色谱纸抗体固定方法

[font=宋体][font=宋体]抗体纯化的原理是依据抗体的生物学特征，如抗体分子的电荷、大小、疏水性等，选用合适的方法将目标抗体分子从初始混合物中分离纯化出来。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]抗体纯化方法包括[/font][/font][b][font=宋体][font=宋体]亲和层析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法和疏水作用层析法[/font][/font][/b][font=宋体][font=宋体]等。选用何种纯化方法取决于抗体的来源、时间、成本以及抗体的最终用途等。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]抗体纯化的方法及步骤[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]抗体是一类免疫蛋白，可识别并结合特定抗原，在生物研究以及临床应用中，纯化得到高质量的抗体十分重要。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]一、凝胶过滤层析法[/font][/font][font=宋体][font=宋体]凝胶过滤层析法的原理是基于抗体分子的不同大小，利用不同孔径的凝胶过滤介质将目标分子（抗体）与较大分子（如蛋白质等杂质）分离开来。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]具体操作步骤如下：[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]将含有目标抗体的混合物加入到预先平衡好的凝胶柱中。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]使用缓冲液进行洗脱，较大分子无法通过凝胶柱而流出。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]目标抗体分子大小适中，可通过凝胶柱并被保留下来。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]最后使用洗脱缓冲液将目标抗体从凝胶柱中洗脱出来，得到纯化的抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]二、[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析法[/b][/url][/font][/font][font=宋体][font=宋体]亲和层析法的原理是利用抗体分子与抗原之间的特异性结合来实现目标抗体的纯化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]具体操作步骤如下：[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]将含有目标抗体的混合物加入到预先包含特异性结合配体[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]如蛋白[/font][font=Calibri]A[/font][font=宋体]、蛋白[/font][font=Calibri]G[/font][font=宋体]等[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]的亲和层析柱中。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]目标抗体与配体之间发生特异性结合。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]使用洗脱缓冲液将非特异结合的组分洗脱掉。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]最后使用洗脱缓冲液将目标抗体从亲和层析柱中洗脱出来，得到纯化的抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]三、离子交换层析法[/font][/font][font=宋体][font=宋体]离子交换层析法的原理是利用目标抗体分子与离子交换柱中固定的离子之间的相互作用来实现纯化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]具体操作步骤如下：[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]将含有目标抗体的混合物加入到预先平衡好的离子交换柱中。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]使用缓冲液进行洗脱，使与固定离子相同电荷的分子无法通过离子交换柱而流出。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]目标抗体由于表面电荷不同，能够通过离子交换柱被保留下来。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]最后使用洗脱缓冲液改变[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]或盐浓度等条件，将目标抗体从离子交换柱中洗脱出来，得到纯化的抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]四、逆向相色谱法[/font][/font][font=宋体][font=宋体]逆向相色谱法的原理是利用目标抗体分子与逆向相色谱柱中固定的疏水基团之间的相互作用来实现纯化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]具体操作步骤如下：[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]将含有目标抗体的混合物加入到预先平衡好的逆向相色谱柱中。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]使用缓冲液进行洗脱，使疏水性较低的分子无法通过逆向相色谱柱而流出。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]目标抗体由于表面疏水性不同，能够通过逆向相色谱柱被保留下来。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]最后使用洗脱缓冲液改变溶剂极性等条件，将目标抗体从逆向相色谱柱中洗脱出来，得到纯化的抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]抗体纯化是一项关键技术，在[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/antibody-production][b]抗体制备[/b][/url]过程中十分重要。每种方法都有其特点和适用性，义翘神州可根据您的具体需求选择合适的抗体纯化方法，保证交付高质量、高纯度的纯化抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/antibody-purification][b]抗体纯化[/b][/url]详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/antibody-purification[/font][/font][font=宋体] [/font]

[b]毛细管色谱柱固定液的涂渍方法[/b]（1）壁开管柱（wall coated open tubular, WOCT）将固定液直接涂在毛细管内壁上，这是戈雷最早提出的毛细管柱。由于管壁的表面光滑，润湿性差，对表面接触角大的固定液，直接涂渍制柱，重现性差，柱寿命短，现在的WCOT柱，其内壁通常都先经过表面处理，以增加表面的润湿性，减小表面接触角，在涂固定液。（2）多孔层开口柱（porous layer open tubular, PLOT）在管壁上涂一层多孔性吸附剂固体微利，不再涂固定液，实际上是使用开管柱的气固色谱。（3）载体涂渍开管柱（support coated open tubular, SCOT）为了增大开管柱内固定液的涂渍量，现在毛细管内壁涂上一层很细的（＜2μm）多孔颗粒，然后在多孔层上涂渍固定液，这种毛细管柱，液膜较厚，因此柱容量较WCOT柱高。（4）化学键合相毛细管柱 将固定相用化学键合的方法键合到硅胶涂敷的柱表面和径表面处理的毛细管内壁上。经过化学键合，大大提高了柱的热稳定性。（5）交联毛细管柱 由交联引发剂将固定相交联到毛细管管壁上。这类柱子具有耐高温、抗溶剂抽提、液膜稳定、柱效高、柱寿命长等特点，因此得到迅速发展。

一 抗体选择指南:检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，为缩小抗体的选择范围选中合适的抗体，需要考虑如下几种因素：1. 分析或应用的类型2. 样本蛋白的结构性质3. 样本的种属4. 抗体宿主的种类5. 抗体的标记和检测1 分析试验的应用类型一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种分析类型，如：可以应用于WB IHC ICC ELASA 分析等，如果抗体说明书没有提及的应用类型，并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型，而仅是说明尚未经过此种分析试验验证，如果抗体不适用某些分析试验，则会在抗体说明书上标注出来不适于某分析试验。2 样本蛋白的结构性质了解样本蛋白的结构性质有助于选择最合适的抗体，至少两方面因素需要考虑(1)..待测样本蛋白的结构域：抗体是由各种不同免疫原免疫宿主而制备得来，其中的免疫原包括：全长蛋白、蛋白片断、多肽、全有机体（如：细菌）或细胞，抗体说明书一般都有免疫原的描述，如果打算检测的是蛋白片断或一种特殊的同型物或蛋白全长的某一区域，则必须选择用含此片段域的免疫原制备出的抗体。如果打算用FACS 流式检测活细胞的表面蛋白，则需要选择含该表面蛋白的胞外域来免疫制备的抗体。(2)样本的提取或处理过程：某些抗体要求样本经过某些特殊处理，例如：许多抗体只识别还原和变性的、表位已暴露不受二级四级结构阻碍的蛋白样本，另一方面，某些抗体仅识别天然折叠状态的蛋白。当选择免疫组化的抗体时，应注意某些抗体只识别未固定的冷冻的组织，而另一些抗体则适用于无需抗原修复解交联步聚的甲醛固定石蜡包埋的组织，这些都会在抗体说明书上应用部分标示出来3 样本的物种 应选择物种相同或有交叉反应的抗体，抗体可能与不同物种的同种靶蛋白有交叉反应，因其氨基酸序列同源性较高，如果样本的种类未列入抗体说明书上的交叉反应种属表中，并不意味着该抗体不适用于检测该物种的蛋白，而只是表示该物种尚未用此抗体检测验证过，应通过序列比对的方法来预测交叉反应，可应用Expasy 和 NCBI BLAST 来进行不同物种蛋白同源性比对。4 一抗宿主物种的选择一般说来，在使用偶联二抗结合无偶联物的一抗时，一抗宿主动物的物种选择较为重要，对于免疫组化而言，尽可能选择与样本不同种系物种的一抗，从而避免二抗与样本内源性免疫球蛋白产生交叉反应，例如：检测小鼠样本蛋白，则不应选择小鼠或大鼠源的一抗，最好选兔源的一抗，则二抗则可选择偶联了检测分子（酶、荧光素、生物素等）的抗兔IgG。如果选择有偶联物的一抗则不适用上述情况，除免疫组化外的其它对不含内源性免疫球蛋白样本的检测方法，则抗体宿主物种的影响不大，如对不含IgG 的细胞裂解物样本的western blotting检测，尽管如此，含有血清的组织裂解物和组织培养上清中含有免疫球蛋白，还原变性样本中含IgG，在western blot 检测中则结合出现IgG 分子50 and 25 kDa 的重链和轻链条带。5 二抗的选择 二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，例如：如果你的一抗是小鼠的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗anti-mouse secondary。建议检查二抗说明书确保该抗体适用于你的检测应用， 二抗一般连接荧光素FITC 或发光团。6 双重染色抗体的选择用未偶联一抗进行细胞培养物或组织切片的双重免疫染色要求一抗来源于不同物种并且二抗分别识别其中之一，二抗说明书应描述其与其它物种来源的免疫球蛋有否有交叉吸附。

[font=宋体]抗体是一类免疫蛋白，可识别并结合特定抗原，在生物研究以及临床应用中，纯化得到高质量的抗体十分重要。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]? 凝胶过滤层析法[/b][/font][font=宋体]凝胶过滤层析法的原理是基于抗体分子的不同大小，利用不同孔径的凝胶过滤介质将目标分子（抗体）与较大分子（如蛋白质等杂质）分离开来。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]具体操作步骤如下：[/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]将含有目标抗体的混合物加入到预先平衡好的凝胶柱中。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]使用缓冲液进行洗脱，较大分子无法通过凝胶柱而流出。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]目标抗体分子大小适中，可通过凝胶柱并被保留下来。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]最后使用洗脱缓冲液将目标抗体从凝胶柱中洗脱出来，得到纯化的抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]? 亲和层析法[/b][/font][font=宋体]亲和层析法的原理是利用抗体分子与抗原之间的特异性结合来实现目标抗体的纯化。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]具体操作步骤如下：[/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]将含有目标抗体的混合物加入到预先包含特异性结合配体[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]如蛋白[/font][font=Calibri]A[/font][font=宋体]、蛋白[/font][font=Calibri]G[/font][font=宋体]等[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]的亲和层析柱中。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]目标抗体与配体之间发生特异性结合。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]使用洗脱缓冲液将非特异结合的组分洗脱掉。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]最后使用洗脱缓冲液将目标抗体从亲和层析柱中洗脱出来，得到纯化的抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]? 离子交换层析法[/b][/font][font=宋体]离子交换层析法的原理是利用目标抗体分子与离子交换柱中固定的离子之间的相互作用来实现纯化。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]具体操作步骤如下：[/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]将含有目标抗体的混合物加入到预先平衡好的离子交换柱中。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]使用缓冲液进行洗脱，使与固定离子相同电荷的分子无法通过离子交换柱而流出。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]目标抗体由于表面电荷不同，能够通过离子交换柱被保留下来。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]最后使用洗脱缓冲液改变[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]或盐浓度等条件，将目标抗体从离子交换柱中洗脱出来，得到纯化的抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]? 逆向相色谱法[/b][/font][font=宋体]逆向相色谱法的原理是利用目标抗体分子与逆向相色谱柱中固定的疏水基团之间的相互作用来实现纯化。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]具体操作步骤如下：[/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]将含有目标抗体的混合物加入到预先平衡好的逆向相色谱柱中。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]使用缓冲液进行洗脱，使疏水性较低的分子无法通过逆向相色谱柱而流出。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]目标抗体由于表面疏水性不同，能够通过逆向相色谱柱被保留下来。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]最后使用洗脱缓冲液改变溶剂极性等条件，将目标抗体从逆向相色谱柱中洗脱出来，得到纯化的抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]抗体纯化方法的优缺点[/b][/font][font=宋体]凝胶过滤层析法：优点：[/font][font=宋体]简单易行，不需要特殊设备，适用于各种规模的实验室 缺点：[/font][font=宋体]分离效率低，只能实现较为粗略的纯化[/font][font=宋体]亲和层析法 优点：[/font][font=宋体]纯度高，效率高 缺点：[/font][font=宋体]需要特定的亲和试剂和配体，成本较高[/font][font=宋体]离子交换层析法 优点：[/font][font=宋体]选择性高，适用性强 缺点：[/font][font=宋体]需要根据不同抗体进行条件优化，操作较复杂[/font][font=宋体]逆向相色谱法 优点：[/font][font=宋体]选择性高，灵活性强 缺点：[/font][font=宋体]需要特定设备支持，操作条件较为复杂[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]抗体纯化是一项关键技术，在抗体制备过程中十分重要。每种方法都有其特点和适用性，义翘神州可根据您的具体需求选择合适的抗体纯化方法，保证交付高质量、高纯度的纯化抗体。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以参看：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/antibody-purification[/font][/font]

[font=宋体]抗体纯化是生物医药领域的一项关键技术，它涉及到从复杂的混合物中提取出高纯度的抗体。纯化后的抗体具有更高的特异性和灵敏度，能够提高实验的准确性和重复性。本文将详细介绍抗体纯化的方法和步骤，包括亲和色谱、离子交换色谱、凝胶过滤色谱等常用技术，并探讨纯化过程中的注意事项和应用实例。通过了解和掌握这些知识，研究人员可以更好地进行抗体相关的实验和研究。[/font][b][font=宋体]抗体纯化方法及步骤详解：[/font][/b][font=宋体] [/font][b][font=宋体]一、凝胶过滤层析法[/font][/b][font=宋体]凝胶过滤层析法的原理是基于抗体分子的不同大小，利用不同孔径的凝胶过滤介质将目标分子（抗体）与较大分子（如蛋白质等杂质）分离开来。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]具体操作步骤如下：[/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]将含有目标抗体的混合物加入到预先平衡好的凝胶柱中。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]使用缓冲液进行洗脱，较大分子无法通过凝胶柱而流出。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]目标抗体分子大小适中，可通过凝胶柱并被保留下来。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]最后使用洗脱缓冲液将目标抗体从凝胶柱中洗脱出来，得到纯化的抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]凝胶过滤层析法在医药研发外包服务中应用广泛，例如美迪西提供从小试到规模生产全程的蛋白分离纯化服务，并根据工艺的要求结合产品特点给客户定制适用的工艺和系统。此外，凝胶过滤层析法还被广泛应用于蛋白质等大分子物质非分离纯化、分子质量测定、脱盐等试验中。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在使用凝胶过滤层析法时，需要注意以下几点：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]正确选择凝胶类型和粒度：不同类型和粒度的凝胶具有不同的分离效果和分辨率，需要根据实验需求进行选择。[/font][font=宋体][font=宋体]优化层析条件：包括流速、缓冲液[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值和离子强度等，这些因素都会影响分离效果和分辨率。[/font][/font][font=宋体]防止柱床干涸：在分离过程中，要保持层析柱的湿润，避免柱床干涸，影响分离效果。[/font][font=宋体]注意样品性质：凝胶过滤层析法适用于相对分子质量较大的物质，对于小分子物质可能无法有效分离。同时，需要注意样品的溶解性、电荷等性质，以选择合适的凝胶和实验条件。[/font][font=宋体]检测和分析：在分离结束后，需要对分离得到的成分进行检测和分析，以确定分离效果和纯度。[/font][font=宋体]总之，凝胶过滤层析法是一种有效的分离和分析方法，需要注意实验条件的选择和操作方法的正确性，以保证实验结果的准确性和可靠性。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]二、亲和层析法[/b][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析法[/b][/url]的原理是利用抗体分子与抗原之间的特异性结合来实现目标抗体的纯化。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]具体操作步骤如下：[/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]将含有目标抗体的混合物加入到预先包含特异性结合配体[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]如蛋白[/font][font=Calibri]A[/font][font=宋体]、蛋白[/font][font=Calibri]G[/font][font=宋体]等[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]的亲和层析柱中。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]目标抗体与配体之间发生特异性结合。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]使用洗脱缓冲液将非特异结合的组分洗脱掉。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]最后使用洗脱缓冲液将目标抗体从亲和层析柱中洗脱出来，得到纯化的抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]亲和层析法的应用范围广泛，例如在免疫分析中，可以利用抗体与抗原的特异性结合，通过亲和层析法分离和纯化抗体；在蛋白质组学研究中，可以利用蛋白质与配基之间的相互作用，分离和纯化特定的蛋白质；在药物筛选中，可以利用药物与靶点之间的相互作用，筛选出潜在的药物分子。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在使用亲和层析法时，需要注意以下几点：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]正确选择配基：配基的选择对于亲和层析的效果至关重要，需要根据目标分子的特性和需要纯化的样品类型选择合适的配基。[/font][font=宋体][font=宋体]优化层析条件：包括流速、缓冲液[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值和离子强度等，这些因素都会影响分离效果和分辨率。[/font][/font][font=宋体]注意配基的结合力和选择性：亲和层析中配基与目标分子的结合力决定了分离效果和纯度，而选择性则决定了能否有效区分不同的目标分子。[/font][font=宋体]检测和分析：在分离结束后，需要对分离得到的成分进行检测和分析，以确定分离效果和纯度。[/font][font=宋体]注意层析过程中的稳定性：亲和层析过程中需要保持层析柱的稳定性，以避免层析柱的塌陷或堵塞等问题。[/font][font=宋体]总之，亲和层析法是一种非常有效的分离和分析方法，需要注意实验条件的选择和操作方法的正确性，以保证实验结果的准确性和可靠性。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]三、离子交换层析法[/b][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec][b]离子交换层析法[/b][/url]的原理是利用目标抗体分子与离子交换柱中固定的离子之间的相互作用来实现纯化。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]具体操作步骤如下：[/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]将含有目标抗体的混合物加入到预先平衡好的离子交换柱中。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]使用缓冲液进行洗脱，使与固定离子相同电荷的分子无法通过离子交换柱而流出。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]目标抗体由于表面电荷不同，能够通过离子交换柱被保留下来。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]最后使用洗脱缓冲液改变[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]或盐浓度等条件，将目标抗体从离子交换柱中洗脱出来，得到纯化的抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]离子交换层析法的应用范围非常广泛，例如在蛋白质分离中，可以利用蛋白质所带电荷的不同，通过离子交换层析法将其分离；在核酸分离中，可以利用核酸所带电荷的不同，通过离子交换层析法将其分离；在多糖分离中，可以利用多糖所带电荷的不同，通过离子交换层析法将其分离。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在使用离子交换层析法时，需要注意以下几点：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]正确选择离子交换剂：根据待分离的生物分子的电荷性质和所需分离的离子的性质，选择合适的离子交换剂。[/font][font=宋体][font=宋体]优化层析条件：包括流速、缓冲液[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值和离子强度等，这些因素都会影响分离效果和分辨率。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]注意控制洗脱液的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值和离子强度：洗脱液的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值和离子强度可以影响生物分子与离子交换剂的结合和解离，进而影响分离效果和纯度。[/font][/font][font=宋体]检测和分析：在分离结束后，需要对分离得到的成分进行检测和分析，以确定分离效果和纯度。[/font][font=宋体]注意层析过程中的稳定性：离子交换层析过程中需要保持层析柱的稳定性，以避免层析柱的塌陷或堵塞等问题。[/font][font=宋体]注意保护层析柱：离子交换层析过程中需要避免过度冲洗和压力过大等问题，以保护层析柱的结构和使用寿命。[/font][font=宋体]总之，离子交换层析法是一种非常有效的生物分子分离和纯化技术，需要注意实验条件的选择和操作方法的正确性，以保证实验结果的准确性和可靠性。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]四、逆向相色谱法[/b][/font][font=宋体]逆向相色谱法的原理是利用目标抗体分子与逆向相色谱柱中固定的疏水基团之间的相互作用来实现纯化。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]具体操作步骤如下：[/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]将含有目标抗体的混合物加入到预先平衡好的逆向相色谱柱中。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]使用缓冲液进行洗脱，使疏水性较低的分子无法通过逆向相色谱柱而流出。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]目标抗体由于表面疏水性不同，能够通过逆向相色谱柱被保留下来。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]最后使用洗脱缓冲液改变溶剂极性等条件，将目标抗体从逆向相色谱柱中洗脱出来，得到纯化的抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]逆向色谱法的应用范围广泛，例如在蛋白质分离中，可以利用蛋白质在色谱柱上的吸附和洗脱过程，通过逆向色谱法将其分离；在多肽分离中，可以利用多肽在色谱柱上的吸附和洗脱过程，通过逆向色谱法将其分离；在核酸分离中，可以利用核酸在色谱柱上的吸附和洗脱过程，通过逆向色谱法将其分离。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在使用逆向色谱法时，需要注意以下几点：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]正确选择色谱柱：根据待分离的生物分子的性质和所需分离的离子的性质，选择合适的色谱柱。[/font][font=宋体][font=宋体]优化层析条件：包括流速、缓冲液[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值和离子强度等，这些因素都会影响分离效果和分辨率。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]注意控制洗脱液的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值和离子强度：洗脱液的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值和离子强度可以影响生物分子与色谱柱的吸附和解离，进而影响分离效果和纯度。[/font][/font][font=宋体]检测和分析：在分离结束后，需要对分离得到的成分进行检测和分析，以确定分离效果和纯度。[/font][font=宋体]注意层析过程中的稳定性：逆向色谱过程中需要保持层析柱的稳定性，以避免层析柱的塌陷或堵塞等问题。[/font][font=宋体]注意保护色谱柱：逆向色谱过程中需要避免过度冲洗和压力过大等问题，以保护色谱柱的结构和使用寿命。[/font][font=宋体]注意样品性质：逆向色谱法适用于相对分子质量较大的物质，对于小分子物质可能无法有效分离。同时，需要注意样品的溶解性、电荷等性质，以选择合适的色谱柱和实验条件。[/font][font=宋体]总之，逆向色谱法是一种非常有效的生物分子分离和纯化技术，需要注意实验条件的选择和操作方法的正确性，以保证实验结果的准确性和可靠性。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]抗体纯化是一项关键技术，在抗体制备过程中十分重要。每种方法都有其特点和适用性，义翘神州可根据您的具体需求选择合适的抗体纯化方法，保证交付高质量、高纯度的纯化抗体。详情可以关注[/font][font=Calibri]:https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/antibody-purification[/font][/font]

中和抗体荧光实验，荧光染料为FITC，发现同一个抗体在其中一个实验中正常，另一个实验中荧光很弱，两个实验的步骤是一样的，只是细胞量不同，检查了一遍，固定液，PBS、都没有问题，求指教问题可能出现在哪里？

[font=宋体][font=宋体][b]多克隆抗体纯化原理[/b]是依据抗体的生物学特性，一般通过[/font][font=Calibri]Protein A[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]Protein G[/font][font=宋体]的方法从动物血清中纯化抗体。但某些使用场景对抗体的质量要求很高，需要利用抗原亲和层析从总[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]抗体中进一步纯化和分离抗原特异性抗体，最终获得纯度高、非特异性背景低的多克隆抗体。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]抗血清是一个非常复杂的混合物，包括血清的全部成分。抗血清被收集后，可通过硫酸铵沉淀法对其进行初步纯化，移除许多粘性蛋白，尽可能减少这些杂质对后续亲和层析纯化的影响。不同的纯化方法经常联合使用，用于从血清中纯化高质量的多克隆抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]①[/font][font=Calibri]Protein A/G[/font][font=宋体]纯化[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Protein A[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]Protein G[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]Protein L[/font][font=宋体]是三种细菌蛋白，具有能与抗体高效结合的特性。这些蛋白经过基因工程技术重组表达，常用于不同物种关键抗体类型的亲和纯化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Protein A/G[/font][font=宋体]纯化是一种快速高效的多克隆抗体纯化方法，其原理是能与不同物种的[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]恒定区发生结合，从而除去血清蛋白和[/font][font=Calibri]IgM[/font][font=宋体]抗体。应该注意的是，终产品包含总[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]抗体和特异性抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州已生产了[/font][font=Calibri]Protein A[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]Protein G[/font][font=宋体]琼脂糖纯化树脂，可用于纯化小鼠[/font][font=Calibri]IgG2a/2b/3[/font][font=宋体]、大鼠[/font][font=Calibri]IgG2c[/font][font=宋体]、人[/font][font=Calibri]IgG1/2/4[/font][font=宋体]和兔[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]等多种来源的抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体][b]②抗原亲和纯化[/b][/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]在[/font][font=Calibri]Protein A/G[/font][font=宋体]纯化步骤后，抗原亲和纯化可进一步用于制备具有特异性高和纯度高的多克隆抗体。这种高灵敏度和高特异性的多克隆抗体适合用于[/font][font=Calibri]IHC[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]IF[/font][font=宋体]等免疫学检测实验，即使在较低的稀释比下使用，也不会增加信号背景。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]抗原亲和纯化，首先将抗原固定至树脂上，然后目的抗体与抗原发生特异性结合，最后洗脱得到目的抗体，以达到纯化多克隆抗体的目的。与[/font][font=Calibri]Protein A[/font][font=宋体]法相比，此方法识别的是抗体的可变区，能高度识别和结合目的抗体，常用于多克隆抗体的纯化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体][b]多克隆抗体的纯化主要包括以下几个步骤：[/b][/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①收集细胞上清液或培养上清液：多克隆抗体是通过免疫动物（如小鼠、兔子等）产生的，因此首先需要收集包含抗体的细胞上清液或培养上清液。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]②蛋白[/font][font=Calibri]A/G[/font][font=宋体]层析：将收集到的上清液通过蛋白[/font][font=Calibri]A/G[/font][font=宋体]层析柱进行纯化。蛋白[/font][font=Calibri]A/G[/font][font=宋体]是常用于捕获免疫球蛋白的亲和色谱基质，可以选择性地结合抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]③洗脱：通过改变洗脱缓冲液的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值或盐浓度等条件，将结合在蛋白[/font][font=Calibri]A/G[/font][font=宋体]柱上的抗体洗脱下来。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]④纯化筛选：使用各种纯化筛选方法，如凝胶过滤、离子交换层析、尺寸排阻层析等，进一步去除杂质并提高抗体的纯度。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]⑤浓缩和储存：对纯化后的抗体进行浓缩处理，通常使用离心浓缩或超滤浓缩等方法。最后，将抗体在适当的储存缓冲液中保存，确保其稳定性和活性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/pab-purification][b]多克隆抗体纯化[/b][/url]详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/pab-purification[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=Calibri] [/font]

[font=宋体][font=宋体]双特异性单克隆抗体[/font][font=Calibri]6ispecific Mcr'b[/font][font=宋体]即杂交的杂交瘤[/font][font=Calibri](hybrid hybridoma)[/font][font=宋体]是将杂交瘤与其他抗原免疫的脾细胞或另一种杂交瘤融合的结果。[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体]什么是双特异性抗体？[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]双特异性抗体（[/font] [font=Calibri]bispecific antibody[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]BsAb[/font][font=宋体]，简称双抗）是指能同时特异性结合两个抗原或抗原表位的人工抗体。形象比喻，它就像一座连接[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]个抗原（表位）的桥梁。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]双特异性抗体在自然条件下并不存在，而是通过细胞融合或重组[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]技术制备实现的。由于其特异性和双功能性，现已成为抗体工程领域的研究热点，在肿瘤治疗及自身免疫病等领域中具有广阔的应用前景。除此之外，双特异性抗体还被应用于治疗骨质疏松、血友病等其他领域。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]双特异性抗体的作用机制[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]双特异性抗体在抗肿瘤治疗中的主要作用机制是：[/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）招募[/font][font=Calibri]T[/font][font=宋体]细胞或自然杀伤细胞，并将它们重定向至肿瘤细胞，增强其对肿瘤细胞的杀伤力；[/font][/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）同时阻断发病进程中两个不同的信号传导通路而发挥独特或重叠的功能，影响肿瘤细胞的生长增殖及存活；[/font][/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）同时靶向细胞表面不同的抗原或表位，增强其与肿瘤细胞的特异性结合并直接杀伤肿瘤细胞。[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]双抗[/font][font=Calibri]VS[/font][font=宋体]单抗，有何优势[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]与普通单克隆抗体相比，双特异性抗体具有同时结合两种特异性表位或目的蛋白的功能，因此可以发挥特殊的功能起到单抗药物难以达到的生物学功能。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]例如，将效应细胞直接靶向肿瘤细胞以增强其细胞毒性、提高抗体选择性和功能性、共刺激或抑制受体。相对单抗，双抗具备更强特异性、靶向性，可以降低脱靶毒性；相较单抗的组合疗法，也可有效降低治疗成本等。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]但双抗药物开发复杂性和技术壁垒更高，对于技术平台和靶点选择的适配性要求也有所提高。[/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体]双特异性抗体的制备方法[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）化学偶联法：该方法于[/font][font=Calibri]1985[/font][font=宋体]年首次被使用，其原理是通过化学偶联剂将两个完全的单抗或[/font][font=Calibri]Fab2[/font][font=宋体]片段偶联成一种双特异性抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）双杂交瘤融合法：将两种杂交瘤细胞通过细胞融合的方法，合成双杂交瘤细胞株，筛选出具有两种抗体功能的稳定靶细胞株。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）基因工程法：利用基因工程技术对抗体进行改造，从而形成多种形式的双特异性抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州在重组抗体生产方面具有扎实的专业知识和经验，利用优化的成熟哺乳动物细胞表达平台，为您提供快速高效的[url=https://cn.sinobiological.com/services/bispecific-antibody-service][b]双特异性抗体表达服务[/b][/url]。从抗体序列开始，我们可以表达多种双特异性抗体形式，如[/font][font=Calibri]BiTE[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]Diabody[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]CrossMab[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]DVD-IgG[/font][font=宋体]。更多详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/bispecific-antibody-service[/font][/font]

影响抗原[url=https://www.tw-reagent.com/category.php?id=34]抗体[/url]反应的因素有两方面，一是反应物自身的因素；二是反应环境条件。　　　　（一）反应物自身的因素　　　　1.抗体：不同来源的抗体，反应性各有差异，抗体的浓度、特异性和亲和力都影响抗体抗原反应，为提高试验的可靠性，应选择高特异性、高亲和力的抗体作诊断试剂。等价带的宽窄也影响抗原抗体复合物的形成，单克隆抗体不适用于沉淀反应。　　　　2.抗原：抗原的理化性状、分子量、抗原决定簇的种类及数目均可影响反应结果。颗粒性抗原出现凝集反应，可溶性抗原出现沉淀反应，单价抗原与相应抗体结合不出现沉淀现象。　　　　（二）反应环境条件　　　　1.电解质：抗原与抗体发生特异性结合后，虽由亲水胶体变为疏水胶体，若溶液中无电解质参加，仍不出现可见反应。为了促成沉淀物或凝集物的形成，常用0.85%NaCl或各种缓冲液作为抗原及抗体的稀释液。　　　　2.酸碱度：抗原抗体反应必须在合适的pH环境中进行。蛋白质具有两性电离性质，因此每种蛋白质都有固定的等电点。抗原抗体反应一般在pH6～9进行，有补体参与的反应pH为7.2～7.4，pH过高或过低都将影响抗原与抗体反应。　　　　3.温度：在一定范围内，温度升高可加速分子运动，抗原与抗体碰撞机会增多，使反应加速。一般为15℃～40℃，常用的抗原抗体反应温度为37℃，温度如高于56℃，可导致已结合的抗原抗体再解离，甚至变性或破坏。此外，适当振荡也可促进抗原抗体分子的接触，加速反应。

我在做免疫分析的时候想通过聚电解质静电吸附方法来固定单克隆抗体，想请教一下小鼠抗人单克隆IgG等电点一般多少？邮箱： lgs005@126.com谢谢，望不吝指教！

[font=宋体][font=宋体]纳米抗体（[/font][font=Calibri]nanobody, Nb[/font][font=宋体]）是一种人工设计的抗体分子，又称为单域抗体（[/font][font=Calibri]single-domain antibodies, sdAbs[/font][font=宋体]）、[/font][font=Calibri]VHH[/font][font=宋体]抗体或[/font][font=Calibri]camelid[/font][font=宋体]抗体，是发现于羊驼、单峰驼等驼科以及鲨鱼、鳐鱼等软骨鱼中的一种天然缺失轻链的重链抗体（[/font][font=Calibri]heavy-chain antibodies, HCAbs)[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]纳米抗体分子量仅为传统抗体的[/font][font=Calibri]10%[/font][font=宋体]，保留了[/font][font=Calibri]HCAbs[/font][font=宋体]完整的抗原结合能力，特异性强、亲和性好、稳定性高，广泛用于生化机制研究、结构生物学及肿瘤等疾病诊疗。[b]纳米抗体的优缺点具体如下：[/b][/font][/font][b][font=宋体]纳米抗体的优点：[/font][/b][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）在高温和[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]下的稳定性；[/font][/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）[/font][font=Calibri]VHH[/font][font=宋体]可以识别通常不被常规抗体识别的抗原位点；[/font][/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）它们的小分子片段有助于快速组织渗透和标记应用，包括跨越血脑屏障；[/font][/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]）用于大规模生产节约成本的替代品。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]纳米抗体的缺点：[/b][/font][font=宋体][font=宋体]由于纳米抗体的半衰期短，限制其临床应用，因此可将[/font][font=Calibri]VHH[/font][font=宋体]抗体与抗血清白蛋白或抗体的[/font][font=Calibri]Fc[/font][font=宋体]段融合表达以延长其在血液中的半衰期。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]纳米抗体的制备主要分为两个方向：基于蛋白工程的方法和基于化学合成的方法。[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]基于蛋白工程的方法：在[/font][font=Calibri]20[/font][font=宋体]世纪[/font][font=Calibri]80[/font][font=宋体]年代晚期和[/font][font=Calibri]90[/font][font=宋体]年代初期，科学家提出了单链抗体[/font][font=Calibri](scFv)[/font][font=宋体]的概念，并使用噬菌体显示技术实现了单链抗体的制备。随后，研究人员进一步改进了单链抗体的设计和优化，使其具有更好的稳定性和亲和力。这些单链抗体通过基因工程手段制备，可以实现在细菌或哺乳动物细胞中大规模生产。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]基于化学合成的方法：随着化学合成技术的发展，科学家们开始探索利用化学合成方法制备纳米抗体。在[/font][font=Calibri]2003[/font][font=宋体]年，研究人员开发出了一种称为[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]导向的抗体组装的方法，通过[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]纳米结构的设计和组装，实现了纳米级抗体的制备。这种方法利用[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的互补配对性质将抗体片段组装在一起，形成稳定的纳米抗体结构。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]其他制备方法的发展：随着纳米科技和纳米材料的发展，研究人员还尝试了其他制备纳米抗体的方法。例如，利用核酸适配体技术结合纳米材料，实现了纳米级别的适配体抗体复合物。此外，还利用纳米粒子和纳米材料作为载体，将传统抗体修饰在其表面，形成纳米抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]总的来说，纳米抗体的制备方式相对来说并不是特别的困难，但是和传统抗体的生产过程一样，它需要注意到的细节问题有很多。值得注意的是，纳米抗体的制备技术依然在飞速发展和创新中，并取得了不错的进展，也让我们制备抗体的时候，有了更多选择。更多详情可以关注义翘神州[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/transmembrane-proteins][b]纳米抗体[/b][/url]页面：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/transmembrane-proteins[/font][/font][font=Calibri] [/font]

[font=宋体]什么是[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/antibody-conjugation][b]抗体标记[/b][/url]？[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]抗体结合也被称为抗体标记，是一种可将特定标记物共价连接到抗体分子上的抗体修饰技术。这些标记抗体可用于从细胞，组织，或者整个个体的混合物中分离和纯化的目的蛋白。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]辣根过氧化酶（[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]）是最常见的抗体酶标记类型。[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]上仅有[/font][font=Calibri]6[/font][font=宋体]个赖氨酸，而且它们的修饰并没有较多的影响酶活性。常见的荧光染料有[/font][font=Calibri]FITC[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]PE[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]APC[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]PerCP[/font][font=宋体]等，均可用于标记抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]除了为客户提供抗体开发，义翘神州还可以提供抗体标记服务，可提供的标记物包括[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]、生物素、荧光基团等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]高质量的标记抗体：[/b][/font][font=宋体][font=宋体]①[/font][font=Calibri]PE[/font][font=宋体]标记抗体[/font][/font][font=宋体][font=宋体]②[/font][font=Calibri]PerCP[/font][font=宋体]标记抗体[/font][/font][font=宋体][font=宋体]③[/font][font=Calibri]FITC[/font][font=宋体]标记抗体[/font][/font][font=宋体][font=宋体]④[/font][font=Calibri]APC[/font][font=宋体]标记抗体[/font][/font][font=宋体][font=宋体]⑤[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]标记抗体[/font][/font][font=宋体]⑥生物素标记抗体[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]常见的抗体标记方法：[/b][/font][font=宋体]和所有蛋白质一样，抗体也是由氨基酸组成的。理论上，通过大多数氨基酸可以实现生物偶联。以下内容介绍了几种基于赖氨酸残基的抗体偶联和标记技术。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①[/font][font=Calibri]NHS[/font][font=宋体]（琥珀酰亚胺）酯法[/font][/font][font=宋体]应用广泛的荧光染料（如罗丹明衍生物）是采用这种方法对抗体进行偶联。通常在磷酸盐缓冲液中进行，随后与未标记的染料在柱上进行分离。该方法的主要缺点是，由于酯类对水分敏感，酯类的稳定性差。因此，反应结束后，标记抗体应立即使用。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]吉妥珠单抗（[/font][font=Calibri]Gemtuzumab ozogamicin, Mylotarg[/font][font=宋体]）是全球范围内首个获批上市的抗体偶联药物（[/font][font=Calibri]ADC[/font][font=宋体]）。半合成的卡奇霉素衍生物具有[/font][font=Calibri]NHS[/font][font=宋体]酯，以便将卡奇霉素与人源化[/font][font=Calibri]IgG4[/font][font=宋体]的赖氨酸残基偶联。然而，由于患者的临床获益不足，[/font][font=Calibri]Mylotarg[/font][font=宋体]已于[/font][font=Calibri]2010[/font][font=宋体]年退市。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②异硫氰酸盐法[/font][font=宋体][font=宋体]这种方法主要用于异硫氰酸荧光素（[/font][font=Calibri]FITC[/font][font=宋体]）染料的偶联，广泛用于荧光标记蛋白和抗体的制备。异硫氰酸盐比[/font][font=Calibri]NHS[/font][font=宋体]更稳定，但也更难制备，而且利用该方法，标记的反应效率可能会降低。与[/font][font=Calibri]NHS[/font][font=宋体]法一样，应在反应结束后通过层析法去除多余染料。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③碳二亚胺法[/font][font=宋体][font=宋体]碳二亚胺衍生化合物将蛋白质上的羧基转换为反应中间体，可与赖氨酸发生反应。碳二亚胺的高反应性意味着它们可用于使用相对惰性的材料（如磁性或金颗粒）标记抗体。最常用的碳二亚胺为[/font][font=Calibri]EDC[/font][font=宋体]。[/font][font=Calibri]NHS[/font][font=宋体]有时可被添加至反应中，以辅助产生相对稳定的中间体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]该方法操作简单，但与[/font][font=Calibri]NHS[/font][font=宋体]一样，[/font][font=Calibri]EDS[/font][font=宋体]具有吸水性，因此，标记后抗体需立即使用。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]④高碘酸盐法[/font][font=宋体][font=宋体]这种方法可用于制备特异性的[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]标记抗体。高碘酸盐通过产生与赖氨酸残基相互作用的醛分子来激活[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]。[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]本身只有少量的赖氨酸残基，因此酶聚合的影响不大。[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]和抗体之间的键是可逆的，可通过添加氰基硼氢化钠使其保持稳定。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情抗体标记详情可以参看：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/antibody-conjugation[/font][/font]

有谁知道，如何制备分析液化石油气的色谱填充柱（要求能够分析出其中的二甲醚）的，固定液与单体的配比？

鉴于本人还是零蛋一个,特发此贴,虽然得分不是最主要目的,但零分确实很让人难受啊!单克隆抗体的研制一、单克隆抗体的概念抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody），简称单抗。与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。二、杂交瘤技术（一） 杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的著名论文。他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。实验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题，从而得到广泛的应用。随后建立的骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653和NSO/1都是既不合成轻链又不合成重链的变种，所以由它们产生的杂交瘤细胞系，只分泌一种针对预定的抗原的抗体分子，克服了骨髓瘤细胞MOPC-21等的不足。再后来又建立了大鼠、人和鸡等用于细胞融合的骨髓瘤细胞系，但其基本原理和方法是一样的。（二） 基本程序和方法杂交瘤技术在具体操作上，各实验室使用的程序不尽一致。本节中介绍的方法是作者所在实验室采用的、实践证明成熟的程序，该程序适合国内大多数实验室。在开展杂交瘤技术制备单抗之前，培养骨髓瘤和杂交瘤细胞必须具备下列主要仪器设备：超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，杂交瘤细胞的筛选与检测的仪器设备，依据检测单抗的方法不同而各异，请参阅本节有关部分。淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等，图6-1概括了淋巴细胞杂交瘤技术研制单抗的主要过程。1、动物免疫(1) 抗原制备 制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上说虽不要求很高，但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加，同时可以减轻筛选的工作量。因此，免疫抗原是越纯越好，应根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。一般来说，抗原的来源有限，或性质不稳定，提纯时易变性，或其免疫原性很强，或所需单抗是用于抗原不同组分的纯化或分析等，免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯，但抗原中混杂物很多，特别是如果这些混杂物的免疫原性较强时，则必须对抗原进行纯化。检测用抗原可以是与免疫抗原纯度相同，也可是不同的纯度，这主要决定于所用筛检方法的种类及其特异性和敏感性。(2) 免疫动物的选择 根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。因为，所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤细胞都来源于LOU/c大鼠，所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免疫动物。但是，有时为了特殊目的而需进行种间杂交，则可免疫其他动物。种间杂交瘤一般分泌抗体的能力不稳定，因为染色体容易丢失。就小鼠而言，初次免疫时以8-12周龄为宜，雌性鼠较便于操作。(3) 免疫程序的确定 免疫是单抗制备过程中的重要环节之一，其目的在于使B淋巴细胞在特异抗原刺激下分化、增殖，以利于细胞融合形成杂交细胞，并增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤的机会。因此在设计免疫程序时，应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。没有一个免疫程序能适用于各种抗原。现用的免疫程序中多数是参照制备常规多克隆抗体的方法。表6-1列举了目前常用的免疫程序。免疫途径常用体内免疫法包括皮下注射、腹腔或静脉注射，也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼。最后一次加强免疫多采用腹腔或静脉注射，目前尤其推崇后者，因为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分。在最后一次加强免疫后第3天取脾融合为好，许多实验室的结果表明，初次免疫和再次免疫应答反应中，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，特异性杂交瘤的形成高峰分别为第4天和第22天，在初次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgM抗体，再次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgG抗体。笔者体会阳性杂交瘤出现的高峰与小鼠血清抗体的滴度并无明显的平行关系，且多在血清抗体高峰之前。因此，为达到最高的杂交瘤形成率需要有尽可能多的浆母细胞，这在最后一次加强免疫后第3天取脾进行融合较适宜。已有人报道采用脾内免疫，可提高小鼠对抗原的免疫反应性，且节省时间，一般免疫3天后即可融合。

[font=宋体][font=宋体]抗体已成为治疗和诊断人类疾病的有效工具。非人源抗体会诱导人类免疫反应，使用非人源抗体产生的中和反应会限制此类抗体在治疗人类疾病的应用。为了克服这个问题，抗体人源化技术应运而生。抗体人源化经历了从嵌合抗体到[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]移植、[/font][font=Calibri]SDR[/font][font=宋体]移植等技术演变，力求在保持高亲和力、高特异性结合能力的同时克服传统鼠源抗体的免疫原性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]现阶段，常用抗体人源化方法包括以下几种：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①基于框架区同源性的[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]移植与回复突变[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]非人源化抗体人源化的常用方法是互补决定区（[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]）移植，即非人源抗体的[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]区移植到人源抗体框架区上。通常，会选择与非人源抗体框架区同源性最高的人源抗体框架区作为[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]移植的受体。这种方法最主要问题是与特定靶标结合的亲和力会降低乃至丧失。将小鼠抗体的[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]环直接移植到人源抗体框架上在某些情况下不会影响抗体亲和力，然而在多数情况下，它会显著降低亲和力。鼠源抗体框架区的一些残基已被证明会影响[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]环的构象以及抗体的亲和力，我们称其为游标区残基。这些残基位于靠近[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]区的β折叠。因此，在选择所需的人源抗体框架区后，需要对这些残基进行回复突变，使其保留在人源化抗体中。除此之外，可变区外氨基酸残基的突变也已被用于赋予人源化抗体新的特性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]②基于胚系基因的[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]移植[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]人类胚系基因可作为鼠源抗体人源化框架区的替代来源。与来源于[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]的框架区相比，胚系基因具有较少的克隆内体细胞超突变。因此，人们认为利用胚系框架的人源化抗体比[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]框架的人源化抗体表现出更低的免疫原性。尽管胚系基因的免疫原性可能较低，但事实上[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]的衍生框架有时更有利。复数研究反映，人源化抗体[/font][font=Calibri]Fc[/font][font=宋体]区的变化会影响抗体活性与亲和力。如有研究证实，将鼠抗可变区融合到[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]恒定区构建的嵌合抗体对黄热病感染的预防和治疗有效，而具有[/font][font=Calibri]IgM[/font][font=宋体]恒定区的嵌合抗体则不然。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③抗体表面重塑[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]抗体表面重塑是非人源抗体人源化的另一种策略。表面重塑是指对非人源抗体的表面氨基酸残基进行抗体人源化改造。该策略的原则是确定鼠源抗体表面残基的位置，在维持抗体活性并兼顾减少抗体免疫原性的基础上，选用与人源抗体表面残基相似的氨基酸进行替换。通过这种方法人源化的抗体通常表现出稳定性和亲和力的变化很小。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]④基于[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]同源性的[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]移植[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]以往的[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]移植通常会选择与非人源抗体框架区同源性最高的人源抗体框架区作为[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]移植的受体。[/font][font=Calibri]Hwang[/font][font=宋体]及其同事首次设计了一种基于[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]区域同源性的抗体人源化新方法。该方法不使用框架区的同源性来选择人源化抗体框架，关键的鼠源残基也不进行回复突变。使用这种方法可以减少被识别为外源物质的可能性。比起基于框架区同源性的[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]移植，通过该方法改造的抗体亲和力维持更好。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]⑤[/font][font=Calibri]SDR[/font][font=宋体]移植[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]通过[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]移植获得的人源化抗体仍可能在患者中引发免疫性抗独特型（[/font][font=Calibri]anti-Id[/font][font=宋体]）反应。为了最大限度地减少抗[/font][font=Calibri]V[/font][font=宋体]区免疫反应，可以通过仅将[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]序列中抗原结合活性所必需的特异性决定残基（[/font][font=Calibri]SDR[/font][font=宋体]）移植到人源抗体框架区上来实现抗体人源化。[/font][font=Calibri]SDR[/font][font=宋体]移植的方法更进一步地提升了抗体人源化程度，并尽可能地减少了鼠源[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]中效应[/font][font=Calibri]T[/font][font=宋体]细胞表位的数量，从而将抗体可变区潜在的免疫原性风险做到最小化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]⑥其他抗体人源化方法[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]定向筛选或链替换抗体库技术，是利用噬菌体展示的方法，将鼠源抗体重轻链[/font][font=Calibri]V[/font][font=宋体]区结构域分别顺序或平行地替换为人源化的。该方法为人源化提供了一个强大的工具，可以最大限度地减少人体的免疫原性。值得注意的是，通过噬菌体展示技术产生人源化抗体，即使是全人源抗体，也无法消除全部的免疫原性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州利用[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]置换技术及计算机辅助结构模拟设计可对羊驼纳米抗体、鼠源单抗进行人源化改造，保证人源化程度 [/font][font=Calibri]95%[/font][font=宋体]，为客户提供优质的单克隆[url=https://cn.sinobiological.com/services/antibody-humanization-service][b]抗体人源化服务[/b][/url]。更多抗体人源化改造详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/antibody-humanization-service[/font][/font]

[font=宋体]什么是双特异性抗体？[/font][font=宋体][font=宋体]双特异性抗体（[/font] [font=Calibri]bispecific antibody[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]BsAb[/font][font=宋体]，简称双抗）是指能同时特异性结合两个抗原或抗原表位的人工抗体。形象比喻，它就像一座连接[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]个抗原（表位）的桥梁。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]双特异性抗体在自然条件下并不存在，而是通过细胞融合或重组[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]技术制备实现的。由于其特异性和双功能性，现已成为抗体工程领域的研究热点，在肿瘤治疗及自身免疫病等领域中具有广阔的应用前景。除此之外，双特异性抗体还被应用于治疗骨质疏松、血友病等其他领域。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]双特异性抗体的作用机制：[/font][font=宋体]双特异性抗体在抗肿瘤治疗中的主要作用机制是：[/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）招募[/font][font=Calibri]T[/font][font=宋体]细胞或自然杀伤细胞，并将它们重定向至肿瘤细胞，增强其对肿瘤细胞的杀伤力；[/font][/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）同时阻断发病进程中两个不同的信号传导通路而发挥独特或重叠的功能，影响肿瘤细胞的生长增殖及存活；[/font][/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）同时靶向细胞表面不同的抗原或表位，增强其与肿瘤细胞的特异性结合并直接杀伤肿瘤细胞。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]双抗[/font][font=Calibri]VS[/font][font=宋体]单抗，有何优势？[/font][/font][font=宋体]与普通单克隆抗体相比，双特异性抗体具有同时结合两种特异性表位或目的蛋白的功能，因此可以发挥特殊的功能起到单抗药物难以达到的生物学功能。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]例如，将效应细胞直接靶向肿瘤细胞以增强其细胞毒性、提高抗体选择性和功能性、共刺激或抑制受体。相对单抗，双抗具备更强特异性、靶向性，可以降低脱靶毒性；相较单抗的组合疗法，也可有效降低治疗成本等。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]但双抗药物开发复杂性和技术壁垒更高，对于技术平台和靶点选择的适配性要求也有所提高。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]双特异性抗体的制备方法[/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）化学偶联法：该方法于[/font][font=Calibri]1985[/font][font=宋体]年首次被使用，其原理是通过化学偶联剂将两个完全的单抗或[/font][font=Calibri]Fab2[/font][font=宋体]片段偶联成一种双特异性抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）双杂交瘤融合法：将两种杂交瘤细胞通过细胞融合的方法，合成双杂交瘤细胞株，筛选出具有两种抗体功能的稳定靶细胞株。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）基因工程法：利用基因工程技术对抗体进行改造，从而形成多种形式的双特异性抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州在重组抗体生产方面具有扎实的专业知识和经验，利用优化的成熟哺乳动物细胞表达平台，为您提供快速高效的双特异性抗体表达服务。从抗体序列开始，我们可以表达多种双特异性抗体形式，如[/font][font=Calibri]BiTE[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]Diabody[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]CrossMab[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]DVD-IgG[/font][font=宋体]。义翘神州服务优势：[/font][/font][font=宋体][font=宋体]①[/font][font=Calibri]20+[/font][font=宋体]种[/font][font=Calibri]BsAb[/font][font=宋体]生产经验[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]②成功率[/font][font=Calibri]90%[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]③自主优化的[/font][font=Calibri]HEK293/CHO[/font][font=宋体]平台[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]④多种纯化技术[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]⑤强大的质控分析能力[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]⑥最高产量[/font][font=Calibri]250 mg/L[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/bispecific-antibody-service][b]双特异性抗体生产服务[/b][/url]内容与抗体结构可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/bispecific-antibody-service[/font][/font]

[font='calibri'][size=13px]重组抗体的制备方法[/size][/font][font='calibri'][size=13px]及过程[/size][/font][font='calibri'][size=13px]分享[/size][/font]重组抗体，也称为基因工程抗体，是指通过DNA重组技术将抗体相应的基因序列根据需要进行改造和重组，并构建在质粒上，再通过蛋白外源表达技术将构建好的质粒转染/转化入适合的宿主细胞表达获得的抗体。重组抗体很好的解决了动物源抗体引起的人体排斥反应，使得抗体实现人源化，使抗体的效能更为完善抗体生产的三个阶段抗体广泛应用于疾病的诊断和治疗，是研究和应用领域最有价值的研究对象之一。抗体制备技术经历了三个阶段，第一阶段，通过抗原免疫高等动物，从动物的血清中纯化获得抗体，该抗体为多克隆抗体；第二阶段，杂交瘤技术问世，通过将无限增殖的骨髓瘤细胞与产生抗体的B淋巴细胞融合生产出针对单一抗原决定簇的单克隆抗体；第三阶段，通过基因工程技术改造动物生产的单克隆抗体的基因序列，使单抗性能更加符合应用需要，并能通过大规模细胞培养获得，该阶段抗体为重组抗体。重组抗体有哪些类型？重组抗体分为五大类：嵌合抗体、人源化抗体、全人源化抗体、小分子抗体、双特异性抗体嵌合抗体抗体的恒定区和可变区分别来源于不同的物种，常见的嵌合抗体是将动物源抗体的可变区与人源抗体的恒定区结合。嵌合抗体的特点：1. 抗体可变区为动物源区域，保留了抗体对抗原的特异性和亲和性 2. 抗体有近70%的部分是人源的，很大程度上降低了抗体的异源性，其中人源性Fc片段能有效介导ADCC（抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应）和CDC（补体依赖的淋巴细胞毒效应）作用；3. 可以根据需要选择不同的抗体类型、亚型、大小、修饰位点等；4. 通过成熟的质粒构建体系及蛋白表达平台，可高效大量的获得目的抗体。嵌合抗体的生产方式：①免疫动物，获得杂交瘤细胞②杂交瘤细胞测序，获得抗体可变区序列③选择人源恒定去亚型④构建重组表达质粒⑤转入合适的宿主细胞表达⑥抗体纯化及检测人源化抗体将人抗体的CDR区域替换成动物源单抗的CDR，也称CDR嫁接抗体。CDR：即互补决定区（complementarity－determining regions），抗体每个可变区含有三个氨基酸顺序超变区，这些超变区是抗原的结合位点，与抗原决定簇结构互补，被称为CDR。可变区里其他氨基酸作为骨架支持部分，称为框架残基（Framework Residue）。人源化抗体特点：1. 人源化抗体在嵌合抗体的基础上将抗体中人源性区域进一步扩大，人源化比例可达80%-90%，使得抗体在应用过程中降低人体的异源排斥反应；2. CDR与抗原结合过程受到FR区域的影响，动物源CDR与人源Fr结合，可能会改变抗体原有CDR的空间结构，进而降低重组抗体与抗原的亲和力。在设计人源化抗体时，可将人源FR区域的关键性氨基酸残基更改为动物源FR，以减少对CDR结构域的影响。人源化抗体生产方式：重组抗体的类型及生产流程全人源化抗体采用基因敲出技术将动物抗体基因敲除，造成动物抗体基因缺失，将人类抗体基因通过转基因或转染色体技术，移至抗体基因缺失动物中，通过动物表达人类抗体，达到抗体完全人源化。采用动物基因敲除和插入的方式获得抗体，操作难度大，成本高，并且依然存在人体排斥反应，噬菌体展示技术应运而生。将人抗体的可变区基因插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，人抗体可变区随噬菌体外壳蛋白的表达而表达，同时，随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面。再通过展示库筛选和细胞表达获得全人源抗体。重组抗体的载体如何选择？全人源化抗体特点:全人源化抗体对人体的免疫原性极小，是抗体药研发最重要的对象，在疾病和癌症的治疗中具备广泛的应用，非常具备研究和生产价值。全人源化抗体生产方式:重组抗体的类型及生产流程小分子抗体小分子抗体顾名思义是分子量较小的抗体，一般为完整Ig的一部分，现有的小分子抗体有Fab、Fv、 scFv、SdAb、微抗体、纳米抗体。重组抗体的类型及生产流程小分子抗体特点:小分子抗体分子量大小只有完整Ig大小的1/12~1/2，穿透性强，同时具备抗原亲和力，并且可通过基因工程系统来操作编辑，通过各种重组蛋白表达系统来大量生产。小分子抗体生产方式:重组抗体的类型及生产流程双特异性抗体具备两种特异性抗原结合位点的抗体，可同时与两种抗原结合，例如可同时结合靶细胞（癌症细胞）和效应细胞（T细胞），定向介导效应细胞对靶细胞的杀伤作用，是抗体药物领域的重要研究对象，在肿瘤治疗方面具有卓越的成效。双特异性抗体特点:1. 拥有两种特异性抗原结合位点，作为抗体药物，是治疗肿瘤的“抗体炸弹”，比普通的抗体药具有更强的导向性、更强的治疗效果，是最为理想的肿瘤治疗药物；2. 自然状态不存在，只能通过人工制备获得。双特异性抗体生产方式:[align=left][font='calibri'][size=13px]义翘神州推出[/size][/font][font='calibri'][size=13px]大规模重组抗体生产服务[/size][/font][font='calibri'][size=13px]，服务周期大概在4-10周；[/size][/font][/align][size=13px]服务内容[/size][size=13px]可以查看：[/size][url=https://cn.sinobiological.com/services/large-scale-antibody-production-service][size=13px]https://cn.sinobiological.com/services/large-scale-antibody-production-service[/size][/url][size=13px] 里面有更详尽的内容服务。[/size]

[font=宋体][font=宋体]辣根过氧化酶（[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]）是最常见的抗体酶标记类型。[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]上仅有[/font][font=Calibri]6[/font][font=宋体]个赖氨酸，而且它们的修饰并没有较多的影响酶活性。常见的荧光染料有[/font][font=Calibri]FITC[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]PE[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]APC[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]PerCP[/font][font=宋体]等，均可用于标记抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]辣根过氧化物酶标记二抗通常用于如免疫印迹、酶联免疫吸附试验以及免疫组织化学等应用。无论在化学发光法中、在比色法中还是在荧光法中，[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]标记二抗需要结合高信噪比的底物。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]除了为客户提供抗体开发，义翘神州还可以提供抗体标记服务，可提供的标记物包括[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]、生物素、荧光基团等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]常见的抗体标记方法[/b][/font][font=宋体]和所有蛋白质一样，抗体也是由氨基酸组成的。理论上，通过大多数氨基酸可以实现生物偶联。以下内容介绍了几种基于赖氨酸残基的抗体偶联和标记技术。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①[/font][font=宋体][font=Calibri]NHS[/font][font=宋体]（琥珀酰亚胺）酯法[/font][/font][font=宋体]应用广泛的荧光染料（如罗丹明衍生物）是采用这种方法对抗体进行偶联。通常在磷酸盐缓冲液中进行，随后与未标记的染料在柱上进行分离。该方法的主要缺点是，由于酯类对水分敏感，酯类的稳定性差。因此，反应结束后，标记抗体应立即使用。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]吉妥珠单抗（[/font][font=Calibri]Gemtuzumab ozogamicin, Mylotarg[/font][font=宋体]）是全球范围内首个获批上市的抗体偶联药物（[/font][font=Calibri]ADC[/font][font=宋体]）。半合成的卡奇霉素衍生物具有[/font][font=Calibri]NHS[/font][font=宋体]酯，以便将卡奇霉素与人源化[/font][font=Calibri]IgG4[/font][font=宋体]的赖氨酸残基偶联。然而，由于患者的临床获益不足，[/font][font=Calibri]Mylotarg[/font][font=宋体]已于[/font][font=Calibri]2010[/font][font=宋体]年退市。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②[/font][font=宋体]异硫氰酸盐法[/font][font=宋体][font=宋体]这种方法主要用于异硫氰酸荧光素（[/font][font=Calibri]FITC[/font][font=宋体]）染料的偶联，广泛用于荧光标记蛋白和抗体的制备。异硫氰酸盐比[/font][font=Calibri]NHS[/font][font=宋体]更稳定，但也更难制备，而且利用该方法，标记的反应效率可能会降低。与[/font][font=Calibri]NHS[/font][font=宋体]法一样，应在反应结束后通过层析法去除多余染料。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③[/font][font=宋体]碳二亚胺法[/font][font=宋体][font=宋体]碳二亚胺衍生化合物将蛋白质上的羧基转换为反应中间体，可与赖氨酸发生反应。碳二亚胺的高反应性意味着它们可用于使用相对惰性的材料（如磁性或金颗粒）标记抗体。最常用的碳二亚胺为[/font][font=Calibri]EDC[/font][font=宋体]。[/font][font=Calibri]NHS[/font][font=宋体]有时可被添加至反应中，以辅助产生相对稳定的中间体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]该方法操作简单，但与[/font][font=Calibri]NHS[/font][font=宋体]一样，[/font][font=Calibri]EDS[/font][font=宋体]具有吸水性，因此，标记后抗体需立即使用。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]④[/font][font=宋体]高碘酸盐法[/font][font=宋体][font=宋体]这种方法可用于制备特异性的[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]标记抗体。高碘酸盐通过产生与赖氨酸残基相互作用的醛分子来激活[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]。[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]本身只有少量的赖氨酸残基，因此酶聚合的影响不大。[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]和抗体之间的键是可逆的，可通过添加氰基硼氢化钠使其保持稳定。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]详情可关注义翘神州[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/antibody-conjugation][b]抗体标记[/b][/url]：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/antibody-conjugation[/font][/font]

【讲座名称】：安捷伦科技反相液相色谱柱在单克隆抗体分离中的应用【讲座时间】：2014年12月18日 10:00【主讲人】：米建秋 （安捷伦消耗品及色谱柱资深应用工程师）【会议简介】安捷伦在反相色谱柱技术上一直处于领先位置，而反相色谱在分析及检定蛋白类药物时扮演着非常 重要的作用。 从 Zorbax 开始，安捷伦科技一直领先液相色谱柱技术。近年还开发了针对于常规液相仪器的快速液相色谱柱 Poroshell 系列，实现高柱效的同时保证了较低的柱压。近期还推出了用于单克隆抗体分离的专用色谱，提供了更快的分析速度和更高的柱效。-------------------------------------------------------------------------------1、报名条件：只要您是仪器网注册用户均可报名参加。2、报名并参会用户有机会获得100元手机充值卡一张哦~3、报名截止时间：2014年12月18日 09:304、报名参会： http://www.instrument.com.cn/webinar/meeting/meetingInsidePage/12485、报名及参会咨询：QQ群—231246773

实验室常用的ELISA方法可以用来测定抗体，也可以用来测定抗原。我们可以根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。下面就让上海劲马ELISA试剂盒为您分享其中关于双抗体夹心法检测抗原的操作步骤。双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：1) 将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。2) 加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。3) 加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。4) 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。劲马ELISA试剂盒小提示：双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。

[font=宋体]抗体亲和力成熟是抗体药物研发的重要环节，旨在提高抗体的特异性和效力，降低毒副作用，提高治疗效果。本文将介绍抗体亲和力成熟的方法、机制和意义。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]抗体亲和力成熟的方法有哪些[/font][font=Calibri],[/font][font=宋体]各自有什么优点：[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]随机突变：通过随机突变引入随机突变，在基因水平上对抗体进行改造，以获得亲和力更高的抗体。该方法的优点是能够快速获得亲和力较高的抗体，但需要大量的筛选工作。[/font][font=宋体][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]改组：通过[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]改组技术对抗体基因进行改造，以获得亲和力更高的抗体。该方法的优点是能够快速获得大量突变体，并且可以通过表面展示技术进行筛选，但需要掌握相应的技术。[/font][/font][font=宋体]抗体亲和力成熟质粒库的构建及筛选：通过构建抗体亲和力成熟质粒库，筛选出亲和力较高的抗体。该方法的优点是能够获得亲和力较高的抗体，但需要掌握相应的技术。[/font][font=宋体]噬菌体表面展示技术：将抗体基因与噬菌体表面展示技术结合，筛选出亲和力较高的抗体。该方法的优点是能够快速获得亲和力较高的抗体，且可以结合其他表面展示技术进行筛选。[/font][font=宋体][font=宋体]总之，抗体亲和力成熟的方法包括随机突变、[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]改组、抗体亲和力成熟质粒库的构建及筛选和噬菌体表面展示技术。这些方法各有优缺点，需要根据具体情况选择合适的方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]抗体亲和力成熟的主要机制：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]抗体亲和力成熟的主要机制是通过体内的亲和力成熟中心（[/font][font=Calibri]germinal center[/font][font=宋体]）发生。亲和力成熟中心是淋巴结和脾脏等淋巴器官中[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞活化和分化的特定区域。在亲和力成熟中心内，[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞经历多轮突变和选择，使其产生高亲和力的抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]高亲和力的抗体是由[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞受体基因的突变引起的。突变是指[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞受体基因中特定区域的[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]序列发生随机突变，这些突变导致了抗体亲和力的变化。突变是一个非常高效的过程，每个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞大约会经历一到两次突变。这样的高度选择性突变能够增加亲和力较高的抗体的产生概率。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]选择是亲和力成熟过程中的关键步骤。选择性地扩增亲和力较高的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞是由[/font][font=Calibri]T[/font][font=宋体]细胞辅助完成的。在这个过程中，抗原与[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞表面的抗原受体结合，形成抗原[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗体复合物。这些复合物将被[/font][font=Calibri]T[/font][font=宋体]细胞辅助细胞识别，并提供刺激信号，使得亲和力较高的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞得到更多的刺激和扩增。通过这种选择性扩增的过程，亲和力较高的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞将占据免疫反应中的主导地位。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]抗体亲和力成熟的意义：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①抗体亲和力成熟的意义在于提高抗体的特异性和效力，有助于减少用药剂量，降低毒副作用等。在抗体亲和力成熟的过程中，通过[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞受体基因的突变和选择性扩增，使得机体能够产生高亲和力的抗体，提高了抗体与抗原的结合能力和特异性识别能力。这有助于提高抗体的效价和减少交叉反应，使得抗体更具有针对性和有效性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②抗体亲和力成熟还有助于人们更好地理解抗体与靶点相互作用的机理，更好地认识靶点的功能。通过研究抗体亲和力成熟的过程和机制，可以进一步优化抗体药物的研发和质量改善，为临床治疗提供更安全、有效的治疗手段。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③抗体亲和力成熟在免疫应答和抗体药物研发中具有重要意义，有助于提高抗体的特异性和效力，减少用药剂量，降低毒副作用等，为临床治疗提供更安全、有效的治疗手段。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/antibody-affinity-maturation-service]抗体亲和力成熟服务[/url]，其优势：[/b][/font][font=宋体]①丰富的经验及多例成功案例[/font][font=宋体]②专业的抗体数据库分析系统[/font][font=宋体]③计算机建模结构模拟优化[/font][font=宋体]④随机突变、定点突变技术[/font][font=宋体]⑤快速、高通量哺乳动物细胞抗体表达与筛选技术平台[/font][font=宋体][font=宋体]⑥[/font][font=Calibri]OCTET Affinity, Kinetics, off-rate, ranking[/font][/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/antibody-affinity-maturation-service[/font][/font]

质谱技术是抗体药物分析最重要的技术手段之一。本文简述了抗体药物的发展和质谱技术的原理。对于质谱技术在抗体药物的分析中应用进行了归类整理，主要分为在一级结构和高级结构分析中的应用。抗体类药物是指含有抗体片段的蛋白类药物，所以在恶性肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、感染和器官移植排斥等重大疾病上得到了快速的发展，是当前生物药物领域增长最快的一类药物.1.抗体药物发展新趋势在生物药物领域，抗体药物占据着越来越重要的地位，全球销售排名前10位的药物中有6个为抗体药物，抗体药物按来源分类可以分为：鼠源单克隆抗体、人鼠嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。目前，批准的单克隆抗体药物中，人源化单抗和全人源单抗数量已占据大多数。1.1 抗体药物偶联物（ADC）抗体药物偶联物（ADC）由单克隆抗体和小分子化合物两部分组成。通过抗体的靶向作用，ADC 的抗体部分和肿瘤细胞表面抗原特异性识别并结合，通过细胞内吞作用，将抗体和小分子化合物一起带进肿瘤细胞内部，释放出小分子化合物。这样既可以降低小分子药物的毒性，同时具有靶向结合的作用。已经上市的两个ADC 是Kadyla 和Adcetris。1.2 双特异性抗体（BsAb）双特异性抗体（BsAb）是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子（细胞）之间架起桥梁，由于基因工程的发展，目前双特异性抗体已经研发出多种类型，主要类型有三功能双特异性抗体、IgG-scFv、三价双特异性分子、串联单链抗体（串联scFv）、DVD-Ig 等多种形式。2.质谱技术近年来质谱仪性能的显著改进主要基于开发出的两种离子化技术：一种是介质辅助的激光解吸/离子化技术。另一种是电喷雾离子化技术。由于这两种电离技术的出现，使原本只能检测小分子的质谱技术，可以运用于检测生物大分子。在过去质谱技术主要运用于对一级结构和序列的表征，而现在质谱技术越来越多地运用于高级结构的分析，而高级结构对于抗体药物的生物活性至关重要。3.质谱技术在抗体药物一级结构分析中的应用3.1 完整抗体药物精确分子量测定当得到抗体药物时，可以直接通过高分辨率的MALDI-TOF或者ESI-MS进行分子量的检测。通过对于脱糖后分子量的检测，可以对于抗体药物进行初步定性分析，并将可以作为药物常规放行的分析方法。对于脱糖前的抗体药物进行分析，可以得到抗体药物的糖基化类型的信息及糖基化水平的分布，对于快速了解生产工艺与药物质量的关系具有十分重要的意义。3.2 药物抗体偶联比（DAR）对于赖氨酸链接的抗体偶联药物，采用C4色谱柱及联用的质谱对去糖基化样品进行分析，根据偶联不同数目药物分子的质量数增加判断偶联数目。对于质谱测定的结果，不仅可以给出确切的药物抗体偶联比值，更能够给出链接不同个小分子药物的分布情况，及反应过程副产物空链接头的分布情况。3.3 肽图谱分析蛋白被特异酶切后的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱。由于不同的抗体药物具有不同的氨基酸序列，蛋白质被酶水解后，产生的肽片段也各不相同，肽混合物的质量数具有唯一特征。可以通过LC-ESI-MS进行肽片段的一级质量数的鉴定，也可以通过LC-ESI-MS/MS对于每个肽片段进行进一步确证，提高肽图谱的准确性。3.4 翻译后修饰研究蛋白质的翻译后修饰（PTM）对于抗体药物的生物学功能十分重要。常见的翻译后修饰有：磷酸化、脱酰胺、甲硫氨酸氧化、糖基化修饰、N端焦谷氨酸环化，C端赖氨酸切除等。质谱分析仪检测蛋白和肽片段的分子量偏差，可以实现高灵敏、高通量和高精确地鉴别蛋白质的翻译后修饰的种类。3.5 N端氨基酸序列检测常规N端氨基酸检测用Edman降解法进行检测，但是抗体药物有时候会出现N 端环化的现象，在这种情况下用Edman降解法需要先对抗体进行去封闭处理，而直接使用质谱可以直接测出N端的氨基酸序列，同时可以检测出N端环化的相对比例。4.质谱技术在抗体药物高级结构分析中的应用4.1 氢/氘交换质谱（HDX-MS）常规的质谱只能获得蛋白的一级结构信息。氢/氘交换质谱（HDX-MS）可以进行蛋白质构象，溶液动力学和表位映射进行分析。在能够调查的蛋白质的高阶结构和动态结构技术中，HDX-MS已经证明适合单克隆抗体和单克隆抗体-抗原复合物的构象分析。4.2 离子淌度质谱法（IM-MS）离子淌度是根据蛋白的电荷和形状选择性分离的方法，可以区分相同分子量的蛋白和肽段，可用于检测蛋白的简单高级结构。4.3 高分辨率傅立叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS）高分辨率傅立叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS）能够检测最高质量数的质谱仪器，并且有着很高的分辨率。FTICR-MS 是目前被公认为是蛋白质组学研究的有力工具，特别是和完整的蛋白质鉴定和上/下调翻译后修饰（PTM）蛋白质的鉴定。

[font=宋体][b]什么是纳米抗体？[/b][/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/nanobody][b]纳米抗体[/b][/url]（[/font][font=Calibri]nanobody, Nb[/font][font=宋体]）是一种人工设计的抗体分子，又称为单域抗体（[/font][font=Calibri]single-domain antibodies, sdAbs[/font][font=宋体]）、[/font][font=Calibri]VHH[/font][font=宋体]抗体或[/font][font=Calibri]camelid[/font][font=宋体]抗体，是发现于羊驼、单峰驼等驼科以及鲨鱼、鳐鱼等软骨鱼中的一种天然缺失轻链的重链抗体（[/font][font=Calibri]heavy-chain antibodies, HCAbs)[/font][font=宋体]。[/font][font=Calibri]1993[/font][font=宋体]年，比利时的科学家在骆驼的血清中发现了一种天然轻链缺失的重链抗体，分子量约[/font][font=Calibri]95 kDa[/font][font=宋体]，其中包括两个恒定区（[/font][font=Calibri]CH2[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]CH3[/font][font=宋体]）、一个铰链区和一个重链可变区（[/font][font=Calibri]variable heavy chain domain, VHH[/font][font=宋体]），接着克隆得到只包含一个重链可变区的单域抗体，即[/font][font=Calibri]VHH[/font][font=宋体]抗体。[/font][font=Calibri]VHH[/font][font=宋体]抗体的晶体结构为[/font][font=Calibri]4 nm[/font][font=宋体]×[/font][font=Calibri]2.5 nm[/font][font=宋体]×[/font][font=Calibri]3 nm[/font][font=宋体]的椭圆形，分子量大小仅普通抗体的[/font][font=Calibri]1/10[/font][font=宋体]，约[/font][font=Calibri]12-14 kDa[/font][font=宋体]，是最小的完整抗原结合片段，因此又被称为纳米抗体。纳米抗体可用于肿瘤等疾病的治疗、疾病的检测、疫苗的研发等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]纳米抗体特性：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1.[/font][font=宋体]高耐热性和稳定性[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]将不同的纳米抗体在[/font][font=Calibri]37[/font][font=宋体]℃放置[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]周，结果其抗原结合活性均在[/font][font=Calibri]80%[/font][font=宋体]以上，表明纳米抗体在室温下保存相当稳定，这使其比常规抗体更易于储藏和运输。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]比较了鼠单抗和纳米抗体在高达[/font][font=Calibri]90[/font][font=宋体]℃高温长时间处理的抗原结合活性，发现纳米抗体都保持了较高的活性仍能重新获得抗原结合能力，而所有常规抗体在[/font][font=Calibri]90[/font][font=宋体]℃处理后都丧失了活性，发生了不可逆的聚合。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]在恶劣条件，如在高热、离液剂、存在蛋白酶和极度[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值变性的条件下（如胃液和内脏中），正常抗体会失效或分解，而纳米抗体仍具有高度的稳定性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2.[/font][font=宋体]高抗原结合性：[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]纳米抗体独特的结构决定了其高抗原结合特性：纳米抗体较长的[/font][font=Calibri]CDR3[/font][font=宋体]，可形成一稳定的暴露的凸环结构（凸环中具有稳定结构的二硫键），能够深入抗原内部以更好的结合抗原从而提高了其抗原特异性和亲和力。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]而传统抗体[/font][font=Calibri]Fab[/font][font=宋体]片段及单链抗体[/font][font=Calibri]scFv[/font][font=宋体]的抗原结合表面常形成凹形拓扑结构[/font][font=Calibri], [/font][font=宋体]通常只能识别位于抗原表面的位点，因此纳米抗体[/font][font=Calibri]VHH[/font][font=宋体]单域具有更加广泛的抗原结合力，甚至当靶蛋白紧密包裹隐藏了普通抗体识别的位点时[/font][font=Calibri],[/font][font=宋体]纳米抗体也可以对其进行表位识别。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3.[/font][font=宋体]较强的组织穿透力：[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]纳米抗体具有强而快的组织穿透能力，可以进入致密的组织如实体瘤发挥作用；并且多余未结合的纳米抗体能够很快的被清除，这相对于单克隆抗体组织穿透力差，不易被清除的不足，更有利于疾病的诊断。另外，纳米抗体能够有效的穿透血脑屏障，这样的特性为脑部给药提供了新方法，有望成为治疗老年痴呆症的新药。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4.[/font][font=宋体]高水溶性、高表达性[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]正常抗体[/font][font=Calibri]VH[/font][font=宋体]结构域单独表达时通常形成包涵体，或者暴露的疏水域相互黏附；而纳米抗体[/font][font=Calibri]VHH[/font][font=宋体]由于其[/font][font=Calibri]FR2[/font][font=宋体]中的疏水残基被亲水残基所取代，使得纳米抗体的水溶性增加，聚合性减少；而且即使以包涵体形式表达，也很容易复性，这样可以大大提高作为药物的利用率。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]因纳米抗体分子量小、结构简单，由单一的基因编码，所以它很容易在微生物中合成，能在噬菌体、酵母等微生物中大量的表达，而且其相对价格低廉、可进行大规模生产，易于普及和应用。有报道，可通过酵母反应器酿造将纳米抗体的产量提高，每公升可达[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]克的产量。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]纳米抗体的应用优势[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①用于生物医药研发（基因工程药物研发、[/font][font=Calibri]ADC[/font][font=宋体]药物研发）；[/font][/font][font=宋体]②用于临床体外诊断（胶体金法、酶联免疫吸附法、电化学发光法）；[/font][font=宋体]③用于肿瘤研究、免疫学研究等基础研究；申请具有自主知识产权的发明专利及科研奖项；[/font][font=宋体]④拓展研究思路、发表国际知名学术刊物。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]纳米抗体是一种非常有前景的下一代治疗性抗体技术，受到越来越多的研究机构和制药公司的关注。为支持纳米抗体药物的早期发现，义翘神州利用噬菌体抗体库技术自主研发了纳米抗体开发平台，已成功开发了多个纳米抗体候选分子。另外，我们的高通量纳米抗体表达平台，已成功表达和生产了多种纳米抗体形式，包括单价、多价或多特异性[/font][font=Calibri]VHH[/font][font=宋体]，满足客户的各种定制需求。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/nanobody[/font][/font][font=Calibri] [/font]

[font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/bispecific-antibody][b]双特异性抗体[/b][/url]（[/font][font=Calibri]bispecificmonoclonalantibody,BsAb[/font][font=宋体]）是一种人工制作出来的可以同时结合两种不同抗原的特殊抗体。双特异性抗体在自然状态下不存在，只能通过人工制备。研究双特异性抗体，对于癌症的免疫治疗有着重大的意义。本文主要对双特异性抗体的结构、作用原理及制备方式做一综述。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]作用原理：[/font][/b][font=宋体]双特异性抗体的的作用机制主要有三种：[/font][font=宋体]介导免疫细胞杀伤[/font][font=宋体]双靶点信号阻断[/font][font=宋体]促进蛋白形成功能性复合体[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①[/font][font=宋体]介导免疫细胞杀伤[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]双特异性抗体的一个重要作用机制是介导免疫细胞杀伤，双特异性抗体有两条抗原结合臂，其中一条与靶抗原结合，另一条与效应细胞上的标志抗原结合，后者可以激活效应细胞，使其靶向杀灭肿瘤细胞。以[/font][font=Calibri]Catumaxomab[/font][font=宋体]（卡妥索单抗，[/font][font=Calibri]2009[/font][font=宋体]年批准上市的双特异性抗体药物）为例，两个抗原结合臂分别结合细胞毒性[/font][font=Calibri]T[/font][font=宋体]细胞的[/font][font=Calibri]CD3[/font][font=宋体]位点和肿瘤细胞的[/font][font=Calibri]EpCAM[/font][font=宋体]位点，从而引导[/font][font=Calibri]T[/font][font=宋体]细胞杀伤靶细胞。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②[/font][font=宋体]双靶点信号阻断[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]同时结合双靶点，阻断双信号通路是双特异性抗体的另一个重要作用机制。受体酪氨酸激酶[/font][font=Calibri](receptortyrosinekinase[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]RTKs)[/font][font=宋体]是最大的一类酶联受体，在细胞增殖过程中发挥重要调节作用，如[/font][font=Calibri]Her[/font][font=宋体]家族等。[/font][font=Calibri]RTKs[/font][font=宋体]在肿瘤细胞表面异常高表达，导致肿瘤细胞恶性增生，因此也是肿瘤治疗的重要靶点。针对[/font][font=Calibri]RTKs[/font][font=宋体]的单靶点单克隆抗体已在肿瘤治疗中得到广泛应用。但是，肿瘤细胞可以通过转换信号通路或通过[/font][font=Calibri]HER[/font][font=宋体]家族成员自身或不同成员之间的同源或异源二聚体激活细胞内信号进行免疫逃逸。因此采用双特异性抗体药物同时灭活两个或多个[/font][font=Calibri]RTKs[/font][font=宋体]或其配体，可以减少肿瘤细胞逃逸，提高治疗效果。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③[/font][font=宋体]促进蛋白形成功能性复合体[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]利用双特异性抗体两个抗原结合臂可以结合不同抗原的特点，两个抗原结合臂分别结合两种特定蛋白分子，形成功能性复合体。利用该种复合体给药，可以减少机体内排斥反应，提高临床治疗效果。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]双特异性抗体种类[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]双特异性抗体按结构区分主要有两大类：含[/font][font=Calibri]FC[/font][font=宋体]区的双特异性抗体（[/font][font=Calibri]IgG-like[/font][font=宋体]双特异性抗体）与不含[/font][font=Calibri]Fc[/font][font=宋体]区的双特异性抗体（[/font][font=Calibri]non-IgG-like[/font][font=宋体]双特异性抗体）。含[/font][font=Calibri]Fc[/font][font=宋体]区双特异性抗体保持了传统的单克隆抗体的结构，具有两个[/font][font=Calibri]Fab[/font][font=宋体]区和一个[/font][font=Calibri]FC[/font][font=宋体]区。但与传统单克隆抗体不同，这两个[/font][font=Calibri]Fab[/font][font=宋体]是可以结合不同抗原。此类抗体主要有[/font][font=Calibri]Triomabs[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]DVD-Ig[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]2in1-IgG[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]kihIgG[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]CrossMAb[/font][font=宋体]等；不含[/font][font=Calibri]Fc[/font][font=宋体]区双特异性抗体缺失了[/font][font=Calibri]Fc[/font][font=宋体]区，由两个抗体的[/font][font=Calibri]VH[/font][font=宋体]区及[/font][font=Calibri]VL[/font][font=宋体]区组成或者由[/font][font=Calibri]Fab[/font][font=宋体]片段组成。此类双特异性抗体主要有[/font][font=Calibri]BiTE[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]DA[/font][font=宋体]Ｒ[/font][font=Calibri]T[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]TandAbs[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]bi-Nanobody[/font][font=宋体]等。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]双特异性抗体的制备方法[/font][/b][font=宋体][font=宋体]制备双特异性抗体，科学界同仁已开发了诸多解决方案。杂交[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]杂交瘤法（也称为四源杂交瘤）是最早用于制备双特异性抗体的技术。基于两种不同杂交瘤细胞系的体细胞融合，表达所需特异性的鼠[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]。然而，这种方法制备的功能性双特异性抗体占比低，为后续的抗体纯化和质控带来了巨大的挑战。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]通过使用分子克隆技术，双特异性[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]抗体由同一细胞系表达的两条不同重链和轻链组成。双特异性抗体的制备需要至少两个用于异二聚化重链的质粒和一个用于公共轻链的质粒。如果使用两个不同的轻链，则需要两个轻链质粒。一般建议[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]个单独的质粒上表达[/font][font=Calibri]HC[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]LC[/font][font=宋体]，因为调整质粒比率是一种简单有效的方法。随后，通常要经历复杂的过程从异质稳定转染池中选择最理想的克隆细胞系，以用于大规模抗体生产。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]与稳定转染相比，瞬时转染无需将重组[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]整合至宿主基因组中，可以在数天内快速得到结果。人胚肾细胞（[/font][font=Calibri]HEK293[/font][font=宋体]）可用于双抗的瞬时表达，适合应用于双抗药物开发的早期阶段。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]目前义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/bispecific-antibody-servicehttp://][b]双特异性抗体制备服务[/b][/url]，详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/bispecific-antibody-service[/font][/font][font=Calibri] [/font]

[font=宋体]在生物医药领域，抗体作为一类重要的生物分子，被广泛应用于疾病诊断、治疗以及基础研究中。其中，单克隆抗体和单链抗体是两种常见的抗体类型，尽管它们都是从杂交瘤或基因工程方法中获得，但在结构、功能和制备方法等方面存在显著差异。本文将对单克隆抗体和单链抗体的区别进行深入解析。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]一、结构差异[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/mab-development][b]单克隆抗体[/b][/url]是由一个单一的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆产生，具有高度的均一性和特异性。其结构包括重链和轻链，通过二硫键连接在一起，形成一个完整的抗体分子。而单链抗体则是由一段柔性连接肽把抗体重链可变区（[/font][font=Calibri]V~H[/font][font=宋体]）和轻链可变区（[/font][font=Calibri]V~L[/font][font=宋体]）连接而成，是具有亲代抗体全部抗原结合位点的最小功能结构单位。单链抗体的结构相对简单，没有重链和轻链的连接，分子量也较小。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]二、功能差异[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]单克隆抗体具有高度的特异性，可以用于疾病的诊断和治疗。由于其结构均一，单克隆抗体的生产和质量控制相对容易，因此在临床应用中具有较高的可靠性。而单链抗体则具有特异的抗原结合活性，能够较好地保持亲本抗体的抗原亲和活性，同时分子量小、结构简单，更适于抗体结构与功能的分析。此外，单链抗体还具有较好的组织穿透能力和低免疫原性等优点，使其在药物研发以及导向治疗等方面具有广泛的应用前景。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]三、制备方法差异[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]单克隆抗体的制备通常采用[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology][b]杂交瘤技术[/b][/url]，将能够产生特异性抗体的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，再通过筛选和克隆化培养获得能够稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系。这种方法需要经过多次筛选和克隆化培养，制备过程相对复杂。而单链抗体的制备则多采用基因工程方法，通过设计和构建基因表达载体，在体外表达单链抗体基因，然后进行分离和纯化得到单链抗体。这种方法相对简单快捷，但需要设计和构建基因表达载体，对技术要求较高。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]综上所述，单克隆抗体和[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/scfv-antibody-production][b]单链抗体[/b][/url]在结构、功能和制备方法等方面存在显著差异。在实际应用中，应根据具体需求选择合适的抗体类型。单克隆抗体具有高度的特异性和可靠性，适用于疾病的诊断和治疗；而单链抗体则具有特异的抗原结合活性、分子量小、结构简单等特点，适用于抗体结构与功能的分析、药物研发以及导向治疗等领域。随着生物技术的不断发展，相信单克隆抗体和单链抗体的应用前景将更加广阔。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services][b]单克隆抗体制备服务[/b][/url]和[url=https://cn.sinobiological.com/services/fab-scfv-antibody-production-service][b]抗体片段生产服务[/b][/url]，同时拥有一整套的抗体开发解决方案，包括免疫原制备、动物免疫、[/font][font=Calibri]scFv[/font][font=宋体]抗体库构建和筛选等步骤。此外，我们在[/font][font=Calibri]scFv[/font][font=宋体]抗体表达纯化方面具有丰富的经验，已成功为客户表达[/font][font=Calibri]di-scFvs[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]tri-scFvs[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]BiTE[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]Diabody[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]scFv-(H)IgG[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]scFv-(L)IgG[/font][font=宋体]等多种[/font][font=Calibri]scFv[/font][font=宋体]形式。详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/fab-scfv-antibody-production-service[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

HJ/T68-2001方法测固定污染源苯胺类，用什么色谱柱？标准上是玻璃填充柱，可以用毛细管柱吗还有采样用的硅胶吸附管都是自己自制的吗？有卖的成品吗？

[font=宋体][font=宋体]抗体亲和力成熟[/font][font=Calibri](antibodyaffinitymaturation)[/font][font=宋体]是指机体正常存在的一种免疫功能状态。在体液免疫中，再次应答所产生抗体的平均亲和力高于初次免疫应答。这种现象称为抗体亲和力成熟。机体的这种功能状态是长期进化和对外界环境不断适应的结果，对机体防御和维持自身免疫监控有着十分重要的意义。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]体内亲和力成熟[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]抗体亲和力成熟形成的原因，是抗体形成细胞本身的基因突变和抗原对[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆的选择性激活。机体在接受抗原刺激后，体细胞发生高频突变，突变产生的各种亲和力不同的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆，经过滤泡树突细胞捕获，使得后代[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞及其产生的抗体对抗原的平均亲和力得到了提升，从而实现了亲和力的体内成熟。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]在机体体液免疫系统中，[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞应对抗原刺激诱导，产生抗体。在反复暴露于抗原的过程中，产生高亲和力的抗体。这涉及两个相互关联的过程：首先在骨髓抗体轻重链的胚系基因片段经[/font][font=Calibri]V-(D)-J[/font][font=宋体]随机重排产生超过[/font][font=Calibri]106[/font][font=宋体]的组合，这是抗体特异性免疫反应的分子基础；其次，机体接受抗原刺激后，在二级淋巴器官的生发中心，抗体基因尤其是互补决定区（[/font][font=Calibri]complementaritydeterminingregion[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]）发生高频突变，突变导致抗体结合特性改变。经过滤泡树突状细胞提呈抗原，只有抗原亲和力最高的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞将选择生存进一步分化为浆细胞和记忆细胞。对于高频突变，近期研究表明：活化的胞嘧啶核苷脱氨酶（[/font][font=Calibri]activation-inducedcytidinedeaminase[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]AID[/font][font=宋体]）将胞嘧啶脱氨基转化为尿嘧啶，突变后的尿嘧啶引发错配和碱基剪切并引发[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]修复，而不正确修复进一步加剧突变产生，导致抗体基因高频突变诱发高亲和力抗体产生。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]体外抗体亲和力成熟[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]抗体制备技术的发展，经历了多克隆技术、单克隆技术和抗体库技术[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]个发展阶段。与单、多克隆技术相比，抗体库技术在基因水平上的操作非常灵活，可对基因序列进行分析、修饰和加工以改进抗体特性或赋予抗体新特性，突破了以往仅局限于抗抗原分子设计的限制。然而，抗体库来源的抗体与传统的单、多克隆抗体相比，实际应用非常少见，主要是因为库来源抗体与天然抗体相比，亲和力偏低，难以满足多种实际需求。特别是来自于未经免疫的天然抗体库中的抗体，抗体的亲和力通常在微摩尔水平，这仅与动物在初次免疫应答后获得的抗体亲和力水平相当。因此人们依据体内抗体亲和力成熟原理，模拟体内亲和力成熟过程、采取各种策略对抗体基因进行相应突变，进行体外亲和力成熟研究。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]常用的抗体体外亲和力成熟技术[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]根据体内抗体亲和力成熟原理，在体外抗体亲和力成熟过程中，选择突变区域以及如何引入突变是一个关键问题，目前的突变策略主要分为三大类，随机突变、置换和定向突变。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①易错[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]易错[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]是目前最常用的抗体突变技术，可以在抗体基因的全长或部分区域随机引入突变。在聚合酶对目的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增[/color][/url]时，通过应用错配率高的聚合酶或调整反应条件等，以一定的频率向目的基因中随机引入突变，并通过多轮[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]反复进行随机诱变，累计突变效应，最终获得目的蛋白的随机突变体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②链置换[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]链置换是保留某个特定抗体的重链或轻链，另一条链与一个随机化的互补链进行组合，从中筛选更高活性的突变株。通过固定抗体两条链中的一条链，对另一条链构建具有足够多样性的置换文库，随机组合有可能产生最佳链组合，经过噬菌体抗体库筛选可获得高亲和力的新抗体。链置换策略常采用轻链替换。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③定点突变[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]由于天然抗体在亲和力成熟过程中，体细胞高频突变发生区域并非均匀分布，而是主要集中在与抗原直接接触的[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]区。在抗体的亲和力体外成熟过程中，[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]区是最常选用的定点突变区域，这样既可以获得足够的序列多样性，又不会破坏蛋白质结构。对[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]进行定点突变时，可以对多个[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]进行平行突变或进行逐步优化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]④[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]改组[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]改组技术是对同源的抗体基因，采用脱氧核糖核酸酶Ⅰ将其切割成不超过[/font][font=Calibri]50bp[/font][font=宋体]的片段，再随机组合后进行[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]扩增成完成的抗体基因的技术。它包含了抗体片段随机化切割、重组和筛选的过程，一定程度上模拟了天然抗体的亲和力成熟过程，并加快了体外定向进化速度。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Tips:[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、在链置换中为什么通常替换的都是轻链？[/font][/font][font=宋体]答：因为抗体重链在抗结合活性和结构方面比较重要，所以链置换策略常采用轻链替换，以尽量避免链替换后抗体结合特异性发生变化。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、抗体库技术与单、多抗技术相比，有何优劣？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]答：优势：抗体库技术筛选范围大、实验周期短、操作简单、不许进行免疫操作、可应用于大规模生产劣势：亲和力弱，不易激发人体的抗原[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗体反应。临床应用受限较大。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]义翘神州会为大家提供抗体亲和力成熟服务，同时义翘神州优势：[/font][font=宋体]①丰富的经验及多例成功案例[/font][font=宋体]②专业的抗体数据库分析系统[/font][font=宋体]③计算机建模结构模拟优化[/font][font=宋体]④随机突变、定点突变技术[/font][font=宋体]⑤快速、高通量哺乳动物细胞抗体表达与筛选技术平台[/font][font=宋体][font=宋体]⑥[/font][font=Calibri]OCTET Affinity, Kinetics, off-rate, ranking[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]同时[url=https://cn.sinobiological.com/services/antibody-affinity-maturation-service][b]抗体亲和力成熟服务[/b][/url]内容及流程详解可以参看抗体亲和力成熟[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/antibody-affinity-maturation-service[/font][/font][font=宋体] [/font][font=Calibri] [/font]

对于气相色谱柱来说，有时候会在资料上看到使用混合固定液。在制备混合固定液的柱子时，一般有以下3种情况：　　１、分别涂渍于担体后再混合；　　２、将固定液混合后再涂渍，注意这时所用的固定液都应溶解在同一个溶剂里；　　３、分别涂渍，分别填装入按比例长短的色谱柱，最后再将它们串接起来。上述三种处理方法，结果基本相同，但对于特殊的分离，有些也会有差异。

[font=宋体][font=宋体]抗体亲和力成熟[/font][font=Calibri](antibody affinity maturation)[/font][font=宋体]是指机体正常存在的一种免疫功能状态。在体液免疫中，再次应答所产生抗体的平均亲和力高于初次免疫应答。这种现象称为抗体亲和力成熟。机体的这种功能状态是长期进化和对外界环境不断适应的结果，对机体防御和维持自身免疫监控有着十分重要的意义。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]体内亲和力成熟[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]抗体亲和力成熟形成的原因，是抗体形成细胞本身的基因突变和抗原对[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆的选择性激活。机体在接受抗原刺激后，体细胞发生高频突变，突变产生的各种亲和力不同的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆，经过滤泡树突细胞捕获，使得后代[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞及其产生的抗体对抗原的平均亲和力得到了提升，从而实现了亲和力的体内成熟。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]在机体体液免疫系统中，[/font][font=Calibri]B [/font][font=宋体]淋巴细胞应对抗原刺激诱导，产生抗体。在反复暴露于抗原的过程中，产生高亲和力的抗体。这涉及两个相互关联的过程：首先在骨髓抗体轻重链的胚系基因片段经[/font][font=Calibri]V-(D)-J [/font][font=宋体]随机重排产生超过[/font][font=Calibri]106[/font][font=宋体]的组合，这是抗体特异性免疫反应的分子基础；其次，机体接受抗原刺激后，在二级淋巴器官的生发中心，抗体基因尤其是互补决定区（[/font][font=Calibri]complementarity determining region[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]）发生高频突变，突变导致抗体结合特性改变。经过滤泡树突状细胞提呈抗原，只有抗原亲和力最高的[/font][font=Calibri]B [/font][font=宋体]细胞将选择生存进一步分化为浆细胞和记忆细胞。对于高频突变，近期研究表明：活化的胞嘧啶核苷脱氨酶（[/font][font=Calibri]activation-induced cytidine deaminase[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]AID[/font][font=宋体]）将胞嘧啶脱氨基转化为尿嘧啶，突变后的尿嘧啶引发错配和碱基剪切并引发[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]修复，而不正确修复进一步加剧突变产生，导致抗体基因高频突变诱发高亲和力抗体产生。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]体外抗体亲和力成熟[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]抗体制备技术的发展，经历了多克隆技术、单克隆技术和抗体库技术[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]个发展阶段。与单、多克隆技术相比，抗体库技术在基因水平上的操作非常灵活，可对基因序列进行分析、修饰和加工以改进抗体特性或赋予抗体新特性，突破了以往仅局限于抗抗原分子设计的限制。然而，抗体库来源的抗体与传统的单、多克隆抗体相比，实际应用非常少见，主要是因为库来源抗体与天然抗体相比，亲和力偏低，难以满足多种实际需求。特别是来自于未经免疫的天然抗体库中的抗体，抗体的亲和力通常在微摩尔水平，这仅与动物在初次免疫应答后获得的抗体亲和力水平相当。因此人们依据体内抗体亲和力成熟原理，模拟体内亲和力成熟过程、采取各种策略对抗体基因进行相应突变，进行体外亲和力成熟研究。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]常用的抗体体外亲和力成熟技术[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]根据体内抗体亲和力成熟原理，在体外抗体亲和力成熟过程中，选择突变区域以及如何引入突变是一个关键问题，目前的突变策略主要分为三大类，随机突变、置换和定向突变。[/font][font=宋体][font=宋体]易错[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]易错[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]是目前最常用的抗体突变技术，可以在抗体基因的全长或部分区域随机引入突变。在聚合酶对目的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]基因扩增[/color][/url]时，通过应用错配率高的聚合酶或调整反应条件等，以一定的频率向目的基因中随机引入突变，并通过多轮[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]反复进行随机诱变，累计突变效应，最终获得目的蛋白的随机突变体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①[/font][font=宋体]链置换[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]链置换是保留某个特定抗体的重链或轻链，另一条链与一个随机化的互补链进行组合，从中筛选更高活性的突变株。通过固定抗体两条链中的一条链，对另一条链构建具有足够多样性的置换文库，随机组合有可能产生最佳链组合，经过噬菌体抗体库筛选可获得高亲和力的新抗体。链置换策略常采用轻链替换。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②[/font][font=宋体]定点突变[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]由于天然抗体在亲和力成熟过程中，体细胞高频突变发生区域并非均匀分布，而是主要集中在与抗原直接接触的[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]区。在抗体的亲和力体外成熟过程中，[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]区是最常选用的定点突变区域，这样既可以获得足够的序列多样性，又不会破坏蛋白质结构。对[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]进行定点突变时，可以对多个[/font][font=Calibri]CDR[/font][font=宋体]进行平行突变或进行逐步优化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③[/font][font=宋体][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]改组[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]改组技术是对同源的抗体基因，采用脱氧核糖核酸酶Ⅰ将其切割成不超过[/font][font=Calibri]50bp[/font][font=宋体]的片段，再随机组合后进行[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]扩增成完成的抗体基因的技术。它包含了抗体片段随机化切割、重组和筛选的过程，一定程度上模拟了天然抗体的亲和力成熟过程，并加快了体外定向进化速度。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/antibody-affinity-maturation-service][b]抗体亲和力成熟服务[/b][/url]，有需求可以参看：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/antibody-affinity-maturation-service[/font][/font]