色谱分析氨基酸含量

氨基酸分析技术的特点与内涵文章来源：国家产品质量安全与法信息中心网 添加时间：2009-7-19 3:13:19 点击：1510摘要：在传统蛋白质分析技术基础上，结合现代分析仪器技术发展优势，针对氨基酸分析技术难点及存在问题，概括比较分析评价当前氨基酸分析技术特点。关键词：蛋白质 氨基酸 分析技术 研究进展1 前言迄今为止，自然界中已发现180多种氨基酸，其中参与蛋白质合成的氨基酸只有20多种，称为基本氨基酸。氨基酸主要有两种存在形式，一种是以游离态存在于生理体液(血浆、尿)、食品(酒、饮料)中；另一种是以结合态存在于肽和蛋白质中。蛋白质在乳中含量为3.0%~3.5%，是乳的主要成分，对乳品的理化特性和营养价值有重要的影响。由于国标法对蛋白的检测是通过检测样品含氮量而得到的，实际上是将样品消化分解，经蒸馏碱吸收后，测定的挥发性“氨基氮”，因而部分不法商贩用添加外源动植物蛋白粉或脲等含氮化合物（虚“氮”）来增加原料乳的氮含量，钻传统检测方法表征“虚氮”的漏洞，以蒙混过关。这些掺入水解动物蛋白或者含氮化合物的乳粉因其氨基酸的组成不合理，根本不能代表动、植物蛋白，不易消化，所以营养价值低下，导致人体吸收利用率降低，严重地影响到婴幼儿的生长发育和智力水平。因此，对氨基酸分析方法的研究与改进逐渐得到各国家、全社会的高度重视。在一般情况下，质量监督检验单位在市场上抽到产品进行检验所得的数据中，蛋白质含量实际上是用总氮含量表示的，所以在加工企业常规检验时、含氮化合物、水解动物蛋白等杂蛋白是测不出来的，因此需要建立快速分析、测定乳制品中蛋白质、氨基酸的检测方法，保障乳制品的质量与安全。,1958年，Spackman等首先提出了用阳离子交换色谱与柱后茚三酮衍生结合的方法分析蛋白质中的氨基酸，实现了氨基酸分析的自动化。其后，人们不断地发展新的氨基酸分析方法，柱前衍生反相高效液相色谱法、高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法、毛细管电泳法、蛋白质芯片技术等相继应用于氨基酸分析。现已是多种氨基酸分析方法并存、互补。本文就目前应用于氨基酸分析的主要方法作一比较分析。,,2 氨基酸分析技术的光谱分析优势及特点利用光谱探针方法定量分析蛋白质的研究在国际上十分活跃，其中，对有机染料(包括显色剂和荧光染料)结合分光光度法和金属离子-有机染料(包括显色剂和荧光染料)结合分光光度法的研究倍受重视。 2.1 有机染料结合分光光度技术因为有机染料结合分光光度法测定蛋白质操作简便，比较灵敏，又不需特别的仪器，方法应用比较广泛。现在研究较多的可作为探针的染料分子中，大部分都含有带正电荷的亲水性基团如羟基、磺酸基、酚羟基及不带电荷的疏水性基团，如苯环。这类方法的基础是在溶液pH小于等电点时，蛋白质的肽键亚胺和N端氨基质子化成阳离子，若有阴离子染料存在时，由于电荷作用，蛋白质便与染料结合沉淀或改变结合染料的光吸收特性，借染料颜色的减褪或变化的程度测定蛋白质的含量。已经应用的染料有酸性橙红、考马斯亮蓝G-250、溴甲酚绿、溴甲酚紫、埃铬青R和溴酚蓝。2.2金属离子-有机染料结合分光光度技术近几年发展了利用金属离子和有机染料特别是荧光染料形成配合物体系结合光光度法来测定蛋白质含量。金属离子与含有-OH或C=O的有机染料相遇时，氧原子中的孤对电子可顺利进人杂化轨道，形成稳定的配合体系，在酸性条件下，该体系遇到结构不对称的蛋白质分子时，互相极化产生静电作用而结合成新的大分子团，改变了原体系的光谱性能，从而能定量测定蛋白质的含量。该方法具有灵敏度高、线性范围广、干扰离子少、操作简单、快速及适用于常规应用等特点。2.3 荧光光度分析技术荧光法是定量测定蛋白质的另一种常用方法通常比分光光度法更灵敏。常用的方法有内源荧光法、荧光探针法、荧光偏振、时间分辨荧光法及激光诱导时间分辨免疫分析法。2.3.1 内源荧光分析技术蛋白质中存在着Tyr、Trp、phe残基，能够吸收270~300 nm的紫外光而发出紫外荧光。当测定体系中加入小分子配体（SM）时，SM与蛋白质发生相互作用，会导致蛋白质荧光的猝灭，利用SM对蛋白质内源荧光的猝灭这一现象可以确定蛋白质与SM的作用类型及其结合部位等。2.3.2 外源荧光分析技术对于蛋白质的研究仅利用其内源荧光是不够的，需要通过外源荧光性质的研究才能获得更多关于蛋白质分子的各种信息，这就使得荧光探针对蛋白质分析有着极其重要的意义，这已成为蛋白质微量检测及溶液的构相分析中不可缺少的手段之一。在外源荧光法中，又可分为有机荧光探针法和稀土荧光探针法。作为一个好的荧光探针应满足以下条件：探针分子与蛋白质分子的某一微区必需有特异性的结合，并且结合比较牢固；探针的荧光必须对环境条件敏感；蛋白质分子与探针结合后不影响其原来的结构和特性。在满足这些条件的基础上可进行蛋白质的测定和与金属离子结合的计量化学等。与光度法类似，蛋白质在和某些具有荧光特性的染料结合后，能引起荧光强度的变化，并且在一定浓度范围内与蛋白质浓度成正比，因此可用于蛋白质的测定。利用这些化合物在不同蛋白质分子中量子产率、峰位及谱带的变化，就可探测蛋白质分子结合区的极性、疏水性的大小，从而推论构象的稳定情况及变化等。2.3.3 荧光偏振分析技术利用荧光体在转动扩散速度上的差异而导致偏振荧光的差别，建立了荧光偏振测定法。利用荧光偏振还可以研究：酶与荧光底物的结合程度；蛋白质聚合与解离；蛋白质从螺旋到无规卷曲的研究。,3 氨基酸分析技术的色谱分析优势及特点3.1 柱后衍生高效阳离子交换色谱分析技术高效阳离子交换色谱（HPCEC）-柱后茚三酮衍生光度检测分离测定氨基酸是一种经典的氨基酸分析方法。此方法是利用氨基酸在酸性条件下形成阳离子而在阳离子交换柱中分离，分离后的氨基酸用茚三酮衍生、紫外可见光检测器检测。该方法以阳离子交换树脂为固定相、酸性缓冲液流动相，在柱后流出液中加入茚三酮使氨基酸生成具有可见光吸收的衍生物进行检测，具有重现性好、仪器稳定、结果可靠、适合于大量常规样品分析等优点。另外，由于衍生化反应发生在氨基酸与其物质分离之后，因而避免了其他物质的干扰，适合复杂样品中氨基酸的分析。其缺点是仪器复杂、体积大、费用高。此外，由于脯氨酸的测定波长在440nm，而其他氨基酸的测定波长为570nm，因脯氨酸不能和其他氨基酸同时测定。氨基酸分析自动仪就是基于阳离子交换色谱分离、柱后茚三酮衍生光度检测技术设计的。商品化的自动氨基酸分析仪是在20世纪60年代初问世，目前的自动氨基酸分析仪已实现了程控自动化和数据处理电脑化，分析时间已缩短至1 h以内。氨基酸自动分析仪实际上属专门用来分析氨基酸的高效液相色谱仪，其优点是高压、快速、灵敏，试剂和样品用量少、重现性好、分析结果稳定。广泛用于食品、医学、农业以及微生物等领域。3.2 柱前衍生反相高效液相色谱分析技术近20年来，柱前衍生反相高效液相色谱法（RP-HPLC）分析氨基酸得到了迅速发展，逐渐取代柱后衍生高效阳离子交换色谱（HPCEC）在许多领域中的应用。RP-HPLC分析方法更加快速灵敏。与专业氨基酸分析的自动分析仪不同，HPLC仪适用性更广、更灵活。RP-HPLC要求将氨基酸在柱前转化为适于反相色谱分离并能被灵敏检测的衍生物，柱前衍生的关键在于衍生试剂的选择。选择衍生试剂的标准是能与各氨基酸定量反应，每种氨基酸只生成一种化合物且产物有一定的稳定性，不产生或易于排除干扰物，操作简单，色谱分离分辨率高、检测灵敏度高，分析时间短，便于实现自动化和使产物能在不同型号的高效液相色谱仪上测定。目前比较常用的柱前衍生试剂有邻苯二甲醛（OPA）、异硫氰酸苯酯（PITC）、氯甲酸芴甲酯（FMOC-Cl）及丹酰氯（Dansyl-Cl）。衍生后的氨基酸一般键合在C18柱上，利用液液分配原理进行分离。流动相多以乙酸盐或磷酸盐缓冲液为主，以乙腈、甲醇或四氢氟喃为调节剂。由于氨基酸衍生物仍保留着两性化合物的特点，除改变调节剂之外，还可通过调节缓冲液pH值、离子强度、柱温等使之达到理想的分离。当然，不同衍生物所选用的柱型、流动相以及氨基酸的洗脱时间和顺序不尽相同。柱前衍生反相高效液相色谱法可用于分析蛋白质水解液、生理体液和食品等样品中的氨基酸。当与质谱技术结合时，采用电离喷雾质谱（ESI-MS）或电离喷雾串联质谱（ESI-MS/MS）联用技术方式，借助计算机的联机检索，可以实现高通量筛选和鉴定蛋白质混合体系。目前，，蛋白质组研究的高效液相色谱-质谱联用的方式有一维色谱-质谱联用技术、多维色谱-质谱联用技术以及亲和色谱-质谱联用技术等。一维色谱-质谱技术仅能分析一些不太复杂的蛋白质体系，而对复杂的多肽混合物常不能满足分离的要求。多维色谱分离的方法在某种程度上满足了对复杂蛋白质混合分离鉴定的要求。,,,3.3 两种氨基酸直接分析技术大多数氨基酸不具备生色团，因此无法利用分光光度法直接检测，故需采用化学衍生技术，使之生成可在紫外或可见光区有吸收的化合物，或者采用荧光法检测。但对于分析工作者来讲，尤其是在新化合物研制的过程中，面对多种未知的降解物，如采

我要用氨基酸分析仪测土壤中游离氨基酸的种类和含量.但不知道如何处理土壤样品 现在非常着急 不只那为好心人可知道如何做 谢谢

通常，饲料原料的氨基酸含量是通过离子交换（IEC）或高效液相色谱（HPLC）方法测定。这些方法由于费用极其昂贵，而且所需时间很长，用于饲料厂的配方调整和质量控制，不切实际。也可以通过测定饲料原料的干物质和粗蛋白含量，回归预测氨基酸含量（NRC,1998），但是，这种折中的方法推测的饲料原料的氨基酸含量与其实际值差异较大(丁丽敏等，2002)，直接用于生产，会造成较大的损失。在实际生产中，饲料厂在制定饲料配方时，饲料原料中所用的氨基酸含量只好参考数据库中推荐的平均值，但推荐的平均值无法反应特定原料氨基酸含量的变异。因此，饲料研究和生产人员一直在寻找一种快速、廉价的测定饲料原料氨基酸含量的方法。 过去人们认为，近红外（Near-Infrared Reflectance Spectroscopy，简称NIRS）技术不适用于测定饲料原料氨基酸含量，因为原料中氨基酸含量过低。但是，近年来，随着近红外分析技术和仪器的发展，通过近红外技术测定的氨基酸结果与传统的测定方法具有了很好的可比性（张维军等，2000）。本文主要对笔者近期应用NIRS 方法快速测定饲料原料氨基酸含量方面所取得的经验进行介绍，以使NIRS技术更好的服务于国内饲料行业。 1 NIRS技术测定饲料原料氨基酸含量的原理和方法 NIRS技术是依据被检测样品中某一化学成分对近红外区光谱的吸收特性而进行定量测定的一种分析方法。应用NIRS方法测定原料氨基酸含量，首先要建立定标方程。定标方程的建立，不仅需要饲料原料的NIRS光谱值，而且需要利用标准方法测定的原料的氨基酸含量。饲料原料NIRS光谱的扫描和氨基酸含量的化学分析值必须是对同一样品进行的。根据所得的光谱值和化学分析值，运用多元回归计算便可得到相应的定标方程。但仅有很少的实验室能够大量的测定这些数据，这也是NIRS在测定原料氨基酸含量方面发展较慢的原因。 每种饲料原料至少需要50个样品才能建立定标方程，而且所取样品必须具有代表性。增加建立定标方程所用的样品数量，能够提高定标方程的准确性和可靠性。德固赛（Degussa）公司拥有全球最大的饲料氨基酸分析实验室，每年分析的饲料样品超过10，000个，为建立NIRS定标方程奠定了坚实的基础，目前，已经对全球16种常用饲料原料的干物质、粗蛋白质和所有必需氨基酸含量建立了定标方程（表1）。新到货的饲料原料，可以对其取样、制样，然后利用NIRS 分析仪对其样品进行扫描获得NIRS 光谱值，并根据相应的定标方程计算，很快就可以获得饲料原料的氨基酸含量。 表1 已经建立定标方程的饲料原料 类别原料名称N 大麦233 玉米328 黑麦273 谷物及其副产品小麦281 麦麸178 高梁205 米糠181 玉米蛋白粉184 菜籽粕171 豆粕341 油籽类葵花粕107 豌豆110 羽扇豆105 鱼粉307 动物副产品羽毛粉247 肉骨粉468 注：N=建立相应饲料原料定标方程的样本数 2 NIRS与色谱法测定的饲料原料氨基酸含量的一致性 NIRS分析结果的有效性，最终还要看其与色谱法测定值的吻合程度（Fontaine等，2001）。图1～3列出了德固赛（Degussa）公司利用NIRS和色谱方法测定的豆粕、肉骨粉和小麦的蛋氨酸以及赖氨酸含量之间的拟合情况。由图以及相应的统计结果可以看出，NIRS方法对饲料原料的氨基酸含量的预测值非常准确和可靠。因此，在实际生产中，可以利用快速、低成本的NIRS 技术代替耗时、昂贵的色谱法测定饲料原料的氨基酸含量。 3 NIRS 技术在饲料生产中的作用 由于利用NIRS技术测定饲料原料氨基酸含量，不仅费用极其低廉，而且所用时间很短，因此获得饲料原料氨基酸含量测定结果的时间主要决定于对原料进行采样和制样的时间。饲料厂可以通过快速、准确的氨基酸含量测定值，评估来自不同产地和供货商的原料，实施真正的质量管理。 3.1 细分饲料原料 饲料厂可以根据氨基酸的测定值，将到厂的饲料原料进行细分。例如，以下几个因素可以作为细分时考虑的因素：品种，种植方法（例如施肥情况），产地，加工条件。将饲料原料细分，能够促使配合饲料厂更准确的优化配方。为了统计分析不同来源、品种或供应商原料的差别，所采集的样品必须具有代表性。而且，每种来源或供应商的样品至少应该有20个。如表2所示，根据粗蛋白质和氨基酸含量的测定值，饲料原料可以分为不同的质量等级。不同质量的饲料原料，应该以不同的价格购买。 表2 根据养分含量对饲料原料（以豆粕为例）的细分表 养分含量（％）所有样品低等质量中等质量高等质量 N=490N=62N=348N=80 粗蛋白（均值）44.8741.6944.8147.58 变异系数4.70 4.632.723.51 赖氨酸（均值）2.7632.5612.7552.961 变异系数4.643.482.511.69 蛋＋胱（均值）1.2771.1891.2761.353 变异系数4.693.952.662.89 苏氨酸（均值）1.7321.6081.7291.840 变异系数6.15 4.35 2.89 3.26 注：N=样品数量 如果配合饲料厂以相同的价格购买所有质量级别的饲料原料，那么饲料厂将会为氨基酸含量较低的饲料原料支付过高的价格。因此，当供应商提供的饲料原料氨基酸含量较低时，饲料厂应该调低支付价格或拒绝接货。 3.2 提高配合饲料质量 NIRS技术还能充分保证配合饲料的质量。如果不能及时检测到的饲料原料的养分变异，即使机械设备和混和技术达到最佳，也会严重影响配合饲料的质量。原料氨基酸含量较大的变异，不可避免的需要增加配合饲料的安全系数，从而增加生产成本。在养殖业中，饲料养分的变异，会导致动物生产性能的降低和畜产品质量变异的增加，尤其是像胸肉率和瘦肉率这些敏感指标。畜产品质量的降低或不整齐，会导致其价格的降低。如果饲料原料到货时以及随后能经常性的检测其氨基酸含量，饲料厂则可以根据检测的结果，对配方进行及时调整，从而保证配合饲料的氨基酸含量。 4 NIRS技术推广中存在的问题与对策 NIRS 技术能够降低饲料生产成本，提高饲料产品质量，但是许多饲料厂没有购买NIRS 分析仪器，有些饲料厂虽然拥有自己的NIRS分析仪器，却没有能力建立可靠的氨基酸定标方程，在一定程度上限制了NIRS 技术的推广。针对以上情况，可以采用一些更为灵活的方法，使饲料厂能够在几乎不增加成本的基础上，获得NIRS技术服务。没有购买NIRS分析仪器的饲料厂，可以将采集的饲料原料样品邮寄到相应单位进行测定。而已经购买了NIRS分析仪器却没有能力建立定标方程的饲料厂则可以与建立了NIRS 饲料原料氨基酸含量定标方程的单位合作，获得定标方程的转移和人员的培训服务。定标方程转移的前提条件是软硬件之间的兼容性。另外，这些饲料厂也可以利用自己的NIRS分析仪对饲料原料进行扫描，然后将获得的NIRS光谱值，通过电子邮件传到拥有NIRS定标方程的单位，进行相应的数据处理，便可以获得饲料原料的氨基酸含量值。通过这些方法，饲料厂可以在几乎不增加成本的基础上，利用NIRS技术，在线检测饲料原料的氨基酸含量。通过在线检测饲料原料氨基酸含量，饲料厂可以更有效的监控原料质量和调整配方，生产出优质、低价的配合饲料产品。 综上所述，NIRS技术测定饲料原料氨基酸含量，具有快速、准确、成本低的特点。因此，饲料厂可以利用NIRS技术对主要的饲料原料氨基酸含量进行在线监测，调整配方和采购策略，降低生产成本，提高产品质量。