我国HPLC色谱柱填料的发展现状及最新进展
李昌厚中国科学院上海生物工程研究中心 上海 200233) 摘要 本文重点介绍了HPLC色谱分离柱的柱填料发展现状(研发中的关键点、理论依据、国内外的发展梗概等等)和发展趋势、柱填发展料的最新进展(重点讨论最具代表性的核壳柱的问题) 同时,对与填料有关的问题进行了讨论。 1、前言 色谱柱是HPLC系统的心脏,而色谱填料是色谱柱的核心,因此色谱填料或色谱柱被誉为“色谱芯”。HPLC色谱技术的进步,往往取决于新型色谱填料的出现,可以说色谱填料的发展是研发具有高选择性、高灵敏度、高通量的色谱分离柱的关键之一。众所周知,HPLC分离柱的基本原理是:利用混合样品各组份在固定相(色谱填料)和流动相中的分配系数不同,当恒定的流动相推动样品中的各组份在色谱柱中迁移的时候,由于各组分在流动相和固定相两相中进行连续、反复、多次的分配,从而形成差速移动,因而出现从色谱柱中洗脱出的时间差异,从而达到色谱分离的目的。 由于HPLC具有高速度、高分离效率、高灵敏度等优点,所以其仪器和应用发展很快[1]、[2]。从二十世纪60年代问世以来, HPLC已经成为分析化学领域发展最快的技术之一。经过几十年的发展和完善,HPLC现在已成为生物技术、生物化学、医学、药物临床、化学化工、食品、卫生、环保检测和商检等领域不可缺少的检测和分离手段之一。而色谱分离技术的重大进展,往往是随着新的色谱分离材料技术的突破而出现的。由此可见,色谱柱填料的重要性。 为了弘扬民族色谱柱填料的发展,本文根据仪器学理论[6]、分析检测实践的要求[7],和作者长期研发、使用HPLC仪器的经验和教训,重点介绍作者所了解到的部分国产色谱填料产品。同时讨论了HPLC分离柱填料的发展趋势,和色谱柱填料研发时应该特别重视的有关问题,供有关科技工作者参考。 2 HPLC色谱分离柱填料的发展现状[3]和趋势 1)色谱填料发展中值得特别重视的三个关键点问题 (1)柱效(N):一般由填料粒径、均匀性、孔道结构决定 (2)选择性(a):分离选择性由填料表面功能基团,孔道结构,流动相和pH决定 方法开发的最终目标是如何使得a≠1 (3)保留因子(K):由填料功能基团及其密度,比表面积,孔道结构,流动相决定 保留因子的最佳值为K=5 2)研发、选择色谱填料的理论依据[3] 研发、选择色谱填料,主要根据色谱分离方程式[3] 3)应该重视色谱填料粒径决定柱效的问题[3]图1 结论:柱效(N)、选择性(ɑ)、保留因子(K),是色谱填料研发的关键点所在 也是使用者挑选、使用中必须高度重视的三个根本性的问题。 色谱柱的柱效是最重要的关键指标,一般都取决于固定相(填料)的性能和装柱技术。而HPLC的色谱柱填料大致可以分为三种[1]:硅胶或以硅胶为基质的填料、聚合物填料和无机物填料。正相色谱柱大多采用硅胶类填料,反相色谱柱则多以硅胶为基质组成的官能团类的填料。以聚合物为填料的色谱柱最大的特点是PH值可在1-14之间都能使用,疏水性强。但无机填料色谱柱一般只是限于特殊用途,比较少用。 目前绝大部分的HPLC分析和分离材料都是在几种主要基质材料上衍生而来的。按基质的不同,填料主要可分为三大类,即以二氧化硅为代表的无机基质填料、以交联聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸酯为代表的合成高分子填料、以葡聚糖为代表的天然碳水高分子改性填料。在高效液相分析领域,二氧化硅(硅胶)及硅胶键合分离填料是应用历史最悠久、也是最为广泛的高效液相色谱柱填料,而合成高分子填料和天然高分子改性填料主要用于现代生物制药工业色谱分离纯化。 4)发展简况 据统计,硅质填料在色谱分析填料家族的应用方面占80%左右。硅胶除了具有良好的机械强度、容易控制的孔结构和比表面外,一个突出的优点就是其表面含有丰富的硅羟基,这是硅胶可以进行表面化学键合和改性的基础, 因此硅胶填料装填的色谱柱柱效高,分辨率高,可用于高效液相色谱分离。早期的硅胶是无定型的二氧化硅颗粒(图2),主要是通过碾磨块状硅胶, 然后通过筛分制备而成。这种色谱填料装成的柱子柱效低,稳定性和重复性,适用于较粗分析和分离。HPLC技术取得极大的进步是得益于球形硅胶的出现(图3), 尤其是小粒径的球形硅胶(粒径 在采用多孔二氧化硅微球作为色谱分离和分析材料的性能时,一般由其粒径大小、粒径分布、孔径,以及表面功能基团等决定。一般来说,粒径越小, 柱效越高, 分辨率也越高,但反压也越高.因此用于工业制备的色谱填料颗粒往往在10微米以上, 常规HPLC色谱柱硅胶填料粒径在3-5微米之间, 而用于UHPLC 的色谱填料在2微米以下。在其它条件相同的情况下, 粒径分布越窄, 柱效越高, 反压也越低, 重复性越好,粒径越小的色谱填料对粒径的均匀性要求越高。目前工业球形多孔氧化硅微球主要用溶胶一凝胶法 (So-Gel)和喷雾干燥法制得。这两种方法适合于大工业制备各种尺寸大小的球形硅胶, 但制备的粒径分布宽, 不能直接满足色谱填料的需求,产品需要进行复杂的分级工艺去除大小不合格的硅胶。 国外大规模生产硅胶色谱填料的主要厂家是瑞典的Kromasil、日本大曹(Daisol)和富士公司 (Fuji)。近几年硅胶色谱填料的研制及产业化在国内进展也非常快,下面介绍一下作者经过调查所了解的、值得读者们高兴和骄傲的,部分国产色谱柱填料的研发情况,供大家参考。 我国月旭科技(上海)股份有限公司正在大力发展色谱柱和色谱填料研究和生产,年销售各种色谱柱达到4万根以上。月旭科技2005年开始从事色谱相关的业务,14年来在色谱领域坚持自主研发和自主生产自己的品牌,先后推出了包括Ultimate® 、Xtimate® 、Welchrom® 、Topsil® 和Boltimate® 等多个品牌的色谱柱及色谱填料产品,为广大客户提供色谱分离分析技术、产品和整体解决方案。 特别值得一提的是,月旭科技打破进口品牌的壁垒,在色谱填料的研发和色谱分离分析方法开发已经达到国内领先、国际先进的水平。据悉,目前月旭开发的色谱柱填料超过百余种,在医药、食品和环境检测方面的应用超过5000个,并且已经有19款被列入美国USP-PQRI数据库。 苏州纳微科技股份有限公司利用独有的专利技术制备出均粒、高纯、全孔硅胶色谱填料(UniSil™ 系列),突破了单分散二氧化硅制备技术难题。该填料具有精确的粒径尺寸和高度均匀的粒径分布,是目前色谱技术应用的理想填料之一。纳微科技生产的高质量,高性能,种类齐全的硅胶基质色谱填料(图5)。常规硅胶色谱填料粒径大小分别有2、3、5、8、 10、 15、 20、 30、40、 50μm 常规孔径可选择0.1nm,、0.12nm 、 0.17nm 、 0.3nm 、0.5nm。该填料具有机械强度高、柱效高、分辨率高和反压低等特点,并已广泛应用于有机化合物及中性分子的分析和大规模生产制备。图5 纳微系列单分散多孔超纯硅胶色谱填料扫描电镜图 纳微科技的UniSil™ 硅胶介质的特点如下: (1)球形粒径高度均一:这一特点,会带来装柱容易、装好的色谱柱高分辨率 (2)优化的孔径结构:可以带来高载量,高选择性 (3)良好的封尾 这是一个很重要的特点,它可以使色谱柱耐碱性好,使用寿命长 (4)无泄漏、无碎片 产品洁净,甚至可以延长色谱柱的寿命等等 纳微科技研发的色谱填料,突破了很多难关,取得了具有完美的球形和高度的粒径均一性,相对市场上粒径分布较宽的填料而言,具有装柱容易、反压低、柱效高、柱床稳定、分辨率高、流速均匀、柱通透性好等优点。同时,无碎片、无小颗粒的纳微填料也可避免筛板堵塞等问题。纳微UniSil硅胶填料与国外进口产品的扫描电镜对比如图6所示。图6 纳微UniSil硅胶填料与国外进口产品的扫描电镜对比图 纳微科技公司生产的色谱填料与国内外生产的一般色谱柱填料相比较,具有粒度均匀等优点。其粒径分布与流速特征关系图如图7所示:图7 国内外一般的色谱填料 纳微科技优质色谱填料 如图7所示:由于纳微科技色谱填料具有完美的球形和高度的粒径均一性(右图),所以,具有装柱容易、反压低、柱效高、柱床稳定、分辨率高、流速均匀、柱通透性好等优点。同时,无碎片、无小颗粒的纳微填料也可避免筛板堵塞等问题。 国内外开展色谱填料研发的企业还有很多,有的公司已经达到了很高的水平。但是因为篇幅所限,作者不可能在一篇文章中一一介绍,恳求广大读者谅解。 5)硅胶色谱填料的发展趋势 第一代,无定型硅胶色谱填料:1960年前后,国内大规模生产,但是形态不规则、粒径大小不可控、粒径分布宽、孔径分布宽、容易破碎、柱效低、金属杂质高、柱床不稳定、重复性差、使用寿命短、线性流速不均、适用于粗慥的分析工作。 第二代,多分散球形硅胶色谱柱填料:1980前后,国外垄断、国内空白、形态(球型)粒径大小不精确、粒径分布较宽、孔径分布窄、柱床较稳定、不容易破碎、重现性较好、金属杂质低、产品使用寿命长、线性流速较均、可以满足各种高效分离要求。 第三代,单分散球形硅胶色谱柱填料:2010以后,中国纳微独家生产、形态(完美球型)粒径精确可控、粒径分布极窄、孔径分布窄、柱床极稳定、不容易破碎、柱效高、重现性好、金属杂质低、产品使用寿命长、线性流速非常均匀、分离效率更好。 目前中国纳微公司的色谱柱填料总体上可以说国际领先水平。 3、色谱分离柱填料的最新进展 目前,色谱分离柱还是以硅胶填料为,但是各种新型的填料也在不断涌现。因篇幅所限,本文重点简介具有代表性的核壳柱的进展情况: 3.1、核壳HALO色谱填料问世 新型的核壳型(core-shell)色谱填料是Jack Kirkland 于2006年研制成功。它将多孔硅壳熔融到实心的硅核表面。它的多孔的环状颗粒具有极窄的粒径分布和扩散路径,能同时减小轴向和纵向扩散,可以允许使用更短的色谱柱和较高的流速以达到快速、高分辨率分离。核壳HALO色谱填料的问世,是近50年来色谱填料进展的重大突破,对液相色谱仪器及其应用将产生巨大影响。 3.1.1、核壳HALO填料的结构 实心球:无孔硅胶,粒径大小1.7 µm左右 壳层:纳米级硅胶颗粒,厚度为0.5 µm 外表层可键合不同功能基团,以满足不同分离模式的分离要求。 3.1.2、HALO柱填料的端基封口[3]、[4] 端基封口非常重要,要求封口残余硅羟基,防止柱内不要的化学反应发生,减少不可逆吸附或防止峰拖尾,增加碳含量(0.1-1.0%),提高柱性能。 常用封尾试剂:三甲基氯硅烷 由于空间位阻的存在,键合反应最多只能覆盖50%的硅羟基, 超过一半硅羟基是活性硅羟基,与碱性基团会发生离子交换作用,增加了保留,导致峰形拖尾,用短链氯硅烷(如三甲 基氯硅烷)键合活性的硅羟基,可以减小拖尾,增加硅胶的化学稳定性,延长使用寿命。但不是所有的分离纯化都需要完全封端,在一些场合未封端的硅胶填料由于有硅羟基的存在,反而增强选择性和分离度。反应条件及硅胶表面性能是影响封端的重要因素。 3.1.3、核壳结构色谱填料的特点 核壳型(core-shell)色谱填料是将多孔硅壳熔融到实心的硅核表面而制备的,这些多孔的“光环”状颗粒具有极窄的粒径分布和扩散路径,可以同时减小轴向和纵向扩散,允许使用更短的色谱柱和较高的流速以达到快速、高分辨率分离。 国产Boltimate® 核壳色谱柱的硅胶颗粒粒径是2.7μm,它是由1.7μm直径的实心核与0.5μm厚的多孔层所构成的[3]。这种核壳型的硅胶颗粒提供了较短的传质路径,减少了轴向扩散,而实心核硅胶提供坚固的支撑结构,可以承受高压,具有与1.8 μm填料相似的分离效率,且柱反压只有sub-2μm色谱柱的50%和明显的抗污染性能。由于实心核的存在,以及薄的多孔层,使得样品分子的扩散距离减小,即可以使用更高的流动相流速,极大的提高了分析速度。 3.1.4 关于核壳柱的指标等有关问题,作者已经在仪器信息网(2020-08-21)上讨论过了。此不赘述,请读者自己查阅。 3.2. 体积排阻色谱填料 体积排阻色谱填料的推出,是色谱填料的重要进展之一。体积排阻色谱(Size exclusion chromatography,SEC)是一种完全按照溶质分子在流动相溶剂中的分子尺寸大小分离的色谱法,是一种非常重要的分离分析生物大分子如蛋白质、多肽、生物酶的工具。其分离原理如下:体积排阻填料具有一定孔径分布,当具有不同尺寸的目标物分子进入体积排阻色谱柱时,分子量很大的分子无法进入填料内部孔中,因此最先被洗脱下来 分子量相对较小的分子能够进入一部分填料内部孔中,因此随后被洗脱下来 分子量很小的分子则能够进入到填料的所有内部微孔中,因而其洗脱体积接近色谱柱的柱体积。根据洗脱体积的不同,可实现各组分之间的有效分离。体积排阻色谱填料通常是具有适合一定孔径的球形硅胶基质填料,由于它具有良好的机械强度及具有极高的分离纯化效率,在生物大分子的分离分析领域广泛使用。 国产的Xtimate® SEC填料是在超高纯全多孔硅胶表面包覆一层具有良好稳定性的亲水性聚合物的体积排阻色谱填料,其填料的作用基团为二醇基,填料表面因受二醇基官能团保护而不与蛋白质相互作用,使得蛋白、生物酶、多肽等样品的非特异性吸附极小,因而广泛应用于生物大分子的分离。 3.3 改进型的3微米新型核壳型HALO色谱柱填料 福立仪器利用公司的专利技术,采用改进的3微米的新型核壳型色谱柱填料,使HPLC系统压力降低到常规HPLC范围,解决了亚2微米分析柱的不足,保证了UPLC超高效的分离分析结果的同时,降低了柱压,仪器的理论塔板数与采用亚2微米的全多孔型柱效相同,但是压力只有其1/2左右。这种改进对HPLC分离柱的发展及应用,将起到重要作用。 3..4 稀有填料(如微米球形金颗粒)的出现,也是色谱柱发展中值得注意的问题,可能会对色谱柱的发展带来新机。 下图是一种微米球形金颗粒填料:(摘自:J. Chromatogr. A, 1198-1199, (2008), 95-100.) 随着以人类健康、生物工程为核心的生命科学、环境科学及制药、合成化学的迅猛发展,人们对HPLC也将不断提出更高、更新、更多的要求。各种色谱柱及其填料将会有更大的发展、各种新型的色谱柱也将不断涌现。有关HPLC色谱分离柱及其填料的发展非常快,开展研发HPLC色谱分离柱及其填料研究与开发的单位很多,例如迪马公司等等,因篇幅所限,本文不能一一列举,希望大家谅解。 4、讨论 从仪器学理论[5]和实际情况来看,HPLC系统是一个比较复杂的、高科技系统,由高压恒流泵、色谱柱、检测器三大部分组成。还有数据处理、智能化等部分,都涉及到很多学科。本文只是讨论了色谱柱的填料,但是建议读者们一定要将色谱填料和色谱柱联合起来考虑。建议有关企业应该引起重视,若要真正研发出优质色谱填料和色谱柱,还必须把它们与HPLC系统联合起来考虑。从整体来看,作者认为如果全世界的科技工作者能将泵、柱、检测器、应用联合起来考虑(研发),则还可以大大加快HPLC仪器及其应用的发展的速度。所以,作者建议我国的有关科技人员联合起来,为发展我国的民族分析仪器、发展国产品牌的HPLC系统、提高有关的应用水平、赶超HPLC领域仪器和应用的国际先进水平共同努力奋斗。 5、主要参考文献 [1]李昌厚,高效液相色谱仪器及其应用,北京:科学出版社,2014. [2]李昌厚,高效液相色谱仪器及其最新进展和有关问题,2019年,仪器信息网.,2019-11-07 [3]江必旺,硅胶色谱填料制备技术最新进展,2020年7月14日,仪器信息网第五届色谱网络会议(iCC2020) [4]闫超,液相色谱及其应用的最新进展,“我国科学器自主创新发展”论坛,2012年8月23日,上海。 [5]李昌厚,仪器学理论与实践,北京:科学出版社,2008 [6]李昌厚,用好HPLC的九大关键问题,仪器信息网,2020/2/26 [7]李昌厚,色谱分离柱主要技术指标及有关问题的探讨,仪器信息网,2020/8/21 作者简介 李昌厚,男,中国科学院上海生物工程研究中心原仪器分析室主任、兼生命科学仪器及其应用研究室主任、教授、博士生导师、华东理工大学兼职教授,终身享受国务院政府特殊津贴。 主要研究方向:长期从事分析仪器研究开发和分析仪器应用研究。主要从事光谱仪器(紫外吸收光谱、原子吸收光谱、旋光光谱、分子荧光光谱、原子荧光、拉曼光谱等)、色谱仪器(液相色谱、气相色谱等)及其应用研究 特别对《仪器学理论》和分析仪器招标检测等有精深研究;以第一完成者身份,完成科研成果15项。由中科院组织专家鉴定,其中13项达到鉴定时国际上同类仪器的先进水平,2项填补国内空白;以第一完成者身份获得国家级和省部级科技成果奖5项(含国家发明奖1项);发表论文183篇,出版专著5本;现任中国仪器仪表学会理事、《生命科学仪器》副主编 曾任中国仪器仪表学会分析仪器分会第五届、第六届副理事长 国家认监委计量认证/审查认可国家级常任评审员、国家科技部“十五”、“十一五”、“十二五”和“十三五”重大仪器及其应用专项的技术专家组成员或组长、上海市科学仪器专家组成员、《光学仪器》副主编、《光谱仪器与分析》副主编、上海化工研院院士专家工作站成员等十多个学术团体和专家委员会成员等职务。