伽玛热点成像系统

为帮助广大实验室用户及时了解高内涵成像前沿技术、创新产品与解决方案，向用户传递准确、实用的技术干货和宝贵的实验经验，仪器信息网特别组织策划“高内涵成像技术” 主题约稿活动(点击查看)。本期，特别邀请到浙江大学药学院药物信息学研究所副教授赵璐博士和研究生葛栩涛同学谈一谈高内涵成像系统在斑马鱼活体成像中的应用心得。高内涵成像技术（High-Content Imaging，HCI）近年发展迅速，2D及3D的细胞成像技术均趋于成熟。例如，Pelkin Elmers公司推出了Opera Phenix Plus高内涵成像分析系统，采用Nipkow转盘和sCMOS相机，配套Harmony®集成软件，提供了高内涵筛选的整体解决方案。Thermo Fisher公司推出了CellInsight CX7 Pro LZR高内涵筛选平台，同样采用Nipkow 旋转和sCMOS相机，配套Amira软件，助力高内涵筛选和分析。而Molecular Devices 公司的ImageXpress Micro Confocal 共聚焦高内涵成像分析系统采用AgileOptix™转盘式共聚焦和 sCMOS 相机，具有大视野、宽动态范围，多种成像模式，支持自动加样等特点，同时其具有3D成像和分析的能力。新款的ImageXpress Confocal HT.ai系统进一步增加了自动水浸物镜、IN Carta 图像分析等功能，简化高级表型分类和 3D 成像分析的工作流程。模式生物斑马鱼凭借繁殖力强、发育迅速、幼鱼体积小且通体透明等特点，加上众多特定细胞标记转基因荧光鱼系的运用，成为目前适合活体高通量荧光成像的唯一脊椎模式生物，在大规模药物筛选领域被日益关注。然而，常规的荧光显微镜成像具有速度慢、清晰度不佳以及图像处理过程繁琐等问题。本文主要以Molecular Devices公司的ImageXpress Micro Confocal 共聚焦高内涵成像分析系统为例，分享本团队在对斑马鱼幼鱼进行高内涵成像及图片处理分析中的一些经验。首先，为了较好的成像效果，用于成像的胚胎一般需要进行以下预处理：(1) 黑色素的抑制：斑马鱼胚胎约发育至24小时左右，躯干及脑部皮肤及视网膜会开始形成逐渐黑色素，影响胚胎成像效果，所以通常在胚胎收集后1天内在培养基中添加苯硫脲（200uM），以抑制黑色素的生成；(2) 胚胎破膜：若用以成像或药物处理的斑马鱼胚胎尚未破膜，需将胚胎孵育于蛋白酶（2mg/ml）中一段时间，随后加入培养基轻轻吹打，使胚胎与绒毛膜分离；(3) 胚胎麻醉和摆放：大部分情况下，成像需保持胚胎于静止位，可考虑使用三卡因（0.016%）对斑马鱼进行麻醉，随后将斑马鱼逐孔加入96孔板内，轻吹并尽量保证其处于侧卧的体位。01 斑马鱼动态血流成像Micro Confocal系统在细胞上能够支持心肌细胞跳动和干细胞分化等快速和罕见事件进行成像。在斑马鱼模型上同样可以支持血液流动以及心脏跳动的成像。以动态血流为例，我们选择了红细胞绿色荧光标记的鱼系Tg (Lcr:eGFP)进行测试。具体拍摄流程为：首先在 2 倍镜或 4 倍镜下定位胚胎并进行初步手动对焦，也可使用高内涵成像平台自带软件MetaXpress 编程进行自动对焦。选中血管区域（一般选择在斑马鱼背主动脉和尾静脉位点，方便后续统计），切换 20 倍镜拍摄视频。另外，后续的人工量化血细胞流动通常费时费力，可以使用MetaXpress 软件的journal模块自动测算单位时间内流过的红细胞数目（Ref. 任灿, 陈雪纯, 吴慧敏, 赵璐, 王毅. (2021). 基于高内涵成像系统的斑马鱼血流动态分析. // 高内涵成像及分析实验手册. Bio-101: e1010854. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010854）。02 斑马鱼静态多通道成像ImageXpress支持至多5或7通道的荧光成像，因此可以实现不同荧光标记细胞的共同成像。拍摄方式与动态摄影类似：先在低倍镜下初步对焦，然后选择心脏区域，切换10倍镜分别拍摄两个通道下的荧光图像。在多孔或整板成像过程中，由于孔与孔之间的斑马鱼位置存在偏差，或不同胚胎本身发育状态有所差异等原因，不同孔的最佳聚焦平面往往会变化，限制了高通量成像。为了方便焦平面的寻找，一个应对方案是使用大步长（10~30um）的Z-stack拍摄初始焦平面上下一定厚度范围内（200um）的一系列图像，再从中挑选最清晰的一帧即可。图1a展示了3dpf斑马鱼心脏和血管内皮Tg (Cmlc2:eGFP Kdrl:mcherry)共同成像的效果图，可以清晰地看到心房和主动脉连接处存在共定位。图1b为3dpf斑马鱼红细胞和血管内皮Tg (Lcr:eGFP Kdrl:mcherry) 共同成像的效果图，可以清晰地看到红细胞位于血管中。此外，目前有一些商品化的特殊孔板可帮助保持胚胎在特定位置，但使用场景仍有较多局限性，尚需进一步优化。图1 斑马鱼静态多通道成像代表图03 斑马鱼高分辨率及3D成像斑马鱼胚胎器官厚度通常在几十至上百微米之间，或拥有复杂的立体结构，因此简单的2D图片往往不能获取高质量信息。我们同样可以使用Z-stack程序拍摄立体图像，不同的是步距需要设置比较小，通常为1~3um。拍摄结束后，可以使用Z project将堆栈图三维投影成一张2D图像，也可以使用3D project将系列图重构成立体图像。另外，10倍镜下难以拍摄全鱼，可以使用多视野拼接的方式得到全鱼荧光。这一部分同样支持多通道荧光成像，图2a展示了Z project重构的中性粒细胞和血管内皮荧光Tg (Lyz:eGFP Kdrl:mcherry)共同成像的效果图，图2b展示了红细胞和血管及淋巴管细胞Tg (Gata1:dsRed Fli1:eGFP)共同成像的效果图。补充视频1和2分别展示斑马鱼脑部血管以及血管叠加红细胞的3D重构图像。图2 斑马鱼高分辨率三维投影成像代表图视频1：斑马鱼脑部血管三维重建视频2：斑马鱼血管红细胞叠加三维重建最后，使用ImageXpress成像系统进行斑马鱼成像还存在一些问题。比如，高强度的激光光源对斑马鱼有一定的刺激，可能会导致其产生应激性游动，造成成像失败，因此对麻醉效果有较高的要求，但在减少应激反应的同时也要注意不能麻醉过度（浓度太高或时间太长）引起胚胎损伤或死亡。另外，目前大部分高内涵成像系统的配套软件在自动定位斑马鱼胚胎及寻找最佳焦平面的功能模块中还有比较大的局限性。在批量成像中，大多数只能做到相似焦平面的孔间自动成像，对于焦平面差异较大的孔，则需要手动调焦，极大影响了拍摄效率。因此，高通量成像目前仅能支持孵化天数较小的胚胎（一般3dpf以内，鱼泡尚未发育且运动能力较弱）的成像，对发育后期的斑马鱼胚胎或幼鱼还不能进行批量成像。期待未来在功能模块进一步完善后，可支持孔板内任意位置及焦平面的高质量成像。最后，在图像数据分析上，尽管我们的前期工作已开发了多个模型的自动分析算法（如心脏、血流动力学），但仍有许多其他模型缺乏对应的分析算法（如血管、免疫细胞、神经系统的分布和行为）等，值得进一步开拓。本文作者： 葛栩涛（研究生） 赵璐（副教授），浙江大学药学院药物信息学研究所浙江大学药学院药物信息学研究所 赵璐 副教授赵璐博士，浙江大学药学院药物信息学研究所副教授、博士生导师、浙江大学“求是青年学者”，博士毕业于美国耶鲁大学医学院。现为浙江大学中药科学与工程学系模式生物平台负责人，研究方向为基于斑马鱼多模态成像的中药药效物质发现。获浙江省杰出青年科学基金支持，主持国家自然科学基金项目2 项，浙江省自然科学基金项目2 项，研究成果获教育部自然科学二等奖1 项。以第一或通讯作者发表PNAS, Engineering等学术论文18 篇，被Nature、Lancet等期刊引用1050 余次。浙江大学药学院药物信息学研究所 葛栩涛 研究生葛栩涛，浙江大学药物信息所21级研究生。主要研究方向为斑马鱼高内涵活体荧光成像技术在中药药效物质筛选中的应用。擅长斑马鱼相关实验技术以及多种荧光显微的斑马鱼活体成像。曾获2022长三角天然药物化学研讨会论文评选二等奖，浙江大学医学院公共技术平台显微注射比赛一等奖，2022-2023学年浙大药学院研究生学术创新能力单项荣誉。如有技术干货、科研成果、仪器使用心得、生命科学领域热点事件观点等内容，欢迎投稿，投稿邮箱：zhaoyw@instrument.com.cn，关于征稿内容要求也可邮件咨询或电话联系：13331136682（同微信）。

2018年10月23日，美国Etaluma CEO Chris Shumate, PHD来访锘海生命科学。Etaluma公司的全自动活细胞成像系统Lumascope可广泛应用于各类活细胞，细胞球体，组织，切片，微流控，细菌，活体成像。Dr. Shumate 给大家进行了专业的显微成像原理，Etaluma对比传统显微镜的优势，以及应用方向等的培训。大家就建立市场合作、了解中国客户需求、在各地高校进行巡回演讲等进行了深入的探讨和学习交流。关于Etaluma全自动活细胞成像系统 Lumascope美国的etaluma公司的全自动活细胞成像系统Lumascope，还可以放入培养箱内进行长时间的活细胞成像观察，保证细胞稳定的生长环境。同时也适用于观察动物、植物组织以及活体。形态小巧可便携式携带，可放入超净台中，自由组合度高。它光路设计简单，灵敏度高，成像质量好，媲美传统共聚焦显微镜。同时该显微镜可以做三色荧光（红、绿、蓝），物镜选择范围1.25X-100X，支持Z轴成像。支持培养皿，培养瓶，载玻片以及微孔板，并且通可以做1536板。其配套显微成像分析软件Lumaquant操作简单，功能强大。Lumaquant可以帮您实现在荧光，在相差和明场成像中2D以及长时间2D图像的分析，可实现检测和跟踪物体（细胞，细胞核，颗粒等）。欢迎参加慕尼黑生化展，现场测样！案例分享BPAE细胞里的DNA，alpha微管蛋白，以及F-肌动蛋白使用LS620拍摄的BPAE细胞里的DNA（蓝），alpha微管蛋白（绿），以及F-肌动蛋白（红）。使用奥林巴斯40x镜头，LifeTech FluoCell slide #2。 小鼠肾脏组织切片细胞球体形成心肌细胞钙流信号检测相差成像关于锘海：锘海生物科学仪器（上海）股份有限公司（Nuohai Life Science）成立于2004年，总部设在上海，并陆续在北京，广州，成都等地设立了8个办事处。锘海致力于提供先进的实验/研究与生产仪器、相关试剂耗材, 并提供专业的应用和技术服务支持。不断促进生命科学领域新技术发展，及时引进国外最新的技术和产品。同时，锘海生命科学为科研及企业客户提供全方位的CRO/CMO 服务，满足产业中的研发和生产需求。

结构和功能的异质性是普遍存在的生命现象，这要求在生殖发育研究、药物筛选等领域进行大规模的样品研究来消除个体差异。其中斑马鱼作为一种重要的模式生物，由于其体积小、透明度好、繁殖能力强等特点非常适合利用其进行大规模成像，在大规模遗传发育研究和药物筛选方面具有明显优势。然而目前常规成像技术受进样方式及成像方法限制，往往只能对少数斑马鱼样品进行手动操作的二维成像。近年来发展的光片照明显微镜可以实现对斑马鱼进行高分辨、低光照的三维成像，但是由于凝胶固定等复杂的样品准备流程，仍然无法满高通量的成像需求。并且获得一个完整的斑马鱼胚胎三维图像，往往需要在多个区域中分别扫描成像而后进行图像拼接，进一步限制了其在高通量分析中的应用。鉴于此，中科院苏州医工所李辉课题组将流式成像与光片结合，建立了流式光片成像系统（light-sheet flow imaging system， LS-FIS）。通过设计精密的控制时序，斑马鱼样品逐个地被加载到与水具有相似折射率的FEP管道中，并以倾斜的角度连续通过光片照明区域，与光片面垂直的物镜采集荧光信号进行成像。LS-FIS在样品流过照明面时进行连续成像，每帧图像叠加形成三维图像，从而实现了不进行图像拼接的情况下全斑马鱼胚胎的高通量三维成像。研究人员还在光片光路中引入明场照明与成像来完成样品运动速度标定与矫正，实现优于3μm的细胞分辨率三维成像。得益于高效的流式进样方式以及先进的图像重建算法，利用LS-FIS可实现200 胚胎/小时的全斑马鱼胚胎三维成像，相较于传统光片技术通量提高了50倍以上，这为使用斑马鱼进行大规模的遗传发育研究和药物筛选提供了仪器装备基础。相关结果以“Heterogeneities of zebrafish vasculature development studied by a high throughput light-sheet flow imaging system”的论文标题发表在最近的Biomedical Optical Express期刊上。图1 a）LS-FIS系统光路图；（b）LS-FIS液路图；（c）利用LS-FIS获得的典型全胚胎斑马鱼血管三维图像Tg(kdrl: EGFP)；（d）躯干放大图；（e）图b中三维截面图可清晰分辨血管内壁；（f）头部放大视图，可清晰分辨主要血管结构利用LS-FIS技术，研究人员进行了斑马鱼躯干及头部血管发育研究，统计并分析了3-9 dpf的斑马鱼节间血管三维长度及眼部晶状体血管网形态变化，共获得超过500条全胚胎斑马鱼三维图像。针对这些大量数据的统计分析显示，节间血管总长在7dpf前持续增长，并且与二维结果一致；但7-9dpf间由于形态卷曲程度增加，二维图像已难以正确体现真实的血管长度，体现出三维成像在血管发育定量评价中的重要性。另一方面，针对晶状体血管网络这种典型的三维空间结构，仅二维成像更加无法全面获得其特征信息。而通过LS-FIS，可以方便地从全胚胎三维结构中分割出眼部区域，进而统计其形态结构，研究结果表明，虽然眼部晶状体血管网络（hyaloid basket）的形态在3-8dpf内仍然为持续增长趋势，但其方差仅为节间血管发育的10%。这提示尽管来自同一批胚胎，斑马鱼不同部位的异质性仍然存在很大差距，这也表明了大规模三维成像对于遗传发育的必要性。图2 （a）全胚胎三维数据中分割出躯干部分节间血管，并绘制血管发育曲线；（b）全胚胎三维数据中分割出头（左上）部及晶状体血管网络（右上、左下），并统计晶状体网络形状的深度及直径信息，绘制其变化曲线（右下）为适应大规模三维图像数据自动化分析的要求，研究人员还开发了基于深度学习的相关图像分析处理算法。针对斑马鱼节间血管，提出了一种多尺度特征的三维卷积神经网络（MS-3D U-Net），通过多尺度特性学习和基于硬注意力机制的损失函数，实现了对三维图像的血管分割和识别，识别准确度达到90%以上（AUC值）。相关结果也发表在Biomedical Optical Express期刊上[1]。图3 LS-FIS样机论文第一作者为助理研究员杨光，通讯作者为李辉研究员。LS-FIS样机和图像分析算法为斑马鱼大规模三维成像，进行异型性研究提供了完整解决方案。本工作得到中国科学院仪器装备研制，国家自然科学基金委等项目的支持。参考文献：1. J. Yin, G. Yang, X. Qin, H. Li, and L. Wang, "Optimized U-Net model for 3D light-sheet image segmentation of zebrafish trunk vessels," Biomed. Opt. Express, BOE 13(5), 2896–2908 (2022).