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在发明蛋白质印迹法(Western Blot)出现了30多年之后,这项技术仍然是获取特定蛋白可靠鉴定的关键。许多近期涌现的产品利用各种方法来提高蛋白质印迹实验的可重复性、敏感性、定量性以及速度。有三个人都被认为发展了蛋白质的免疫印迹方法,但其中只有一人才算得上是“Western Blotting(蛋白质印迹法)”的命名者,他就是当时在西雅图哈钦森癌症研究中心Bob Nowinski实验室工作的W. Neal Burnette。“Western Blotting”的命名中暗含了Southern Blotting(Edwin Southern在1975年发明的一项技术,使用胶、尼龙膜和吸水纸去鉴定一个复杂个体中特定的DNA序列)、Northern Blotting(随后发明出的相似策略,用于鉴定RNA)以及位于西海岸(West Coast)的Nowinski实验室三者之意。http://www.ibioo.com/data/attachment/portal/201309/22/095234xzm2pso06fsmtbof.jpgBurnette的技术成果直到1981年才得以发表。他回想起来,当时审稿人“特别”反对使用“Western blotting”这一名称。但尽管如此,这个名称还是沿袭了下来,而且蛋白质印迹技术也成为了最广泛使用的免疫化学技术之一。工作原理蛋白质印迹法的第一步涉及到用凝胶电泳(Gelelectrophoresis)按照大小分离蛋白质,然后通过将膜置于胶上,将蛋白质转移到膜上(通常是硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜),并在膜上加上若干片吸水纸,然后将这套堆层放在缓冲溶液中,这样就能通过毛细管作用将蛋白质向上拉拽到膜上。这也就是所谓的湿法或槽式转印法。另外两项技术是干法和半干转印法,这两种方法比传统的湿转印法更快也更规整,但是对于高分子量蛋白质而言,效率更低。对于半干转印方法来说,膜和胶放置在被缓冲液浸泡过的滤纸层之间,将这些都夹在阴极和阳极之间,电流就能驱动蛋白质转移到膜上。三种方法中,干法转印最快,但转印效率也最低。转印结束后,膜被放在稀释过的蛋白质溶液中用来封闭非特异性的蛋白质结合。然后将膜与一抗进行孵育、洗脱,再与标记了信号检测探针的二抗进行孵育。最后一步是检测,通常采用化学发光或者荧光方法。在化学发光检测中,与酶交联的二抗能够与检测抗原产生光发生反应,可以被胶片或成像装置捕获。而在荧光检测中,抗体探针被荧光集团所标记。荧光检测方法的主要优势在于,它可以同时检测多个蛋白质,并且其信号更加一致。因此与化学发光检测相比,也更有利于量化研究。不少制造蛋白质印迹相关设备、软件和消耗品的公司正在努力推动其中一些或所有步骤的自动化,期望能够将这一实验变得更加简单有效。同时在实验中加入了一些验证点,让研究人员能够随时监测实验进展,甚至重新打造整个过程。科学家们寻求的是高效性、稳健性和策略化,从而能够帮助他们避免浪费宝贵的造价高昂的抗体。加速免疫检测过程转印、抗体孵育、上样和洗脱步骤占据了蛋白质印迹法实验80%的时间,EMD Millipore公司“蛋白质印迹法解决方案”产品经理Michele Hatler这样介绍。这家总部位于加州泰梅库拉的公司推出的SNAP i.d. 2.0蛋白质检测系统加速了整个过程,使用真空装置通过膜推入试剂,而不仅仅依赖于扩散作用。这样就能将免疫检测的时间从4小时缩短到30分钟,Hatler表示。她解释说:“我们真正致力于提高蛋白质印迹工作流程的效率。我们仍然是按照传统的步骤走,只是加了一个真空装置。”Hatler指出,2.0版本是于2012年9月推出的,相比之前的版本有几个方面的优势。它可以使用中等大小的凝胶(8.5×13.5厘米)和迷你凝胶(7.5×8.4厘米),之前则只能用迷你凝胶。“这一设备很便宜,操作也很简便,但切实提高了实验效率,节省了实验时间。” Hatler说。伯乐公司(Bio-Rad)的Trans-Blot Turbo蛋白质转移系统是实验台面大小的仪器,能够提供快速而高效的转印。得益于新的转印缓冲液配方,特殊的过滤材料和增强的电流强度(由一个集成电源调节),这一系统能够在短至3分钟的时间内完成转印,并且印迹结果能与槽式转移相媲美。传统的半干转移系统需要15到60分钟时间,而且通常无法提供高分子量蛋白质转移的有力结果。增加验证点以缓解忧虑蛋白质印迹法的高失败率常常令人感到非常沮丧,尤其是你需要若干天来换取一个结果。“这是一项非常不稳定的技术,”伯乐公司“蛋白质印迹组”市场经理Ryan Short说,“我们对用户调查时发现,一半的用户报告他们用此技术的失败率至少是25%。”Short还说:“几乎没有什么机会可以检查实验过程是否满足期望。由此就产生了焦虑。我们正在引入可视验证点的概念来增加信心和确定性。”这家公司的标准和Mini-PROTEAN免染色预制胶,利用其ChemiDoc MP胶成像系统,使得研究者可以快速观测到他们的蛋白是否正确地载入到凝胶上,进而确证高质量的蛋白质转移,便于决定是否应该转向下一个步流程或是重新开始。ChemiDoc MP系统是为化学发光和多元荧光斑点成像技术所设计,能够在个人电脑上用ImageLab软件来操作。这些验证点“真的很有用”,在实验室使用该系统的加州大学戴维斯分校助理教授Aldrin Gomes表示:“我们可以成像这些免染的凝胶,不用加入额外的染料,而且能够快速判断跑在胶上的样品是否出现问题。我们还能在蛋白质转膜之后再去对凝胶成像,如果其中任何一个步骤出现问题,我们都可以在这一点上停止实验进程。”成像和软件提高定量性当许多科学家仍在使用胶片分析蛋白质印迹时,世面上开始出现越来越多的宽范围免胶片凝胶记录成像系统,这些系统可以用来成像并分析化学发光的印迹、荧光的印迹斑点或者同时检测这两种印迹。许多公司开始纷纷努力,争相制造尽可能便捷的成像仪及其分析软件。很多公司提供了按键式成像捕捉系统,其大小可在实验台上操作。Syngene公司于2012年4月推出了非常简洁的一键操作系统PXi,分析化学发光和荧光印迹。该系统是基于该公司的G:BOX成像系统,并配有GeneSys成像软件。2012年10月,赛默飞世尔公司(Thermo Fisher Scientific)推出了myECL成像仪,使用紫外和可见光透射法,专业的滤镜和电荷耦合器件(CCD)摄影技术去捕获和分析蛋白质印迹以及蛋白和核酸凝胶。
[b]先说说冷阴极真空规的工作原理:[/b][color=#212529] [size=12px]在冷阴极真空规中,电离是自持放电的一部分。然而,由于冷阴极真空规没有[/size][font=Arial, Helvetica, sans-serif][size=16px]([/size][/font][size=12px]热离子发射[/size][font=Arial, Helvetica, sans-serif][size=16px])[/size][/font][size=12px]灯丝,这个放电是由杂散场发射或外部事件[/size][font=Arial, Helvetica, sans-serif][size=16px]([/size][/font][size=12px]宇宙射线或放射性衰变[/size][font=Arial, Helvetica, sans-serif][size=16px])[/size][/font][size=12px]引发的。在低压下,这可能需要几分钟才能打开,冷阴极规通常在高压[/size][font=Arial, Helvetica, sans-serif][size=16px](1e-1Pa[/size][/font][size=12px]或更高[/size][font=Arial, Helvetica, sans-serif][size=16px])[/size][/font][size=12px]下打开。一旦启动,测量仪的磁场将电子限制在螺旋路径中,使它们具有较长的路径长度和较高的电离剩余气体的可能性。离子被收集和测量,以确定气体压力。[/size][/color][color=#212529] [/color][color=#212529][size=12px]在冷阴极真空规中,不同几何形状的电极被使用,如[/size][/color][color=#212529][size=12px]圆柱体,板,环,棒,[/size][/color][color=#212529][size=12px]最终目的是为了[/size][/color][color=#212529][size=12px]最大限度地测量电流。如果压力表的中心或“末端”电极是负的,通常称之为磁控管。如果[/size][/color][color=#212529][size=12px]这个[/size][/color][color=#212529][size=12px]电极是正的,则称为倒置磁控管。[/size][/color][color=#212529][size=12px] 与热离子[/size][/color][color=#212529][size=12px]规[/size][/color][color=#212529][size=12px]不同,冷阴极[/size][/color][color=#212529][size=12px]规[/size][/color][color=#212529][size=12px]没有灯丝或栅极来脱气。[/size][/color][color=#212529][size=12px]而且[/size][/color][color=#212529][size=12px],冷阴极[/size][/color][color=#212529][size=12px]规[/size][/color][color=#212529][size=12px]可[/size][/color][color=#212529][size=12px]以[/size][/color][color=#212529][size=12px]会被拆开,[/size][/color][color=#212529][size=12px]对[/size][/color][color=#212529][size=12px]电离室和[/size][/color][color=#212529][size=12px]规[/size][/color][color=#212529][size=12px]的内壁[/size][/color][color=#212529][size=12px]进行清洗维护[/size][/color][color=#212529][size=12px]。[/size][/color][color=#212529][size=12px]甚至经过培训的普通[/size][/color][color=#212529][size=12px]用户就可以[/size][/color][color=#212529][size=12px]清洗[/size][/color][color=#212529][size=12px]洗冷阴极计的内壁,[/size][/color][color=#212529][size=12px]以便[/size][/color][color=#212529][size=12px]清除“溅射”到内壁上的[/size][/color][color=#212529][size=12px]氧化层[/size][/color][color=#212529][size=12px]。[/size][/color][color=#212529][size=12px]因此比热离子规使用寿命更长[/size][/color][color=#212529][size=12px]。[/size][/color][color=#212529][size=12px][/size][/color][align=center][img=,267,230]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/09/202209020934314468_9224_1618736_3.png!w267x230.jpg[/img][/align][back=#ffffff][/back][align=CENTER][size=12px] 由于冷阴极真空规在工作时处于一种持续放电状态,因此长期使用后,在阴极和阳极的表面会形成一层不导电氧化层,影响离子流的收集效率,[/size][color=#ff3333][size=12px]从而造成真空值读数异常,比如显示“[/size][/color][font=Times New Roman, serif][color=#ff3333][size=12px][u]1×10[/u][/size][/color][color=#ff3333][sup][size=12px][u]-6[/u][/size][/sup][/color][color=#ff3333][size=12px][u]Pa[/u][/size][/color][color=#ff3333][size=12px]”[/size][/color][/font][color=#ff3333][size=12px]等不符合常识的数值[/size][/color][size=12px],[/size][size=12px]特别是在较高气压条件下启动真空规,这种氧化更剧烈,将大大缩短真空规的有效使用时间,不过不用担心,冷阴极真空规经过清洗维护后可以恢复到正常的状态;下图是真空规管的主要部件;[/size][/align][size=12px][/size][align=center][img=,384,238]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/09/202209020935241179_6656_1618736_3.png!w384x238.jpg[/img][/align][font=Times New Roman, serif]以AIM-S[/font]真空规的清洗为例:[size=12px]工具:卡簧钳;[/size][font=Times New Roman, serif][size=12px]3M7447[/size][/font][size=12px]百洁布;去离子水;无水乙醇;十字头螺丝刀;一字螺丝刀;超声波清洗机;[/size][font=Times New Roman, serif][size=12px]1000mL[/size][/font][size=12px]玻璃烧杯。[/size]操作步骤:[font=Times New Roman, serif][size=12px]1.[/size][/font][size=12px]拆卸和清洗[/size][font=Times New Roman, serif][size=12px]1[/size][/font][size=12px])在质谱仪安全关机的前提下,将[/size][font=Times New Roman, serif][size=12px]AIM-S[/size][/font][size=12px]真空规从质谱仪的真空腔体连接处拆下并置于水平宽敞的桌面上;[/size][font=Times New Roman, serif][size=12px]2[/size][/font][size=12px])左手握住[/size][font=Times New Roman, serif][size=12px]AIM-S[/size][/font][size=12px]真空规的中部,右手握住[/size][font=Times New Roman, serif][size=12px]AIM-S[/size][/font][size=12px]真空规顶部的[/size][font=Times New Roman, serif][size=12px]KF25[/size][/font][size=12px]接口部分,逆时针旋转大约[/size][font=Times New Roman, serif][size=12px]30°[/size][/font][size=12px]使规管的卡针从锁定状态变成释放状态;[/size][align=center][img=,320,427]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/09/202209020936345388_5537_1618736_3.png!w320x427.jpg[/img][/align][font=Times New Roman, serif][size=12px]3[/size][/font][size=12px])用手将规管沿着[/size][font=Times New Roman, serif][size=12px]AIM-S[/size][/font][size=12px]真空规的顶部方向拉出(适当用力),使规管与主体部分分离开,并将两部分妥善放置于工作桌面上;[/size][font=Times New Roman, serif][size=12px]4[/size][/font][size=12px])使用卡簧钳从规管上部([/size][font=Times New Roman, serif][size=12px]KF25[/size][/font][size=12px]一侧)将内部的孔用弹性挡圈拆下,并拿出阴极桶和离子挡板,并置于桌面上;[/size][font=Times New Roman, serif][size=12px]5[/size][/font][size=12px])使用卡簧钳从规管下部伸入阳极压紧螺母(高分子材料)的卡位槽中,逆时针旋转拆下阳极压紧螺母,然后小心拿下规管阳极(不要触碰探针引线),由于橡胶密封圈的粘性,可能需要轻微发力撬动密封盘才能拿下规管阳极; [/size][align=center][b]注意:[/b]不要直接拔或扳规管阳极的探针引线,以免损坏规管阳极的玻璃金属密封结构。[/align][align=center][img=,432,576]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/09/202209020941093691_9979_1618736_3.png!w432x576.jpg[/img][/align][align=left][font=Times New Roman, serif][size=12px]6[/size][/font][size=12px])使用[/size][font=Times New Roman, serif][size=12px]7447[/size][/font][size=12px]百洁布擦拭阳极的棒和圆盘的表面,同时擦拭阴极圆筒的内表面和离子挡板表面,至表面的氧化层基本去除,露出金属色即可[/size][font=Times New Roman, serif][size=12px] [font=Times New Roman, serif]7)[/font][size=12px]置入放有无水乙醇的烧杯中超声清洗[/size][font=Times New Roman, serif]10[/font][size=12px]分钟,换去离子水再次超声清洗[/size][font=Times New Roman, serif]10[/font][size=12px]分钟,换干净的无水乙醇再次超声[/size][font=Times New Roman, serif]5[/font][size=12px]分钟后,拿出放置于干净的烧杯中,在[/size][font=Times New Roman, serif]100℃[/font][size=12px]的烘箱中烘烤[/size][font=Times New Roman, serif]30[/font][size=12px]分钟后自然冷却;[/size][font=Times New Roman, serif]AIM-S[/font][size=12px]真空规的阳极和阴极清洗完成;[/size][/size][/font][/align][align=center][img=,690,690]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/09/202209020947333857_7206_1618736_3.png!w690x690.jpg[/img][/align][font=Times New Roman, serif]9)[/font]清洗烘烤完成后,按照顺序组装真空规。由于冷阴极真空规内部没有热灯丝等易损部件,所以非常皮实耐用,工作中遇到的绝大部分故障都是因为污染造成的读书异常问题,所以今后大家遇到类似的问题可以通过清洗维护来解决这个问题。
质谱仪器真空系统主要包含如下一些部件:真空泵、真空计和真空阀。[b]1.真空泵[/b]真空泵是获得真空的设备。市场上真空泵种类很多简单地可将其划分为低真空泵和高真空泵两大类。低真空泵又称前级真空泵,既可用于真空腔室的预抽真空,又可作为高真空泵的前级泵提供高真空泵正常工作所需要的前级真空;高真空泵包括扩散泵、涡轮分子泵、钛升华泵、溅射离子泵、吸气剂泵、低温泵等,负责真空系统里高真空的抽取。高真空泵启动的一个共同点是不在常压下启动,需要在一定的真空条件下启动。因此在一个真空系统中,低真空泵和高真空泵常常配合使用,共同完成抽取和保持系统真空的任务171现在一些真空仪器厂商根据市场,也已推出了将低真空泵和高真空泵功能组合在一起的真空机组,用来满足各类分析仪器对真空的需求。[b]2.真空计[/b]真空计是测量真空的设备。真空计又可分为绝对真空计和相对真空计,前者直接测量空间内气体的压强,后者通过与压强有关的物理量间接地测量空间内气体的压强。按照真空计的不同原理与结构可细分为静态变形真空计、压缩式真空计、热传导真空计、电离真空计、气体放电真空计、辐射真空计等。真空阀是使真空隔离和保持的常用组件。下面简单介绍部分常用的真空组件。[b](1)扩散泵[/b]扩散泵是通过加热使高闪点的泵油蒸发,形成高速气流从喷口喷出。由于油气喷口设计在靠近泵的进气口,且使油气向侧下喷出,因此进入泵内的气体分子会往高速油气流中扩散被带走,当气流到达由冷却水冷却的泵壁后,又会凝结成液体流回蒸发器,油气中因冷凝析出的气体分子就会在出气口处被前级泵抽出即扩散泵是靠油的蒸发、喷射、凝结重复循环来实现抽气任务的。扩散泵具有无噪声、无震动和成本不高等优点,但其极限真空偏低,且使用过程中易造成系统油气污染,现在很多新型质谱仪器上已不再使用。[b](2)涡轮分子泵(turbo pump)[/b]是通过高速旋转的多级涡轮转子叶片和静止涡轮叶片的组合进行抽气的,在分子流区域内对被抽气体产生很高的压缩比,从而获得所需要的真空性能,对被抽气体无选择性、无记忆效应,操作简单、使用方便。[b](3)钛升华泵[/b]主要依靠电子轰击或通电加热使吸气材料升温,达1200~1500℃时它将不断升华并沉积在水冷泵壁内表面,形成新鲜的活性膜层而不断地吸收和“掩埋”气体分子。对活性气体主要是形成固化化合物,对惰性气体主要是“掩埋”。[b](4)溅射离子泵[/b]溅射离子泵是靠电磁场的作用产生潘宁放电而使气体分子电离,利用电离产生的离子高速轰击阴极钛板引起钛原子溅射,连续制造活性吸气膜使电离了的气体分子收附于其中达到抽气效果的真空泵。[b](5)吸气剂泵[/b]利用能够吸收气体的物质来获得真空的装置(常用来作吸气剂的物质为锆铝、锆石墨、锆钒铁等)。工作过程:首先将锆铝吸气剂加热至激活(900℃)形成活性表面,然后降温至工作温度(400℃)即可吸气。吸气机理:①化学吸收,锆铝吸气剂与其接触的活性气体如O2、CO、CO2、N2、烃类化合物发生化学反应,生成稳定的化学物;②化学吸附,锆铝吸气剂和一些气体如氢在一定温度下生成氢化物,温度稍高时,气体从表面层扩散入内层成为溶解于锆铝吸气剂合金晶格内的固溶体;③物理吸附,锆铝吸气剂的多孔表面依靠范德华力使气体分子附着在表面和孔隙中(注:物理吸附的气体在温度升高时便可很快释放)[b](6)低温泵[/b]利用20K以下的低温表面冷凝容器中的气体和水蒸气而获得真空的设备。利用泵体内温度不同的两级低温板(65K、1K)来冷凝吸附真空系统中的气体分子及水分子达到使系统获得高真空。第一级低温板温度保持在65K(-08℃)左右,主要用于冷凝吸附真空系统中的水分子;第二级低温板温度为15K(-28℃),主要用于冷凝吸附真空系统中的气体分子(H2、N2、Ar)。低温泵主要由制冷循环系统和低温泵泵体两部分组成;制冷系统使用高纯氦气作为制冷剂,对环境无害,工作安全性好。[b](7)机械泵[/b]机械泵是运用机械方法不断地改变泵内吸气空腔的体积,使被抽容器内气体的体积不断膨胀,从而获得真空的装置。它可以直接在大气压下开始工作,极限真空度一般为1.33~1.33×10[sup]-2[/sup]pa,抽气速率与转速及空腔体积的大小有关,一般在每秒几升到每秒几十升之间。[b](8)全量程冷阴极真空规[/b]这是一种全量程的新型冷阴极真空规,它集成了两个独立的真空测量系统(Pirani Cold Cathode冷阴极电离真空计系统),测量范围为5×10[sup]-9 [/sup]1000mbar(1bar=10[sup]5[/sup]Pa),真空技术在20世纪得到迅速发展,并有广泛的应用。20世纪初,旋转式机械泵、皮氏真空计、扩散泵、热阴极电离真空计等真空获得和真空测量设备的相继出现,为质谱技术的发展创造了条件。接着,油扩散泵、涡轮分子泵、离子泵、低温泵等新型真空获得设备的出现,促使真空技术进入超高真空时代,质谱仪器的性能指标也得到了显著提高