液相质谱蛋白分析

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褚福亮,王福生, 中国人民解放军第302医院全军艾滋病与病毒性肝炎重点实验室 北京市 100039项目负责人 王福生, 100039 ,北京市丰台路26号, 中国人民解放军第302医院全军艾滋病与病毒性肝炎重点实验室. fswang@public.bta.net.cn电话:010-66933332 传真:010-63831870收稿日期 2002-08-15 接受日期 2002-09-03摘要新近广泛应用蛋白质芯片（ProteinChipâ Array）系统成功鉴定出了一些重要疾病（如肿瘤和危害性较大的传染病）新的、特异性的生物标记（biomarkers）,后者不仅在生物医学的基础方面具有重要的科学价值,而且在临床疾病的诊断、治疗和预防发挥重要的指导作用,显示了良好的发展前景.本文就表面增强的激光解析电离-飞行时间-质谱（SELDI-TOF-MS）相关的原理、特点、在临床和基础研究中的应用新进展和未来的发展趋势做一综述.此外,我们就蛋白质谱分析技术在病毒性肝炎、肝硬化和肝癌等一系列肝病方面的应用策略和前景进行了分析.褚福亮,王福生. 蛋白质谱分析方法特点及其在蛋白组学研究领域中的应用.世界华人消化杂志 2002 10(12):1431-14350 引言人类基因组计划已经进入后基因组时代-即功能基因组时代[1]，作为基因功能的直接体现者-蛋白质，及其之间的相互作用越来越引起基础和临床科学家们的关注[2-6] .因为要彻底了解生命的本质，只把基因测出来还是不够的，还必须要了解其在生物生长、发育、衰老和整个生命过程中的功能、不同蛋白质之间的相互作用以及他们与疾病发生、发展和转化的规律[7-14] .正因为如此，有关上述问题的蛋白质组学研究成了今天生命科学最重要的焦点之一[15] .为了阐明蛋白质在上述生命现象中的作用和相关机制，人们设计了许多新的方法技术，如：二维电泳、质谱分析、微距阵列、酵母双杂交和噬菌体展示等，这些方法在一些特定的情况下，虽然显示出了他们各自不同的优点，但是同样也存在着较大的局限性，难以开展大规模、超微量、高通量、全自动筛选蛋白质等方面的分析，因而设计更全面、同时研究多种蛋白质相互作用的技术，在功能基因组和蛋白组学的研究中建立一个更有效的技术平台，成为本领域中优先关注的问题[16] .近来，美国Ciphergen（赛弗吉）公司研制的ProteinChipâ Array的仪器，并建立了一种新的蛋白质飞行质谱-表面增强的激光解析离子化-飞行时间-质谱（surface-enhanced laser desorption/inionation-time of flight-mass spectra， SELDI-TOF-MS），已取得可喜的进展，筛选出了许多与疾病相关的新型生物标志，不仅为临床疾病的诊断和治疗等提供了新的选择，而且在基础科学、新药研制和疾病预防等方面具有广泛的应用前景[16-18] .本文就SELDI-TOF-MS相关的原理、特点、在临床和基础研究中的应用新进展和未来的发展趋势做一综述.1 ProteinChipâ Array系统和SELDI-TOF-MS的特点1.1 蛋白质芯片系统的组成和原理 蛋白质芯片系统由三部分组成：蛋白质芯片、芯片阅读器和芯片软件.供研究用芯片上有6-10芯池，不同的芯片表面上的化学物质不同，芯片表面分为两大类：一类为化学类表面，包括经典的色谱分析表面，如：结合普通蛋白质的正相表面，用于反相捕获的疏水表面，阴阳离子交换表面和捕获金属结合蛋白的静态金属亲合捕获表面；另一类称为生物类，特定的蛋白质共价结合于预先活化的表面阵列，可以用来研究传统的抗体一抗原反应，DNA和蛋白质作用，受体、配体作用和其他的一些分子之间的相互作用[19] . 根据检测目的不同，可以选用不同的芯片，或者自己设计芯片.将样本和对照点到芯池上以后，经过一段时间的结合反应，用缓冲液或水洗去一些不结合的非特异分子，再加上能量吸收分子（energy absorbing molelule，EAM）溶液，使样本固定在芯片表面.当溶液干燥后，一个含有分析物和大量能量吸收分子“晶体”就形成了.能量吸收分子对于电离来说非常重要.经过以上步骤，就可经把芯片放到芯片阅读器中进行质谱分析. 在阅读器的固定激光束下，芯片上、下移动，使样本上每一个特定点都被“读”到.激光束的每一次闪光释放的能量都聚集在该区一个非常小的点上（focused laser beam，聚焦激光束）.这样，每个区都含有丰富的，可寻址（addressable）的位置.蛋白质芯片处理软件精确控制激光寻读过程.当样本受到激发，就开始电离和解除吸附.不同质量的带电离子在电场中飞行的时间长短不同，计算检测到的不同时间，就可以得出质量电荷比,把他输入电脑,形成图像[19].Ball et al [20]采用一种称为人工神经网络（artifical neural network,ANN）的算法处理出现的成千上万的峰，鉴定出三个分子量为13 454、13 457和14 278的生物标记分子，使疾病预测率达到97.1 %.1.2 ProteinChipâ Array芯片和SELDI-TOF-MS的特点 新型蛋白芯片与以往的蛋白芯片不同之处：SELDI-TOF-MS，他是在MALDI（matrix-assisted laser desorption/inionation）［21,22］基础上，改进后实行表面增强的飞行质谱.SELDI-TOF-MS优于MALDI-TOF表现为他不会破坏蛋白质，或使样本与可溶的基质共结晶来产生质谱信号.对SELDI-TOF来说，可以直接将血清、尿液、组织抽取物等不需处理直接点样检测[40] 由于一部分非特异结合的分析物被洗去，因而出现的质峰非常一致，有利于后期分析[23,24] . 与二维电泳相比：二维电泳分析蛋白质的分子量在30 KDa以上时电泳图谱较清楚，对在组织抽提物中占很大比例的低丰度的蛋白质不能被检出；其次，二维电泳胶上的蛋白质斑点很大一部分包含一种以上的蛋白质；而且，二维电泳耗时长，工作量大，对象染色转移等技术要求高，不能完全实现自动化.而SELDI-TOF在200 Da-500 KDa区间都可以给出很好的质谱，对一个样本的分析在几十分钟内就可以完成[19]，处理的信息量远远大于二维电泳；对于低丰度物质，即使浓度仅attomole(10-18)的分子，只要与表面探针结合，就可以检测到，这也是二维电泳所不具备的[24,25] . 对于微距阵蛋白芯片来说，需要一种不破坏折叠的蛋白质构象的固定技术，再与另外的蛋白质反应，经检测莹光来观察蛋白质之间的作用[26] .而基于SELDI-TOF-MS的ProteinChip分析蛋白质不需溶解、不需染色、廉价、针对性强. 因而蛋白质芯片仪具有以下优势：(1)可直接使用粗样本，如：血清、尿液、细胞抽提物等[27] .(2)使大规模、超微量、高通量、全自动筛选蛋白质成为可能；(3)他不仅可发现一种蛋白质或生物标记分子，而且还可以发现不同的多种方式的组合蛋白质谱，可能与某种疾病有关[28] (4)推动基因组学发展，验证基因组学方面的变化，基于蛋白质特点发现新的基因.可以推测疾病状态下，基因启动何以与正常状态下不同，受到那些因素的影响，从而跟踪基因的变化[2,14,15] . 其存在的问题：对于不同的样本，根据检测的目标采取或者设计几种芯片，理论上可以把所有的相同性质蛋白质捕获，但是实际上仍有少量的分子没与表面探针结合.使用SELDI-TOF-MS，仅能给出蛋白质的分子量，不能给出C端、N端的序列，也没法知道蛋白质的构型，因此需要将蛋白质充分纯化后，用蛋白酶消化芯片上的蛋白质，分析肽段，再用生物信息学方法鉴定蛋白质序列[18,24] .另外，在国内，该芯片费用较高，分析质谱需要大量后续工作支持.

谁有胶原蛋白氨基酸分析的图谱，液相或[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]均可，我在做论文要用到这样的色谱图，拜托大家不吝赐教！谢谢！

T/BPCT 001-2023牛乳及制品中A2 β-酪蛋白含量的测定 [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]质谱法

[摘要] 质谱对于现代蛋白质化学研究是一项重要的技术。也可用于蛋白组分析,在同一时间监控上千种蛋白的表达情况。首先蛋白质混合物可以用双向凝胶电泳分开，再用质谱及随后的蛋白质数据库检索对单个蛋白进行鉴定和分析。最近几年，质谱领域取得了令人鼓舞的进展，使得全自动、高通量的蛋白检测成为可能。质谱也可以用来分析蛋白的转录后调节以及研究蛋白质复合体。本文将介绍目前蛋白组研究中质谱方法的应用并对其优缺点进行讨论。关键词: 质谱；二维电泳（2-DE）；蛋白组分析MALDI-TOF1 前 言蛋白组学是研究生物特定组织或细胞内表达的所有蛋白质成分，蛋白质组的一门学科。蛋白组分析一般是用双向凝胶电泳（2-DE），质谱（MS）以及数据检索来完成。2-DE要回顾到20世纪70年代初[1],但是用质谱技术对蛋白质进行鉴定和分析是在近十年内才成为可能。其中最重要的一个原因是新的软离子技术即基质辅助激光解析电离（MALDI）[2]和电喷雾电离（ESI）[3，4]技术的发展和应用，以及样本制备技术和质谱仪的发展等。从数据库中获得成指数上升的序列信息也促进了质谱技术的发展。跟转录组学中的全自动DNA微阵列技术相比，蛋白组分析需要更多的手工操作，尤其在2-DE上会出现很多问题[5，6]。尽管存在很多困难，蛋白组学的重要性还是公认的。DNA微阵列技术是建立在对mRNA稳定水平的检测上，然而蛋白组学研究的对象是细胞中最活跃的因子——蛋白质。最近有研究证明，mRNA的表达和蛋白的水平并非具有相关性[7，8]。蛋白质有转录后修饰过程，并会以不同的形式出现。而这些修饰过程是相应的DNA测序技术所不能预测的。质谱技术在蛋白质修饰分析过程中具有重要的作用。2 质谱对蛋白质的检测质谱仪是由离子源，质量分析，离子检测器，以及数据检索等单元组成。首先，被分析的分子在离子源中被离子化，然后在质量分析器里根据不同的质荷比分开，再对分开的离子进行检测。随着MALDI和EIS的出现，质谱技术已经广泛用来分析蛋白质。质量分析器有很多种，最常用的方法是将飞行时间检测器（TOF）与MALDI或三级四级串联质谱仪联用，或者将四级杆-TOF，离子阱等连接到ESI上。蛋白组分析中，可以用两种不同的方法检测电泳分离后的单个蛋白质。最简单的方法叫做肽指纹谱测定（PMF）[9～13]。这个方法是用特殊的酶对2-DE分离后的蛋白质点进行降解，产生的肽从凝胶中分离出来后再用质谱分析和检测肽的分子量。数据库检测能够产生所有蛋白质理论上的PMF，把它们和质谱分析所获得的肽片进行比较就可以得出结果。第二种方法是在质谱仪中把凝胶分离后的肽分解成片段，产生局部的氨基酸序列（序列标签）。那么就可以用分子量或者序列信息进行数据库检索[14，15]。PMF一般用MALDI-TOF来实现，序列标签可以用串联质谱技术MS-MS进行检测[16～18]。用质谱检测蛋白的灵敏性可以精确到飞摩的水平，甚至已有报道其精确度可以达到阿摩水平[19]。3 用MALDI-TOF进行肽指纹谱分析凝胶分离后的蛋白质鉴定以及肽指纹谱分析是目前质谱实验室常规使用的方法。在进行MALDI分析之前需要最优化的凝胶上消化[20～22]和脱盐过程。胰岛素是最常用的凝胶消化酶，因为它在赖氨酸和精氨酸位点能够特异性切割蛋白质，产生分子量在600～2500Da之间的小分子肽，并能够从凝胶上有效的分离出来。MALDI-TOF是质谱技术中相对简单并很容易使用的一种方式，对样本中的盐和其他污染物有很高的耐受性，这点优于ESI。提取的肽片混合物中较小的片段可以直接沉积在靶板上做PMF分析，剩下的样本可以储存起来作为以后的ESI-MS分析。如果经凝胶分离后所有的肽全用来做MALDI分析，那么样本经脱盐以后将会取得更好的结果。脱盐的过程可以用商品化的试剂盒ZipTip(Millipore)，或者在凝胶电泳仪的末端放置一个小的逆向塑料柱来实现[23,24]。PMF中非常重要的一个因素就是质谱测量分子量的准确度[25]。现代的MALDI-TOF仪都具有延迟取样反射器装置，用它们检测的肽段分子量可以精确到10～30ppm。这样的精确度使得4～5个肽段足以清楚的鉴定蛋白质的分子量。MALDI产生的大多数都是单电荷离子，所以它的图谱很容易解释。4 肽质指纹谱分析的自动化为了实现高通量蛋白检测，样本准备，质谱检测，资料分析和数据检索必须实现自动化操作。目前有些实验室用机器人对蛋白质进行自动化取点，凝胶上消化，样本脱盐以及对MALDI平板进行定点测定等。而且，现代化的MALDI-TOF仪完全能够让MALDI检测自动化。资料分析和数据检索过程同样可以自动化。在进行蛋白组分析时，如果在凝胶上不用单个分离就可以对所有蛋白质进行鉴定将是非常具有诱惑力的。为此，研究人员做了很多努力，由Hochestrasser及其同事建立了一套称作分子探测术的方法（molecular scanner）[26，27]。它是将整个2-ＤＥ胶上蛋白质样本同时酶解,并将酶解片段一起原位转移至另一张膜上,再直接用ＭＡＬＤＩ－ ＴＯＦ 质谱对膜上样本进行整体扫描,为实现蛋白质组学研究的自动化、规模化以及临床应用提供了一个崭新的思路和方法。这种思路的优点是显而易见的,不过按照目前的方法,要普及此种技术主要的难点是,质谱扫描一张图谱所需的时间过长,如用0.4ｍｍ的精度扫描一张4ｃｍ×4ｃｍ的膜需55个小时,这就意味着一张16ｃｍ×16ｃｍ的常用膜的扫描,至少需要36天不间断的工作和大约40Ｇ的磁盘空间存储如此庞大的原始数据。5 用ESI-MS/MS的方法创建序列标签只有当被消化的蛋白存在于已有的蛋白或基因组数据库中，并且能从MALDI分析器中得到四五个肽片的数据才能成功进行。如果在EST数据库中只有目的蛋白的部分序列，那么就需要知道肽片的序列信息。创建序列标签的优势在于，用肽的分子量和序列作为数据库检索对象比只用分子量作为检索对象具有更高的特异性。有了序列标签信息后，也可以用EST数据库进行检索[28]。通常来自于一个肽上的序列标签就足以鉴定蛋白质。同MALDI相比，纳升-ESI-MS/MS费时费力，而且在做ESI分析之前必须对样本进行脱盐处理。这些问题可以通过ESI-MS与HPLC联用得到解决。做ESI分析对样本浓度很敏感，用现代化的纳升-HPLC方法可以提供很高的局部肽片凝聚物，分离后的样本可以直接用于质谱分析，而不需要再分解。当分析混合物的时候，在质谱之前做LC分离尤其重要，因为它使得数据依赖的实验（DDE）成为可能,在DDE中，所有的离子都进入检测器进行测量，如果从HPLC到质谱之间出现一个峰的话，软件将自动从质谱转换到MS/MS模式并对产生的离子进行扫描。跟纳升-ESI相比，用这个方法可以从一份标本产生更多的MS/MS数据。Yates等已经详细叙述了如何进行[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS全自动蛋白检测的策略[29]。

二维液相和质谱分析都是分析复杂体系的有力工具，我以前应用二维液相和质谱联用做过一些植物萜类化合物的分析，现在正在做多酚类化合物和糖苷类化合物的研究。在工作中，发现在阀切换时，总有系统峰出现，虽然不影响分析，但有点难看，如果大家有消除系统峰的好办法请告诉我。大家应用二维液相和质谱联用做的东东交流一下，看看有那些问题。下面是一份二维液相质谱分析在蛋白质组学分析中应用的专题报告，244页，内容丰富，与大家分享一下。[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=129341]二维液相质谱分析在蛋白质组学分析中应用[/url]

2003年人类基因组精细图绘制完成，是人类科学史上一个里程碑式的事件。后基因组时代的研究重点自然落在了蛋白质头上。为啥？因为中心法则告诉我们，基因的产物——蛋白质，是生命活动的最终执行者。与基因组类比，研究生物体内全套蛋白质的科学，就是蛋白质组学。基因组计划完成的同年，人类蛋白质组计划启动，令人激动的是，2014年人类蛋白质组的草图也完成了。而蛋白质组学能够飞速发展的最大功臣非质谱莫属。质谱的应用范围非常广泛，但这里只讨论蛋白质组学中的质谱。简单地说，质谱法（mass spectrometry）就是对肽段离子的重量（质荷比，m/z）进行测量的分析方法。样品经质谱仪（mass spectrometer）检测得到质谱图（mass spectrum），通过对质谱图的分析就可以对样品中的蛋白进行鉴定、定量。亲，图1的这种典型的蛋白质组学流程都很熟悉吧。蛋白首先都要被特异性的酶（通常为Trypsin）切割为肽段，再进行后续分析，这在蛋白质组学中被称为“自下而上”的研究策略（Bottom-up proteomics）。我们平时见到的质谱分析基本都是这种类型。提到蛋白质组，即会联想到一系列高大上的名词，iTRAQ、SWATH、SILAC、Shotgun、Label-free等等。很多概念容易弄混淆，下面我们就来理理清楚。图1. 典型的蛋白质组学流程大体上，质谱研究蛋白主要是鉴定和定量。通过二级质谱图（MS2或者MS/MS）进行数据库搜索匹配鉴定蛋白。通过各种标记或非标记的手段对不同样品中的蛋白进行比较就是定量。蛋白定量比较是质谱最重要的用途，图2是对定量方法的一个简单总结。非标定量（Label-free）不需要标记，不同样品分别处理、分别进质谱检测；优点是处理简单、无需标记、价格便宜、可以比较很多组样品，缺点是对操作步骤、LC、质谱稳定性要求严格。SILAC是在细胞培养基中加入稳定同位素标记的氨基酸，在代谢水平标记蛋白，一级质谱图进行定量，可以做到三组样品混合后进行比较，定量准确，但是不能标记组织样本，养细胞成本也较贵。双甲基化标记是通过化学反应的办法在肽段水平进行标记，一级质谱定量，也可以三组对比，标记试剂都比较便宜，而且可以标记任何来源的样品。iTRAQ和TMT是商品化的试剂盒，肽段水平标记，二级质谱定量；分别可以做到最多8组和10组样品间蛋白质组的比较。图2. 质谱定量方法以上这几个是一家的，还有几个名词是属于另外一家，比如Shotgun (DDA)、SWATH/DIA、SRM (MRM)、MRMHR/PRM。质谱进行数据采集的方式大致分为三种：鸟枪法（Shotgun）、选择反应监控（SRM）和全景式的SWATH/DIA。下面对照图3再来简单介绍一下。图3. 质谱扫描方式DDA、IDA、Shotgun和鸟枪法说的是相同的东西，意思是质谱在每个循环的中从一级里挑选丰度高的TopN个肽段去打碎做二级扫描，得到的结果通过与已知数据库中的理论蛋白进行匹配。DDA简单有效，分析流程比较成熟，也是目前质谱分析的主流方式。DDA也有其固有的缺陷，即具有一定的随机性，偏向于检测丰度较高的肽段，而抑制了低丰度肽段的检测。靶向策略被称为质谱领域的Western blot。质谱只去采集目标肽段大小的离子信息，因而提高了灵敏度和特异性。这种方法用来研究感兴趣的特定蛋白，定量准确，但是通量很有限。SWATH/DIA这种全景式的数据采集方式在最近几年突然火了起来，被认为在不远的未来可能会取代DDA的主流位置。该方法采取的策略是将扫描范围内的所有肽段按照质荷比分为若干个窗口，再对每个窗口里所有的肽段一起打碎，采二级，数据分析时通过抽提蛋白的子离子信息进行定量。SWATH/DIA解决了DDA中随机性选择肽段的缺陷，所以重复性更好，定量的准确性基本达到了SRM的水平，而且可以实现大规模定量。借用听来的一个比喻来说明：DDA就像机关枪扫射，数量多、体积大的目标命中的概率要大一些。靶向扫描（SRM或PRM）就像精准狙击，排除干扰，目标明确，每一枪直指目标，但是难以大规模消灭敌人。SWATH/DIA就是地毯式轰炸，只要暴露在我方攻击范围内的敌人，不管三七二十一，全部炸完。图4. 定量方法与采集方式结合如果将上述的定量方法（图2）和质谱数据采集方式（图3）结合起来，就得到了现在基于质谱的蛋白质组学研究的各种策略（图4）。再打个比方，保证吃货们一听就懂：鸡、鱼、肉、蛋、蔬菜要通过炒锅、烤箱、高压锅、微波炉等烹调之后才能变为美食，填饱肚子。同样的，各种定量方法（非标的和标记的）处理的样品，要通过质谱各种采集方式变为电脑中的数据，才能分析并从中得到蛋白的信息。本次的介绍就先到这里了，如果其中有什么问题，欢迎您批评和建议，我们会努力变得更好；如果需要跟我们进行技术交流和讨论，欢迎大家联系武汉金开瑞。后续我们还会继续推出对质谱技术各方面进行解析的文章，敬请期待。ReferencesA draft map of the human proteome. Nature 509: 575–581 (2014)Mass-spectrometry-based draft of the human proteome. Nature 509: 582–587 (2014)A review: Annu. Rev. Biochem. 80: 273–99 (2011)SILAC: Molecular & Cellular Proteomics 1: 376-386 (2002)iTRAQ: Molecular & Cellular Proteomics 343: 91–99 (2010)SRM: Nature Methods 9: 555–566 (2012)SWATH: Molecular & Cellular Proteomics 11: 1–17 (2012)

亚铁氰化钾和乙酸锌去蛋白，去蛋白后过滤进质谱可以吗？

PS1利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间（MALDI-TOF）技术来表征生物分子。样品溶于固定的底物中形成晶体，用激光脉冲使其离子化，离子被加速后通过飞行管时分离，所有离子均可被检测。系统包括三个组成部件：样品点样制备工作站（SymBiot 1）、生物质谱工作站（Voyager-DE PRO）和自动化分析软件（AutoMS-Fit）。SymBiot1 是一个自动样品处理系统，支持亚微升级微量点样，具有快速省时、重现性好的特点；Voyager-DE PRO是为蛋白质组研究专门设计的自动飞行时间质谱分析系统，配有AB公司之专利—延迟检测技术，具有高分辨率、质荷比宽等特点；AutoMS软件可以批处理方式或实时动态方式检索Protein Prospector蛋白数据库或您指定的蛋白数据库，查询参数可以任意设定，检索结果以Microsoft Access格式分类编号及储存。 PS 1技术平台建立伊始便受到了许多蛋白质课题研究组的关注。中国科学院上海生物化学研究所戚正武院士课题组从猪肝中提取某一活性蛋白组分，该组分理化性质不清楚，天然含量十分低，并无相关文献报道。用HPLC分离以后对活性组分的成分不能确定。上海基康生物技术有限公司运用PS 1系统对HPLC分离后的活性组分作了质谱分析，仅在一个工作日内就精确确定该组分由分子量极为相近的几种蛋白质构成，分子量精确度达到10 ppm。后经HPLC再次细分（洗脱梯度增加了2.5倍），证实了质谱的结论。此活性组分曾滤过1kD分子筛，基康的质谱数据纠正了研究人员过去对该活性组分分子量的误判，为研究人员明确实验方向、优化实验步骤提供了强有力的依据。 PS1除了可以进行生物大分子的精确分子量测定，还可用于蛋白的肽指纹图谱分析(peptide mass fingerprint，PMF)，提供相关生物信息学服务，并且还可以利用源后衰变（Post Source Decay，PSD）技术来获得样品的MS/MS数据，以得到一级结构信息。PSD方法通常增加了激发激光的功率，使其超过产生一般肽指纹谱图所需功率的阈值，过剩的能量使前体离子在源内离子化之后发生裂解，产生一系列碎片离子，在反射器的作用下，最终可以得到一张连续的碎片离子图谱。经特定的软件分析后，即可在数据库中检索到肽段的氨基酸序列。利用PSD分析技术，还可以对磷酸化，糖基化等翻译后修饰进行定位分析，同样也可以鉴定产生翻译后修饰肽段的蛋白质。Neville et al.（1997）将这一方法成功的用于磷酸肽的序列分析。作为重要的蛋白质鉴定手段之一，PS1的精确度可以达到10 ppm，灵敏度为fmol，分子量检测范围可达到500 kDa，每天可自动分析40-100个样品，适用于大规模“蛋白质组学”研究。

蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物细胞，约占细胞干质量的50%以上， 作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行、调节代谢、抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家极为关注的问题，其研究的内容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列分析及立体化学分析等。随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速。 自约翰.芬恩(JohnB.Fenn)和田中耕一(Koichi.Tanaka)发明了对生物大分子进行确认和结构分析的方法及发明了对生物大分子的质谱分析法以来，随着生命科学及生物技术的迅速发展，生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研究领域之一[1]。它的发展强有力地推动了人类基因组计划及其后基因组计划的提前完成和有力实施。质谱法已成为研究生物大分子特别是蛋白质研究的主要支撑技术之一，在对蛋白质结构分析的研究中占据了重要地位[2]。 1．质谱分析的特点 质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点：很高的灵敏度能为亚微克级试样提供信息，能最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定，同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。 2．质谱分析的方法 近年来涌现出较成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术主要有下列几种：1)电喷雾电离质谱；2)基质辅助激光解吸电离质谱；3)快原子轰击质谱；4)离子喷雾电离质谱；5)大气压电离质谱。在这些软电离技术中，以前面三种近年来研究得最多，应用得也最广泛[3]。 3．蛋白质的质谱分析 蛋自质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子，复杂结构主要包括以肽链为基础的肽链线型序列[称为一级结构]及由肽链卷曲折叠而形成三维[称为二级，三级或四级]结构。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。 3.1蛋白质的质谱分析原理 以往质谱(MS)仅用于小分子挥发物质的分析，由于新的离子化技术的出现，如介质辅助的激光解析/离子化、电喷雾离子化，各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。其原理是：通过电离源将蛋白质分子转化为[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z值)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。 3.2蛋白质和肽的序列分析 现代研究结果发现越来越多的小肽同蛋白质一样具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽库是现在的研究热点之一。因此需要高效率、高灵敏度的肽和蛋白质序列测定方法支持这些研究的进行。现有的肽和蛋白质测序方法包括N末端序列测定的化学方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例如作为肽和蛋白质序列测定标准方法的N末端氨基酸苯异硫氰酸酯(phenylisothiocyanate)PITC分析法(即Edman法，又称PTH法)，测序速度较慢(50个氨基酸残基/天)；样品用量较大(nmol级或几十pmol级)；对样品纯度要求很高；对于修饰氨基酸残基往往会错误识别，而对N末端保护的肽链则无法测序[4]。C末端化学降解测序法则由于无法找到PITC这样理想的化学探针，其发展仍面临着很大的困难。在这种背景下，质谱由于很高的灵敏度、准确性、易操作性、快速性及很好的普适性而倍受科学家的广泛注意。在质谱测序中，灵敏度及准确性随分子量增大有明显降低，所以肽的序列分析比蛋白容易许多，许多研究也都是以肽作为分析对象进行的。近年来随着电喷雾电离质谱(electrospray ionisation，ESI)及基质辅助激光解吸质谱(matrix assisted laser desorption/ionization，MALDI)等质谱软电离技术的发展与完善，极性肽分子的分析成为可能，检测限下降到fmol级别，可测定分子量范围则高达100000Da，目前基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI TOF MS)已成为测定生物大分子尤其是蛋白质、多肽分子量和一级结构的有效工具，也是当今生命科学领域中重大课题——蛋白质组研究所必不可缺的关键技术之一 [5] 。目前在欧洲分子生物实验室(EMBL)及美国、瑞士等国的一些高校已建立了MALDI TOF MS蛋白质一级结构(序列)谱库，能为解析FAST谱图提供极大的帮助，并为确证分析结果提供可靠的依据[6]。

蛋白分析系统在我们选择蛋白分析工具的时候，通常是根据不同的蛋白来选择不同的分析手段，如凝胶电泳、化学荧光染色、质谱等等。但是目前已经研制出的蛋白分析工具的种类繁多，从这一方面也在一定程度上反映了蛋白分析的复杂性。以下是一些近期推出的蛋白分析系统，希望能帮助您轻松完成研究工作。

那位老师有：液相色谱做麦谷蛋白的方法。麻烦发到我油箱：liue-mailbox@163.com

FPLC简介 FPLC全称为快速蛋白液相色谱（Fast protein liquid chromatography），其原理与高效液相色谱理论类似，是由经典的液体柱层析引入[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url]理论，并且对相体进行了改革，配用高压输液泵，采用高灵敏检测器、梯度洗脱装置、自动收集装置和微机等发展起来的现代液相色谱。FPLC是专门用来分离蛋白质、多肽及多核苷酸的系统，是HPLC近年来的一项重要革新，它不但保持了HPLC的快速、高分辨率等特性，而且还具有柱容量大、回收效率高及不易使生物大分子失活等特性。因此在近年来在分离蛋白质、多肽及寡核苷酸等方面得到了广泛应用随着HPLC的发展，出现了两种新型填料：薄壳型填料和双扩散灌流型填料，它们对大分子物质的分离具有独特的优越性，从而使FPLC的应用领域得以拓展。其可应用于蛋白、有机化合物的分离纯化，能定量测定蛋白的含量和和确定蛋白的分子量，因此可应用于生物学领域和化学领域的研究。 The Pharmacia fast protein liquid chromatography (FPLC) system is used for methods developmnent and the purification of large quantities of various biomolecules (i.e., protein and DNA). The system includes two pumps capable of continuous flow to the purification columns (vary by user) , a peristaltic pump may be used for column equilibration, a UV monitor to detect biomolecules on the column, a mixer to produce elution gradients, motor valves may be used to assist with sample injection, column selection or flow reversal, and a controller with an integration function for computerized operation of various programs directing flow to the pumps and controlling the motor valves. A chart recorder is the typical mode of 'run' documentation.

6 质谱仪的最新进展用质谱检测蛋白，首先考虑到用PMF与 MALDI-TOF联用，如果无法检测，下一步就用ESI-MS/MS创建序列标签。在PMF分析中，MALDI的平板中只需一小部分样本就足以检测，剩下的样本就可以用来创建序列标签。并且，在MALDI-TOF仪器上，用一种叫做“源后延迟”的方法可以对只有部分序列的肽段进行检测。然而，用这个方法产生的质谱图比较难说明，精确性也很差。最近，用MALDI联合四级杆-时间质谱分析器[30，31]以及原始的MALDI-TOF/TOF[32]方法产生了。因此同一份标本可以首先考虑用PMF检测蛋白[33]，如果有必要的话，再用MS/MS创建序列标签。MALDI联合四级杆-TOF检测高通量蛋白是有希望的[31]。7 蛋白质组研究中的转录后修饰分析蛋白组分析很重要的一点就是能对蛋白表达水平以及转录后修饰，如磷酸化和糖基化进行研究。蛋白质的磷酸化是很有趣的，因为在信号转导途径中它扮演了重要的角色。最早检测蛋白质表达水平的方法是进行2-DE之前用35S-Met对样本进行代谢性标记，再在2-DE上进行放射自显影[34-36]。在凝胶中，不同蛋白的磷酸化和糖基化位点通常在凝胶中显示一连串蛋白质点，但是还需要做更详细的分析来确定修饰类型。蛋白质磷酸化的改变既可以用32P标记细胞，也可以用特异性磷酸化抗体做western blotting进行研究。如果用32P标记的方法，仍然需要做2-DE。经过凝胶比较后，把感兴趣的点从胶上切下来，然后用质谱鉴定[36]。Soskic使用的是印迹法，两个2-DE同时进行，一个用于做特异的磷酸化抗体实验，另一个做常规染色。蛋白质磷酸化和糖基化更为详细的特性可以用质谱来检测，但是需要更多的起始材料而不仅仅是二维凝胶上的一个点。另外这些分析不能产生直接的序列信息，技术上也比用质谱检测蛋白要难的多。在蛋白上查找磷酸化位点有很多种方法。为了检测消化后的混和肽中哪一个是磷酸化的，可以用MALDI-MS在磷酸化前后对混合肽做PMF分析：经过磷酸酯酶处理后，磷酸化的肽将会失去一个磷酸基团，分子量将比处理前小80Da.糖基化研究中，多聚糖从蛋白中释放出来，对多聚糖结构的检测就是从这些游离的多聚糖中得到的。一般把MALDI仪和外源性糖苷酶[37-40]联合使用进行检测。如果需要更为详细的信息，可以用ESI-MS联合使用前体离子扫描仪[41-44]。到目前为止，能够用电泳分离后的蛋白进行糖蛋白结构检测的报道很少。其中有一项研究是N端糖蛋白酶切以后用一维SDS-PAGE分离，然后用MALDI-MS以及外源性的糖苷酶进行结构分析[45]。8 用质谱研究蛋白-蛋白之间的作用经典的蛋白组学着重于研究蛋白质在何时何处表达。因为大部分的细胞功能都是由蛋白质复合体而不是由单个蛋白来执行的，所以鉴定蛋白质的成分和相互作用是非常重要的。这个过程可以用生物化学方法纯化蛋白质后用质谱来鉴定不同的成分，如人类剪接体的成分，酵母的核孔复合体[46]以及核蛋白体等都可以用此策略检测出来。一般的蛋白复合体是用亲和层析的方法纯化和分离，如免疫沉淀反应[47，48]。 DNA结合蛋白可以用同它们有特异性亲和力的核酸来分离，然后用质谱来鉴定[49]。Rigaut等人在串联层析的基础上，建立了一种通用的蛋白质复合体纯化方法[50]。在这个方法中，一种TAP标签和靶蛋白融合在一起，然后把蛋白转移到宿主细胞或者组织中，融合蛋白在宿主细胞和组织中能持续表达。TAP标签包括一种A蛋白和一种钙调蛋白，在标签之间有一个TEV蛋白酶切位点。用串联亲和层析法能将融合蛋白及与它相互作用的蛋白成分从细胞提取物中有效的分离，纯化出来。Rappsiber等人分别用亲和层析，交叉耦合以及质谱等方法[51]对酵母的核孔复合物Nup85p的亲和性进行研究。经过层析以后，用一维SDS-PAGE方法就可以分离蛋白复合体中的各个成分，因此二维电泳的不足之处就可以避免。同样也有可能直接用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]方法分析大分子量蛋白质复合体[52]。蛋白组分析的优越之处主要是用于蛋白和蛋白之间的相互作用以及蛋白的转录后修饰的研究，同时也可以用于基因表达水平的研究。质谱对于蛋白组分析来说是一项非常重要的技术，近年来仪器以及数据库软件的发展使得质谱成为能力更强大的工具。参考文献[1] O’Farrell PH. 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借助高效液相色谱法测定乳制品中乳铁蛋白。方法：先通过额外加入的二价铁离子使乳铁蛋白的构型更利于沉淀。然后用体积分数60% 乙醇溶液沉淀蛋白除去糖分，再用醋酸盐缓冲液提取乳铁蛋白并分离掉酪蛋白，最后用高效液相色谱检测，采用LiChrosorb RP-C18 色谱柱，在质量浓度0.1g/100mL 的三氟乙酸溶液协助下，甲醇与水线性梯度洗脱。结果：乳铁蛋白的线性范围是0.4～2mg/mL(R2=0.9980)，平均回收率95.4%。结论：此方法可以用于乳制品中乳铁蛋白的测定。

我是新手，还没入门，想请教下大家有没有过质谱测蛋白的？大家都是用哪种质谱来测得蛋白，有哪些网站或者书籍之类的推荐学习吗？

我现在是一名研二学生，课题是从乳清蛋白中分离α-乳白蛋白，目前要用高效液相色谱做出α-乳白蛋白的标准曲线，实验室用的是型号POLARIS-211的液相色谱仪，目前出峰的拖尾峰明显，停留时间也不稳定，有用过这个仪器的朋友吗，希望得到大家的帮助http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09511.gif

蛋白质组学研究--生物质谱技术 对分离的蛋白质进行鉴定是蛋白质组研究的重要内容，蛋白质微量测序、氨基酸组成分析等传统的蛋白质鉴定技术不能满足高通量和高效率的要求，生物质谱技术是蛋白质组学的另一支撑技术。 生物质谱技术在离子化方法上主要有两种软电离技术，即基质辅助激光解吸电离(matrix—assisted laser desorption／ionization，MALDl)和电喷雾电离(electrospray ionization，ESl)。MALDI是在激光脉冲的激发下，使样品从基质晶体中挥发并离子化。ESI使分析物从溶液相中电离，适合与液相分离手段(如液相色谱和毛细管电泳)联用。MALDI适于分析简单的肽混合物，而液相色谱与ESI—MS的联用(LC—MS)适合复杂样品的分析。 软电离技术的出现拓展了质谱的应用空间，而质量分析器的改善也推动了质谱仪技术的发展。生物质谱的质量分析器主要有4种：离子阱(iontrap，IT)、飞行时间(TOF)、四极杆(quadrupole)和傅立叶变换离子回旋共振(Fourier transform ion cyclotron resonance，FTICR)。它们的结构和性能各不相同，每一种都有自己的长处与不足。它们可以单独使用，也可以互相组合形成功能更强大的仪器。 离子阱质谱灵敏度较高，性能稳定，具备多级质谱能力，因此被广泛应用于蛋白质组学研究，不足之处是质量精度较低。与离子阱相似，傅立叶变换离子回旋共振(FTICR)质谱也是一种可以“捕获”离子的仪器，但是其腔体内部为高真空和高磁场环境，具有高灵敏度、宽动态范围、高分辨率和质量精度(质量准确度可很容易地小于1mg／L)，这使得它可以在一次分析中对数百个完整蛋白质分子进行质量测定和定量。FTICR—MS的一个重要功能是多元串级质谱，与通常的只能选一个母离子的串级质谱方式不同，FTICR—MS可以同时选择几个母离子进行解离，这无疑可以大大增加蛋白质鉴定工作的通量。但是它的缺点也很明显，操作复杂、肽段断裂效率低、价格昂贵等，这些缺点限制了它在蛋白质组学中的广泛应用。MALDI通常与TOF质量分析器联用分析肽段的精确质量，而ESI常与离子阱或三级四极杆质谱联用，通过碰撞诱导解离(collision—induceddissociation，CID)获取肽段的碎片信息。 1. MALDI—TOF—MS (1)MALDI—TOF—MS的技术特点：①具有分离、鉴定双重功能，可用于混合物的分析；②测量范围宽，相对分子质量可达300 000；③精度高，蛋白质相对分子质量测定精度可达0．01％；④灵敏度高，所需样品量少，可达fmol级；⑤分析时间短，5～10rain可完成一次分析；⑥样品制备简便，操作易自动化；⑦对样品要求低，能忍耐较高浓度的盐、缓冲剂和非挥发性杂质，所以特别适合于鉴定二维凝胶电泳分离的蛋白质。 (2)MALDI—TOF—MS的技术改进：近年来MALDI—TOF—MS又有许多新的技术改进，以提高其检测灵敏性和准确度，增强其蛋白质鉴定的功能。如将MALDI离子源与四极杆—飞行时间—串联质谱对接，实现了同一样品在同一质谱仪上的肽指纹图谱与肽序列标签分析同时进行，提高于蛋白质鉴定的速度和准确性。还有MALDI—TOF—TOF—MS等。但这些技术共同的缺点是仪器非常昂贵。 (3)MALDI—TOF—MS的发展方向：①寻求新的基质(如混合基质、室温离子化液体等)和新的制样方法(如超微量进样，n1级)；②将新技术应用在分析中(如酶切技术、毫微升溶剂提取技术等)；③对质谱仪进行改进或与其他分析仪器联用，如MALDI与傅立叶转换离子回旋共振质谱(MALDI—FTMS)联用能得到更多的蛋白结构信息；④小型化、智能化、简易化及自动化已成为趋势。 2．ESI (1)ESI的优势：①检测范围宽，生物大分子经电喷雾后质荷比大大下降，因而可测相对分子质量高达十几万甚至更高的生物样品；②分辨率和灵敏度高，可达10-15—10-12mol；③不需要特定基质，避免子基质峰的干扰；④适用于结构分析，可分析生物大分子的构象及非共价相互作用，与串联质谱结合可分析蛋白质、多肽的一级结构和共价修饰位点等；⑤自动化程度高，可与液相色谱、毛细管电泳等高效分离手段在线联用；⑥MALDI是脉冲式离子化技术，而ESI是连续离子化技术，检测所需时间更短；⑦ESI常和四极杆质谱联用，仪器价格相对便宜。 (2)ESI的局限性：①对样品中的盐类耐受性差；②对混合物图谱的解析较复杂；③受溶剂的影响和限制很大。目前ESI主要用于亲水生物大分子的分析，较少用于疏水生物样品的分析。总体来说，MALDI和ESI各有长处，有各自的适用范围，是两种互补的技术。 (3)ESI的技术发展：近年来，ESI也有许多新的技术发展。液相色谱与电喷雾质谱连用(LC—ESI—

分子量测定： Q：为什么测定的结果跟理论的结果不一致？ A：因为机器测定会有一定的误差，如100000Da的蛋白质最大误差是100Da，如果测定的结果与理论值成倍数关系的可能原因是：0.3倍可能是三电荷峰，0.5倍可能是双电荷峰，原因是样品含碱氨基酸较多；2倍可能是二聚体，3倍可能是三聚体，原因可能是样品中含有过多的二硫键。 Q：为什么我的样品非常纯，但在主峰的附近会有一些小峰？同时在主峰一半或两倍的地方有一个小峰？ A：这是因为在激光的扫描的过程中可能会使样品分子损失一些离子，如H2O、NH3等，或者出现样品分子与基质的加合峰，正常的情况下MALDI-TOF单电荷峰占主要，所以有时会在主峰一半或两倍的地方有一个小峰，是双电荷峰和二聚体峰； Q：为什么我的样品纯度、浓度都很好，盐浓度也很低，却得不到结果？ A：这只能与蛋白质本身的结构有关，基质不能很好的分离样品，所以希望您能尽可能滇供样品其他的理化质，如酸、碱蛋白、糖蛋白等。的确，有时您的样品的所有质、状态都正常，还是不能得到您想要的结果，这种问题其实已经超出了我们能力的范围，我们仅仅是您整个实验的一个环节，能够做到的是向您提供一个准确的结果。 肽指纹图谱及数据库检索 Q：为什么考马斯染色的结果比银染的结果好。 A：主要是银染的灵敏度较高，得到的蛋白质量较少，再加上在处理样品的过程中银染要脱银，增加洗脱的次数，样品的损失较大，所以噪音和角蛋白污染对目的蛋白的影响较大，对最终的数据库检索也会产生影响 Q：我的PMF的峰值较少，为什么？这些片段数量及峰值是否达到最基本的数据库检索的要求？影响检索的结果吗？ A：因为我们用的是胰酶对蛋白质进行降解的，胰酶是一种专一较强的酶，只水解精氨酸、赖氨酸的C端，可能是你的样品的酶解的位点偏多或偏少，偏多酶解为小片段，峰值跟基质在一起难以分辨，偏少肽段的分子量偏大，胶内的样品滞留在胶内，在质谱图上体现不出来，溶液样品可以收集到，但是分子量越大检索的结果越不准确；理论上图谱的峰越多越好，要是都能匹配上那么蛋白的确定程度就更高，相反就越低；一般至少要拿到4个肽段。 Q：如何理解这些片段峰值大小意义，越高（纵坐标值大）越精确吗？以及这些酶解片段的数量及峰值一般应达到什么标准才算比较好？？ A：片段峰横坐标的大小的意义是酶解下来的肽段的质量大小，纵坐标表示的收集的该肽段的相对的信号的强度，左边是相对的，右边是绝对的，绝对的越高，抗干扰的能力越好，质谱的精确度由仪器来决定的。我们的仪器的精确度在10ppm以内。 Q：图谱上肽段多于8条，为什么选这8条？ A：至于提交检索的肽段的数量是根据肽段的信号强度来选取的，同时在软件处理的过程中会过滤一部分峰， 如胰酶的自解峰等； Q：数据库检索报告中m/zsubmitted，MH+matched两项是什么意思？ A：m/z submitted 的意思是您提交给数据库的m/z值（因为质谱仪用m/z来分离样品的）， MH+matched指的是与你提交数值相匹配数值，因为在样品在离子化过程中从基质中得到一个质子，所以它会加一个H Q：这两项的分子量和你们的图谱上相应分子量不一致。 A：因为在用图谱数据在数据库检索之前需要通过一个数据的校正和处理，所以图谱上的值与提交检索的值有区别图谱中的峰值是经过一个软件处理后的结果，主要是经同位素峰的合并图谱上的结果会不一至的，例如在你的图上读到的是1519.402，在看图的时候把它给放大处理（只有我这里的图谱处理的软件才能看到），就会发现存在1518.402、1520.402、1521.402、1522.402等相差1的质谱峰，这是由于在天然界中好多物质都存在同位素如O16、O17、O18等，所以在提交给数据库之前会用一个类似于碳水化合物的通式进行校正，所以图谱上读到的数可能会与提交的相差1，还在处理的过程的设置也会影响给出的峰值，但应该在0.1Da以内的；同时在还会进行胰酶自解峰的扣除和空白对照峰的扣除。

如题，我想用C8的色谱柱跑液相色谱看一下发酵液中的蛋白质变化，但是发酵液里面较复杂，如何前处理纯化蛋白质，来达到能够上机的要求？ 如果用三氯乙酸或有机相使蛋白质变性沉淀，弃去上清，还能否将沉淀溶解？我看到这类方法多用在电泳上面，那液相色谱该用上面方法呢？期待高手指点~

GB/T 5009.194-2003保健食品中免疫球蛋白IgG的测定！有人做过这个方法没，用的什么液相色谱柱啊，我在网上找不到这种色谱柱，求做过的大侠指点下！

[table=100%][tr][td]想请教一下，做完胶内酶解肽段后的质谱，如何处理数据寻找差异蛋白，并进行相关分类呢，这方面没接触过，希望懂的赐教一下，谢谢[/td][/tr][/table]

几种常用的蛋白鉴定方法传统的蛋白鉴定方法，如免疫印迹法、内肽的化学测序、已知或未知蛋白的comigration分析，或者在一个有机体中有意义的基因的过表达通常耗时、耗力，不适合高流通量的筛选。 目前，所选用的技术包括对于蛋白鉴定的图象分析、微量测序、进一步对肽片段进行鉴定的氨基酸组分分析和与质谱相关的技术。1 图象分析技术（Image analysis）“满天星”式的2-DE图谱分析不能依靠本能的直觉，每一个图象上斑点的上调、下调及出现、消失，都可能在生理和病理状态下产生，必须依靠计算机为基础的数据处理，进行定量分析。 在一系列高质量的2-DE凝胶产生（低背景染色，高度的重复性）的前提下，图象分析包括斑点检测、背景消减、斑点配比和数据库构建。 首先，采集图象通常所用的系统是电荷耦合CCD（charge coupled device）照相机；激光密度仪（laser densitometers）和Phospho或Fluoroimagers，对图象进行数字化。 并成为以象素（pixels）为基础的空间和网格。 其次，在图象灰度水平上过滤和变形，进行图象加工，以进行斑点检测。 利用Laplacian，Gaussian，DOG（difference of Gaussians） opreator使有意义的区域与背景分离，精确限定斑点的强度、面积、周长和方向。图象分析检测的斑点须与肉眼观测的斑点一致。 在这一原则下，多数系统以控制斑点的重心或最高峰来分析，边缘检测的软件可精确描述斑点外观，并进行边缘检测和邻近分析，以增加精确度。 通过阈值分析、边缘检测、销蚀和扩大斑点检测的基本工具还可恢复共迁移的斑点边界。 以PC机为基础的软件Phoretix-2D正挑战古老的Unix为基础的2-D分析软件包。 第三，一旦2-DE图象上的斑点被检测，许多图象需要分析比较、增加、消减或均值化。 由于在2-DE中出现100%的重复性是很困难的，由此凝胶间的蛋白质的配比对于图象分析系统是一个挑战。 IPG技术的出现已使斑点配比变得容易。 因此，较大程度的相似性可通过斑点配比向量算法在长度和平行度观测。 用来配比的著名软件系统包括Quest，Lips，Hermes，Gemini等，计算机方法如相似性、聚类分析、等级分类和主要因素分析已被采用，而神经网络、子波变换和实用分析在未来可被采用。 配比通常由一个人操作，其手工设定大约50个突出的斑点作为“路标”，进行交叉配比。 之后，扩展至整个胶。例如：精确的PI和MW（分子量）的估计通过参考图上20个或更多的已知蛋白所组成的标准曲线来计算未知蛋白的PI和MW。 在凝胶图象分析系统依据已知蛋白质的pI值产生PI网络，使得凝胶上其它蛋白的PI按此分配。 所估计的精确度大大依赖于所建网格的结构及标本的类型。 已知的未被修饰的大蛋白应该作为标志，变性的修饰的蛋白的PI估计约在±0。25个单位。 同理，已知蛋白的理论分子量可以从数据库中计算，利用产生的表观分子量的网格来估计蛋白的分子量。 未被修饰的小蛋白的错误率大约30%，而翻译后蛋白的出入更大。 故需联合其他的技术完成鉴定。2 微量测序（microsequencing）蛋白质的微量测序已成为蛋白质分析和鉴定的基石，可以提供足够的信息。 尽管氨基酸组分分析和肽质指纹谱（PMF）可鉴定由2-DE分离的蛋白，但最普通的N-末端Edman降解仍然是进行鉴定的主要技术。 目前已实现蛋白质微量测序的自动化。 首先使经凝胶分离的蛋白质直接印迹在PVDF膜或玻璃纤维膜上，染色、切割，然后直接置于测序仪中，可用于subpicomole水平的蛋白质的鉴定。 但有几点需注意：Edman降解很缓慢，序列以每40 min 1个氨基酸的速率产生；与质谱相比，Edman降解消耗大；试剂昂贵，每个氨基酸花费3～4$。 这都说明泛化的Edman降解蛋白质不适合分析成百上千的蛋白质。 然而，如果在一个凝胶上仅有几个有意义的蛋白质，或者如果其他技术无法测定而克隆其基因是必需的，则需要进行泛化的Edman降解测序。近来，应用自动化的Edman降解可产生短的N-末端序列标签，这是将质谱的序列标签概念用于Edman降解，业已成为一种强有力的蛋白质鉴定。 当对Edman的硬件进行简单改进，以迅速产生N-末端序列标签达10～20个/d，序列检签将适于在较小的蛋白质组中进行鉴定。若联合其他的蛋白质属性，如氨基酸组分分析、肽质质量、表现蛋白质分子量、等电点，可以更加可信地鉴定蛋白质。 选择BLAST程序，可与数据库相配比。 目前，采用一种Tagldent的检索程序，还可以进行种间比较鉴定，又提高了其在蛋白质组研究中的作用。3 与质谱（mass spectrometry）相关的技术质谱已成为连接蛋白质与基因的重要技术，开启了大规模自动化的蛋白质鉴定之门。 用来分析蛋白质或多肽的质谱有两个主要的部分，1）样品入机的离子源，2）测量被介入离子的分子量的装置。 首先是基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）为一脉冲式的离子化技术。 它从固相标本中产生离子，并在飞行管中测其分子量。 其次是电喷雾质谱（ESI-MS），是一连续离子化的方法，从液相中产生离子，联合四极质谱或在飞行时间检测器中测其分子量。 近年来，质谱的装置和技术有了长足的进展。在MALDI-TOF中，最重要的进步是离子反射器（ion reflectron）和延迟提取（delayed ion extraction），可达相当精确的分子量。 在ESI-MS中，纳米级电雾源（nano-electrospray source）的出现使得微升级的样品在30～40 min内分析成为可能。将反相液相色谱和串联质谱（tandem MS）联用，可在数十个picomole的水平检测；若利用毛细管色谱与串联质谱联用，则可在低picomole到高femtomole水平检测；当利用毛细管电泳与串联质谱连用时，可在小于femtomole的水平检测。 甚至可在attomole水平进行。 目前多为酶解、液相色谱分离、串联质谱及计算机算法的联合应用鉴定蛋白质。 下面以肽质指纹术和肽片段的测序来说明怎样通过质谱来鉴定蛋白质。(1)肽质指纹术（peptide mass fingerprint， PMF）由Henzel等人于1993年提出。 用酶（最常用的是胰酶）对由2-DE分离的蛋白在胶上或在膜上于精氨酸或赖氨酸的C-末端处进行断裂，断裂所产生的精确的分子量通过质谱来测量（MALDI-TOF-MS，或为ESI-MS），这一技术能够完成的肽质量可精确到0。1个分子量单位。 所有的肽质量最后与数据库中理论肽质量相配比（理论肽是由实验所用的酶来“断裂”蛋白所产生的）。 配比的结果是按照数据库中肽片段与未知蛋白共有的肽片段数目作一排行榜，“冠军”肽片段可能代表一个未知蛋白。若冠亚军之间的肽片段存在较大差异，且这个蛋白可与实验所示的肽片段覆盖良好，则说明正确鉴定的可能性较大。(2)肽片段（peptide fragment）的部分测序肽质指纹术对其自身而言，不能揭示所衍生的肽片段或蛋白质。 为进一步鉴定蛋白质，出现了一系列的质谱方法用来描述肽片段。 用酶或化学方法从N-或C-末端按顺序除去氨基酸，形成梯形肽片段（ladder peptide）。 首先以一种可控制的化学模式从N-末端降解，可产生大小不同的一系列的梯形肽片段，所得一定数目的肽质量由MALDI-TOF-MS测量。 另一种方法涉及羧基肽酶的应用，从C-末端除去不同数目的氨基酸形成肽片段。 化学法和酶法可产生相对较长的序列，其分子量精确至以区别赖氨酸（128。09）和谷氨酰胺（128。06）。 或者，在质谱仪内应用源后衰变（post-source decay， PSD）和碰撞诱导解离（collision-induced dissociation， CID），目的是产生包含有仅异于一个氨基酸残基质量的一系列肽峰的质谱。 因此，允许推断肽片段序列。 肽片段PSD的分析在MALDI反应器上能产生部分序列信息。 首先进行肽质指纹鉴定。 之后，一个有意义的肽片段在质谱仪被选作“母离子”，在飞行至离子反应器的过程中降解为“子离子”。 在反应器中，用逐渐降低的电压可测量至检测器的不同大小的片段。 但经常产生不完全的片段。 现在用肽片段来测序的方法始于70年代末的CID，可以一个三联四极质谱ESI-MS或MALDI-TOF-MS联合碰撞器内来完成。 在ESI-MS中，由电雾源产生的肽离子在质谱仪的第一个四极质谱中测量，有意义的肽片段被送至第二个四极质谱中，惰性气体轰击使其成为碎片，所得产物在第三个四极质谱中测量。 与MALDI-PSD相比，CID稳定、强健、普遍，肽离子片段基本沿着酰胺键的主架被轰击产生梯形序列。 连续的片段间差异决定此序列在那一点的氨基酸的质量。 由此，序列可被推测。 由CID图谱还可获得的几个序列的残基，叫做“肽序列标签”。 这样，联合肽片段母离子的分子量和肽片段距N- C端的距离将足以鉴定一个蛋白质。4 氨基酸组分分析1977年首次作为鉴定蛋白质的一种工具，是一种独特的“脚印”技术。 利用蛋白质异质性的氨基酸组分特征，成为一种独立于序列的属性，不同于肽质量或序列标签。 Latter首次表明氨基酸组分的数据能用于从2-DE凝胶上鉴定蛋白质。 通过放射标记的氨基酸来测定蛋白质的组分，或者将蛋白质印迹到PVDF膜上，在15

请问用高效液相色谱法检测牛血清白蛋白标准品（BSA），用什么柱子比较好？

最近在考虑用ESI源测大分子蛋白的分子量的问题，总结起来有如下：1 用ESI源的质谱（比如常用的ESI-Q-TOF）测大分子完整蛋白（比如：BSA，分子量约64KDa）的分子量有哪些难点？对比测多肽来说有哪些不同的地方（参数设置，以某种质谱为例，毕竟不同的公司离子源的设计不一样）。2 现在用Q-TOF测完整蛋白分子量的比较多（AB,Waters的机器都有人做过），但用离子阱，或者离子阱串联的其它质量分析器很难（有文献报到，但是不多），为什么？大分子很难被离子阱囚禁？还是说大分子在离子阱内聚焦的时候容易被碰碎？大家畅所欲言哈，也欢迎各位兄弟关于这个主题（ESI源测大分子蛋白）提出自己的问题或者见解。

通过对比试验研究洗脱时间、柱温、流速、洗脱梯度等对反相高效液相色谱法的影响，确立适宜小麦胚乳醇溶蛋白（Gliadin）反相高效液相色谱法（RP-HPLC）分离的最佳实验方法为：在1.0mL/min的流速、60℃的柱温条件下对上样醇溶蛋白进行洗脱、洗脱梯度为流动相B的体积比在55min内由21%升至48%（V/V），最后通过210nm紫外光检测洗脱组分的吸收值。