液相色谱分析含量

异稻瘟净水乳剂的液相色谱分析【摘要】：采用高效液相色谱法,使用Hypersil C18不锈钢柱,用紫外检测器在210nm波长下测定。以甲醇+水为流动相，该方法的标准偏差为0.2%，变异系数为0.40%，平均回收率98%以上。 异稻瘟净即异丙稻瘟净，属有机磷杀菌剂。主要干扰细胞膜透性，阻止某些亲脂几丁质前体通过细胞质膜，使几丁质的合成受阻碍，细胞壁不能生长，抑制菌体的正常发育。可用于防治水稻稻瘟病，水稻小球菌核病。异稻瘟净含量的测定，有气相色谱法（HG 3286-2002 异稻瘟净乳油等），鉴于水乳剂中有较大量的水存在，不适合采用气相色谱法，本方法使用反相高效液相色谱，外标法测定异稻瘟净有效成分含量，操作简便、快速，结果重现性好，定量准确。1 试验部分1.1 仪器与试剂、样品仪器：液相色谱仪，带可调波长紫外检测器；试剂：甲醇 （色谱纯) 、二次蒸馏水、异稻瘟净标准品(含量≥ 98%)。1.2 高压液相色谱分析条件色谱柱：Diamonsil C18（250mm×4.6mm (i.d.)) ；柱 温 ： 室 温 ；流动相：ψ（甲醇+水）=75+25 ；流速：0.8ml/min；紫外检测波长：210nm ；进样量：1 0 μl；保留时间：约6min。上述操作条件系典型操作参数，可根据不同仪器特点，对操作参数作适当调整，以期获得最佳效果。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/10/2015093010132619_01_1620630_3.jpg1 - 异稻瘟净 图1 异稻瘟净标准品的液相色谱图 http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/10/2015093010204207_01_1620630_3.jpg1 - 异稻瘟净 图2 异稻瘟净水乳剂的液相色谱图 2 试验方法2.1 标准溶液的配制准确称取异稻瘟净标准品约 0.1g（精确至0.0002g）置于50mL容量瓶中，用甲醇溶解，超声波振荡 10min后，冷却至室温，用流动相稀释至刻度，摇匀备用。用移液管准确移取1.0mL上述溶液于50mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。2.2 样品溶液的配制 称取含有效成分异稻瘟净试样约0.1g（精确至0.0002g），置于50mL容量瓶中，用甲醇溶解，超声波振荡 10min后，冷却至室温，用流动相稀释至刻度，摇匀。用移液管准确移取5.0mL上述溶液于50mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。2.3 测定在上述操作条件下，待仪器基本稳定后，连续注入数针标准溶液，待相邻两针的相对响应值变化小于1％时，按下列顺序进样分析：标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液。2.4 结果计算将测得的两针试样溶液以及试样前后的两针标样溶液中的异稻瘟净峰面积分别进行平均，以质量分数表示的异稻瘟净含量 X1按式（1）计算： A2·m1·P X1 = ———————— ……………………………… (1) A1·m2式中： A1 — 标样溶液中异稻瘟净峰面积的平均值； A2 — 试样溶液中异稻瘟净峰面积的平均值； m1 — 异稻瘟净标准品的质量，g； m2 — 试样的质量，g； P — 标准品中异稻瘟净的质量分数。3 方法精密度与回收率3.1 方法精密度 准确称取同一批50％异稻瘟净水乳剂5份，分别测定其中的有效成分，分析结果见表 1。表1 精 密 度 试 验 样 品 编 号12345称 样 量 g0.20110.19850.20150.21090.2089异稻瘟净 %50.150.650.250.450.2 平均含量： 50.3 % ，标准偏差：0.20% ，变异系数： 0.40 %3.2 方法回收率为验证本方法的可靠性，我们在已知含量的样品中，分别加入一定量的异稻瘟净纯品，然后按本标准测定其含量，所得到的测定值与理论值进行比较，得到回收率见表2。表2 回 收 率 试 验 样 品 编 号12345理论值 mg21.543.064.586.0107测定值 mg21.342.563.885.0106回收率 %99.0798.8498.9198.84[a

[color=#3e3e3e]在液相色谱分析过程中，我们经常遇到的问题主要有二种，一种与液相色谱仪器本身因素有关，如,液相色谱的阀门、混合器、检测器的光源以及其它的一些硬件设备。出现这类问题后，如果能找出问题根源，解决起来一般很简单，而且这类问题可以通过对仪器的精心维护来避免；而另一类问题则是分析方法本身造成的问题，如，出现色谱峰形状不好、峰与峰之间不能分开、基线飘移等等。不幸的是，如果出现这类问题，看起来似乎很明显，但是要找出原因并解决这类问题却非常困难。为了减少出现这一类型的问题，就必须在分析之前，仔细研究并选择一个好的分析方法，有了一个好的分析方法，就很容易获得理想的分离效果，而且在出现问题是也很便于找出原因。要选择一个好的分析方法，就必须对液相色谱分析的一些基本原则要有一个很深的了解。[/color][color=#3e3e3e][b]（1）分析方法选择的基本原则[/b]假如你想做一顿丰盛的晚餐，首先必须看一下食谱，然后检查一下你所需的东西是否齐全，如果少了配料还必须去商店购买，这样你才可能做出一顿可口的晚餐。同样进行液相色谱分析时，也必须按照一定的程序进行，首先你必须要有专门的仪器和试剂，然后有目的地选择分析方法，这样你才可能得到好的分析结果，避免走一些弯路。[/color][color=#3e3e3e][b]（2）柱子的选择[/b]现在大部分液相色谱分析都是使用反相色谱柱，其中以C[sub]18[/sub]和C[sub]8[/sub]柱最为流行，然而，色谱分析并不是流行歌曲，这两种色谱柱之所以运用广泛是因为在大多数情况下，使用这两种柱子都能获得理想的分离效果。尽管一些样品的分离并不是这两种柱子(如，表一所示)，但C[sub]18[/sub]和C[sub]8[/sub]经常是最好的固定相，C[sub]18[/sub]和C[sub]8[/sub]柱两者之间并无明显的差别。色谱分析人员遇到的多数样品需要利用反相色谱柱进行分析，但一些样品可能需要其它的分析技术才能成功地分离，这些样品及分离方法在表一中作了简要的叙述。[/color][color=#3e3e3e][img=,527,121]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/05/201705142201_01_3214098_3.png[/img][/color][color=#3e3e3e]表一：样品及分析方法[/color][color=#3e3e3e]在过去的15年中，高纯度、低金属杂质含量的硅胶基质色谱柱是最为实用的色谱柱之一。但传统色谱分析用的硅胶颗粒具有差异性及酸性表面，固定在柱子表面后，导致出现拖尾峰，而且柱与柱之间的重现性较差。最近硅胶基质中出现一种新的产品，这种硅胶具有Metal-free特性，因此，柱子性能更稳定，重现性也更好，分离后峰的形状也很不错。这种改性后的硅胶称为B型硅胶。由于具有上述优点，大多数色谱制造商都用不同的名称来表明它们与传统的产品之间的不同，如，Intertsil (日本)、 BDS(USA)、YMC--Base(USA)等等。大多数色谱柱制造商都生产以B型硅胶为基质的色谱柱，因此你可以选择你所喜欢的供应商提供的产品。由于这种产品具有上述特性，建议使用A型硅胶柱的改为使用B硅胶柱。[/color][b]（3）柱子尺寸规格的选择[/b][color=#3e3e3e]液相色谱分析时柱子选择的另一个因素就是柱子大小、及填充颗粒的直径(dp)的选择。最常用颗粒直径为5μm，但颗粒的直径(dp)为3.0及3.5μm的也适合分析使用，但大多数色谱工作者都喜欢使用颗粒直径为5μm的色谱柱，因为这种色谱柱具有很长的使用历吏。颗粒的dp小意味着可以获得较高的理论塔板数，但所需的柱压增大，而且dp为3.0μm的色谱柱易堵塞，所以一些色谱制造商又生产出dp为3.5μm的色谱柱。在实验室中经常使用的是150mm×4.6mm，dp为5μm的色谱柱。另一种可以选择 的色谱柱为75mm×4.6mm，dp为3.5μm的柱子，这种柱子的分离效果与前一种色谱柱分离效果相似，但使用时间减小一半。这两种柱子还有一个优点就是在合理的压力下(2000psi )，流速可以设定在1.5-2.0mL/min之间，而流速高意味着可以缩短分析时间。有些分析者建议使用30 or 50mm长的柱子作为前处理柱，但这种柱子不能提供足够的塔板数。另一种意见是使用窄孔柱(2mmid)或微孔柱(≤1mmid)，这两种柱子所需的溶剂少，但是这两种柱子所需的某些仪器与正常使用的色谱仪有些不同，而且正处在一个研究阶段，建议等这两种色谱柱研究成熟之后再使用。[b]150mm×4.6mm，dp为5μm的色谱柱最为常用，75mm×4.6mm，dp为3.5μm的色谱柱也中较常见，在一般情况下流速可设定为1.5mL/min。[/b][/color][color=#3e3e3e][b]（4）有机相的选择[/b]获得成功分离的另一个重要因素就是流动相有机溶剂的选择，如果使用反相色谱柱可以有三种有机溶剂可以选择，甲醇、乙腈和四氢呋喃。每一种溶剂都有其独特的优点，但色谱分析人员很少能预见哪一种溶剂更合适，所以具体选择哪一种溶剂你必须充分考虑同行的意见。分析药物中的成份时，其中有些样品的紫外吸收很弱，所以，分析时紫外检测器的波长为220nm甚至更低，但是四氢呋喃的紫外吸收比较强，所以在波长低于240nm时，就不能选择这种溶剂。尽管低浓度的甲醇在较低的波长下也可使用，但是在低于220nm时，甲醇的浓度不易控制。选择何种溶剂还必须考虑其与样品及空气之间不发生作用，而四氢呋喃易分解，形成过氧化物，所以使用这种溶剂时须格外小心。一些研究人员发现，在四氢呋喃中加入水可以解决这个问题，但它与色谱柱平衡所需的时间比甲醇、乙腈长，而且其不愉快的气味也是一个不利因素。与四氢呋喃相比，甲醇和乙腈的最大优点是在柱压较低的条件下，流速可控制在1-2mL/min之间。考虑到理想溶剂的特点，如粘度低、紫外吸收弱、与样品不相互作用，而且使用方便，所以首选的有机溶剂应是乙腈，当然利用甲醇作为有机溶剂的也较为常见。[b]（5）水相的选择[/b]假如样品为一般化合物，可以用水作为水相，然而离子化合物在药物分析时普遍存在，而这类化合物需要控制pH值才能得到很好的分离。如流动相的pH值必须高于或低于样品的PKA1.5个单位。在分析有机酸时，当pH值低于3时，色谱柱一般还比较稳定，然而当PH值高于8时，就需要缓冲液，因为此pH值已经超出了二氧化硅的有效使用范围。宽PH值的二氧化硅柱也比较常见，但是对高pH值物质的分离，很少有这方面的报道。所以建议使用缓冲液来减少二氧化硅的流失。考虑到样品的特性及柱子的稳定，建议在分析PH值较高的物质时应使用缓冲液，2.5mm的磷酸盐缓冲液 (pH=2.5)是非常合适的水相。如果在分析方法中使用了分光仪，那么就必须选择易挥发的缓冲液，尽管不如真正的缓冲液有用，但0.1%Trifluoroacetic酸和乙酸能够满足pH值的控制要[b]求。（6）其它因素[/b]在你选择液相色谱的分析方法时，必须考虑到其它的一些因素，比如，温度。因为温度变化1度，保留时间将变化1-3%，所以温度控制十分重要，温度的变化还影响色谱柱的选择性，这会使你更积极地投入到温度选择中去。在分析时柱温一般比室温高一点(如，35℃)，因为此温易控制，而且在低压下有利于降低溶剂的粘度，从而降低柱压。有时你需要利用其它的一些方法 ，如在流动相中加入部分特殊的物质，不过建议最好在你实在必须时才用这种方法，记住KISS原则(Keep it simple ，stupid)，不要使你的流动相过分复杂![/color][color=#3e3e3e][b]（7）总结[/b]在液相色谱分析时条件的选择非常重要，而且流动相是常年与之打交道的，所以必须慎重选择。一些较为常见的分析条件如表二所示：[/color][color=#3e3e3e][b][img=,529,146]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/05/201705142214_01_3214098_3.png[/img][/b]表二：分析条件内容[/color][color=#3e3e3e]（转载于：实验与分析）[/color]