质谱检测蛋白质分析

贾伟、陈熙沃特世科技（上海）有限公司实验中心氢氘交换质谱法是一种研究蛋白质空间构象的质谱技术。它在蛋白质结构及动态变化研究、蛋白质相互作用位点发现、蛋白表位及活性位点鉴定方面有着广泛的应用。随着氢氘交换质谱技术的不断发展，它正在成为结构生物学家及生物药物研发的重要手段。 氢氘交换质谱（HDX MS，hydrogen deuterium exchange mass spectrometry）是一种研究蛋白质空间构象的质谱技术。其原理是将蛋白浸入重水溶液中，蛋白的氢原子将于重水的氘原子发生交换，而且蛋白质表面与重水密切接触的氢比位于蛋白质内部的或参与氢键形成的氢的交换速率快，进而通过质谱检测确定蛋白质不同序列片段的氢氘交换速率，从而得出蛋白质空间结构信息[1]。这个过程就像将握着的拳头浸入水中，然后提出水面并张开手掌。这时，湿润的手背表明它在&ldquo 拳头&rdquo 的结构中处于外表面，而较为干燥的手心表明它是&ldquo 拳头&rdquo 的内部。除样品制备外，氢氘交换质谱法的主要过程包括：交换反应、终止反应、将蛋白快速酶切为多肽、液相分离、质谱检测、数据解析。其中交换步骤需要在多个反应时长下进行，如0s、10s、1min、10min、60min等，以绘制交换率曲线，得到准确全面的信息。氢氘交换质谱技术在蛋白质结构及其动态变化研究[1]、蛋白质相互作用位点发现[2]、蛋白表位及活性位点鉴定方面有着广泛的应用[3]。 与经典的蛋白质结构研究方法相比，如X射线晶体衍射（X-Ray Crystallography）和核磁共振（NMR. Nuclear Magnetic Resonance）等方法，氢氘交换质谱不能够提供精确的蛋白空间结构，它直接提供的主要信息包括哪些氨基酸序列位于蛋白质空间结构的表面位置（包括动态变化中的）、可能的活性位点和蛋白-蛋白相互作用位点等。但是氢氘交换质谱技术有着其他经典方法不具备的优点：首先，可以进行蛋白质结构动态变化的研究是氢氘交换质谱的一个突出优点，包括变化中的活性位点及表位；其次，氢氘交换质谱在蛋白复合体构象的研究中也具有独到的优势；此外，氢氘交换质谱还具有对样品需求量小、纯度要求相对较低、研究对象为溶液环境下的蛋白质的天然构象而非晶体中构象等优势[1,4,5]。自1991年第一篇研究论文发表起，氢氘交换质谱技术不断发展，已经成为结构生物学及质谱技术中一个非常重要的应用领域[6]。但是氢氘交换质谱实验的复杂的实现过程在一定程度上影响了其应用的广泛度。主要的难点有：1、如何避免交换后氘代肽段的回交现象；2、实验控制的高精确性和重现性要求；3、交换后造成的叠加的质谱峰如何准确分辨；4、简易高效的分析软件需求；5、以氨基酸为单位的交换位点辨析。沃特世公司自2005年起，针对以上难点不断进行攻关，推出了目前唯一商业化的全自动氢氘交换质谱系统解决方案&mdash &mdash nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System(图1)。在全世界范围内，这套系统已经帮助科学家在包括Cell、Nature等顶级研究期刊中发表研究论文[7,8]。除科研需求外，沃特世氢氘交换质谱系统也受到众多国际领先制药公司的认可，并用于新药开发中蛋白药物活性位点及表位的研究工作中。氢氘交换实验中的回交现象将严重影响实验数据的可信度，甚至导致错误结果的产生。要避免回交需要做到两点：尽量缩短液质分析时间和保证液质分析中的温度和pH为最低回交反应系数所要求的环境。沃特世UPLC系统采用亚二纳米色谱颗粒填料，较HPLC使用的大颗粒填料，UPLC具有无与伦比的分离度。因此UPLC可以做到在不损失色谱分离效果的要求下，极大缩短液相分析时间的要求[9]。对于对温度和pH控制问题，在多年的工程学改进中，nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System已经实现了对酶切、液相分离等步骤的全程控制[10]。 对氢氘交换质谱实验精确性和重现性的要求是其应用的第二个主要难点。在实验中一般需要采集0s、10s、1min、10min、60min、240min等多个时间点的数据。如果进行人工手动实验，很难做到对10S-10min等几个时间点的精确操作。再考虑到重复实验的需求，人工手动操作会对最终数据可信度产生影响。而且实验过程重复繁琐，将给实验人员带来非常大的工作压力。nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System完全通过智能机械臂，精确完成交换、终止交换、进样、酶切等一系列实验过程，而且始终保证各个步骤所需不同的温度环境。这些自动化过程不但保证了实验数据的可靠性，提高了实验效率，也将科学家从繁琐的重复实验中解放出来。 氢氘交换实验的质谱数据中，随着交换时间的延长，发生了交换反应的多肽，由于质量变大，其质谱信号将逐渐向高质荷比方向移动。因此，这些质谱峰可能与哪些未发生交换反应的多肽质谱峰逐渐叠加、相互覆盖。相互叠加的质谱信号，不但影响对峰归属的判断，更会增加交换率数据的误差。因为交换率判断需要通过对发生交换的多肽进行定量，毫无疑问因叠加的而混乱的质谱数据将极大的影响对质谱峰的准确定量。这点对于单纯通过质荷比进行分析的质谱仪来说完全无能为力。但是，这个看似不可能完成的任务却被沃特世 nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System攻克了。这是因为，不同于其它常见质谱，沃特世的SYNAPT质谱平台还具备根据离子大小及形态进行分离的功能（行波离子淌度分离）。在数据处理时，除多肽离子的质荷比信息外，还可以通过离子迁移时间（离子淌度维度参数）将不同离子区分。因此这种SYNPAT独有的被命名为HDMSE的质谱分析技术可以将因质荷比相同而重叠的多肽分离开，轻而易举地解决了质谱信号叠加的问题，得到准确的交换率数据[11,12]（图2）。SYNPAT质谱平台一经推出就夺得了2007年PITTCON金奖，目前已经推出了新一代的SYNAPT G2HDMS、SYNAPT G2-S HDMS等型号，并具备ESI、MALDI等多种离子源。除氢氘交换技术外，SYNAPT质谱系统在蛋白质复合体结构研究中也是独具特色，已有多篇高质量应用文献发表[13,14,15]。 实现氢氘交换质谱技术的第四个关键点，是如何高效分析实验产生的多时间点及多次重复带来的大量数据。人工完成如此巨大的信息处理工作，将消耗科学家大量的时间。沃特世氢氘交换质谱解决方案所提供的DynamX软件可以为科学家提供简便直观的分析结果，并包含多种呈现方式。 在某些特殊研究中，要求对蛋白氢氘交换位点做到精确到氨基酸的测量，这是氢氘交换质谱研究的又一个难点。在常规的研究中采用CID（碰撞诱导解离）碎裂模式，可能导致氘原子在多肽内重排，而致使不能对发生交换的具体氨基酸进行精确定位。SYNPAT质谱提供的ETD（电子转移解离）碎裂模式可以避免氘原子重排造成的信息混乱，并具有良好的碎裂信号[16]。沃特世的nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System为氢氘交换质谱实验提供了前所未有的简易的解决方案，强有力地推动了氢氘交换技术在蛋白质结构及动态变化研究、蛋白质相互作用位点发现、蛋白表位以及活性位点鉴定方面的应用，正在成为众多结构生物学科学家和生物制药企业必不可少的工作平台。参考文献(1) John R. Engen, Analysis of Protein Conformation and Dynamics by Hydrogen/Deuterium Exchange MS. Anal. Chem. 2009,81, 7870&ndash 7875(2) Engen et al. probing protein interactions using HD exchange ms in ms of protein interactions. Edited by Downard, John Wiley & Sons, Inc. 2007, 45-61(3) Tiyanont K, Wales TE, Aste-Amezaga M, et al. Evidence for increased exposure of the Notch1 metalloprotease cleavage site upon conversion to an activated conformation. Structure. 2011, 19, 546-554(4) Heck AJ. Native mass spectrometry: a bridge between interactomics and structural biology. Nat Methods. 2008, 5, 927-933.(5) Esther van Duijn, Albert J.R. Heck. Mass spectrometric analysis of intact macromolecular chaperone complexes. Drug Discovery Today. Drug Discovery Today: Technologies Volume 3, 2006, 21-27(6) Viswanat ham Katta, Brian T. C hait, Steven Ca r r. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 1991, 5, 214&ndash 217(7) Chakraborty K, Chatila M, Sinha J, et al. Chaperonin-catalyzed rescue of kinetically trapped states in protein folding. Cell. 2010 Jul 9 142(1):112-22.(8) Zhang J, Adriá n FJ, Jahnke W, et al. Targeting Bcr-Abl by combining allosteric with AT P-binding-site inhibitors. Nature. 2010,463, 501-506(9) Wu Y, Engen JR, Hobbins WB. Ultra performance liquid chromatography (UPLC) further improves hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. 2006 , 17, 163-167(10) Wales T E, Fadgen KE, Gerhardt GC, Engen JR. High-speedand high-resolution UPLC separation at zero degrees Celsius. Anal Chem. 2008, 80, 6815-6820(11) Giles K, Pringle SD, Worthington KR, et al. Applications of a travelling wave-based radio-frequency-only stacked ring ion guide. Rapid Commun Mass Spectrom. 2004, 18, 2401-2414(12) Olivova P, C hen W, C ha kra borty AB, Gebler JC. Determination of N-glycosylation sites and site heterogeneity in a monoclonal antibody by electrospray quadrupole ion-mobility time-offlight mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 2008, 22,29-40(13) Ruotolo BT, Benesch JL, Sandercock AM, et al. Ion mobilitymass spectrometry analysis of large protein complexes. Nat Protoc.2008, 3, 1139-52.(14) Uetrecht C, Barbu IM, Shoemaker GK, et al. Interrogating viral capsid assembly with ion mobility-mass spectrometry. Nat Chem.2011, 3,126-132(15) Bleiholder C, Dupuis NF, Wyttenbac h T, Bowers MT. Ion mobility-mass spectrometry reveals a conformational conversion from random assembly to &beta -sheet in amyloid fibril formation. Nat Chem.2011, 3, 172-177(16) Kasper D. Rand, Steven D. Pringle, Michael Morris, John R., et al. ETD in a Traveling Wave Ion Guide at Tuned Z-Spray Ion Source Conditions Allows for Site-Specific Hydrogen/Deuterium Exchange Measurements. J Am Soc Mass Spectrom. 2011, in press

阐明小分子（包括内源性代谢物和外源性化合物）如何发挥调控作用的关键问题之一是小分子的靶标发现和验证，即蛋白质-小分子相互作用研究。蛋白质与小分子的相互作用模式既有较稳定的共价结合，也有瞬时的弱相互作用。如何灵敏、高效地捕获并解析多种类型的蛋白质-小分子相互作用是分析难点。目前，蛋白质-小分子相互作用的分析策略大致可分为两类：一是靶向相互作用研究，以蛋白质（或小分子）为中心，发现并验证与之相互作用的小分子（或蛋白质）；二是非靶向相互作用研究，全面识别多种蛋白质-小分子的相互作用轮廓。应用的具有分析技术包括：表面等离子体共振技术（surface plasmon resonance，SPR）、氢氘交换质谱分析技术（hydrogen deuterium exchange mass spectrometry，HDX MS）、限制性蛋白水解-质谱分析技术（limited proteolysis-mass spectrometry，LiP-MS）、蛋白质热迁移分析技术（cellular thermal shift assay，CESTA）和药物亲和反应靶标稳定性分析技术（Drug affinity responsive target stability，DARTS）等。本期介绍限制性蛋白水解-质谱分析技术（LiP-MS）的原理、技术流程和其在蛋白质-小分子相互作用研究中的应用。1. 原理LiP-MS技术最初由瑞士苏黎世联邦理工学院的Paola Picotti课题组建立 [1] ：利用小分子结合蛋白后相较于原蛋白产生蛋白质空间构象和位阻的变化，经蛋白酶切后形成差异肽段，液质联用分析识别和鉴定差异肽段，基于差异肽段推测蛋白质与小分子的相互作用位点。2. 技术流程在非变性条件下提取蛋白，以保留蛋白活性和空间结构。先使用低浓度（1:100, w/w）蛋白酶K在较低温度（25℃）下短时间内（5 min）对蛋白-小分子复合物进行有限的蛋白酶切。蛋白与小分子结合后，相互作用位点存在空间位阻，从而避免被蛋白酶K切割，由此产生差异肽段。随后进行蛋白变性和胰酶酶切，蛋白质组分析识别和鉴定差异肽段，基于差异肽段所处位置预测蛋白质与小分子的相互作用位点（图1）。图1 限制性蛋白水解-质谱分析（LiP-MS）技术流程 [2]3. 试验试剂和分析仪器3.1 蛋白抽提：可依据实际目的和细胞类型选择不同的细胞/组织裂解液，如RIPA、N-PER、M-PER等，进行细胞/组织蛋白抽提，获得的细胞/组织全蛋白提取物可直接与目标小分子共孵育。3.2 蛋白酶切：关键的蛋白酶切试剂，例如蛋白酶K、胰酶等均有市售。3.3 分析仪器：目前多种类型的液相色谱-高分辨质谱联用仪均可用于蛋白质组学分析，已应用于LiP-MS的高分辨质谱仪包括，布鲁克、赛默飞、沃特世和SCIEX等品牌的飞行时间质谱、轨道阱质谱和傅里叶变换离子回旋共振质谱等。4. 应用实例研究人员基于LiP-MS技术在大肠杆菌中探索多种内源性代谢物和蛋白的相互作用模式 [1]，先采用凝胶过滤法除去大肠杆菌全蛋白提取物中的内源性代谢物，获得大肠杆菌全蛋白；随后将大肠杆菌蛋白与20个中心碳代谢相关的关键内源性代谢物（三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、6-磷酸葡萄糖、果糖-1,6-二磷酸、丙酮酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸等，见图2A）分别共孵育。基于LiP-MS流程发现，上述20个内源性代谢物可与大肠杆菌中1678个蛋白发生潜在相互作用，其中1447个相互作用是首次发现的（图2B）。作者将所发现的相互作用与在线数据库BRENDA对比（主要涉及酶的功能和代谢通路等信息），证明LiP-MS技术能够准确地识别已报道的蛋白-内源性代谢物相互作用，假阳性率低于6 %。图2 20个与中心碳代谢相关的关键内源性代谢物（图A）及其在大肠杆菌中发生相互作用的蛋白数量（图B）[1]参考文献：[1] Piazza, I., Kochanowski, K., Cappelletti, V., Fuhrer, T., Noor, E., Sauer, U., Picotti, P. A map of protein-metabolite interactions reveals principles of chemical communication. Cell, 2018, 172(1-2), 358-372.[2] Pepelnjak M, Souza N D, Picotti P. Detecting Protein–Small Molecule Interactions Using Limited Proteolysis–Mass Spectrometry (LiP-MS). Trends in Biochemical Sciences, 2020, 45(10), 919-920.

日前，由弗雷德哈钦森癌症研究中心(Fred Hutchinson Cancer Research Center)领导的一个国际研究小组证实了大规模、标准化蛋白质检测的可行性，这是验证疾病生物标志物和药物靶点的必要条件。这项刊登在《自然-方法》(Nature Methods)杂志上的最新论文表明，科学家们开发的一种靶向性蛋白质检测方法具有系统地、可靠地检测人类蛋白质组的潜力。　　论文主要作者、癌症蛋白质组学专家 Amanda Paulovich 博士和同事们开发的这项技术，可同时准确地检测许多不同样本中成百上千种蛋白质的丰度。来自西雅图、波士顿和韩国等其他地区的实验室重现了人类乳腺癌细胞中 319 种蛋白质的检测结果，证实这种方法可跨越实验室和国界实现标准化。　　Paulovich 表示：&ldquo 这种方法有潜力彻底改变我们检测人类蛋白质的方式。利用全球资源对所有人类蛋白质进行标准化定量设立一些新标准，无疑将能提高临床研究的可重现性，其将对转化新型治疗和诊断带来巨大的影响。&rdquo 　　作为所有生物功能的执行分子机器，蛋白质掌控着早期疾病和疾病进程的信号传导。探求癌症生物标记物&mdash &mdash 细胞中的蛋白质指纹有可能促使开发出一些测试方法，更早期地检测疾病，早在癌症形成之前鉴别出个体的特殊风险，以及更好地指导患者的治疗。然而没有标准化和可重现的方法来检测它们的水平，验证新发现的候选生物标记物是一件不可能的事情。　　每个有前景的生物标记物都必须在临床试验中开展进一步的研究，这就要求研究人员能够检测数百到数千个患者样本中每个候选标志物的丰度。由于将任何一种候选标记物转化至临床应用的机率都极其的低，鉴别一种具有临床价值的生物标记物必须对大量的蛋白质进行测试。　　Paulovich 表示：&ldquo 现在，你还不能对大多数的人类蛋白质进行大规模检测。在我们完成人类基因组测序，获得DNA分子全目录10多年之后，仍然不能够采用一种标准化定量方法在各种通量模式下对人类蛋白质组开展研究。&rdquo 　　为了解决这一问题，Paulovich 和同事们利用了一种称作为多反应检测质谱法(MRM-MS)的敏感性靶向蛋白质检测技术。这种质谱法并非是全新的技术，多年来全球的临床实验室利用它来测量药物代谢产物和与先天性代谢缺陷有关的一些小分子。最近，Paulovich和其他研究人员开始利用它来检测人类蛋白质。　　采用研究人员开发的这种方法，每天每台仪器能够对最少 20 个临床样本中的 170 种蛋白质进行高度特异性地、精确地、多路定量分析 任何其他的现有技术都没有这种能力。　　由于质谱技术是针对性的，这意味着研究人员能够调整设备寻找癌细胞或其他样品类型中特殊的蛋白质亚群，相比于非针对性策略，它可以在更低的水平上检测微量血液样本或活检标本中目的蛋白质的存在。　　研究的主要作者、Paulovich 实验室分析化学家 Jacob Kennedy 说：&ldquo 我们的目标是用这一技术来取代当前采用的一些非常老旧的技术。&rdquo 　　当前，研究人员通常是采用 Western blotting、ELISA 或是免疫组化(IHC)技术来检测临床样本中的蛋白质水平。这些方法往往无法在实验室之间重现结果，从而很难验证适用于临床的候选生物标记物，它们不适用于一次检测大量的蛋白质和样本。　　Paulovich 和同事们通过分析乳腺癌细胞生成的 300 多种已知蛋白质验证了他们的技术 研究结果表明，MRM-MS 可以重现及扩展以往采用其他技术进行乳腺癌研究所生成的观察结果。　　该研究证实了，MRM-MS 能够以一种标准化方式一次检测许多的蛋白质，为开展国际性的、有组织的研究工作定量人类蛋白质中的每种蛋白奠定了基础。　　原文检索：　　Jacob J Kennedy,Susan E Abbatiello,Kyunggon Kim,Ping Yan,Jeffrey R Whiteaker,Chenwei Lin,Jun Seok Kim,Yuzheng Zhang,Xianlong Wang,Richard G Ivey,Lei Zhao,Hophil Min,Youngju Lee,Myeong-Hee Yu,Eun Gyeong Yang,Cheolju Lee,Pei Wang,Henry Rodriguez,Youngsoo Kim,Steven A Carr& Amanda G Paulovich. Demonstrating the feasibility of large-scale development of standardized assays to quantify human proteins. Nature Methods, 08 December 2013 doi:10.1038/nmeth.2763

Fig. 1: View of the SuperMaMa laboratory at the University of Vienna. The hanging gold-plated insert is the radiation shield behind which the superconducting nanowire detectors are installed. C: Quantennanophysik @ Universität Wien　　Fig. 2: Counting single proteins with a superconducting nanowire. The background and nanowire are altered in Photoshop with the Generative Fill AI. (Human Insulin PDB:3I40). C: CC BY-ND 4.0 Quantum Nanophysics University of Vienna.　　据奥地利维也纳大学(University of Vienna, Boltzmanngasse, Vienna, Austria.)2023年12月4日提供的消息，由维也纳大学量子物理学家马库斯阿恩特(Markus Arndt)领导的国际研究团队在蛋白质离子检测方面取得突破：超导纳米线探测器凭借其高能量灵敏度，实现了蛋白质离子检测的突破(Quantum physics: Superconducting Nanowires Detect Single Protein Ions)。几乎100%的量子效率，比传统离子探测器在低能量下的探测效率高出1000倍。与传统探测器相比，它们还可以通过冲击能量来区分大分子。这允许更灵敏地检测蛋白质，并提供质谱分析中的附加信息。这项研究的结果于2023年12月1日已经在在《科学进展》(Science Advances)杂志网站发表——Marcel Straus, Armin Shayeghi, Martin F. X. Mauser, Philipp Geyer, Tim Kostersitz, Julia Salapa, Olexandr Dobrovolskiy, Steven Daly, Jan Commandeur, Yong Hua, Valentin Köhler, Marcel Mayor, Jad Benserhir, Claudio Bruschini, Edoardo Charbon, Mario Castaneda, Monique Gevers, Ronan Gourgues, Nima Kalhor, Andreas Fognini, Markus Arndt. Highly sensitive single molecule detection of macromolecule ion beams. Science Advances, 1 Dec 2023, Vol 9, Issue 48. DOI: 10.1126/sciadv.adj2801. https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adj2801　　参与此项研究的除了来自维也纳大学的研究人员之外，还有来自奥地利科学院(Austrian Academy of Sciences, Boltzmanngasse, Vienna, Austria)、荷兰MSVision(MSVision, Televisieweg 40, 1322 AM Almere, The Netherlands)、荷兰单量子(Single Quantum, Rotterdamseweg 394, 2629 HH, Delft, The Netherlands) 瑞士巴塞尔大学(University of Basel, St. Johannsring 19, CH-4056 Basel, Switzerland)以及瑞士洛桑联邦理工学院(école Polytechnique Fédérale de Lausanne简称EPFL, Rue de la Maladière 71b, CH-2002 Neuchatel, Switzerland)的研究人员。　　大分子的检测、识别和分析在生命科学的许多领域都很有趣，包括蛋白质研究、诊断和分析。质谱法通常用作检测系统即一种通常根据带电粒子(离子)的质荷比分离带电粒子(离子)并测量检测器生成的信号强度的方法。这提供了有关不同类型离子的相对丰度的信息，从而提供了样品组成的信息。然而，传统探测器只能对具有高冲击能量的粒子实现高探测效率和空间分辨率——这一限制现已被使用超导纳米线探测器的国际研究团队克服。　　低能粒子的合力(Joined forces for low energy particles)　　在当前的研究中，由维也纳大学与代尔夫特的单量子、EPFL、MSVision和巴塞尔大学的合作伙伴协调的欧洲联盟首次展示了超导纳米线的使用所谓的四极杆质谱(quadrupole mass spectrometry)中蛋白质束的优秀检测器。待分析样品中的离子被送入四极杆质谱仪并进行过滤。“如果我们现在使用超导纳米线而不是传统探测器，我们甚至可以识别以低动能撞击探测器的粒子，”维也纳大学物理学院量子纳米物理小组(Quantum Nanophysics Group at the Faculty of Physics at the University of Vienna)的项目负责人马库斯阿恩特 (Markus Arndt) 解释道。这是通过纳米线探测器的特殊材料特性(超导性)实现的。　　借助超导技术实现这一目标(Getting there with superconductivity)　　这种检测方法的关键是纳米线在非常低的温度下进入超导状态，在这种状态下它们失去电阻并允许无损电流流动。进入离子对超导纳米线的激发导致返回到正常导电状态(量子跃迁)。在此转变期间纳米线电特性的变化被解释为检测信号。“通过我们使用的纳米线探测器，”第一作者马塞尔 施特劳斯(Marcel Strauß / Marcel Straus)说，“我们利用了从超导到正常导电状态的量子跃迁，因此可以比传统离子探测器性能高出三个数量级。” 事实上，纳米线探测器在极低的冲击能量下具有显著的量子产率-并重新定义了传统探测器的可能性：“此外，配备这种量子传感器的质谱仪不仅可以根据分子的质量到电荷状态来区分分子，还可以根据分子的动能对它们进行分类。这改善了检测并提供了更好的空间分辨率的可能性，”马塞尔施特劳斯说道。纳米线探测器可以在质谱、分子光谱、分子偏转或分子量子干涉测量中找到新的应用，这些领域需要高效率和良好的分辨率，特别是在低冲击能量下。图 2(Fig. 2)是用超导纳米线计数单个蛋白质。　　团队和资金(Team & Funding)　　单量子(Single Quantum)领导超导纳米线探测器的研究，洛桑联邦理工学院的专家提供超冷电子学，MSVISION 是质谱专家，巴塞尔大学的专家负责化学合成和蛋白质功能化。维也纳大学将所有组件与其在量子光学、分子束和超导性方面的专业知识结合在一起。　　本研究得到了戈登和贝蒂摩尔基金会 (Gordon and Betty Moore Foundation: 10771)、欧盟地平线2020框架计划(European Union’s Horizon 2020 Framework Programme: 860713 and 777222)的资助。　　上述介绍，仅供参考。欲了解更多信息，敬请注意浏览原文或者相关报道。　　Abstract　　The analysis of proteins in the gas phase benefits from detectors that exhibit high efficiency and precise spatial resolution. Although modern secondary electron multipliers already address numerous analytical requirements, additional methods are desired for macromolecules at energies lower than currently used in post-acceleration detection. Previous studies have proven the sensitivity of superconducting detectors to high-energy particles in time-of-flight mass spectrometry. Here, we demonstrate that superconducting nanowire detectors are exceptionally well suited for quadrupole mass spectrometry and exhibit an outstanding quantum yield at low-impact energies. At energies as low as 100 eV, the sensitivity of these detectors surpasses conventional ion detectors by three orders of magnitude, and they offer the possibility to discriminate molecules by their impact energy and charge. We demonstrate three developments with these compact and sensitive devices, the recording of 2D ion beam profiles, photochemistry experiments in the gas phase, and advanced cryogenic electronics to pave the way toward highly integrated detectors.文章来源：科学网 诸平

大家好，本周为大家分享一篇发表在Anal Chem上的文章，Native Ambient Mass Spectrometry Enables Analysis of Intact Endogenous Protein Assemblies up to 145 kDa Directly from Tissue [1]。该文章的通讯作者是来自英国伯明翰大学的Helen J. Cooper教授。非变性原位质谱（native ambient mass spectrometry, NAMS）是一种新型的自上而下质谱分析方法。它结合非变性质谱和原位质谱的优势，可直接在蛋白质及其复合物的生理环境中进行对其进行无标记表征。NAMS可提供蛋白质结构、空间及瞬时相互作用的信息，具有直接从组织中分析内源性蛋白质组装体的巨大潜力。但是，目前，NAMS仅成功应用于直接检测低分子量 (20kDa) 或高丰度的蛋白，如血红蛋白四聚体或RidA 同源三聚体。目前应用于组织中蛋白质NAMS分析的技术有液体萃取表面分析（LESA）与纳喷雾解析电喷雾电离 (nano-DESI) [2]。LESA需要对组织底物进行自动微液节点采样，然后进行纳喷雾电离（nanoESI）进行MS分析。nano-DESI则通过探针与流动相形成流动溶剂桥，与样品直接接触，之后进行质谱分析成像。在本研究中，作者采用NAMS对大鼠脑、肾、肝组织切片中的蛋白质组装体进行全面分析。主要通过调整质谱仪中的离子光学和气体压力以改善m/z传输与纳喷雾性能，来实现对较大蛋白质组装体的分析。结果鉴定出八种蛋白质组装体，证明了NAMS的可及分子量高达145kDa，并通过nano-DESI质谱成像在大脑和肾脏中绘制了高达94kDa的蛋白质组装体的空间分布。在脑组织中，作者通过nano-DESI NAMS绘制了大鼠大脑切片中分子量为37.0–66.4kDa的完整蛋白质复合物的空间分布以及对应的质谱图（图1a,b）。实验成功鉴定并成像出大鼠脑组织中三种蛋白质组装体，包括同源三聚体细胞因子巨噬细胞迁移抑制因子 (MIF, 37.0kDa)、同源二聚体磷酸甘油酸变位酶1 (PGAM1, 57.6kDa)和苹果酸脱氢酶2 (MDH2, 66.4kDa)。结果发现，MIF在整个脑组织区域是均匀分布（图1c）。作者通过nano-DESI-HCD MS2分析产生的单体 (5+、4+) 和二聚体 (5+) 亚基和序列离子的谱图，识别出MIF（图1d）。作者还利用nano-DESI-HCD MS2成功识别出PGAM1，并发现PGAM1在大脑皮层区域中显示出高丰度，而在中脑和胼胝体中的丰度较低（图1e，f）。相比之下，MDH2在脑组织中的空间分布基本均匀（图1g，h）。检测到的结果与蛋白在大鼠脑中的实际分布相符合，可信度较高。图 1. 离子图像和 HCD MS2光谱表明大鼠脑中蛋白质复合物的亚基解离。(a) H&E染色的连续组织切片的光学图像。标签：Ce,小脑；C，大脑皮层；CC，胼胝体；F，穹窿；V，侧脑室区；Mb，中脑；Me，髓质和脑桥；H，海马；Th，丘脑；Ht，下丘脑；BG，基底神经节；OR，嗅觉区域。(b) Nano-DESI 全扫描质谱，代表光学图像中标记为“(b)”的像素。（c，d）巨噬细胞抑制因子同源三聚体显示均匀分布。（e，f）PGAM1同型二聚体分布。（g，h）MDH2同型二聚体分布。此外，作者在大鼠肾脏中鉴定了四种同源二聚体蛋白组件（61.2-94.2kDa），包括ω-酰胺酶 (61.2kDa)、MDH2 (66.4kDa)、苹果酸脱氢酶1 (MDH1, 72.8kDa) 和α-烯醇化酶 (94.2kDa)，并将其成像（图2）。其中观察到的α-烯醇化酶为金属结合形式，每个亚基上结合了2个Mg 2+离子。图 2. (a)大鼠肾脏的H&E染色连续切片显示皮质(C)和髓质(M)组织。(b)在MSI期间获得的大鼠肾皮质组织中单个nano-DESI 像素的示例全扫描质谱。(c, d)α-烯醇化酶同型二聚体。(e, f)苹果酸脱氢酶1。(g, h) MDH2同型二聚体。(i, j) ω-酰胺酶。研究还从大鼠肝组织中鉴定出同型三聚体鸟氨酸转氨甲酰酶（OTC，108.8kDa）和同型四聚体乳酸脱氢酶A（LDHA，145.4kDa）（图3）。其中，在全扫描模式下，nano-DESI可以检测到145.4kDa的LDHA的较弱信号。通过nano-DESI-PTCR MS2的进一步确认，检测到的物质确实为LDHA。图3. (a) 直接来自大鼠肝组织的完整OTC同源三聚体的nano-DESI-PTCR MS 2。(b) 完整OTC同源三聚体的nano-DESI-HCD MS 2显示亚基质量为36.2kDa。(c)完整LDHA同源四聚体 (145.4kDa)的nanoESI-PTCR MS2。(d)完整LDHA 同源四聚体的nanoESI-HCD MS2。在此研究中，作者成功利用NAMS质谱分析方法，直接从组织中检测并鉴定出内源性蛋白质组装体，分子范围为37.0-145.4kDa，包括二聚体、三聚体以及四聚体。其中检测到的上限（145.4kDa）超出LESA MS报道的质量上限的两倍，比nano-DESI 报道过的质量上限高出100kDa。通过调整离子光学和高m /z的气体压力，或者后续仪器和方法的开发，NAMS有可能进一步突破145.4kDa的上限，检测到分子量更大的蛋白组装体。[1]Hale OJ, Hughes JW, Sisley EK, Cooper HJ. Native Ambient Mass Spectrometry Enables Analysis of Intact Endogenous Protein Assemblies up to 145 kDa Directly from Tissue. Anal Chem. 2022 Apr 12 94(14):5608-5614.[2]Hale OJ, Cooper HJ. Native Mass Spectrometry Imaging and In Situ Top-Down Identification of Intact Proteins Directly from Tissue. J Am Soc Mass Spectrom. 2020 Dec 2 31(12):2531-2537.

项目编号：0811-234DSITC0247项目名称：蛋白质组学质谱分析系统预算金额：790.0000000 万元（人民币）最高限价（如有）：790.0000000 万元（人民币）采购需求：蛋白质组学质谱分析系统/壹套（项目预算：人民币790万元，可以采购进口产品）合同履行期限：合同签订之日起至合同内容履行完毕止本项目( 不接受 )联合体投标。获取招标文件时间：2023年02月20日 至 2023年02月27日，每天上午9:00至11:30，下午13:00至16:30。（北京时间，法定节假日除外）地点：微信公众号“东松投标”方式：关注微信公众号“东松投标”，完成信息注册，即可购买招标文件售价：￥700.0 元，本公告包含的招标文件售价总和对本次招标提出询问，请按以下方式联系。1.采购人信息名称：同济大学地址：上海市四平路1239号联系方式：袁老师 021-659856142.采购代理机构信息名称：上海东松医疗科技股份有限公司地址：上海市宁波路1号申华金融大厦11楼联系方式：刘韵、王悦 0086-21-63230480转8606、86273.项目联系方式项目联系人：刘韵、王悦电话：0086-21-63230480转8606、8627

俗话说：文无第一，如果非要整出个蛋白质质谱与蛋白质组学领域世界第一牛人，显然并不是一件容易的事，也注定是一件有争议的事。作为一个半路出家的准业内人，我就本着无知者无畏的革命精神，说一下我自己心目中的第一牛人：Ruedi Aebersold。　　考虑到科学网的大多数网友对蛋白质组学并不了解，先简单科普一下，根据百度百科的定义：“蛋白质组学(Proteomics)一词，源于蛋白质(protein)与 基因组学(genomics)两个词的组合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。” 1995年(也有1994，1996年之说)Marc Wikins首次提出蛋白质组(Proteome)的概念1，1997年, Peter James(就职于有欧洲MIT之称的瑞士联邦工学院(ETH))又在此基础上率先提出蛋白质组学的概念2。基因组学和蛋白质组学的概念又进一步催生了N多的各种各样的组学(omics)，两者的诞生的发展，也使系统生物学成为可能，本文的主人公Ruedi Aebersold与Leroy Hood一起于2000年在美国西雅图创办了系统生物学研究所(ISB),该所的建立不但标志着系统生物学作为一门独立的学科的诞生(此句话貌似不靠谱，参见文后14楼的评论)，也带动了包括蛋白质组学在内的多种组学的发展，当然各种组学的发展也同时促进了系统生物学的发展。尽管日本也于2000年在东京建立了系统生物学研究所，但是同为第一个吃螃蟹的，东京的这个所，无论是学术水平还是世界影响都无法和西雅图的那个系统生物学领域的麦加相提并论。闲话少叙，我之所以认为Ruedi Aebersold是蛋白质质谱与蛋白质组学领域世界第一牛人，是基于如下原因：　　Ruedi Aebersold对蛋白质组学的最大贡献可谓是同位素代码标记技术(ICAT)，现在这一蛋白组定量技术自从1999年在Nature上发表以来，该技术已世界广泛应用，该论文迄今(截至2013年1月11日)已被引用了近3000次。Web of Science的检索结果显示，蛋白组学领域迄今已经至少有超过10万篇论文发表，按照被引用次数排名，该论文位居第三位。有意思的是，被引用次数排第四位的是Ruedi Aebersold和另外一位牛人Mathias Mann(下面会介绍)于2003年发表在Nature上的有关蛋白质质谱与蛋白质组学的综述论文，迄今也已被引用近2800次。而引用次数排第一和第二的两篇论文的通讯作者并算不上是蛋白质质谱与蛋白质组学领域的，蛋白质组学仅仅是他们使用的工具，他们的影响也在这个领域之外。蛋白质组学领域，最重要的专业协会应该算是HUPO (国际人类蛋白质组组织), 最重要的专业会议也当属HUPO世界大会，Ruedi Aebersold曾获HUPO含金量最高的成就奖，他本人也经常是HUPO世界大会的分会主席或大会特邀报告人。当然Aebersold还获得了包括美国质谱协会(ASMS)大奖在内的许多专业大奖。可能有人会列出另外的自己心中的第一牛人(如上述的Mathias Mann)，但Ruedi Aebersold无疑至少是领域内公认的前几位的世界级牛人。另外，顺便说一下德国马普所的Mathias Mann(其在丹麦首都也有实验室)，Mann和Aebersold可谓是蛋白质组学领域的双子星座，都是该领域的顶级牛人，Mann发表的论文有多篇都在蛋白质组学领域被引用次数前10位，不少被引用次数都上千次。上述的Mann和Aebersold两人能在Nature发表综述论文也说明了他们的江湖地位。Aebersold和Mann所发表的论文总被引次数分别超过了5万和3万次，这个数字在世界所有领域都是惊人的。另外，Mathias Mann在蛋白质组学最大的贡献可以说是发明了蛋白质组体内标记技术SILAC3,这种技术与Ruedi Aebersold发明的ICAT已及另外一种标记iTRAQ是公认的应用最为广泛的蛋白质组学定量标记技术。　　今年年近花甲的Ruedi Aebersold是世界蛋白质组学的开拓者之一，现在在上述的ETH的工作，和最早提出蛋白质组学Peter James在同一个大学。作为土生土长的瑞士人，Ruedi Aebersold是在2004年底、2005年初才开始在ETH全职工作的，可谓是瑞士的大海龟。Ruedi Aebersold此前在西雅图的ISB和华盛顿大学工作，作为ISB的元老和共同创办人，Ruedi Aebersold现在还是ISB的兼职教授，发表论文时也还署ISB地址。Mann和Aebersold都是欧洲人，现在又都致力于将蛋白质质谱与蛋白质组学应用到临床，尽管蛋白质组学已有十多年发展历史，现在最大的一个瓶颈可以说在基本无法应用到临床，现有的技术，对于临床应用而言，时间和经济成本都太高(无法高通量、检测成本太贵)。这一块硬骨头显然不是一般人能够啃得动的，需要从临床样品制备、质谱技术到数据分析都要有突破甚至革命性的创新，我很期待，也相信Mann和Aebersold有能力最终使蛋白质组学(尤其是基于此的生物标志物鉴定技术)应用到临床。　　我国在蛋白质质谱与蛋白质组学领域在世界上最出名的无疑非贺福初莫属，贺福初的名字在国内搞蛋白质组学应该都知道他的名字，他的头衔很多(如将军、院士)，我就不一一列举了，新年伊始他又多了一个牛头衔：万人计划中的科技领军人才。贺的工作和学术水平，我不熟悉，不敢评头论足。他的文章被引用次数最高的是发表在Cancer Research一篇论文，迄今已有126次，但并非是蛋白质组学领域。在蛋白质组学领域，他的被引次数(含自引)最高的论文是2007年发表在蛋白质组学顶级期刊MCP的文章4，迄今已有105次引用。蛋白质质谱领域，我国在世界上最出名的学者估计要数复旦大学的杨芃原了，他的被引用次数最高的一篇论文，是2005年发表在化学顶级期刊德国应用化学的文章5，迄今已被引用70次，杨芃原为该论文的共同通讯作者。我国在蛋白质组学目前被引用次数最高的是南开大学王磊(澳大利亚海归、长江学者)2007年发表在美国科学院院刊(PNAS)的论文6，迄今被引次数已经超过500次。　　蛋白质质谱仪主要生产商Thermo Fisher(即原来的Finnegan), 最近新出了本挂历，这本特别的挂历上列了13位在蛋白质质谱与蛋白质组学领域的牛人，上述的Ruedi Aebersold和Mathias Mann都在之列，其余11位简单介绍、列表如下。姓 名工作单位主要贡献Richard D. Smith美国太平洋西北国家实验室1990年首次用三重四级杆质谱Top-down（自上而下）分析完整蛋白John Yates III美国Scripps研究所SEQUEST MS/MS数据库搜索程序Joshua Coon美国威斯康星大学麦迪逊分校发明了电子转移解离技术(ETD)Neil Kelleher美国西北大学Top-down蛋白质组学Kathryn Lilley英国剑桥大学蛋白质组学定量技术Pierre Thibault加拿大蒙特利尔大学应用生物质谱和蛋白质组学到细胞生物学Michael MacCoss美国华盛顿大学（西雅图）稳定同位素标记技术Albert Heck荷兰Utrecht大学基于质谱的结构生物学Catherine Costello美国波士顿大学HUPO前任主席，质谱技术发展及应用Alexander Makarov德国Thermo Fisher Scientific 生物质谱全球研发总监领导研发Orbitrap质谱仪Donald Hunt美国弗吉尼亚大学FT-MS and ETD　　简单的说，上述13位世界级牛人都来自欧美，没有一位来自亚洲，也没有一位华人。我不知道以Ruedi Aebersold代表的上述牛人是如何炼成的，但可以肯定的是：他们不是欧美版的“百人”计划，也不是“千人”计划，更不是“万人”计划而“计划”出来的。网上的公开信息表明：Ruedi Aebersold除了在国际专业协会和期刊有学术兼职外，没有任何行政职务，就是一普通教授，但是这不妨碍他成为蛋白质质谱与蛋白质组学领域世界第一牛人。

p style="line-height: 1.5em " 中国科学院计算技术研究所研究员贺思敏及其研究团队设计和实现了新一代开放式搜索算法Open-pFind，可提高质谱数据解析的数量与质量，有望成为蛋白质组学日常数据分析的主力工具。相关成果10月9日在线发表于《自然—生物技术》。br//pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201810/uepic/419b4d61-469e-48e0-baf9-3ef492f7ff8b.jpg" title="2018-10-12_165404.png" alt="2018-10-12_165404.png"//pp style="line-height: 1.5em "　　质谱数据的低解析率直接影响着肽段和蛋白质鉴定数目和鉴定精度的提高。质谱数据解析率一直较低，是由于质谱数据中通常有大量存在意外修饰或发生意外酶切的肽段，传统的限定式搜索因搜索空间有限，通常无法对上述肽段进行有效检索。/pp style="line-height: 1.5em "　　新一代开放式搜索引擎Open-pFind采用基于序列标签索引的开放式搜索流程，快速扫描蛋白质数据库并对部分高质量谱图进行鉴定。在此过程中，意外修饰、突变、半特异及非特异性酶切肽段均在引擎的搜索空间内。Open-pFind通过基于支持向量机的肽谱匹配重打分算法，挖掘数据中的特征信息，并据此进行第二次精细搜索。同时，Open-pFind集成了前端数据处理的pParse模块，对肽段母离子进行校准，并有效提取混合谱图，进一步提升了谱图解析率。/pp style="line-height: 1.5em "　　在四组典型质谱数据集上，Open-pFind解析率均达到了70%~85%，比同类软件鉴定结果多出50.5%~117.0%。对于高质量的串联质谱图，Open-pFind甚至基本实现了完全解析。在搜索空间是常规引擎5个量级的基础上，Open-pFind的速度仍然是常规引擎的2~3倍，是同类开放式引擎的数十倍甚至上百倍。在超大规模人类蛋白质组数据集上，Open-pFind报告了超过12000种蛋白，且准确度远远超过以往常规分析结果。/pp　　/ppbr//p

项目编号：0873-2201HW5L0268项目名称：北京大学医学部蛋白质组学质谱分析系统采购项目预算金额：603.0000000 万元（人民币）采购需求：采购蛋白质组学质谱分析系统1套，用于科研。接受进口产品投标，详见附件合同履行期限：合同签订后120天（国内供货）或者L/C后120天（进口免税）本项目( 不接受 )联合体投标。

一、项目基本情况 1.项目编号：ZJ-2362483 项目名称：国科大杭州高等研究院蛋白质组质谱离子淌度分析系统 预算金额（元）：8000000 最高限价（元）：8000000 采购需求： 标项名称: 蛋白质组质谱离子淌度分析系统 数量: 不限 预算金额（元）: 8000000 简要规格描述或项目基本概况介绍、用途：蛋白质组质谱离子淌度分析系统1套。具体以招标文件第三部分采购需求为准，供应商可点击本公告下方“浏览采购文件”查看采购需求。 备注：允许进口 合同履约期限：标项 1，按照招标文件要求 本项目（是）接受联合体投标。 2.项目编号：0625-23218D89 项目名称：国科大杭州高等研究院高效液相色谱-三重四级杆串联质谱联用分析系统 预算金额（元）：5000000 最高限价（元）：/ 采购需求： 标项名称: 高效液相色谱-三重四级杆串联质谱联用分析系统 数量: 3 预算金额（元）: 5000000 简要规格描述或项目基本概况介绍、用途：详见招标文件 备注： 合同履约期限：标项 1，详见招标文件 本项目（是）接受联合体投标。二、获取招标文件 时间：/至2023年11月10日 ，每天上午00:00至12:00 ，下午12:00至23:59（北京时间，线上获取法定节假日均可，线下获取文件法定节假日除外） 地点（网址）：政采云平台（https://www.zcygov.cn/） 方式：供应商登录政采云平台https://www.zcygov.cn/在线申请获取采购文件（进入“项目采购”应用，在获取采购文件菜单中选择项目，申请获取采购文件） 售价（元）：0 三、对本次采购提出询问、质疑、投诉，请按以下方式联系 1.采购人信息 名 称：国科大杭州高等研究院 地 址：杭州市西湖区转塘街道象山支弄1号 传 真：/ 项目联系人（询问）：宋老师 项目联系方式（询问）：18321712725 质疑联系人：沈老师 质疑联系方式：0571-86080792 2.采购代理机构信息 名 称：浙江国际招投标有限公司 地 址：杭州市文三路90号东部软件园1号楼3楼317室 传 真：/ 项目联系人（询问）：沈建平（18005883302）、倪樟如 项目联系方式（询问）：0571-81061840，0571-81061802 质疑联系人：董福利 质疑联系方式：0571-81061818 　　　　　　 3.同级政府采购监督管理部门 名 称：杭州市财政局政府采购监管处 /浙江省政府采购行政裁决服务中心（杭州） 地 址：杭州市上城区四季青街道新业路市民之家G03办公室 传 真：/ 联 系 人：朱女士/王女士 监督投诉电话：0571-85252453

蛋白质组学是指在大规模水平上以蛋白质的生物多样性为基础，研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律、蛋白质翻译后修饰以及蛋白与蛋白之间相互作用等，从而揭示疾病发生、发展和药物治疗相关的规律与机制。随着质谱技术以及色谱与质谱联用技术的快速发展，蛋白质组学分析技术在未知蛋白质的鉴定、蛋白质结构的解析、靶向蛋白质定量、以及生物技术药物研发、质量控制和体内药代动力学研究方面应用越来越广泛。药典委拟制定《中国药典》蛋白质组学分析方法及应用指导原则，并于2024年2月20日发布公示稿（详见附件）并征求意见。该指导原则适用于蛋白质组学在蛋白质组成及其变化规律、蛋白质翻译后修饰以及蛋白与蛋白之间相互作用方面的分析研究，规范蛋白质组学分析方法建立，分析过程质量控制和数据分析，确保蛋白质组学分析结果的重复性与可靠性。蛋白质组学分析方法需要具备实用性强、多肽和蛋白的检测特性好以及合适的质控过程，保证分析结果的可靠性。同时蛋白质组学在操作过程中能够处理大量样品。蛋白质组学分析基本流程主要包括：1. 蛋白样品的提取，变性还原，酶解与多肽分离富集；2. 多肽的分析与鉴定；3. 数据分析。分离和富集技术：凝胶电泳和色谱技术分析与鉴定技术：质谱、二维凝胶电泳、X射线分析、核磁共振波谱和透射电子显微镜技术附件： 蛋白质组学分析方法及应用指导原则草案公示稿（第一次）.pdf

蛋白质分析仪一种用于定量测定蛋白质含量的仪器，广泛应用于生物医学研究、药物开发和临床诊断等领域。检测精度是衡量蛋白质分析仪性能的重要指标，影响检测精度的因素有很多，本文将详细探讨这些因素及其对检测精度的影响。　　一、检测精度的基本概念　　检测精度是指仪器在测量过程中，测量值与真实值的一致程度。精度越高，说明测量结果越接近真实值。检测精度通常用相对误差、误差和标准偏差等指标来衡量。　　二、影响检测精度的主要因素 　　1.仪器性能　　-蛋白质分析仪的性能直接影响其检测精度。仪器的分辨率、灵敏度、线性范围和稳定性等参数对其精度有重要影响。高质量的仪器通常具有更高的检测精度。　　2.操作规范　　-操作规范与否对检测精度有很大影响。操作人员需严格按照仪器的操作规程进行操作，确保每一个步骤都符合要求，避免因操作不当引起的误差。　　3.样品准备 　　-样品的准备工作，如样品的采集、处理和储存等，对检测精度也有重要影响。样品的代表性、纯净度和稳定性等因素都会影响较终的检测结果。　　4.环境条件　　-环境条件，如温度、湿度、气压和振动等，对检测精度有显著影响。仪器在不同的环境条件下可能表现出不同的性能，因此需要在适宜的环境下使用仪器，以确保检测精度。　　5.校准与标定　　-定期校准与标定是确保仪器检测精度的重要措施。通过校准，可以消除仪器在使用过程中由于漂移、老化等因素引起的误差，确保测量结果的准确性。　　6.仪器维护　　-仪器的日常维护与保养对检测精度也有重要影响。定期清洁、检查和更换仪器的易损部件，可以延长仪器的使用寿命，保持其良好的工作状态，从而提高检测精度。 　　三、提高检测精度的方法　　1.选择高性能的仪器　　-根据具体的检测需求，选择性能优良、精度高的仪器，以确保检测结果的准确性。　　2.严格遵循操作规程　　-操作人员需经过专业培训，掌握仪器的操作要领，严格按照操作规程进行操作，避免因操作不当引起的误差。　　3.规范样品准备　　-样品的采集、处理和储存需按照相关标准和规范进行，确保样品的代表性和稳定性，避免因样品问题引起的误差。　　4.控制环境条件　　-在使用仪器时，尽量选择适宜的环境条件，避免在异常环境下使用仪器，以确保检测精度。 　　5.定期校准与标定　　-定期对仪器进行校准与标定，消除仪器漂移、老化等因素引起的误差，确保仪器的测量精度。　　6.加强仪器维护　　-定期对仪器进行清洁、检查和维护，确保仪器处于良好的工作状态，延长其使用寿命，提高检测精度。　　总之，蛋白质分析仪的检测精度受多种因素的影响，通过科学合理的管理和操作，可以显著提高其检测精度和应用效果。在实际应用中，应根据具体情况，采取有效的措施，确保仪器的较佳性能和应用效果。

6月美国质谱学会年会(ASMS)上发布的最新数据表明，新的仪器和工作流程极大地提高了基于质谱的血浆蛋白组学实验的覆盖深度和通量。这些进步可使质谱成为各应用领域中更有用的工具，包括血浆蛋白生物标志物的开发以及迄今由Olink和SomaLogic等亲和性平台主导的大规模人群研究。　　血浆是一种易于获取和常用的样本来源，尤其是在临床工作和人群研究中。然而，由于血浆含有大量丰度较高的蛋白质和较宽的动态范围，传统的质谱蛋白质组学分析能力不足。对于细胞裂解物的分析，质谱工作流程可测量8000到12000个蛋白质，但对血浆，类似的工作流程只能测量500到1000个蛋白质。虽然可通过去除丰度较高的蛋白质或进行粗分离来改善这一情况，但这也会牺牲通量。　　去年，瑞士蛋白质组学公司Biognosys在Journal of Proteome Research杂志上发表了一项研究，他们使用赛默飞的Orbitrap Exploris 480质谱仪，通过两小时的液相色谱梯度测量了180个去除了高丰度蛋白的血浆样品中的2732个蛋白质，这是未进行血浆分离处理情况下最高深度的血浆蛋白质组分析。　　最近，蛋白质组学公司Seer推出了一种新的血浆蛋白组学解决方案。该公司的Proteograph系统使用一组纳米颗粒来富集血浆蛋白质，然后可以使用质谱等技术对其进行鉴定和定量分析。与传统的血浆蛋白组学方法相比，Seer系统在覆盖深度和通量上都有所提升。在一份发表于四月BioRxiv 预印本的研究中，威尔康奈尔医学院-卡塔尔团队使用该系统分析了345个血浆样本，测量了大约3000种蛋白质，在其液相色谱-质谱法的运行时间下每天可分析大约10个样本。　　根据以上数据，Biognosys分析和Seer系统的覆盖深度都接近于Olink的Explore平台，后者可以在血浆中测量大约3000种蛋白质，但它们仍远远落后于SomaLogic的SomaScan平台，后者可以在血浆中测量大约7000种蛋白质。在每周约70个样本的处理量上，Biognosys和Seer系统的通量仍然落后于Olink和SomaLogic平台，后者每周分别可以处理多达1000个和340个样本。　　ASMS年会上，赛默飞展示了使用Seer最新发布的Proteograph XT试剂盒在其新的Orbitrap Astral仪器上测量大约6000种蛋白质的数据，每天处理大约30个血浆样本。这些数据标志着血浆蛋白组学工作流程的重大进展，并表明在大规模血浆研究方面，结合Seer Proteograph等血浆富集技术的质谱法与基于亲和性的平台现在可能成为竞争对手。　　剑桥大学临床医学院MRC流行病学单位的生物信息学家Maik Pietzner表示：“坦白说，我们没有预见到这么大的飞跃。”他和他的同事在大规模蛋白质基因组学研究中使用了SomaLogic的SomaScan和Olink的Explore。他指出，根据ASMS展示的数据，“看起来现在似乎变得可行了”，因为他们的研究需要1000个或更大的样本队列。　　华盛顿大学基因科学教授Michael MacCoss还表示，质谱技术具备的覆盖深度和通量使其成为大规模人群研究的有用工具。他说：“像英国生物库(UK Biobank)或弗雷明汉心脏研究(Framingham Heart Study)这样的大型队列……这些样本的价值是巨大的，研究人员希望能够以最少的资源获取最多的信息，很多实验都使用了Olink或SomaLogic。”　　如果质谱技术能够可靠地提供ASMS演示中展示的覆盖深度和通量，它可能成为亲和性平台的有力补充和竞争对手。许多蛋白质存在多种形式，或称为蛋白质变体，其变异包括氨基酸变异、截断或翻译后修饰等，这些变化会影响它们的功能，在亲和性平台上往往不清楚或不确定测量的是蛋白质的哪种变体。质谱方法更适合分析这些不同的蛋白质变体。　　Olink总裁Carl Raimond表示，他认为质谱和亲和性平台是“绝对互补的”，并补充说“看到蛋白质分析领域有创新是非常好的”。然而，他表示在Olink占据领先地位的大规模人群研究中质谱技术近期可能无法成为竞争对手，他同时也质疑ASMS展示的令人印象深刻的数据在广泛应用时是否能够经受考验。他说：“细节决定成败。提出要求很容易，但真正能够实现或提出关于这一要求背后的问题则是完全不同的事情。”Raimond补充说，虽然质谱技术不断改进，但亲和性平台也将不断进步。Olink正在将其Explore平台扩展到约5,000种蛋白质靶点，而SomaLogic计划在今年年底前将SomaScan平台扩展到覆盖约10,000种蛋白质。Pietzner同样表示，虽然在ASMS上发布的数据令人兴奋，但他和他的同事们期待看到更广泛的数据，包括总体的蛋白质覆盖范围，不同蛋白质和肽段在样本中检出的一致性和重复性。他说，“亲和性方法已经应用于规模大于50,000的人群队列中，并带来了惊人的发现。我们需要进行头对头的比较以评估这些新的质谱技术是否能够实现类似的扩展。”　　MacCoss表示，使用质谱进行此类研究的公司或研究人员需要提供数据，证明他们能够在每个样本中一致且可重复地测量一组核心蛋白。他说：“当人们使用Olink时会有一个清单，上面列出了每次都会测到的蛋白质。我们仍然需要这样做。我们仍然需要说，这是每次实验都会返回定量值的蛋白质列表……以及测量中获得高质量分析数值的蛋白。”　　Pietzner表示，他和他的同事目前正在努力扩展他们的蛋白质基因组学研究以包括质谱技术。强生和强生制药公司的神经科学数据科学主管，以及英国生物库药物蛋白质组学项目(PPP)主席Christopher Whelan表示，目前一个规模最大的蛋白质基因组学人群研究项目正在实施基于质谱的蛋白质组学。　　Seer本月宣布推出Seer技术访问中心，该中心将组合其XT试剂盒与Orbitrap Astral质谱仪，为没有质谱仪的用户提供蛋白质组学服务。　　尽管到目前为止很难全面评估赛默飞的Orbitrap Astral和Seer的Proteograph XT的性能，但一些早期用户表示其产生的结果很出色。　　Cedars-Sinai精准生物标志物实验室主任Jennifer Van Eyk一直在使用Orbitrap Astral进行血浆蛋白质分析，在这方面它比先前的仪器有更强的能力。Van Eyk表示，在每天运行60个样本时，新仪器可测得的蛋白质数量是相同工作流程下使用Thermo Fisher的Exploris 480仪器的2到2.5倍。　　她说：“我们不仅可以检测到更多蛋白质，而且可以定量更多蛋白质，并且这些蛋白质是可重复的，也就是说，如果我们运行一个样本五次，我们确实会五次都观察到同样的蛋白。这是一个很大的飞跃。”这台仪器最出色的或许是其高通量，Van Eyk表示，她和她的同事们每天可以运行多达180个的未去除高丰度蛋白的血浆样本并获得良好的数据和深度的覆盖。她说，“在每天运行180个样本的情况下，突然间你可以开始讨论运行10,000个样本，然后它就成为一个人群研究了。”Van Eyk和她的同事目前正在试验Seer Proteograph系统，以“充分测试”其性能，并评估是否要将其作为血浆蛋白质组学工作流程的一部分。　　威斯康星大学麦迪逊分校的生物分子化学和化学教授Joshua Coon指出，他的实验室能够使用50分钟的液相色谱梯度在未处理的血浆中测量大约1,500种蛋白质，并且已经在该仪器上开发出了一种一分钟的直接注射方法，能够在每个样本中测量约200种蛋白质。　　Coon还是SeerProteograph平台的用户，尽管他尚未将其与Orbitrap Astral结合使用。他的实验室一直在使用Seer XT试剂盒分析阿尔茨海默病患者的血浆样本以及长期新冠肺炎(long COVID)个体的样本。他说，尽管他的团队尚未开始处理大批量样本，但在初步工作中，实验室每个样本一致地测量到约3,000种蛋白质，这是不使用Seer系统时的五倍左右。他认为，当研究人员将工作流程应用于Orbitrap Astral系统时，这些数字还会进一步提高。　　除了覆盖深度外，Coon表示，Proteograph对简化质谱样品制备非常有用。他说：“我没有完全认识到到它的自动化程度，它非常方便。现在主要的用户是一个一年级和二年级的研究生……所以他们必须快速学习。他们在处理样本、获得消化产物和肽段方面取得了很大的成功。当你有新人或者长时间不做该工作的人时，进行大规模蛋白质组学研究的样品制备将耗费整个实验一半以上的精力，只需使用该平台然后熟练掌握。”　　尽管Seer Proteograph平台提供的覆盖深度使质谱血浆蛋白质组学在某些应用中与Olink和SomaLogic等亲和力平台更具竞争力，但Seer本身在血浆富集领域面临新的竞争。　　在ASMS会议上，蛋白质组学样品制备公司PreOmics推出了其ENRICH-ist富集血浆和血清蛋白质的试剂盒。该试剂盒使用非功能化顺磁性微珠来富集低丰度蛋白质，据该公司称，与未去除高丰度以及未富集的血浆相比，用该试剂盒处理血浆可将蛋白质检出率从50%提升至100%。PreOmics首席执行官Garwin Pichler表示，微珠与缓冲液的结合可在去除高丰度蛋白的同时富集低丰度蛋白以提高覆盖深度。Biognosys推出了一种新的基于微珠的血浆蛋白质组富集试剂盒，作为其TrueDiscovery服务平台的一部分。据该公司称，这种试剂盒可以高通量定量人类血浆中约4,000种蛋白质。　　此外，在本月，华盛顿大学研究人员领导的团队在BioRxiv预印本上发表了一篇论文，描述了一种使用ReSyn Biosciences的磁性微粒富集血浆蛋白质的方法，其通过结合血浆中的膜结合囊泡并分析相关蛋白质来提高覆盖深度。华大的MacCoss是这篇预印本的通讯作者，该预印本的第一作者Christine Wu也是该富集方法的主要开发者。他们能够在Orbitrap Astral上使用30分钟的液相色谱梯度稳定地定量约4,800种血浆蛋白质，每天可处理约40个样本。在使用一小时的液相色谱梯度时，他们能够测量5,000到6,000种蛋白质。MacCoss他们迄今没有过度挑战该方法的能力，所以这些数字是相对保守的。MacCoss表示，由于Seer公司的技术成本较高，研究人员对于血浆蛋白质组学富集的替代方法很感兴趣。他说：“Seer在制造这些产品方面做得很好，但成本是一个高门槛。”　　维也纳分子病理研究所的蛋白质组学负责人Karl Mechtler表示，他与Seer的讨论中，每个样品的报价大约是600美元。他说：“如果我有100个样品，对于一个蛋白质组学实验室来说，这是一笔巨款。”他指出，对于一个典型的蛋白质组学实验室，一个合适的价格范围应该在每个样品25到50美元左右。Wu表示，使用华大的富集方法进行实验的每个样品成本低于5美元。PreOmics将ENRICH-ist试剂盒作为完整蛋白质组学样品准备工作流程的一部分销售，每个样品总共80美元。　　在回答成本问题时，Seer公司董事长兼首席执行官Omid Farokhzad表示，他认为价格是“价值交换的问题”。他说：“并非所有内容都是等价的。问题在于，从Seer所提供的与其替代方案所提供的内容来说，价值交换是什么?”在血浆蛋白质组学领域最新的发展中，这个问题的答案似乎是一个不断变化的目标。　　参考文献：[1] Tognetti Marco,Sklodowski Kamil,Müller Sebastian et al. Biomarker Candidates for Tumors Identified from Deep-Profiled Plasma Stem Predominantly from the Low Abundant Area.[J] .J Proteome Res, 2022, 21: 1718-1735.[2] bioRxiv - Genomics Pub Date : 2023-04-21 , DOI：10.1101/2023.04.20.537640Karsten Suhre, Guhan Ram Venkataraman, Harendra Guturu, Anna Halama, Nisha Stephan,Gaurav Thareja, Hina Sarwath, Khatereh Motamedchaboki, Margaret Donovan, Asim Siddiqui, Serafim Batzoglou, Frank Schmidt

瓜氨酸化是影响蛋白质结构和功能的关键的翻译后修饰。尽管它与各种生物过程和疾病发病紧密相关，但由于缺乏有效的方法来富集、检测和定位该翻译后修饰，其潜在机制仍然知之甚少。近期，威斯康星大学麦迪逊分校李灵军教授课题组报道了生物素硫醇标签的设计和开发，该标签能够通过质谱法对瓜氨酸化进行衍生化、富集来实现可靠的鉴定。作者对小鼠组织的瓜氨酸化蛋白质组进行了全局分析并且从432种瓜氨酸化蛋白质中识别出691个修饰位点，这是迄今为止最大的瓜氨酸化数据集。作者发现并阐述了这个翻译后修饰的新的分布和功能并且表示该方法有希望为进一步破译瓜氨酸化的生理和病理作用奠定基础。这项工作以“Enabling Global Analysis Of Protein Citrullination Via Biotin Thiol Tag-Assisted Mass Spectrometry”为题发表在国际化学权威杂志Analytical Chemistry上 (https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c03844)，文章作者为Yatao Shi#, Zihui Li#, Bin Wang#，Xudong Shi , Hui Ye, Daniel G. Delafield, Langlang Lv, Zhengqing Ye, Zhengwei Chen, Fengfei Ma，Lingjun Li*。此外，李灵军教授课题组进一步拓展了此方法的实用性。作者通过应用二甲基化亮氨酸(DiLeu)等重标记策略第一次实现了瓜氨酸化的高通量定量研究，并利用这一方法揭示了瓜氨酸化在人体细胞DNA损伤及修复过程中的重要作用。相关成果以“12-Plex DiLeu Isobaric Labeling Enabled High-Throughput Investigation of Citrullination Alterations in the DNA Damage Response”为题同样发表在Analytical Chemistry上(https://doi.org/10.1021/acs.analchem.1c04073)，文章作者为Zihui Li, Bin Wang, Qinying Yu, Yatao Shi, Lingjun Li*。　　研究的主要内容　　作者设计了一种生物素硫醇标签，它可以很容易的以低成本合成并且可以与瓜氨酸残基和2,3-丁二酮发生特异性反应(图 1a)。这种衍生化不仅增加了质量转移以允许更可靠的鉴定，而且还引入了生物素部分，使修饰分子的后续富集成为可能。该生物素硫醇标签设计具有紧凑的结构，在高能碰撞解离 (HCD) 期间仅产生两个碎片/诊断离子(图 1b)。 因此，肽主链可以保持良好的裂解效率，并在 HCD 或电子转移解离 (ETD) 期间分别产生丰富的b/y或c/z离子系列。在 HCD(图 1c)、ETD或电子转移/高能碰撞解离(EThcD)碎裂下，衍生化肽标准品的序列收集质谱图几乎完全覆盖相应的肽序列。实验结果表明生物素硫醇标签衍生的瓜氨酸化肽可以产生用于解析及标注的高质量的串联质谱图，并且与各种裂解技术相结合时可以提高瓜氨酸化位点的识别可信度。　　图1|用于瓜氨酸化分析的生物素硫醇标签设计。a，使用生物素硫醇标签和 2,3-丁二酮对瓜氨酸肽进行衍生化。 b，HCD、ETD 或 EThcD 片段化后生物素硫醇标签衍生的瓜氨酸化肽的片段化位点。c，HCD 裂解后生物素硫醇标签衍生的瓜氨酸肽标准品 SAVRACitSSVPGVR 的串联质谱图。　　在接下来的实验中作者使用该生物素硫醇标签和基于质谱的自下而上的蛋白质组学方法对瓜氨酸化进行分析(图2a)。作者在体外利用 PAD(一种可以催化瓜氨酸化的酶)催化的人组蛋白 H3 蛋白来验证这个过程。作为未被PAD催化的阴性对照，未发现组蛋白的肽段被鉴定为瓜氨酸化，证明了生物素标签反应的高特异性(图 2b)。在体外 PAD 处理后，作者 发现许多精氨酸残基被催化为瓜氨酸，并且大量的位点被高可信度的鉴定为瓜氨酸化位点(图 2c)，进一步表明该方法的高效性。在 HCD 碎裂后，其产生了一系列丰富的 b/y 离子，可以帮助准确的表征在同一肽段上单个(图 2d)以及多个(图 2e)瓜氨酸化位点。　　图2|使用生物素硫醇标签进行体外瓜氨酸化分析。a，使用生物素硫醇标签进行蛋白质瓜氨酸化分析的实验工作流程。b、c，在体外 PAD 处理之前 (b) 和之后 (c) 组蛋白 H3 蛋白的瓜氨酸化分析。 已识别的瓜氨酸化位点在序列中以蓝色字母突出显示。 序列下方的红色矩形表示鉴定的瓜氨酸化肽，而瓜氨酸化位点以蓝色显示。 d，PAD处理的组蛋白 H3 (R64Cit) 的已鉴定瓜氨酸化肽的串联质谱图示例。 e，PAD 处理的组蛋白 H3 的同一肽上鉴定的两个瓜氨酸化位点(R70Cit 和 R73Cit)的串联质谱图示例。　　接下来，作者们尝试利用所开发的方法对复杂的生物样本中的瓜氨酸化进行全局分析，并希望能够以此提供阐明生物体中瓜氨酸化调节机制的依据。首先，作者对小鼠的六个身体器官和五个大脑区域进行了深入的瓜氨酸组分析，生成了第一个小鼠瓜氨酸组组织特异性数据库。作者从432种瓜氨酸化蛋白质中以高置信度的方式鉴定了691个瓜氨酸化位点(图 3a)。更重要的是，这些蛋白质中约有 60% 未曾在UniProt 数据库检索并被报道，这一结果极大地扩展了对瓜氨酸化以及这些底物蛋白质如何受到瓜氨酸化影响的理解。作者发现结果中与 UniProt 数据库的已知的瓜氨酸位点重叠部分较少(图 3b)，这可能是因为 UniProt 中描述的近 40% 的瓜氨酸化位点是基于相似性外推理论而没有实际的实验证据。此外，许多报道的位点位于组蛋白上，尤其是蛋白质末端，可能会逃过自下而上质谱策略的检测(图 3b)。图 3c 展示了单位点瓜氨酸化和多位点瓜氨酸化蛋白质分布情况，其中 70% 的已鉴定蛋白质仅有一个瓜氨酸化位点被检测到。　　这个新发现的瓜氨酸化蛋白质组为推测瓜氨酸化的调控机制提供了宝贵的资源。例如，作者在髓鞘碱性蛋白(MBP)上鉴定到了九个瓜氨酸化位点，而在 UniProt 数据库中只有四个(图3d)。作者的结果提供了高质量的串联质谱图，不仅证实了已知修饰位点的存在(图3e)，而且还高可信度的识别了未知的位点(图 3f)。然后作者进行了瓜氨酸化肽段的序列分析，发现在鉴定的瓜氨酸化位点两侧并没有高度保守的氨基酸序列模式(图3g)，但是谷氨酸残基更频繁地出现在瓜氨酸的N末端侧附近。这与Fert-Bober 等人报道的小鼠瓜氨酸组分析结论一致。另一方面，Tanikawa 等人发现在人体组织和血浆中大约五分之一的 PAD4 底物含有 RG/RGG 基序。同样，Lee 等人及相关研究人员观察到天冬氨酸和甘氨酸残基在瓜氨酸化位点出现频率偏高。值得注意的是，这些研究使用了不同的人源细胞系或组织，因此作者的结果可能表明在不同物种之间瓜氨酸化位点周围的序列模式是不同的。为了更好地辨别瓜氨酸化蛋白质所涉及的功能，作者展示了基因本体论(GO)富集分析的热图，其显示了二十个最显著富集的细胞成分(图3h)以及KEGG途径(图3i)。作者发现小鼠大脑组织和身体器官之间存在明显差异，而瓜氨酸蛋白更多地参与大脑功能。具体来说瓜氨酸化蛋白质集中在轴突、髓鞘、核周体和突触中，因此在中枢神经系统中可能发挥着重要的作用。　　图3|不同小鼠组织的大规模瓜氨酸组分析。a，不同小鼠组织中已鉴定的瓜氨酸化蛋白和瓜氨酸化位点的数量。 b，本研究中鉴定的瓜氨酸化位点与 UniProt 数据库中报告的位点比较。 c，每个鉴定的瓜氨酸化蛋白质的瓜氨酸化位点数量分布。d，本研究中确定的瓜氨酸化位点与 UniProt 数据库中关于髓鞘碱性蛋白的瓜氨酸化位点的比较。e、f，在髓磷脂碱性蛋白 R157Cit (e) 和 R228Cit (f) 上鉴定的两个瓜氨酸化位点的示例串联质谱图。g，鉴定的瓜氨酸化肽的序列。瓜氨酸化位点位于中间的“0”位置。字母的高度表示每个氨基酸在特定位置的相对频率。 h,i，使用 Metascape 生成的热图显示不同小鼠组织中显着丰富的(p 值 0.01)细胞成分 (h) (KEGG) 通路 (i)。　　为了进一步拓展该方法的实用性，作者应用了二甲基化亮氨酸(DiLeu)等重标记策略，第一次实现了对瓜氨酸化进行高通量的定量研究。作者首先使用瓜氨酸化标准肽段进行测试，证明在优化反应条件下DiLeu标记和生物素硫醇标记反应可以分步进行而不互相干扰(图 4B，4C)。同时，将标准肽段按照已知比例进行4-plex DiLeu标记并混合，再进行生物素硫醇标记和瓜氨酸化分析，结果显示了非常好的定量准确性(图5)。作者进一步优化了运用该方法在复杂生物样品中进行定量分析的实验方法，并且证明此方法依然可以实现极佳的定量准确度和精确度(图6)。　　图4|瓜氨酸化标准肽段测试DiLeu标记和生物素硫醇标记分步反应的特异性和效率　　图5|瓜氨酸化标准肽段测试DiLeu标记和生物素硫醇标记定量分析的准确性　　图6|复杂生物样品测试DiLeu标记和生物素硫醇标记定量分析的准确度和精确度　　作者接下来应用该方法对DNA损伤中瓜氨酸化的作用进行了研究。作者在MCF7细胞中用三种方法造成了DNA损伤，并定量分析了蛋白质瓜氨酸化的变化。作者一共鉴定到63种瓜氨酸化蛋白以及其包含的78个瓜氨酸化位点，并发现三个实验组中的瓜氨酸化表达相比于对照组呈现出非常不同的趋势(图7A)，这一结果表明瓜氨酸化在不同类型的DNA损伤模型中具有差异性的作用。通过对实验组中显著变化的瓜氨酸化蛋白进行生物过程网络分析，作者发现瓜氨酸化主要对DNA代谢，蛋白结构变化，翻译以及DNA修复等过程进行调控(图 7B，7C)。该实验结果表明蛋白瓜氨酸化对DNA损伤以及相关发病机理具有非常重要的作用。　　图7|高通量定量分析研究瓜氨酸化在DNA损伤中的变化及作用(来源：Anal. Chem.)　　小结　　本文章介绍了一种生物素硫醇标签的设计和开发，该标签可与瓜氨酸化肽段发生特异性反应并极大地提高了瓜氨酸化的富集和检测效率。在使用标准肽和重组蛋白证明该方法的有效性后，作者进一步优化了从复杂生物样品中检测瓜氨酸化的实验过程。通过此方法对小鼠五个大脑区域和六个身体器官的蛋白质瓜氨酸化进行分析，作者鉴定出432个瓜氨酸化蛋白以及691个瓜氨酸化位点，这是迄今为止最大的数据集。该研究揭示了这种翻译后修饰可能在神经系统中发挥的关键作用，并表明它们在包括呼吸和糖酵解在内的许多代谢过程中也可能发挥着重要作用。总的来说，实验结果表明蛋白质瓜氨酸化在不同组织中具有广泛分布并参与各种生物过程，这扩展了目前对蛋白质瓜氨酸化生理作用的认知和理解。此外，作者进一步拓展了此方法的实用性，通过应用DiLeu等重标记策略第一次实现了瓜氨酸化的高通量定量研究，并利用这一方法揭示了瓜氨酸化在人体细胞DNA损伤及修复过程中的重要作用。更重要的是，该方法可以提供一种普适、简单而强大的检测方法来明确鉴定蛋白质瓜氨酸化，这也将启发和有益于未来对这种翻译后修饰在生理和病理条件下的功能作用的研究。　　相关研究成果近期发表在Analytical Chemistry上的两篇文章中, 通过生物素硫醇标签辅助质谱法对蛋白质瓜氨酸化进行全局分析文章的共同第一作者是威斯康星大学麦迪逊分校博士生石亚涛，李子辉，王斌，并与中国药科大学叶慧教授课题组合作 应用二甲基化亮氨酸等重标记策略进行蛋白质瓜氨酸化高通量定量研究文章的第一作者是威斯康星大学麦迪逊分校博士生李子辉，两篇文章通讯作者为李灵军教授。更多关于李灵军教授研究团队的最新研究进展欢迎登陆课题组网站：https://www.lilabs.org/

仪器信息网讯 胰腺是人体最重要的器官之一。它产生胰岛素来调节血糖和帮助消化食物。如果胰腺失控，糖尿病、癌症或其他疾病就会威胁生命。然而，关于胰腺如何使人们保持健康以及器官如何衰竭，还有很多未知之处。数以万计的蛋白质控制着胰腺的工作方式：它如何生长和发育，如何产生消化酶以及如何分泌胰岛素。因此，科学家需要进一步了解蛋白质结构如何随时间变化，以帮助开发针对糖尿病或癌症的治疗方法。　　基于此，威斯康星大学麦迪逊分校药学院与化学系的李灵军课题组与医学和公共卫生移植外科医生Jon S Odorico合作开展了追踪从出生前到成年后期胰腺蛋白质组(整套蛋白质)变化的相关研究。研究团队还开展了细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的研究和分析，该物质能够指导细胞分化、迁移、形态和功能，对于在实验室细胞培养和器官移植过程中生长和支持胰腺细胞至关重要。但在人类胰腺研究中，目前尚未系统研究过不同发育阶段的ECM蛋白质组。该研究中，科学家们应用了基于质谱的定量蛋白质组学策略，并描述了四个年龄组的全蛋白质组和ECM特异性变化：胎儿(妊娠18-20周)，青少年(5- 16岁)，青年(21-29岁)和老年(50-61岁)。研究团队鉴定了3523种蛋白质，其中包括185种ECM蛋白质，并对其中的117种进行了定量。课题组检测了胰腺发育和成熟过程中以前位置的蛋白质组和基质组的特征。他们还使用免疫荧光染色观察特异性CEM蛋白质，并研究CEM在胰岛和腺泡间的定位变化。该研究全面的蛋白质组学分析有助于深入了解CEM在人类胰腺发育和成熟过程中所起的关键作用。　　成果表明，胰腺在人类整个童年时期都会显著重塑其蛋白质，最终在成年阶段稳定。值得一提的是，与癌症相关的蛋白质之间存在明显的年龄特异性变化，这一发现有助于研究人员加深对胰腺癌的了解。　　该成果于2月15日发表在《自然通讯》杂志上，论文题目为“Proteome-wide and matrisome-specific alterations during human pancreas development and maturation”。论文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-21261-w关于研究团队：威斯康星大学麦迪逊分校 李灵军教授　　　　李灵军教授在神经肽和功能性肽组学研究领域取得了开拓性的成果。她所带领的课题组针对神经生物学中的关键性课题，开发了一系列的基于质谱和微分离技术的研究平台，对由分子、细胞水平认识神经肽的功能以及神经退行性疾病生物标志物的发现作出了突出的贡献。据仪器信息网跟踪报道，李灵军教授曾荣获美国质谱学会颁发的Biemann奖章，是世界质谱领域的最高荣誉之一，授予那些长期在质谱学研究领域做出突出贡献的学者。此外，2016年英国分析科学家网站公布了全球50位最具影响力女性分析科学家名单，李灵军教授也荣誉获选。　　在以往的采访中，李教授也曾表示：”我最热衷于开发新型分析工具和策略来解决具有挑战性的生物问题。我们很高兴开发一套用于发现神经肽功能的多功能质谱工具，并使用这些技术来提高我们对大脑工作原理的理解。最近，我们正致力于开发用于定量MS分析和系统生物学中高通量测量的新型化学标签。我也热爱培训和指导研究生和博士后，并帮助他们过渡到成功的职业生涯的这个过程。”课题组官网: https://www.lilabs.org/　　团队合照

本期专家访谈Ben C Collins教授给我们讲述DIA方法的开发和应用，以及对蛋白质组学领域未来发展的看法。　　Ben C Collins　　英国贝尔法斯特女王大学生物科学学院教授　　主要从事定量蛋白质组学研究，研究方向主要集中在三个方面：数据非依赖采集的质谱方法(DIA)开发和应用；蛋白质相互作用网络和蛋白质复合物分析中的方法开发和应用；在宿主-病原体生物学、先天免疫、癌症生物学和药物发现中的应用。　　DIA的优势是什么，还有哪些问题亟待解决?　　在早期阶段，DIA获得认可面临的挑战之一是软件工作流程的复杂性。幸运的是，随着时间的推移，这一挑战已基本得到解决，DIA 数据分析也变得更加容易。数据采集过程本身变得更加简单，现在的方法也可以得到令人印象深刻的结果。特别是随着仪器的进步和新的分析采集方法的出现，许多基本问题已经得到解决。目前的重点应该是展示DIA的实际应用和优势，这包括进行广泛的基准测试和成功的示例展示。虽然持续的技术发展很有价值，但最紧迫的任务是有效利用现有技术。因此，应高度重视DIA技术的推广应用。DIA 最显著的优势是其已证明的有效性，它已被证明是一种可靠且稳健的蛋白质组学研究方法。在我目前的工作中，我对DIA在规模化蛋白质相互作用研究和化学蛋白质组学中的应用特别感兴趣，并启动了与参与药物发现的制药公司的合作。过去，这些公司在蛋白质组学方面投入了大量资金，但技术还不够先进，无法满足他们的需求。然而，我们现在正处于 DIA 可以为药物发现提供有价值线索的阶段。我们与这些行业合作很有前景，因为可以帮助他们识别有用的化合物、进行筛选并做出明智的决策。这是 DIA 如何为药物发现和其他领域的实际应用做出贡献的一个很好例子。　　您如何看待蛋白质组学领域学术界与工业界的关系?　　在考察蛋白质组学领域学术界和工业界的关系时，有必要分别考虑供应商和制药公司。从供应商看，我必须说学术研究人员和供应商之间的合作非常成功，双方都需要彼此的专业知识。我们一直与各种供应商合作，开发方法和应用的学术研究人员与开发仪器的供应商之间的协同作用是显而易见的。但与医药行业的关系却有些不同。近年来，药物发现领域发生了转变，开始认识到蛋白质组学可以为其工作带来价值。这种认识的转变在为制药公司提供服务的合同研究组织 (CRO) 数量不断增加中得到体现。这些 CRO 正在扩大并展示其对制药行业的作用。此外，有一种趋势是基于蛋白质组学技术建立药物研发公司。此类公司从风投获得大量资金的例子有很多。这些公司认为，他们独特的蛋白质组学技术可以显著帮助确定化合物的优先级、进行化合物筛选以及推进药物开发的各个阶段。这一趋势表明蛋白质组学技术在行业中变得越来越有价值。然而，在促进学术机构和制药公司之间的关系方面还有改进的空间。例如制药专业人士较少参与会议上的演讲报告。我们这样的组织提供了弥合鸿沟的机会，召开化学工程、蛋白质组学和药物发现领域的研讨会和活动等举措有助于提高知名度，加强学术界和制药界之间的联系。这种积极主动的方法可以进一步推动蛋白质组学技术与药物发现过程的整合。　　应该如何看待 AlphaFold 和 ChatGPT 等人工智能工具?蛋白质组学和人工智能如何共同激发更大的进步?　　从根本上讲，人工智能已经在质谱数据处理、信号预测、物理化学性质预测和分类任务等任务中展示了其实用性，这些应用已经显示出巨大的前景，并且已经为蛋白质组学领域做出了贡献。这种趋势可能会持续并扩大，进一步增强我们的数据分析和解释能力。然而，当涉及到揭示生物学机制等更复杂的问题时，人工智能的应用仍然是一个悬而未决的问题。例如，AlphaFold 在预测蛋白质结构方面的成功是一项重大成就，但将人工智能模型应用于深入理解生物学机制是一项更具挑战性的工作。一个关键挑战在于人工智能模型的“可理解性”。无论是在生物学还是在一般的人工智能应用中，了解人工智能系统如何得出结论和预测都是至关重要的。“可理解的智能”一词强调了这种需求。能够解释人工智能生成的见解背后的推理非常重要，尤其是在涉及复杂的生物系统时。从本质上讲，人工智能在蛋白质组学和生物学中具有多个层面的适用性。它已经在数据驱动的任务中证明了自己的价值，并且可能进一步扩展到预测药物敏感性或进行生物学预测等领域。然而，从人工智能模型中获得机械理解和真正的生物学见解是一项更具挑战性的工作。它需要解决与模型透明度和可解释性相关的问题。随着我们的前进，科学界应该将人工智能视为一种强大的工具，并共同努力，利用其潜力获得更深入的生物学见解。尽管还有一些挑战需要克服，但人工智能有能力在未来几十年内推动蛋白质组学和生物学的重大进步。　　您认为全球蛋白质组学研究人员应该如何合作实现“π-HuB”计划的目标?　　“π-HuB”计划无疑是一项具有全球影响力的开创性举措，科学界也渴望共同努力，为该项目做出积极的贡献。目前，该项目还处在讨论制定具体的合作机制和形式阶段。为了推进这种合作，科学家必须与政策制定者和政府联络沟通以获得必要的支持和资源。“π-HuB”计划国际合作将通过持续的讨论和规划继续完善。从本质上讲，虽然具体的合作结构尚未完全确定，但中国和国际科学界的共同承诺，使实现“π-HuB” 计划宏伟目标变得更有希望。　　您对蛋白质组学领域未来5-10年的发展有何预测?　　预测科学的未来总是充满挑战，但我可以对未来 5-10 年蛋白质组学领域的潜在发展提供一些见解。令人感兴趣的领域之一是基于质谱的方法和非质谱方法之间的平衡。我们正在见证基于亲和力的方法、纳米孔测序和单分子方法等技术的进步。关于哪种方法进展更快并有可能主导该领域的争论仍在继续。然而，重要的是不要教条地选择自己喜欢的方法，而是让数据来决定。在未来 5-7 年中，质谱分析可能会继续占据主导地位，但除此之外，其他方法也可能会占据主导地位，每项新技术都应根据其优点和缺点进行评估。另一个有进步空间的领域是研究蛋白质复合物和翻译后修饰的无偏性方法。目前，这方面的大规模检测方法还比较有限，需要进行创新。此外，蛋白质组学还有更广泛应用的潜力，特别是在药物发现和开发方面。在这方面，蛋白质组学可以成为宝贵的资源，并且其应用还有显著增长的空间。制药行业越来越认识到蛋白质组学在决策过程中的效用。在临床应用方面，蛋白质组学在发现工作方面具有巨大的潜力。然而，关于是否在临床环境中使用质谱或选择其他平台的争论仍将继续。这两种方法都应该探索，并根据实用性和有效性选择最合适的一种，常规且简单的技术可能更适合临床检测。值得注意的是，长期以来人们一直希望将高分辨率质谱技术整合到临床环境中。虽然这一目标过去设定为 10 年，但事实证明实现这一目标具有挑战性。供应商和研究人员一直在努力实现这一目标，但在临床实践中广泛采用的时间表仍不确定。总之，蛋白质组学领域是动态且不断发展的。未来 5-10 年，技术、应用领域和方法可能会取得进步, 灵活性、数据驱动的决策和创新对于塑造蛋白质组学研究的未来至关重要。

普渡大学和Tymora Analytical Operations的科学家团队通过对尿液胞外囊泡（EVs）蛋白质和磷酸化蛋白质进行质谱分析识别了一组可用于诊断帕金森病的蛋白质标志物。该项工作于本月发表在Communication Medicine，其中详细介绍了研究工作。该研究的部分资助来源于迈克尔J福克斯帕金森研究基金会，该组织的一部分工作就是探究EVs分析是否能识别新型的帕金森病标志物。EVs是由细胞分泌到各种体液中，被认为能反映来源细胞的分子组成。鉴于检测源自癌细胞的外泌体中的蛋白质或核酸比检测患者血液或尿液中自由循环的癌细胞相关核酸或蛋白质可能更容易的想法，胞外囊泡已成为液体活检研究的一个热门领域。同样的思路也适用于神经退行性疾病，尤其是从血液或尿液样本中寻找这些疾病的标志物，血液或尿液相比于脑脊液易于获取，但含有的相关标志物浓度通常较低。总部位于印第安纳州威斯特拉法叶市的Tymora是普渡大学化学生物学和分析化学教授安迪陶（Andy Tao）实验室的衍生企业。Tymora的首席执行官是Communication Medicine论文的通讯作者之一Anton Iliuk。Tymora专注于EVs的蛋白质组学和磷酸化蛋白组学分析，将其作为研究服务出售给外部合作伙伴以及用于其内部生物标志物和诊断方法的开发工作。2018年，该公司及其合作者在Journal of Proteome Research杂志上发表了一项研究，在该研究中，他们在尿液中收集的EVs中鉴定出约860种磷酸化蛋白质和超过2,000种未修饰的蛋白质。迈克尔J福克斯帕金森研究基金会的研究项目副总裁Shalini Padmanabhan是该论文的作者之一，她表示，基金会的研究人员在阅读该研究时“对结果很有兴趣”，因为鉴定到的蛋白中包括几种与帕金森病有关的蛋白质。Padmanabhan指出，当时基金会已经收集了大量来自帕金森病患者的尿液样本，并由Tymora技术看到一个检验新方法（识别帕金森病患者EVs蛋白质特征相对于健康对照组的变化）的机会。研究人员使用Tymora的EVtrap技术从哥伦比亚大学欧文医学中心收集的82个尿液样本中分离出EVs（21个健康对照组，13个携带与帕金森病相关的LRRK2突变但健康的人，28名没有LRRK2突变的帕金森病患者和20名携带LRRK2突变的帕金森病患者）。EVtrap方法使用包被疏水和亲水基团的磁珠来结合EVs的脂质双层膜。该方法可灵敏且可重复地捕获EVs，同时限制高浓度循环蛋白的捕获，这是相对于其他一些EV富集方法的优势。在分离出外泌体后，研究人员在赛默飞Q-Exactive HF-X仪器上进行LC-MS分析其蛋白质。他们识别4,476个独特的蛋白质和2,680个独特的磷酸化蛋白质，从中筛选出48个潜在的标记物，并最终确定了6个最佳标志物。他们发现，这六个标志物组合可以在曲线下面积为0.94的情况下区分健康人群和帕金森病患者。随后，研究人员用两个实验验证了这些表现最佳的蛋白质和与帕金森有关的其它蛋白质。其中一个实验利用靶向质谱技术测定13名健康对照组和23名帕金森病患者的蛋白质，另一个实验使用免疫方法测定10名健康对照组和10名帕金森病患者的蛋白质。Tao 表示，他的实验室继续与哥伦比亚大学的研究小组合作获取更多的样本，并且正在与普渡大学的同事Jean-Christophe Rochet合作研究蛋白质聚集在帕金森病、阿尔茨海默病和Lewy小体痴呆等神经退行性疾病中的作用。Tao 和 Rochet 正在探讨的一个问题是外泌体是否可能成为突触核蛋白α-synuclein(α-syn)的有用来源。在帕金森病患者中，错误折叠的α-syn聚集形成路易氏小体在大脑中积累，被认为会引起神经元损伤，也被认为是潜在的药物靶标和生物标志物。对于帕金森病的诊断，α突触核蛋白种子扩增检测方法前景光明。该方法通过将来自患者的αSyn与正常αSyn孵育并观察其是否产生帕金森病的特征性聚集物。通常，αSyn突触核蛋白样品从患者脑脊液中收集，需要进行脊髓穿刺。这促使研究人员探索通过血液或尿液样品等微创性的方式收集这种蛋白质，其中外泌体是一种潜在的采样途径。Padmanabhan指出，“虽然α-synuclein的分布范围及与帕金森病生物学相关性的全面了解仍不充分，但已有人提出外泌体可能富集有α-synuclein，包括病理性形式。”她补充说，到目前为止，福克斯基金会将外泌体用作αSyn的样本来源的主要工作侧重于在血液中的外泌体，“血液中α Syn的存在已经有研究支持”。然而，她表示该组织“继续探索所有可能的CSF替代方案，以改进临床使用的检测，作为我们持续开展的突触核蛋白生物学研究项目的一部分”。CEO Iliuk表示Tymora不打算继续开发Communication Medicine论文中确定的标记物，但他指出，神经退行性疾病，特别是阿尔茨海默病，已成为Tymora内部生物标志物开发工作和为外部客户工作的重点。Iliuk指出，虽然血浆被广泛认为是临床诊断阿尔茨海默病生物标志物的最切实可行的替代样本，但帕金森病的研究显示了尿液EVs作为神经退行性疾病生物标志物来源的潜力。他说：“我们在血浆方面做了相当多的工作，我认为那是主要关注的地方。但是我们最近一直在研究尿液。现在还处于非常初期的阶段，人们对其作为一种可行的样本还存在很多犹豫，因为它距离大脑太远了，所以并不是一个合情合理的选择。但我认为帕金森病的研究表明神经退行性疾病的标志物可以传播到尿液中并被检测到。”福克斯基金会支持了许多其他在尿液中寻找帕金森病蛋白标记物的努力，包括2021年由马克斯普朗克生物化学研究所蛋白质组学和信号转导部门主任Matthias Mann实验室发表的蛋白质组学研究，该研究确定了几种潜在的帕金森病蛋白标志物。文章链接：https://www.nature.com/articles/s43856-023-00294-w

2015年1月23日一期的Science公布了基于人类蛋白质图谱的大分析结果，包括与癌症相关的详细蛋白质图片，血液中蛋白质种类和数量，以及市场上被批准的所有药物所作用的目标蛋白质。 人类蛋白质图谱（The Human Protein Atlas）,是由Knut and Alice Wallenberg基金会于2014年11月支持的一个大型跨国研究项目。近期他们又开放了一个以人器官组织为基础的蛋白质图谱数据库。基于1300万个注释的图像，整个数据库涵盖了人体中的所有主要组织和器官的蛋白质分布，也标注了仅表达在特定组织，如脑，心脏或肝脏的蛋白。作为一个开放的数据资源，这个数据库提高了对人类生物学的基本见解，更有望帮助推动新的诊断和药物的开发。 在Science的这篇文章里，"基于组织的人类蛋白质组图谱" 结合基因组学，转录组学，蛋白质组学，以及基于抗体的分析，详细分析了大约20,000个蛋白质编码基因。分析结果表明，蛋白编码基因几乎一半都是普遍表达在所有分析的组织。而有大概的15％的蛋白质编码基因大量表达在一个或几个特定的组织或器官，包括众所周知的组织特异性蛋白质，如胰岛素和肌钙蛋白。睾丸是含有最丰富种类蛋白质的器官，其后是大脑和肝脏。分析结果还表明，大约3000种蛋白质是从细胞中分泌释放的，另有5500种蛋白位于细胞膜结构。 这一蛋白质图分析结果为制药行业的提供了重要信息。研究小组的Uhlé n表示,他们发现了市场上使用的药品有70%的作用目标是分泌或膜结合蛋白。有趣的是，另外30%被发现是作用其他组织和器官，这可能有助于解释药物的一些副作用，并且对未来药物开发提供一定的参考价值。 该数据库已经免费对外开放，网址是www.proteinatlas.org.

p style="text-align: center "img title="IMG_1279.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/053b4ae8-ce11-4330-abec-7a4ed6c2a53a.jpg"//pp　　2017年9月18日，在第十六届人类蛋白质组学年度世界大会(HUPO)上，Bruker推出了用于PASEF质谱的timsTOF Pro系统。该质谱采用了专有捕获离子迁移谱(TIMS)技术，能实现更高速度、更高灵敏、更强大的鸟枪法蛋白质组学分析，具有出色的单次肽和蛋白质鉴定性能。/pp　　基于TIMS创新技术的四极杆飞行时间质谱仪(QTOF-MS)由MaxQuant / Perseus和PEAKS Studio蛋白质组学分析软件支持，这种timsTOF Pro方法对于定量蛋白质组学工作流程尤其有利。/pp 从较小样品量的识别性能方面，这种独特的前端TIMS分析仪对更高速度的鸟枪法蛋白质组学进行了优化。其独特的双TIMS几何形状允许离子在第一个TIMS部分中并行累积，并且在实时执行额外的TIMS分离步骤之后，离子从第二个TIMS部分释放出来，用于MS / MS碎裂。这可以产生近100%的占空比，使得这种平行堆积和连续碎裂(PASEF)技术在酶促消化产生的蛋白质混合物中，应用可重复纳流LC-MS分析可以具有前所未有的性能。/pp style="text-align: center "img title="timsTOF_Pro nanoELUTE_3D - 副本.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/b2589663-240a-424c-8bb3-77fa0c6b1803.jpg"/　　/pp PASEF能力代表了性能的改进，因为它提供更高灵敏度和更高速度的鸟枪法蛋白质组学分析，而不损失质量分辨率。而之前，更高的扫描速度通常导致用于鸟枪法蛋白质组学的基于FT的质谱技术具有较低质量分辨率。这些临界限制可以由PASEF消除，允许以高灵敏度以及接近100%的占空比，同时还可以保持前体和产物离子的超高质量分辨率。双TIMS技术这一重要PASEF功能，有助于科学家们深入研究细胞复杂生物学以及发现重要低水平生物学蛋白。同时，这一功能也有助于蛋白质翻译和临床蛋白质组学研究中的验证和纵向研究。/pp　　定量蛋白质组学是蛋白质组学研究的关键领域，双重TIMS供电的PASEF提供了超越传统门控时间串联FT的质谱分析局限性的优势。新的timsTOF Pro提供超过四个数量级的动态范围，低肽负载(100-200ng)，这使得它非常适合于研究细胞生物学和临床中经常遇到的小细胞群体和低样品量的蛋白质组学。/pp　　德国马丁斯堡的马克斯· 普朗克生物化学研究所蛋白质组学和信号转导系主任马蒂亚斯· 曼(Matthias Mann)表示：“我的实验室与布鲁克合作开发PASEF技术，我们很高兴看到timsTOF Pro实现我们最初设想的鸟枪法蛋白质组学的潜力。这种新技术有可能革新蛋白质组学的几个领域：临床研究，其中速度和定量能力是运行大样本队列的关键 需要增加灵敏度的应用 富含磷酸肽或其中有限数量的细胞可用于分析的样品；并且对于使用等压标记的定量实验，其中使用捕获的离子迁移率的额外分离可以至少部分地消除引起所谓的比例压缩效应导致不可接受的误差的共分裂物质的干扰。我们对技术进一步发展的潜力感到非常兴奋。“/pp　　Bruker Daltonics的Omics解决方案副总裁Gary Kruppa表示：“蛋白质组学研究人员总是希望提高速度，灵敏度和定量能力，同时保持高分辨率，准确的质量和高保真度同位素图案，以便更深入地了解蛋白质组。使用PASEF，科学家们现在不需要将扫描速度和敏感度的解决方案进行权衡，它们通过TIMS前体离子选择获得高灵敏度，高扫描速度和无与伦比的特异性这三重效果。这提供了发现低水平生物相关蛋白质的可能性，目前它们是超出了非TIMS质谱仪的性能范围的。“/pp　　马丁· 马克斯普朗克生物化学研究所计算系统生物化学小组组长Juergen Cox评论说：“Bruker决定采用开放文件格式，以便我们可以直接使用原始数据，将有利于蛋白质组学研究人员的使用MaxQuant和Perseus软件平台。我们对数据质量特别重视，并期待与Bruker合作，通过最先进的客户支持软件和分析统计查询，我们可以使用PASEF在timsTOF Pro上获取数据。“/pp　　关于带有PASEF的timsTOF PRO/pp　　专有的timsTOF Pro系统使用通过捕获离子迁移光谱(TIMS)实现的PASEF，为鸟枪法蛋白质组学提供了行业领先的数据采集速度。 timsTOF Pro的独特双TIMS几何结合了TIMS设备中离子包的时间聚焦，意味着PASEF提供的速度优势同时提高了灵敏度和定量。所有这些在速度，灵敏度和定量方面的增益保持了Bruker的高性能QTOF质谱仪的优势，包括高质量分辨率(即使在最高数据采集速率下，分辨率为50,000 FWHM)，ppm精确质量和高同位素保真度(True同位素模式或TIPTM)。具有PASEF的强大的timsTOF Pro为科学家提供了深入细胞机器复杂生物学研究、发现低水平生物学重要蛋白质、在蛋白质翻译以及临床蛋白质组学研究中进行验证提供了有力工具。/pp　　关于MaxQuant和Perseus软件平台/pp　　MaxQuant是猎枪蛋白质组学数据分析的行业标准。 Juergen Cox在过去十年发展起来，已经成为肽，蛋白质和翻译后修饰的鉴定和定量最常用的包装。近期，MaxQuant已经适应于timsTOF数据的分析，管理由保留时间、离子迁移率、质量和信号强度所占据的空间中的4D特征。用于多元数据分析的Perseus软件支持生物和生物医学研究人员解释分子定量，相互作用和蛋白质翻译后修饰数据。 Perseus包含用于高维数据分析的统计工具的综合组合，涵盖归一化，模式识别，时间序列分析，跨学科比较和多重假设检验。/pp　　关于PEAKS Studio/pp　　生物信息解决方案公司的旗舰软件PEAKS Studio为蛋白质组学研究界提供了创新的质谱数据分析工作流程。自从在二十世纪初期首次亮相以来，PEAKS Studio已被高度认可，其基准测试从头测序算法被集成到所有其他鸟枪法蛋白质组学软件模块中。从头测序与传统数据库检索的结合确保了对原始光谱数据的完整解释，以满足质谱的复杂性和灵敏度，并为蛋白质组学和治疗性蛋白质发现提供了先进的解决方案，如通过肽/蛋白质鉴定和定量，肽图，翻译后修饰和序列变体。/pp　　PEAKS Studio提供的独特工作流程以及由timsTOF Pro的第四维离子迁移率引起的令人信服的数据质量促成了生物信息解决方案公司和Bruker的合作。/pp　　关于布鲁克公司(纳斯达克股票代码：BRKR)/pp　　55多年来，布鲁克已经使科学家们能够突破发现，开发新的应用，提高人类生活质量。 Bruker的高性能科学仪器和高价值分析和诊断解决方案使科学家能够在分子，细胞和微观层面探索生命和材料。/pp　　通过与客户的密切合作，Bruker在生命科学分子研究，应用和制药应用以及显微镜，纳米分析和工业应用方面实现了创新，生产力和客户成功。近年来，Bruker也成为细胞生物学，临床前成像，临床表现学和蛋白质组学研究，临床微生物学和分子病理学研究的高性能系统的提供者。/pp /p

沃特世公司（WAT:NYSE）最新推出了Protein-Pak™ Hi Res离子交换（IEX）色谱柱，用于在沃特世 ACQUITY UPLC 系统上分析生物分子，包括单株抗体、重组蛋白质、DNA/RNA和疫苗。生物治疗药物厂商使用该色谱柱分析完整生物分子的各种带点状态，可以获得更高的分辨率，更快的分析速度，以及更好的重现性。，因此，提高了监测能力，有助于厂商高品质和高效率的生产。 　　沃特世Protein-Pak Hi Res IEX系列色谱柱的开发，是为了使用UPLC技术定性分析目前在众多新型生物制药疗法中发现的重组蛋白质和单株抗体的。这些无孔的、高健合密度颗粒技术与传统的多孔IEX颗粒技术在大分子分离方面比较，具有较高峰值容量和较高的分辨率。另外，新的颗粒技术及表面化学特性也提高了色谱柱的载样能力和分辨率，同时最大限度减小了色谱柱污染。　　在聚合物颗粒的表面健合的离子交换的健合相包括强阴离子交换(季胺盐，Q)和弱强阳离子交换物质(羧甲基(CM)和磺丙基(S))。它们在pH值3-10这个范围内可以耐受高盐浓度和高压。离子交换色谱法被证实是重要的用于评估生物分子带电状态的技术。生物分子生产的重现性是个难点问题。是重现，蛋白质带电量的变化是脱酰胺或糖基化作用的良好标志，进而会影响产品稳定性和功效，因此需要密切监测。更多详情，请访问网站 www.waters.com/proteins。　　将UPLC技术的能力扩展至生物分子　　2004年，沃特世公司推出了ACQUITY UPLC系统，彻底改变了LC分离技术，相比传统HPLC技术，UPLC技术大大的提高了样品通量。沃特世公司最新的Protein-Pak Hi Res IEX色谱柱与ACQUITY UPLC系统的完美结合，可以在保持关键组分的分辨率下，获得最高的灵敏度。另外，每根色谱柱都采用沃特世ACQUITY UPLC eCord™ 技术，有助于监测单根色谱柱在整个色谱柱生命周期内的使用参数 – 信息永远伴随着色谱柱。　　总之，这些互相结合的技术极大地增强了单株抗体、重组蛋白质、DNA或RNA以及疫苗成分的定性分析能力。　　关于沃特世公司(www.waters.com)　　50年来，沃特世公司(NYSE:WAT)通过提供实用且可持续的创新，实现了全球医疗保健、环境管控、食品安全、水质监测等领域的显著进步，为基于实验室的许多机构创造了商业价值。　　沃特世的技术突破和实验室解决方案开创了分离科学、实验室信息管理、质谱技术和热分析的相互组合，为客户提供了一个持久成功的平台。　　沃特世公司2009年的总收入达15亿美元拥有5,200名员工 公司正在帮助全球客户推进科研进程，并为其提供绝佳的操作体验。

2011年6月8日，苏黎世联邦理工学院及 AB SCIEX(全球领先的生命科学分析技术公司)的科学家汇聚一堂，公布一项基于质谱应用的新技术，利用此项技术，科学家有史以来首次可以获得单独蛋白质组学样品分析中每个肽段的数据。SWATH 采集模式 是一项重大技术突破，使用质谱研究蛋白质组学的用户得以获知整个蛋白质组的完整数据。在与苏黎世联邦理工学院 Ruedi Aebersold 博士进行的 MRMAtlas 合作的过程中，AB SCIEX 将开发 MS/MSALL 增强功能，使 AB SCIEX TripleTOF™ 5600 系统可以运行 SWATH 采集模式供全球科学家使用。有关 SWATH 的详情将于本周在丹佛召开的美国质谱协会 (American Society of Mass Spectrometry, ASMS) 会议上公布。　　SWATH 采集模式是 Aebersold 博士及其在苏黎世联邦理工学院的团队共同开发，为未来的蛋白质组学研究提供的一种新的工作流程，该系统预计将产生令人震撼的蛋白质组学新发现，并克服目前的质谱平台中因数据重复而给科学家带来的困惑。本技术关键优势在于其能提供样品的完整定量与定性结果，该结果能按照提出的新假设经电脑模拟进行回溯性的挖掘。　　这一新技术是对 MRMAtlas 的完美补充，MRMAtlas 以质谱技术为基础，向大多数人类蛋白质组提供研究平台。全球科学家利用这一图谱极大推进了生物标志物研究、蛋白药物开发、基础生物及生物医学研究。MRMAtlas 提供简单及有效分析能力，探索蛋白质组中前所未见的新领域。利用 TripleTOF 5600 系统的 SWATH 采集模式，将有更多科学家能使用 MRMAtlas。　　现有高分辨率及轨道阱质谱系统仅能定性检测出复杂样品中的蛋白质子集，因为它们 MS/MS 获取速度相对较慢，且为探知更准确的定量结果，常常会采用其他仪器再次进样分析样品。面对这些挑战，AB SCIEX 开发出 SWATH 采集模式可以在单一进样分析中同时对所有蛋白质与肽进行定量与定性检测。　　与 Aebersold 博士及其团队共同展开的这一活动还将继续开发软件处理方法，更好解析 MRMAtlas 的数据。SWATH 采集模式 是 AB SCIEX 的 MS/MSALL 技术的延伸，只能在 TripleTOF™ 5600 上完成，这是因为需要将极高的采集速度与定量能力、精确质量及高分辨率整合在一起方可实现。MS/MSALL 以前已成功用于脂质组学及特种结构表达。现在进一步扩展此能力，MS/MSALL 采用 SWATH 采集模式，极大提高了工作效率，因此可以结合 LC/MS， 显著提高了质谱技术。　　瑞士联邦理工学院(苏黎世联邦理工学院)分子系统生物学学院Ruedi Aebersold 博士、教授　　“利用 SWATH 和 MRMAtlas，我们能够重新思考研究蛋白质组学的方法。我们能够利用前所未有的方法研究样品，我们预计这将产生令人震撼的新发现。与 AB SCIEX 合作使我们达到开发此项技术所必须的速度与定量层次，我们将向全球整个科学界提供这一技术。”　　AB SCIEX 制药与蛋白质组学业务部总经理兼副总裁 Dave Hicks　　“AB SCIEX 再一次与世界一流科学家紧密合作，推动质谱技术发展，达到其他任何厂家均难以想象的高度。TripleTOF 5600 系统提供的能力和速度使这一革命性的 SWATH 技术成为现实。我们预计这一发展将在接下来的几年中重振蛋白质组学研究。”

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，Improved Label-Free Quantification of Intact Proteoforms Using Field Asymmetric Ion Mobility Spectrometry [1]，文章的通讯作者是美国俄克拉荷马大学的Luca Fornelli教授。完整proteoforms的非标记高通量定量方法的应用对象通常为从整个细胞或组织裂解物中提取的0 - 30 kDa质量范围内蛋白质。然而当前，即使通过高效液相色谱或毛细管电泳实现了proteoforms的高分辨率分离，可鉴定和定量的proteoforms的数量也不可避免地受到固有的样品复杂性的限制。近年来，随着质谱技术的发展，自上而下蛋白质组学质谱(top-down proteomics)研究中蛋白质的鉴定数量大大提升，生成了包含数万种proteoforms的数据集，但在proteoforms的量化能力方面并没有得到相应的性能提升。为克服这一问题，本文中作者通过应用场不对称离子迁移谱法(Field asymmetric ion mobility spectrometry, FAIMS)对大肠杆菌中的proteoforms进行了非标记定量。由此产生的改进允许在单次LC-MS实验中采用多个FAIMS补偿电压(Compensation voltages, C.V.)，而不会增加整个数据采集周期。与传统的非标记定量实验相比，FAIMS的应用在不影响定量准确性的情况下，大大增加了鉴定和定量的proteoforms数量。首先，作者优化了质谱stepped-C.V.数据采集方法对Orbitrap Eclipse性能的影响，并从中筛选出了最优条件(−40、−20、0 V组合)。所有最新的基于Orbitrap的质谱仪(包括Exploris platform和Orbitrap Ascend)都可以采用single time-domain transients(即单次微扫描)在top down FTMS实验中生成高质量的质谱图。作者认为这对于在单次LC - MS2运行期间应用多个C.V.值的采集策略特别有益。接下来，作者应用该方法对大肠杆菌中的蛋白质进行了检测，并与传统的LC - MS2 DDA采集方法进行了比较(图1)。如图所示，每个C.V.值下的总离子流图都不同，且这一额外的分离导致在LB(Luria broth)和M9(醋酸钠处理)样品中鉴定到的proteoforms的数量显著提升。　　图1. 样本制备方法和proteoforms鉴定结果总结虽然在LC-FAIMS和LC-only数据集中，大多数鉴定到的proteoforms质量都小于15 kDa，但其中约20%的质量大于18 kDa甚至高达33.3 kDa(图2)。对已鉴定的proteoforms列表的深入分析表明，达到鉴定低丰度proteoforms的关键参数之一是在串联质谱(MS2)中有足够的时间注入离子。　　图2. A. FAIMS和非FAIMS鉴定到的proteoforms的质量分布。B. 鉴定到的proteoforms与注射时间之间的关系。最后，作者采用ProSight PD v 4.2 (Proteineous, Inc)进行了基于MS1的非标定量，结果显示基于FAIMS的数据集在LB样品(蓝色)和M9样品中检测到的差异表达的proteoforms均有所增加(图3)。作者评估了两个数据集之间的差异(使用和不使用FAIMS采集数据)，以验证FAIMS的应用是否会对量化准确性产生不利影响，结果只有1个proteoform显示相互矛盾的丰度趋势。这种差异是由于该蛋白和一个共流出蛋白之间质谱峰几乎完全重叠造成的。它们具有非常接近的单同位素质量，这样高水平的信号干扰可以很容易地干扰基于MS1的量化。启用FAIMS可以使MS1谱图简化，因为两种proteoforms可以富集在两种不同的C.V. 值下。　　图3. 大肠杆菌proteoforms无标记定量结果分析。作者将LC - FAIMS - MS2数据集与通过BUP在类似样品上获得的非标定量结果进行比较，得出两个主要的结论:1. BUP仍然对蛋白质组提供了更深层次的定量表征 2. BUP提供了与单个基因相关的所有产物的整体丰度水平信息 而TDP方法表明，给定的UniProt accession可以由多个差异表达的proteoforms组成，可能具有不同的行为(即在给定条件下，一些被上调，另一些被下调)。这一额外的信息可能具有潜在的生物学意义，但在基于BUP的定量分析中可能会被遗漏。本文描述的基于FAIMS的定量数据采集方法与PEPPI(Passively eluting proteins from polyacrylamide gels as intact species)蛋白分离技术完全兼容，产生0 - 30 kDa的组分，并且可以方便地根据待分析蛋白的平均质量调整质谱参数(C.V.值)，未来在更大的蛋白质定量方面具有广阔的应用前景。　　撰稿：张颖　　编辑：李惠琳　　原文：Kline JT, Belford MW, Huang J, Greer JB, Bergen D, Fellers RT, Greer SM, Horn DM, Zabrouskov V, Huguet R, Boeser CL, Durbin KR, Fornelli L. Improved Label-Free Quantification of Intact Proteoforms Using Field Asymmetric Ion Mobility Spectrometry. Anal Chem. 2023 Jun 13 95(23):9090-9096.　　李惠琳课题组网址www.x-mol.com/groups/li_huilin　　参考文献　　1.Kline JT, Belford MW, Huang J, Greer JB, Bergen D, Fellers RT, Greer SM, Horn DM, Zabrouskov V, Huguet R, Boeser CL, Durbin KR, Fornelli L. Improved Label-Free Quantification of Intact Proteoforms Using Field Asymmetric Ion Mobility Spectrometry. Anal Chem. 2023 Jun 13 95(23):9090-9096.

p style="text-indent:28px"span style="font-family:宋体"近日，美国威斯康辛大学麦迪逊分校葛瑛团队借助布鲁克/spanspanmaXis II/spanspan style="font-family:宋体"电喷雾行时间串联质谱在自顶而下的蛋白质组学研究中取得了重大突破。相关研究成果发表在著名期刊“/spanspannature methods/spanspan style="font-family:宋体"”（/spanspanIF=26.919/spanspan style="font-family:宋体"）上，文章题目“/spanspanA photocleavable surfactant for top-down proteomics/spanspan style="font-family:宋体"”。/span/pp style="text-indent:28px"span style="font-family:宋体"翻译后修饰的蛋白质在许多关键细胞中发挥着重要作用，因此对蛋白质组进行全面的分析，对于解释分子作为一个系统如何相互作用，以及了解细胞系统在健康和疾病中的功能至关重要。而基于/spanspantop-down/spanspan style="font-family:宋体"质谱技术的蛋白质组分析是表征完整蛋白质组的新兴手段，它可以提供一个系统的、全局的、无偏差的、定量的蛋白质评估，包括相互作用，修饰，位置和功能方面的信息。/span/pp style="text-indent:28px"spantop-down/spanspan style="font-family:宋体"质谱技术是将反相液相色谱（/spanspanRPLC)/spanspan style="font-family:宋体"直接与/spanspanMS/spanspan style="font-family:宋体"偶联来进行操作的，可以对来自于全细胞或组织裂解液的复杂混合物中的完整蛋白进行快速、灵敏的分析。然而，由于蛋白质组的高度复杂性和动态性，蛋白质组学依然面临着巨大的挑战。其中之一便是蛋白质溶解的问题，为了有效的从细胞或组织中提取蛋白质，提取缓冲液中通常含有表面活性剂。但是传统的表面活性剂与质谱不相容，它们的存在极大的抑制蛋白质的质谱信号，因此在质谱分析前要先除去表面活性剂。/span/pp style="text-indent:28px"span style="font-family:宋体"葛瑛团队针对这一难题，创造性的合成了可光降解的表面活性剂/spanspanAzo/spanspan style="font-family:宋体"。并对其进行了一系列的质谱分析，来验证其作为表面活性剂在蛋白质组学中的优异性能。/span/pp style="text-align:center" span style="font-family:宋体"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201904/uepic/b918dc99-5c9a-4371-b153-1b8548915f5d.jpg" title="1_meitu_1.jpg" alt="1_meitu_1.jpg" width="579" height="102" style="width: 579px height: 102px "//span/pp style="margin-top:8px margin-right:0 margin-bottom:8px margin-left:0 text-align:center"strongspan style="font-family:宋体"图/spanspan1 Azo/span/strongstrongspan style="font-family:宋体"作用机理/span/strong/pp style="text-indent:28px"span style="font-family:宋体"首先在保证对蛋白质增溶的前提下，借助布鲁克/spanspanmaXis II/spanspan style="font-family:宋体"电喷雾质谱分析小分子蛋白质/spanspanubi/spanspan style="font-family:宋体"与/spanspan0.1%/spanspan style="font-family:宋体"表面活性剂的相容性质。结果表明，在所有被评估的表面活性剂中，/spanspanAzo/spanspan style="font-family:宋体"是唯一一种既能有效溶解蛋白质，又能与完整蛋白质的/spanspantop-down/spanspan style="font-family:宋体"质谱分析相容的表面活性剂。/span/pp style="margin-top:8px margin-right:0 margin-bottom:8px margin-left:0 text-align:center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201904/uepic/7c38388f-f60e-4eea-ba33-92d4e4c80f54.jpg" title="8.jpg" alt="8.jpg" width="385" height="346" style="width: 385px height: 346px "//pp style="text-align: center "strongspan style="font-family:宋体"图/spanspan2 Azo/spanspan style="font-family:宋体"与常用表面活性剂的质谱相容性评价/span/strong/pp style="margin: 8px 0px text-align: center "img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201904/uepic/7da2baff-7569-4bd5-b574-f4bca40cfad0.jpg" title="9.jpg" alt="9.jpg" width="385" height="281" style="width: 385px height: 281px " border="0" vspace="0"//pp style="margin: 8px 0px text-align: center "strongspan style="font-family:宋体"图/spanspan3 /spanspan style="font-family:宋体"表面活性剂对心肌组织裂解液/spanspanLC-MS/spanspan style="font-family:宋体"分析的影响比较/span/strong/pp style="text-indent:28px"span style="font-family:宋体"对/spanspanAzo/spanspan style="font-family:宋体"在在线反相液相色谱和质谱联用（/spanspanspanRPLC-MS/span/spanspanspanspan style="font-family:宋体"）中自顶向下蛋白质组学中的应用/span/span/spanspan style="font-family:宋体"进行评估，对比没有表面活性剂蛋白浓度和质谱信，使用/spanspanAzo/spanspan style="font-family:宋体"时号均明显升高（/spanspanb/spanspan style="font-family:宋体"）。在单一的/spanspanRPLC-MS/spanspan style="font-family:宋体"运行中，在/spanspanAzo/spanspanspan style="font-family:宋体"存在的蛋白质缓冲液中/span/spanspan style="font-family:宋体"观察到/spanspan663/spanspan style="font-family:宋体"个独特的蛋白形式，而在无/spanspanAzo/spanspan style="font-family:宋体"存在的蛋白质缓冲液中只观察到了/spanspan6/spanspan style="font-family:宋体"个（/spanspanc/spanspan style="font-family:宋体"，/spanspand/spanspan style="font-family:宋体"）。此外，从三种液相色谱/spanspan-/spanspan style="font-family:宋体"质谱联用的准确质量测量上，共检测到/spanspan2836/spanspan style="font-family:宋体"种蛋白质形式（/spanspane/spanspan style="font-family:宋体"，/spanspanf/spanspan style="font-family:宋体"）。/span/pp style="text-align:center"span style="font-family:宋体"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201904/uepic/3892f310-54a7-42e0-a5fc-3281847cecf7.jpg" title="10.jpg" alt="10.jpg" width="385" height="335" style="width: 385px height: 335px " border="0" vspace="0"//span/pp style="margin: 8px 0px text-align: center "span /spanstrongspan style="font-family: 宋体 "图/span4 RPLC-MSspan style="font-family: 宋体 "）/spanAzospan style="font-family: 宋体 "在自顶向下蛋白质组学中应用/span/strong/pp style="margin-top:8px margin-right:0 margin-bottom:8px margin-left:0"span style="font-family:宋体"此外，/spanspanAzo/spanspan style="font-family:宋体"还能大大提高检测的深度，并显示出许多在对照样品中检测不到的蛋白质。/span/pp style="text-align:center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201904/uepic/d4e74520-0d11-49b0-aec3-4c991dc3f8f5.jpg" title="11.jpg" alt="11.jpg" width="385" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 385px height: 320px "//pp style="margin: 8px 0px text-align: center "strongspan style="font-family:宋体"图/spanspan5 Azo/spanspan style="font-family:宋体"队翻译后修饰蛋白质的质谱分析/span/strong/pp style="text-indent:28px"span style="font-family:宋体"葛瑛团队还进一步证明/spanspanAzo/spanspan style="font-family:宋体"能有效提取心肌组织及胚胎肾细胞的膜蛋白，并能够进行自上而下的蛋白质组学质谱分析。通过借助布鲁克用/spanspanmaXis II/spanspan style="font-family:宋体"电喷雾质谱对表面活性剂/spanspanAzo/spanspan style="font-family:宋体"的质谱分析，验证了/spanspanAzo/spanspan style="font-family:宋体"与/spanspanMS/spanspan style="font-family:宋体"具有良好的相容性，能有效的增加蛋白质的溶解度，可用于高通量自顶向下的蛋白质组学。同时，/spanspanAzo/spanspan style="font-family:宋体"还是唯一一种能够有效溶解蛋白质，包括膜蛋白，而不阻碍下游自上而下的质谱分析的强表面活性剂。/span/pp style="margin-top:8px margin-right:0 margin-bottom:8px margin-left:0 text-indent:28px"strongspan style="font-family:宋体"产品介绍/spanspan--/spanspan style="font-family:宋体"/span/strongspan style="font-family:宋体"布鲁克/spanspanmaXis II/spanspan style="font-family:宋体"电喷雾飞行时间串联质谱/span/pp style="text-align:center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201904/uepic/a9e5b405-9ff8-414d-8d4e-de35249fa535.jpg" title="0.jpg" alt="0.jpg"//pp style="text-align: center "strongspan style="text-indent: 28px "span style="font-family: 宋体 text-indent: 28px "布鲁克/spanmaXis II/spanspan style="text-indent: 28px font-family: 宋体 "电喷雾飞行时间串联质谱/span/strong/pp style="text-indent:28px"span style="font-family:宋体"布鲁克/spanspanmaXis II/spanspan style="font-family:宋体"电喷雾飞行时间串联质谱在广泛的应用领域展现出良好的性能和解决最具挑战性分析难题的能力，/spanspanmaXis II/spanspan style="font-family:宋体"能同时提供全方位的性能指标。另外，/spanspanmaXis II/spanspan style="font-family:宋体"提供电子转移解析/spanspan(ETD)/spanspan style="font-family:宋体"功能，能够分析包括单克隆抗体亚基在内的整体大蛋白序列分析。可选功能“/spanspanHighMass/spanspan style="font-family:宋体"”有利于表征大分子和天然状态的蛋白质复合物如抗体药物偶联物。/span/pp style="text-indent:28px"spanmaXis II/spanspan style="font-family:宋体"配备上最新的/spanspanTOF/spanspan style="font-family:宋体"创新技术，使其在整合解决方案、灵敏度、光谱精确度和动态的范围方面处于领跑位置。来自于/spanspanmaXis II/spanspan style="font-family:宋体"的高质量数据，有准确的质量和真实的同位素模型/spanspan(TIP)/spanspan style="font-family:宋体"，结合/spanspanBruker/spanspan style="font-family:宋体"公司的计算公式发现工具，/spanspanSmartFormula/spanspan style="font-family:宋体"™ 和/spanspanSmartFormula 3D/spanspan style="font-family:宋体"™ ，确保提供最大程度的准确分子式。/span/pp style="margin-top:8px margin-right:0 margin-bottom:8px margin-left:0 text-indent:28px"spanmaXis II/spanspan style="font-family:宋体"最佳适用范围包括抗体表征/spanspan(/spanspan style="font-family:宋体"完整蛋白与亚基/spanspan)/spanspan style="font-family:宋体"、分析整蛋白和蛋白质组、蛋白复合物、小分子鉴定与定量，采用/spanspanHigh Mass/spanspan style="font-family:宋体"可选功能，可以获取天然态质谱图，同时有电子转移解析/spanspan(ETD)/spanspan style="font-family:宋体"功能/spanspan(/spanspan style="font-family:宋体"可选/spanspan)/spanspan style="font-family:宋体"。/span/ppbr//p

干血斑（Dried Blood Spot, DBS）是一种微量血液采集、干燥和储存的生物采样技术。该技术由Robert Guthrie于1963年首次应用于新生儿苯丙酮尿症（PKU）筛查[1]。相比于临床检验中常用的液态血液基质，干血斑技术具有采血量少、操作简便、一般不需冷冻或冷藏、储存和运输成本低等优点，已应用于新生儿疾病筛查、流行病学样本分析、药物研发等领域。将干血斑应用于蛋白质研究，拓宽了蛋白质分析研究的生物样本采集形式，具有很好的临床研究和实际应用价值。本文重点讨论两种常见干血斑蛋白质分析技术及应用。1. 基于干血斑的蛋白分析技术1.1 酶联免疫吸附分析法原理：酶联免疫吸附分析法（ELISA）是指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合，进行免疫反应的定性和定量分析，具有灵敏、特异、及易于自动化操作等特点。根据免疫识别和信号输出方式的不同，ELISA可以分为双抗体夹心法、直接免疫竞争法和非直接免疫竞争法等。实验材料及分析仪器：研究人员可通过购买固相载体、抗体或抗原进行包被制备ELISA试剂盒或购买市售试剂盒。酶联免疫吸附测定试剂盒已成为实验中不可缺少的工具，目前国内外Elisa试剂盒生产厂家很多，如上海酶联生物、Abcam、BioVision等，科研人员可根据研究需求选择高质量的试剂盒品牌，以提升分析效率及结果有效性。干血斑处理：以干血斑HIV分析为例：用HIV阴性混合血液样本对阳性混合血液样本进行梯度稀释后，以固定体积点样至干血斑收集卡，室温下干燥。采用干血斑打孔设备获得一定直径的干血斑样片，用300 μL PBST（0.05% Tween20）室温静置洗脱，洗脱液经酶标仪测定样本吸光度值（OD值）。分析和结果处理：以标准曲线样品的浓度为横坐标，以测得的OD值为纵坐标，根据不同类型ELISA本身的特点拟合标准曲线（如竞争法和夹心法可以采用四参数拟合回归方程），选择R值大于0.99的拟合方式，并根据标准曲线计算样品浓度。分析仪器：酶标仪（MicroplateReader）即酶联免疫检测仪，是对酶联免疫检测（EIA）实验结果进行读取和分析的专业仪器。酶标仪可分为普通酶标仪和多功能酶标仪，普通酶标仪的主要功能一是充当分光光度计的角色，二是基于免疫反应的ELISA分析，价格相对较低；多功能酶标仪可实现吸光度、荧光强度、时间分辨荧光、荧光偏振和化学发光等多种检测模式拓展，满足生化分析、免疫检测、细胞研究、药物筛选和机制探索等众多领域检测需要。目前酶标仪市场常用的仪器品牌进口的有：伯腾、帝肯、美谷分子、珀金埃尔默和赛默飞等；国产的有：安图生物、奥盛和闪谱等。1.2 基于质谱技术的蛋白质分析技术基于质谱（Mass Spectrometry, MS）技术的蛋白质分析方法具有高通量、自动化程度高、分离能力强等特点，已逐渐成为蛋白质分析和鉴定的重要技术。原理：蛋白酶将样本中的蛋白质消化成肽段混合物，可采用鸟枪法（Shotgun）对蛋白组进行全谱分析，在最小限度分离蛋白质的同时实现复杂混合物中成千上万种蛋白质的鉴定和定量；或用液相色谱法（Liquid Chromatography, LC）对酶解肽段进行分离，经基质辅助激光电离（MALDI）或电喷雾电离（ESI）等软电离技术将其离子化，带电蛋白质离子通过质量分析器将具有特定质荷比的肽段离子分离，然后经检测器分析。质谱技术与干血斑技术的结合为蛋白质组学研究和蛋白生物标志物筛选提供了强有力手段。图1 基于质谱技术的蛋白质组学分析流程[2]样本处理：采用干血斑打孔设备获得一定直径的干血斑样片，转移至EP管中，加入少量水后用组织研磨器或匀浆机快速、彻底破碎干血斑样片，剧烈摇晃试管。后续处理与常规样本的蛋白提取相似：加入蛋白裂解液（如SDS、SDC、RIPA等），冰上裂解约半小时（辅以震荡），低温、高转速离心后取上清，得干血斑蛋白提取物。分析和结果处理：蛋白质组学数据分析和结果处理包括：①应用数据库搜库对蛋白进行鉴定并相对定量分析，借助如主成分分析、相关性分析、聚类分析等方法掌握数据的整体情况；②对蛋白的生物学功能进行注释，例如GO功能注释、KEGG注释等；③通过蛋白的生物学功能或参与的信号通路可以进一步筛选与研究目标相关的蛋白进行后续的分析。分析仪器：蛋白质组学分析主要使用高分辨液质联用系统进行。可进行蛋白质组学分析的液质联用系统目前以进口为主，常见仪器主要有布鲁克、赛默飞、沃特世和SCIEX的Q-TOF、Q-Orbitrap、Q-Trap质谱仪等。2. 干血斑蛋白分析应用实例分享2.1 采用ELISA法分析干血斑中HIV抗体1996年美国食品药品监督管理局（FDA）批准了以干血斑为载体的样本邮寄传递检测模式，并证明其可作为传统检测模式的良好补充，极大地推动了干血斑技术在传染性疾病分析中的应用。在我国，全国艾滋病检测技术规范（2020年修订版）第二章第4部分“常规HIV抗体或HIV抗体抗原联合检测方法”中指出：ELISA试验可使用血液（包含血清、血浆和干血斑）或尿液样本检测HIV抗体，也可联合检测HIV抗体抗原，说明干血斑在基于ELISA技术的HIV抗体检测中是可代替血浆、血清的生物样本基质，具有广阔的应用前景。近年来，相关专家多推荐受检者使用HIV自主采样包，根据说明采集干血斑样本，匿名寄至专业实验室，通过电话等方式获取结果。图2 RDA Spot公司的干血斑自主采样包（包含一次性采血针，消毒湿巾，样本采集卡，使用说明书及用于运输的特殊包装）图片来源：https://www.rdaspot.com/2.2 基于质谱技术的干血斑蛋白质组学分析研究人员建立了应用Thermo UltiMate 3000 RSLCnano纳升液相色谱联合Q Exactive HF-X质谱技术的干血斑蛋白质组学分析方法，并于2020年在Journal of Proteome Research中报道了该项工作[3]。由于全血中含有较多可溶性蛋白（如血红蛋白、白蛋白、纤维蛋白原等），研究人员为克服干扰、提高分析灵敏度，采用碳酸钠沉淀法（SCP）成功去除干血斑中可溶性蛋白并富集目标分析物疏水性蛋白。采用基于数据非依赖采集模式（DIA）的蛋白质组学分析方法，进行EMBL-EBI（针对人类蛋白GO功能分析的综合注释数据库）蛋白组学搜库分析，通过限定质谱扫描范围和延长离子累积时间等提高了分析方法的检测灵敏度。该研究最终在健康受试者干血斑样本中鉴定到1977种蛋白质，其中包含585种疾病相关蛋白。3. 小结与展望干血斑是一种先进的血液采集及保存技术，具有操作简单、对人体损伤小、便于运输和储存等优势，在临床快检中受到关注。干血斑技术与蛋白质研究的结合将有效推动蛋白质研究成果临床转化。随着分析技术的发展和相关研究的不断深入，前处理自动化仪器、高通量分析仪器和成熟的蛋白分析流程将成为干血斑蛋白质分析的有力工具，干血斑蛋白质分析定将在蛋白质分析中发挥重要作用，为高通量诊断、差异蛋白分析和疾病生物标志物挖掘等拓展新的技术平台。参考文献：[1] R. Guthrie, & Susi, A., A Simple phenylalanine method for detecting phenylketonuria in large populations of newborn infants., Pediatrics, 32 (1963) 338–343.[2] B. Kuster, M. Schirle, P. Mallick, R. Aebersold, Scoring proteomes with proteotypic peptide probes, Nature Reviews Molecular Cell Biology, 6 (2005) 577-583.[3] D. Nakajima, Y. Kawashima, H. Shibata, T. Yasumi, M. Isa, K. Izawa, R. Nishikomori, T. Heike, O. Ohara, Simple and sensitive analysis for dried blood spot proteins by sodium carbonate precipitation for clinical proteomics, Journal of proteome research, 19 (2020) 2821-2827.

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，PACTS-Assisted Thermal Proteome Profiling for Use in Identifying Peptide-Interacting Proteins。该文章的通讯作者是来自北京蛋白质组学研究中心的贾辰熙和Chen Yali研究员。生物活性肽是一类重要的生物分子，通过与蛋白受体相互作用，参与调控多种生物学进程。研究肽-蛋白相互作用对于理解这些功能分子的调节机制至关重要。目前已开发多种方法用于表征肽-蛋白的相互作用，例如通过引入荧光探针在多肽上来监测蛋白-多肽的相互作用，或者将多肽固定在磁珠或其他载体材料上进行进一步的亲和沉淀。然而以上方法都需要对多肽进行修饰，导致多肽的结构发生改变，进一步影响多肽-蛋白相互作用，产生假阳性结果。细胞热转移变分析（CETSA）和热蛋白质组分析（TPP）作为一种无修饰/无标签技术已被广泛用蛋白-配体相互作用研究。当配体与蛋白结合后，蛋白的热稳定性发生了改变，导致熔解曲线(Melting cure)发生位移。通过监测熔解温度的变化(∆Tm)，实现对蛋白-配体相互作用的检测。CETSA以及TPP允许在天然环境下研究分子互作，从而保留了内源性蛋白表达水平、翻译后修饰、局部微环境等生物物理特性。除了改变蛋白质的热稳定性，肽配体与蛋白质受体相互作用还会导致蛋白构象、疏水性和溶剂可及性的改变，一些配体甚至起到生物助溶的作用。所有这些特性的改变会导致研究体系中靶蛋白丰度的变化。这种由肽段配体结合诱导蛋白的丰度改变现象称之为PACTS。而PACTS也可以被合理的利用用于识别与肽段配体结合的靶蛋白。基于此，本文将PACTS与TPP技术相结合用于肽-蛋白质相互作用研究，PACTS可以辅助TPP分析，特别是在TPP分析过程中，由于配体-靶蛋白结合导致靶蛋白丰度降低至质谱检测限以下，无法绘制熔解曲线的情况下，PACTS可以作为另一个重要的监测手段。如图1所示，PACTS辅助TPP分析的实验流程大致如下：将蛋白提取液分成2份，分别与缓冲液（对照组）、肽配体（实验组）孵育，再将孵育后的每组样本等分成10份，在10个不同的温度下加热3 min。加热完成后，离心，收集上清液。利用SDS-PAGE将肽段与蛋白分离并进行胶内酶切。酶切后的肽段随即用TMT 10-plex标记，最后通过LC-MS/LS进行定量分析。将37 °C下对照组、实验组中同一蛋白的丰度变化作为PACTS的衡量指标（蓝框）。将在不同温度下蛋白的相对丰度变化转化为熔解曲线（黑框），实验组相较于对照组，同一蛋白熔解曲线的位移（∆Tm）作为TPP的衡量指标。综合两种方法识别出的靶标蛋白，作为最终的筛选结果。图1. PACTS辅助TPP分析的实验流程图作者首先用标准肽段-蛋白互作对验证了PACTS辅助TPP分析的可行性。如图2所示，右侧为对照组/实验组中靶蛋白在不同温度下丰度变化（Western blot），中间及左侧则是基于Western blot数据生成PACTs以及熔解曲线。对于JIP1-JNK1互作对，PACTS显示没有明显的丰度变化，而熔解曲线则显示发生了位移（图2A）。与之相反的，对于HOXB-AS3-hnRNP A1互作对，PACTS显示出明显的丰度变化，而熔解曲线则由于靶蛋白丰度降至检测限以下而无法绘制（图2B）。以上两个例子都说很好地说明，PACTS和TPP是两种互补的检测手段，使用两种方法同时检测有利用提高结果的准确性。作者还考察了不同细胞环境对蛋白-配体互作的影响（图CD及图EF）。来源于293T细胞的OPRN1与Enkephalin配体互作产生的熔解温度变化为∆Tm= 0.5 °C（图E），而来源于Hippocampus的OPRN1与Enkephalin配体互作产生的熔解温度变化为∆Tm= -14.4 °C（图F）。这个差异可能是由于孵育时不同的微环境造成的。图2. PACTS辅助TPP分析标准肽段-蛋白互作对。随后，作者将PACTS辅助TPP分析应用到组学层面。Aβ肽是淀粉样斑的主要成分，而淀粉样斑块主要存在于阿尔茨海默症（AD）患者的大脑中。在Aβ肽中，Aβ1-42在介导神经毒性和氧化应激中起关键作用。THP-1细胞类似于小胶质细胞，小胶质细胞功能障碍加速了与年龄相关的神经退行性疾病的进展，如AD。作者利用了PACTS辅助TPP分析研究了THP-1细胞中与Aβ1-42肽段相互作用的蛋白。如图3所示，图3A为PACTS结果，共发现37个蛋白在37 °C下有丰度变化。而TPP结果（图3B）则显示66个蛋白熔解曲线发生了位移。PACTS与TPP的结果具有较小的重合，说明两种方法具有互补性。GO分析表明（图3C），大多数与Aβ1-42相互作用的蛋白存在于细胞外泌体、胞质溶胶和细胞膜中。外泌体在AD中充当双刃剑，一方面，外泌体传播有毒的Aβ肽和过度磷酸化的tau遍及整个大脑，并诱导神经元凋亡。另一方面，它们消除大脑中的Aβ肽并促进其降解。了解Aβ肽与外泌体蛋白之间的相互作用有利于更好的开发AD治疗治疗药物。此外，作者用Western blot的方法进一步确认识别出的靶标蛋白（图D-E）。最后，作者用免疫共沉淀的方法进一步证明靶蛋白与Aβ1-42存在相互作用。图3. PACTS辅助TPP分析与Aβ1-42相互作用的蛋白总之，本文开发一种PACTS辅助TPP的分析方法，可用于大规模组学层面肽段-蛋白质相互作用研究。该方法具有无标记、无修饰的优势，无需额外实验，即可在TPP分析的同时获得PACTS信息。该方法也有助于理解多肽-蛋白质复合物相关的分子调控机制，进一步开发新型治疗药物。撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：PACTS-Assisted Thermal Proteome Profiling for Use in Identifying Peptide-Interacting Proteins 参考文献1.Zhao T, Tian J, Wang X, et al. PACTS-Assisted Thermal Proteome Profiling for Use in Identifying Peptide-Interacting Proteins. Anal Chem. 2022 94(18): 6809-6818. doi:10.1021/acs.analchem.2c00581

p　　用于生物样品分析的蛋白指纹法，该专利技术被国际顶级科学杂志《科学》以及医学界权威杂志《柳叶刀》评为世界蛋白指纹图谱和蛋白质芯片排名第一的技术。针对这项技术的一些问题，火石创造对许洋博士进行了深度的专访。/pp style="text-align: center "img width="300" height="385" title="001.png" style="width: 300px height: 385px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/ebf3be8e-c0c2-49d6-9891-a76d207d183f.jpg" border="0" vspace="0" hspace="0"//pp style="text-align: center "strong　　许洋博士/strong/pp　　许洋博士一直致力于蛋白质组学研究开发，怀揣近五十项蛋白分子质谱诊断技术的自主发明专利。2009年他创办了湖州赛尔迪生物医药科技有限公司，凭借专利产品蛋白指纹图谱仪成为行业领头羊，也成为此类器械行业标准的起草者。/ppstrong　　火石：请问您为什么做蛋白质谱?/strong/pp　　许洋博士：我研究蛋白质谱是偶然也是必然。在美国纽约著名的Sloan-Kettering研究所单克隆抗体实验室早期研究治疗白血病时，我们制造了全世界第一枚人源化单克隆抗体(抗CD33人源化单抗)。后来我又和顶尖美国公司合作第一个将人源化单克隆抗体做成了靶向药。有了扎实的基础，必然能在更窄的蛋白质谱领域做的更好。/pp　strong　火石：蛋白质谱当前的临床应用情况如何?/strong/pp　　许洋博士：只有拿到医疗器械注册证才算进入临床，蛋白质谱目前只有三种临床应用：对肿瘤的筛查 对早期肾脏疾病的分析 在细菌上的鉴定应用。蛋白质谱在国内仍处于非常早期的阶段，且具有垄断性，极少人能做且在做。/ppstrong　　火石：作为国家“千人计划”医疗器械特聘专家，您认为蛋白指纹图谱仪在医疗器械中的角色是什么?/strong/pp　　许洋博士：蛋白指纹图谱仪分析的大数据可以生动地比喻为人体疾病的健康地图。/pp　　蛋白指纹究竟是什么?把质谱仪的显示屏中的每一个蛋白质都用一个分子量来表达，这些分子量组合起来就叫蛋白指纹。就像每个人的指纹都是不同的，每种疾病的特定蛋白质表达物也不同，称之为指纹图谱。蛋白指纹图谱技术是由蛋白质芯片及分析仪器——表面加强激光解析电离飞行时间质谱仪两部分组成，可以将病人血清中蛋白质成分的变化记录下来，绘制成蛋白指纹质谱图，并显示样品中各种蛋白的分子量、含量等信息。将这张图谱与正常人、某种疾病病人的谱图或基因库中的谱图进行对照，就能最终发现和捕获新的特异性相关蛋白及其特征。这种方法具有微量、精确、简易、快速的特点，适应于基础和临床等各个领域。/pp　　之所以将蛋白指纹图谱仪分析的大数据比喻为人体疾病的健康地图(MAP)，是因为既然β2—微球蛋白是11731、人绒毛膜促性腺激素是37580、转甲状腺素蛋白是13761(数字对于计算机的应用更好管理)，而每个蛋白质在质谱仪分析中都是数字，它本身就是大数据。任何物质在质谱底下都是数字，综合起来就是大数据。我把大数据串联起来，就能将分子在身体的MAP做出来。譬如一位吸烟的男士来体检，能发现他吸了烟数年之后肺部出现影像学病理性位点，结合质谱仪分析发现相关的疾病标志物，我们能够模拟出肺部疾病的健康地图，即通过质谱仪检测的健康大数据，可以模拟出该患者肺部出现了数个小红点，点击每个红点后都会解释原因，如显示铅、铬等数据是否超标，以及告诉你相应的对策。这样的技术开启了全智能健康4.0时代。/pp　　Tips：β2—微球蛋白(β2—MG)被认为是诊断早期肾功能损伤的敏感指标，尤其对于糖尿病肾病、高血压肾病、红斑狼疮肾炎的早期诊断具有重要参考价值，因此β2—微球蛋白的测定在临床上是有多种价值的。/pp　　strong火石：您和您的团队在蛋白质组学研究的技术或者方法上有什么突破吗?/strong/pp　　许洋博士：蛋白质作为标志物对肿瘤的诊断，确实没有太大的进展。/pp　　一直以来蛋白质组学研究面临的重大瓶颈是蛋白质分离问题：人体内有十万种蛋白质与衍生物，多数可能与疾病有关联，但这十万种蛋白质与衍生物只有分开后，质谱才能分析清楚。此前蛋白质组学技术中最流行、最通用的蛋白质分离方法是双向电泳，基本上能分离近二千种血浆蛋白质，远远不及十万种，所以成为了瓶颈。/pp　　2006年我提出了一个设想：和蛋白有关的抗体至少有一万多种，那为什么不用抗体来分离蛋白质?这件事一直有人在做，但之前都没有人想到用抗体组把一千个蛋白质一次性快速、实时地分离出来。之后就诞生了免疫质谱分析方法(专利号ZL 200610140652.0)，可以在一个抗体组基质上同时捕获多个生物标志，并对捕获的变异的或修饰的生物标志进行质谱精确分析，还可以同时检测多个生物标志群。用免疫组质谱技术能测定抗原变异片段的分子量。另外，还可以将多种疾病特异性抗原的抗体同时标在一个基质点上。/pp　　Tips:免疫质谱分析方法：质谱与抗体分离技术联合应用即为免疫组质谱(Immunomic mass spectrometry，IMS)。免疫组质谱检测为一组多种(类)抗体与质谱联合来精确地鉴别变异或修饰生物标志群的方法。在一个抗体组基质上同时捕获多个生物标志，并对捕获的变异的或修饰的生物标志进行质谱精确分析。可以同时检测多个生物标志群(biomarkers)。/pp　　双向电泳(Two-dimensional electrophoresis)：是一种等电聚焦电泳与SDS-PAGE相结合，分辨率更高的蛋白质电泳检测技术。目前是快速成长的蛋白质组学技术中最流行最通用的蛋白质分离方法。目前2D-PAGE能够在同一块凝胶上同步检测和定量数千个蛋白质。/pp　　从整个2015年的政策看，医疗器械行业是受到国家大力扶持的，行业地位与重要性大幅提升，法规向国际化看齐，行业监管不断趋严，医疗器械正成为与药物齐头并进的新兴产业。/pp　　strong火石：是什么驱动着行业的高增长?/strong/pp　　许洋博士：一是需求，老龄化加剧，家庭支付能力增强，导致医疗需求高增长 二是政府加大医疗卫生投入，《医疗器械科技产业“十二五”专项规划》表示，“十二五”期间将扶植形成8～10家产值超过50亿元的大型医疗器械产业集团 三是为配合新医改完善基层医疗建设的目标 四是国内生物技术研发应用进入突破期。/pp　　strong火石：您认为接下来医疗器械未来发展的特点和前景会是怎么样的?/strong/pp　　许洋博士：未来5年，医疗器械和制药占比将会达到1:1。近十年，我国医疗器械市场规模快速增长，国内医疗器械工业总产值从2003年的189亿人民币上升到2013年的1889亿，2013年同比增长21%，增长速度远快于药品。预计在未来5年左右，我国医疗器械行业仍然将保持高速增长。医疗器械行业涉及到医药、机械、电子、塑料等多个行业，中高端医疗器械更是多学科交叉、知识密集、资金密集的高技术产业，研发成本高，决定了只有大型厂商才能在大中型医疗器械方面有所作为。此外，器械“国产化”也会成为必然趋势。/pp　　strong火石：赛尔迪当前开展的业务、研发的产品有哪些?公司部署战略是怎么样的?/strong/pp　　许洋博士：我们现在正在做一张人类的大健康MAP。通过精准医疗计划，基于环境健康大数据，通过蛋白指纹图谱仪完成健康管理。现在的疾病市场最关注的问题分别是：检测0～6岁儿童智力、优生优育(为什么生不出聪明宝宝)、高达5千万的肿瘤人群以及3.5亿的高血压、糖尿病人群。/pp　　其中糖尿病肾病是糖尿病最常见且严重的并发症之一，是糖尿病所致的肾小球微血管病变而引起的蛋白排泄和滤过异常那个渐进性肾功能损害。而微量白蛋白尿即早期糖尿病肾病是可逆的，这不同于大量白蛋白尿即临床糖尿病肾病，因此积极防治早期糖尿病肾病就显得尤为重要。去年底，赛尔迪公司与中国医学科学院北京协和医院签署协议，承担国家对糖尿病肾病体内铅、镉毒素的临床大样本检测。全新升级的蛋白指纹图谱仪，是目前唯一获国家药监局批准、能检测含微量白蛋白、β2—微球蛋白以及泛素3项指标的医疗器械。这对糖尿病肾病的早发现、早治疗具有重大意义。/pp　　赛尔迪接下来将按照个体化精准检测所附带的信息，由这些信息与大数据库交流，提出符合个体化治疗的方案，向个体化精准医学管理方式转变。/pp　　随着大数据时代的来临，“互联网+”概念的提出让医疗健康事业呈现出了新的发展势态和特征。医学知识体系正被大数据、精准医疗所重构，信息化进程提高了知识传递速度与医疗协同效率。/ppstrong　　火石：蛋白质组学技术如何助推精准医疗?/strong/pp　　许洋博士：常识知道铅、镉会引起糖尿病性肾病。但铅、镉指标不是医院常规检测的项目。如果采取个体化精准治疗，每年常规检查一次体内铅与镉的指标，发现异常就能进行针对性的从尿液排泄的治疗。已经得了肾病正在透析的病人，检测铅与镉指标后进行针对性排泄也会增强治疗效果。利用蛋白指纹图谱仪能够发现早期的肿瘤和心血管标志物，这就会对疾病的治疗带来极大的希望。随着质谱技术在精准医疗的应用，越来越多的个体化标志物将会被发现，人体的蛋白指纹图谱测定将会成为医院的常规工作。/pp　　精准医疗，即考虑每一个体健康的差异，制定个性化的预防和治疗方案。正确的选中一个工具，解决关键问题，这就是精准医疗。基于基因组测序技术、生物医学工具以及大数据工具逐步成熟和完善，精准医疗能够为个体基因特征、环境以及生活习惯进行疾病干预及治疗，但如何尽快与大数据结合才是发展重点。日前我与北京协和医院合作，创立了中国特色的首个百万人疾病与环境毒素数据库与IMS(爱睦世)特检中心：HZIMS2008，首次在复杂疾病系统中构建了基于环境毒素大数据的移动网络数据库的质量控制体系，使我国重大疾病，如高血压、糖尿病、肿瘤的大数据病因学研究处于世界领先。/pp/p

近日，中科院大连化学物理研究所研究员王方军团队与南方科技大学教授田瑞军、副教授李鹏飞等人合作，利用193nm紫外激光解离—质谱装置，实现了免疫共受体CD28磷酸化胞质端与激酶PKCθ的C2结构域识别结合机制解析。相关研究成果发表在Cell Chemical Biology上。与常规毫秒级碰撞诱导质谱解离（CID）相比，5ns单脉冲193nm紫外激光解离（UVPD）可直接激发非变性蛋白质骨架共价键至高能态引发高效解离，激发解离速率提升6个数量级，位点解离效率和碎片离子产率与其局部非共价作用和微观结构密切相关，通过碎片离子和解离产率分析可同时获得蛋白质序列和结构信息。目前，193nm紫外激光解离质谱尚未商品化设备，仅在少数实验室有自主搭建设备。免疫共受体CD28是癌症免疫治疗的重要靶点，其胞质端酪氨酸磷酸化激活引起的下游蛋白识别结合机制尚不清楚。本工作中，研究人员采用光亲和质谱法发现CD28磷酸化胞质端与激酶PKCθ的C2结构域特异性结合；利用193nm紫外激光解离质谱对C2结合前后进行了全序列覆盖位点光解离效率的差异分析，发现了光解离效率显著下降的三个关键结合区域和核心识别位点K49、H63、R68；证明了高能紫外激光解离策略在蛋白质动态识别结构变化分析中的高灵敏度和单位点分辨高精度优势。团队通过交叉学科联合攻关，在大连相干光源搭建了193nm紫外激光解离-高分辨质谱装置，在前期工作中通过高能光子对多肽分子的高效激发解离实现了多磷酸化肽修饰位点精确定位和蛋白质组学规模化序列鉴定。相关论文信息：https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2022.01.005

后基因组时代蛋白质组闪亮登场中国计量院高通量蛋白质检测技术研究取得重大突破　　“高通量蛋白质分离检测关键技术研究取得的突破给我们很大鼓舞，但这只是我们大规模系统集成研究的一部分，我们正在着力于系统后续的研究。相信，在不久的将来，这套集成系统将为蛋白质组的分析提供一个完整规范的平台。”谈起不久前通过项目鉴定的《高通量蛋白质分离检测关键技术研究》和取得的成果，中国计量科学研究院生物、能源与环境研究所科学仪器研究室主任刘新志显得踌躇满志。　　随着全球性的国际人类基因组计划的初步完成，一个以蛋白质和基因调节为研究重点的后基因组时代已经拉开序幕。蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。伴随人类基因组研究而发展的蛋白质组学则是研究细胞内各种蛋白质的组成及其活动规律的一门新兴学科。后基因组时代，蛋白质组将成为重点研究方向之一，并将有力推动生物产业的持续性高速发展。　　“蛋白质组研究是一门极为年轻的科学，从诞生到蓬勃发展也不过七八年历史，我国的研究时间也只有六年而已。但其发展速度非常迅猛，应用范围也非常广泛。”刘新志说。　　蛋白质组研究对生命科学、化学分析、食品安全、人类健康等诸多领域都有着重要意义。例如，几乎所有的药物都是通过蛋白质发挥作用，蛋白质组学在药学研究中的应用不仅可直接产生新的药物，更重要的是可减少对新药开发研制的盲目性，大大加速和简化新药研制的过程 通过对疾病不同阶段蛋白质组的研究，还可帮助诊断和防治疾病。目前，蛋白质组学已成功用于肿瘤、糖尿病、艾滋病、关节炎等多种疾病的诊断和治疗。　　“蛋白质组研究的核心技术分为两个部分：蛋白质分离技术和蛋白质鉴定技术。实验数据表明，现阶段依赖质谱分析的蛋白质鉴定技术的发展水平远高于蛋白质分离技术的发展水平。但对大分子、复合物、细胞的分离纯化是进行更详尽的生物鉴定和工程化应用所必需的重要步骤，如果不能快速有效地进行蛋白质分离，后续的鉴定也无法进行。所以，蛋白质组研究的瓶颈来自于蛋白质分离技术的限制。”刘新志打了一个比喻：“蛋白质鉴定技术好比一条宽敞的高速路，但通往这条高速路的必经路——蛋白质分离技术就好比一条小胡同，这条小胡同严重影响了车辆的快速通行。”　　据介绍，目前蛋白质分离技术主要有两种——双向电泳技术和高效液相色谱技术。“这两种传统技术与生俱来的缺点是很难分解出难溶性蛋白，而且不能分解出不溶性蛋白。要打通这条小胡同，就必须找到一种新的方法、研制一种新的装置，能够有效地分离出难溶性蛋白和不溶性蛋白，并且要实现高通量快速分离。”刘新志介绍。　　由中国计量科学研究院完成的《高通量蛋白质检测关键技术的研究》课题在解决蛋白质的快速分离技术方面取得了重大突破。研究建立了以反向加样连续自由流电泳(FFE)分离方法为核心的高通量蛋白质分离检测技术中最为关键的高稳定度自由流电泳(HSFFE)装置。“该装置最显著的特点就是解决了两种传统的分离技术所不能解决的问题——从蛋白混合物中有效地分离出可溶性蛋白、难溶性蛋白、不溶性蛋白，实现了对这三种蛋白的完全分离 其次，装置的通量高，速度快，能够满足蛋白质快速分离鉴定的需要。”刘新志说。　　专家认为，该装置是我国第一台自主研发的实用大型地基液相制备电泳装置，主要指标已经达到国际同类装置的技术水平。同时，该课题的实施具有技术上的前瞻性和集成创新性，对蛋白质组学研究提供了关键的技术支撑。具有自主知识产权的这项成果降低了我国在同类仪器设备上对国外技术的依存度，具有较高的实际应用价值。该装置不仅可以为我国的蛋白质组基础研究提供技术支撑，还可以广泛应用于生物产业的生产环节，如生物制药。同时，还能应用于医学临床，如疾病预防和临床监测。正如一位资深的生物学家所说：“其应用范围几乎可以遍及生物学、生物化学和细胞学的各个领域。”　　“虽然这套装置本身已经可以作为独立的产品应用于相关领域，但这并不是我们的最终目的。我们的目标是实现以该装置为核心的高通量完整蛋白质分离、酶解消化、肽段分离和质谱鉴定接口的大规模系统集成，以保证蛋白质组的分析可以在一个连续自控的系统中规范化完成。到时候，我们的装置将发挥更大的作用。”刘新志信心十足。

1月22日，《高通量蛋白质检测关键技术的研究》项目验收鉴定会在中国计量院召开。此次科技基础条件平台项目的验收，得到了科技部、国家质检总局的重视，国家科技部条财司条件处郑健博士，国家质检总局科技司技术发展处姚泽华副处长，计量院段宇宁副院长、科发部及生能环所的相关人员参加了验收会。会议由姚泽华副处长主持，以中国科学院生物物理研究所杨福全研究员为组长的8位专家对该项目进行验收鉴定。　　近年来，随着生命科学、食品安全等领域需求的不断涌现，蛋白组学的发展非常迅速，已成为各项相关分析技术的必备手段。一直以来，蛋白质组分析技术的发展受限于蛋白质分离手段的滞后，目前完整蛋白质的分离主要依赖于双向电泳和高效液相色谱，不能满足复杂蛋白质混合物的有效分离 FFE技术(反向加样连续自由流电泳)的出现能较好地解决蛋白质组研究的两大难题：蛋白质组的复杂程度和现有检测手段的低通量。　　《高通量蛋白质检测关键技术的研究》课题建立了以FFE分离方法为核心的高通量蛋白质分离检测技术中最为关键的“高稳定度自由流电泳(HSFFE)”装置，为高通量完整蛋白质的酶解、肽段分离和质谱鉴定接口的大规模系统集成奠定了基础，也是我国第一台自主研发的实用大型地基液相制备电泳装置。该装置通过对自适应高压稳定电源、腔体热交换工艺、速率调整机构、应力同步机构等关键技术的完成，实现了高通量蛋白质制备分离 装置的整体技术水平已达到国际先进水平，其中一些技术方法处于国际领先水平，对于改变我国蛋白质组分离长期以来依靠国外技术装备的现状，将发挥重大作用。　　科技部条财司郑健博士谈到，科技部一直比较重视科学仪器的自主研发工作，近几年来在科技支撑计划的支持下，我国的科学仪器自主创新已经到了一个新高度。该项目的研究成果改变了我国在蛋白质分离技术研究方面依赖国外进口仪器设备的现状，希望计量院能进一步加强现有产品、现有装置、现有成果的工程化和应用方法的研究。通过大家的共同努力，使下一步我国的仪器创新发展获得更大的进步。　　姚泽华副处长祝贺项目组出色完成了任务，他谈到，质检总局面临的许多社会问题是突发的、紧急的，又极具推动力的，如：08年的三聚氰胺，推动了国产仪器液相色谱的发展 09年的H1N1流感，又推动了国产的红外测温仪的发展。而计量院在此方面的研制开发一直是非常及时和有效的。该课题是计量院近年来在科学仪器自主研发方面所取得的又一重要成果。希望计量院能够继续研制出更多具有国际领先水平的国产科学仪器装置，为我国进出口的产品贸易提供良好的支撑，满足国家社会更多更广泛的需求。　　该项目的研制成功不仅增强了我国生命科学的系统创新能力，而且具有普及性强、性能价格比高和市场容积率高的优点，尤其是该系统的结构模块化、系统单元相对独立的特点，有效避免了国外仪器设备固有的售后维修困难问题，具有较好的国内和国际市场需求潜力。

近日，大连化物所生物分子结构表征新方法研究组（1822组）王方军研究员团队与南方科技大学田瑞军教授、李鹏飞副教授等人合作，利用193nm紫外激光解离—质谱装置，实现了免疫共受体CD28磷酸化胞质端与激酶PKCθ的C2结构域识别结合机制解析。 与常规毫秒级碰撞诱导质谱解离（CID）相比，5ns单脉冲193nm紫外激光解离（UVPD）可直接激发非变性蛋白质骨架共价键至高能态引发高效解离，激发解离速率提升6个数量级，位点解离效率和碎片离子产率与其局部非共价作用和微观结构密切相关，通过碎片离子和解离产率分析可同时获得蛋白质序列和结构信息。目前，193nm紫外激光解离质谱尚未商品化设备，仅在少数实验室有自主搭建设备。　　免疫共受体CD28是癌症免疫治疗的重要靶点，其胞质端酪氨酸磷酸化激活引起的下游蛋白识别结合机制尚不清楚。本工作中，研究人员采用光亲和质谱法发现CD28磷酸化胞质端与激酶PKCθ的C2结构域特异性结合；利用193nm紫外激光解离质谱对C2结合前后进行了全序列覆盖位点光解离效率的差异分析，发现了光解离效率显著下降的三个关键结合区域和核心识别位点K49、H63、R68；证明了高能紫外激光解离策略在蛋白质动态识别结构变化分析中的高灵敏度和单位点分辨高精度优势。　　大连化物所王方军和肖春雷研究员通过交叉学科联合攻关，在大连相干光源搭建了193nm紫外激光解离-高分辨质谱装置，在前期工作中通过高能光子对多肽分子的高效激发解离实现了多磷酸化肽修饰位点精确定位（Chin. Chem. Lett.，2018）和蛋白质组学规模化序列鉴定（Anal. Chim. Acta.，2021）。　　相关研究结果以“Motif-dependent Immune Co-receptor Interactome Profiling by Photoaffinity Chemical Proteomics”为题，于近日发表于Cell Chemical Biology上。