液相色谱峰型分析

我们用的是安捷伦1100的高效液相色谱仪，在做一个软膏剂的时候，标准规定的浓度进样10μl，峰形有前延峰，把浓度稀释一半，进样10μl，峰的对称性在1.0左右，如果再把浓度稀释一半，进样20μl的话，峰形又不对称了。大家分析一下是什么原因？液相色谱的进样量与峰形之间的关系怎样？（药品名字是“复方地塞米松乳膏”，内标法测定地塞米松含量，内标物是甲睾酮）

请问有没有在分析型的高效液相色谱上配的自动馏分收集器，Waters的液相色谱。

液相色谱分析条件的选择字体: 小 中 大 | 打印 发布: 2010-09-14 14:46:32 来源: 上海禾工科学仪器有限公司 在液相色谱分析过程中，我们经常遇到的问题主要有二种，一种与液相色谱仪器本身因素有关，如液相色谱的阀门、混合器、检测器的光源以及其它的一些硬件设备。出现这类问题后，如果能找出问题根源，解决起来一般很简单，而且这类问题可以通过对仪器的精心维护来避免;而另一类问题则是分析方法本身造成的问题，如出现色谱峰形状不好、峰与峰之间不能分开、基线飘移等等。不幸的是，如果出现这类问题，看起来似乎很明显，但是要找出原因并解决这类问题却非常困难。为了减少出现这一类型的问题，就必须在分析之前，仔细研究并选择一个好的分析方法，有了一个好的分析方法，就很容易获得理想的分离效果，而且在出现问题是也很便于找出原因。要选择一个好的分析方法，就必须对液相色谱分析的一些基本原则要有一个很深的了解。下面是我们实验室对色谱分析人员进行技能培训的一些基本知识。　　一：分析方法选择的基本原则　　假如你想做一顿丰盛的晚餐，首先必须看一下食谱，然后检查一下你所需的东西是否齐全，如果少了配料还必须去商店购买，这样你才可能做出一顿可口的晚餐。同样进行液相色谱分析时，也必须按照一定的程序进行，首先你必须要有专门的仪器和试剂，然后有目的地选择分析方法，这样你才可能得到好的分析结果，避免走一些弯路。　　二：柱子的选择　　在液相色谱分析方法中最重要的就是色谱柱的选择，色谱分析人员面对几百种色谱柱，你从何入手呢?我采取的方法就是订阅 LCGC亚太版中RonMajors 的“色谱柱观察”这一专栏，自1984（1）年以来，RonMajors在这一专栏中介绍许多新柱子、色谱柱新技术、色谱柱使用方法等方面的信息。　　现在大部分液相色谱分析都是使用反相液相色谱柱，其中以C18 和C8柱最为流行。然而色谱分析并不是流行歌曲，这两种色谱柱之所以运用广泛是因为在大多数情况下，使用这两种柱子都能获得理想的分离效果。尽管一些样品的分离并不是这两种柱子（如表一所示），但[font=

在液相色谱分析过程中，我们经常遇到的问题主要有二种，一种与液相色谱仪器本身因素有关，如液相色谱的阀门、混合器、检测器的光源以及其它的一些硬件设备。出现这类问题后，如果能找出问题根源，解决起来一般很简单，而且这类问题可以通过对仪器的精心维护来避免;而另一类问题则是分析方法本身造成的问题，如出现色谱峰形状不好、峰与峰之间不能分开、基线飘移等等。不幸的是，如果出现这类问题，看起来似乎很明显，但是要找出原因并解决这类问题却非常困难。为了减少出现这一类型的问题，就必须在分析之前，仔细研究并选择一个好的分析方法，有了一个好的分析方法，就很容易获得理想的分离效果，而且在出现问题是也很便于找出原因。要选择一个好的分析方法，就必须对液相色谱分析的一些基本原则要有一个很深的了解。下面是我们实验室对色谱分析人员进行技能培训的一些基本知识。　　一：分析方法选择的基本原则　　假如你想做一顿丰盛的晚餐，首先必须看一下食谱，然后检查一下你所需的东西是否齐全，如果少了配料还必须去商店购买，这样你才可能做出一顿可口的晚餐。同样进行液相色谱分析时，也必须按照一定的程序进行，首先你必须要有专门的仪器和试剂，然后有目的地选择分析方法，这样你才可能得到好的分析结果，避免走一些弯路。　　二：柱子的选择　　在液相色谱分析方法中最重要的就是色谱柱的选择，色谱分析人员面对几百种色谱柱，你从何入手呢?我采取的方法就是订阅 LCGC亚太版中RonMajors 的“色谱柱观察”这一专栏，自1984（1）年以来，RonMajors在这一专栏中介绍许多新柱子、色谱柱新技术、色谱柱使用方法等方面的信息。　　现在大部分液相色谱分析都是使用反相液相色谱柱，其中以C18 和C8柱最为流行。然而色谱分析并不是流行歌曲，这两种色谱柱之所以运用广泛是因为在大多数情况下，使用这两种柱子都能获得理想的分离效果。尽管一些样品的分离并不是这两种柱子（如表一所示），但 C18和C8经常是最好的固定相，C18和C8柱两者之间并无明显的差别，但在我们实验室中以常使用的是C8柱。　　色谱分析人员遇到的多数样品需要利用反相色谱柱进行分析，但一些样品可能需要其它的分析技术才能成功地分离，这些样品及分离方法在表一中作了简要的叙述，在以后的章节中将进一步阐述。　　表一：样品及分析方法[color=bla

这段时间，在做液相色谱分析时，峰面积重现性不好，是什么原因导致的，我用的是外标法。

液相色谱出峰，拖尾因子在0.95-1.05范围内，但峰型矮胖，峰宽达到2.5左右，减小进样体积至5ul，有所改善，也换过流动相，换了两次色谱柱，峰宽还是很宽，可以再从哪些方面改善？

[color=#444444]对一种植物里面的黄酮成分进行液相分析，有几个大峰不知道是什么，可以通过[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质联用[/color][/url]进行打质谱然后解谱分析确定那几个大峰吧？[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质联用[/color][/url]的出峰顺序和我当时液相色谱分析时的出峰顺序会有变化吗？而且我做[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质联用[/color][/url]时的条件直接用液相色谱条件就可以吗？[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质联用[/color][/url]的流动相和液相色谱的流动相一样吗？[/color]

[color=#444444]我目前在对一种植物里面的黄酮成分进行液相分析，有几个大峰不知道是什么，可以通过[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质联用[/color][/url]进行打质谱然后解谱分析确定那几个大峰吧？[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质联用[/color][/url]的出峰顺序和我当时液相色谱分析时的出峰顺序会有变化吗？而且我做[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质联用[/color][/url]时的条件直接用液相色谱条件就可以吗？[/color]

液相色谱仪检测器（分析型）的流通池体积一般是多少？大家都用什么型号的液相色谱仪，其检测器流通池体积（分析型）是多少？

[color=#444444]在做环己烷空气氧化制己二酸的实验[/color][color=#444444]产物的分析，丁二酸、戊二酸、己二酸 须由液相色谱检测[/color][color=#444444]由于杂峰太多，所以要求峰型好，易分离。[/color][color=#444444]可现在峰型不好，我怀疑是流动相的问题[/color][color=#444444]现在的流动相：[/color][color=#444444]甲醇-水溶液，千分之一甲酸。[/color][color=#444444]请问各位高人，如何改善峰型？[/color][color=#444444]流动相是否需要缓冲溶液，如果需要，该如何调配？[/color]

TNT经Fenton氧化后为什么用液相色谱分析时峰是乱的

“核壳型填料液相色谱柱以其尖锐的峰型，快速的分析速度和低使用压力受到广大高速高通量液相分析用户的喜爱。”你知道什么叫核壳型填料吗？

在液相色谱分析过程中，我们经常遇到的问题主要有二种，一种与液相色谱仪器本身因素有关，如液相色谱的阀门、混合器、检测器的光源以及其它的一些硬件设备。出现这类问题后，如果能找出问题根源，解决起来一般很简单，而且这类问题可以通过对仪器的精心维护来避免;而另一类问题则是分析方法本身造成的问题，如出现色谱峰形状不好、峰与峰之间不能分开、基线飘移等等。不幸的是，如果出现这类问题，看起来似乎很明显，但是要找出原因并解决这类问题却非常困难。为了减少出现这一类型的问题，就必须在分析之前，仔细研究并选择一个好的分析方法，有了一个好的分析方法，就很容易获得理想的分离效果，而且在出现问题是也很便于找出原因。要选择一个好的分析方法，就必须对液相色谱分析的一些基本原则要有一个很深的了解。下面是我们实验室对色谱分析人员进行技能培训的一些基本知识。　　一：分析方法选择的基本原则　　假如你想做一顿丰盛的晚餐，首先必须看一下食谱，然后检查一下你所需的东西是否齐全，如果少了配料还必须去商店购买，这样你才可能做出一顿可口的晚餐。同样进行液相色谱分析时，也必须按照一定的程序进行，首先你必须要有专门的仪器和试剂，然后有目的地选择分析方法，这样你才可能得到好的分析结果，避免走一些弯路。http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/brow/em09510.gif

现我有一样品！用高效液相色谱对其进行分析！但出峰较晚！流动相用95％甲醇5％（0.02M磷酸盐缓冲液），出峰时间在8分钟，但峰型很差！请求大家帮帮忙好不好？帮我想想有没有其它的办法呢？！先谢了哦！

AKATA制备型液相色谱蛋白分析仪纯化蛋白步骤很简单的，比较适合初学者。[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=113913]AKATA制备型液相色谱蛋白分析仪纯化蛋白步骤[/url]

中药是一个典型的复杂未知样品,其化学物质基础的阐明是中药现代化的关键科学问题之一。液相色谱是中药分析中应用最普遍的技术,也是进一步与质谱、核磁共振等联用的基本分离手段。本论文在总结了中药复杂体系的特点和分析中需要解决的问题后,提出了中药分析的思路,开展了线性梯度下的液相色谱保留值规律、峰形规律的研究,发展了快速获取液相色谱保留参数、峰形参数的方法,从而将未知样品快速转化为色谱已知样品。并以实际样品藏茵陈和黄芪为例,应用发展的方法建立了相应的液相色谱参数数据库,提供中药活指纹图谱的信息基础。同时,面向实际应用,发展了中药组分的目标优化方法。建立了液-质联用表征黄芪皂甙的方法,建立了高效液相制备色谱快速制备黄芪组分的方法并初步发现了具有诱导分化白血病细胞的组分。发展了用五次线性梯度快速、准确地获取液相色谱保留值方程的方法。以线性梯度a、c 值预测任意梯度下的溶质的保留时间,并发展了基于内标峰的校正方法。应用于藏茵陈和黄芪样品的色谱保留参数获取,对c-a 关系进行了考察。基于EMG模型和自动曲线拟合技术,首次建立了以线性梯度快速获取液相色谱液相色谱峰形参数和峰形规律的方法。以线性梯度峰形规律预测了任意梯度条...[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=31320]中药高效液相色谱分析方法发展的理论基础研究[/url]

[align=center]高效液相色谱组分定性分析方法简述[/align]1、保留时间对照法（1）外标对照法 即在相同的色谱条件下，分别进样品溶液与高纯度的单一组分对照品溶液，这里推荐先进样品溶液，确定系统适应性没有问题了再进对照品溶液，对比两组分的保留时间，一般保留时间相对差异在5%以内，同时绝对误差在0.1min以内的认定为同一个物质，但仍遵守“同一组分保留时间肯定一样，但保留时间一样不一定是同一组分，保留时间不一样的肯定不是同一组分”的原则。（2）标准加入法 即在相同的色谱条件下，将高纯度的对照品加入样品溶液中再上机检测，与相同浓度未加对照品的样品溶液比较，峰高或峰面积应呈等比例增加的，可认定为是同一物质。此法比较适用于组分比较复杂，邻近有干扰组分峰时。上述方法尽量使用柱效高或长柱，峰高尽量小一些，甚至可以小到定量限浓度，一些在高响应下是单个峰的，在低响应时可能是两个峰，所以一定要注意峰形，只要峰形与对照品不一致，就要怀疑不是同一个物质。再严谨一点，还可以改变流动相组成、色谱柱、柱温等，样品中的组分峰应与对照品的组分峰有相同的变化。2、利用检测器选择性进行鉴别（1）DAD检测器波长扫描法 对于配有DAD检测器的还可以对比三维扫描图谱和峰纯度计算进行辅助定性。如果没有配DAD检测器，但有具波长扫描功能的可变波长检测器的，可以使用停泵扫描功能，查看扫描图谱进行鉴别。（2）质谱检测器鉴别法 该方法适用于联用有质谱分析仪的高效液相色谱仪，通过比较碎片峰进行比较鉴别。3、破坏法 将物质进行化学破坏，可以是酸、碱降解，也可以是衍生后再进行检测，看组分峰的变化。当然，此方法不适用于组分复杂的样品。

对于LC-MS/MS色谱柱人们的惯性思维通常是由反相液相色谱柱开始研发, 产生这种惯性思维是因为常规高效液相色谱分析中C18等反相高效液相色谱柱占有统治地位,另一方面是色谱公司不懂LC-MS/MS分析误导用户的结果。这惯性思维是不正确的! LC-MS/MS分析的实用战略和HPLC有很大不同! LC-MS/MS分析的方法的选择性最重要! 色谱公司不能简单地将现成的反相液相色谱填料装成5cm x 2.1mm短柱充当LC-MS/MS柱使用, 但事实上几乎所有色谱公司都是这样做的。这样的反相液相色谱LC-MS/MS柱有三个明显的弱点:(1) 许多极性化合物难以保留，质谱灵敏度差。 许多重要的物质，如抗癌药物DTIC, 抗痛药物河豚毒素，污染物质三聚氰胺, 中草药中糖肽等非常极性, 在反相液相色谱柱上没有保留。还有许多的化合物比较极性, 使用少量的甲醇或乙腈就从反相液相色谱柱上洗脱。在药物代谢研究中, 观察到许多化合物自己疏水, 但代谢产物亲水的情况。甲醇或乙腈含量低, 离子化程度低, 质谱灵敏度差。所谓水相C18柱在LC-MS/MS分析中没有价值。(2) 用常规反相色谱填料装成2.1mm内径的色谱柱在LC-MS/MS和LC/MS应用中常陷入记忆效应（Carryover Effect）的“陷阱” LC-MS/MS和LC/MS应用中另一个重大问题是记忆效应（Carryover Effect）。记忆效应是指在进样后, 再进一针空白在同样的保留时间仍然观察到化合物峰。记忆效应的副作用是明显的: 它可能人为地增加下一样本的MRM信号, 影响定量分析的精密度和准确度。US FDA Bioanalytical Regulatory Guidances限制最高校准标准(highest calibration standard) 的记忆效应不能超过20 ％最低校准标准(lowest calibration standard)MRM信号的20%。 由于大部分色谱公司都使用现成的反相液相色谱填料简单地装成5cm x 2.1mm短柱充当LC-MS/MS柱, 在许多情况下，使记忆效应强, 校准标准曲线范围必须人为缩短, 或不得已在进样后, 再进一针甚至两针空白最小化记忆效应, 然后进下一个样品。所有这些严重地降低了生产效率。(3) 峰形拖尾或扭曲 因为活性硅醇基无法完全封闭, 许多碱性化合物在几乎所有色谱公司的Cogent Diamond Hydride反相液相色谱柱上面有明显的峰形拖尾。这种峰形拖尾是记忆效应的一个重要的根源。另一方面，使用不正确方法过分封闭致使一些酸性和两性化合物分离效果不佳, 特别是出现峰失真和分裂现象。 专家认为LC-MS/MS色谱柱和色谱方法的第一选择是亲水色谱(HILIC或)! 亲水色谱使用乙腈作为弱溶剂和水为强溶剂, 彻底解决质谱灵敏度差, 记忆效应等问题。疏水化合物首先流出, 然后是亲水化合物。不仅彻底解决极性化合物难以保留的问题, 而且同时分析了疏水化合物, 也提高了疏水化合物质谱灵敏度。峰形拖尾问题也获得彻底解决。此外，乙腈提取液不需要蒸发和重新溶解，从而节省了大量的时间。另一方面, 反相LC-MS/MS色谱柱和色谱方法仍然重要, 不仅是一些重要的中性化合物如抗癌药物紫杉醇, 抗免疫器官植入药物FK 506和雷帕霉素(rapamycin), 降脂药等必须使用反相LC-MS/MS色谱柱和色谱方法, 还因为大多数客户习惯于反相LC-MS/MS色谱柱和色谱方法。即使这样反相液相色谱填料也必须通过处理才能装成5cm x 2.1mm短柱充当LC-MS/MS柱使用。

问题: 请问 正相液相色谱 峰型前拖尾 应该怎么解决[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/05/201705220745_01_3114888_3.jpg[/img]

液相色谱对样品定量分析，偶尔有一针标样的峰面积不重现液相色谱对样品进行定量分析，在进样的过程中，为什么偶尔会出现一针标样的峰面积不重现呢？

w 液相色谱峰拖尾分析从色谱柱分离机理角度 造成拖尾的原因多数是因为要分离的化合物是碱性的。 硅胶表面的硅羟基 pKa 值是2-3， 也就是当流动相的 pH 值大于这个值，硅羟基就会解离，这时这个氧带的外层电子对碱的吸 附是特别强的，很多人知道硅羟基对碱性物质吸附，解决办法：应选择封尾的柱子，但是即 使封尾，不管工艺怎么好，都不会是100%能封住。那么就争取从 pH 值角度考虑，减小流 动相 pH，或者说加三乙胺，三乙胺容易被这个解离的硅羟基吸附，其实作用相当于对色谱 柱封尾。 从流动相的角度 用甲醇做碱性物质要相对比乙腈好，因为甲醇含有-OH，多少能抑制硅羟基解离，加缓冲盐 的目的也是抑制硅羟基解离。 所以说种种方法都是抑制硅羟基解离或竞争吸附， 尽量减少解 离的硅羟基对碱性物质的吸附。 前沿峰图 非常有可能是色谱柱的硅胶溶解造成的。 前沿峰还有可能是由溶解性效应引起， 就是溶解样 品的溶液对样品的溶解性远大于流动相。 现在市场上有种色谱柱经过表面处理之后残留的硅 羟基 pKa 值能达到5.5-6我不说哪家生产的，用这种柱子做你的流动相 pH 控制在5.5以下拖 尾的效果非常好， 另外建议做碱性化合物时选择色谱柱尽量选择比表面积小， 含碳量低些的 色谱柱，效果会好。 A、 峰拖尾 、 1、筛板阻塞(a、反冲色谱柱 b、更换进口筛板 c、更换色谱柱) 2、色谱柱塌陷(填充色谱柱) 3、干扰峰(a、使用更长的色谱柱 b、改变流动相或更换色谱柱) 4、流动相 PH 选择错误 (调整 PH 值。对于碱性化合物，低 PH 值更有利于得到对称峰) 5、样品与填料表面的溶化点发生反应(a、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂 b、换柱子) B、 峰前延 、 1、柱温低(升高柱温) 2、样品溶剂选择不恰当 (使用流动相作为样品溶剂) 3、样品过载 (降低样品含量) 4、色谱柱损坏 (见 A1、A2) C、 峰分叉 、 1、保护柱或分析柱污染图 (取下保护柱再进行分析。如果必要更换保护柱。如果分析柱阻 塞， 拆下来清洗。 如果问题仍然存在， 可能是柱子被强保留物质污染， 运用适当的再生措施。 如果问题仍然存在，入口可能被阻塞，更换筛板或更换色谱柱。) 2、样品溶剂不溶于流动相 (改变样品溶剂。如果可能采取流动相作为样品溶剂。) D、 峰变形 、 1、样品过载 (减少样品载量) E、 早出的峰变形 、 1、样品溶剂选择不恰当 (a、减少进样体积 b、运用低极性样品溶剂) F、 早出的峰拖尾程度大于晚出的峰 、 1、柱外效应(a、调整系统连接(使用更短、内径更小的管路) b、使用小体积的流通池) G、 K’增加时，脱尾更严重 增加时， 、 增加时 1、二级保留效应，反相模式(a、加入三乙胺(或碱性样品)b、加入乙酸(或酸性样品)c、加入 盐或缓冲剂(或离子化样品)d、更换一支柱子) 2、二级保留效应，正相模式(a、加入三乙胺(或碱性样品)b、加入乙酸(或酸性样品)c、加入 水(或多官能团化合物)d、试用另一种方法) 3、二级保留效应，离子对 (加入三乙胺(或碱性样品)) H、 酸性或碱性化合物的峰拖尾 、 1、缓冲不合适 (a、使用浓度50-100mM 的缓冲液 b、使用 Pka 等于流动相 PH 值的缓冲液) I、 额外的峰 、 1、样品中有其他组份 (正常) 2、前一次进样的洗脱峰 (a、增加运行时间或梯度斜率 b、提高流速) 3、空位或鬼峰 (a、检查流动相是否纯净 b、使用流动相作为样品溶剂 c、减少进样体积) J、 保留时间波动 、 1、温控不当 (调好柱温) 2、流动相组分变化 (防止变化(蒸发、反应等)) 3、色谱柱没有平衡 (在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱) K、 保留时间不断变化 、 1、流速变化 (重新设定流速) 2、泵中有气泡 (从泵中除去气泡) 3、流动相选择不恰当 (a、更换合适的流动相 b、选择合适的混合流动相) L、 基线漂移 、 1、柱温波动,即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测 器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。 (控制好柱子和流动相的温度，在检测 器之前使用热交换器图) 2、 流动相不均匀,流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。 (使用 HPLC 级的溶 剂，高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气，使用中使用氦气。) 3、流通池被污染或有气体 (用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要，可以用1M 的 硝酸。(不要用盐酸)) 4、检测器出口阻塞,高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线 (取出阻塞物或更换管子。参 考检测器手册更换流通池窗) 5、流动相配比不当或流速变化 (更改配比或流速,定期检查流动相组成及流速) 6、柱平衡慢，特别是流动相发生变化时 (用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在 分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗) 7、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成 (检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及 HPLC 级的溶剂) 8、 样品中有强保留的物质(高 K’值)以馒头峰样被洗脱出， 从而表现出一个逐步升高的基线。 (使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子) 9、使用循环溶剂，但检测器未调整(重新设定基线。当检测器动力学范围发生变化时，使用 新的流动相) 10、检测器没有设定在最大吸收波长处。(将波长调整至最大吸收波长处)柱头有空隙。解决 办法：使用填料或玻璃珠填充柱顶部 柱上样品超载。解决办法：使用更高负载量的固定相。增加色谱柱内径、减少样品量、 单峰- 存在干扰性组分。解决办法：净化样品；预分离 存在未扫的死体积。解决办法：减少接头的数量、确保进样器密封垫紧密、确保接头正 确固定 碱性化合物- 硅醇相互作用。解决办法：换成聚合物固定相 碱性基质- 硅醇相互作用。 解决办法： 使用更强的流动相或添加竞争碱 （例如， 三甲胺） 硅胶基- 柱降解。解决办法：使用特种色谱柱；聚合物柱或空间位阻 硅胶基- 柱降解。解决办法：使用特种色谱柱；聚合物柱或空间位阻+

制备型高效液相色谱系统的应用领域制备型高效液相色谱系统主要应用在植化、合成、制药、生物及生化等领域的产品的提取及纯化工作中。在不同的工作领域中，组份的提取和纯化量的差异是很大的。在生物技术领域中，酶的分离是微克级；在植化和合成化学领域中，为了鉴别未知成份并进行结构测定，需要得到一至若干毫克的纯品；在药品和医药学测试中，需要克级的标准品和对照品；在当今的工业级提纯中，制药成份往往需要千克级的提取。制备型高效液相的应用领域可以归纳在下表中。 成份量:所在领域 微克: 生物技术领域的酶的分离、生物学和生化学测试 毫克: 结构描述和特征鉴定，包括：生产中的副产品、生物矩阵的新陈代谢产物、天然产物 克级: 对照品（分析标准）毒物学分析所需组份：高纯品中的主要成份、副产品的分离提取 千克级:工业规模生产，活性成份，药物 制备方法的发展和扩大规模的计算　　在分析液相中色谱柱的典型进样量是微克级，甚至更低。样品量和固定相之比有的甚至小于1:100000。进样体积一般来说都大大小于色谱柱体积（小于1:100）。 在这种条件下，会达到很好的分离效果，峰形尖锐并且很对称。而在制备液相中，最大的区别就是超量进样。其结果，超量进样的方法和分析方法的放大将在下章内介绍。 吸附变化线　　分析液相的目的是给一种组份定性、定量。重要的色谱参数有溶解度、峰宽和峰的对称性。如果进样量越来越多，峰高和峰面积会增加，但峰的对称性和容量因子保持不变。如下图。 　 在分析液相中，最佳的峰形应是一条高斯曲线。峰的标准背离 бV 描述了其对称性和与高斯曲线的相似性。容量因子是与一种不保留物质的保留时间t0相关的保留时间。　 如果将超过一定量的样品注射进色谱柱，吸附变化线就会成非线性。这意味着峰形会变的不再对称，表现为严重的拖尾和容量因子的缩小。如下图。在制备液相中，这种效果称作浓缩超量进样。在一些情况中，根据进样量的增加，容量因子也相应变大，并造成很强的前峰。既然吸附变化线取决于组份的多少，那么液相色谱柱的载样能力就必须根据不同的制备液相实验来决定。 色谱柱载样和超量载样　　大样品量的纯化有两种可行的方法：分析系统的放大或色谱柱超量载样。分析系统的放大意味着使用直径更大的制备柱、更高的流速和根据色谱柱的长度增加进样量并保持样品浓度不变。峰形仍会保持尖锐而对称。这种方法需要大型的色谱柱和大量的溶剂来分离较少的样品，因此这种方法是不经济的。 因此色谱柱超量载样，暨在相同的分析条件下超量进样通常是一种很好的选择。使用色谱柱超量载样的方法，在分析柱上甚至可以进行毫克级的分离。但更大 量的样品分离就需要整个系统的放大。色谱柱超量载样可以通过两钟方法进行— 浓缩法和体积超载法。　在浓缩法中，样品的浓度会提高，但进样体积保持不变。容量因子k’降低，同时峰形从高斯曲线变为矩形。如下图。浓缩法超量载样只有在样品组份在流动相中具有良好的溶解性的条件下才有可能采用。 　　如果样品组份的溶解性很差，浓缩法超量载样不能使用。同时更多的样品体积注射到色谱柱中，这种技术称作体积法超量载样。超过一定的进样体积，峰高不变，但峰变宽并且呈矩形。在制备液相中浓缩法超量载样比体积法超量载样更受欢迎，因为可被分离的样品量更高。既然组份的溶解性通常是一个限制因素，所以两钟超量载样技术通常被结合起来使用。两种技术的概览浓缩法超量载样 　 体积法超量载样 取决于组份在流动相中的溶解性 　 取决于进样体积 吸附变化线的制备部分 　 吸附变化线的分析部分 生产效率决定于选择性 　 生产效率决定于制备柱直径 受固定相粒度大小的影响不大 　 需要小颗粒填料 方法的放大　浓缩法超量载样和体积法超量载样都会导致组份溶解性的降低。既然组份的分离需要一定的溶解性，那么在放大分析方法的时候，优化溶解性、特别是选择性就是一项很重要的工作。 　　因为选择性和超量载样潜力是相互依靠的，选择性的提高会提高一次运行中所分离的样品量，因此从分析方法到制备方法的放大和方法的优化需要三个步骤。 1. 优化分析方法的选择性。2. 在分析柱上进行超量载样。3. 放大到制备柱 制备型高效液相色谱的目的　　判断制备型高效液相色谱使用的结果有三个重要参数：产品的纯度、产量和生产效率。三个参数之间是相对独立的，因此很难同时使用这三个参数来优化制备型高效液相色谱方法。见图形6。 色谱图1显示在制备型高效液相色谱的使用中有很高的生产效率，但是两种组份的分离效果却是很差的。这种方法很可能得到两种组份的高纯品，但是产量和收率却是很低的。　 在色谱图2中峰有很好的分离，因此这种方法可以得到两种组份的高纯品和高产量，但是生产效率却很低。　 色谱图3中的情况是三个参数综合后得到的最优化的结果。峰在基线上被完全分开，这使得产品纯度、产量和生产效率都达到最高。　 在实际应用中，每个参数的重要性都是不同的。如为了进行活性或药物测试，某种组份必须被完全单独提取，那么组份的纯度是最重要的参数，产量和生产效率是其次的。如果某种合成中间体必须被纯化，并且需要有足够的量为下一步合成作准备，那么纯度就不是最重要的了。而生产效率在这种情况下就是个首先需要解决的问题，因为其直接关系到完成整个合成工作的进程和速度。同时产量也是很重要的，因为高价值组份的损失需要控制在最少的范围内。

老师打算让我将不健康粪样中的水溶物提取出来，直接上样跑；然后再和健康粪样跑的峰作比对，看看差异，然后再分析是什么差异。 这能行吗？液相色谱分析不是有针对性的吗？像这样笼统的跑可行吗？能分离出来吗？

[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=115288]LC—5000型液相色谱泵阀电路故障分析[/url]通过对美国瓦里安(Varian)公司生产的LC-5000型液相色谱仪泵阀控制信号故障分析,分别介绍各相关电路的组成及工作原理,并提供详细的检测与维修方法，很值得参考的

[color=#444444]乙酰丙酸用液相色谱进行分析时，如果用268nm检测只有一个峰，在215nm下检测会出现两个峰，且两个峰时间间隔有近2min，有哪位大神能帮解释一下这是为什么啊[/color]

在液相色谱分析过程中，我们经常遇到的问题主要有二种，一种与液相色谱仪器本身因素有关，如液相色谱的阀门、混合器、检测器的光源以及其它的一些硬件设备。出现这类问题后，如果能找出问题根源，解决起来一般很简单，而且这类问题可以通过对仪器的精心维护来避免；而另一类问题则是分析方法本身造成的问题，如出现色谱峰形状不好、峰与峰之间不能分开、基线飘移等等。不幸的是，如果出现这类问题，看起来似乎很明显，但是要找出原因并解决这类问题却非常困难。为了减少出现这一类型的问题，就必须在分析之前，仔细研究并选择一个好的分析方法，有了一个好的分析方法，就很容易获得理想的分离效果，而且在出现问题是也很便于找出原因。要选择一个好的分析方法，就必须对液相色谱分析的一些基本原则要有一个很深的了解。下面是我们实验室对色谱分析人员进行技能培训的一些基本知识。一：分析方法选择的基本原则假如你想做一顿丰盛的晚餐，首先必须看一下食谱，然后检查一下你所需的东西是否齐全，如果少了配料还必须去商店购买，这样你才可能做出一顿可口的晚餐。同样进行液相色谱分析时，也必须按照一定的程序进行，首先你必须要有专门的仪器和试剂，然后有目的地选择分析方法，这样你才可能得到好的分析结果，避免走一些弯路。

对于LC-MS/MS色谱柱人们的惯性思维通常是由反相液相色谱柱开始研发, 产生这种惯性思维是因为常规高效液相色谱分析中C18等反相高效液相色谱柱占有统治地位,另一方面是色谱公司不懂LC-MS/MS分析误导用户的结果。这惯性思维是不正确的! LC-MS/MS分析的实用战略和HPLC有很大不同! LC-MS/MS分析的方法的选择性最重要! 色谱公司不能简单地将现成的反相液相色谱填料装成5cm x 2.1mm短柱充当LC-MS/MS柱使用, 但事实上几乎所有色谱公司都是这样做的。这样的反相液相色谱LC-MS/MS柱有三个明显的弱点:(1) 许多极性化合物难以保留，质谱灵敏度差。 许多重要的物质，如抗癌药物DTIC, 抗痛药物河豚毒素，污染物质三聚氰胺, 中草药中糖肽等非常极性, 在反相液相色谱柱上没有保留。还有许多的化合物比较极性, 使用少量的甲醇或乙腈就从反相液相色谱柱上洗脱。在药物代谢研究中, 观察到许多化合物自己疏水, 但代谢产物亲水的情况。甲醇或乙腈含量低, 离子化程度低, 质谱灵敏度差。所谓水相C18柱在LC-MS/MS分析中没有价值。(2) 用常规反相色谱填料装成2.1mm内径的色谱柱在LC-MS/MS和LC/MS应用中常陷入记忆效应（Carryover Effect）的“陷阱” LC-MS/MS和LC/MS应用中另一个重大问题是记忆效应（Carryover Effect）。记忆效应是指在进样后, 再进一针空白在同样的保留时间仍然观察到化合物峰。记忆效应的副作用是明显的: 它可能人为地增加下一样本的MRM信号, 影响定量分析的精密度和准确度。US FDA Bioanalytical Regulatory Guidances限制最高校准标准(highest calibration standard) 的记忆效应不能超过20 ％最低校准标准(lowest calibration standard)MRM信号的20%。 由于大部分色谱公司都使用现成的反相液相色谱填料简单地装成5cm x 2.1mm短柱充当LC-MS/MS柱, 在许多情况下，使记忆效应强, 校准标准曲线范围必须人为缩短, 或不得已在进样后, 再进一针甚至两针空白最小化记忆效应, 然后进下一个样品。所有这些严重地降低了生产效率。(3) 峰形拖尾或扭曲 因为活性硅醇基无法完全封闭, 许多碱性化合物在几乎所有色谱公司的反相液相色谱柱上面有明显的峰形拖尾。这种峰形拖尾是记忆效应的一个重要的根源。另一方面，使用不正确方法过分封闭致使一些酸性和两性化合物分离效果不佳, 特别是出现峰失真和分裂现象。 专家认为LC-MS/MS色谱柱和色谱方法的第一选择是亲水色谱(HILIC或Cogent Diamond Hydride)! 亲水色谱使用乙腈作为弱溶剂和水为强溶剂, 彻底解决质谱灵敏度差, 记忆效应等问题。疏水化合物首先流出, 然后是亲水化合物。不仅彻底解决极性化合物难以保留的问题, 而且同时分析了疏水化合物, 也提高了疏水化合物质谱灵敏度。峰形拖尾问题也获得彻底解决。此外，乙腈提取液不需要蒸发和重新溶解，从而节省了大量的时间。另一方面, 反相LC-MS/MS色谱柱和色谱方法仍然重要, 不仅是一些重要的中性化合物如抗癌药物紫杉醇, 抗免疫器官植入药物FK 506和雷帕霉素(rapamycin), 降脂药等必须使用反相LC-MS/MS色谱柱和色谱方法, 还因为大多数客户习惯于反相LC-MS/MS色谱柱和色谱方法。即使这样反相液相色谱填料也必须通过处理才能装成5cm x 2.1mm短柱充当LC-MS/MS柱使用。