更是认真解答，讨论氛围热烈。　　本次会议设小型展示，岛津、赛默飞、AB SCIEX、安捷伦、东西分析、珀金埃尔默、普立泰科等展示了质谱相关新产品及技术。(撰稿：杨娟)

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，Epitope Mapping with Diethylpyrocarbonate Covalent Labeling-Mass Spectrometry，该文章的通讯作者是美国马萨诸塞大学的Richard W. Vachet1。基于单克隆抗体 (mAb) 的疗法之所以成功，是因为抗体与其抗原之间的高特异性和亲和力。表位识别涉及确定 mAb 识别的抗原残基，对于了解结合机制和帮助设计未来的治疗方法至关重要。识别抗原中的结合残基和特异性结合所必需的抗原高阶结构 (HOS) 的特征对于理解结合机制至关重要。在研究完整的抗体-抗原复合物时，质谱 (MS) 已成为一种很有前途的表位定位工具；MS仅需要低样本量，不受分子量的限制，并且比核磁共振或X晶体衍射提供更高的分辨率。目前已经开发了各种用于抗原-抗体相互作用的 MS 工具，其中，共价标记质谱（CL/MS） 已成为一种有前途的补充技术，可以提供残留水平的分辨率并且具有相对较高的通量，通常不会像 HDX-MS 那样遭受标记损失，并且根据试剂的不同，样品制备很简单，不需要专门的设备。焦碳酸二乙酯（DEPC）是一种很有前途的CL试剂，它可以标记许多亲核残基，包括赖氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和 N 端，可以标记平均蛋白质中约 30% 的残基。组氨酸和赖氨酸残基的标记程度与其溶剂可及表面积（SASA）相关，而丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的标记对其微环境敏感，特别是附近疏水残基的存在。此外，DEPC 标记在很大程度上不受毫秒时间尺度上发生的蛋白质动力学的影响。本文为了评估 DEPC-CL/MS 用于研究抗体-抗原相互作用，选择肿瘤坏死因子-α(TNFα)作为模型系统，研究了三种具有不同的表位并在不同程度上稳定TNFα的mAb——阿达木单抗、英夫利昔单抗和戈利木单抗结合TNFα的相互作用。至于具体试剂制备、DEPC-蛋白质反应、蛋白质消化条件、LC-MS 和 MS/MS 参数以及数据分析等详细信息请点击“阅读原文”进一步了解。1、抗体-抗原复合物的 DEPC-CL/MS考虑因素TNFα 是一种含有157个残基的蛋白质，具有35个DEPC可修饰残基。单独标记TNFα 表明其中34个残基可以被修饰，从而提供足够的结构覆盖信息。DEPC-CL/MS 实验通常比较游离蛋白与复合蛋白的标记，以确定结合位点。然而，对于抗体-抗原系统，直接比较游离TNFα与TNFα/mAb复合物较困难，因为抗体增加了过多的可标记残基数量，所以需要含有非结合mAb利妥昔单抗的溶液中的 TNFα 进行对照，从而提供了一种校正由抗体存在而引起的任何标记变化的方法。该对照试验表明，在利妥昔单抗存在时，TNFα中标记的残基较少（34），这表明当存在额外的蛋白质时，某些残基的标记水平降至检测限以下。用利妥昔单抗（即对照）结合TNFα与用另外三种mAb结合TNFα的比较揭示了标记残基的可能发生的三种不同变化（图1）。第一种，有些残留物的标记程度没有显着变化，表明它们的微环境或 DEPC 可及性没有变化。第二种，由于溶剂可及性的增加，引起特别是组氨酸和赖氨酸残基标记的增加；或微环境的变化，引起特别是丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基标记的增加（由于DEPC局部浓度增加，可接近的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基周围的疏⽔性更强的微环境导致这些弱亲核残基反应性更⼴泛）。第三种，由于溶剂暴露的损失或疏⽔性更低的微环境，引起残基标记减少。图1. TNFα与mAb复合后标记程度可能的变化情况。TNFα三聚体以灰色表示；抗体以黄色表示；标记用绿色星号表示，星号的大小与标记程度成正比。分别显示了(A)标记程度没有变化、(B)标记程度增加和(C)标记程度减小的结果。2、与阿达⽊单抗复合的TNFα的DEPC-CL/MS阿达⽊单抗在所研究的mAb中具有最⼤的表位，该表位由TNFα同源三聚体的两个亚基组成（图2A、B）。该表位包含11个可修饰残基，其中8个在对照或存在阿达⽊单抗的情况下被标记。其余三个，His78、His73和Lys65，在利妥昔单抗或阿达⽊单抗条件下均未标记，因为它们埋在TNFα三聚体中。图2. 与阿达木单抗复合的TNFα的结构和DEPC标记结果。(A) 阿达木单抗与TNFα三聚体的复合物，阿达木单抗在三聚体凹槽中与TNFα三聚体的两个单体结合。(B)与TNFα 三聚体复合的阿达木单抗Fab的表面结构表示(PDB ID: 3WD5）。(C)使用和不使用阿达木单抗的TNFα中表位残基的DEPC标记程度。(D)使用和不使用阿达木单抗的TNFα中非表位残基的DEPC标记程度。(E)在阿达木单抗结合后标记减少（蓝色）的表位残基映射到TNFα 三聚体上。阿达木单抗以黄色显示，TNFα三聚体以灰色显示。(F)与阿达木单抗结合后标记增加（红色）的表位残基映射到TNFα三聚体上。在比较利妥昔单抗对照和阿达木单抗时，八个表位残基的标记程度发生了变化（图2C）。八个残基中有五个标记减少，包括Tyr141、Lys112、Lys90、Thr72和Ser71，因为在阿达木单抗结合后被埋藏（图2 E）；其中大多数这些残基的标记是完全被阻止的。剩余三个表位残基（Thr77、Ser81和Ser147）在阿达木单抗结合时被标记，但在对照中它们没有被标记（图2F）。Thr77标记的增加可能是由于阿达木单抗重链上靠近Trp53的疏水性微环境增加所致（图3A）。虽然 Ser81 不与阿达木单抗接触，但它被认为是表位的一部分，因为它靠近与mAb结合的Lys90和Glu135（图3B）。Ser147也被标记，可能是由于结合时更加疏水的环境（图3C）。总体而言，TNFα 表位中所有可修饰残基都会发生 DEPC 标记变化，但表位边缘的Thr和Ser残基实际上会增加标记，这些违反直觉的变化反映了 DEPC 标记对这些弱亲核残基的疏水微环境的独特敏感性。图3.阿达木单抗结合时TNFα残基的代表性结构变化。（A）Thr77的微环境由于其靠近阿达木单抗中的Trp53而增加疏水性。（B）Ser81被表位残基Lys90和Glu135掩埋，但在阿达木单抗结合时部分暴露，导致其DEPC反应性增加。（C）在未结合的TNFα中，Ser147完全暴露于溶剂中，然而在阿达木单抗的存在下，Ser147位于更疏水的微环境中。（D）Ser86的微环境在结合状态（灰色）下变得不那么疏水，因为它与Tyr87的接近度降低。（E）Thr89和Thr105由于靠近阿达木单抗而增加标记。（F）Ser9、Tyr151、Tyr119、Tyr56 和 Ser99 的标记范围都有所增加，这些残基十分靠近三聚体界面。在表位之外，标记了21个残基，其中大部分 (11/21) 的标记程度没有变化，表明它们在SASA或微环境中没有发生显着变化。残基Ser86标记程度降低（图2D），是因为其在阿达木单抗结合后重新定位，周围的疏水口袋很可能发生变化（图3D），导致标记减少。表位外的九个残基增加了标记程度。这些残基中的大多数 (7/9) 是丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸，其 DEPC 反应性对微环境变化非常敏感。其余两个残基 Thr89 和 Thr105 在利妥昔单抗对照中未标记，但在阿达木单抗结合后，它们的微环境变得更加疏水，可能是由于它们与表位非常接近，所以它们的标记程度增加（图3E )。Ser9、Tyr56、Tyr119 和 Tyr151 的标记增加可能是因为它们面向 TNFα 中的三聚体界面（图3F），在阿达木单抗结合时发生的三聚体的稳定化可能会改变这些残基的微环境，从而增加它们的标记程度。其中两个残基Tyr56、Tyr151在利妥昔单抗对照中完全未标记，并在复合物中被标记，使其行为类似于表位边缘的Ser和Thr残基。标记程度增加的另外两个非表位残基是His15和Lys128，然而，阿达木单抗与TNFα三聚体的Fab的晶体结构并未表明His15或Lys128的SASA变大；阿达木单抗/TNFα 在实验浓度下形成的大于3:1的高阶复合物的复杂变化可能可以解释标记的增加。此外，作者还对英夫利昔单抗复合物中TNFα和与戈利木单抗复合的TNFα进行了DEPC-CL/MS分析。综上所述，本实验使用结合TNFα的三种治疗性mAb，证明 DEPC-CL/MS 可以揭示有关表位的准确信息以及远离表位的细微结构变化。为了获得可靠的结果，需要涉及非结合mAb的对照实验来解释由mAb中存在大量可修饰残基引起的额外标记变化。研究结果表明，表位中的组氨酸和赖氨酸残基在标记中显着减少，而在表位内或表位边缘的弱亲核性丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基由于附近疏水微环境的产生而发生标记程度的增加。大多数远离表位的残基在标记程度上不会发生任何显着变化；确实发生变化的残留物主要分为三类：第一类包括不属于表位但与表位非常接近的残基，因此由于部分掩埋而导致标记程度发生变化；第二类，TNFα三聚体界面上的残基会发生标记变化，这些变化反映了抗体结合后三聚体稳定化引起的结构变化；第三类主要包括弱亲核性残基由于抗体结合时发生的 HOS 变化而在微环境中发生标记增加或减少，并反映在这些残基周围产生或多或少的疏水环境，这是 结构变化或形成具有大mAb/TNFα化学计量的复合物的结果。总而言之，DEPC 标记可以提供有关抗体-抗原表位的信息，并且具有很好的表位定位潜力，也可用于快速筛选潜在的治疗性抗体或生物等效性研究。参考文献：1、Tremblay CY, Kirsch ZJ, Vachet RW. Epitope Mapping with Diethylpyrocarbonate Covalent Labeling-Mass Spectrometry. Anal Chem. 2022 Jan 18 94(2):1052-1059.阅读原文：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.1c04038

截至2020年，全球共有76个多肽类药物被批准上市，7000多个活性多肽被发现，约150个多肽药物进入临床试验，在过去20多年中，平均每年被批准的多肽药物约3个。微球、脂质体、聚乙二醇（PEG）修饰等方法的深入应用解决了多肽药物稳定性差、体内易降解、半衰期短等成药性差的问题，促进了多肽药物的开发利用。多肽药物药效广泛，临床上以慢性病治疗为主，例如罕见病、肿瘤、糖尿病、胃肠道、骨科、免疫、心血管疾病等。国内外药典将合成多肽类药物列入化药的范畴进行杂质的控制。欧洲药典规定合成多肽含量在0.5%以上的相关杂质需进行定性分析，对含量在1%以上的相关杂质进行定量分析并考察其毒副作用。2007年国家食品药品监督管理局发布了《合成多肽药物药学研究技术指导原则》，指出合成多肽原料药中工艺杂质的来源和一般化学药物有所不同，其可能的工艺杂质如：缺失肽、断裂肽、去酰胺多肽、氨基酸侧链的不完全脱保护所形成的副产物、氧化肽、二硫键交换的产物、非对映异构的多肽、低聚物和/或聚合物及合成中所用的毒性试剂和溶剂等。 多肽含有二硫键、裸露的氨基和羧基，容易因分子间二硫键或氨基羧基间脱水形成共价聚合物。共价键形成的聚合物杂质可能存在较大免疫原性风险，在多肽类药物制剂质量研究和新药申报中应予以重点关注。质谱分析、氨基酸组成分析和氨基酸序列测定是合成多肽药物及杂质结构确证最常用的技术手段。 岛津解决方案 ● 分析仪器岛津液相系统Nexera LC-40 +高分辨质谱仪LCMS-9030 ● 分析条件流动相为水：乙腈：TFA=60:40:0.2流速：0.5 mL/min等度洗脱柱温：25℃质谱：离子源：ESI（+）扫描范围：m/z 100 ~5000 多肽药物应用案例一STN聚合物杂质结构鉴定图1. 注射用STN破坏样品HPLC色谱图（UV 210 nm）图2. STN聚合物杂质可能的聚合方式 通过STN聚合物杂质精确质量数预测其分子式，结合多肽的质谱峰归属对STN聚合物杂质进行结构推测（如图2）。STN结构中含有一对二硫键，综合判断其聚合位点为分子间二硫键。 多肽药物应用案例二TJN聚合物杂质结构鉴定图3. 注射用TJN破坏样品HPLC色谱图（UV 214 nm） 图4. TJN聚合物杂质MS2质谱图 使用岛津精确分子式预测工具Formula Predictor对TJN聚合物杂质进行分子式预测，其分子式预测结果恰好相当于两分子TJN脱水，因此推测其聚合位点为两分子TJN的氨基端和羧基端缩合生成肽键。TJN为20肽，其游离氨基端为苯丙氨酸，游离羧基端为亮氨酸。结合TJN二聚体的推定氨基酸序列进行二级质谱碎片归属，TJN聚合物MS2质谱图中识别出多种特征碎片。特别是y19和b21碎片的存在证明聚合位点为亮氨酸（L）和苯丙氨酸（F）缩合而成的肽键。 结论随着我国成为国际人用药品注册技术协调会（ICH）成员国，药品的技术标准逐步与国际接轨。同时随着我国药品一致性评价工作的全面开展，合成多肽药物杂质结构鉴定将面临巨大的技术挑战。岛津公司采用尺寸排阻色谱法建立合成多肽药物的聚合物分析方法，并通过高分辨质谱LCMS-9030测定聚合物的准确质量数推测其分子式，同时结合MS/MS特征碎片推测聚合物杂质的结构。本文展示LCMS-9030在多肽药物的两种主要聚合方式（二硫键和肽键）鉴定中的应用。岛津液相色谱四极杆飞行时间串联质谱LCMS-9030具有高质量准确度，高分辨率的性能优势，是合成多肽药物杂质一级结构鉴定的强有力工具。 本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，Ion Mobility-Mass Spectrometry and Collision-Induced Unfolding of Designed Bispecific Antibody Therapeutics1，文章的通讯作者是密歇根大学的Brandon副教授。　　双特异性抗体(bispecific antibodies, bsAbs)是一类重要的新兴疗法，能够同时靶向两种不同的抗原，已被开发作为对某些单克隆抗体疗效有限疾病的治疗手段。尽管bsAbs具有独特的优势，但它的结构较为复杂，需要特殊的制备工艺，“knobs-into-holes”(KiH)是其中一种可以用于制备bsAbs的技术，这种技术通过将knob链CH3结构域表面的特定氨基酸突变为较大氨基酸，将hole链上的突变为较小氨基酸，从而实现“knobs-into-holes”的配对形式，提高不同轻重链在配对时的正确配对率，产生正确的bsAbs。然而，由于抗体治疗药物分子量较大，通常比传统的小分子药物表现出更大的结构复杂性和异质性，对KiH bsAb 高级结构的完整表征对定义bsAb的结构功能关系，以及确保最终治疗的稳定性、有效性和安全性都至关重要。目前已开发的分析方法有很多，但是普遍存在样品消耗量大、数据采集和解析时间较长等缺点。近年来，非变性离子迁移质谱(ion mobility-mass spectrometry, IM-MS)和碰撞诱导去折叠(collision-induced unfolding，CIU)逐渐被证实是用于分析单克隆抗体高级结构的有效方法，能够从存在结构异质性和杂质的几微克样品中表征单抗治疗药物的高级结构。IM可以根据气相蛋白离子的电荷和旋转平均碰撞截面(collision cross sections，CCSs)在毫秒时间尺度上对蛋白进行分离。当与质谱耦合时，可以很容易地将质荷比相同但CCS不同的离子区分开来，而CIU可以使IM-MS同步提供蛋白质结构和构象稳定性信息。CIU根据二硫键、糖基化水平、结构域交换特性等信息来区分差异。　　在这篇文章中，作者描述了定量CIU在bsAbs中的首次应用，扩展了非变性IM-MS和CIU的能力，用于稳定表征KiH bsAb及其亲本knob和hole同型二聚体单抗的高级结构。　　图1 Native、未修饰的knob(蓝色)和hole(橙色)同型二聚体，以及KiH bsAb异型二聚体(绿色)的CIU实验。(A)24+电荷态(左)及其相应重复RMSD基线(右)的平均CIU指纹图谱(n=3)。所有的指纹图谱都显示了白色虚线框所示的三个主要特征。在(B) 5 V、(C) 65 V、(D) 110 V时的标准化TWCCSN2分布。在较低的激活电位下，所有抗体均具有相似的CCS，在较高的加速电位下则存在显著差异。(E)两两的RMSD分析显示，与重复的RMSD基线(虚线)相比，抗体之间的整体高级结构差异。(F)CIU50分析说明了KiH bsAb模型的稳定性如何保持在knob和hole的同型二聚体之间。　　如图1所示，bsAb的稳定性似乎与本文研究的KiH模型的两个亲本同型二聚体单克隆抗体相关。在电压为65V时，KiH bsAb的TWCCSN2分布与亲本knob同型二聚体单抗的分布相似 而在110V时，则与亲本hole同型二聚体单抗的分布相似。并且KiH bsAb的稳定性介于两种亲本同型二聚体单抗的稳定性之间。与指纹图谱中记录的第一次CIU转换相对应的是CIU50-1值，第二次的则是CIU50-2值，从3组样本的数据分析推测，CIU50-1和CIU50-2很可能代表了KiH bsAb和mAb结构中不同结构域的局部稳定性。　　图2 knob和hole的半体CIU数据。(A)16+电荷态的平均CIU指纹图谱(n=3).(B)两两RMSD分析显示，半体之间的高级结构存在显著差异。(C)CIU50分析显示，蛋白质稳定性存在显著差异。　　为了更好地展示KiH bsAb不同结构域的CIU特征，作者记录了同型二聚体单抗IM-MS光谱中16+电荷态的knob和hole半体的CIU数据。从图2A的指纹图谱可以看出，每种结构都包含4种主要的CIU特征，但是图2B的RMSD分析显示两种半体的高级结构之间存在显著差异。CIU50分析进一步表明，在观察到的两次展开过渡中，knob半体明显比hole半体更稳定。作者推测造成这种CIU主要差距的原因可能是Fab结构域的差异。　　图3 Fab和Fc片段的CIU数据。(A)13+电荷态的平均CIU指纹图谱(n=3).(B)两两RMSD分析显示，knob和hole的Fab片段之间存在显著差异。(C)CIU50分析显示，不同片段之间稳定性存在显著差异。　　为了进一步将CIU特征联系到KiH bsAb的结构域当中，作者对木瓜蛋白酶消化后产生的Fab和Fc片段进行了CIU分析。从图3A可以看出，knob和hole的Fab片段都具有3种CIU特征，但是嵌合的Fc片段则具有4种CIU特征。尽管knob和hole的Fab片段具有相似的CIU指纹图谱，但是RMSD分析显示它们之间的高级结构仍然存在较大差异，并且knob的Fab片段稳定性明显高于hole的。至于Fc片段的稳定性则远高于两种Fab片段，可能的原因是重链CH3结构域的强非共价作用以及knobs-into-holes配对的影响。　　图4 去糖基化后的knob、hole同型二聚体和KiH bsAb异型二聚体24+离子(n=3)。(A)比较对照组和去糖基化抗体的RMSD分析显示，高级结构有显著差异。CIU50-1(B)和CIU50-2(C)分析显示抗体去糖基化后表现出显著的不稳定性。(D)对照组和去糖基化抗体之间的CIU50值差异图。　　先前的研究已经证明，CIU对不同水平的单抗糖基化很敏感，其中去糖基化会导致单抗高级结构的不稳定。作者利用高分辨率非变性轨道阱质谱分辨添加PNGaseF前后同型二聚体mAb和KiH bsAb糖型的变化。实验结果显示，KiH bsAb表现出高度糖异质性，包含至少12种不同的糖型。这很可能归因于组装的KiH bsAb中每个独立的knob和hole重链上存在独特的糖基化，进一步增加了其复杂性。　　总而言之，这篇文章展示了IM-MS结合CIU用于建立KiH bsAb及其亲本同型二聚体之间高级结构联系的能力。单独的CCS不足以解决此研究中抗体之间细微的高级结构差异。相比之下，CIU指纹图谱则可以分辨和区分每一个等截面的抗体。这一解释bsAb CIU细节的能力，加上对KiH bsAb稳定性的更深入理解，有可能提供支持KiH bsAb发现和发展的关键信息。　　撰稿：梁梓欣　　编辑：李惠琳　　文章引用：Ion Mobility-Mass Spectrometry and Collision-Induced Unfolding of Designed Bispecific Antibody Therapeutics　　李惠琳课题组网址www.x-mol.com/groups/li_huilin　　参考文献　　Villafuerte-Vega, R. C., Li, H. W., Slaney, T. R., Chennamsetty, N., Chen, G., Tao, L., & Ruotolo, B. T. (2023). Ion Mobility-Mass Spectrometry and Collision-Induced Unfolding of Designed Bispecific Antibody Therapeutics. Analytical Chemistry.

ADC药物作为一类新兴的生物治疗药，其结构更为复杂，质量表征挑战也随之升级。在ADC的定量和定性表征中，质谱凭借其独特的能力发挥着不可或缺的作用，可以从完整分子水平、亚基水平、肽段水平和小分子分析等方面对ADC进行多维度的表征（如图1所示）。图1. 质谱多维度表征ADC的方法[1]ADC质谱表征策略√ 丰富的项目经验夏尔巴生物在ADC项目开发方面积累了丰富的经验，涵盖半胱氨酸随机偶联、糖基化定点偶联、半胱氨酸定点偶联、双抗ADC以及双载荷ADC等多种类型。目前，已有5个项目进入临床阶段、多个项目处于临床前阶段。√ 高效的ADC质谱表征流程夏尔巴生物凭借深厚的表征经验和先进的分析平台，成功打造出一套全面、高效的ADC质谱表征策略，可对不同偶联方式的ADC药物进行全方位表征，涵盖分子量、偶联位点、偶联位点占有率、偶联杂质、二硫键和翻译后修饰等，确保分析的全面性和深入性。这套质谱表征流程有效克服了在DAR（药物抗体比）分析、复杂肽段偶联位点的质谱表征研究方面的难题，实现了在完整分子水平的精准分析，充分为产品质量保驾护航。本文聚焦于药物抗体比（DAR, drug-to-antibody ratio）和偶联位点这两个ADC药物的关键质量属性，深入介绍夏尔巴生物的质谱表征方法。 药物抗体比（DAR, drug-to-antibody ratio）的质谱表征ADC常用的偶联方式一般分为随机偶联和定点偶联，随机偶联包括赖氨酸随机偶联和半胱氨酸随机偶联；定点偶联方式较多，包括引入反应性半胱氨酸定点偶联、引入非天然氨基酸定点偶联、糖基化偶联、抗体间二硫键桥接偶联、其他酶促反应偶联等。半胱氨酸随机偶联过程如图2所示，由于半胱氨酸随机偶联ADC的轻链和重链以及重链和重链之间的二硫键被破坏，RP-LC/MS方法流动相中的有机溶剂会破坏非共价连接的立体空间结构，无法在完整分子水平分析DAR值和载荷分布情况。图2. 半胱氨酸随机偶联ADC偶联过程和结构展示[2] 而非变性质谱法（Native MS）由于其自身的特性，尤其是体积排阻色谱（Size exclusion chromatography, SEC）和质谱联用，很好的弥补了这种缺陷。SEC-MS法通常选择与质谱兼容的乙酸铵作为流动相体系，液相分离过程中无有机相参与，对柱温要求较低，分子的非共价结构得以保留，从而可以在完整分子水平进行DAR值分析。疏水作用色谱（HIC）通常以含盐的水溶液作为流动相，检测过程中不会引入有机相，也适用于在完整分子水平进行DAR值分析，通常被作为半胱氨酸偶联ADC的DAR值检测放行方法。但是HIC法本身不具备DAR值组分鉴定的能力，所以在HIC方法开发过程中，需要收集不同的组分，借助Native MS鉴定每个峰的组成。HIC法DAR值检测典型图谱见图3A，相应的Native-MS鉴定结果如图3B所示。图3. HIC和Native MS检测DAR值结果[2]定点偶联ADC在偶联过程中一般不会打开分子的链间二硫键，所以传统的RP-LC/MS法可以进行完整水平的DAR值分析。经典的糖定点偶联过程如图4所示，偶联过程中链间的二硫键得以保留，RP-LC/MS法以有机溶剂和水作为流动相，经过反相分离后进行质谱检测，对质谱结果解卷积分析后即可得到平均DAR值和载荷分布。图4. 糖定点偶联ADC的偶联过程[3]双载荷ADC（dual-payload）是在抗体上偶联两种不同的载荷，其自身异质性较强，常规分析方法很难实现两种载荷的DAR值检测，质谱可以根据带有不同载荷分子的分子量差异进行总DAR值以及两种不同载荷DAR值（DAR-A和DAR-B）的表征研究（图5）。图5. 双载荷ADC质谱表征[4]质谱分析DAR相较于常规分析方法的另一个优势在于可以在完整分子和亚基水平分别评估，如图6所示，对完整分子进行DTT还原后，可以检出轻链和重链上分别偶联的linker-payload数量，加权计算得出平均DAR值，与完整分子量检测结果交叉验证，可以得到更准确的ADC结构信息。 图6. 质谱在完整分子和亚基水平DAR值检测结果ADC偶联位点的质谱表征研究肽图分析（LC-MS/MS法）是表征大分子药物的强大工具，将ADC样品酶解后，利用LC-MS/MS分析，从而确证氨基酸序列、翻译后修饰、二硫键连接形式，通过一级和二级质谱信号对肽段序列和linker-payload特征碎片进行确认即可获得偶联位点信息。图7. 肽图法质谱分析流程对于含有多个偶联位点的肽段，偶联位点的鉴定会更复杂，如图8所示，铰链区酶切肽段含有两个半胱氨酸偶联位点（~CPPC~），肽段有可能偶联一个或者两个linker-payload，这时就需要通过一级质谱判断肽段偶联的linker-payload数量，结合二级质谱信息判断偶联发生位点。图8. 偶联一个和两个linker-payload肽段质谱鉴定结果综上所述，夏尔巴生物的质谱分析平台具备生物大分子的全面表征分析能力，可以实现抗体、融合蛋白以及随机/定点不同偶联方式的不同分子形式ADC药物的全面表征研究和分析方法开发，可以根据需求为客户提供Top-down、Middle-down、Bottom up等基于质谱的、全面的生物大分子结构表征研究和质量控制策略，助力客户产品提质增效。参考文献1) Zhu X, Huo S, Xue C, et al. Current LC-MS-based strategies for characterization and quantification of antibody-drug conjugates[J]. Journal of pharmaceutical analysis, 2020, 10(3): 209-220.2) Valliere-Douglass JF, Hengel SM, Pan LY. Approaches to Interchain Cysteine-Linked ADC Characterization by Mass Spectrometry. Mol Pharm. 2015 Jun 1 12(6):1774-83.3) van Geel R, Wijdeven MA, Heesbeen R, Verkade JM, Wasiel AA, van Berkel SS, van Delft FL. Chemoenzymatic Conjugation of Toxic Payloads to the Globally Conserved N-Glycan of Native mAbs Provides Homogeneous and Highly Efficacious Antibody-Drug Conjugates. Bioconjug Chem. 2015 Nov 18 26(11):2233-42.4) Yamazaki C M , Yamaguchi A , Anami Y ,et al.Antibody-drug conjugates with dual payloads for combating breast tumor heterogeneity and drug resistance[J].Nature Communications[2024-03-05].关于夏尔巴生物夏尔巴生物专注于提供抗体、融合蛋白、ADC（抗体偶联药物）等药物的开发和商业化生产，致力于“帮助优质客户开发出全球老百姓用得起的高质量生物药”。公司已组建了一支具有丰富经验的国际化人才团队，并助力完成了40多个项目的申报注册以及10个产品的国内外上市，满足了250多万病人的用药需求。目前，夏尔巴生物在苏州已有60,000L的总产能，生产线的建设标准同时符合NMPA、FDA和EMA等GMP要求。同时，夏尔巴生物在杭州基地还有172,000L产能在建，其中4条20,000L的生物反应罐已建成。夏尔巴生物致力于为优质客户提供优质的技术服务，可提供行业领先的一站式解决方案，协助客户加速将创新成果实现商业化，惠及更多患者。“利他以恒，匠心致远”，以分享、帮助、成就、共赢的理念，帮助优质客户开发出全球老百姓用得起的高质量生物药，是夏尔巴生物的理想和目标。

按照《全国畜牧业标准化技术委员会标准终审管理办法（试行）》的有关要求，《畜禽养殖污水中四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法》《畜禽粪便中139种药物残留量的测定液相色谱-高分辨质谱方法》2项农业行业标准已完成公开征求意见稿，现公开征求意见。请于2022年5月18日前以电子邮件方式反馈全国畜牧业标准化技术委员会秘书处。《畜禽养殖污水中四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法》：标准编制原则本标准的编写制定过程中以提高测试方法的选择性、准确度、精密度、检测限和分析效率为总原则，反映科学技术的先进成果和先进经验。使用性能的普遍性包括方法精密度、准确度、检测限等方面能满足要求，确保标准既能保持技术上的先进性，又具有经济上合理性。同时遵循了标准制定过程中的先进性、经济性和适用性原则。在标准的制定过程中严格遵循国家有关方针、政策、法规和规章，标准的编写规则及表述按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》、GB/T 20001.4-2015《标准编写规则第4部分：试验方法标准》的要求编写。在标准制定过程中力求做到：技术内容的叙述正确无误；文字表达准确、简明、易懂；标准的构成严谨合理；内容编排、层次划分等符合逻辑与规定。主要技术内容确定的依据本标准的适用范围：畜禽养殖场污水。本标准使用液相色谱-串联质谱进行检测方法开发。使用仪器型号为waters公司的Waters Acquity UPLC超高液相色谱和AB Sciex公司的 Triple Quad™ 4500质谱联用仪（HPLC-MS/MS）。本标准方法学考察包括检测限（LOD）和定量限（LOQ）。其中LOD拟设定为信噪比为3时的样品添加浓度，LOQ拟设定为信噪比为10时且回收率结果和相对标准偏差符合要求的样品添加浓度。本标准设低、中、高3个添加浓度进行回收率测定，按照LOQ、2LOQ、10 LOQ进行添加，因此三个添加浓度定为5 ng/mL、10 ng/mL及50 ng/mL。定量限以上添加浓度的回收率范围应该在60% ~ 120%之间，根据NY/T 1896-2010兽药残留实验室质量控制规范规定的筛选分析方法精密度的性能要求，结果的批内变异系数不超过25%，批间变异系数不超过30%。标准曲线则使用标准品稀释的系列工作溶液经测定后标准曲线，设置至少5个点进行测定。《畜禽粪便中139种药物残留量的测定液相色谱-高分辨质谱方法》编制原则本标准的编写制定过程中以提高测试方法的选择性、准确度、精密度、检测限和分析效率为总原则，反映科学技术的先进成果和先进经验。使用性能的普遍性包括方法精密度、准确度、检测限等方面能满足要求，确保标准既能保持技术上的先进性，又具有经济上合理性。同时遵循了标准制定过程中的先进性、经济性和适用性原则。在标准的制定过程中严格遵循国家有关方针、政策、法规和规章，标准的编写规则及表述按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则的要求》、GB/T 5009.1-2003 《食品卫生检验方法理化部分总则》和GB/T 20001.4-2015《标准编写规则第4部分：化学分析方法》的要求编写。在标准制定过程中力求做到：技术内容的叙述正确无误；文字表达准确、简明、易懂；标准的构成严谨合理；内容编排、层次划分等符合逻辑与规定。 主要技术内容确定的依据本标准的适用范围：畜禽粪便样本。本标准使用液相色谱-高分辨率串联质谱进行检测方法开发。使用仪器型号为美国安捷伦公司的超高效液相色谱（型号1290）串联（型号6545）飞行时间质谱（UHPLC-QTOF）。本标准方法学考察检测限（LOD）和定量限（LOQ）。其中LOD拟设定为信噪比为3时的样品添加浓度，LOQ拟设定为信噪比为10时且回收率结果和相对标准偏差符合要求的样品添加浓度。本标准设低、中、高3个添加浓度进行回收率测定，由于药品种类较多，无法兼顾各类药品的检出限，因此三个添加浓度定为5 μg/kg、10 μg/kg及50 μg/kg。定量限以上添加浓度的回收率范围应该在50%-120%之间，结果的变异系数应在20%以内。标准曲线则使用标准储备液稀释后的系列工作溶液，设置5个点进行测定。养殖场污水中四环素类、磺胺类和喹诺酮类药物的测定-正文-公开征求意见稿-陈刚-0411.docx1 TOF-兽残-标准文本-公开征求意见稿-粪便-2022.4.18.docx

在翻译后修饰和/或极碱肽的序列分析方面，电子转移裂解（ ETD ）线性离子阱质谱是很有优势的工具。传统的诱导活化裂解（CAD）常用来鉴定蛋白，并试图确定和找到他们修饰的位点，但这种技术有其本身固有的缺点，下面将详细叙述。与线性离子阱的结合使用的ETD是蛋白质组学研究的一个可靠的技术，可以很容易鉴定用CAD不能鉴定的多肽。ETD 是一个相对较新的肽/蛋白质碎裂的技术，能够大大推进质谱鉴定蛋白质这个领域的进步。 翻译后修饰 翻译后修饰（PTM）是翻译后的蛋白质进行的一种化学修饰，是蛋白质生物合成的后续步骤之一。蛋白的分析及其翻译后修饰的分析对于研究许多疾病是非常重要的，如癌症、糖尿病、心血管疾病和神经退行性疾病---阿尔茨海默病。这是因为在蛋白质的合成的过程中以及合成之后，可能发生各种蛋白修饰。对于正常细胞的功能，这些修饰是必须的，但调节这些修饰的变化可能会导致疾病的发生，如阿尔茨海默病，癌症和勃起功能障碍。蛋白质修饰可提高/降低蛋白质的活性，可以与其他蛋白质发生相互作用和将某一蛋白质定位到细胞的特定地方。 翻译后修饰，如磷酸化，乙酰化和甲基化被用作化学开关，激活/灭活组蛋白基因转录调控， DNA复制和DNA损伤修复。组蛋白是染色质的主要蛋白，DNA盘绕时，它们起到线轴的作用，而且在基因调控中发挥重要作用。因此，鉴定这种翻译后修饰是必需的，因为它在生物系统中对于某些蛋白的功能和作用至关重要。 用CAD鉴定蛋白 质谱在确定蛋白及其翻译后修饰上发挥了不可或缺的作用。CAD是一种常见的分析鉴定蛋白质的技术。一般用胰蛋白酶将蛋白质消化成较小的多肽，然后用反相色谱将其分离，并直接注入电喷雾质谱仪检测，通过串联质谱（ MS / MS法）获得序列信息。通过电喷雾电离这些多肽形成几种带电状态的肽离子，而较低带电状态的最适合CAD分析。低能量的CAD串联质谱一直是最常用的分析方法，通过裂解肽离子进行后续的序列分析。 翻译后修饰分析，如磷酸化，磺酸化和糖基化很难用CAD进行分析，因为这些修饰通常是不稳定且容易丢失肽骨架的碎裂信息，从而导致很少或几乎不能得到肽序列和磷酸化位点。利用常规的CAD质谱对于含多个碱性残基多肽测序也是极为困难。 根据不同的蛋白质序列，有时胰蛋白酶会产生过小或过大的肽段。在这种情况下，缺乏可信的序列分析手段。因此CAD对短的，低带电的多肽是最有效的。对于鉴定蛋白和了解蛋白的生物学功能，这是一种广泛使用的方法，然而，限制了研究者分析了所有的肽段，这也阻止多个翻译后修饰位点的检测和了解这些蛋白的生物学功能。 先进的碎裂方式：ETD ETD是基于离子/离子气相化学一种碎裂多肽的新方法。ETD通过从阴离子自由基到质子肽转移电子的化学能量将肽碎裂，这引起多肽骨干的分裂。 ETD产生的骨干肽序列和肽侧链的信息往往与CAD互补。 ETD已成功应用与线性离子阱以及其前身三维离子阱。虽然ETD在三维阱的执行价格具有竞争力且和CAD自身相比提供了独特好处 ，这样的组合并没有提供蛋白质组学分析所需的技术能力。非线性离子阱的ETD，它一直未能很好控制裂解过程，而且由于三维阱离子存储能力的有限不能处理大量的多肽。基于此，研究人员已经提出ETD功能应用于线性离子阱（Thermo Scientific LTQ XL mass spectrometer质谱仪） 。 相对于传统的CAD技术， ETD提供了更稳定的方法来定性PTMs，鉴定大型多肽或甚至整个蛋白质。 ETD能够将普通翻译后修饰的多肽，或者多个碱性残基的多肽甚至整个蛋白质生成离子。 ETD也可以轻易碎裂含有二硫键的的多肽。 ETD是为更复杂的FT-ICR仪器开发相似的裂解技术。使用电子转移试剂，而不是影响肽碎裂的自由电子使ETD在广泛使用的射频四极离子阱中得到应用。射频离子阱质谱仪具有低成本，低维护费用以及更易接受优点，相对于CAD碎裂方法，ETD碎裂技术能够产生更多的产物离子，利于肽段的解读。 ETD的线性离子阱提供了强有力的工具鉴定蛋白及其翻译后修饰 。LTQ XL线性离子阱质谱仪比其他任何离子阱提供更多的结构信息，ETD能够得到常规方法无法得到的序列信息。相比非线性离子阱，ETD的线性离子阱的显著特征在于离子和离子发生反应。虽然ETD功能是完全自动的且通常无需用户干预，但是当需要对离子数进行累积的时候，用户可通过软件完全控制线性离子阱的离子。线性离子阱质谱仪有能力处理大量的样品，并分析低浓度的大分子和小分子。与非线性离子阱的相比，该过程更为复杂和费时 应用实例 在最近的应用中，极碱的多肽和大量重要的翻译后修饰已经用含CAD和ETD线性离子阱质谱分析了。通常CAD碎裂方式产生的普通只显示有限的肽碎裂信息。然而，用ETD碎裂这些多肽的时候， 肽骨架碎裂信息能完全或几乎完全产生，因此得到更广泛的多肽序列的信息。 ETD的灵敏度和稳定性对于蛋白质组学分析是必不可少的。 ETD提供了高度可靠的解决方案，此方案具有用户友好性，几乎不需要日常维护，并提供高度准确的数据，而且ETD的数据分析有相应的软件支持，非常方便简单。 结论： 在蛋白质组学研究领域，ETD的应用对于研究疾病的机理，如癌症，药物开发研究以及细胞功能和信号转导有重大意义，ETD将扩大目前的分析，包括更多的碱性、非胰酶切肽段和蛋白质。它们能确定各种翻译后修饰以及鉴定新的蛋白亚型。 配备ETD的线性离子阱质谱可应用于蛋白质组学各个领域内。ETD的线性离子阱将继续推动蛋白质组学的发展，而且已被证明是替代CAD一种有效技术，而且ETD同样可以应用于非线性离子阱进行肽序列分析。在不久的将来，配备ETD的线性离子阱预计将成为碎裂技术的一种新选择。 参考文献 Leann M. Mikesh et al, The utility of ETD mass spectrometry in proteomic analysis, Biochemica et Biophysica Acta (2006), doi:10.1016/j.bbapap.2006.10.003关于 Thermo Fisher Scientific （赛默飞世尔科技，原热电公司） Thermo Fisher Scientific纽约证交所代码：TMO）是全球科学服务领域的领导者，致力于帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。公司年销售额超过100亿美元，拥有员工约30000人，在全球范围内服务超过350000家客户。主要客户类型包括：医药和生物公司，医院和临床诊断实验室，大学、科研院所和政府机构，以及环境与工业过程控制装备制造商等。公司借助于ThermoScientific和FisherScientific这两个主要的品牌，帮助客户解决在分析化学领域从常规的测试到复杂的研发项目中所遇到的各种挑战。ThermoScientific能够为客户提供一整套包括高端分析仪器、实验室装备、软件、服务、耗材和试剂在内的实验室综合解决方案。FisherScientific为卫生保健，科学研究，以及安全和教育领域的客户提供一系列的实验室装备、化学药品以及其他用品和服务。赛默飞世尔科技将努力为客户提供最为便捷的采购方案，为科研的飞速发展不断地改进工艺技术，提升客户价值，帮助股东提高收益，

大家好，本周为大家介绍的是一篇发表在Analytical chemistry上的文章Epitope Mapping of Polyclonal Antibodies by Hydrogen–Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS)1，文章通讯作者是意大利锡耶纳葛兰素史克公司实验室主任Nathalie Norais和丹麦哥本哈根大学药学系教授Kasper Rand。抗体表位定位对理解适应性免疫、研究治疗性抗体和疫苗的作用方式至关重要。对疫苗接种后产生的多克隆抗体群（pAb）的结合特性的深入了解将为疫苗开发提供重要价值，但很少有表位定位方法能耐受pAb样品的复杂性。本文使用氢氘交换质谱（HDX-MS），通过检测存在不同量的pAb时抗原的HDX值变化，绘制了pAb样品识别的表位，并提供了表位与抗体的相互作用信息。因子H结合蛋白（fHbp）是被广泛研究的脑膜炎奈瑟菌抗原之一，在人体中能引发强大的保护性免疫反应。fHbp是27kDa的脂蛋白，N端为一个饼状的β-sheet，C端为一个8股β桶，两端由linker连接。本文的研究对象是fHbp和用fHbp免疫的兔pAb。首先作者进行了被pAb识别的fHbp抗原表位的鉴定。重组fHbp在不孵育和孵育两倍量的pAb下进行了30秒到20分钟的HDX实验，在抗原的多个区域检测到了抗体导致的HDX降低，标记10min后HDX的变化最为显著，因此接下来的HDX-MS实验选择了10 min时间点。随后作者进行了孵育比例的考察以判断结合亲和力，考察了Ag：pAb从1:2、1:5、1:10到1:15，氘代时间为10分钟（图1），可以观察到抗原的3-26、44-72、104-120三个区域的氘代被抗体显著的保护住了，从1:5时开始看出差异，从1:2到1:15，所有肽的平均氘代降低率从3%增加到了16%，104-120的氘代降低率最高。之前的研究表明，fHbp的兔抗中存在与抗原亲和力在1nM及以下的抗体，故氘代保护率随抗体用量增加的原因可能是，在低比例的多克隆抗体中，每种抗体的占比有限，高亲和力的抗体还没达到能与抗原形成1:1复合物的浓度。作者将实验结果与前人研究的fHbp的单克隆抗体结果进行比对，多个氘代减少的区域得到了印证，尤其是104-120区域，残基S112、G116和K117可被认定为抗原表位。同时，抗体之间也存在组合功能，即单个抗体无法发挥的功能会由两到三个抗体协同产生，本实验中使用多克隆抗体研究的优势在于，通过与单克隆抗体研究中氘代降低的区域对照，判断表位抗体间的组合功能和起到免疫效果所需的交叉区域。图1. 不同比例的Ag：pAb对抗原fHbp氘代率的影响。A.颜色由浅到深依次是1:2、1:5、1:10、1:15，正值代表加入抗体后氘代率降低。B.映射到晶体结构上的氘代变化（PDB：3kvd）。C. 15-31、44-71、102-120、209-234区域随抗体加入比例的变化，灰色线为不加抗体时的氘代值，所有氘代是最大氘代值（MX）的相对值，最大氘代值为1:15比例下氘代24h的结果。接着，作者使用VADAR分析研究fHbp的主要表位区。VADAR v1.8算法基于蛋白的X射线结构原子坐标测量fHbp单个残基的表面可及性，将其与HDX结果相结合可进一步描述fHbp的表位区域。可及表面积分数（ASA）超过50%的残基为暴露残基，图2总结了映射到fHbp晶体上的所有暴露的残基，每个识别的表位区域的范围为1992-2509 Å2，作者强调位于表位区的暴露残基不一定都参与表位组成，也可能是间接稳定抗体的结合引起的HDX保护。图2. 结合VADAR和HDX数据的抗原表位区。两个在N端结构域（黑灰、浅绿），两个在C端结构域（浅蓝深蓝、深绿），紫色代表不在HDX鉴定的表位区域内的暴露残基。最后，作者使用了变性剂和盐来评估结合特异性和非特异性相互作用。由于亲和力低的抗体在变性剂存在时可与抗原解离，作者将此策略应用到了HDX实验中，选择1:10结合比例进行HDX，标记缓冲液使用含有或不含有盐（0.5M NaCl）或变性剂（硫氰酸铵AT或尿素），探究这些情况对HDX结果的影响（图3）。在存在0.5M、2M和4M AT的情况下，fHbp的多个区域获得了更多的氘代，N端区域3-26和44-71，以及C端区域176-184显示出氘代增加（相对于不加AT结果），因此作者推断即便在0.5M的浓度水平下AT也能影响fHbp与抗体的结合，2M尿素存在下也是如此。但0.5M尿素和0.5M NaCl的存在没有明显影响fHbp与抗体的结合。因为非结构肽中酰胺氢的交换速率会受到溶剂离子强度、pH值、温度、以及相邻残基侧链的诱导和空间效应的影响，作者额外考察了0.5M尿素和0.5M NaCl是否会影响fHbp酰胺氢自身的交换速率，即在对照条件（PBS缓冲液）和实验条件（加入0.5M尿素或 NaCl）下分别标记5秒和30秒，控制缓冲液的pH相同且控温（在冰浴进行标记）。结果表明实验组序列覆盖率没有降低，相比于对照组，肽的回收率也高达91.8%，三次重复实验可表明0.5M尿素或 NaCl的加入不会对fHbp自身的氘代特性产生任何显著性影响，也不影响fHbp的构象。将0.5M尿素或 NaCl添加到抗原抗体孵育后的氘代实验中，发现fHbp上的所有表位在抗体结合后仍被显著保护，排除了抗体非特异性结合的可能。值得注意的是，在存在尿素或NaCl的情况下，fHbp的表位区域氘代降低变化幅度不同，尤其是在标记30秒时，这说明了不同表位在与抗体互作时的特性不同，例如残基3-26和104-120可能为静电相互作用（被NaCl破坏），残基133-166和209-234可能为氢键作用（被尿素破坏）。图3. 添加剂对抗原结构和抗原-抗体结合的影响。A.在0.5M AT存在下，30秒氘代后fHbp结构中氘代增加的区域（蓝色）。B.抗原-抗体1:10孵育对fHbp氘代的影响。C.49条鉴定肽在30秒氘代时的变化，蓝色为添加0.5 M AT，紫色为添加0.5 M尿素。D. 抗原-抗体1:10孵育后，49条鉴定肽在30秒氘代时的变化，橙色为对照组，蓝色为添加0.5 M NaCl，紫色为添加0.5 M尿素。总结：本文通过监测fHbp与多克隆抗体群pAb孵育后的HDX-MS变化，绘制了fHbp的抗原表位，并使用尿素和NaCl深入了解了抗体群的相对丰度和亲和力，以及潜在的非特异性结合，这种方法可以广泛应用于其他抗原和pAb样品，为免疫学和疫苗设计提供有价值的信息。参考文献：1.Ständer, S. R. Grauslund, L. Scarselli, M. Norais, N. Rand, K., Epitope Mapping of Polyclonal Antibodies by Hydrogen–Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS). Analytical Chemistry 2021, 93 (34), 11669-11678.

动物源性食品（猪肉、猪肝、鸡蛋、虾、牛奶）中76种兽药（&beta -受体激动剂类、磺胺类、苯二氮卓类、硝基咪唑类、苯并咪唑类、三苯甲烷类）残留量的制样和液相色谱-质谱测定。下载: 动物源性食品中多种碱性药物残留量的检测方法 液相色谱-质谱质谱法(SN/T 2624-2010).pdf 了解更多产品请进入安谱公司网站 http//www.anpel.com.cn/

p　　质谱技术具有快速、高灵敏度、高通量等优点，已被广泛应用于生物医药领域中蛋白质、糖类、代谢小分子等的检测。/pp　　在国家自然科学基金委和中国科学院的长期支持下，中科院化学研究所活体分析化学重点实验室研究员聂宗秀课题组研究人员开发了用于糖异构体区分(Anal. Chem. 2018, 90, 1525)、细胞表面糖蛋白检测(Anal. Chem. 2018, 90, 6397)、监测蛋白二硫键重构(Anal. Chem. 2018, 90, 10670)、胰腺癌生物标志物检测(Chem. Comm. 2018, 54, 10726)等的质谱分析新方法，以及用于基质辅助激光解吸电离质谱成像的新基质和新技术(Anal. Chem. 2018, 90, 729 Chem. Comm. 2018, 54, 10905)和新型基质喷涂装置(Anal. Chem. 2018, 90, 8309)。他们还发展了一种可以快速检测小鼠体内碳纳米材料亚器官分布的通用、免标记的直接质谱成像方法(Nature Nanotech. 2015, 10, 176)。/pp　　最近，该实验室的研究人员联合美国约翰惠普金斯医学院的学者，发展了一种新型无标记激光解吸电离质谱成像技术(LDI MSI)，通过监测纳米载体和药物分子固有的质谱信号强度比，实现了质谱成像定量分析纳米载体在组织中的原位药物释放，相关结果发表于Science Advances，2018, 4, eaat9039。他们选择新型过渡金属二硫化物-MoS2纳米载药系统，使用LDI MSI技术，可以根据MoS2纳米片和其负载的抗癌药物阿霉素(DOX)在激光剥蚀下同时产生的质谱指纹峰来追踪纳米载体和药物在体内的分布，无需任何标签，且不受生物体内源性的分子干扰。通过原位监测纳米载体和药物的质谱指纹峰强度比值的变化得到定量测量，研究人员发现在正常和肿瘤模型小鼠中，药物在组织间和组织内的释放呈现组织依赖性。如在肿瘤中的释放量最多，肝组织中的释放量最小。/pp　　无标记激光解吸电离质谱成像技术(LDI MSI)克服了纳米载药研究中传统检测方法正存在空间分辨率有限、贴标过程复杂、难以同时跟踪纳米载体和药物等缺点。研究人员下一步计划将该技术应用于已进入临床的脂质体阿霉素的原位药物释放研究。/pp style="text-align: center "img title="W020181112594468027136.jpg" alt="W020181112594468027136.jpg" src="https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/c279fa73-25d8-411a-84bd-12f0448681e3.jpg"//pp style="text-align: center "　　纳米载体药物原位药物释放质谱成像研究/pp /p

2012年11月16日，由仪器信息网主办的“2012质谱网络研讨会(iCMS 2012)”圆满落下帷幕，共吸引了近2500余名专业用户报名参加，参会人员来自大专院校、科研院所、质检机构、分析测试中心、仪器企业等。 本次会议得到了中国仪器仪表学会分析仪器分会、清华大学分析中心和江西省质谱科学与仪器重点实验室的大力支持，还专门邀请质谱行业内多名专家组成了学术委员会。本次iCMS得到了安捷伦、赛默飞世尔科技、沃特世、东西分析、岛津五家厂商的赞助。会议历时5天，开设了6个大会主题专场，共邀请了35位来自北美、台湾、大陆地区的著名质谱专家做精彩报告，从质谱技术及行业应用等多个角度介绍了目前国内外的热点问题 同时，此外，本次会议还特别安排了WORKSHOP、专家答疑、培训等多种交流方式，并得到了仪器信息网广大用户的积极参与和一致认可。 应广大用户要求，主办方现将视频上传到“网络讲堂”栏目中，欢迎相关质谱用户查看。 具体视频列表如下： 主题：质谱技术进展 视频1：气相离子-离子反应的质谱仪器设计及其在蛋白组学的应用 主讲人：瑕瑜（普渡大学） 视频2：Synchronized Dual-Polarity Mass Spectrometry 主讲人：王亦生（中央研究院基因體研究中心） 视频3：质谱分析的新视野 主讲人：贾伟（沃特世科技（上海）有限公司） 视频4：离子源进展及相关应用 主讲人：刘春胜（华质泰科） 视频5：微流控芯片质谱联用仪器研制的新进展 主讲人：林金明（清华大学） 视频6：电感耦合等离子体串联质谱新技术及其应用 主讲人：陈玉红（安捷伦科技有限公司） 主题：药物分析 视频1：高分辨质谱和定性定量分析主讲人：盛龙生（中国药科大学） 视频2：质谱技术在蛋白质、多肽药物二硫键分析中的应用主讲人：魏开华（北京蛋白质组研究中心） 视频3：岛津质谱在药物分析中的应用主讲人：邓力（岛津企业管理（中国）有限公司） 主题：食品安全 视频1：农药残留分析方法建立及应用主讲人：马晓东（中国农业大学） 视频2：新离子光学改善GCMSMS的分析通量主讲人：朱曼洁（赛默飞世尔科技有限公司） 视频3：水产品、乳制品、禽肉产品分析方法主讲人：彭涛（中国检验检疫科学研究院） 主题：环境分析 视频1：质谱技术在持久性有机污染物（pops）上的应用主讲人：董亮（国家环境分析测试中心） 视频2：水质分析技术最新进展-直接进样主讲人：赵永刚（江苏省产品质量监督检验研究院） 视频3：安捷伦高端气相色谱质谱GCQTOF在食品、环境中的应用主讲人：余翀天（安捷伦科技有限公司） 视频4：全二维气相色谱质谱技术在大气有机物检测中的应用主讲人：徐晓斌（中国气相科学研究院） 主题：能源与资源 视频1：全二维气相色谱-飞行时间质谱在石油地质中的应用主讲人：王汇彤（中国石油勘探开发研究院） 视频2：重质油分子组成的质谱分析技术主讲人：史权（中国石油大学） 视频3：高性能的Extrel在线质谱仪在石化过程控制及其它领域中的应用主讲人：Jian Wei（Extrel CMS，LLC） 视频4：化工产品的质谱检测技术主讲人：张颖（北京石化研究院） 视频5：ICPMS在能源资源领域的应用主讲人：郭冬发（核工业地质研究院） 闭幕报告 视频：道法自然主讲人：舒放（沃特世科技(上海)有限公司） 培训课程 视频1：NIST的使用及应用技巧专题主讲人：刘翠华（华中农业大学） 视频2：质谱性能及参数介绍及质谱谱图解析方法概述主讲人：苏焕华（石油化工研究院）

大家好，本栏目供稿来自于中山大学李惠琳课题组，以后将定期为大家带来质谱新技术、新方法领域的前沿文献与工作交流，欢迎评论互动。本周为大家分享一篇发表在mAbs上的文章，Non-targeted characterization of attributes affecting antibody-FcγRIIIa V158 (CD16a) binding via online affinity chromatography-mass spectrometry1，通讯作者是美国加利福尼亚州Amgen公司的Pavel V. Bondarenko。Fcγ受体（FcγR）是免疫球蛋白（Ig）超家族的膜结合糖蛋白，存在于免疫系统的许多造血细胞表面。这些受体可以结合IgG免疫复合物，在免疫反应的调节中发挥重要作用。FcγRIIIa（CD16a）是一种低亲和力Fc受体，与抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）有关。研究表明FcγRIIIa结合亲和力与治疗性单克隆抗体（mAb）的ADCC效力之间存在良好的相关性，测量这种相互作用的亲和力是体外评估单克隆抗体疗法ADCC效力的一个重要部分。Fc上保守N糖基化位点（N297）的聚糖组成对CH2结构域的构象动力学和灵活性有显著的影响，并进一步关系到该结构域与Fcγ受体的亲和力，这种亲和力的差异为区分单克隆抗体糖型提供了一种独特的方法。在文章中，作者描述了一种使用固定化FcγRIIIa受体的亲和层析方法，通过在线质谱（MS）和离线馏分收集，在单个非靶向大规模实验中研究影响FcγRIIIa亲和性的因素。一、基于Fcγ受体亲和层析的抗体糖型鉴别图1显示了利妥昔单抗的糖型分离。从个体保留时间来看，半乳糖基化在与受体的结合亲和力中起着重要作用，更高水平的半乳糖导致亲和力增加（图1b）。几种糖型在提取质谱图（XMC）中含有多个峰（图1c），例如G1F/G1F。这是因为可能存在质量相同的位置异构体（例如G1F/G1F和G0F/G2F含有相同数量的糖，但排列方式不同）。此外，一次只有一个Fc-聚糖与Fc-γRIIIa相互作用，因此不对称糖基化单抗的一侧比另一侧具有更高的亲和力，这可以表现为两个不同的亲和力峰。此外还检测到两种无核心岩藻糖基化物种（M5/M5和G0F/G0）。据报道，这些物种的亲和力和ADCC效价显著增加，但这似乎并未反映在本实验中的保留时间上。最值得注意的是，据报道，M5/M5糖型对FcγRIIIa的亲和力增加了4-6倍，但在所有糖型中洗脱时间最早。仅观察到相对于岩藻糖基化G0F/G0F，无岩藻糖基化G0F/G0糖型的亲和力略有增加，保留时间偏移的幅度与G1F/G1F糖型相当，而不是文献中报道的增加10-50倍。作者推测，与大多数已发表的结合研究中使用的糖基化FcγRs相比，这种偏离预期保留行为的现象可能源于柱上的FcγRIIIa受体是无糖基化的。观察到具有唾液酸化的抗体分子的洗脱时间比其无唾液酸化的对应物稍早。例如，在图1c中，糖型G0F/S1G1F的洗脱时间与G1F/G1F相同。G0F/S1G1F的结构类似于G0F/G2F，在一个半乳糖上带有末端唾液酸，但其洗脱时间更早（类似于G1F）。这表明唾液酸残基可能阻止或抑制第二半乳糖与FcγRIIIa的相互作用，使其更类似于G1F聚糖。图1 利妥昔单抗的FcγRIIIa亲和LC-UV-MS表征。（a） 整个样品的去卷积质谱；（b） 280 nm紫外检测的LC色谱图。星号表示A1G0F的洗脱。（c） 提取的质谱图（XMC）用于检测含有M5/M5、G0F/G0F、G0F/G1F、G1F/G1F、G1F/G2F和G2F/G2F聚糖的单个完整抗体分子。二、亲和层析结果与AlphaLISA结合分析结果的相关性 图2显示了根据平均加权保留时间（根据峰面积加权）排列的四种治疗蛋白质的亲和色谱图。图2b和c显示了平均保留时间与AlphaLISA结合试验的相对亲和力百分比之间的线性相关性。这两种试验报告了类似的趋势，其中糖基化Fc融合蛋白显示无结合，mAb3（IgG2）显示非常弱的结合，与mAb1相比，mAb2（具有高水平半乳糖基化的IgG1）的结合增加。这为使用FcγRIIIa亲和层析方法表征影响结合的产品属性的影响提供了验证。图2 （a） 四种具有代表性的治疗蛋白模式的FcγRIIIa亲和色谱图：无糖基化Fc融合蛋白（紫色）、IgG2单抗（红色）和两种具有不同糖基化模式的IgG1单抗（蓝色和绿色）。（b） 相关图显示了相对结合亲和力与平均加权保留时间之间的关系，去除了异常样本。（c） 相对结合亲和力与加权保留时间的相关图，包括异常样本。三、受体亲和力的差异导致IgG亚类效应器功能的变化IgG亚类（IgG1、IgG2、IgG3和IgG4）的Fc区域具有高度的序列同源性，但在几个关键残基上有所不同，这决定了它们与各种Fc受体的亲和力。为了探究不同Fc结构域的角色，作者对具有相同Fab结构域，但Fc结构域分别来自IgG1、IgG2和IgG4的mAb2变体，以及一种工程化稳定效应器无功能变体（SEFL2）进行亲和分离（图3b）。SEFL2变体是一种无糖基化IgG1变体（N297G），带有额外的工程铰链二硫键，设计为不具有ADCC功能。保留时间数据表明，工程SEFL2-IgG1模式的亲和力最低，其次是IgG2、IgG4，然后是IgG1，这些样品的整体洗脱顺序与已有文献报道的结果一致。然而，IgG4变体的洗脱时间似乎高估了结合亲和力，洗脱时间仅略早于IgG1变体。这种增加的表观亲和力或许与柱上受体的糖基化性质有关，不应用于评估FcγRIIIa对IgG4亚类单克隆抗体的亲和力。图3 （a） 人类IgG重链CH2区域的对齐序列（EU编号）。参与FcγRIIIa结合的IgG Fc残基以绿色突出显示（本研究中通过实验测量），蓝色和红色突出显示（文献报道），二硫键以黄色突出显示。与IgG1序列不同的残基以粗体显示。（b） 具有相同Fab区和不同Fc区的四种mAb2变体的紫外色谱图（λ=280 nm），对应于IgG1（蓝色）、IgG2（品红）、IgG4（褐红色）和带有N297G突变的IgG1 SEFL2（黑色）。插图显示了AlphaLISA测量的相对FcγRIIIa结合亲和力值。亲和力是相对于mAb2参考标准物质的IgG1变体测量的。四、二硫化物异构体对IgG2单抗中FcγRIIIa结合的影响鉴于IgG2亲和色谱图的异质性，作者选择具有二硫化物变体的IgG2（mAb3）进行进一步表征。该IgG2单抗存在几种天然的二硫键结构异构体，它们可以影响疗效和Fc受体结合行为。对二硫化物异构体的反相和FcγRIIIa亲和分离的并排比较（图4）。有趣的是，亲和分离方法中使用的类天然条件仍然能够区分这些结构异构体，这表明这些异构体对Fc和FcγRIIIa的结合亲和力也存在一定影响。图4 （a） 在280 nm处进行紫外检测的反相色谱图，显示天然产生的IgG2二硫化物变体和富集IgG2-a和IgG2-B的纯化样品的混合物分离。（B）相同样品的FcγRIIIa亲和紫外色谱图，显示IgG2二硫化物亚型的部分分辨率。六、在应力条件下识别对FcγRIIIa结合产生负面影响的修饰对受体结合位点或其附近的残基进行化学修饰可影响抗体-受体相互作用的亲和力，从而导致ADCC和疗效的变化。这种修饰可以在各种应激条件下诱导。本研究使用热应激利妥昔单抗样品（40°C，持续6周），通过LC-MS/MS肽图谱检测到200多个修饰。对比具有温度应力的样品和保持在4℃的对照样品的亲和色谱图，每个样品的主峰收集为四个组分（F1–F4）。40°C下的应力导致FcγRIIIa结合的最低亲和组分F1的峰面积略有增加（2%~4%）。对每个收集的组分进行肽图谱绘制，以确定组分中修饰相对百分比的趋势（图5）。馏分被分别赋值为0.1、0.2、0.3、0.4，以便斜率与R2进行比较，并且斜率的R2与绝对值之和可用作评分。具有正斜率的修饰（如半乳糖基化和唾液酸化）表明对受体结合有有利影响，而具有负斜率的修饰（如去酰胺化）表明对结合有不利影响。应激后，组分中的化学修饰斜率（N329脱酰胺）更高（图5b、d、f），而应激前后糖类的斜率（图5c、e、g）保持相似，表明斜率主要由聚糖对受体亲和力的影响以及组分中存在的糖类来定义。图5 （a）亲和色谱图突出显示了在40°C下热应激6周后，相对于4°C对照样品，mAb1峰值强度的变化。（b–g）FcγRIII亲和组分F1、F2、F3和F4中所选修饰的相对丰度变化。（h，i）R2与4°C组分中PTMs的百分比变化斜率的关系。R2与斜率的关系由组分中所有检测到的PTMs的线性回归确定。在所有面板中，红色表示热应力样本（40°C，6周），黑色表示4°C对照样本。所有统计分析中确定的关键属性汇总如表1所示。选择六个指标来评估数据的显著性，以确定修饰是否对FcγRIIIa结合至关重要。评估显示，利妥昔单抗P231（EU P227）、N301（EU N297）和N329（EU N325）三个残基上的11个修饰对结合的影响具有统计学意义。作者进一步分析了这些残基的空间分布，结果显示每个已鉴定的残基都与IgG1到FcγRIIIa的结合域非常接近，为确认这些属性对结合有重要影响提供了额外的信心。表1 确定关键性属性的统计分析总结撰稿：夏淑君编辑：李惠琳文章引用：1 Daniel W. Woodall, Thomas M. Dillon, Kevin Kalenian, et al. Non-targeted characterization of attributes affecting antibody-FcγRIIIa V158 (CD16a) binding via online affinity chromatography-mass spectrometry. mAbs, 2022, 14(1): 2004982.

p　　strong仪器信息网讯/strong span style="font-family: times new roman "2016年9月10日-12日，布鲁克作为高端质谱生产制造商参加了在青海西宁举办的第34届中国质谱学会学术年会。继去年推出用于完整的组织成像的rapifleX MALDI tissuetyper之后，布鲁克在今年的美国质谱年会(ASMS 2016)发布了全新的质谱技术平台捕集型离子淌度QTOF( timsTOF)和rapilfeX TOF/TOF。仪器信息网编辑在西宁会议现场就布鲁克质谱的最新技术与市场情况采访了布鲁克质谱中国区高级商业总监王克非与全国销售经理鲁静。/span/pp style="text-align: center "span style="font-family: times new roman "img title="布鲁克道尔顿中国区高级商业总监王克非与全国销售经理鲁静.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201609/insimg/97e1da20-fbb8-4bc1-be16-50fd7b344b15.jpg"//span/pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 112, 192) font-family: times new roman font-size: 14px "strong布鲁克道尔顿中国区高级商业总监王克非与全国销售经理鲁静在布鲁克展位合影/strong/span/ppspan style="font-family: times new roman "　　timsTOF是一款将布鲁克专利TIMS(Trapped Ion Mobility Spectrometry)技术与ESI-QTOF质谱联用的布鲁克最新技术。王克非博士在本届质谱会质谱检测新方法的研究分会场详细介绍了timsTOF捕集离子淌度高分辨质谱原理及应用，到场听众对该技术表现出浓厚的兴趣。/span/pp style="text-align: center "img title="质谱检测新方法的研究分会场.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201609/insimg/15fd8de7-94ec-405c-b7bc-9e888fe6786a.jpg"//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 112, 192) font-family: times new roman font-size: 14px "strong质谱检测新方法的研究分会场/strong/span/pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 112, 192) font-family: times new roman font-size: 14px "strongimg title="王克非博士.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201609/insimg/b5809cd5-a6eb-493f-94b6-1daf12d41e27.jpg"//strong/span/pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 112, 192) font-family: times new roman font-size: 14px "strong王克非博士在质谱检测新方法的研究分会场介绍timsTOF捕集离子淌度高分辨质谱原理及应用/strong/span/ppspan style="font-family: times new roman "　　在报告之后，仪器信息网编辑针对timsTOF的原理与技术创新采访了王克非博士。据王克非介绍，捕集型离子淌度技术(Trapped Ion Mobility)是近几年新发展的离子淌度新技术，布鲁克成功将这一技术用在了液质Q-TOF产品中。其离子淌度分析部分包含离子漏斗和淌度分析器，能够捕获聚集离子以达到更高的分析效率。与传统离子淌度的载气与离子同方向流动不同，tims的分析是载气与离子在电场作用下反方向流动，较大离子因淌度较小而先流出进入质谱分析。/span/ppspan style="font-family: times new roman "　　timsTOF能够提供高分辨的淌度和质谱分析。据介绍，该系统的离子淌度分辨率R超过了200。而独特的离子淌度扩展技术imeX能够调整淌度的分辨能力。用户可以在分辨率与所需求的分析质量数(m/Z)范围之间平衡选择，给科研工作带来了灵活性。timsTOF可应用于同分异构化合物的分析，因为异构体在一般的LC-MS/MS上很难分析。timsTOF还可分离和排除母离子干扰离子，极大程度降低背景噪音，提高二级图谱质量。timsTOF在分析中可以得到准确的( 0.5%) 碰撞截面值(CCS)，为复杂物质定性定量分析提供了另一个关键参考信息。/span/ppspan style="font-family: times new roman "　　王克非还提到，离子淌度质谱系统的软件是体现系统优越性的重要一环。timsTOF采用开放的数据格式(*.tdf)和开源格式SQLite支持用户定制分析过程与算法。灵活的软件使用户能根据高分辨的离子淌度质谱数据实现在热图、mobilograms和质谱谱图之间的相互分析研究。/span/ppspan style="font-family: times new roman "　　布鲁克在离子淌度技术发展方面做出新的技术突破，于今年把捕集离子淌度技术与QTOF的结合带给了用户。对此，王克非感叹说：“匠人匠心，德国先进技术一直在传承，在这背后是对高端质谱技术的坚持和热爱”。和布鲁克其他Q-TOF质谱一样，timsTOF能够获得精确的同位素峰形以及干净的MS/MS谱图，得到真实性更强的同位素分布(TIP)。/span/ppspan style="font-family: times new roman "　　除此之外，今年布鲁克先进的MALDI产品家族又添了新成员MALDI TOF/TOF –rapilfeX TOF/TOF，以满足更高应用需求，是科研工作者在生物药和生物仿制药的Top-down测序、糖基化结构分析、二硫键或三硫键定位分析和错配分析、组织成像等方面的最佳选择。/span/ppspan style="font-family: times new roman "　　王克非对布鲁克质谱的在中国的销售情况比较乐观。2016年上半年，受欧洲经济疲软的影响，布鲁克质谱在全球的销售业绩出现小幅下滑，但布鲁克质谱在中国的销售额却获得了2位数的增长。他透露，“今年MALDI质谱在中国销售额已经超过了100%的增长。布鲁克MALDI质谱在政府机构、科研、临床及工业微生物市场全面开花。”/span/pp style="text-align: left "span style="font-family: times new roman "　　今年7月份，布鲁克质谱对内部进行了重新部署，正式任命原区域销售经理鲁静为全国销售经理。对于布鲁克MALDI质谱在中国的发展情况，鲁静补充说：布鲁克MALDI Biotyper是取得国内医疗器械许可证为数不多的质谱仪器之一，目前在国内医院微生物检验科、食品安全系统、疾病控制等系统得到了用户好评。除此之外，我们也能够为临床医院、科研院所等用户提供用于分子成像、蛋白组学研究等领域的高端研究级MALDI质谱。目前，在微生物鉴定之外的医学领域是我们的高增长区，主要是质谱用于精准医疗的热潮中。MALDI-TOF由于操作便捷易学、图谱简单易解等特点已成为医生和新兴的医疗企业首选的质谱平台，各种围绕着MALDI-TOF的诊断解决方案不断被开发出来。/span/pp style="text-align: center "span style="font-family: times new roman "img title="布鲁克新技术交流会：应用专家潘晨松.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201609/insimg/cdcda811-91ac-4b65-ae6b-44917541eb47.jpg"//span/pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 112, 192) font-family: times new roman font-size: 14px "strong布鲁克新技术交流会：应用专家潘晨松介绍《基于液相色谱-质谱联用的代谢组学研究中代谢物的结构鉴定进展》/strong/span/pp style="text-align: left "span style="font-family: times new roman "　　对于布鲁克独有的傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(FTMS)，鲁静透露：在继中科院生态环境研究中心和中科院大连化物所之后，石油化工科学研究院将成为国内第三家拥有最高分辨率15T FTMS的研究机构。鲁静对FTMS的应用充满信心，她表示：目前在国内拥有2台和2台以上FTMS的单位逐渐增加，FTMS的应用技术正在不断发展。/span/ppspan style="font-family: times new roman "　　在2016年8月的国际质谱大会(IMSC 2016)上，布鲁克发布了最新的FT质谱solariX 2XR。该产品具有7T磁场价格适中，在1秒检测时间内能够达到120万的检测分辨(m/z 200)，可以稳定的获得未知小分子化合物的分子式。用户能够利用solariX 2XR质谱获得1千万以上的分辨率，清晰分辨出其他质谱技术无法分辨的质谱峰，可用于进行石油、可溶性有机质、质谱成像、代谢组学及自上而下蛋白质组学等研究领域中的极度复杂样品。/span/pp style="text-align: left "span style="font-family: times new roman "　　在问到对今年的最新产品timsTOF的市场前景预估时，鲁静表示，布鲁克的QTOF具有很多优势，如鉴定的重要指标同位素峰型最为接近真实值。再加上timsTOF融入了最新的捕集IMS技术，已经引起了很多用户的关注，截止目前已经产生了订单。她表示，希望timsTOF能够帮助更多的科研工作者解决分析难题。/span/pp style="text-align: right "span style="font-family: times new roman "仪器信息网编辑：郭浩/span楠br//p

在我国质谱分析事业迅速发展的形势下，中国物理学会质谱分会有机质谱专业委员会与中国分析测试协会将于2009年11月7-9日在北京联合举办《2009年中国有机质谱年会》。会议将邀请著名质谱学专家作大会学术报告，举行分组专题报告和壁报论文展示，交流有机质谱学的最新研究成果及应用经验。会议期间各质谱仪器公司还将介绍新产品、新技术及其应用新进展。为帮助大量初涉质谱分析领域的分析人员提高业务水平，将举办二场免费技术讲座，拟邀请有关专家讲解《质谱在食品安全检测中的应用》及《质谱在药物分析中的应用》。　　一、会议议题　　1. 有机质谱的基础研究及新技术、新进展　　2. 生命科学、医学、药学中的质谱应用研究　　3. 环境科学、农林、化学化工领域的质谱应用研究　　4. 能源、材料领域的质谱应用研究　　5. 食品安全、毒物分析和兴奋剂检测中的质谱应用研究　　二、 大会报告　　在质谱新技术及基础研究、生命科学、医学、药学中的质谱应用研究、以及环境化学、食品安全方面邀请了以下知名专家做大会报告：　　(1) 张玉奎院士, 中科院大连化物所，蛋白质分离鉴定方法进展　　(2) 江桂斌研究员:中科院生态环境研究中心，高分辨色谱-质谱方法在持久性有机污染物分析中的应用　　(3) 刘淑莹研究员：蛋白质中二硫键的质谱分析问题　　(4) 再帕尔研究员：基于RRLC-MS/MS方法的恶性肿瘤的代谢组学研究　　(5) 钟大放研究员：采用UPLC-Q-TOF-MS追踪和鉴定生物样品中的药物代谢产物　　(6) 欧阳正教授：美国普度大学，小质谱的研究现状与未来发展　　(7) 袁谷教授：北京大学，电喷雾质谱鉴定环肽对映体及碎裂机理研究　　(8) 齐飞教授：中国科技大学，同步辐射电离质谱及其应用　　(9) 丁传凡教授：复旦大学，从双曲面电极到平面电极--新型离子阱质谱仪研究　　(10) 聂宗秀研究员：中科院化学所，生物颗粒质谱的研究　　(11) 质谱技术的发展与食品安全，报告人待定　　三、征文要求　　1. 凡未在国内外期刊公开发表或其他重大会议上发表，并与上述议题相关的研究内容或有价值的综述均可投稿。会议论文摘要格式请严格按照《质谱学报》征文要求(见通知附件)。请注明是否同意刊入《质谱学报》增刊。　　会议论文摘要内容应包括论文题目、前言、材料和方法(实验部分)、结果和讨论、主要参考文献、英文论文题目和英文简短摘要，篇幅限于2页 如只刊登中英文摘要，篇幅限于1页。　　为了促进学术交流，一部分论文在会议上口头报告，另一部分论文以壁报形式展出。壁报尺寸：宽80厘米，高110厘米，自行制作。　　2. 征得作者同意的会议论文摘要，将以《质谱学报》2009年增刊的形式发表，收取150元/页的版面费。　　3. 收稿截止日期为2009年9月15日。投稿一律采用电子版，投到质谱学报信箱： jcmss401@163.com。　　来稿请务必注明作者通讯地址、邮编和联系电话，邮件标题注明“2009年中国有机质谱年会参会论文”字样。　　四、青年论坛　　为鼓励青年质谱工作者，大会举办青年论坛并评选优秀论文。参会人员年龄限制在35岁以下(1974年9月15日以后出生，以身份证为准)。参加青年论坛者9月15 日前将稿件全文发到以下邮箱:cjiuli@cau.edu.cn,论文摘要仍发到质谱学报，以便收录到大会论文集(质谱学报增刊)。　　五、报名时间及注意事项　　欲参加本届会议者，请于2009年9月10日以前将会议回执寄给会议联系人，以便会务组安排相关事宜。会议注册费为700元/人，食宿自理。学生参会会务费减半。会议具体地点以及有关事宜详见第三轮通知。　　为更好地组织大会，希望参会人员在9月30日前缴纳会议费 9月30日以后交费者，会议费增加10% 即一般人员会务费770元，学生380元。　　缴费方法：　　(1)从银行汇款：将会议费汇到以下账号:　　户名：中国分析测试协会　　开户行：工商银行北京市阜外大街支行　　帐号： 02000492090249074-57　　行号：492　　(2)从邮局汇款：将会议费寄到:北京市西城区三里河路54号，中国分析测试协会 汪正范收，邮编100045　　汇款注明有机质谱年会 会议费。并注明参会人单位，姓名。　　六、会议初步安排　　大会：11月6日报到，11月7-9为会议报告、学术交流及讲座时间。　　技术讲座：《质谱在食品安全检测中的应用》及《质谱在药物分析中的应用》讲座分别在11月6日及11月10日举办，每个讲座各一天。参加者可于11月5日报到。　　会议地点：北京　　七、会议联系人　　 　　1.李重九，中国农业大学西校区理学院，北京海淀区圆明园西路2号，邮编100193，电话010-62733079，E-mail：cjiuli@cau.edu.cn　　2.胡蓓，中国医学科学院，电话65296573，pei.hu.pumc@gmail.com　　3.乔善义，军事医学科学院，电话 66930634，crbj611202@sina.com　　4.汪福意, 中科院化学所, 电话 62529069，fuyi.wang@iccas.ac.cn　　八、大会支持媒体：仪器信息网 www.instrument.com.cn　　中国分析测试协会 中国物理学会质谱分会 　　2009年8月

肝胆胰恶性肿瘤起病隐匿，导致诊断、治疗延后，影响预后。目前临床使用的血清学标志物灵敏度及特异度仍有待提升。在过去的十年中，免疫治疗的发展改变了癌症的治疗现状。一项使用小鼠模型的研究发现肿瘤可诱导系统免疫功能障碍，且这一障碍可通过肿瘤切除得到逆转。越来越多的证据也提示肿瘤发生发展伴随着系统性免疫紊乱和外周免疫细胞的改变。因此，探测外周血免疫细胞组成变化可能有助于早期发现肝胆胰恶性肿瘤。质谱流式技术(CyTOF)作为新发展起来的检测免疫细胞组成和数量的技术，可获得外周血免疫细胞组成、表型和功能的高维信息。利用质谱流式技术评价外周免疫状态，有望为肿瘤早筛早诊提供全新工具。　　　　近日，浙江大学医学院附属第一医院梁廷波教授团队联合国内14家医院在Gut上在线发表了题为Mass cytometry-based peripheral blood analysis as a novel tool for early detection of solid tumours: a multicentre study的研究成果。该研究基于质谱流式检测外周血细胞组分改变构建了肝癌、胰腺癌筛查模型，取得了优异的肿瘤诊断效能，有望提高相关肿瘤早诊率，进而改善这部分患者的预后情况。　　　　这是一项前瞻性、多中心临床研究，共入组2348名受试者，其中包含肝癌患者790名，肝良性疾病患者341名，胰腺癌患者376名，胰腺良性疾病患者208名，健康受试者633名。采集受试者外周血并进行质谱流式分析，通过来自浙大一院的训练集及随机森林算法完成模型构建，并在内部验证队列和10余家外部验证队列中进行模型效能评价。研究者建立了外周免疫评分PBIScore和联合现有临床肿瘤标志物的整合外周免疫评分iPBIScore。阿里云提供了云计算服务。　　结果显示，基于PBIScore的肝癌诊断模型在训练集、内部验证集、外部验证集的AUC分别达到0.98、0.91、0.85 基于iPBScore的肝癌诊断筛查在训练集、内部验证集、外部验证集点AUC分别达到0.99、0.97、0.96。基于PBIScore的胰腺癌诊断模型在训练集、内部验证集、外部验证集的AUC分别达到0.98、0.89、0.89 基于iPBScore的胰腺癌诊断筛查在训练集、内部验证集、外部验证集点AUC分别达到0.99、0.98、0.97。同时，在肿瘤标志物阴性和极早期肝癌、胰腺癌患者中该模型也保持了很好的检测效能。　　此研究是目前最大规模的基于质谱流式技术评估外周免疫并开发肿瘤诊断方法的研究，在取得优异诊断性能的同时提示，进一步明确了外周免疫细胞亚群的改变可以反映肿瘤发生发展情况。值得一提的是，该研究显示，这一方法有作为泛癌早筛早诊的潜能，将可能在未来健康人体检和肿瘤高危人群筛查中发挥重要作用。　　原文链接：　　https://gut.bmj.com/content/early/2022/09/15/gutjnl-2022-327496

p　　何为非变性质谱?就是选用温和的溶液体系及质谱条件，使蛋白保持在非变性状态下被分析。听到这，有些小伙伴可能会一头雾水：师兄师姐教我处理蛋白质样品的时候，第一步就是要变性啊，怎么现在又不要变性了?/pp　　在通常的蛋白质相关分析中，为了破坏蛋白质的三维立体空间结构，便于酶解等操作，会通过加热或是加入高浓度的变性试剂(如尿素、盐酸胍等)，使蛋白质变性 另外，对于常用的分离手段——反相色谱来讲，其流动相的酸性pH条件与高有机相同样也会使蛋白质变性。当需要对蛋白质中的非共价结合进行研究时，为了避免非共价结合被强烈的变性条件所破坏，则需在非变性的液相-色谱条件下(通常为50mM醋酸铵，pH=7的中性体系)进行研究 另外，对于组成较为复杂的蛋白样品，在非变性条件下分析时，由于体系中质子数减少，所以蛋白电荷态数目也会相应减少，电荷态之间的相互重叠度也会下降，进而减少复杂组分之间的相互影响，从而能够得到复杂蛋白样品中每个组分的分子量信息(图1)。/pp style="TEXT-ALIGN: center"img title="图1_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/56171fe8-be7c-4cc8-a672-814a9fe87e30.jpg"//pp style="TEXT-ALIGN: center"　strong图1/strong 同一样品分别于变性及非变性条件下进行分子量测定的原始谱图/pp　　目前，strong非变性质谱技术主要应用在两个方面/strong：一是strong生物制药领域/strong，通过打开单克隆抗体链间二硫键后在Cys位点上偶联小分子药物(Cys-ADC)的完整分子量分析，此类药物的链间仅靠非共价力结合，故变性条件下各条链会分离，无法测得其完整状态的分子量 另一应用方向为strong研究蛋白质多聚体/strong，非变性条件下不仅可以保持各个亚基间的非共价相互作用，同时由于中性条件更接近生理状态，得到的结果更具意义。/pp　　现在，非变性质谱与氢氘交换、X-ray衍射、核磁共振、冷冻电镜和cross-linking等技术联合使用、互为补充，已经越来越多的被应用在结构生物学、生物医药等领域的研究中。本期文章将会重点介绍非变性质谱在治疗性生物医药制品完整分子量测定中的研究，下期文章将会侧重介绍非变性质谱用于蛋白复合物的研究进展。/ppspan style="COLOR: #002060"strongOrbitrap超高分辨质谱：非变性质谱研究的理想平台/strong/span/pp　　古人云：工欲善其事，必先利其器。要想研究做得好，趁手工具不可少!针对于非变性质谱研究中的需求，我们在Orbitrap质谱平台上对相关参数进行了优化，包括离子源区脱溶剂能量、质量范围的扩展以及高质荷比离子传输效率的优化等，使Orbitrap在固有的高分辨率、高质量精度及高灵敏度基础上，在非变性质谱领域也能有出色表现。/pp style="TEXT-ALIGN: center"img title="图2_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/caeec8f3-896f-4e02-a44a-84aae9ecd287.jpg"//pp style="TEXT-ALIGN: center"　　strong图2/strong Orbitrap质谱平台用于非变性质谱分析/pp　　上文中提到，在生物制药领域中，会通过分子工程设计，在单克隆抗体的特定氨基酸上通过化学反应，偶联上小分子治疗药物，通过单克隆抗体的靶向识别功能将小分子药物精确带至病变细胞处并释放，达到精确给药、减少毒副作用的目的，这类药物被称作抗体药物偶联物(Antibody Drug Conjugates，ADCs)。在这类药物中，通过将单抗链间二硫键打开从而在Cys位点上偶联药物的Cys-ADC，由于其链间仅靠非共价力结合，故需在非变性质谱条件下才能对其完整分子量进行测定(图3)。/pp style="TEXT-ALIGN: center"img title="图3_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/270ff8dd-d5c1-442b-baf1-f287fcb557b9.jpg"//pp style="TEXT-ALIGN: center"　strong　图3/strong Cys-ADC结构示意图/pp style="TEXT-ALIGN: center"　　图4展示了使用非变性质谱平台对Cys-ADC进行完整分子量测量的结果。由图中不难发现，使用体积排阻色谱(SEC)，可以将单克隆抗体与其他杂质分离开，而Orbitrap质谱平台能够得到基线分离、信噪比高的原始谱图。经数据处理软件解卷积处理后，可见偶联了0/2/4/6/8个小分子药物的簇峰分布，符合Cys-ADC的典型分布特征 解卷积后计算所得该ADC的药物/抗体比值(Drug to Antibody Ratio, DAR)，与之前报道过的DAR值相符。/pp style="TEXT-ALIGN: center"img title="图4_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/b494de8a-6ac5-42cf-ad12-d84637e32bef.jpg"//pp style="TEXT-ALIGN: center"　　strong图4 /strong使用非变性质谱平台对Cys-ADC进行完整分子量测量。/pp style="TEXT-ALIGN: center"　　(上)，原始色谱/质谱图 (下)，解卷积后谱图。/pp　　作为对照，在变性条件下也对同一个样品进行了分子量测定(图5)，发现链间的非共价结合在强烈的变性条件下均被破坏，只能观察到部分ADC的分子量信息。该实验进一步说明了在非变性条件下对Cys-ADC进行分子量测定的必要性。/pp style="TEXT-ALIGN: center"img title="图5_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/46b85220-b769-47dc-b534-f92c93b56cff.jpg"//pp style="TEXT-ALIGN: center"　　strong图5/strong 变性质谱条件下对Cys-ADC进行分子量测量。/pp style="TEXT-ALIGN: center"　　(上)，原始色谱/质谱图 (下)，解卷积后谱图。/pp　　对于常见的另外一种ADC——Lys-linked ADC，虽然其小分子药物与单克隆抗体是通过共价键相结合，但偶联上小分子药物后，ADC的复杂度大大增加，此时若在非变性条件下进行分子量测定，可以减少信号之间的干扰，得到更加准确的测量结果(图6)。/pp style="TEXT-ALIGN: center"img title="图6_20170406090915_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/7c9e60f0-f01a-45eb-85eb-f9dceece9c46.jpg"//pp style="TEXT-ALIGN: center"　　▲非变性条件可减少复杂组分间信号重叠/pp style="TEXT-ALIGN: center"img title="非变性2_20170406090518_副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/e634be51-bf68-49f2-b7be-e205227a7242.jpg"//pp style="TEXT-ALIGN: center"　　▲非变性条件下Lys-ADC完整分子量测量结果/pp style="TEXT-ALIGN: center"　　strong图6 /strong使用非变性质谱平台对Lys-ADC进行完整分子量测量。/pp　　strong小结/strong/pp　　本期我们对非变性质谱技术的原理、适用范围进行了介绍，并以Cys-ADC与Lys-ADC样品的完整分子量测量为例展示了该方法的应用，不知道小伙伴们有没有对非变性质谱技术有个初步的了解呢?下期我们将会介绍该技术在蛋白复合物研究中的应用，各位看官走过路过不要错过，我们下期见!/pp　　参考文献/pp　　[1] Dabaene et al., Anal Chem. 2014, Nov 4 86 (21):10674-83./pp /p

2009年中国有机质谱年会(第三轮通知)　　在我国质谱分析事业迅速发展的形势下，中国质谱学会有机质谱专业委员会与中国分析测试协会将于2009年11月7-9日在北京联合举办“2009年中国有机质谱年会”。会议将邀请著名质谱学专家作大会学术报告，举行分组专题报告和壁报论文展示，交流有机质谱学的最新研究成果及应用经验。会议期间各质谱仪器公司还将介绍新产品、新技术及其应用新进展。为帮助大量初涉质谱分析领域的分析人员提高业务水平，将举办二场免费技术讲座，拟邀请有关专家讲解《质谱在食品安全检测中的应用》及《质谱在药物分析中的应用》。　　一、会议议题　　1. 有机质谱的基础研究及新技术、新进展　　2. 生命科学、医学、药学中的质谱应用研究　　3. 环境科学、农林、化学化工领域的质谱应用研究　　4. 能源、材料领域的质谱应用研究　　5. 食品安全、毒物分析和兴奋剂检测中的质谱应用研究　　二、 大会报告　　在质谱新技术及基础研究、生命科学、医学、药学中的质谱应用研究、以及环境化学、食品安全方面邀请了以下知名专家做大会报告：　　(1) 张玉奎院士, 中科院大连化物所，蛋白质分离鉴定方法进展　　(2) 江桂斌研究员:中科院生态环境研究中心，高分辨色谱-质谱方法在持久性有机污染物分析中的应用　　(3) 刘淑莹研究员：蛋白质中二硫键的质谱分析问题　　(4) 再帕尔研究员：基于RRLC-MS/MS方法的恶性肿瘤的代谢组学研究　　(5) 钟大放研究员：采用UPLC-Q-TOF-MS追踪和鉴定生物样品中的药物代谢产物　　(6) 欧阳正教授：美国普度大学，小质谱的研究现状与未来发展　　(7) 袁谷教授：北京大学，电喷雾质谱鉴定环肽对映体及碎裂机理研究　　(8) 齐飞教授：中国科技大学，同步辐射电离质谱及其应用　　(9) 丁传凡教授：复旦大学，从双曲面电极到平面电极--新型离子阱质谱仪研究　　(10) 聂宗秀研究员：中科院化学所，生物颗粒质谱的研究　　(11) 许国旺中国科学院大连化学物理研究所 中国科学院分离分析重点实验室，代谢组学研究对色谱-质谱分析技术的挑战　　(12) 质谱技术的发展与食品安全，报告人待定　　三、 会议论文及青年论坛：详见第二轮通知。　　四、会议日程安排：　　11月5日：参加《质谱在药物分析中的应用》讲座代表报道　　11月6日《质谱在药物分析中的应用》讲座，参会代表报道　　11月7-9日：2009年中国有机质谱年会　　11月10日：《《质谱在食品安全检测中的应用》　　五、会议地点及参会事项　　1.会议地点：北京外研社国际会议中心 地址：北京市大兴区芦城工业开发区(见附件)　　2.乘车路线：　　(1)北京西站(火车站西天桥出站)：937支线——郝庄子下车(外研社国际会议中心)　　(2)北京站：乘地铁到“南礼士路”，换乘937支线至”“郝庄子”下车(外研社国际会议中心)　　(3).首都机场：乘机场大巴7线到北京西站南广场(中盐大厦)，在莲花池乘340路车至“岔路口”站下车，换乘937支线至“郝庄子”下车(外研社国际会议)　　(4)乘出租(见附图)　　为了方便代表参会，在11月5日、6日早10时、14时、20时分别在北京西站、北京站和中盐大厦接站 请参会代表订购机票或火车票时选择合适的车次及抵京时间。建议同一地区的代表集体抵京，组委会可专车接站。　　3.会议注册：会议注册费为700元/人，食宿自理。学生参会会务费减半。学生注册请带身份证、学生证，及学生证复印件。　　为更好地组织大会，希望参会人员在10月30日前缴纳会议费 10月30日以后交费者，会议费增加10% 即一般人员会务费770元，学生380元。　　缴费方法：　　(1)从银行汇款：将会议费汇到以下账号:　　户名：中国分析测试协会　　开户行：工商银行北京市阜外大街支行　　帐号： 02000492090249074-57　　行号：492　　(2)从邮局汇款：将会议费寄到:北京市西城区三里河路54号，中国分析测试协会 汪正范收，邮编100045　　汇款注明有机质谱年会 会议费。并注明参会人单位，姓名。　　4.客房预定：由于会议中心远离北京市区，大会组委会为代表预定的客房有3种：标准间，300元(2人)/天 公寓式2室一厅，200元(2人)/天，公寓式3室一厅255元(3人)/天。各位代表客根据自己的情况提前订房，填写订房回执，用电子邮件或传真在10月26日前发给国际会展中心齐岚女士。　　六、会议联系人　　1.李重九，中国农业大学西校区理学院，北京海淀区圆明园西路2号，邮编100193，电话010-62733079，E-mail：cjiuli@cau.edu.cn　　2.胡蓓，中国医学科学院，电话65296573，pei.hu.pumc@gmail.com　　3.乔善义，军事医学科学院，电话 66930634，crbj611202@sina.com　　4.汪福意, 中科院化学所, 电话 62529069，fuyi.wang@iccas.ac.cn　　5.齐岚,外研社国际会议中心，电话:010-61207838 ，qilan5588@sina.com　　七、大会支持媒体：仪器信息网 www.instrument.com.cn　　中国分析测试协会 中国物理学会质谱分会　　2009年10月客房预定回执姓名性别工作单位及通讯地址电话和E-mail标准间二室一厅三室一厅 入住日期 　　回执请发给齐岚,外研社国际会议中心，电话:010-61207838 ，qilan5588@sina.com

复旦大学附属中山医院检验科郭玮教授团队开发了三合一肾素-血管紧张素-醛固酮系统（Renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）激素质谱检测方法，有效简化了RAAS激素的检测流程，在保证检测准确性的前提下显著降低成本，具有重要的临床应用价值。该成果发表于国际期刊《Journal of Chromatography B》 [1] ，受到业内广泛关注。RAAS激素检测的临床意义RAAS由一系列激素及相应酶组成，在调节人体血压、水、电解质平衡，维持人体内环境稳定中发挥重要作用。其中肾素作为一种酶直接催化血管紧张素原向血管紧张素I转化，临床中常用的肾素活性即为血管紧张素I的生成速率。RAAS激素水平的变化对多种高血压综合征具有关键的指示作用，尤其是原发性醛固酮增多症（也被称为原醛）。原醛是由肾上腺皮质肿瘤或增生等病变引起的醛固酮自主分泌过多，导致潴钠排钾和体液容量扩张的一种综合征，也是临床上最常见的继发性高血压病因之一。原醛在新诊断高血压中的发生率超过4.0%，在难治性高血压人群中占比更高达17-23% [2] 。图1 肾素-血管紧张素-醛固酮系统原醛患者多以高血压起病，而普通降压药物往往效果不佳，手术或盐皮质激素受体拮抗剂药物才是原醛患者的有效治疗方式。此外，原醛诊断和治疗的延误会增加高血压靶器官并发症的发生风险，研究发现过量醛固酮会增加代谢综合征和心脏重塑风险。因此，对高血压特别是难治性高血压及新诊断高血压人群进行RAAS激素筛查，对高血压精准诊疗有着现实的指导意义，国内外原醛的诊疗指南均将RAAS激素的检测作为重要的筛查、诊断和定位手段 [2] 。精益求精——从逐一击破到一网打尽中山医院检验科利用质谱平台的高敏感性和高特异性，分别开发了血浆醛固酮、肾素活性(即检测血管紧张素I的生成速率)、血管紧张素II的质谱检测方法，在实际应用中得到临床广泛好评，但是上述三种激素的分开检测导致了较高的检测成本和繁琐的工作流程。为了优化RAAS激素检测，中山医院质谱团队利用多种酶抑制剂共同作用，升级开发了三合一RAAS激素检测方法。该方法只需经过一次样本前处理，便可同时准确定量检测醛固酮、肾素活性和血管紧张素II。三合一RAAS激素检测三合一RAAS激素检测方法采用离子源正负离子切换模式，同时兼顾了三种不同类型化合物的不同电离模式，从而获得较优响应。该检测方法具有以下优势：更经济：减少固相萃取板的用量，减少操作人员数量，直接降低耗材和人员成本。更方便：检测三种激素只需一次样品前处理，简化操作流程，也减少了样本用量。更快速：仪器检测一个样本只需5 mins，同时得到醛固酮、肾素活性和血管紧张素II的检测结果，提高了分析通量。更稳定：全新设计的孵育体系，确保实验结果的准确性。三种激素同时检测，简化流程，减少了人为影响因素，有利于方法的稳定性。图2 血管紧张素I、血管紧张素II和醛固酮色谱图复旦大学附属中山医院检验科遵循以患者为中心，以临床需求为导向的原则，依托LC-MS（液相色谱-质谱）技术平台，在类固醇激素、儿茶酚胺类激素、治疗药物监测等检测项目的研发与临床转化上，取得了大量的实践经验和成果。本实验室的RAAS激素质谱检测是实验室自建方法（Laboratory developed tests, LDT）的典型代表。LDT项目具有极高的灵活性，并且具有自我更新迭代的巨大优势。在临床不断增加的新需求面前，LDT作为常规商品化检测项目的有益补充，发挥着越来越重要的作用。中山质谱团队将一如既往地利用好质谱LDT的诸多优势，精益求精，不断创新，致力于让临床在准确结果前满意，患者从技术创新中受益。

沃特世公司（纽约证券交易所代码：WAT）近日在北京成功举办了以“质谱技术在蛋白表征及高级结构中应用”为主题的技术研讨会，吸引了60余位来自国家蛋白质组中心、中国食品药品检定研究院、中国科学院、清华大学、北京大学、军事医学科学院、中国农业科学院等知名高校、科研院所、分析测试平台及生物制药企业等相关领域的研究人员参加了会议。 研讨会的主旨为 “提升国内蛋白表征领域对蛋白高级结构研究的认知”，涵盖三大议题：蛋白药物深度结构表征所需要的质谱技术与生物信息学软件、氢氘交换（HDX）技术及IMS在结构生物学特别是表位学研究、蛋白质相互作用研究领域的最新进展及SONAR技术在蛋白质鉴定和非标记定量蛋白质组学研究中的进展。 会上国际知名学者、日本大阪大学副教授Susumu Uchiyama博士指出，氢氘交换质谱（HDX MS）逐渐成为蛋白质高级结构研究不可或缺的技术，并介绍了氢氘交换质谱技术及其在表位学和蛋白相互作用研究上的具体应用 。同时对其最近发表在Nature Communication上的题为《Haem-dependent dimerization of PGRMC1/sigma-2 receptor facilitates cancer proliferation and chemoresistance》论文的研究成果进行了汇报，获得了与会科研学者的一致高度评价。 日本大阪大学副教授Susumu Uchiyama博士做大会报告 沃特世（Waters）总部制药业务部高级市场拓展经理Asish Chakraborty博士对生物制药行业普遍关注的宿主蛋白残余测定进行了报告演讲，并介绍了使用通用型UPLC/MS分析对生物治疗性蛋白质中的HCP进行全面鉴定和定量。此分析方法采用在线二维液相色谱法分离多肽，然后利用高分辨率、高质量准确度的质谱仪进行蛋白质鉴定和定量。另外，Chakraborty博士对当前氢氘交换质谱方案的新进展也作了更新介绍。 沃特世公司总部Asish Chakraborty博士做大会报告 来自沃特世亚太区的高级科学家陈熙博士作了题为“非变性质谱技术及IMS行波离子淌度质谱技术在蛋白质高级结构研究上的应用进展”的精彩报告，介绍了行波离子淌度高分辨质谱技术在生物药分析上的最新应用进展，成熟的行波离子淌度分离技术为常规高分辨质谱增加了更多一个维度的分离能力，在蛋白质药物常规结构表征如二硫键错配、氢-氘交换质谱技术进行蛋白质药物高级结构和动态变化研究以及HCP(宿主细胞蛋白)残留的鉴定和定量上发挥着重要作用。 沃特世亚太区高级科学家陈熙博士做大会报告 沃特世中国应用科学家殷薛飞博士作了 “最新DIA质谱技术-SONAR在非标记定量蛋白质组学研究中的应用”的报告。殷博士介绍的 SONAR数据采集模式于今年9月发布，科学家们只需执行一次进样即可完成更准确的定性和定量分析，对复杂样品中脂质、代谢物和蛋白质的定量和鉴定，可免去采用MS/MS方法分析时通常需要额外进行方法开发的麻烦。 大会还邀请了来自美国Genentech的蛋白质化学部科学家甘雨田博士分享了她运用蛋白质组学思路进行生物药物研究开发的思路与实践，甘博士还介绍了她今年8月发表于Nature Biotechnology上的ISDetect快速自动蛋白末端质谱检测法，引起与会人员的强烈兴趣。 会议最后 ，沃特世中国生物制药高级经理宋兰坤女士作了“LC/MS平台化方案助力生物药研究开发”的报告，并对会议进行了总结。宋经理说：“质谱技术是蛋白质研究中不可取代的工具，其在蛋白质常规表征及高级结构研究中均有很好的应用方案及研究文献, 为揭示生命科学的奥秘发挥着越来越重要的作用。作为全球生物制药领域解决方案顶尖供应商，沃特世公司为生物药物产业界及蛋白质研究相关科学领域提供先进的仪器和技术。希望本次会议的议题可以激发与启迪科研工作者的思路，为生物药物产业的从业人员搭建一个学术讨论与经验分享的平台。 会议同期展出的蛋白科学研究先进生物技术墙报

2014年11月21日，上海——科学服务领域的世界领导者赛默飞世尔科技（以下简称：赛默飞）于12月15日在上海张江举办了2014生物制药质谱分析技术进展研讨会。会议共有来自相关行业的60多位客户参加。通过多个质谱技术应用报告，与会者系统而简明地了解了质谱在蛋白类药物质量分析中的基本应用和最新进展。 2014年10月29日, 国家食品药品监督管理总局药品审评中心发布《生物类似药研发与评价技术指导原则(征求意见稿)》。这份文件标志着国家生物大分子药物产业即将进入全新阶段。在此份文件中，首次明确了对生物类似药物序列、修饰及其它结构信息分析的必须性，高分辨质谱已经成为不可或缺的分析手段。基于此本次研讨会通过“蛋白类药物质谱表征的一般分析流程”、“高分辨质谱用于大、小分子药物定量”、“蛋白类药物质谱分析的难点及应对方法”三个主题，由面到点地介绍了Orbitrap在蛋白类药物完整分子量测定、肽图、电荷异质性、寡糖、二硫键、代谢定量、高级结构分析方面的基本应用及最新进展。此外，会议还就2014年最新进展——如何使用HDX（氢氘交换技术）进行ADC（Antibody Drug Conjugates）药物结构变化研究进行了讲解。研讨会精炼并具有时效的报告内容获得了参会嘉宾的一直好评。此外，在此次研讨会中，通过与多位的质量分析主管的深入讨论，赛默飞质谱应用团队初步确定了将在2015年与业内领先的企业及研究单位深度合作，开展包括ADC、HCP等多个难点分析项目的应用技术开发。 应用专家介绍高分辨质谱用于大、小分子药物定量分析 ----------------------------------------------------------------------关于赛默飞世尔科技赛默飞世尔科技（纽约证交所代码：TMO）是科学服务领域的世界领导者。公司年销售额170亿美元，在50个国家拥有员工约50,000人。我们的使命是帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。我们的产品和服务帮助客户加速生命科学领域的研究、解决在分析领域所遇到的复杂问题与挑战，促进医疗诊断发展、提高实验室生产力。借助于Thermo Scientific、Life Technologies、Fisher Scientific和Unity? Lab Services四个首要品牌，我们将创新技术、便捷采购方案和实验室运营管理的整体解决方案相结合，为客户、股东和员工创造价值。欲了解更多信息，请浏览公司网站：www.thermofisher.com 赛默飞世尔科技中国赛默飞世尔科技进入中国发展已有30多年，在中国的总部设于上海，并在北京、广州、香港、台湾、成都、沈阳、西安、南京、武汉等地设立了分公司，员工人数超过3800名。我们的产品主要包括分析仪器、实验室设备、试剂、耗材和软件等，提供实验室综合解决方案，为各行各业的客户服务。为了满足中国市场的需求，现有8家工厂分别在上海、北京和苏州运营。我们在全国共设立了6个应用开发中心，将世界级的前沿技术和产品带给国内客户，并提供应用开发与培训等多项服务；位于上海的中国创新中心结合国内市场的需求和国外先进技术，研发适合中国的技术和产品；我们拥有遍布全国的维修服务网点和特别成立的中国技术培训团队，在全国有超过2000名专业人员直接为客户提供服务。我们致力于帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。欲了解更多信息，请登录网站www.thermofisher.cn

2014年12月15日，上海——科学服务领域的世界领导者赛默飞世尔科技（以下简称：赛默飞）于12月15日在上海张江举办了2014生物制药质谱分析技术进展研讨会。会议共有来自相关行业的60多位客户参加。通过多个质谱技术应用报告，与会者系统而简明地了解了质谱在蛋白类药物质量分析中的基本应用和最新进展。 2014年10月29日, 国家食品药品监督管理总局药品审评中心发布《生物类似药研发与评价技术指导原则(征求意见稿)》。这份文件标志着国家生物大分子药物产业即将进入全新阶段。在此份文件中，首次明确了对生物类似药物序列、修饰及其它结构信息分析的必须性，高分辨质谱已经成为不可或缺的分析手段。基于此本次研讨会通过“蛋白类药物质谱表征的一般分析流程”、“高分辨质谱用于大、小分子药物定量”、“蛋白类药物质谱分析的难点及应对方法”三个主题，由面到点地介绍了Orbitrap在蛋白类药物完整分子量测定、肽图、电荷异质性、寡糖、二硫键、代谢定量、高级结构分析方面的基本应用及最新进展。此外，会议还就2014年最新进展——如何使用HDX（氢氘交换技术）进行ADC（Antibody Drug Conjugates）药物结构变化研究进行了讲解。研讨会精炼并具有时效的报告内容获得了参会嘉宾的一直好评。此外，在此次研讨会中，通过与多位的质量分析主管的深入讨论，赛默飞质谱应用团队初步确定了将在2015年与业内领先的企业及研究单位深度合作，开展包括ADC、HCP等多个难点分析项目的应用技术开发。 应用专家介绍高分辨质谱用于大、小分子药物定量分析 会议期间的抽奖活动 ------------------------------------------------------------关于赛默飞世尔科技赛默飞世尔科技（纽约证交所代码：TMO）是科学服务领域的世界领导者。公司年销售额170亿美元，在50个国家拥有员工约50,000人。我们的使命是帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。我们的产品和服务帮助客户加速生命科学领域的研究、解决在分析领域所遇到的复杂问题与挑战，促进医疗诊断发展、提高实验室生产力。借助于Thermo Scientific、Life Technologies、Fisher Scientific和Unity? Lab Services四个首要品牌，我们将创新技术、便捷采购方案和实验室运营管理的整体解决方案相结合，为客户、股东和员工创造价值。欲了解更多信息，请浏览公司网站：www.thermofisher.com 赛默飞世尔科技中国赛默飞世尔科技进入中国发展已有30多年，在中国的总部设于上海，并在北京、广州、香港、台湾、成都、沈阳、西安、南京、武汉等地设立了分公司，员工人数超过3800名。我们的产品主要包括分析仪器、实验室设备、试剂、耗材和软件等，提供实验室综合解决方案，为各行各业的客户服务。为了满足中国市场的需求，现有8家工厂分别在上海、北京和苏州运营。我们在全国共设立了6个应用开发中心，将世界级的前沿技术和产品带给国内客户，并提供应用开发与培训等多项服务；位于上海的中国创新中心结合国内市场的需求和国外先进技术，研发适合中国的技术和产品；我们拥有遍布全国的维修服务网点和特别成立的中国技术培训团队，在全国有超过2000名专业人员直接为客户提供服务。我们致力于帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。欲了解更多信息，请登录网站www.thermofisher.cn

p　　现代生物学研究已经不再停留在仅从组织中识别一种特殊的化学成分，或者蛋白成分上了，我们需要精确的了解这些物质是如何分布，如何构成的，解答这些问题需要更进一步的实验技术，比如免疫组化或免疫荧光检测方法，但是这些技术需要特殊的抗体，而且效率低，偏差大。/pp　　因此研究人员将目光转向了质谱技术上，以质谱为基础的成像方法不局限于特异的一种或者几种蛋白质分子，可在组织切片中找到每一种蛋白质分子，并提供这些蛋白质分子在组织中的空间分布的精确信息，而事先无需知道所检测蛋白的信息，不需要对待测物进行标记，分析物可以其最初的形态被检测，同时可对这些蛋白质分子含量进行相对定量，适用于研究生物分子的反应。/pp　　质谱成像(Imaging Mass Spectrometry,IMS)这种最新原位分析技术主要是利用质谱直接扫描生物样品，分析分子在细胞或组织中的 “结构、空间与时间分布”信息。其基本流程(以质谱分析生物组织标记物为例)见下：/pp style="text-align: center "img title="9a504fc2d56285350618456392ef76c6a6ef63fc.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201708/insimg/640b0273-3ad1-4c6a-b6bf-22df33199709.jpg"//pp　　简单而言，质谱成像技术就是借助于质谱的方法，再配套上专门的质谱成像软件控制下，使用一台通过测定质荷比来分析生物分子的标准分子量的质谱仪来完成的。但是随着这项技术的不断发展，也陆续出现了许多针对各种问题的新技术。/pp　　最早的质谱成像技术是基质辅助激光解吸电离(MALDI，matrix assisted laser desorption ionization)质谱分子成像技术，由范德堡大学(VanderbiltUniversity)的Richard Caprioli等在1997年提出，他们通过将MALDI质谱离子扫描技术与专业图像处理软件结合，直接分析生物组织切片，产生任意指定质荷比(m/z)化合物的二维离子密度图，对组织中化合物的组成、相对丰度及分布情况进行高通量、全面、快速的分析，可通过所获得的潜在的生物标志物的空间分布以及目标组织中候选药物的分布信息，来进行生物标志物的发现和化合物的监控。/pp　　正如数字图像包括三个通道：红、绿、蓝一样(单个亮度定义了每个像素的颜色)，质谱成像也包含了数以千计的通道，每一个对应于一个特殊的光谱峰值，“你可以通过质谱方法从这些像素中获得任何信号，然后调整图像中所需分子像素的相对亮度，最后得到一张分子特异性的成像图。”/pp　　这种方法可用于小分子代谢物、药物化合物、脂质和蛋白，而且质谱成像能相对快速的利用许多分子通道，完全无需特殊抗体。下面列出五种先进的质谱成像方法。/pp　　strongI. 挑战高分子量蛋白——MALDI质谱分子成像技术/strong/pp　　在对组织或生物体进行成像，分析小分子构成的时候，有一个“拦路虎”总是阻碍实验的进程，那就是多肽，这些多肽体积十分大，要想对它们进行分子成像几乎是不可能的，比如想要研究肿瘤边缘的分子微环境，如果直接成像是不可能获得清晰图像的。/pp　　来自范德堡大学的质谱方法专家Richard Caprioli博士因此发明了基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱分子成像技术，这项技术不局限于特异的一种或者几种蛋白质分子，它可在组织切片中找到每一种蛋白质分子，并提供这些蛋白质分子在组织中的空间分布的精确信息，而事先无需知道所检测蛋白的信息，同时可对这些蛋白质分子含量进行相对定量。/pp　　MALDI 质谱分子成像是在专门的质谱成像软件控制下，使用一台通过测定质荷比来分析生物分子的标准分子量的质谱仪来完成的。被用来研究的组织首先经过冰冻切片来获得极薄的组织片，接着用基质封闭组织切片并将切片置入质谱仪的靶上。通过计算机屏幕观察样品，利用MALDI 系统的质谱成像软件，选择拟成像部分，首先定义图像的尺寸，根据尺寸大小将图像均分为若干点组成的二维点阵，来确定激光点轰击的间距。激光束通过这个光栅图案照射到靶盘上的组织切片，软件控制开始采集质谱数据，在质谱仪中，激光束对组织切片进行连续的扫描，组织样品在激光束的激发下释放出的分子被质谱仪所鉴定从而获得样品上每个点的质荷比(m/ z)信息，然后将各个点的分子量信息转化为照片上的像素点。在每个点上，所有质谱数据经平均化处理获得一幅代表该区域内化合物分布情况的完整质谱图。仪器逐步采集组织切片的质谱数据，最后得到具有空间信息的整套组织切片的质谱数据。这样就可以完成对组织样品的“分子成像”。设定m/ z 的范围，即可确定该组织区域所含生物分子的种类，并选定峰高或者峰面积来代表生物分子的相对丰度。图像中的彩色斑点代表化合物的定位，每个斑点颜色的深浅与激光在每一个点或像素上检测到的信号大小相关。/pp　　通过增加单位面积上轰击的激光点数量和像素，研究人员可以获得更多的样品信息，例如采用4000 像素比200 像素能够得到更好的样品图像。质谱分子成像技术是一种半定量或相对定量技术，图像上颜色深的部分表明有更多的生物分子聚集在组织的这个部分。然而，不可能据此确定生物分子在组织的不同部位的实际绝对含量。选择组织图像上的任意一个斑点，图像都能够给出一个质谱谱图或者离子谱图，代表在组织的该部位存在这种生物分子，然后与做指纹图谱类似，像做指纹图谱那样，将样品的离子谱图与已知标准品进行对照，分析差异，从而进行生物标志物的发现和药物作用的监控。/pp　　strongⅡ. 无需样品处理 实时成像——电喷雾电离技术/strong/pp　　一般质谱成像方法由于体积庞大，重量重，需要冗长的样品准备阶段，因此并不适用于即时成像(bedside applications)，比如说要帮助外科医生进行实时的肿瘤边界成像监控，那么就要寻找新的方法了。/pp　　一种称为电喷雾电离技术(desorption electrospray ionization，DESI)的MS成像技术解决了这个问题。DESI技术于2004年首次提出，由于这一方法具有样品无需前处理就可以在常压条件下，从各种载物表面直接分析固相或凝固相样品等优势而得到了迅速的发展。/pp　　这种方法的原理是带电液滴蒸发，液滴变小，液滴表面相斥的静电荷密度增大。当液滴蒸发到某一程度，液滴表面的库仑斥力使液滴爆炸。产生的小带电液滴继续此过程。随着液滴的水分子逐渐蒸发，就可获得自由徘徊的质子化和去质子化的蛋白分子DESI与另外一种离子源：SIMS(二次离子质谱)有些相似，只是前者能在大气压下游离化，发明这项技术的普渡大学Cooks博士认为DESI方法其实就是一种抽取方法，即利用快速带电可溶微粒(比如水或者乙腈acetonitrile)进行离子化，然后冲击样品，获得分析物的方法。/pp　　DESI系列产品最大的优势就在于无需样品处理，一般质谱和高效液相色谱分析，样品必须经过特殊的分离流程才能够进行分析检测，使得一次样品检测常常需要约一个小时，而DESI系列产品可将固体样品直接送入质谱,溶液被喷射到检测表面,促使样品离子均匀分布。采用这一手段的质谱分离过程，只需3分钟左右即可完成。/pp　　strongⅢ. 活体成像——APIR MALDI/LAESI技术/strong/pp　　了解细胞的内部成分是理解健康细胞不同于病变细胞的关键。但是直到目前为止，唯一的方法是观察单个细胞的内部，然后将其从动物或植物中移除，或者改变细胞的生存环境。但是这么做的话，会使细胞发生变化。科学家还不是很清楚一个细胞在病变时与健康细胞的差别，或者当它们从一个环境移到另一个环境中产生的变化。/pp　　来自华盛顿大学Akos Vertes教授希望能从另外一个方面来进行活细胞分析，在他的一项关于活叶样品中初级和次级代谢产物分布的研究中，研究人员发现叶片中积累基质很厚，常导致光谱末端低分子量部分模糊，而且基质辅助激光解析电离(MALDI)质谱分析需要在真空中进行，但活体样本在真空中无法存活。/pp　　实际上，MALDI质谱分析的原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。而生物样品也可以直接吸收能量的，比如2.94mm波长的光能激活水中氢氧键。/pp　　因此Vertes等人想到复合两种技术来解决这一问题。首先他们利用大气压红外线(an atmospheric pressure infrared，APIR)MALDI激光直接激活组织中的水分，使样品气化，就像是组织表面发生了细胞大小的核爆炸，从而获得了离子化微粒，进入质谱中进行分析。但是并不是所有的气化微粒都带电，大部分其实是不带电的，会被APIR MALDI遗漏。/pp　　为了捕捉这些中性粒子，Vertes等人采用了第二种方法：LAESI (laser ablation electrospray ionization，激光烧蚀电喷雾电离)，这种方法能捕捉大量带电微滴的微粒，然后重新电离化。通过对整个样品进行处理，复合这两种方法，就能覆盖更多的分子，分析质量更高。/pp　　与一般质谱成像过程不同，Verte的方法还在成像中增加了高度，从而实现了3D代谢物成像。这项技术的分辨率是直径10mm，高度30mm，这与生物天然的立体像素相吻合，这样科学家们就可以获得天然构像。/pp　　strongⅣ. 3D成像——二次离子质谱技术/strong/pp　　质谱成像技术能将基质辅助激光解吸电离质谱的离子扫描与图像重建技术结合，直接分析生物组织切片，产生任意质荷比(m/z)化合物的二维或三维分布图。其中三维成像图是由获得的质谱数据，通过质谱数据分析处理软件自动标峰，并生成该切片的全部峰值列表文件，然后成像软件读取峰值列表文件，给出每个质荷比在全部质谱图中的命中次数，再根据峰值列表文件对应的点阵坐标绘出该峰的分布图。/pp　　但是一般的质谱成像技术不能对一些携带大分子碎片的化学成分进行成像，来自宾夕法尼亚州州立大学的Nicholas Winograd教授改进了一种称为二次离子质谱(SIMS，secondary ion mass spectrometry)的方法，可以对样品进行完整扫描，三维成像。/pp　　SIMS早在用于生物学研究之前就已经应用广泛了，比如分析集成电路(integrated circuits)中的化学成分，这种质谱技术是表面分析的有利工具，能检测出微小区域内的微量成分，具有能进行杂质深度剖析和各种元素在微区范围内同位素丰度比的测量能力。/pp　　这种技术具有几个优点：速度快(-10,000 spectra per second)，亚细胞构造分辨率(-100 nm)，以及不需要基质。但是另外一方面，不同于MALDI方法，SIMS方面不是一种“软”技术，这种方法只能对小分子成像，因此常常需要进行粉碎。/pp　　Winograd教授改进了这一方法，他利用了一种新型SIMS光束(carbon-60 磁性球)，这种新光束比传统的SIMS光束对物体的化学损伤更小。C60同时撞击样品表面，类似于“一阵爆炸”，这样重复的轰击使得研究人员能深入样品，进行三维分子成像，Winograd教授称这个过程是“分子深度成像”(molecular depth profiling)。/pp　　C60的能量与其它的离子束相当，却不到达样品表面以下，这样样品可以连续地被逐层剥离，研究人员就可以得到纵面图形，最终获得三维的分子影像。Winograd教授等人用含有肽的糖溶液将硅的薄片包裹起来并进行SIMS实验，随着薄膜逐渐被C60剥蚀，可以获得糖和肽的稳态信号。最终，薄膜完全剥离后就可以获得硅的信号。如果用其它的射线或原子离子代替C60 ，粒子束会快速穿过肽膜而无法提供有关生物分子的信息。因此这种方法具有良好的空间分辨率，能够获得巨噬细胞和星型细胞的细胞特征和分析物的分布情况。/pp　　这里还要说到一点，SIMS和上一技术(APIR MALDI/LAESI技术)都可以对三维成像，但两者也有差别，SIMS方法中，采用高能离子轰击样品，逐出分析物离子(二级离子)，离子再进入质量分析器。MALDI方法则用激光辐射样品使之离子化，另外SIMS探针可以探测到100nm的深度，能提供纳米级的分辨率，而MALDI可以探测更深，但空间分辨率较低。/pp　strong　Ⅴ. 高灵敏度 高分辨率——纳米结构启动质谱技术/strong/pp　　质谱在检测生物分子方面有很大潜力，但现有方法仍存在一些缺陷，灵敏度不够高和需要基质分子促使分析对象发生离子化就是其中之二。比如说，需要溶解或者固定在基质上的方法检测代谢物，较易错判，因为这些代谢物与那些基质常常看上去都一样。另外基于固定物基质的系统也不允许研究人员精确的判断出样品中某一分子到底来自于哪儿。/pp　　来自斯克利普斯研究院的Gary Siuzdak博士发明了一种称为纳米结构启动质谱(nanostructure-initiator mass spectrometry，NIMS)的新技术，这种技术能以极高的灵敏度分析非常小的区域，从而允许对肽阵列、血液、尿和单个细胞进行分析，而且还能用于组织成像。/pp　　NIMS利用了一种特制的表面，这种多孔硅表面上聚集了一种含氟聚合物，这些分子在受到激光或离子束照射时会猛烈爆发，这种爆发释放出离子化的分析物分子，它们被吸收到表面上，使其能够被检测到。这种方法利用激光或离子束来从纳米尺度的小囊中气化材料，从而克服了一般质谱方法缺少所需的灵敏度和需要基质分子促使分析对象发生离子化的缺陷。/pp　　通过这种方法可以分析很多类型的小分子，比如脂质，糖类，以及类固醇，虽然每一种分析材料需要的含氟聚合物有少许差别，但是这是一种一步法的方法，比MALDI简单多了——后者需要固定组织，并添加基质。/pp　　由于含氟聚合物不能很好的离子化，因此会发生轻微的光谱干扰，而且由于离子化过程是“软性”的——就像MALDI，所以NIMS产生的生物分子是整块离子化，而不是片段离子化。不过这种技术对于完整蛋白的检测灵敏度没有MALDI高。/pp /pp /p

&ldquo 奶粉疑致婴儿性早熟事件&rdquo 引起众多消费者的关注，据有关专家介绍，现代牛奶中的雌激素包括内源性雌激素（即奶牛本身产生的雌激素）和外源性雌激素（即应用于奶牛发情和泌乳的雌激素），但目前普遍认为在规范用药的前提下雌激素药物残留量可忽略不计。&ldquo 所谓的不允许检出雌激素是指不能检出人为添加的合成雌激素物质。&rdquo 上海安谱公司根据SN/T1744-2006《进出口动物饲料中己烷雌酚、己烯雌酚、双烯雌酚残留量的检验方法&mdash &mdash 气相色谱串联质谱法》，对动物饲料中的人工合成激素己烷雌酚、己烯雌酚、双烯雌酚残留进行检测以降低外源性雌激素污染的风险。 产品信息请下载: 《进出口动物饲料中己烷雌酚、己烯雌酚、双烯雌酚残留量的检验方法&mdash &mdash 气相色谱串联质谱法》相关耗材如需咨询、订购以及查询更多产品，请联系：上海安谱 021-54890099了解详情请进入安谱公司网站 http://www.anpel.com.cn/

美国疾病控制和预防中心的研究人员已经开发一种检测新生儿高同型半胱氨酸血症的方法，这是一种常被常规新生儿筛查测试忽略的病症，可能导致永久性损害或死亡。在上周发表在 Clinical Chemistry 杂志上的一项研究中描述该测试时，作者指出，高同型半胱氨酸血症影响到婴儿代谢蛋氨酸的能力，导致蛋氨酸和另一种生物标记物——同型半胱氨酸的水平升高。此外，它还会引起眼部和骨骼问题、智力缺陷和血管异常等问题。 传统的病症筛查方法使用的是以蛋氨酸为生物标记物的多重快速流注分析质谱（FIA-MS/MS）测试，但这种方法通常在新生儿筛查时蛋氨酸水平仍然较低。该测试可以检测到该病症但常常会漏诊。 该试验中引入了还原步骤以及使同型半胱氨酸灵敏度提高的衍生化步骤，使得新测试方法可以更准确地检测到高同型半胱氨酸血症，而不受其他生物标记物的影响。该测试可以无缝集成到现有和未来的一级新生儿筛查测试中，具有实际应用价值。 此测试是第一种能在常规的FIA-MS/MS新生儿筛查测试中实现同型半胱氨酸多重定量的测试方法。此前的属于二级筛查，总同型半胱氨酸进行分离、质谱分析，时间较长，并且比FIA-MS/MS测试使用频率低。该试验可能会漏诊低蛋氨酸水平下的同型半胱氨酸血症患儿，因此一般将其作为第二级筛查生物标记物，但有时在新生儿出生后两天内采集的血液样本中蛋氨酸水平还不够高会导致漏诊。同型半胱氨酸更加接近同型半胱氨酸血症代谢途径并且在受影响的新生儿身上更早出现，而且不受管路喂养的影响，因此可以提高新生儿筛查的准确性。 该试验被测试在152位临床标本中，其中有100个被判定为健康样本，50个是在医院接受管路营养治疗的婴儿样本，以及2个被诊断为同型半胱氨酸血症样本，测试结果准确无误。 测试方法可集成现有和未来的一级新生儿筛查测试中，成本低，具有实际应用价值。只需在现有筛查测试中添加额外的化学物质即可无缝集成。该方法需要进一步测试、验证并取得监管批准后方可大规模使用。 研究人员还计划将其他两个生物标记物引入测试中，以区分同型半胱氨酸血症和其他疾病。此外，该测试方法可以为检测使用总同型半胱氨酸作为生物标记的其他罕见代谢性疾病打开大门。在新生儿筛查中，检测其他与同型半胱氨酸水平相关的疾病也被提出作为一种选择。 总之，该测试方法为早期检测同型半胱氨酸血症提供了一种更准确、更快速和更经济的方法。研究人员表示，该方法的适用范围不仅限于CDC实验室，其他新生儿筛查实验室也可以采用该方法，并且这种化学物质成本较低，便于实际应用。 研究人员表示，该测试方法具有重要的临床意义和应用前景。在医学实践中，检测同型半胱氨酸血症很重要，因为它是一种罕见但可能会引起永久性损伤或死亡的疾病。如今，通过该测试方法，新生儿可以接受更及时、更准确的筛查，以确保他们的健康和幸福。此外，这种测试方法还可以进一步提高新生儿筛查的准确性，为其他代谢性疾病的早期筛查提供参考和借鉴。 然而，该测试方法并非百分之百准确，仍存在漏诊和误诊的风险。因此，在实践中，研究人员建议采用多种测试方法相结合的筛查方法，从而最大程度地减少漏诊和误诊的风险。 总之，对于新生儿来说，早期筛查是非常重要的，因为许多疾病在早期就可以通过筛查被发现和治疗，避免造成长期的不可逆损伤。而这项新的同型半胱氨酸血症测试方法的出现，将有助于提高新生儿筛查的准确性和效率，为新生儿健康保驾护航。 研究人员表示，该测试方法是基于最新技术的成果，并得到了现代技术的支持。基于这个方法，他们也在尝试开发其他新的测试方法，以提高新生儿筛查的准确性和覆盖面。同时，他们还将继续研究同型半胱氨酸血症的治疗方法，为患者提供更好的治疗方案。 该新测试方法的出现为新生儿筛查提供了一种更准确、更快速和更经济的方法，有助于预防和治疗同型半胱氨酸血症等代谢性疾病。这是一个非常好的消息，使我们相信，随着先进技术的不断发展和应用，我们能够更好地保障人类健康和幸福。 该测试方法还需要进一步开发和优化。研究人员将继续改进该方法，包括增加生物标记物的数量和灵敏度，并且要将该测试集成到更多实际应用中。此外，他们还将考虑将该测试方法应用于其他人群的筛查中，以扩大其应用范围。 此外，该测试方法的出现也受到了一些限制和挑战。例如，该测试需要采集新生儿的血液样本，这可能会造成疼痛和不适，需要专业医护人员进行操作。此外，该测试方法还需要耗费一定的时间和资源，这将对筛查的效率和成本产生一定的影响。因此，在实际应用中，需要权衡各种因素，并与其他筛查方法一起使用，以最大程度地提高筛查效果。新生儿高同型半胱氨酸血症是一个危险的罕见疾病，早期筛查尤为重要。该研究开发出的测试方法可以提高筛查准确性，有望在实践中应用。这项成果不仅对筛查同型半胱氨酸血症有很大帮助，而且还为其他罕见代谢性疾病的早期筛查提供借鉴。我们期待着更多的科技成果能够为人类健康事业作出贡献。 Petritis也提出了检测与同型半胱氨酸水平相关的其他疾病作为一种选择。将同型半胱氨酸分析加入到基于串联质谱的主要筛查中，“打开了检测使用总同型半胱氨酸作为生物标志物的其他罕见代谢性疾病的大门。”Petritis指出，举例来说，重甲基化障碍是其中之一。该研究小组还在致力于将另外两种生物标志物多重复合到测试中，以区分同型半胱氨酸尿症和其他疾病。 参考文献: https://academic.oup.com/clinchem/advance-article/doi/10.1093/clinchem/hvad007/7068836

12月13日，中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会官网对《血中1,2-二氯乙烷的气相色谱-质谱测定方法》进行了解读，对1,2-二氯乙烷GC-MS检测进行了介绍。 1,2-二氯乙烷是广泛使用的有机溶剂，目前主要用作化学合成的原料、工业溶剂和粘合剂。1,2-二氯乙烷对眼睛及呼吸道有刺激作用，吸入可引起肺水肿，抑制中枢神经系统、刺激胃肠道，引起肝、肾和肾上腺损害。由于目前仍无1,2-二氯乙烷的生物监测指标， 1,2-二氯乙烷的职业中毒诊断缺乏具有代表性的指标，曾有病例被误诊为急性有机磷中毒或癫痫。我国迫切需要制定1,2-二氯乙烷的生物监测指标，建立生物材料中1,2-二氯乙烷的标准检测方法。　　气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)在国内实验室已越来越普及，方法可以得到较好的推广应用。本标准依据职业卫生标准制定指南第5部分：生物材料中化学物质测定方法( GBZ/T210. 5-2008)进行研究，建立了既适合于实验室普遍应用，又具有特异性的、准确、可靠、灵敏的血样中1,2-二氯乙烷检测方法。

Bevacizumab是重组人源化人血管内皮生长因子（VEGF）单克隆抗体，作为美国第一个获得批准上市的抑制肿瘤血管生成的药，可用于转移性结直肠癌以及非鳞状非小细胞肺癌治疗等。在中国，超过10家贝伐珠单抗生物类似药在研发上市过程中，面对生物类似药分析，充满技术挑战，贝伐单抗生物类似药表征是质量控制关键点之一，分析过程中，抗体肽图分析方法尤为关键，今天我们就聊一聊贝伐单抗生物类似药肽图分析技术方法。 肽图分析（peptide mapping）是研究抗体药物结构组成的重要技术之一，抗体通过酶切处理后，利用色谱结合岛津高分辨Q-TOF质谱LCMS-9030分析，不仅可以对蛋白质氨基酸序列进行分析，同时可以对于相应肽段的翻译化修饰（PTM）进行分析。通过岛津反相HPLC方法分离不同性质的肽段，后续肽段通过高分辨质谱进行一级和二级扫描，通过监测的母离子和子离子匹配相应的肽段氨基酸序列以及存在的修饰。肽图分析是抗体蛋白药物质量控制的重要手段，岛津高分辨质谱可以完成相关所有的分析检测项目。 分析仪器及色谱柱方案 01分析仪器 LCMS-9030四极杆飞行时间质谱仪使高速度、高灵敏度的四极杆质谱与TOF技术的紧密结合。融合岛津先进工程技艺的DNA，打造出速度与出色性能兼备的全新一代高分辨质谱仪，以优异表现轻松胜任定性和定量分析挑战。 LCMS-9030 02液相色谱柱 ● 反相肽段分析专用色谱柱● 寿命长，耐压高，出峰稳定Shim-pack GISS-HP,3um，150*3.0 mm 应用实例 以bevacizumab 生物类似药为例，进行peptide mapping分析，将抗体蛋白通过胰酶酶切后，通过反相色谱质谱分离后进入高分辨Q-TOF质谱进行一级全扫描和二级扫描，高分辨数据提取分析匹配相应的肽段序列，完整流程如下图所示。 图. 利用岛津LCMS-9030抗体测序基本流程以及举例 岛津分析bevacizumab 生物类似药序列分析，通过Shim-pack GISS-HP色谱柱（3um，150*3.0 mm），可以高效分离酶切后的轻重链肽段，最后用LC-MS 9030 进行一级和二级扫描，最佳参数色谱质谱参数如下表所示。 图. 利用岛津LCMS-9030抗体测序详细参数 通过软件分析高分辨数据，进而匹配生物类似药的重链和轻链序列，完成整个抗体的肽图分析。因篇幅有限，以重链肽段序列部分数据进行展示，匹配覆盖率100%，可以说明岛津LCMS-9030 Q-TOF质谱在抗体肽段分析方面具有强大的实力。部分序列分析结果见下图所示。 图.bevacizumab 生物类似药重链测序结果展示（部分展示） 结合前述案例，岛津建立高分辨质谱LCMS-9030针对抗体药物进行肽图分析完整策略，此外对于分子量分析、翻译化修饰、二硫键分析、糖基化分析，LCMS-9030可以完成所有相关抗体药物关键质量属性检测，为用户节能增效，创造最大价值。