微生物克隆筛选系统

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[font='calibri'][size=13px]单克隆抗体的制备过程及原理是什么？[/size][/font][font='宋体'][size=13px]义翘神州是一家抗体试剂和定制抗体的领先供应商，目前已成功交付了数以万计的抗体项目，客户涵盖科研院校、生物制药公司、诊断公司和其他生物技术公司等。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]针对定制单克隆抗体，义翘神州提供了一套全面的解决方案。我们将与您通力合作，完成从抗原设计、纯化和抗体验证的完整过程。义翘神州拥有包括杂交瘤、噬菌体抗体库和单B细胞在内的抗体发现平台， 我们可根据您感兴趣的靶点、抗体应用和时间表等，来选择最合适的技术平台。 此外，义翘神州还提供ELISA、WB、流式细胞术、IHC、基于细胞的筛选、亲和力检测等多种表征和筛选技术，确保最终鉴定到最佳的抗体，以满足研究、诊断和治疗领域等应用。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]单克隆抗体的制备原理：[/size][/font][font='宋体'][size=13px]单克隆抗体(MAb)是针专一的抗原决定簇产生的抗体，单克隆技术又名杂交瘤技术起源于1975年，由G.K?hler和Milstein创立。主要原理是利用产生抗体的B细胞与肿瘤细胞杂交融合成杂交瘤细胞，生产抗体。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]单克隆抗体的制备过程：[/size][/font][font='宋体'][size=13px]1、免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的 过程。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]2、细胞融合 采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]3、选择性培养 选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化 在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。[/size][/font][font='宋体'][size=13px]5、单克隆抗体的大量制备 单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。[/size][/font][font='宋体'][size=13px][url=https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services][b]单克隆抗体定制服务[/b][/url]推荐：https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services[/size][/font]

经过抗体测定的阳性孔，可以扩大培养，进行克隆，以得到单个细胞的后代分泌单克隆抗体。克隆的时间一般说来越早越好。因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长，互相争夺营养和空间，而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。但克隆时间也不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。克隆化的阳性杂交瘤细胞，经过一段时期培养之后，也还会因为细胞突变或特定染色体的丢失，使部分细胞丧失产生抗体的能力，所以需要再次或多次克隆化培养。克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的免疫性强弱而决定。一般说，免疫性强的抗原克隆次数可少一些，但至少要3～5次克隆才能稳定。克隆化的方法很多，包括有限稀释法、显微操作法、软琼脂平板法及荧光激活分离法等。一、有限稀释法1．材料① 微量培养盘，盘内各孔于克隆化前一天培养小鼠腹腔细胞（即饲养细胞）每孔2万～4万。② HT培养基2．操作方法① 取出抗体阳性孔细胞，用HT培养液制成细胞悬液。并取样进行台盼兰染色，计数。② 用HT培养液将细胞稀释成200个/ml、40个/ml、20个/ml和的悬液。③ 用吸管将细胞悬液分别种入微量培养盘，每孔0.05ml，细胞含量分别为10个/孔、2个/孔、1个/孔和0.5个/孔。④ 5％CO2饱和湿度，37℃培养。⑤ 每天用倒置显微镜观察克隆生长情况，选择只有一个集落生长的孔，弃掉两个以上和没有细胞生长的孔。⑥ 克隆大量繁殖后，布满孔底的1/3～1/2时，测培养液抗体。⑦ 抗体阳性孔细胞，移到有饲养层的组织培养瓶中，并传2～4代就可以脱离饲养细胞，建成克隆株。二、软琼脂克隆化借助撒在软琼脂上单个细胞定位生长，而达到克隆化，具体操作如下：1．配2.5％的琼脂糖30ml，水浴溶化后，移入45℃水浴中。2．将117ml完全DMEM液和3ml 10倍浓度的DMEM液混合，置45℃水浴预热。3．将琼脂糖与DMEM液混合，即为含0.5％琼脂糖的完全DMEM液，并加75×108 脾细胞。4．每块平皿加10ml，于室温中凝固。5．DMEM中的细胞与DMEM―琼脂1:1混合，将细胞琼脂混合物2ml铺于凝固的平板上，使其全部覆盖。6．放入CO2箱饱和湿度，37℃培养10天。7．用PBS配制0.6％琼脂糖，于沸水浴溶解后，置45℃，在保温情况下取一试管，迅速加入0.1ml 25％羊红血球，0.2ml豚鼠补体，2.7ml 0.6％琼脂糖。8．用3ml琼脂糖―羊红血球混合液覆盖克隆。于37℃CO2箱孵育1h~2h。从克隆上部溶解羊红血球的溶血范围，可筛选抗羊红血球Ig。三、显微镜操作法在直径6cm培养皿中，加入1ml 1.0×108 细胞悬液放置5％CO2饱和湿度，37℃温箱中放置30min以上，倒置显微镜下，寻找那些与周围相距甚远的单个细胞，将毛细管口（一头有直角弯头毛细管，一头连接一尺长乳胶管，用口控制液体进入）水平置放于液面上，左右微动，直到看见管口，对准细胞，吸入毛细管，将管中细胞移到预先加有2.0×104~5.0×104 饲养细胞96孔板内，培养后，即可获得单个细胞形成的克隆。四、荧光激活分离法用一种荧光激活细胞分类器（Fluorescein Activafed Cell Sorter，FACS）。其基本原理是：将细胞经荧光抗体染色后，经喷嘴形成单个细胞的线形液滴，在莱塞光激发下，荧光素发射荧光，此信号由光电倍增管接收，再结合细胞形态大小产生光散射信号，经电脑处理，产生信号并与预定的信号对比，根据细胞荧光强度及细胞大小不同，将细胞分成不同级别，在电场中发生偏离，而分别收集于不同容器中。

[font=宋体][b]单克隆抗体技术的基本原理[/b][/font][font=宋体][font=宋体]单克隆抗体（[/font][font=Calibri]monoclonal antibody, mAb[/font][font=宋体]）是由单一[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。单克隆抗体在生物医学研究、疾病诊断和某些疾病治疗（如传染病和癌症）中是十分重要的工具。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]当前常见的[b][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-technology]单克隆抗体制备技术[/url][/b]主要有杂交瘤、噬菌体抗体库和单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞技术。其中，杂交瘤技术是将免疫小鼠的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选具有特异性抗体分泌功能的杂交瘤细胞，进而生产纯化获得单克隆抗体。噬菌体抗体库技术是利用基因工程技术将抗体的基因连接到噬菌体中，并以融合蛋白的形式展示在噬菌体的表面，通过与靶蛋白的结合，完成噬菌体展示抗体的筛选。单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞技术是根据每个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞只含有一对功能性的重链和轻链，每个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞只产生一种特异性抗体的特性，可以直接从单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞中扩增抗体基因获得单克隆抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]义翘神州拥有四大单克隆抗体开发平台，为客户提供多样化的抗体制备服务套餐，覆盖从抗原设计与制备、动物免疫到获得纯化抗体的完整流程，满足您的研究需求。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]一、杂交瘤技术制备单克隆抗体[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]杂交瘤技术是经典的单克隆抗体制备技术，具体流程为：[/font][font=宋体][font=Calibri]1) [/font][font=宋体]抗原制备；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）动物免疫；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]）筛选杂交瘤细胞获得分泌目标抗体的阳性单克隆杂交瘤细胞；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]）扩大培养阳性单克隆杂交瘤细胞；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]6[/font][font=宋体]）单克隆抗体大量制备。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州建立了杂交瘤开发技术平台，已成功开发了[/font][font=Calibri]19000[/font][font=宋体]株以上杂交瘤阳性克隆，可以根据客户的最终应用需求，制定个性化的抗原设计、动物免疫、克隆筛选及抗体鉴定方案，生产高质量的单克隆抗体，满足客户的不同需求。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]二、噬菌体抗体库技术制备单克隆抗体[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]噬菌体抗体库技术也是一种制备单克隆抗体的方法。通常首先是从外周血或脾、淋巴结等组织中分离[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞，提取[/font][font=Calibri]mRNA[/font][font=宋体]并反转录为[/font][font=Calibri]cDNA[/font][font=宋体]，以扩增所有的[/font][font=Calibri]VH[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]VL[/font][font=宋体]片段。然后构建[/font][font=Calibri]Fab[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]scFv[/font][font=宋体]等形式的抗体组合文库，使外源抗体基因表达的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体外壳蛋白[/font][font=Calibri]pIII[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]pVIII[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]端。 最后，经过“吸附[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]洗涤[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]扩增”过程筛选并富集特异性抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]噬菌体抗体库开发平台包括噬菌体展示抗体库构建、淘洗、单克隆鉴定和阳性克隆重组表达等步骤，义翘神州能为客户提供个性化的抗体定制服务，包括鼠源单克隆抗体、兔源单克隆抗体、鸡源单克隆抗体和全人源抗体等多个种属的抗体发现服务。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]三、单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体技术制备单克隆抗体[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体技术是独立于杂交瘤技术和噬菌体展示技术的、新一代的单克隆抗体开发技术。其技术流程是从免疫动物组织或外周血中分离抗原特异性[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞，通过单细胞[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]技术从单个抗体分泌[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞中扩增[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]重链和轻链可变区基因，然后在哺乳动物细胞内表达获得具有生物活性的单克隆抗体。该技术保留了轻重链可变区天然配对，具有基因多样性好、效率高和所需细胞数量少的优点。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州拥有流式单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞和[/font][font=Calibri]Beacon[/font][font=宋体]单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞两大技术平台，可提供一站式的单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体制备服务，包括从免疫原制备到单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞分选、鉴定、及抗体生产等步骤。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]文章来源：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-technology[/font][/font]

[font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-technology][b]单克隆抗体技术[/b][/url]的基本原理是利用单一的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆培养出具有高度一致性的抗体组织。通过将能产生特定抗体的单一[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞与骨髓肿瘤细胞进行融合，生成一种既能产生所需抗体，又能无限增殖的杂交瘤细胞。这种技术所得到的抗体仅来自一种类型的细胞，这与多克隆抗体或由多种类型细胞产生的多株抗体形成了鲜明对比。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]当前常见的单克隆抗体制备技术主要有杂交瘤、噬菌体抗体库和单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞技术。其中，杂交瘤技术是将免疫小鼠的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选具有特异性抗体分泌功能的杂交瘤细胞，进而生产纯化获得单克隆抗体。噬菌体抗体库技术是利用基因工程技术将抗体的基因连接到噬菌体中，并以融合蛋白的形式展示在噬菌体的表面，通过与靶蛋白的结合，完成噬菌体展示抗体的筛选。单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞技术是根据每个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞只含有一对功能性的重链和轻链，每个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞只产生一种特异性抗体的特性，可以直接从单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞中扩增抗体基因获得单克隆抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]单克隆抗体技术流程[/b][/font][font=宋体]①杂交瘤技术制备单克隆抗体[/font][font=宋体]杂交瘤技术是经典的单克隆抗体制备技术，具体流程为：[/font][font=宋体][font=Calibri]1) [/font][font=宋体]抗原制备；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）动物免疫；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]）筛选杂交瘤细胞获得分泌目标抗体的阳性单克隆杂交瘤细胞；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]）扩大培养阳性单克隆杂交瘤细胞；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]6[/font][font=宋体]）单克隆抗体大量制备。（点击了解杂交瘤技术的操作步骤）[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州建立了杂交瘤开发技术平台，已成功开发了[/font][font=Calibri]19000[/font][font=宋体]株以上杂交瘤阳性克隆，可以根据客户的最终应用需求，制定个性化的抗原设计、动物免疫、克隆筛选及抗体鉴定方案，生产高质量的单克隆抗体，满足客户的不同需求。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]②噬菌体抗体库技术制备单克隆抗体[/b][/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/phage-display-antibody][b]噬菌体抗体库技术[/b][/url]也是一种制备单克隆抗体的方法。通常首先是从外周血或脾、淋巴结等组织中分离[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞，提取[/font][font=Calibri]mRNA[/font][font=宋体]并反转录为[/font][font=Calibri]cDNA[/font][font=宋体]，以扩增所有的[/font][font=Calibri]VH[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]VL[/font][font=宋体]片段。然后构建[/font][font=Calibri]Fab[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]scFv[/font][font=宋体]等形式的抗体组合文库，使外源抗体基因表达的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体外壳蛋白[/font][font=Calibri]pIII[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]pVIII[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]端。 最后，经过“吸附[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]洗涤[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]扩增”过程筛选并富集特异性抗体。（点击了解噬菌体抗体库技术的操作步骤）[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]噬菌体抗体库开发平台包括噬菌体展示抗体库构建、淘洗、单克隆鉴定和阳性克隆重组表达等步骤，义翘神州能为客户提供个性化的抗体定制服务，包括鼠源单克隆抗体、兔源单克隆抗体、鸡源单克隆抗体和全人源抗体等多个种属的抗体发现服务。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]③单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体技术制备单克隆抗体[/font][/b][/font][font=宋体][font=宋体]单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体技术是独立于杂交瘤技术和噬菌体展示技术的、新一代的单克隆抗体开发技术。其技术流程是从免疫动物组织或外周血中分离抗原特异性[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞，通过单细胞[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]技术从单个抗体分泌[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞中扩增[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]重链和轻链可变区基因，然后在哺乳动物细胞内表达获得具有生物活性的单克隆抗体。该技术保留了轻重链可变区天然配对，具有基因多样性好、效率高和所需细胞数量少的优点。（点击了解单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞技术的操作步骤）[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州拥有流式单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞和[/font][font=Calibri]Beacon[/font][font=宋体]单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞两大技术平台，可提供一站式的单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体制备服务，包括从免疫原制备到单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞分选、鉴定、及抗体生产等步骤。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]详情可以关注[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-technology[/font][/font][font=Calibri] [/font]

[font=宋体]本文主要介绍了单克隆抗体与多克隆抗体的定义，并介绍单抗、多抗在制备流程、特点及应用上的区别。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]单抗与多抗的定义：[/b][/font][font=宋体][font=宋体]抗原上可以引起机体产生抗体的分子结构叫做抗原决定簇，也称为抗原表位。一个抗原可以有许多不同的抗原决定簇，因此，机体也可以产生多种不同的抗体。由单一[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆产生的高度均一、仅识别某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体（单抗）。而由多个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞克隆产生的，受到多种抗原决定簇刺激并可以与多种抗原表位结合的抗体就是多克隆抗体（多抗）。从某种角度而言，多抗是多种单抗的混合物。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]单抗和多抗制备上的区别：[/b][/font][font=宋体][font=宋体]经过特定抗原处理过的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞与骨髓瘤细胞通过细胞融合的方法得到杂交瘤细胞，经[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基筛选、[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]检测效价后就得到阳性克隆株，最后进行细胞培养或将细胞注入到动物（一般为[/font][font=Calibri]balb/c[/font][font=宋体]小鼠）腹腔中用腹水培养，收集上清[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]腹水纯化后就能得到单克隆抗体。而制备多克隆抗体就没有单克隆抗体繁琐，只需将抗原（纯度越高越好）直接注入到动物体内进行免疫，经过[/font][font=Calibri]3~4[/font][font=宋体]次免疫，[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]测其效价合格后，收集血液离心得到上清，纯化后即能得到多克隆抗体。因此多抗制备周期比单抗的短，多抗首次制备价格也比单抗要低。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]单抗多抗应用上的区别：[/b][/font][font=宋体][font=宋体]单抗和多抗都有各自鲜明的特点与优势。单克隆抗体的特异性高，一旦制备成功就可以永续的生产完全一致的单克隆抗体，因此可以对其特异性进行全面、系统地验证。但如果所识别的抗原表位被破坏，实验的结果将会受到很大的影响，这也是单抗的缺点之一。而多克隆抗体的特异性较差，即使是使用相同的抗原制备多抗，不同批次间也会存在差异，因而在特异性、一致性方面有很大的局限。所以在用多抗做免疫检测时，更容易造成背景，例如在[/font][font=Calibri]WB[/font][font=宋体]中有杂带，在[/font][font=Calibri]IHC[/font][font=宋体]中背景较深等等。虽然还存在着交叉反应[/font][font=Calibri]*[/font][font=宋体]的问题，但由于多抗识别多个抗原表位，即使是有少数几个抗原表位被破坏或者抗原构象改变，实验的结果也不会受到影响。在相同条件下，使用多抗可以提高检测的灵敏度，对于丰度偏低的蛋白也更容易检出。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]如果对抗体的特异性要求高，用量较大或需要长期使用一致的抗体，制备的抗体应用要求多（[/font][font=Calibri]WB/IP/IF/ICC[/font][font=宋体]等[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]，可以选择制备单克隆抗体。若对抗体的特异性要求不高，需要做沉淀和凝集反应的检测性实验或者只需做[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]检测，可以选择制备多克隆抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州是一家抗体试剂和定制抗体的领先供应商，目前已成功交付了数以万计的抗体项目，客户涵盖科研院校、生物制药公司、诊断公司和其他生物技术公司等。目前提供单克隆抗体定制服务和多克隆抗体定制服务。想了解更多关于单抗和多抗区别详情可以查看：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services[/font][/font][font=宋体][font=宋体]多克隆抗体定制服务：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/polyclonal-antibody-production-services[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]单克隆抗体制备：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-production[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=Calibri] [/font]

[font=宋体]单克隆抗体第一次筛选是制备过程中的关键步骤，涉及抗原特异性、抗体分泌量和细胞生长特性等多方面评估。通过精细操作和科学流程，确保筛选出特性优良的杂交瘤细胞株，为后续研究与应用奠定坚实基础。下面一起来看下[b]单克隆抗体第一次筛选的方法[/b]：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]第一次筛选[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]首先，在已免疫过的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞（即效应[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞）和骨髓瘤细胞进行杂交时，可能出现的情况应该先弄清楚。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]如果只考虑两两融合，可能的情况有：（效应）[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞和（效应）[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞的融合；（效应）[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合（即杂交瘤细胞）；骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞的融合（即瘤瘤细胞）。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]第一类细胞在体外培养的条件下，因为无法无限增殖，最终死亡，因此，筛选的关键是限制第二类细胞的增殖。科学家在设计实验时，已经考虑到这方面问题，所以他们选择的瘤细胞是有遗传缺陷的，即胸腺嘧啶核苷激酶缺陷（[/font][font=Calibri]TK[/font][font=宋体]－）或者次黄嘌呤磷酸核苷转移酶（[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]－）缺陷。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]筛选的目的：获得杂交瘤细胞。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]筛选的方法：[/font] [font=宋体]用选择性培养基来完成，即[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基。[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]加入次黄嘌呤（[/font][font=Calibri]H[/font][font=宋体]）、氨基喋呤（[/font][font=Calibri]A[/font][font=宋体]）及胸腺嘧啶核苷（[/font][font=Calibri]T[/font][font=宋体]）的培养基称[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]其中，氨基喋呤可阻断[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成的主要途径。主要途径阻断后，依靠应急途径即在[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）和[/font][font=Calibri]TK[/font][font=宋体]（胸苷激酶）作用下，利用胸腺嘧啶和次黄嘌呤合成[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]，缺少其中一种，[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成不能发生。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]用于杂交的骨髓瘤细胞系均由经有毒药物诱导而成选择产生的代谢缺陷型细胞，细胞内均无[/font][font=Calibri]TK[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]，所以单个或融合骨髓瘤细胞在[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养液中将死亡。[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞虽然有[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]TK[/font][font=宋体]，但在体外通常培养条件下，尤其是在单个细胞环境下难于长期存活和增殖传代。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]因此，只有杂交瘤细胞才能在[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养液中生长繁殖。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]即[/font][font=Calibri]:[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①淋巴细胞：不能生长，[/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]到[/font][font=Calibri]7[/font][font=宋体]天死亡；[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的主要合成途径被[/font][font=Calibri]A[/font][font=宋体]阻断。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]②骨髓瘤细胞：不能生长，[/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]到[/font][font=Calibri]7[/font][font=宋体]天死亡；[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]缺乏，[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成的旁路途经受阻。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]③骨髓瘤细胞和脾细胞融合形成杂交瘤细胞，可长期生长繁殖。利用淋巴细胞的[/font][font=Calibri]HGRT[/font][font=宋体]将[/font][font=Calibri]H[/font][font=宋体]合成为嘌呤碱并最终与[/font][font=Calibri]T[/font][font=宋体]一起合成[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息，从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]由于通过以上方法选择出杂交瘤细胞，虽然都是杂交瘤细胞，但可能是同一抗原的不同抗原决定簇刺激产生的。所以产生抗体是不纯的。如果不进一步提纯，这样得到的是多克隆抗体，所以，需要第二次筛选。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-culture-antibody-production-service][b]杂交瘤细胞培养及抗体生产服务[/b][/url]，可采用低血清或无血清培养基进行高密度体外培养，降低牛[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]污染，是国内外客户优选的杂交瘤细胞生产抗体方案。详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-culture-antibody-production-service[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

[font=宋体][font=宋体]抗体具备与特定抗原结合的独特能力，在生物学、医学及生物医学研究中发挥着举足轻重的作用。[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-production][b]单克隆抗体（[/b][/url][/font][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-production][b][font=Calibri]MAbs[/font][font=宋体]）[/font][/b][/url][/font][font=宋体]和[/font][font=宋体][font=宋体]多克隆抗体（[/font][font=Calibri]PAbs[/font][font=宋体]）已成为免疫学研究、诊断及疫苗质量控制中不可或缺的工具。本文将[/font][/font][font=宋体]简单介绍[/font][font=宋体]这两种抗体生产[/font][font=宋体]的[/font][font=宋体]关键步骤及其优化策略。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]一、多克隆抗体的生产与应用[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]多克隆抗体的制备涉及抗原制备、动物选择、佐剂配置[/font][font=宋体]和[/font][font=宋体]注射方案等多个环节。在抗原制备时，应确保其质量与数量，以保证免疫反应的特异性。动物种类的选择则需考虑所需抗体量[/font][font=宋体]和[/font][font=宋体]血液样本获取的难易程度等因素。注射方案应根据动物种类和佐剂特性制定，并在注射后密切监测动物的反应，确保免疫过程的顺利进行。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]多克隆抗体因其制备周期短、成本相对较低，广泛应用于[/font][font=宋体]基础[/font][font=宋体][font=宋体]研究。然而，由于其来源于多种[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆，特异性相对较低，因此在某些需要高度特异性的应用场景中，其应用受到一定限制。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]二、单克隆抗体的生产与应用[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]单克隆抗体则是由单一[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆产生的，具有高度特异性。[/font][/font][font=宋体]通过杂交瘤技术制备小鼠单克隆抗体的[/font][font=宋体][font=宋体]生产过程涉及[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞的生成、与骨髓瘤细胞的融合、杂交瘤细胞的克隆与选择以及抗体的扩大生产等步骤。其中，[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞的生成和通过腹水诱导法生产抗体是基于实验动物的关键[/font][/font][font=宋体]步骤[/font][font=宋体]。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]单克隆抗体因其高度的特异性和可重复性，广泛应用[/font][font=宋体]于[/font][font=宋体]基础研究、诊断[/font][font=宋体]检测[/font][font=宋体]和医疗领域。例如，在疾病诊断中，单克隆抗体可以精确地识别并定位病原体，为疾病的早期发现和治疗提供有力支持。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]为优化免疫反应，建议在抗原制备时[/font][font=宋体]确保[/font][font=宋体]其质量与纯度，注射前进行充分的质量控制。在选择动物种类时，应综合考虑抗体需求量、血液样本获取的难易程度以及抗原与动物间的系统发育关系。此外，佐剂的选择和制备也至关重要，需确保混合物的稳定性和质量，谨慎选择注射途径和注射量。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]多克隆抗体与单克隆抗体各具特色，分别适用于不同的研究场景。通过优化生产过程中的各个环节，我们可以提高抗体的质量和产量，为生物医学研究和临床应用提供更加精准、有效的工具。未来，随着技术的不断进步，这两种抗体将在更多领域展现其独特的价值。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]本篇文章由义翘神州进行整理，同时提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services]单克隆定制服务[/url]和[url=https://cn.sinobiological.com/services/polyclonal-antibody-production-services]多克隆抗体制备服务[/url]，详情可点击了解！[/b]参考文献：[/font][font='Segoe UI'][color=#212121]Leenaars M, Hendriksen CF. Critical steps in the production of polyclonal and monoclonal antibodies: evaluation and recommendations.[/color][/font][font='Segoe UI'][color=#212121] [/color][/font][i][font='Segoe UI'][color=#212121]ILAR J[/color][/font][/i][font='Segoe UI'][color=#212121]. 2005 46(3):269-279. doi:10.1093/ilar.46.3.269[/color][/font][font=Calibri] [/font]

[font=宋体]在生物医药领域，抗体作为一类重要的生物分子，被广泛应用于疾病诊断、治疗以及基础研究中。其中，单克隆抗体和单链抗体是两种常见的抗体类型，尽管它们都是从杂交瘤或基因工程方法中获得，但在结构、功能和制备方法等方面存在显著差异。本文将对单克隆抗体和单链抗体的区别进行深入解析。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]一、结构差异[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/mab-development][b]单克隆抗体[/b][/url]是由一个单一的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆产生，具有高度的均一性和特异性。其结构包括重链和轻链，通过二硫键连接在一起，形成一个完整的抗体分子。而单链抗体则是由一段柔性连接肽把抗体重链可变区（[/font][font=Calibri]V~H[/font][font=宋体]）和轻链可变区（[/font][font=Calibri]V~L[/font][font=宋体]）连接而成，是具有亲代抗体全部抗原结合位点的最小功能结构单位。单链抗体的结构相对简单，没有重链和轻链的连接，分子量也较小。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]二、功能差异[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]单克隆抗体具有高度的特异性，可以用于疾病的诊断和治疗。由于其结构均一，单克隆抗体的生产和质量控制相对容易，因此在临床应用中具有较高的可靠性。而单链抗体则具有特异的抗原结合活性，能够较好地保持亲本抗体的抗原亲和活性，同时分子量小、结构简单，更适于抗体结构与功能的分析。此外，单链抗体还具有较好的组织穿透能力和低免疫原性等优点，使其在药物研发以及导向治疗等方面具有广泛的应用前景。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]三、制备方法差异[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]单克隆抗体的制备通常采用[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology][b]杂交瘤技术[/b][/url]，将能够产生特异性抗体的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，再通过筛选和克隆化培养获得能够稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞系。这种方法需要经过多次筛选和克隆化培养，制备过程相对复杂。而单链抗体的制备则多采用基因工程方法，通过设计和构建基因表达载体，在体外表达单链抗体基因，然后进行分离和纯化得到单链抗体。这种方法相对简单快捷，但需要设计和构建基因表达载体，对技术要求较高。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]综上所述，单克隆抗体和[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/scfv-antibody-production][b]单链抗体[/b][/url]在结构、功能和制备方法等方面存在显著差异。在实际应用中，应根据具体需求选择合适的抗体类型。单克隆抗体具有高度的特异性和可靠性，适用于疾病的诊断和治疗；而单链抗体则具有特异的抗原结合活性、分子量小、结构简单等特点，适用于抗体结构与功能的分析、药物研发以及导向治疗等领域。随着生物技术的不断发展，相信单克隆抗体和单链抗体的应用前景将更加广阔。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services][b]单克隆抗体制备服务[/b][/url]和[url=https://cn.sinobiological.com/services/fab-scfv-antibody-production-service][b]抗体片段生产服务[/b][/url]，同时拥有一整套的抗体开发解决方案，包括免疫原制备、动物免疫、[/font][font=Calibri]scFv[/font][font=宋体]抗体库构建和筛选等步骤。此外，我们在[/font][font=Calibri]scFv[/font][font=宋体]抗体表达纯化方面具有丰富的经验，已成功为客户表达[/font][font=Calibri]di-scFvs[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]tri-scFvs[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]BiTE[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]Diabody[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]scFv-(H)IgG[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]scFv-(L)IgG[/font][font=宋体]等多种[/font][font=Calibri]scFv[/font][font=宋体]形式。详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/fab-scfv-antibody-production-service[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

pET系统是有史以来在 E.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=113071]pET系统[/url]

近日，新型食品及其加工咨询委员会（ACNFP）在一次公开会议上，评价了由克隆牛及其后代加工成的肉乳制品的安全性，并在《新型食品法规》基础上决定是否批准克隆肉乳制品。 新型食品及其加工咨询委员会（ACNFP）指出： 克隆肉乳制品同普通的肉乳制品在成分上是一致的，因此克隆肉乳制品不可能导致食品安全风险。 有关肉乳制品在成分上的证据较为有限，进一步表明肉乳产品受动物喂养环境的影响证据是必需的。 消费者可能希望由克隆动物及其后代加工成的产品具有明确的标识。 针对以上观点，食品标准局首席科学家安德鲁。维奇（Andrew Wadge）表示，由克隆牛及其后代加工成的肉乳制品同普通的肉乳制品没有本质的区别，因此克隆肉乳产品不可能导致食品安全风险。 食品标准局委员会将在12月的会议继续讨论克隆肉乳制品的安全性，该委员会将认真考虑ACNFP的观点、欧洲委员会对克隆肉乳产品的禁令以及其它的意见，最终将其建议提供给部长。

[b]什么是克隆食品？[/b]　　克隆是英文clone的音译，简单讲就是一种人工诱导的无性繁殖方式。 　科学家把人工遗传操作动物繁殖的过程叫克隆，这门生物技术叫克隆技术。克隆食品，简单地说，就是指克隆动物生产的肉和奶。 美国食品和药物管理局(FDA)于2008年宣布，经过克隆的牛、猪和山羊以及它们的后代均可以安全食用，克隆牛产的奶也可安全食用。 FDA称，科学家就克隆技术安全性问题在全球各地进行了数十次相关研究，研究结果显示，从生物角度来说，以上克隆动物以及它们的后代与按传统方式繁殖的同类没有什么不同，它们的肉和人们今天食用的肉也没什么两样。 据报道，随着美国批准克隆动物的奶制品和肉制品上市销售，我国在未来也许会允许克隆食品的销售。

[size=3] 英国食品标准署8月4日发布公告说，发现有两头克隆公牛的肉制品已流入市场，另有两头克隆母牛所产的牛奶是否流入市场尚不确定。这起克隆动物食品“溜”上餐桌的事件再次引发了公众对克隆动物食品的安全、管理等问题的关注和争议。克隆动物食品（以及转基因食品）能不能放心食用？21世纪的人们究竟该怎样看待克隆（转基因）动物食品？它会给我们带来什么？本期科技文摘约请专家试图就这些热门话题作出回答，敬请读者关注。 争议： “牛奶等来自健康克隆动物的食品目前看来是安全的，但必须按规定获准才能上市。”——英国食品标准署 “克隆动物食品中所含的维生素、脂肪、蛋白质、氨基酸等含量与普通动物食品无异，经克隆食品喂养长大的实验鼠也没有出现不良反应。” ——美国FDA “现有克隆技术效率低下，会对动物造成不必要的痛苦。”——英国防止虐待动物协会 “还没有令人信服的论据证实克隆动物食品的安全性。”——欧盟下属科学与新技术伦理欧洲小组 克隆的意义，表面上是用不同于两性结合繁衍后代的方式创造生命，但更重要的是要利用克隆动物获得新的生物产品，包括肉类、乳品和蛋，这些食物就可以统称为克隆动物食品 [/size]

[font=宋体][font=宋体]单克隆抗体（[/font][font=Calibri]Monoclonal antibodies[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]mAb[/font][font=宋体]）是由[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞产生，并能特异性靶向抗原的免疫球蛋白。单克隆抗体不仅是生物化学、分子生物学和医学研究中必不可少的工具，其在临床治疗上的应用也以革命性的速度改进了多种疑难杂症的治疗方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1975[/font][font=宋体]年[/font][font=Calibri]Khler[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]Milstein[/font][font=宋体]提出的杂交瘤技术（[/font][font=Calibri]Hybridoma technology[/font][font=宋体]），使得大量获得单克隆抗体成为可能，为基础研究及其临床应用提供了无限潜力。其他科学和技术进步也促进了单克隆抗体的发展、丰富了单克隆抗体的制备方法。 经过近[/font][font=Calibri]50[/font][font=宋体]年的发展，单克隆抗体制备方法不再局限于免疫小鼠的淋巴细胞术，噬菌体展示技术（[/font][font=Calibri]Phage display[/font][font=宋体]）、人源抗体转基因小鼠（[/font][font=Calibri]Human antibody-producing mice[/font][font=宋体]）和单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体技术（[/font][font=Calibri]Single B cell antibody technology[/font][font=宋体]）也都陆续登上舞台。这些方法虽然有各自的局限性，但都已广泛应用于单克隆抗体筛选。同时，这些技术都不完全是独立存在的，如果能充分利用各技术的优点，采用灵活的方法将各技术优化组合就能更加高效、快速地进行抗体开发。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]一、杂交瘤技术[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]杂交瘤技术是一种将[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞与骨髓瘤细胞融合生产小鼠单克隆抗体的传统方法，是目前应用最广泛的单克隆生产技术。在这种技术中，首先收集免疫小鼠的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞，并将其与[/font][font=Calibri]BALB/c[/font][font=宋体]小鼠骨髓瘤细胞融合，从而形成永生化的杂交瘤细胞。然后筛选杂交瘤细胞，鉴定出能生产特异性抗体的单克隆细胞株。十几年后，[/font][font=Calibri]1988[/font][font=宋体]年，兔单克隆抗体制备方法首次被《[/font][font=Calibri]Science[/font][font=宋体]》杂志报道 [/font][font=Calibri][1][/font][font=宋体]。该研究使用小鼠[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]兔异种杂交瘤方法生产兔单克隆抗体，但鼠[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]兔异种杂交瘤细胞分泌抗体的效率较低、不稳定，且无法长时间分泌抗体。时间进展到[/font][font=Calibri]90[/font][font=宋体]年代中期，[/font][font=Calibri]1995[/font][font=宋体]年，《[/font][font=Calibri]PNAS[/font][font=宋体]》报道了能稳定生产兔单抗的兔[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]兔杂交瘤细胞。但兔杂交瘤细胞也被证明不如常规鼠杂交瘤细胞稳定，这大大阻碍了其实验室水平的广泛使用。并且，由于融合和转化效率低下，使用兔杂交瘤细胞生产单克隆抗体在应用推广中受到了极大的限制。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]经过多年发展及应用，杂交瘤技术作为一种成熟的产生鼠单克隆抗体的方法已被广泛应用于多种抗体的生产。然而，由于缺乏合适的骨髓瘤融合伴侣，杂交瘤技术一直局限于免疫啮齿动物。[/font][font=Calibri]20[/font][font=宋体]世纪[/font][font=Calibri]80[/font][font=宋体]年代，《[/font][font=Calibri]PNAS[/font][font=宋体]》报道了一种应用人杂交瘤技术生产治疗用抗体的文章 [/font][font=Calibri][3][/font][font=宋体]。利用该方法可以在无额外修饰的情况下产生天然的人源抗体，并用于临床治疗。随着融合伴侣和电融合技术的发展，人杂交瘤细胞融合成功率逐步增加，这将在未来促进治疗性抗体的开发。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]二、噬菌体展示技术[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1990[/font][font=宋体]年开始，噬菌体展示技术被视为一种新的产生单克隆抗体的方法。这种方法是从淋巴细胞中收获抗体可变区基因（[/font][font=Calibri]V gene[/font][font=宋体]）全集，克隆[/font][font=Calibri]VHs[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]VLs[/font][font=宋体]的组合并与外壳蛋白融合后表达于丝状噬菌体表面，然后筛选表达特异性抗体的噬菌体。与受限于啮齿动物的杂交瘤技术相比，噬菌体展示技术已经成功用于任何已知免疫球蛋白基因的物种中筛选和分离单克隆抗体。[/font][font=Calibri]2000[/font][font=宋体]年，[/font][font=Calibri]Rader[/font][font=宋体]等人首次介绍了应用噬菌体展示技术生产兔单克隆抗体的全过程。在这篇文章中，[/font][font=Calibri]Rader[/font][font=宋体]等人用噬菌体展示技术筛选和人源化的人[/font][font=Calibri]A33[/font][font=宋体]兔抗体，不仅对人[/font][font=Calibri]A33[/font][font=宋体]抗原有高特异性，且保留高亲和力。目前，噬菌体展示技术因为其高效、简便及体外控制在原核或真核系统中原则参数的能力正逐步成为生产治疗用抗体的重要技术平台。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]随着我们对抗体结构、功能和序列多样性研究的不断深入，除了原有的抗体库外，一种新的合成抗体库技术也在不断发展。例如，[/font][font=Calibri]HuCAL&Ylanthia[/font][font=宋体]文库中，为了使筛选出的人源抗体能更好的进行分子识别，将精确设计的序列插入抗原结合位点，并优化设计多种可变重链、轻链框架区域 [/font][font=Calibri][7-10][/font][font=宋体]。随着文库设计和筛选方法的不断进步，合成抗体文库将成为快速生产具有高特异性和高亲和力单克隆抗体不可或缺的工具。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]三、人源抗体转基因小鼠[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1985[/font][font=宋体]年，[/font][font=Calibri]Alt[/font][font=宋体]等人首次提出将人抗体基因引入小鼠种系并使用转基因小鼠中产生人抗体的想法 [/font][font=Calibri][11,12][/font][font=宋体]。随着基因编辑技术的进步，使用人源抗体转基因小鼠生产人源化抗体已不再是天方夜谭。与其他技术相比，使用人源抗体转基因小鼠有许多优势，如无需人源化、具有更多的生物多样性，且由于体内成熟具有天然的亲和力。但是，人免疫球蛋白体量庞大对转基因小鼠抗体生产是一个巨大的挑战。为了克服这些困难，研究人员们通过使用不同策略已成功地获得转基因动物表达的人源抗体库，如全人源抗体小鼠和嵌合人源抗体小鼠等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]四、单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体技术[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]虽然杂交瘤技术和噬菌体展示技术已经在单克隆抗体生产中广泛应用，但它们依然存在较难克服的缺点制约着抗体生产过程。近些年，为了克服杂交瘤技术细胞融合效率低，噬菌体展示技术导致重链、轻链的天然同源配对丢失等问题，单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体技术正被逐步开发和应用。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]简单来说，单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体技术包含以下几个步骤：[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]a.[/font][font=宋体]从外周血或免疫器官中初步提取淋巴细胞；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]b.[/font][font=宋体]使用磁性活化细胞分选（[/font][font=Calibri]MACS[/font][font=宋体]）或荧光活化细胞分选（[/font][font=Calibri]FACS[/font][font=宋体]）技术鉴定和分离出特定的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]c.[/font][font=宋体]将分离出的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞进行单细胞培养；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]d.[/font][font=宋体]使用逆转录聚合酶链式反应（[/font][font=Calibri]RT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]）和抗体特异性引物鉴定单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞分泌抗体的特异性；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]e.[/font][font=宋体]扩增特异抗体基因；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]f.[/font][font=宋体]将抗体基因克隆到表达载体中，并在细菌或细胞系统中表达；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]g.[/font][font=宋体]纯化表达产生的抗体，并用[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]等方法进行评估。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体技术现在已广泛用于人和小鼠单克隆抗体生产，如一些治疗性中和单抗，可用于治疗多种疾病，包括癌症、自身免疫性疾病和传染性疾病亡[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]总结[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]种方式制备单克隆抗体的优缺点[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology][b]杂交瘤技术[/b][/url]：[/font][font=宋体]优势：技术成熟、研发成本低[/font][font=宋体]劣势：周期长、融合率低、需要进行人源化[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]人源抗体转基因小鼠：[/font][font=宋体]优势：[/font][font=宋体]①可用杂交瘤技术获得人源抗体[/font][font=宋体]②良好的免疫原性[/font][font=宋体]③亲和力高[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]劣势：[/font][font=宋体]①存在免疫耐受[/font][font=宋体]②依然有鼠抗产生[/font][font=宋体]③难以免疫毒性抗原[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/phage-display-antibody][b]噬菌体展示技术[/b][/url]：[/font][font=宋体]优势：[/font][font=宋体]①基因来源灵活[/font][font=宋体]②随机库可以避免免疫耐受[/font][font=宋体]③可以灵活，特异得调整设计方案[/font][font=宋体]④可长时间保存[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]劣势：[/font][font=宋体]①重链轻链非天然配对[/font][font=宋体]②展示效率具有偏好性[/font][font=宋体]③需要再次进行功能验证[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体技术：[/font][/font][font=宋体]优势：[/font][font=宋体]①无需杂交瘤融合[/font][font=宋体]②制备周期短[/font][font=宋体]③重链、轻链天然配对[/font][font=宋体]④无需合成基因[/font][font=宋体]⑤可直接获得各物种抗体[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]劣势：[/font][font=宋体]①需要新鲜样本[/font][font=宋体]②抗原特异性细胞比例低[/font][font=宋体]③操作环境要求严格[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]目前义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services][b]单克隆抗体制备服务[/b][/url]，同时拥有流式单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞分选平台、噬菌体抗体库技术平台、杂交瘤开发平台…… 可供大家选择，有需求或者了解具体详情可以查看[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services[/font][/font][font=Calibri] [/font]

[font=宋体][font=宋体][b]单克隆抗体技术的基本原理[/b][/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]单克隆抗体（[/font][font=Calibri]monoclonal antibody, mAb[/font][font=宋体]）是由单一[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。单克隆抗体在生物医学研究、疾病诊断和某些疾病治疗（如传染病和癌症）中是十分重要的工具。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]当前常见的单克隆抗体制备技术主要有杂交瘤、噬菌体抗体库和单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞技术。其中，杂交瘤技术是将免疫小鼠的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选具有特异性抗体分泌功能的杂交瘤细胞，进而生产纯化获得单克隆抗体。噬菌体抗体库技术是利用基因工程技术将抗体的基因连接到噬菌体中，并以融合蛋白的形式展示在噬菌体的表面，通过与靶蛋白的结合，完成噬菌体展示抗体的筛选。单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞技术是根据每个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞只含有一对功能性的重链和轻链，每个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞只产生一种特异性抗体的特性，可以直接从单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞中扩增抗体基因获得单克隆抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体][b]单克隆抗体技术流程[/b][/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]一、杂交瘤技术制备单克隆抗体[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology][b]杂交瘤技术[/b][/url]是经典的单克隆抗体制备技术，具体流程为：[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]1) [/font][font=宋体]抗原制备；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）动物免疫；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]）筛选杂交瘤细胞获得分泌目标抗体的阳性单克隆杂交瘤细胞；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]）扩大培养阳性单克隆杂交瘤细胞；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]6[/font][font=宋体]）单克隆抗体大量制备。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州建立了杂交瘤开发技术平台，已成功开发了[/font][font=Calibri]19000[/font][font=宋体]株以上杂交瘤阳性克隆，可以根据客户的最终应用需求，制定个性化的抗原设计、动物免疫、克隆筛选及抗体鉴定方案，生产高质量的单克隆抗体，满足客户的不同需求。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]二、噬菌体抗体库技术制备单克隆抗体[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]噬菌体抗体库技术也是一种制备单克隆抗体的方法。通常首先是从外周血或脾、淋巴结等组织中分离[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞，提取[/font][font=Calibri]mRNA[/font][font=宋体]并反转录为[/font][font=Calibri]cDNA[/font][font=宋体]，以扩增所有的[/font][font=Calibri]VH[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]VL[/font][font=宋体]片段。然后构建[/font][font=Calibri]Fab[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]scFv[/font][font=宋体]等形式的抗体组合文库，使外源抗体基因表达的多肽以融合蛋白的形式展示在噬菌体外壳蛋白[/font][font=Calibri]pIII[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]pVIII[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]端。 最后，经过“吸附[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]洗涤[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]扩增”过程筛选并富集特异性抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]噬菌体抗体库开发平台包括噬菌体展示抗体库构建、淘洗、单克隆鉴定和阳性克隆重组表达等步骤，义翘神州能为客户提供个性化的抗体定制服务，包括鼠源单克隆抗体、兔源单克隆抗体、鸡源单克隆抗体和全人源抗体等多个种属的抗体发现服务。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]三、单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体技术制备单克隆抗体[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体技术是独立于杂交瘤技术和噬菌体展示技术的、新一代的单克隆抗体开发技术。其技术流程是从免疫动物组织或外周血中分离抗原特异性[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞，通过单细胞[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]技术从单个抗体分泌[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞中扩增[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]重链和轻链可变区基因，然后在哺乳动物细胞内表达获得具有生物活性的单克隆抗体。该技术保留了轻重链可变区天然配对，具有基因多样性好、效率高和所需细胞数量少的优点。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州拥有流式单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞和[/font][b][url=https://cn.sinobiological.com/services/platform/beacon-b-cell-screening][font=Calibri]Beacon[/font][font=宋体]单[/font][font=Calibri]B[/font][/url][/b][font=宋体][b][url=https://cn.sinobiological.com/services/platform/beacon-b-cell-screening]细胞[/url][/b]两大技术平台，可提供一站式的单[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞抗体制备服务，包括从免疫原制备到单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞分选、鉴定、及抗体生产等步骤。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多单克隆抗体技术详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-technology[/font][/font]

[font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-production][b]单克隆抗体[/b][/url]（[/font][font=Calibri]mAb[/font][font=宋体]）源于单一[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆，具有高度的均一性和特异性，仅针对某一特定抗原表位。在生物医学研究、疾病诊断以及某些疾病治疗（如传染病和癌症）中单克隆抗体发挥着至关重要的作用。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]目前，制备单克隆抗体的主流技术包括[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology][b]杂交瘤技术[/b][/url]、[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/phage-display-antibody][b]噬菌体抗体库技术[/b][/url]和[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/single-b-cell-technology][b]单个[/b][/url][/font][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/single-b-cell-technology][b]B[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/single-b-cell-technology][b]细胞技术[/b][/url]。杂交瘤技术通过融合免疫小鼠的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞与骨髓瘤细胞，筛选出能够特异性分泌抗体的杂交瘤细胞，进而生产并纯化得到单克隆抗体。噬菌体抗体库技术则利用基因工程技术，将抗体基因与噬菌体基因相连接，使抗体以融合蛋白的形式呈现在噬菌体表面，通过与靶蛋白的结合，筛选出具有特定亲和力的噬菌体展示抗体。而单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞技术则基于每个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞仅含有一对功能性的重链和轻链，每个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞仅产生一种特异性抗体的特性，直接从单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞中扩增抗体基因，从而获得单克隆抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]制备单克隆抗体的基本流程：[/font][/b][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）抗原制备[/font][/font][font=宋体][font=宋体]一般来说，抗原可以是蛋白（天然蛋白或重组蛋白）、多肽、小分子等。依据需求选择和制备合适的免疫原对于抗体开发至关重要。义翘神州在蛋白抗原、多肽抗原制备积累了丰富的经验，可提供专业的抗原制备服务。另外，义翘神州还成功制备出[/font][font=Calibri]6000[/font][font=宋体]多种重组蛋白产品，可作为抗原用于动物免疫和抗体筛选，欢迎订购。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）动物免疫[/font][/font][font=宋体][font=宋体]通常选用[/font][font=Calibri]Balb/c[/font][font=宋体]小鼠作为免疫动物，根据抗原的特性制定免疫方案，包括免疫抗原纯度、抗原量、免疫方法和途径等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]免疫方法一般有常规免疫法、脾内一次性免疫法、短程免疫法和体外免疫法等，免疫途径主要有皮下注射、腹腔注射和静脉注射。脾内一次性免疫法具有用量少、免疫程序短、不加佐剂且所得单克隆抗体的特异性较高等特点。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]常规免疫周期如下：第一次免疫（抗原[/font][font=Calibri]+[/font][font=宋体]弗氏完全佐剂，皮下注射）、第二次免疫（抗原[/font][font=Calibri]+[/font][font=宋体]弗氏不完全佐剂，皮下注射）、第三次免疫（抗原[/font][font=Calibri]+[/font][font=宋体]不加佐剂，皮下或静脉注射）、第四次免疫（抗原[/font][font=Calibri]+[/font][font=宋体]不加佐剂，静脉注射）。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）细胞融合[/font][/font][font=宋体]细胞融合前准备：[/font][font=宋体][font=宋体]脾淋巴细胞制备：取已经免疫的[/font][font=Calibri]Balb/c[/font][font=宋体]小鼠的脾脏，制备淋巴细胞，通常每只小鼠可得[/font][font=Calibri]1x10^8-2.5x10^8[/font][font=宋体]个脾细胞；同时摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]骨髓瘤细胞制备：骨髓瘤细胞应该和免疫动物属于同一品系，便于细胞融合以及产生大量[/font][font=Calibri]Ab[/font][font=宋体]。融合前骨髓瘤细胞维持的方式，对成功得到杂交瘤非常重要。目的是使骨髓瘤细胞处于对数生长的时间尽可能长，融合前不能少于[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]周；冻存的细胞在复苏后要生长[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]周才能处于适合于融合的状态。[/font][/font][font=宋体]饲养细胞：常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞。饲养细胞促进杂交瘤细胞增殖的机制可能是释放非种属特异性的生长刺激因子，为杂交瘤细胞提供必要的生长条件；也可能是满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]细胞融合：细胞融合方法有病毒介导的细胞融合、聚乙二醇（[/font][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]）介导细胞融合、电融合。[/font][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]融合相邻骨髓瘤和[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]或抗体分泌细胞的质膜，形成具有两个或更多核的单细胞。异核体保留这些核，直到核膜在有丝分裂前溶解。电融合通过施加脉冲电场连接相邻细胞的膜。电融合比[/font][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]更加有效，结果具有重现性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]）杂交瘤筛选以及单克隆鉴定[/font][/font][font=宋体][font=宋体]骨髓瘤细胞和脾细胞融合之后，由于细胞融合是随机的，因此要利用[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基筛选杂交瘤细胞。骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤－鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]），对氨蝶呤钠敏感，在[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]选择培养液中不能生长；免疫脾细胞虽然有[/font][font=Calibri]HGPRT[/font][font=宋体]，但不能在体外无限繁殖。因此只有融合的杂交瘤细胞，才能在[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]选择培养液中无限繁殖。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]得到融合的杂交瘤细胞后，需要进一步筛选特异性抗体。将融合的细胞进行充分有限稀释，使分配到培养板的每一孔中的细胞数在[/font][font=Calibri]0[/font][font=宋体]至数个细胞之间（[/font][font=Calibri]30%[/font][font=宋体]的孔为[/font][font=Calibri]0[/font][font=宋体]才能保证每个孔中是单个细胞），培养后取上清液用[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]法选出抗体高分泌性的细胞，这一过程常被称作克隆化。将这些阳性细胞再进行克隆化，应用特异性抗原包被的[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株，增殖后进行冻存、体外培养或动物腹水培养。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]）单克隆抗体大量制备[/font][/font][font=宋体]利用杂交瘤细胞大规模制备单克隆抗体主要有两种方式：体外培养法和腹水制备法。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]体外培养可以采用单层细胞培养的形式，也可以采用悬浮培养的形式。单层细胞培养法是各个实验室最常用的，是将杂交瘤细胞加入培养瓶中，用完全培养基培养，细胞浓度以[/font][font=Calibri]1.0X10^6~2.0X10^6[/font][font=宋体]个[/font][font=Calibri]/mL[/font][font=宋体]为宜，然后收集培养上清液。如果想在体外高效率地大量制备单克隆抗体，就必须高密度培养杂交瘤细胞，充分利用培养基的立体空间。单位体积内细胞数量越多，产生的单克隆抗体就越多，浓度就越高，产量就越大。义翘神州提供杂交瘤体外培养抗体生产服务，成功率[/font][font=Calibri]99%[/font][font=宋体]，可采用低血清或无血清培养基进行高密度悬浮培养，生产规模从毫克级到克级不等，满足客户的不同需求。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]腹水制备法是通过将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，并产生腹水，可得到大量的腹水单抗。这种方式能够在相对短的时间内获得大量高浓度的抗体，而且成本低、操作相对简单以及不需要复杂的培养条件。然而，这种方法也有一些限制，比如腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白（包括[/font][font=Calibri]Ig[/font][font=宋体]），因此在很多情况下要提纯后才能使用，而且还有污染动物病毒的危险。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]单克隆抗体技术：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-technology[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]杂交瘤技术：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

题目：Recombinant Environmental Libraries Provide Access to Microbial Diversity for Drug Discovery from Natural Products类别：环境微生物／药物开发出处：APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Jan. 2003, p. 49–55主要观点、创新点及学术、技术意义（以下从目的why、方法how、结果what、讨论总结so四方面加以解析）：Why？ 为更进一步探究天然产物药物来源的微生物生物多样性，文章探索了可能的途径。How？ 1．文章构建并且筛选了一个包含5，000个克隆的"鸟枪"环境基因组文库， 文库使用大肠杆菌－链霉菌粘粒穿梭载体作为媒介，插入片断直接来源于环境未经培养的微生物。进一步通过遗传信息(GC%，rRNA)途径评估了文库的多样性。2．为进一步将环境文库系统发生多样性分析和评估其包含相关功能基因的潜能联系起来，文章以聚酮（由各种土壤微生物产生的结构多样的天然化合物家族）生物合成基因簇的酮基合成酶为目标，利用活性位点附近高度保守的两套放线菌来源的已知引物对文库进行了96孔池的扩增和序列分析。3．为探究土壤粘粒文库中异源DNA表达情况，文章对文库进行了各种生物学活性克隆筛选。将大肠宿主中的文库克隆排列在琼脂平板上，30度生长几天后，覆上一层B. subtilis来检测抗细菌活性。此外，为检测编码卡那抗性的基因，该基因可能位于生物合成基因出的邻近，克隆涂于含卡那的培养基上。4．液相筛选文库克隆抽提物中的异源分子：为进一步考察土壤粘粒文库中异源DNA的表达情况, 文章利用液相化学筛选手段, 检测和定性文库克隆中新代谢物。除了其它随机选择的文库克隆外，PKSI中预筛选的阳性克隆转化到S. lividans TK24. 细胞在各种培养基下生长，总共2500抽提物，1700来自E. coli 并且800 from S.lividans (corresponding to 480 and 40 E. coli and Streptomyces clones, respectively？), 进行了液相分析，使用的是光敏二极管列阵检测器。What？1．土壤环境文库的特征：a.测序分析了17个土壤文库克隆DNA，插入片断中土样DNA GC%从 53 －70%. 表明E. coli宿主（平均GC%为51%）, 没有展现出对高GC DNA严重的GC偏向性。与前人报道的一致；b.从47个环境DNA文库克隆（代表整个文库克隆的1％）中扩增了rRNA基因序列，序列分析证实所有47个序列是唯一的并且文库似乎源于系统发生多样性的微生物，其中许多未曾分离或筛选过。大部分序列分析属于多变细菌类（文章未显示相关数据）。与前人报道的一致。c.文库的系统发生分析显示出极其多样性，表明大部分微生物都未曾报道过。然而，最重要的是，文章是直接对文库克隆开展的多样性分析，而不是对土样DNA的分析，因此，到目前为止，延伸了以前的结果，多样性存在于大的DNA片断并克隆于载体构建了环境DNA文库。2．利用PCR筛选文库中类似I型聚酮合酶克隆：a.筛选文库中含PKS I DNA序列的克隆：文库克隆96孔池PCR分析检测到10 （1st primer pair） and 15（2nd primer pair）个阳性克隆，对其中一些进行克隆、测序。获得了12个差异核苷酸序列。预测氨基酸序列的比对分析表明11个核苷酸序列编码的高度保守区对应于PKS I基因的KS（酮基合成酶）活性位点保守区。进一步在GenBank数据库中比对克隆的土壤DNA序列表明所有克隆的土壤PKS I序列均是新颖序列并且与已知的微生物PKS I基因序列高度同源。图1总结了这些分析结果。尤其是，最高同源值发现在粘细菌（橙色标桩菌），蓝细菌(Microcystis and Nostoc)，和分支杆菌属。来自土壤的PKS I克隆序列与红霉素聚酮化合物基因簇同源性53％。b.11个差异的PCR产物中，三个来自同一个粘粒，a26G1,表明该粘粒插入基因片断编码至少三个不同的PKS I模块。文章测定了整个插入序列（图.2）。用Frame-Plot分析序列揭示了6个方向一致的大的ORFs, 在三处上游ORF与下游的起始密码子重叠。第一个和最后一个ORF不完整。第一个ORF编码装配非核糖体肽(NRPS)； 第二个ORF装配一个蛋白，包含一个NRPS和一个PKS模块。ORFs 3, 4, 5, and 6都装配PKS，每一个ORF（或部分ORF6）仅编码一个模块。预测的这些ORFs与粘细菌PKS和NRPS模块中涉及S. aurantica中的myxothiazole和Sorangium cellulosum中的epothilone生物合成的基因簇具最高相似性。插入片段GC％为64%，与粘细菌DNA GC含量相当。结果表明至少获得了8个新颖的聚酮合酶基因克隆。C.小结：以热门的PKS I基因作为例，文章对其进行研究来评估环境DNA文库中潜在的令人感兴趣的天然产物的富度。从相对随机和小的DNA样品库（250Mb）中，发现了11个PKS I基因序列，该结果比预期的高得多。a26G1中编码的不完整NRPS/PKS途径强有力的表明：若文库包含更多的克隆和更大的插入片段，完全有理由期待在文库中找到完整的PKS基因簇或其它生物合成基因。3. 文库生物学活性克隆筛选：a．抗细菌活性克隆筛选：检测到在E. coli中表达的一个抗细菌活性克隆(clone a10B12)。尽管抗细菌活性表型似乎是由粘粒中插入片段编码的小分子组成，并且在E. coli抽提物中检测到小分子，但在我们检测化合物结构之前活性丧失。可能由于E. coli.的强烈负选才使得该分子得以表达。b．卡那抗性的基因克隆筛选：检测到一个卡那抗性克隆(clone a8E12)。卡那抗性在E. coli中稳定表达，并对粘粒中插入的DNA进行了测序，尽管ORF很可能不是编码抗生素的生物合成基因簇部分，但它确实编码的是一个推测的与几个属（包括假单胞菌属和链霉菌属）的氨基糖苷类乙酰基转移酶高度同源的蛋白（图3）。C．卡那抗性克隆转化到S. lividans 中的异源表达：粘粒a8E12转化到S. lividans 中，但并没有在宿主中表达卡那抗性，强调使用多重表达系统捕获更广泛的可能活性的重要性。D．额外的粘粒克隆的异源表达表型分析和液相检测分析：一些额外的粘粒克隆（包括a10B12 和编码PKS I的同源克隆) 转化到S.lividans TK24 和S. lividans 衍生菌（内原色素基因缺失，A. Martinez, unpublished results). 尽管在内原色素基因缺失的衍生菌中并没有发现抗细菌活性，但克隆a22G9 （30个测试的克隆之一）导致S. lividans TK24产生过度的蓝色色素(actinorhodin), 暗示了异源分子的产生(Martinez, unpublished). 液相分析菌株TK24 抽提物，携带该粘粒的菌株显示了两个新的峰而仅携带原始粘粒的宿主菌对照中并未出现（图4）。4．液相筛选结果：A．12，000峰中，大于100个峰能与UV库相匹配（也就是菌中不存在的）。这些峰中的绝大多数低于可靠的纯度域值并省略了进一步的分析。B．然而，两株重组菌，S. lividans克隆a24H2和a24A3, 色谱图相同, 包含的峰揭示了宿主菌中检测不到的同源化合物的存在。确定了分析的最佳的平等条件，文章分离了一系列6个高度相关的化合物，他们的UV谱几乎完全一样。这些条件下的液相色－质谱测定法分析，其中4个产生一个相对原子量为294。液体色谱法－核磁共振光谱测定了化合物的结构（图5）。这些脂肪丁烯均聚酒精异构体未曾在(4; Chemical Abstracts databases through 1999; American Chemical Society, Washington, D.C.)文献中报道过。

[font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology][b]杂交瘤技术[/b][/url]是一种将[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合生产单克隆抗体的传统方法。该技术通过将动物脾细胞与骨髓瘤细胞融合，产生永生化杂交瘤细胞系，然后筛选其上清液中的抗原特异性克隆，并进一步循环亚克隆以产生严格的单克隆抗体。[/font][/font][font=宋体][font=宋体][b]利用杂交瘤技术制备单克隆抗体通常操作流程为[/b]：抗原制备、抗原免疫动物、杂交瘤细胞制备、融合细胞的筛选、培养杂交瘤细胞制备抗体。（详细实验流程：杂交瘤单克隆抗体制备[/font][font=Calibri]SOP[/font][font=宋体]）在单克隆抗体制备过程中，常常会遇到细胞污染，细胞融合后不生长、亚克隆后的细胞株不分泌抗体以及细胞难以克隆等问题，本文将详细分析以上常见问题的产生原因以及解决该问题的方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]一、微生物污染[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①细菌、真菌污染主要是由于实验人员操作不当或者消毒不到位引起的。人身上可能携带各种孢子，如果操作不当，或者是未能及时到位的消杀，就有可能会引入污染。除此之外，还须注意平时使用的一些消毒剂，比如[/font][font=Calibri]84[/font][font=宋体]消毒液或者[/font][font=Calibri]75%[/font][font=宋体]酒精，要确认它的纯度以及质量。如果是因为这些问题导致的消毒不到位，是非常不容易发现的。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]②支原体污染则可能由血清制品、关键试剂材料或实验人员带入。正常的[/font][font=Calibri]SP2/0[/font][font=宋体]细胞圆润透亮，当被支原体污染后，短期内细胞没有明显的变化，当污染严重后，细胞生长会变得极为缓慢，生长周期变长，细胞形态多样。可通过加入商品化的清除支原体试剂，或者通过将污染的杂交瘤细胞注射进小鼠腹腔，待产生实体瘤后或产生腹水后，无菌分离重新获得杂交瘤细胞。[/font][/font][font=宋体]③原生生物污染主要是大家比较头疼的黑胶虫，污染后会陆续出现多少不等的小黑点。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]二、融合后细胞不生长[/font][font=宋体][font=宋体]①融合后细胞不生长可能是因为融合试剂有毒性，部分毒性试剂作用时间过长引起的。如[/font][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]在[/font][font=Calibri]10%~60%[/font][font=宋体]都可以进行融合，但浓度越高毒性越大。[/font][/font][font=宋体]②也有可能是使用血清质量比较差，推荐使用胎牛血清。[/font][font=宋体][font=宋体]③还有可能是因为添加的[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]试剂中氨基喋呤（[/font][font=Calibri]A[/font][font=宋体]）含量过高或[/font][font=Calibri]HT[/font][font=宋体]（次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷）含量过低。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]三、杂交瘤细胞不分泌抗体或者停止分泌抗体[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、杂交瘤细胞不分泌抗体，可能的原因有以下几种：[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]a.[/font][font=宋体]抗原免疫原性弱，免疫效果不好，可以通过多方案检测血清效价进行进一步评估；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]b.[/font][font=宋体]操作过程中脾细胞损伤较多，抗原特异性淋巴母细胞大量死亡；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、杂交瘤细胞前期有抗体分泌，后期在克隆化过程中抗体分泌量减少或停止分泌抗体，可能的原因有以下几种：[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]a.HAT[/font][font=宋体]试剂中氨基喋呤（[/font][font=Calibri]A[/font][font=宋体]）失效，骨髓瘤细胞增殖抑制杂交瘤细胞的生长；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]b.[/font][font=宋体]未及时克隆，不分泌抗体的杂交瘤大量生长挤占生存空间；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]c.[/font][font=宋体]骨髓瘤细胞返祖化，抵抗氨基喋呤（[/font][font=Calibri]A[/font][font=宋体]）的选择；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]d.[/font][font=宋体]梁色体丢失（突变）[/font][font=Calibri] [/font][/font][font=宋体][font=Calibri]e.[/font][font=宋体]支原体污染。[/font][/font][font=宋体]解决方法有三种：第一，及时进行细胞建库；第二，高频次检查细胞状态和是否污染；第三，定期进行抗原筛选。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]四、杂交瘤细胞难以克隆化[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]一旦确认有分泌抗体的杂交瘤细胞，就应尽快进行克隆化。克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体，反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞若难以克隆化，可以尝试以下解决方法：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①使用已有杂交瘤细胞株对血清进行筛选，确定最佳批次的血清和使用浓度；[/font][font=宋体][font=宋体]②融合后第一次克隆（一亚）仍需采用含[/font][font=Calibri]HT[/font][font=宋体]的条件培养；[/font][/font][font=宋体][font=宋体]③在培养体系中加入白细胞介素[/font][font=Calibri]6[/font][font=宋体]（[/font][font=Calibri]IL6[/font][font=宋体]），一般商品化的杂交瘤因子都含有[/font][font=Calibri]IL6[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]义翘神州提供杂交瘤测序服务和杂交瘤细胞培养及抗体生产服务，具体关于杂交瘤相关问题详情可以参看[/font][font=宋体][font=宋体]杂交瘤技术：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology[/font][/font][font=宋体][font=宋体]杂交瘤细胞培养及抗体生产服务：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-culture-antibody-production-service[/font][/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-sequencing-service][b]杂交瘤测序服务[/b][/url]：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-sequencing-service[/font][/font]

自从1996年世界上第一只体细胞克隆羊“多利”在英国诞生以来，克隆技术似乎变得越来越普及，各国很多科学家都掌握了这种技术，更有许多科学家雄心勃勃，朝着克隆动物产品产业化的目标进发。　　在中国，已经有数家科研机构有能力克隆动物，并让不少的克隆动物存活下来。中国科学院动物所首席研究员陈大元、2007年12月刚当选为中国工程院院士的中国农业大学李宁教授等，都已经成功培养出克隆牛，中国工程院院士、上海医学遗传研究所所长曾溢滔也在克隆牛和羊的工作上稳步前进。　　药物也好，牛排也好，克隆技术最终的目标，都是制造产品送进人的身体里，所以，“克隆离餐桌有多远”这个问题，永远吸引人们的关心。美国FDA认可了部分克隆动物食品的安全性以后，中国大众也开始讨论克隆食品能不能吃的问题。　　关于克隆食品的安全性，中国农业大学李宁教授介绍说，目前国内还没有相关的标准出台，有关部门领导碰面时会提及标准问题，但距离正式的探讨还有距离。“中国与美国的情况不同，美国的产业部门会向FDA提出制定克隆动物食品标准的要求。”李宁教授说，产业部门的呼吁已有五六年之久，FDA关于安全性的标准和认可姗姗来迟。为此，产业部门极为不满。他在国外参加学术会议时，常常听到国外专家的抱怨。但在国内，动物产品生产的各个环节分属不同部门管理，很难有部门主动“应战”。　　但李宁教授认为，目前中国克隆动物产品距离产业化还有“漫长的道路”，原因并不在于缺乏安全性审查的标准，因为安全性标准完全可以参照国外既有的标准。他认为，真正的距离在于技术。“个别的科研团体能够克隆，是不可能实现产业化的。”　　陈大元教授同样不够“乐观”。他自己带领的克隆牛研究，就还没有达到理想的“效率”。2002年陈大元的团队培养出第一批克隆牛，14头成功克隆的牛最后只存活下5头牛犊，第一头克隆牛在出生不久以后夭折。2003年在新疆成功的31头克隆牛，也只有12头存活。不久前，中科院一个研究小组培育的克隆牛，全部存活，这几乎是克隆实验中的“奇迹”，陈大元介绍说，这次“例外”的原因，科研人员正在研究当中。　　尽管有“例外”发生，克隆动物存活率低的问题，仍然是目前克隆技术产业化的瓶颈，如果没有新的方法解决，对产业化的期待，也许还为时尚早。不过，陈大元认为，最近日本和美国实现了“诱导多能干细胞”技术，如果尽快把这一技术应用到克隆中，那么产业化也许可以早点到来。“只要是健康存活下来的克隆动物，作为食物就跟传统动物没有两样，是安全的，问题在于我们的技术还没有能力批量地生产克隆动物产品。”陈大元说。　　“1980年初，外国哺乳动物克隆研究走得很快，中国科学界直到1990年才追上克隆技术的步伐。”陈大元说。不过，上世纪90年代以后，中国克隆技术的进步，立即进入加速度，兔、鼠、猪、牛、羊等等动物的克隆，都被中国的科学家实现。陈大元把这个时期形容为“登峰造极”。2000年以后，随着克隆技术的成熟，世界各地的科学家开始探索克隆产业化，中国的科研工作者也加入了实现产业化的努力当中。在很多国外研究者看来，中国人的智慧和勇气，常常能制造轰动性的成果，在克隆动物产品产业化的领域，中国的表现也值得期待。

鉴于本人还是零蛋一个,特发此贴,虽然得分不是最主要目的,但零分确实很让人难受啊!单克隆抗体的研制一、单克隆抗体的概念抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody），简称单抗。与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。二、杂交瘤技术（一） 杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。1975年8月7日，Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的著名论文。他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。实验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题，从而得到广泛的应用。随后建立的骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653和NSO/1都是既不合成轻链又不合成重链的变种，所以由它们产生的杂交瘤细胞系，只分泌一种针对预定的抗原的抗体分子，克服了骨髓瘤细胞MOPC-21等的不足。再后来又建立了大鼠、人和鸡等用于细胞融合的骨髓瘤细胞系，但其基本原理和方法是一样的。（二） 基本程序和方法杂交瘤技术在具体操作上，各实验室使用的程序不尽一致。本节中介绍的方法是作者所在实验室采用的、实践证明成熟的程序，该程序适合国内大多数实验室。在开展杂交瘤技术制备单抗之前，培养骨髓瘤和杂交瘤细胞必须具备下列主要仪器设备：超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。此外，杂交瘤细胞的筛选与检测的仪器设备，依据检测单抗的方法不同而各异，请参阅本节有关部分。淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等，图6-1概括了淋巴细胞杂交瘤技术研制单抗的主要过程。1、动物免疫(1) 抗原制备 制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上说虽不要求很高，但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加，同时可以减轻筛选的工作量。因此，免疫抗原是越纯越好，应根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。一般来说，抗原的来源有限，或性质不稳定，提纯时易变性，或其免疫原性很强，或所需单抗是用于抗原不同组分的纯化或分析等，免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯，但抗原中混杂物很多，特别是如果这些混杂物的免疫原性较强时，则必须对抗原进行纯化。检测用抗原可以是与免疫抗原纯度相同，也可是不同的纯度，这主要决定于所用筛检方法的种类及其特异性和敏感性。(2) 免疫动物的选择 根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。因为，所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤细胞都来源于LOU/c大鼠，所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免疫动物。但是，有时为了特殊目的而需进行种间杂交，则可免疫其他动物。种间杂交瘤一般分泌抗体的能力不稳定，因为染色体容易丢失。就小鼠而言，初次免疫时以8-12周龄为宜，雌性鼠较便于操作。(3) 免疫程序的确定 免疫是单抗制备过程中的重要环节之一，其目的在于使B淋巴细胞在特异抗原刺激下分化、增殖，以利于细胞融合形成杂交细胞，并增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤的机会。因此在设计免疫程序时，应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。没有一个免疫程序能适用于各种抗原。现用的免疫程序中多数是参照制备常规多克隆抗体的方法。表6-1列举了目前常用的免疫程序。免疫途径常用体内免疫法包括皮下注射、腹腔或静脉注射，也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼。最后一次加强免疫多采用腹腔或静脉注射，目前尤其推崇后者，因为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分。在最后一次加强免疫后第3天取脾融合为好，许多实验室的结果表明，初次免疫和再次免疫应答反应中，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，特异性杂交瘤的形成高峰分别为第4天和第22天，在初次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgM抗体，再次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgG抗体。笔者体会阳性杂交瘤出现的高峰与小鼠血清抗体的滴度并无明显的平行关系，且多在血清抗体高峰之前。因此，为达到最高的杂交瘤形成率需要有尽可能多的浆母细胞，这在最后一次加强免疫后第3天取脾进行融合较适宜。已有人报道采用脾内免疫，可提高小鼠对抗原的免疫反应性，且节省时间，一般免疫3天后即可融合。

平端连接通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效 率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能 在两6条DNA链的3'末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为 3'突出一个碱基的DNA分子。这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR 产物的效率通过较高，。在采用大量T4DNA连接酶并配以5-10u T4 RNA连接酶时，可显著提高其连接效率。对于较短PCR产物，用PUS19 的HincⅡ位点进行克隆，以X－gal和IPTG筛选，常可得到足量重组 子。另一种提高克隆效率的途径是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶 消去3'末端突出碱基将PCR产物变成平端DNA，然后再用平端连接法 克隆PCR产物。粘端连接引物中设计入限制酶位点：由于PCR引物的5'末端可以增加一些非 互补碱基，因此可以在两引物的5'末端设计单限制酶或双限制酶切 位点。这样得到的PCR产物用限制酶消化产生粘性末端，即可与有互 补粘端的载体DNA重组。这种克隆方法效率较高，且当两引物中设计 不同酶切位点时，可有效地定向克隆PCR产物。其缺点是需要加长 PCR引物，除限制酶识别序列外，还需要在其5'端多合成3-4个碱基 以利于限制性内切酶与PCR产物末端的稳定结合。即使如此，其酶切 效率也不够高。其中尤以NotI、XhoI和XbaI等较为难切。采用突变 PCR方法可克服上述缺点。该方法是通过在两PCR引物序列中改变1至 数个核苷酸创造出一个限制性内切酶位点。鉴于PCR引物的3'末端序 列的互补性是PCR成功的关键，在PCR引物的中部或近5'端改变1个或 几个碱基对PCR扩增效果影响不大。这种方法不需要增加PCR引物的 长度，而且酶切效果优于5'加端法。对于特定DNA片段的克隆，此方 法较为经济、实用。但对于基因诊断PCR产物的克隆，似乎5'加端法 更为适宜。T4DNA聚合回切产生粘端如PCR两引物的5'末端是A或T，则可在 其5'端分别加上CG和CCGG.用此二引物扩增的PCR产物在dATP和dTTP 存在的情况下，用T4DNA聚合酶进行处理，则T4DNA聚合酶因具有3'→ 5'外切酶活性而消去3'末端的G和C，产生AccI和XmaI粘性末端（图1）。 此DNA片段直接与用AccI和XmaI切开的载体进行连接。这种方法只需 在PCR引物的5'端加2-4个碱基，但其可选择的限制酶类有限。T－vector法TaqDNA聚合酶能在平端双链DNA的3'末端加一个碱 基，所加碱基几乎全是腺苷。据此，Marchuk等人采用3'端突出一个 胸苷的质粒DNA来克隆PCR产物，其克隆效率比平端的连接至少高出 100倍。他们用EcoRV将pBluescript切成平端，然后在2mmol/LdTTP 存在下，用TaqDNA聚合酶催化pBluescript的两个3'末端各加一处胸 苷。因为在4种dNTP都存在时，Taq聚合酶选择性参入dATP，而当仅 一种dNTP存在时，它只能参入该种碱基。因此，在只加入ddTTP时， 用TaqDNA聚合酶可使平端载体DNA转变成3'末端突出一个胸苷的T尾 载体，称为T－vector.用这种T－vectorsk可以较有效地直接克隆 PCR产物。Hotton等人也报道了另一种制备T－vector的方法。他们 使用脱氧核苷酸末端转移酶在切成平端的载体DNA的3'末端加上一个 胸苷。由于末端转移酶可以催化多个碱基（ddTTP）作为底物，使平 端载体DNA分子的两个3'末端各加上一个T.用这种方法制备的T－vector 的不同之处在于前者3'末端不能与待克隆PCR产物的5'末端连接，仅 5'末端可与PCR产物的3'末端形成磷酸二脂键。共环消解法最近，Jung等人报道了一种有效的PCR产物克隆方 法。用磷酸化的PCR引物扩增得到的PCR产物，先用T4DNA连接酶催化 连接反应，使5'端带有限制酶切位点的扩增DNA片段连接成共环结 构。然后再用相应的限制酶进行消化，产生粘端DNA片段。对于对称 性限制酶位点，只需在引蛾的5'末端加上一关识别序列，因为在串 接成共环后能恢复限制酶切位点难于切开的缺点，且可用于双限制 酶切位点的设计，只不过有PCR产物共环化后，仅约1/4的限制酶切 点得以恢复。故此法较适用于单限制酶位点的克隆。无连接酶亚克隆法(A)无连接酶克隆法（ligase-free subcloning，LFS）是利用引物5’ 末端附加碱基修饰法，修饰碱基不是酶切位点，而是与某一质粒两 端分别互补的碱基。两引物的3’端约20-25个核苷酸分别与待扩增 DNA两翼互补，5’端各有约24个核苷酸分别与线性化质粒的3’端相 同的附加序列。由于线性化质粒的3’端序列各不相同，PCR片段可 以通过选择各引物的合适5’附加序列与引物3’端定向杂交。由此物a和b产生的两端有附加序列的PCR产物与未反应引物分离后， 分别加入两只含有线性化质粒的反应管中进行第二次PCR.第1管中 用引物a和c，引物a即为第一PCR扩增的上游引物a，引物c为下游引 物，与紧邻5’端附加序列内测的质粒（+）链互补。同样，第2管的 引物为b和d，引物b与第一次PCR扩增的下游引物b相同，引物d为上 游引物，与紧邻5’附加序列内侧的质粒（-）链互补。

[size=3]近日，记者在内蒙古自治区鄂托克旗召开的“转基因克隆绒山羊培育成果通报会”上获悉，不久前，位于鄂托克旗的“内蒙古白绒山羊种羊场”诞生了目前国际上规模最大的一批转基因克隆绒山羊，这标志着中国绒山羊现代生物育种技术又有了新的突破。 　　这项研究为国家转基因生物新品种培育重大专项课题，由内蒙古大学生命科学学院实验动物研究中心研究员刘东军带领的研究团队，在中国工程院院士旭日干的指导下取得的一项具有国际先进水平的科研成果。 　　此研究团队成功构建了对绒毛生长有促进作用的转胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）基因载体，利用该载体成功转染了绒山羊胎儿成纤维细胞，建立起转基因细胞系。再利用转基因细胞进行体细胞克隆，从而获得的转基因绒山羊。 　　2009年9月至10月，这个研究团队在位于鄂托克旗草原上的内蒙古白绒山羊种羊场开展绒山羊转基因克隆胚胎的生产和移植工作。今年2月至3月陆续获得羔羊17只，其中转基因克隆羔羊14只、体细胞克隆羔羊3只。 [/size]

[font=宋体][font=宋体]单克隆抗体是由单一[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（[/font][font=Calibri]hybridoma[/font][font=宋体]）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞杂交瘤。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1975[/font][font=宋体]年分子生物学家[/font][font=Calibri]G.J.F.[/font][font=宋体]克勒和[/font][font=Calibri]C.[/font][font=宋体]米尔斯坦在自然杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术，他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞融合，成为杂交细胞系，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤作单个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量的、高浓度的、非常均一的抗体，其结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的，而且在培养过程中，只要没有变异，不同时间所分泌的抗体都能保持同样的结构与机能。这种单克隆抗体是用其他方法所不能得到的。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]单克隆抗体的优势和局限性[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]．单克隆抗体的优点[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri](1)[/font][font=宋体]杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri](2)[/font][font=宋体]可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri](3)[/font][font=宋体]由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如[/font][font=Calibri]IRMA[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri](4)[/font][font=宋体]由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]．单克隆抗体的局限性[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri](1)[/font][font=宋体]单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri](2)[/font][font=宋体]单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri](3)[/font][font=宋体]制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高 。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]单克隆抗体的应用[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]．检验医学诊断试剂[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]作为检验医学实验室的诊断试剂，单克隆抗体以其特异性强、纯度高、均一性好等优点，广泛应用于酶联免疫吸附试验、放射免疫分析、免疫组化和流式细胞仪等技术。并且单克隆抗体的应用，很大程度上促进了商品化试剂盒的发展。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]．蛋白质的提纯[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]单克隆抗体是亲和层析中重要的配体。将单克隆抗体吸附在一个惰性的固相基质（如[/font][font=Calibri]Speharose 2B[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]4B[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]6B[/font][font=宋体]等）上，并制备成层析柱。当样品流经层析柱时，待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性结合，其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离子强度或[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]，欲分离的抗原与抗体解离，收集洗脱液便可得到欲纯化的抗原。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]． 肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]将针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗药物或放疗物质连接，利用单克隆抗体的导向作用，将药物或放疗物质携带至靶器官，直接杀伤靶细胞，称为肿瘤导向治疗。另外，将放射性标记物与单克隆抗体连接，注入患者体内可进行放射免疫显像，协助肿瘤的诊断。单克隆抗体主要为鼠源性抗体，异种动物血清可引起人体过敏反应。因此，制备人[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]人单克隆抗体或人源化抗体更为重要，但此方面仍未取得明显进展。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]目前义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services][b]单克隆抗体定制服务[/b][/url]，有需求可查看详情[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services[/font][/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-technology][b]单克隆抗体技术[/b][/url]详情：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-technology[/font][/font]

[font=宋体]在生物医学领域，[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/pab-development][b]多克隆抗体[/b][/url]是一种非常重要的工具。多克隆抗体是由免疫动物产生的一类具有识别多种抗原表位的抗体，具有广泛的应用价值。制备多克隆抗体的方法有多种，其中最常用的是免疫接种和杂交瘤技术。本文将介绍多克隆抗体的制备方法及流程。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]多克隆抗体的制备方法[/font][/b][font=宋体]主要是通过动物免疫，刺激宿主产生大量抗体。通常选用兔子和山羊作为免疫动物，因为动物反应良好，能提供足够数量的血清。用于免疫的动物应适龄、健壮、无感染性疾病、最好为雄性，此外还要注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。一般采用皮下或背部多点皮内注射免疫原，多次免疫之后，激发动物机体免疫系统产生抗体，最后获取动物高免血清获得抗体；进一步通过纯化及验证后才可以使用。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]利用兔子制备多克隆抗体涉及[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]个关键步骤，具体概述如下[/font][/font][/b][font=宋体]：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [font=宋体]步骤[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]：抗原制备[/font][/font][font=宋体][font=宋体]蛋白抗原或多肽抗原合成是多抗制备的第一步。目标抗原的纯度对于抗体来说很关键，直接影响最终多克隆抗体的质量。抗原中的杂质（＜[/font][font=Calibri]1%[/font][font=宋体]）也可能具有免疫原性（例如许多细菌抗原），可能导致抗体识别杂质，而不是目标抗原。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州拥有重组蛋白表达平台，在[/font][font=Calibri]CHO[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]HEK293[/font][font=宋体]和大肠杆菌中有着丰富的重组蛋白表达经验，可提供专业高效的抗原制备服务。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [font=宋体]步骤[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]：动物免疫[/font][/font][font=宋体][font=宋体]多克隆抗体制备时，如何选择动物取决于这[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]个方面：所需抗血清的数量、抗原物种与免疫动物之间的亲缘关系以及免疫原制备的经验。兔子通常是多抗制备的首选，体积大，每次可抽取多达[/font][font=Calibri]25mL[/font][font=宋体]的血清，对兔子本身无显著的不良影响。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]免疫佐剂是多抗制备时用于增强机体免疫应答的辅助物质。弗氏佐剂是一种最常用的免疫佐剂，分为完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂。在佐剂存在的情况下，将蛋白抗原通过肌肉注射、皮内注射或皮下注射的方式注入选定种类的动物体内。初次免疫的[/font][font=Calibri]4~8[/font][font=宋体]周后，开始进行加强免疫，并每隔[/font][font=Calibri]2~3[/font][font=宋体]周进行[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]次。初次免疫和每次加强免疫之后，都需要进行动物采血并测定抗体效价。当抗体效价达到预期水平时，即可放血制备抗血清。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [font=宋体]步骤[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]：抗体纯化[/font][/font][font=宋体]对于多克隆抗体的制备，亲和纯化是一种高效的纯化方法。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]蛋白[/font][font=Calibri]A/G[/font][font=宋体]亲和纯化可从抗血清富集免疫球蛋白[/font][font=Calibri]G[/font][font=宋体]（[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]），并且除去大量不需要的蛋白。但产品仍然有大量非特异性[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]的存在，可能导致在各种[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]、免疫组织化学和蛋白质免疫印迹等免疫检测中背景偏高。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]为了从抗血清中分离出特异性多克隆抗体，通常使用抗原特异性亲和纯化。抗原亲和纯化可除去大量非特异性[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]组分，并且富集与目标抗原发生特异性反应的免疫球蛋白组分。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [font=宋体]步骤[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]：质量控制[/font][/font][font=宋体][font=宋体]纯化后，抗体需要经过一系列[/font][font=Calibri]QC[/font][font=宋体]检测，以确保多克隆抗体的质量。抗体浓度测定是在[/font][font=Calibri]280nm[/font][font=宋体]（[/font][font=Calibri]A280[/font][font=宋体]）测定其[/font][font=Calibri]OD[/font][font=宋体]值。使用[/font][font=Calibri]SDS-PAGE[/font][font=宋体]电泳用于检测多抗的纯度。[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]法可用于测定多克隆抗体的效价。根据下游检测需求，可对抗体进行标记，用于[/font][font=Calibri]IHC[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]WB[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]等实验。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]关于更多[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/pab-production][b]多克隆抗体制备[/b][/url]详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/pab-production[/font][/font][font=宋体] [/font][font=Calibri] [/font]

[font=宋体][font=Calibri]wb[/font][font=宋体]抗体选择单克隆还是多克隆抗体呢？首先要看你做的是什么物种，根据物种特异与否选择单抗或者多抗。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]一般小鼠、大鼠等常用模式动物可以选择鼠源单克隆抗体，其特异性较好，如果是不常见动物模型，建议选择多克隆抗体。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]当然，单抗或者多抗也不是一定的，需要去查询抗原决定簇的归属，一般是找到抗体所对应的特异氨基酸序列，到数据库与你要做的物种进行比对，如果匹配度较高（[/font][font=Calibri]85%[/font][font=宋体]以上），则建议购买尝试。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]二抗的选择相对就简单了，根据一抗的种属特异性进行二抗选择即可。[/font][font=宋体][font=宋体]如一抗选用鼠源（[/font][font=Calibri]Mouse[/font][font=宋体]）抗体，则二抗选用抗小鼠抗体即可（[/font][font=Calibri]e.g. Goat Anti-Mouse[/font][font=宋体]），注意二抗的反应特性（荧光、生物素或[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]偶联等）[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]其次就是多查阅文献，查看和[/font] [font=Calibri]Western Blot [/font][font=宋体]实验相关的 [/font][font=Calibri]SCI [/font][font=宋体]文献，查看要做的种属和指标关联度高的文献。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]Western Blot [/font][font=宋体]实验应该如何选择一抗和二抗[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]抗体分类：根据重链恒定区的血清学类型，可将抗体分为[/font] [font=Calibri]IgM[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]IgA[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]IgD[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]IgE [/font][font=宋体]五类，它们的重链分别为 [/font][font=Calibri]mu, gamma, alpha, delta, epsilon [/font][font=宋体]链。在上述每一类别中，按重链构造上的变异又可分为几个亚类，例如人的 [/font][font=Calibri]IgG [/font][font=宋体]可分为 [/font][font=Calibri]IgG1[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]IgG2[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]IgG3[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]IgG4 [/font][font=宋体]四个亚类。 轻链分为两种类型，[/font][font=Calibri]kappa[/font][font=宋体]链和[/font][font=Calibri]lambda[/font][font=宋体]链，但每种抗体中只存在一种类型的轻链。 [/font][/font][font=宋体][font=宋体]二抗：二抗是在其它宿主体内制备的能与一抗或一抗片段结合的抗体，上面通常连有酶或荧光素等标签。由于二抗所具备的优点使得其在免疫学实验中得以应用广泛，如[/font] [font=Calibri]western blot[/font][font=宋体]（通过与特异性抗体结合来鉴定蛋白质），[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]（以耦联有酶的抗体或抗原为标记来检测特异性的蛋白质，尤其是相应的抗原或抗体），免疫组织化学（检测组织中的特异性抗原），免疫细胞化学（通过免疫学方法检测细胞的抗原组成），流式细胞术（通过检测激光所激发荧光来鉴定分离不同类型的细胞）及免疫沉淀（通过抗原与抗体的特异性结合作用来分离相应抗原）。二抗针对某一特定物种（如小鼠）的所有抗体均具有特异性，因而使用标记的二抗可以免去对每一个一抗进行标记，大大节省了时间和费用；此外，一个一抗分子可以同时结合几个二抗分子，从而使信号大大增强，提高了实验灵敏度。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]如何选择二抗[/font][font=宋体]——根据一抗种属及类型选择合适的二抗[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]广义上是指专门和进行特异性反应和结合的抗体，在免疫学反应中，经常需要针对试验选择不同的二抗，上海信帆生物科技有限公司为您的科研工作提供适合和全面的二抗产品。检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，同时在后继试验中也会有不同的检测方案，因此在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求，一般来说，选择合适的二抗需要从下面几个方面考虑：【一抗的种属来源】[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，例如：如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。即根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。这通常是针对单克隆抗体而言。多克隆抗体主要是[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗 [/font][font=Calibri]IgG [/font][font=宋体]抗体。其中单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述，如果你的一抗是小鼠 [/font][font=Calibri]IgM[/font][font=宋体]，那么相应的二抗就应当是抗小鼠 [/font][font=Calibri]IgM[/font][font=宋体]。如果单克隆一抗是小鼠 [/font][font=Calibri]IgG [/font][font=宋体]的某一亚类（[/font][font=Calibri]IgG1[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]IgG2a[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]IgG2b[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]IgG3[/font][font=宋体]），那么几乎所有的抗小鼠 [/font][font=Calibri]IgG [/font][font=宋体]都可以与之结合，或者你也可以选择专门针对这一亚类的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠 [/font][font=Calibri]IgG1[/font][font=宋体]，那么你可以选择抗[/font][font=Calibri]IgG1 [/font][font=宋体]的二抗，此种抗体在双标记实验中尤其适合。在不清楚一抗为何种类[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]亚类的情况下，可以选用抗相应物种 [/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]一般来说，不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系，来源于山羊的二抗与来源于驴的二抗在一般的实验里没有太多的差别。然而在一些特殊的实验里，如双标实验里，如果其中一个一抗是山羊来源的，一个是小鼠来源的，则相应的二抗分别要抗山羊和抗小鼠的二抗，这时候，二抗就不能选择山羊或者小鼠来源的。有相应的驴来源的二抗，非常适合做类似双标的免疫实验。【二抗的耦联标记】[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]一般来讲，耦联到二抗上的探针主要有酶（辣根过氧化酶[/font] [font=Calibri]HRP [/font][font=宋体]和碱性磷酸酶 [/font][font=Calibri]AP [/font][font=宋体]或其衍生物，[/font][font=Calibri]PAP[/font][font=宋体]），荧光基团（[/font][font=Calibri]FITC[/font][font=宋体]、 [/font][font=Calibri]Rhodamine[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]Texas Red[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]PE[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]Rhodamine[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]Dylight [/font][font=宋体]等）、生物素、金颗粒。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于 [/font][font=Calibri]Western Blot [/font][font=宋体]和 [/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]，常用的二抗是酶标二抗；而细胞或组织标记实验（细胞免疫化学，组织免疫化学，流式细胞术）中通常使用荧光基团标记的二抗，免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的二抗。如果想要更大程度的放大检测信号，可以使用 [/font][font=Calibri]Biotin/Avidin[/font][font=宋体]检测系统。在一些荧光检测方案中，则需要选择不同的荧光标记；而金颗粒标记的二抗则更多的应用于免疫电镜中。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供单抗和多抗制备服务，同时有[/font][font=Calibri]Western Blot[/font][font=宋体]检测服务，详情可以关注[/font][/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/polyclonal-antibody-production-services][b]多克隆抗体制备服务[/b][/url]：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/polyclonal-antibody-production-services[/font][/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services][b]单克隆抗体定制服务[/b][/url]：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/monoclonal-antibody-production-services[/font][/font][font=宋体][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/services/western-blot-wb-service][b]Western Blot[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/western-blot-wb-service][b]检测服务[/b][/url]：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/western-blot-wb-service[/font][/font][font=Calibri] [/font]

概念：细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。基本步骤：1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率 =（克隆数/接种细胞数）×100%平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

[font=宋体][font=宋体]单克隆抗体是由单个[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞克隆产生的高度均一、特异性针对某一抗原表位的抗体。通过使用杂交瘤技术，科学家们将具有分泌特异性抗体能力的致敏[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞与具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合，形成了独特的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞杂交瘤。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]1975[/font][font=宋体]年分子生物学家[/font][font=Calibri]G.J.F.[/font][font=宋体]克勒和[/font][font=Calibri]C.[/font][font=宋体]米尔斯坦在自然杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术，他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞融合，成为杂交细胞系，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤作单个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量的、高浓度的、非常均一的抗体，其结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的，而且在培养过程中，只要没有变异，不同时间所分泌的抗体都能保持同样的结构与机能。这种单克隆抗体是用其他方法所不能得到的。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/monoclonal-antibody-production][b]单克隆抗体[/b][/url][b]的优势和局限性[/b][/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]．单克隆抗体的优点[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](1)[/font][font=宋体]杂交瘤可以在体外“永久”地存活并传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](2)[/font][font=宋体]可以用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](3)[/font][font=宋体]由于可能得到“无限量”的均一性抗体，所以适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法，如[/font][font=Calibri]IRMA[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]等。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](4)[/font][font=宋体]由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]．单克隆抗体的局限性[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](1)[/font][font=宋体]单克隆抗体固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围。由于单克隆抗体不能进行沉淀和凝集反应，所以很多检测方法不能用单克隆抗体完成。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](2)[/font][font=宋体]单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](3)[/font][font=宋体]制备技术复杂，而且费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高 。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]单克隆抗体的应用[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]如今，单克隆抗体广泛应用于癌症治疗、医疗诊断和基础研究等方面。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①癌症治疗应用[/font][font=宋体][font=宋体]用于癌症治疗的单克隆抗体旨在结合癌症细胞表面的抗原，相比于健康细胞，这种抗原通常在癌细胞过表达。通过[/font][font=宋体]“瞄准”这些抗原，抗体可以锁定癌细胞，并在免疫系统中充当其他免疫战士的“战斗号令”。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]美国食品和药物管理局（[/font][font=Calibri]FDA[/font][font=宋体]）已经批准了[/font][font=Calibri]100[/font][font=宋体]多种单克隆抗体用于治疗不同类型的癌症，包括乳腺癌、头颈癌、肺癌、肝癌、膀胱癌、黑色素瘤以及霍奇金淋巴瘤等。有报道称，单克隆抗体首次用于晚期黑色素瘤，将部分患者的生存延长了[/font][font=Calibri]10[/font][font=宋体]年之久。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②医疗诊断应用[/font][font=宋体][font=宋体]单克隆抗体的出现，已经变革了多种疾病的实验室诊断。它们可作为生物化学分析的诊断试剂，也可作为疾病诊断影像的工具。基于单抗试剂的诊断检测一般可用于实验室中的放射免疫测定（[/font][font=Calibri]RIA[/font][font=宋体]）和酶联免疫吸附测定（[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]）。[/font][/font][font=宋体]单克隆抗体已用于例如妊娠、激素紊乱、传染病和癌症等疾病的早期诊断。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③基础研究应用[/font][font=宋体][font=宋体]在基础研究中，研究人员可以使用单克隆抗体通过蛋白质印迹、流式细胞术、免疫组化（[/font][font=Calibri]IHC[/font][font=宋体]）、酶联免疫吸附测定（[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]）等多种方法来识别目标分子。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多关于[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/mab-development][b]单克隆抗体开发[/b][/url]详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/mab-development[/font][/font][font=Calibri] [/font]

所谓亚克隆就是对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。亚克隆的基本过程包括：(1)目的DNA片段和载体的制备；(2)目的DNA片段和载体的连接；(3)连接产物的转化；(4)重组子筛选。 一、试剂准备1．LB液体培养基：胰化蛋白胨（细菌培养用）10g，酵母提取物（细菌培养用） 5g，NaCl 10g，加ddH2O 至1000ml，完全溶解，分装小瓶，15lbf/in2高压灭菌20min。2．1.5%琼脂LB固体培养基: 称取1.5g琼脂粉放入300ml锥形瓶,加100ml LB，15 lbf/in2 高压灭菌20min，稍冷却，制备平皿。3．IPTG、X-Gal4．0.1M MgCl2 ：15 lbf/in2高压灭菌20min，0℃冰浴备用。5．0.1M CaCl2（以20%甘油水溶液配制）：15 lbf/in2高压灭菌20min，0℃冰浴备用。6．限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶。二、目的DNA片段和载体的制备选择适宜的限制性核酸内切酶，消化已知目的DNA和载体，获得线性DNA，用于重组。根据目的DNA和载体的具体情况，选择一种或者两种适当的限制酶切割，分别产生对称性粘性末端（用一种限制性内切酶进行消化而产生带有互补突出端）、不对称粘性末端（用两种不同的限制性内切酶进行消化而产生带有非互补突出端）、平端。在亚克隆时，首选不对称相容末端连接，次选对称性粘性相容性末端连接，由于平末端连接效率较低，通常很少采用。但有时目的片段的末端与载体不匹配 ，一般先将不匹配末端补平，然后再以平末端连接。（实验操作同前述） 三、利用T4 DNA连接酶进行目的DNA片段和载体的体外连接（一）连接要求和结果外源DNA片段末端性质 连接要求 连接结果 不对称粘性末端 两种限制酶消化后，需纯化载体以提高连接效率 载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；非重组克隆的背景较低；外源DNA可以定向插入到载体中。 对称性粘性末端 线形载体DNA常需磷酸酶脱磷处理 载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；外源DNA会以两个方向插入到载体中。 平端 要求高浓度的DNA和连接酶 载体与外源DNA连接处的限制酶切位点消失；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；非重组克隆的背景较高 。 带有相同末端(平端或粘端)的外源DNA片段必须克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中,但是在连接反应时,外源DNA和质粒都可能发生环化,也有可能形成串联寡聚物。因此，必须仔细调整连接反应中两个DNA 的浓度，以便使“正确”连接产物的数量达到最佳水平，此外还常常使用碱性磷酸酶去除5’磷酸基团以抑制载体DNA的自身环化。利用T4 DNA连接酶进行目的DNA片段和载体的体外连接反应，也就是在双链DNA 5’磷酸和相邻的3’羟基之间形成新的共价键。如载体的两条链都带有5’磷酸（未脱磷），可形成4个新的磷酸二酯键；如载体DNA已脱磷，则只能形成2个新的磷酸二酯键，此时产生的重组DNA带有两个单链缺口，在导入感受态细胞后可被修复。（二）T4 DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案1．连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。2．10μl体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1∶1-1∶5），补足ddH2O 至8μl。3．轻轻混匀，稍加离心，56℃水浴5min后，迅速转入冰浴。4．加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA连接酶合适单位， 用ddH2O 补至10μl，稍加离心，在适当温度（一般14-16℃水浴）连接8-14hr。四、连接产物的转化1.感受态细胞的制备⑴ 保存于-70℃的DH5α（或其他菌种）用接种环划菌于1.5%琼脂平板上，37℃恒温倒置培养至单菌落出现（约14-16 hr）。⑵ 挑取单菌落，接种于2.0ml LB液体培养基中，37℃恒温，250g振荡培养过夜（约12hr）。⑶ 取0.5ml 过夜培养液，接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-2.5hr，至OD600为0.4-0.5时，放置于4℃冰箱冷却1-2hr。（注：以下操作均应在冰浴中进行。）⑷ 将培养液分入两个50ml离心管中，4℃离心，4000g×10min，弃去上清，用冰浴的0.1M MgCl2 25ml悬浮30min。⑸ 4℃离心,4000g×10min，弃去上清，加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液1ml悬浮。⑹ 以100μl/管分装入1.5ml离心管中，-70℃冻存备用。注：此法制备感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒DNA产生5×106-2×107个菌落，这样的转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要，制备的感受态细胞可贮存于-70℃，但保存时间过长会使转化效率在一定程度上受到影响，一般三个月以内转化效率无多大改变。2. 连接产物的转化⑴ 取100μl贮存于-70℃钙化菌，冰浴化开；⑵ 加入适量连接产物（一般不超过10μl，轻轻混匀，冰浴20min；⑶ 于42℃热休克90s，迅速转移至冰浴中，继续冰浴2-3min；⑷ 加入LB液体培养基200μl，于37℃缓摇孵育45min；⑸ 将培养物适量涂于1.5%琼脂LB平板（根据质粒性质添加抗生素或/和X-Gal/IPTG），待胶表面没有液体流动时，37℃温箱倒置培养12-16hr。