质谱流式成像检测

近日，清华大学精密仪器系尤政教授团队提出了基于点阵激光激发方法的高通量流式成像方法。该方法可实现低成本、高可扩展性的成像流式细胞仪，而且首次验证了全光谱成像流式技术。相关成果以“Imaging flow cytometry using linear array spot excitation”为题在期刊《Device》上发表，并被选为当期封面文章。[align=center][img=c26a7468c0a13da42a1780598874882f_640_wx_fmt=png&wxfrom=5&wx_lazy=1&wx_co=1.png]https://img1.17img.cn/17img/images/202401/uepic/c494041c-314c-47ad-9e5d-2f92c66f26b9.jpg[/img][/align][color=#c00000][b]研究背景与成果[/b][/color]流式和显微镜是细胞检测的两个基本工具。流式技术具有高通量和丰富的分子检测信息，但缺乏细胞形态信息；相反，荧光显微镜可以提供细胞影像信息，但检测通量低，难以获取足够的样本数据进行统计分析。自流式细胞仪问世以来，其发展趋势一直在于保持高检测通量的同时增加更多信息维度，例如空间形态信息或光谱信息，以实现更准确的细胞分析或分选。成像流式技术是一种整合了流式细胞仪高检测通量和荧光显微镜空间分辨能力的仪器。然而，由于成像通量、分辨率和检测灵敏度之间的基本矛盾，现有的成像流式技术通常采用复杂的光路系统、复杂的图像重构算法，同时成像可扩展性也很有限。这使得成像流式细胞仪难以达到像传统流式细胞仪那样的高检测通道数，并且其高昂的技术成本限制了应用范围。为解决这些问题，清华大学精仪系尤政教授课题组提出了一种基于点阵激光激发的成像方法，即Linear spot array excitation（LASE）。该方法的核心思想是使用点阵结构光斑替代传统流式细胞仪中的椭圆或条状光斑，从而赋予流式细胞仪成像能力。[align=center][img=图片]https://img1.17img.cn/17img/images/202401/uepic/2a51cd6f-84e6-460b-8bec-791da44f9167.jpg[/img][/align][align=center]图1：点阵激光激发成像原理示意图[/align]图1展示了该成像方法的工作原理。在检测区域中，激发光斑呈一串等间隔的点阵光斑，由衍射光学器件生成，光斑间隔大于细胞大小，并且其排列直线与细胞运动直线呈一定的小角度。当细胞依次通过照明光斑时，将产生一串荧光和散射光信号。在图像重构阶段，只需通过信号的分割和重组即可重建细胞图像。该方法具有实现简单、实时重建的优势，并且与现有流式细胞仪光路结构兼容，因此具有良好的可扩展性，能够在高检测通量的基础上，同时实现多激光、多荧光通道以及无标记成像。[color=#c00000][b]技术成果展示[/b][/color][align=center][img=图片]https://img1.17img.cn/17img/images/202401/uepic/f7c2ba0d-80b1-411e-8e3f-9420cb746c2c.jpg[/img][/align][align=center]图2. 双激光五通道成像流式系统[/align][align=center][img=图片]https://img1.17img.cn/17img/images/202401/uepic/965bb49f-6bb0-4cc3-95fc-0151b53c32e8.jpg[/img][/align][align=center]图3.细胞器进行成像与细胞周期研究[/align]本研究利用基于LASE成像方法构建了一个成像系统，具备2色激光（488nm/638nm）和5个成像通道（明场、FITC、PE、PI、APC），如图2A所示。该系统经验证在30×30μm的成像视场下，具有1.3μm的空间分辨率。当细胞样本以5m/s的流速经过探测区域后，系统能够进行无标记的明场成像和荧光成像，且不会出现运动模糊，成像通量最高可达每秒5000个细胞每秒。该系统不仅能够对细胞中的细胞器结构进行成像（见图3A），而且可以在多个荧光波段下，实现对不同细胞结构的同时成像（见图3B）。在生物学应用中，图像被广泛视为金标准，因为它能够为细胞分析提供更为丰富和准确的信息，从而更细致准确地进行细胞分型。举例来说，通过图像，可以在传统流式基础上更进一步区分细胞周期M期的细胞核形态，如图3C所示。[align=center][img=图片]https://img1.17img.cn/17img/images/202401/uepic/bb721d89-7acb-43ad-9181-552afeb94d76.jpg[/img][/align][align=center]图4. 32通道全光谱成像流式验证[/align]得益于LASE成像方法的高度可扩展性，本论文将成像荧光信号引入一个基于棱镜色散的32通道光谱仪中，初步验证了全光谱成像流式细胞仪的可行性。该系统在保持每秒5000个细胞的检测速度通量的同时，能够同时在32个光谱通道上对细胞进行成像。借助光谱分解算法，可以有效解决多染料检测实验中染料光谱混叠效应的问题，将成像流式细胞仪的理论可检测染料数扩展至30以上的量级。这将大大提高成像流式细胞仪给单细胞分析带来的信息量。[color=#c00000][b]成果优势[/b][/color]该研究提出的点阵激光激发的成像方法，具有以下优势：1、系统简单：采用衍射器件在传统流式细胞仪基础上进行光斑整形，即可实现高通量成像功能，相较于已有成像流式技术，具备显著的成本优势。2、图像重建复杂度低：可实现实时重建，进一步可用于基于图像的实时细胞分选。3、可扩展性强：该技术可搭配多个激光和更多的检测通道，也可结合光谱检测实现全光谱成像，使成像流式细胞仪达到与传统流式细胞仪和光谱流式细胞仪相当的可检测标记数量。该技术提供的高通量和信息量将有效为细胞病理学、多组学、药物筛选、液体活检、单细胞测序等研究领域提供高质量的数据。[b]该研究的第一完成单位为清华大学精密仪器系。中国工程院院士、清华大学精密仪器系教授尤政，斯坦福大学研究科学家赵精晶(原精仪系博士生）为该论文的共同通讯作者。[/b]精仪系博士毕业生韩勇、赵精晶为该文的共同第一作者。精仪系博士毕业生晁子翕、焦泽衡，精仪系博士生张驰、姜凌奇等为该论文共同作者。该研究得到了国家自然科学基金、生物医学检测技术及仪器北京实验室的资助。论文链接：[url]https://www.cell.com/device/fulltext/S2666-9986(23)00183-7#secsectitle0070[/url][align=right]（文：清华大学精密仪器系）[/align][来源：仪器信息网] 未经授权不得转载[align=right][/align]

原标题：英开发出质谱成像技术运用新方法 推动癌组织分析进入数字时代 在癌症研究领域，质谱成像（MSI）是一种非常有前途的技术，但目前该技术的运用还受原始数据预处理、图像精确度及图像识别能力等问题限制。英国帝国理工学院近日发布新闻公报称，该校研究人员开发出一种新方法，可有效解决上述问题。新方法将改变病体组织的检测方式，从而推动癌症组织分析进入数字时代。相关研究成果刊发在最新一期《美国国家科学院院刊》上。 质谱成像技术主要是利用质谱直接扫描生物样品，分析化学成分在细胞或组织中的结构、空间与时间分布信息。这种成像方法不局限于特异的一种或几种蛋白质分子，可在生物组织样本中找到每一种蛋白质分子，并提供它们在组织中空间分布的精确信息。早在几年前，就有科学家提出利用该技术来确定生物组织类型的构想，但却一直没有设计出实用有效的方法。 新方法利用解吸电喷雾电离技术来优化数据预处理，提高图像精确度，并通过提取生物组织特定的分子印记来强化不同生物组织类型的生化特性，以增强图像识别能力。研究人员称，利用新开发的集成生物学信息平台，可将质谱成像技术获得的大量人体组织的具体信息数据，用于构建各种类型的组织数据库。通过多样本分析，并与传统的组织学分析结果进行比较，计算机就可以学习识别不同类型的组织，从而使癌变组织的解析变得相对简单高效。他们将自己设计的工作流程用于直肠结肠癌组织的检测，效果良好。 与标准组织学动辄几周才会得出完整结果的检测手段相比，利用质谱成像技术进行单一检测，仅需几小时即可获得更详尽的信息，不仅会显示组织是否发生癌变，还会显示癌症是哪一种类型和亚型。这些信息对于医生选择最有效的治疗方法十分重要。 研究人员指出，自19世纪后期染色技术用于显示组织结构以来，对组织病理学样本的分析方法鲜有变化。直到今天，染色法依然是医院组织学分析的主流手段，并且变得越来越复杂，耗费也越来越高。而质谱成像技术可能改变组织学的基本范式，科学家将不再根据组织的结构，而是根据它们的化学成分来定义组织类型。将来的检测不再依靠专家的眼睛，而是以海量数据为基础，仅一个检测所得到的信息就远比多个传统组织学检测所得到的更多。他们表示，新研究克服了一些质谱成像技术实际应用所遇到的障碍，将成为创建下一代完全自动化的组织学分析手段的第一步。 总编辑圈点 这是用互联网思维改造传统检测方法的一种尝试，它首先选取了质谱成像方法中最容易快速成像的解吸电喷雾电离技术，实现了数据快速采集；其次，通过将质谱成像得到的结果数字化，建立样本库，提高了数据规模，保证了分析精度；最后，与大数据、云计算等结合，可不断提高检测的准确性，为可靠应用提供保证。新思维已经提高了单个样本的检测精度，我们对它在群体和地区性疾病的检测预防方面也应有所期待。

[font=&][size=14px]质谱成像（Imaging Mass Spectrometry, IMS）这种最新原位分析技术主要是利用质谱直接扫描生物样品，分析分子在细胞或组织中的“结构、空间与时间分布”信息。其基本流程（以质谱分析生物组织标记物为例）见下: [color=#333333] [/color][/size][/font][img]https://file.jgvogel.cn/134/upload/resources/image/406626.jpeg?x-oss-process=image/resize,w_700,h_700[/img][font=&][size=14px]简单而言，质谱成像技术就是借助于质谱的方法，再配套上专门的质谱成像软件控制下，使用一台通过测定质荷比来分析生物分子的标准分子量的质谱仪来完成的。但是随着这项技术的不断发展，也陆续出现了许多针对各种问题的新技术。[/size][/font][font=&][size=14px]最早的质谱成像技术是基质辅助激光解吸电离（MALDI，matrix assisted laser desorption ionization）质谱分子成像技术，由范德堡大学（Vanderbilt University）的Richard Caprioli等在1997年提出，他们通过将MALDI质谱离子扫描技术与专业图像处理软件结合，直接分析生物组织切片，产生任意指定质荷比（m/z）化合物的二维离子密度图，对组织中化合物的组成、相对丰度及分布情况进行高通量、全面、快速的分析，可通过所获得的潜在的生物标志物的空间分布以及目标组织中候选药物的分布信息，来进行生物标志物的发现和化合物的监控。[/size][/font][font=&][size=14px]正如数字图像包括三个通道：红，绿，蓝一样（单个亮度定义了每个像素的颜色），质谱成像也包含了数以千计的通道，每一个对应于一个特殊的光谱峰值，“你可以通过质谱方法从这些像素中获得任何信号，然后调整图像中所需分子像素的相对亮度，最后，得到一张分子特异性的成像图。”[/size][/font][font=&][size=14px]这种方法可用于小分子代谢物，药物化合物，脂质和蛋白，而且,质谱成像能相对快速的利用许多分子通道，完全无需特殊抗体,下面列出五种先进的质谱成像方法。[/size][/font][font=&][size=14px]1、MALDI质谱分子成像技术[/size][/font][font=&][size=14px]在对组织或生物体进行成像，分析小分子构成的时候，有一个“拦路虎”总是阻碍实验的进程，那就是多肽，这些多肽体积十分大，要想对它们进行分子成像几乎是不可能的，比如，想要研究肿瘤边缘的分子微环境，如果直接成像是不可能获得清晰图像的。[/size][/font][font=&][size=14px]来自范德堡大学的质谱方法专家Richard Caprioli博士因此发明了基质辅助激光解吸电离（MALDI）质谱分子成像技术，这项技术不局限于特异的一种或者几种蛋白质分子，它可在组织切片中找到每一种蛋白质分子，并提供这些蛋白质分子在组织中的空间分布的精确信息，而事先无需知道所检测蛋白的信息。同时，可对这些蛋白质分子含量进行相对定量。[/size][/font][font=&][size=14px]MALDI质谱分子成像是在专门的质谱成像软件控制下，使用一台通过测定质荷比来分析生物分子的标准分子量的质谱仪来完成的。被用来研究的组织首先经过冰冻切片来获得极薄的组织片，接着用基质封闭组织切片并将切片置入质谱仪的靶上。通过计算机屏幕观察样品，利用MALDI系统的质谱成像软件，选择拟成像部分，首先定义图像的尺寸，根据尺寸大小将图像均分为若干点组成的二维点阵，来确定激光点轰击的间距。激光束通过这个光栅图案照射到靶盘上的组织切片，软件控制开始采集质谱数据，在质谱仪中，激光束对组织切片进行连续的扫描，组织样品在激光束的激发下释放出的分子被质谱仪所鉴定从而获得样品上每个点的质荷比（m/z）信息，然后将各个点的分子量信息转化为照片上的像素点。在每个点上，所有质谱数据经平均化处理获得一幅代表该区域内化合物分布情况的完整质谱图。仪器逐步采集组织切片的质谱数据，最后得到具有空间信息的整套组织切片的质谱数据。这样就可以完成对组织样品的“分子成像”。设定m/z的范围，即可确定该组织区域所含生物分子的种类，并选定峰高或者峰面积来代表生物分子的相对丰度。图像中的彩色斑点代表化合物的定位，每个斑点颜色的深浅与激光在每一个点或像素上检测到的信号大小相关。[/size][/font][font=&][size=14px]通过增加单位面积上轰击的激光点数量和像素，研究人员可以获得更多的样品信息，例如，采用4000像素比200像素能够得到更好的样品图像。质谱分子成像技术是一种半定量或相对定量技术，图像上颜色深的部分表明有更多的生物分子聚集在组织的这个部分，然而，不可能据此确定生物分子在组织的不同部位的实际绝对含量。选择组织图像上的任意一个斑点，图像都能够给出一个质谱谱图或者离子谱图，代表在组织的该部位存在这种生物分子，然后,与做指纹图谱类似，像做指纹图谱那样，将样品的离子谱图与已知标准品进行对照，分析差异，从而进行生物标志物的发现和药物作用的监控。[/size][/font][font=&][size=14px]2、电喷雾电离技术[/size][/font][font=&][size=14px]一般质谱成像方法由于体积庞大，重量重，需要冗长的样品准备阶段，因此，并不适用于即时成像（bed side applications），比如，要帮助外科医生进行实时的肿瘤边界成像监控，那么就要寻找新的方法了。[/size][/font][font=&][size=14px]一种称为电喷雾电离技术（desorption electrospray ionization，DESI）的MS成像技术解决了这个问题。DESI技术于2004年首次提出，由于这一方法具有样品无需前处理就可以在常压条件下，从各种载物表面直接分析固相或凝固相样品等优势而得到了迅速的发展。[/size][/font][font=&][size=14px]这种方法的原理是带电液滴蒸发，液滴变小，液滴表面相斥的静电荷密度增大。当液滴蒸发到某一程度，液滴表面的库仑斥力使液滴爆炸。产生的小带电液滴继续此过程。随着液滴的水分子逐渐蒸发，就可获得自由徘徊的质子化和去质子化的蛋白分子DESI与另外一种离子源：SIMS（二次离子质谱）有些相似，只是前者能在大气压下游离化，发明这项技术的普渡大学Cooks博士认为DESI方法其实就是一种抽取方法，即利用快速带电可溶微粒（比如，水或者乙腈acetonitrile）进行离子化，然后冲击样品，获得分析物的方法。[/size][/font][font=&][size=14px]DESI系列产品最大的优势就在于无需样品处理，一般质谱和高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]分析，样品必须经过特殊的分离流程才能够进行分析检测，使得一次样品检测常常需要约一个小时,而DESI系列产品可将固体样品直接送入质谱,溶液被喷射到检测表面,促使样品离子均匀分布。采用这一手段的质谱分离过程，只需3分钟左右即可完成。[/size][/font][font=&][size=14px]3、APIR MALDI/LAESI技术[/size][/font][font=&][size=14px]了解细胞的内部成分是理解健康细胞不同于病变细胞的关键，但是，直到目前为止，唯一的方法是观察单个细胞的内部，然后将其从动物或植物中移除，或者改变细胞的生存环境。但是这么做的话，会使细胞发生变化。科学家还不是很清楚一个细胞在病变时与健康细胞的差别，或者当它们从一个环境移到另一个环境中产生的变化。[/size][/font][font=&][size=14px]来自华盛顿大学Akos Vertes教授希望能从另外一个方面来进行活细胞分析，在他的一项关于活叶样品中初级和次级代谢产物分布的研究中，研究人员发现叶片中积累基质很厚，常导致光谱末端低分子量部分模糊，而且基质辅助激光解析电离（MALDI）质谱分析需要在真空中进行，但是，活体样本在真空中无法存活。[/size][/font][font=&][size=14px]实际上，MALDI质谱分析的原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射晶体时，由于，基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp][color=#3333ff]气相[/color][/url]。而生物样品也可以直接吸收能量的，比如，2.94mm波长的光能激活水中氢氧键。[/size][/font][font=&][size=14px]因此，Vertes等人想到复合两种技术来解决这一问题。首先他们利用大气压红外线（an atmosphericpressure infrared，APIR）MALDI激光直接激活组织中的水分，使样品气化，就像是组织表面发生了细胞大小的核爆炸，从而获得了离子化微粒，进入质谱中进行分析。但是并不是所有的气化微粒都带电，大部分其实是不带电的，会被APIR MALDI遗漏。[/size][/font][font=&][size=14px]为了捕捉这些中性粒子，Vertes等人采用了第二种方法：[/size][/font][font=&][size=14px]LAESI(laser ablation electrospray ionization，激光烧蚀电喷雾电离)，这种方法能捕捉大量带电微滴的微粒，然后重新电离化。通过对整个样品进行处理，复合这两种方法，就能覆盖更多的分子，分析质量更高。[/size][/font][font=&][size=14px]与一般质谱成像过程不同，Verte的方法还在成像中增加了高度，从而实现了3D代谢物成像。这项技术的分辨率是直径10mm，高度30mm，这与生物天然的立体像素相吻合，这样科学家们就可以获得天然构像。[/size][/font][font=&][size=14px]4、二次离子质谱技术[/size][/font][font=&][size=14px]质谱成像技术能将基质辅助激光解吸电离质谱的离子扫描与图像重建技术结合，直接分析生物组织切片，产生任意质荷比(m/z)化合物的二维或三维分布图。其中三维成像图是由获得的质谱数据，通过质谱数据分析处理软件自动标峰，并生成该切片的全部峰值列表文件，然后成像软件读取峰值列表文件，给出每个质荷比在全部质谱图中的命中次数，再根据峰值列表文件对应的点阵坐标绘出该峰的分布图。[/size][/font][font=&][size=14px]但是，一般的质谱成像技术不能对一些携带大分子碎片的化学成分进行成像，来自宾夕法尼亚州州立大学的NicholasWinograd教授改进了一种称为二次离子质谱（SIMS，secondary ion mass spectrometry）的方法，可以对样品进行完整扫描，三维成像。[/size][/font][font=&][size=14px]SIMS早在用于生物学研究之前就已经应用广泛了，比如，分析集成电路（integratedcircuits）中的化学成分，这种质谱技术是表面分析的有利工具，能检测出微小区域内的微量成分，具有能进行杂质深度剖析和各种元素在微区范围内同位素丰度比的测量能力。[/size][/font][font=&][size=14px]这种技术具有几个优点：[/size][/font][font=&][size=14px]速度快（－10,000 spectra per second），亚细胞构造分辨率（－100nm），以及不需要基质。但是另外一方面，不同于MALDI方法，SIMS方面不是一种“软”技术，这种方法只能对小分子成像，因此常常需要进行粉碎。[/size][/font][font=&][size=14px]Winograd教授改进了这一方法，他利用了一种新型SIMS光束（carbon-60磁性球），这种新光束比传统的SIMS光束对物体的化学损伤更小。C60同时撞击样品表面，类似于“一阵爆炸”，这样重复的轰击使得研究人员能深入样品，进行三维分子成像，Winograd教授称这个过程是“分子深度成像”（molecular depth profiling）。[/size][/font][font=&][size=14px]C60的能量与其它的离子束相当，却不到达样品表面以下，这样样品可以连续地被逐层剥离，研究人员就可以得到纵面图形，最终获得三维的分子影像。Winograd教授等人用含有肽的糖溶液将硅的薄片包裹起来并进行SIMS实验，随着薄膜逐渐被C60剥蚀，可以获得糖和肽的稳态信号。最终，薄膜完全剥离后就可以获得硅的信号。如果用其它的射线或原子离子代替C60，粒子束会快速穿过肽膜而无法提供有关生物分子的信息。因此，这种方法具有良好的空间分辨率，能够获得巨噬细胞和星型细胞的细胞特征和分析物的分布情况。[/size][/font][font=&][size=14px]这里还要说到一点，SIMS和上一技术（APIR MALDI/LAESI技术）都可以对三维成像，但两者也有差别，SIMS方法中，采用高能离子轰击样品，逐出分析物离子（二级离子），离子再进入质量分析器。MALDI方法则用激光辐射样品使之离子化，另外SIMS探针可以探测到100nm的深度，能提供纳米级的分辨率，而MALDI可以探测更深，但空间分辨率较低。[/size][/font][font=&][size=14px]5、纳米结构启动质谱技术[/size][/font][font=&][size=14px]质谱在检测生物分子方面有很大潜力，但现有方法仍存在一些缺陷，灵敏度不够高和需要基质分子促使分析对象发生离子化就是其中之二。比如说，需要溶解或者固定在基质上的方法检测代谢物，较易错判，因为这些代谢物与那些基质常常看上去都一样。另外基于固定物基质的系统也不允许研究人员精确的判断出样品中某一分子到底来自于哪儿。[/size][/font][font=&][size=14px]来自斯克利普斯研究院的Gary Siuzdak博士发明了一种称为纳米结构启动质谱（nanostructure-initiator mass spectrometry，NIMS）的新技术，这种技术能以极高的灵敏度分析非常小的区域，从而允许对肽阵列、血液、尿和单个细胞进行分析，而且还能用于组织成像。 [/size][/font][font=&][size=14px]NIMS利用了一种特制的表面，这种多孔硅表面上聚集了一种含氟聚合物，这些分子在受到激光或离子束照射时会猛烈爆发，这种爆发释放出离子化的分析物分子，它们被吸收到表面上，使其能够被检测到。这种方法利用激光或离子束来从纳米尺度的小囊中气化材料，从而克服了一般质谱方法缺少所需的灵敏度和需要基质分子促使分析对象发生离子化的缺陷。 [/size][/font][font=&][size=14px]通过这种方法可以分析很多类型的小分子，比如，脂质，糖类，以及类固醇，虽然每一种分析材料需要的含氟聚合物有少许差别，但是这是一种一步法的方法，比MALDI简单多了——后者需要固定组织，并添加基质。 [/size][/font][font=&][size=14px]由于，含氟聚合物不能很好的离子化，因此，会发生轻微的光谱干扰，而且由于离子化过程是“软性”的——就像MALDI，所以NIMS产生的生物分子是整块离子化，而不是片段离子化。不过这种技术对于完整蛋白的检测灵敏度没有MALDI高[/size][/font]